Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 7

EXPERIMENTE PE SISTEM CARDIOVASCULAR ŞI RESPIRATOR DE BROASCĂ

Dr. Metz Júlia, Dr. Orbán-Kis Károly, Dr. Szilágyi Tibor

SCOPUL LUCRĂRII

La această lucrare se doreşte investigarea funcţiilor cardiovasculare şi respiratorii la

broască. Analiza funcţionării in situ (in vivo) şi in vitro a organelor de broască reprezintă
metodă experimentală folosită pentru înţelegerea fiziologiei umane, broasca având sisteme
funcţionale foarte similare cu cele umane.
Scopurile definite ale lucrării sunt:
– demonstrarea mişcării ciliare la nivelul mucoasei respiratorii
– microcirculaţia de la nivelul patului unghial
– demonstrarea circulaţie arteriale şi venoase pe limba de broască
– înregistrarea activităţii mecanice şi electrice a inimii de broască, demonstrarea
efectului termic, a substanţelor inotrope şi cronotrope precum şi a variaţiei
concentraţiei ionilor asupra activităţii cordului de broască
– demonstrarea pragului de excitaţie şi a perioadelor refractare

Animalele de experienţă sunt manevrate doar de către asistent! Nu atingeţi şi

nu daţi mâncare sau de băut animalelor de experienţă!

PRINCIPII TEORETICE

Mişcarea ciliară. Toate căile respiratorii, de la cavitatea bucală/nazală şi până la bronhiolele

terminale, sunt menţinute umede de către un strat subţire de mucus ce tapetează întreaga
suprafaţă. Mucusul captează particulele mici din aerul inspirat, împiedicându-le să mai
ajungă în alveole. Mucusul este în continuare reînnoit datorită clearance-lui mucociliar.
Întreaga suprafaţă a căilor respiratorii este acoperită de un epiteliu ciliat, aproximativ 200
cili/celulă epitelială. Aceştia se mişcă în continuu cu o frecvenţă de 10-20 bătăi/s, iar direcţia
de mişcare a mucusului este spre faringe. Astfel, mucusul din căile respiratorii inferioare se
deplasează în sus, iar la nivelul cavităţii nazale în jos.

Figura nr. 1. Schema microcirculaţiei de la nivelul patului unghiei umane.

(adaptat după D. P. Allen et al. Acquisition and analysis of nailfold capillary
images)
8 Lucrări practice de fiziologie

Această mişcare continuă face ca stratul de mucus să se deplaseze încet, cu o viteză de

aproximativ 1 cm/min, spre faringe unde împreună cu particulele capturate este înghiţit sau
eliminat. Particularitatea anatomiei de broască este că epiteliul ciliat există şi în 1/3
superioară a esofagului.

Microcirculaţia. Din punct de vedere structural microcirculaţia cuprinde mai multe categorii
de vase: arteriole, venule, capilare (Figura nr. 1). Acestea pot fi vizualizate la om la nivelul
patului unghial în timp ce la broască pe limbă şi membrana interdigitală. Vizualizarea
microcirculaţiei la om permite numărarea arcurilor capilare, măsurarea diametrelor vaselor la
acest nivel şi determinarea vitezei de circulaţie prin metoda Doppler. Acestă metoda poate fi
folosită pentru diagnosticarea unor boli precum boala Raynaud, sclerodermia, etc.
Vizualizarea vaselor de la nivelul limbii de broască permite recunoaşterea arteriolelor, în care
circulaţia sângelui este în direcţia ramificaţiilor în timp ce în venule direcţia circulaţiei este
dinspre vase mici spre vene mai mari. În arteriole viteza sângelui este mai mare şi se
observă pulsaţii. Vizualizarea vaselor mari permite şi recunoaşterea circulaţiei laminare:
se observă fluxul axial de viteză mai mare şi fluxul parietal de viteză mult mai mică (Figura
nr. 2).

Figura nr. 2. Circulaţia laminară la nivelul arteriolelor (săgeţile din stânga

reprezintă viteza straturilor de lichid).

