CURS 3

GENETICA

UMANĂ
1
21/10/11
21/10/11
STRUCTURA
GENELOR

4
 U.M.F IAŞI

1. GENA - UNITATE DE STRUCTURĂ A

MATERIALULUI GENETIC

 GENA = un segment de cromozom,

GENA X
precis delimitat,
continuu (indivizibil), CARACTER
ocupă o poziţie fixă,
locus
X

numită locus*
determină un anumit caracter
---------------------------
* Plural = loci Cromozom

5
 U.M.F IAŞI Polialelie
O genă (A) → mai multe mutaţii
diferite → alele multiple (A1, A2, A3…),
GENA
GENE ALELE. POLIALELIE cu efecte fenotipice (N sau An)
Cromozom
limitate la acelaşi caracter.

PROTEINĂ Locusul ABO :

alele A1, A2, B şi O
CARACTER
mutaţie 1 mutaţie 2
Culoarea ochilor
(ochi negri)

Gene alele
M1  O genă normală poate M2

Variantă / alelă suferi o mutaţie * ce

Variantă / alelă
normală produce o variantă a anormală
genei numită alelă.
 ALELA este o formă
alternativă a genei.
- ocupă acelaşi locus,
OCHI ALBAŞTRI ALBINISM OCULAR
- influenţează acelaşi
caracter*

6
 U.M.F IAŞI

GENE ALELE. POLIALELIE

 Un caracter (fenotip) va fi determinat

de o pereche de gene alele (genotip)
situate în aceeaşi poziţie (locus) pe
cromozomii omologi.
 Genele alele segregă în meioză:
 gameţii (haploizi) sunt “puri genetic”
(posedă o singur alelă);
 Genele alele situte pe o pereche de crz.
omologi (ex., Dd) segeregă (în meioză)
independent de genele alele situate pe
altă pereche (ex., Mm) formându-se
gameţi cu combinaţii genice diferite.
7
U.M.F IAŞI

HOMOZIGOT. HETEROZIGOT. HEMIZIGOT

 Genele alele (N sau A), ce ocupă loci omologi, pot fi :

 identice (NN sau AA) → HOMOZIGOT
 diferite (Na sau An) → HETEROZIGOT
( A1A2 ) → HETEROZIGOŢI COMPUŞI
 La bărbaţii XY o genă “autozomală” de pe X nu are echivalent
a
pe Y → genotip HEMIZIGOT (X Y)

8
 U.M.F IAŞI

DOMINANT. RECESIV. CODOMINANT

 La heterozigoţi, genele alele diferite

se pot manifesta fenotipic diferit,
în funcţie de "forţa" lor de expresie.
 Gena şi caracterul care se Genotip→Fenotip
manifestă la heterozigoţi sunt A1A1 → A1
numite dominante. A1A2 → A1
Na → caracter N Ex., Genele ABO
A1 o → A1
An → caracter A [(A1>A2)=B]>0 B B →B
 Gena (a sau n) care NU se B o → B
manifestă la heterozigoţi se A1B → A1B
numeşte recesivă; A2B → A2B
ea se exprimă numai la 00 → 0
homozigoţi (aa sau nn).
A2A2  A2
 Dacă ambele gene alele se
A20  A2
manifestă fenotipic la heterozigoţi →
codominante 9
 U.M.F IAŞI

2. FENOMENELE DE ÎNLĂNŢUIRE GENICĂ (LINKAGE) ŞI

ÎNCRUCIŞARE CROMOZOMIALĂ (CROSSING-OVER)

 Un cromozom = mai multe gene gene

nealele A

- situate în loci distincţi

- dispuse liniar ("în monom") B

- determină caractere ≠ C

 Prezenţa a două sau mai multe gene D

distincte pe acelaşi cromozom se

numeşte SINTENIE. E

cromozom

10
 U.M.F IAŞI
a). ÎNLĂNŢUIREA GENICĂ (LINKAGE)

 Genele nealele,
- situate foarte aproape una de alta pe
acelaşi cromozom, D d

- nu segregă (nu se separă) în meioză şi M m

- se transmit împreună (“în bloc”) de la

părinţi la descendenţi.
meioză
D d
Acest fenomen se numeşte ÎNLĂNŢUIRE m
GENICĂ ("linkage") M

 Fenomenul de înlănţuire se referă la gameţi

LOCI şi nu la alele.
 Ex., locusul D (pentru o boală genetică)
este înlănţuit cu un locus marker (ce are
variantele alelice M şi m);
în unele familii alela D este înlănţuită cu 11
alela M iar în altele d cu m.
 U.M.F IAŞI

ÎNLĂNŢUIREA GENICĂ (LINKAGE)

Genele dintr-o regiune cromozomială care se transmit

împreună formează un grup de înlănţuire sau un
HAPLOTIP.

gene marker

Ex., genele din

regiunea HLA

(cromozomul 6p)

12
 U.M.F IAŞI

DEZECHILIBRUL DE ÎNLĂNŢUIRE

 Uneori o genă mutantă (morbidă) (B) se

asociază mai frecvent cu o anumită alelă a
locusului marker = asociere alelică
preferenţială sau dezechilibru de Hemocromatoza ereditară
înlănţuire
 Boală ereditară (AR)
frecventă, 1:400
 Ex.: 85% dintre bolnavii cu hemocromatoză  Absorbţie crescută de fier
ereditară (HE) din Europa au o mutaţie ce produce acumulare
unică (în codonul 282 din gena HFE) care excesivă de fier în ficat
se asociază cu alela HLA A3 (ciroză), cord (insuficienţă
cardiacă), pancreas
Explicaţie: cei mai mulţi bolnavi cu HE (diabet), piele
provin dintr-un strămoş comun (“efect de (pigmentaţie bronzată),
fondator”) care a avut gena mutantă glande endocrine.
asociată cu HLA A3  Gena HFE pe cromozomul
 Prezenţa mutaţiei HE a avut efecte benefice 6p lângă gena HLA A
în trecut, când alimentaţia era săracă în fier
13
21/10/11
U.M.F IAŞI

APLICAŢII PRACTICE A FENOMENULUI DE ÎNLĂNŢUIRE GENICĂ

Diagnosticul (prenatal sau presimptomatic) al

unor boli genetice
prin studiul transmiterii unei gene marker , uşor de
identificat, înlănţuită cu gena mutantă (gena morbidă)

15
 U.M.F IAŞI

Exemplu de DIAGNOSTIC PRENATAL prin

înlănţuire genică

INTERSEXUALITATE
PHF prin deficit de
21-hidroxilază (AR)
16
 Hipofiză Hiperplazie
suprarenaliană
Secreţie crescută de ACTH
Mecanism de feed-back

SUPRARENALĂ
negativ

Deficit de 21-hidroxilază

Blocarea sintezei Blocarea sintezei de Conversia cvasicompletă a

de glucocorticoizi mineralocorticoizi colesterolului în androgeni

Deficit de cortizol Deficit de aldosteron Exces de androgeni

Răspuns inadecvat Pierdere renală de NaCl Masculinizare prenatală a organismelor

la infecţii şi stress şi apă. masculine şi feminine
Hipotensiune arterială

17
U.M.F IAŞI

DIAGNOSTIC PRENATAL
prin înlănţuire genică

?
Risc 25%

INTERSEXUALITATE
PHF prin deficit de
21-hidroxilază (AR)
18
 U.M.F IAŞI

Diagnosticul prenatal al unor boli genetice:

 identificarea mutaţiei (aa) la făt → posibil dar
presupune cunoaşterea prealabilă a mutaţiei la copilul
bolnav; laborioasă şi scumpă
 studiul transmiterii unei gene marker , uşor de
identificat, înlănţuită cu gena mutantă (gena morbidă)

 gena pentru enzima 21 hidroxilază (CYP21B) este localizată

pe cromozomul 6p şi se transmite strâns înlănţuită cu gena B
a complexului HLA (genă marker cu mai multe alele)

19
 U.M.F IAŞI

 Transmiterea genei mutante pentru 21-hidroxilază

într-o familie şi diagnosticul molecular al bolii
(transmisă AR) se pot stabili prin analiza genei
marker HLA-B, cu care gena mutantă este strâns
înlănţuită.