Activitatea electrică şi mecanică a inimii. Potenţialul de acţiune reprezintă răspunsul

electric al celulelor miocardice la acţiunea unui stimul a cărei intensitate depăşeşte valoarea
prag.

Figura nr. 3. Fenomenul electric şi mecanic (FRA – faza refractară absolută,

PA – potenţial de acţiune, MCG - mecanocardiogramă).
Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 9

Pe timpul potenţialului de acţiune miocardul este în perioadă refractară, în acest timp fibra
miocardică nu mai răspunde la stimuli electrici indiferent de intensitatea acestora. Potenţialul
de acţiune este urmat de contracţia celulelor miocardice după un scurt interval de timp
necesar cuplării electromecanice. Fenomenul mecanic şi electric au durată aproximativ egală
(Figura nr. 3). Datorită existenţei perioadelor refractare fenomenele mecanice nu pot fi
sumate şi astfel miocardul nu poate fi tetanizat. Succesiunea periodică a fazelor de
contracţie şi relaxare este esenţială pentru funcţia de pompă (fază de umplere şi ejecţie).

Modularea activităţii inimii.

1. Efectul termic: încălzirea sinusului venos creşte frecvenţa contracţiilor cardiace, iar
încălzirea ventriculilor creşte amplitudinea contracţiilor acestora. Răcirea sinusului
venos şi a ventriculilor scade frecvenţa respectiv amplitudinea contracţiilor. Atât
contracţia cât şi excitabilitatea sunt dependente de activitatea unor sisteme
enzimatice respectiv de modificarea conformaţiei unor proteine (canale ionice),
influenţate de temperatură.
2. Mediatorii chimici: adrenalina produce creşterea frecvenţei şi amplitudinii
contracţiilor prin acţiune asupra receptorilor adrenergici β1. Acetilcolina produce
scăderea frecvenţei şi amplitudinii contracţiilor cardiace prin intermediul receptorilor
colinergici muscarinici (M2). Prezenţa acestor receptori la nivelul fibrelor miocardice
face ca aplicarea mediatorilor sistemului nervos vegetativ pe inima denervată să
reproducă efectele stimulării simpatice, respectiv parasimpatice.
3. Concentraţia ionilor din spaţiul extracelular: creşterea concentraţiei Ca2+
extracelular are efecte "sistolizante", ducând la creşterea forţei de contracţie, în timp
ce relaxarea diastolică devine din ce în ce mai redusă, până la oprirea inimii în sistolă
prin acumularea calciului în spaţiul intracelular (fenomenul de "calcium rigor").
Creşterea concentraţiei K+ extracelular produce prin blocarea neselectivă a porurilor
externe a canalelor de Ca2+ şi Na+ scăderea amplitudinii contracţiilor, până când
inima se opreşte în diastolă (Figura nr. 4).

Figura nr. 4. Efectul concentraţiei ionilor asupra activităţii mecanice a inimii

de broască.

4. Efectul îndepărtării pericardului: deschiderea pericardului permite o

mişcare/expansiune mai a accentuată cavităţilor inimii ceea ce duce la creşterea
sensibilităţii mecanismului Frank-Starling şi o creştere a volumului bătaie.
Îndepărtarea pericardului duce la absenţa efectului vagal şi prin acesta la creşterea
frecvenţei cardiace.

METODA DE ÎNREGISTRARE SIMULTANĂ A FENOMENELOR ELECTRICE ŞI MECANICE

Pentru înregistrarea simultană a activităţii electrice şi mecanice a inimii de broască (Figura

nr. 5) se folosesc trei electrozi metalici. Primul este inserat la baza inimii, al doilea (un cârlig
10 Lucrări practice de fiziologie

metalic) este prins la nivelul vârfului inimii, iar ultimul reprezintă electrodul de pământare.
Înregistrarea activităţii electrice se realizează prin metodă bipolară şi amplificare diferenţiată.
Semnalul electric preluat este amplificat şi apoi digitalizat.

Figura nr. 5. Schema aparaturii necesare pentru înregistrare (explicaţii în

text).

Înregistrarea activităţii mecanice se efectuează cu ajutorul unui traductor mecano-electric

(Figura nr. 6). Pe scurt aceasta funcţionează pe principiul dinamometrului, alungirea
resortului elastic este proporţională cu forţa contracţiei. Miezul de ferită al bobinei este
conectat la vârful inimii prin intermediul cârligului metalic, astfel contracţiile cordului modifică
poziţia miezului şi prin aceasta proporţional inductanţa bobinei.

Figura nr. 6. Schema traductorului mecanoelectric (explicaţii în text).

Introducând un cârlig metalic prin vârful inimii aceasta străpunge atât spaţiul extracelular
(EC) cât şi cel intracelular (Figura nr. 7). Astfel se înregistrează un potenţial de leziune.
Potenţialul înregistrat seamănă calitativ cu ceea ce se obţine prin metoda intracelulară cu
microelectrozi dar există un curent extracelular (shunt) care distorsionează semnalul util,
deci va trebui micşorat.

Figura nr. 7. Înregistrarea potenţialului de leziune (explicaţii în text).

Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 11

Aceasta se efectuează prin creşterea rezistenţei spaţiului extracelular; alungirea fibrei

miocardice este realizată prin punerea sub tensiune a firului (vezi şi ecuaţiile):

V
I
R
L
R  
S
I – curent, V – diferenţa de potenţial, R – rezistenţa electrică, L – lungimea,
S – suprafaţa de secţiune, ρ – rezistenţa specifică a ţesutului

ASPECTE DE ANATOMIE ŞI FIZIOLOGIE DE BROASCĂ

Broasca este folosită pentru experimente întocmai pentru că are sisteme funcţionale similare
cu cele umane dar cu o sensibilitate a ţesuturilor mai scăzută faţă de hipoxie şi ischemie.
Principalele organe şi sisteme ce vor fi identificate în timpul disecţiei sunt prezentate într-un
fişier [.pdf] intitulat „Anatomia funcţională de broască” ce poate fi accesat prin situl Disciplinei
de Fiziologie (http://www.umftgm.ro/~fizio/edu/lp/data/anatomia_functionala_broasca.pdf).

Inima de broască prezintă anumite particularităţi anatomice faţă de inima umană (Figura nr.
8). Inima de broască se compune din patru compartimente: sinus venos, atrii, ventricul, bulb
aortic, care se contractă succesiv. În condiţii normale excitaţia se generează la nivelul
sinusului venos şi se conduce de la un compartiment la altul; dar fiecare compartiment
dispune şi de un pacemaker separat. În condiţii fiziologice, pacemakerul sinusului venos
generează frecvenţa cea mai mare, 60 bătăi pe minut, guvernând activitatea electrică a
inimii (overdrive suppression). Pacemakerul atrial poate genera un ritm de aprox. 50 bătăi pe
minut, cel ventricular un ritm de 25 bătăi pe minut, iar cel din bulbul aortic un ritm de 10 bătăi
pe minut. Între fiecare compartiment există o zonă joncţională la nivelul căreia conducerea
electrică este încetinită. La aceste nivele impulsul electric întârzie permiţând o umplere mai
bună a compartimentului următor şi prin acesta o hemodinamică mai eficientă. La om sinusul
venos este înglobat în peretele atrial, există un pacemaker sinoatrial (denumire ce denotă
originea filogenetică a acesteia) iar nodul sinoatrial este înconjurat de prima joncţiune (cel
dintre SV şi A la broască) ceea ce poate cauza blocurile sinoatriale.