?
Risc 25%

20
 U.M.F IAŞI

 Transmiterea genei mutante pentru 21-hidroxilază

într-o familie şi diagnosticul molecular al bolii
(transmisă AR) se pot stabili prin analiza genei
marker HLA-B, cu care gena mutantă este strâns
înlănţuită.

?
Risc 25%

21
U.M.F IAŞI

 Valoarea diagnostică a înlănţuirilor genice dintre un

locus boală şi un locus marker a început să fie larg
utilizată după 1980 prin folosirea markerilor ADN
polimorfici .

22
 U.M.F IAŞI

b). ÎNCRUCIŞARE CROMOZOMIALĂ (CROSSING-OVER)

 Înlănţuirea genică NU este un

fenomen absolut → numai
D d
genele situate foarte aproape
una de alta se transmit totdeauna M m
împreună, înlănţuite.

 Genele situate la distanţă una de

alta, pe acelaşi cromozom pot fi CO Profaza
separate prin fenomenul de meioză I

încrucişare cromozomială sau

crossing-over (în profaza
d
meiozei primare). D

m Gameţi M

recombinanţi 23
 U.M.F IAŞI

ÎNCRUCIŞARE CROMOZOMIALĂ (CROSSING-OVER)

 MECANISM CO:
- sinapsa (“genă la genă”) a
cromozomilor omologi (în zigoten);
- încrucişarea cromatidelor (“chiasmă”);
- ruperea lor la locul de contact +
schimb EGAL de gene
- rezultă o nouă dispoziţie a genelor
parentale = RECOMBINARE GENICĂ
OMOLOAGĂ.
 Recombinarea genică omoloagă – SURSĂ
IMPORTANTĂ DE VARIABILITATE.
24
 U.M.F IAŞI

 CARACTERISTICILE CO:
 Recombinările genice omologe,
produse în meioză prin CO, sunt
fenomene aleatorii şi
imprevizibile;

 frecvenţa de producere a CO între

două gene/ loci este direct
proporţională cu distanţa fizică
dintre ele; aplicaţii – în
cartografierea genică.

25
 U.M.F IAŞI

IMPORTANŢA CUNOAŞTERII CO

 CO INEGAL:
împerechere greşită a unor secvenţe
asemănătoare dar neomologe, situate
pe cromosomii omologi → prin CO →
schimbul inegal de segmente →
deleţii şi duplicaţii genice.
 RECOMBINARE OMOLOAGĂ NEALELICĂ →
BOLI GENOMICE.

26
U.M.F IAŞI

B. CONCEPŢIA ACTUALĂ DESPRE

STRUCTURA GENEI

GENA = un ansamblu liniar de secvenţe

nucleotidice de ADN necesar pentru a produce
un produs funcţional: un polipeptid sau o
moleculă de ARN
Gena este o unitate de transcripţie.
Genele :
 segmente de ADN,
 imprecis delimitate
 divizibile = structură discontinuă
 ocupă un locus distinct

27
1. ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFICĂ PROTEINE
 o regiune centrală, transcrisă integral în ARN mesager
precursor, numită "cadrul de lectură" al informaţiei
genetice → necesară pentru sinteza proteinei;
 două părţi laterale, netranscrise, cu rol reglator

28
 U.M.F IAŞI
ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFICĂ PROTEINE

1.1.REGIUNEA CENTRALĂ
Situs de
iniţiere al
 transcrisă integral în ARN transcripţiei
mesager precursor (“ORF*”);
codon iniţiator
 alternanţa de secvenţe
codante = exoni şi
necodante = introni
 Începe cu:
- situsul de iniţiere al
transcripţiei (SIR sau
INR) şi
- regiunea netranslată
5’UTR ce se încheie cu
codonul iniţiator ATG
5’-CCAGCCATG-3’
29
* ORF= open Reading Frame
 U.M.F IAŞI

REGIUNEA CENTRALĂ A GENEI

EXONII
secvenţe
transcrise în
pre ARNm şi
păstrate în
ARNm matur.
Regiuni
codante pt
anumite părţi
din proteină =
domenii.
30
 U.M.F IAŞI