LIGATURILE LUI STANNIUS

Prin ligaturile lui Stannius se poate studia conducerea intracardiacă a excitaţiei. Înconjurând
o zonă joncţională şi strângând aţa, se întrerupe mecanic conducerea impulsurilor electrice
de la un compartiment la altul. Prima ligatură a Iui Stannius se face cu un fir de aţă subţire la
nivelul limitei de separaţie dintre sinusul venos şi atrii. După prima ligatură a lui Stannius,
sinusul venos îşi continuă contracţiile cu frecvenţa iniţială, de aproximativ 60/min, ritm impus
de pacemakerul fiziologic, localizat la nivelul sinusului venos (ganglionul Remak, echivalentul
nodului sinusal la om), iar atriile şi ventriculul se opresc în diastolă. După câteva minute
acestea îşi reiau activitatea, dar cu o frecvenţă mai scăzută, de aproximativ 40/min; ritmul lor
fiind determinat de un pacemaker localizat la nivelul atriilor (ganglionul Ludwig, echivalentul
nodului atrioventricular la om). A doua ligatură a lui Stannius se face, cu păstrarea primei, la
nivelul limitei de separaţie dintre atrii şi ventricul. După a doua ligatură a lui Stannius, sinusul
venos se contractă cu frecvenţa iniţială, atriile se contractă cu frecvenţa dobândită în urma
primei ligaturi, în timp ce ventriculul, după o pauză de obicei mai lungă (timp în care se pot
determina perioadele refractare), îşi reia activitatea cu o frecvenţă mai scăzută, de
aproximativ 25/min, şi total asincron faţă de ritmul sinusal (se recreează astfel artificial blocul
12 Lucrări practice de fiziologie

atrioventricular gradul III la om). Ritmul ventricular este dat de ganglionul Bidder, localizat la
acest nivel.

Figura nr. 8. Compartimentele inimii de broască. Imaginea stânga sus –

poziţie anatomică, imaginea dreapta sus, inima cu vârful întors în sus pentru
vizualizarea sinusului venos. Schema de jos prezintă succesiunea celor
patru cavităţi precum şi poziţia ligaturilor Stannius. SV – sinus venos; A –
atriu; V – ventricul; BAo – bulb aortic; Ao – aorta; VCS – vena cavă sup.;
VCI – vena cavă inf.

DETERMINAREA PRAGULUI DE EXCITAŢIE ŞI STUDIUL PERIOADELOR REFRACTARE

Se ataşează la inimă un stimulator bipolar. Se stimulează inima după aplicarea ligaturii

Stannius II (în perioada liberă în care ventriculul încă nu şi-a reluat activitatea). Se începe
stimularea cu o intensitate minimă crescând treptat acesta până la apariţia primei contracţii.
Astfel se determină pragul de excitaţie. Dacă cordul nu şi-a reluat încă activitatea stimulăm
cordul cu două impulsuri succesive folosind cel puţin intensitatea minimă necesară iniţierii
potenţialului de acţiune. Apoi se scade treptat intervalul dintre impulsurile succesive până la
dispariţia celui de al doilea potenţial de acţiune. Astfel determinăm perioada refractară
absolută.
În cazul în care ventriculul şi-a reluat activitatea se captează cu ajutorul plăcii A/D potenţialul
de acţiune propriu al miocardului (generat de pacemakerul ventricular) acesta fiind folosit de
program ca un trigger pentru iniţierea stimulului electric. Stimularea cordului în prima parte a
potenţialului de acţiune nu produce nici un răspuns, acesta demonstrând existenţa fazei
Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 13

refractare absolute. La sfârşitul potenţialului de acţiune, miocardul fiind ieşit din faza
refractară, răspunde printr-o contracţie suplimentară numită extrasistolă. Ea este urmată de
o pauză mai lungă, numită pauză compensatorie; aceasta se datorează faptului că stimulul
normal următor pornit din pacemakerul ventricular, găseşte miocardul în fază refractară în
urma extrasistolei.

Folosind ghidul oferit pe următoarele pagini (Realizarea practică) răspundeţi

la întrebările din Fişa de lucru.

Stimulatoarele biologice pot genera stimuli cu amplitudine mare, care pot fi

periculoase dacă electrozii sunt aşezaţi în aşa fel încât curentul electric poate
să treacă prin cord! Stimulatoarele biologice pentru animale de experienţă nu
se utilizează niciodată la om! Nu atingeţi aparatura utilizată pentru
înregistrare sau stimulare decât în prezenţa şi la dorinţa expresă a
asistentului.
14 Lucrări practice de fiziologie

REALIZAREA PRACTICĂ

A. Examinarea microcirculaţiei umane. Circulaţia sângelui la om se poate vizualiza cu

ajutorul microscopului capilar. Microscopul capilar este de fapt un microscop de disecţie, la
care obiectul examinării este iluminat de sus. În acest caz se va folosi lumină de culoare
verde sau albastră. Se pune o picătură de glicerină pe patul unghial al inelarului. Se aşează
degetul pe masa microscopului în aşa fel, încât în câmpul vizual să apară limita dintre unghie
şi piele. Se începe de la mărirea minimă a microscopului (ocular 10x, obiectiv 0,63x). Se
creşte treptat mărirea microscopului. La o mărire de 40 de ori, se observă ansele capilare
(Figura nr. 9).

Figura nr. 9. Microcirculaţia la nivelul patului unghial (explicaţii în text).

B. Observarea circulaţiei sanguine pe limba de broască. Se cântăreşte broasca, după

care se înfăşoară cu ajutorul unei cârpe. Se injectează intraperitoneal uretan 20% în doză de
1ml/50g. Instituirea narcozei este semnalată de abolirea reflexului de întoarcere (broasca nu
se întoarce de pe spate în poziţie normală) şi lipsa reflexului cornean (broasca nu clipeşte la
atingerea corneei cu un obiect bont). Broasca se aşează pe o banchetă fixată în poziţie
orizontală cu ajutorul unui stativ. Limba trasă afară se fixează cu ace pe un placaj de plută
găurit la mijloc. Placajul de plută se aşează pe masa microscopului. (Figura nr. 10).

Figura nr. 10. Observarea circulaţiei sanguine pe limba de broască.

Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 15

Se examinează circulaţia sângelui cu obiectiv mic (10x). În cazul unei examinări îndelungate,
mucoasa se umezeşte periodic cu soluţie Ringer la temperatura camerei.

Soluţia Ringer pentru broască este o soluţie ce conţine clorură de sodiu,

clorură de potasiu, bicarbonat de sodiu şi glucoză (principalii ioni din spaţiul
extracelular în concentraţii fiziologice, sursă energetică, respectiv soluţie de
tampon pentru menţinerea pH) ce este utilizată pentru menţinerea în viaţă a
ţesuturilor în timpul experimentelor. Soluţia Ringer pentru broască a fost
utilizată pentru prima oară în 1882 de către Sidney Ringer (clinician şi
farmacolog britanic, 1836-1910). Variante ale acestei soluţii adaptate la
fiziologia diferitelor specii sunt utilizate şi astăzi atât experimental cât şi în
practica medicală.

C. Examinarea motilităţii ciliare pe broască. Broasca (deja) anesteziată se fixează din nou
într-o cârpă. Se introduce unul din tăişurile foarfecii în cavitatea bucală şi se îndepărtează
capul deasupra liniei ochilor (Figura nr. 11).

Figura nr. 11. Metoda de decapitarea a broaştei anesteziate.

Broasca se aşează pe planşeta de lemn. În continuare se lucrează cu capul îndepărtat al

broaştei. Pe mucoasa palatului se pune o mică picătură de soluţie Ringer ce conţine
particule de cărbune suspendat în ser fiziologic. După câteva minute se poate observa cu
ochiul liber cum particulele de cărbune se deplasează spre esofag.

D. Examinarea motilităţii ciliare pe broască la microscop optic. Din mucoasa palatului se

efectuează raclaj cu un bisturiu, se întinde pe o lamă degresată şi se umezeşte cu o picătură
de soluţie Ringer la temperatura camerei. Se examinează la microscop cu obiectiv de 10x şi
se observă mişcarea uniformă a cililor.

E. Disecţia broaştei şi identificarea organelor interne. Examinarea inimii. Se continuă cu

disecţia broaştei. Se fixează broasca în decubit dorsal pe o planşetă de lemn şi cu o pensă
chirurgicală se prinde pielea la nivelul abdomenului ridicând-o şi efectuând o incizie în formă
de "V". Se prelungeşte incizia până la nivelul claviculelor, care se secţionează, şi cu o
secţiune transversală se îndepărtează plastronul astfel pregătit. Se observă şi se identifică
organele. Cavitatea toracică şi cea abdominală nu sunt despărţite, broasca neavând
diafragm. Se vede inima în sacul pericardic, arterele şi venele mari precum şi plămânii. Dacă
plămânul mai conţine aer se observă structura acinară a plămânului. Se identifică organele
abdominale.
Se numără frecvenţa ventriculară a inimii în poziţie anatomică. Cu o pensă fină se prinde
pericardul (vizualizat ca o membrană fină albă mulată pe cord) şi se secţionează având grijă
să nu se lezeze inima. Se numără frecvenţa ventriculară după deschiderea sacului
pericardic. Inima se observă în poziţie anatomică şi întors în sens cranial, cu vârful ridicat
sus cu ajutorul unei pense fine, după secţionarea ligamentului posterior al inimii. Se identifică
16 Lucrări practice de fiziologie

cavităţile inimii şi se examinează contracţia succesivă a cavităţilor. În continuare se

examinează efectul termic aplicând soluţie Ringer rece şi apoi caldă direct pe inimă. După
aplicarea diferitelor soluţii se măsoară frecvenţa ventriculară. În continuare se îndepărtează
inima prin excizare cu foarfecă la nivelul vaselor mari de la baza inimii şi se aşează într-un
vas Petri în soluţie Ringer, notând frecvenţa ventriculară. Apoi se adaugă adrenalină în vasul
Petri şi se observă schimbarea frecvenţei ventriculare. Dacă după îndepărtarea inimii acesta
s-a oprit, se aplică stimulare mecanică cu un ac bont.

F. Examinarea motilităţii ciliare pe esofagul de broască. După îndepărtarea inimii se

identifică esofagul, stomacul şi intestinele, observând motilitatea intestinală. Se identifică
ficatul cu vezica biliară şi splina. Ridicând intestinele, se văd rinichii cu glandele suprarenale,
vezica urinară şi organele genitale. Se prepară esofagul broaştei, din partea superioară se
taie o bucată de cca. 0,5 cm, care se trage pe o pipetă de sticlă gradată şi se fixează în
poziţie orizontală. După câteva minute se observă deplasarea bucăţii de esofag ca urmare a
mişcării cililor.

G. Înregistrarea activităţii mecanice şi electrice ale inimii de broască. Broasca

anesteziată, decapitată, despinalizată se aşează pe spate, se prepară (prin metoda deja
descrisă) şi se îndepărtează plastronul sternal, vizualizând inima. Se deschide pericardul. Se
aşează electrozii, cârligul metalic fiind inserat la nivelul vârfului inimii. Inima se ridică punând
sub tensiune firul traductorului mecano-electric. Se înregistrează simultan activitatea
electrică şi mecanică a cordului în condiţii bazale cu ajutorul calculatorului. Continuând
înregistrarea se aplică mai întâi soluţie Ringer încălzită la 40°C şi soluţie Ringer de la
gheaţă, iar apoi diverşi mediatori chimici (adrenalină, acetilcolină) şi electroliţi (Ca2+ şi K+)
observând efectele. Se aplică apoi ligaturile lui Stannius şi se observă efectul acestora
asupra activităţii cordului. Se ataşează electrodul stimulatorului la inimă şi se determină mai
întâi intensitatea minimă de curent necesară atingerii potenţialului prag (şi iniţierii
potenţialului de acţiune) iar apoi se determină perioada refractară. În cazul în care ventriculul
îşi reia activitatea spontană se demonstrează extrasistola şi pauza compensatorie.