INTRONII REGIUNEA CENTRALĂ A

(secvenţe intercalare=IVS) GENEI
 Secvenţe necodante
 Transcrise iniţial în
preARNm şi apoi
decupate precis şi
îndepărtate din ARNm
matur, alcătuit numai din
asamblarea exonilor
(“matisare”)
 încep cu 5’ GT şi
sfârşesc cu AG 3’ –
semnale pentru enzimele
implicate în matisare
→decupare precisă.
 Rol puţin cunoscut →
intervin probabil în
matisarea alternativă
(selecţia anumitor exoni)

31
 U.M.F IAŞI

 Regiunea centrală se REGIUNEA CENTRALĂ A GENEI

termină cu o secvenţă
3’UTR necodantă ce
conţine:
 Unul din codonii stop
(TAA; TAG, TGA)
 Situsul de terminare al
transcripţiei (AATAAA)
 Situsul de poliadenilare
– locul de desprindere a
moleculei de ARNm
sintetizată şi adăugare
unui segment
poliadenilic (rol în
stabilitatea şi transportul
ei din nucleu)

32
 U.M.F IAŞI
ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFICĂ
PROTEINE

1.2. REGIUNILE
LATERALE

 Flanchează
regiunea
centrală (ORF)

 Netranscrise

 Rol de reglare
a transcripţiei
33
 U.M.F IAŞI

ANATOMIA UNEI
GENE CARE
CODIFICĂ PROTEINE

a). Regiunea laterală 5' - (în amonte de ORF)

 3 situsuri:
 PROMOTOR
 Situs de specificitate tisulară
 Situs de modulare a activităţii genice
 Serveşte la:
 iniţierea transcripţiei - (fixarea ARN polimerazei)
 reglarea anumitor gene în anumite ţesuturi (specificitate tisulară),
în anumite stadii de dezvoltare (specificitate temporală) sau la
anumite semnale / stimuli din mediu (ex. hormoni)
 Reglarea intensităţii transcripţiei 34
 U.M.F IAŞI
REGIUNEA LATERALĂ
5’

 PROMOTORUL conţine mai multe

elemente sau module pe care se
ataşează proteine reglatoare
(trans-activatoare) numite factori de
transcripţie (TF II);

 TF se fixează la miezul promotorului

(TATA; CAAT; GC) şi are rolul să
fixeze, să poziţioneze şi să
activeze ARN polimeraza II, astfel
ca transcripţia să înceapă exact la
SIT, cu primul nucleotid (+1)
 Alţi TF reglează specificitatea
tisulară, răspunsul la semnale şi
intensitatea transcripţiei
35
U.M.F IAŞI

b. REGIUNEA LATERALĂ 3’

 Regiunea laterală 3' - situată în aval de cadrul de

lectură al genei.
 o secvenţă netranscrisă, imprecis delimitată şi
cunoscută,
 rol structural şi funcţional.
 În această regiune se găsesc secvenţe semnal care
afectează procesarea, stabilitatea şi durata de viaţă a
ARNm.

36
 U.M.F IAŞI

2. TIPURI DE GENE

2.2. Gene unice şi familii de gene

2.1. Gene comune şi gene
specifice
 Gene comune - ubicuitare
(“housekeeping genes”)
 Se exprimă în toate celulele.
 Codifică proteine
indispensabile funcţiilor celulare
fundamentale.
 Transcripţie continuă, la nivel
scăzut.
 Gene specifice:
 Expresie limitată spaţial
(anumite ţesuturi / celule) sau
temporal (anumite stadii)
 Codifică proteine specifice
 Majoritatea genelor sunt unice,
puţine sunt duplicate
 Unele copii ale genelor unice
sunt nefuncţionale (gene
trunchiate; fragmente de gene;
pseudogene)
 Familii de gene:
 Au o structură identică
 Produc proteine asemănătoare
 Au o origine comună (prin
duplicaţia unei gene ancestrale
37
EXOM ? GENOM

21/10/11
 U.M.F IAŞI

C. METODE DE CLONARE ŞI ANALIZĂ A GENELOR

(TEHNOLOGIA ADN)

 Până în 1970 genele erau entităţi materiale inaccesibile analizei

directe :
 dimensiuni foarte mici
 imposibilitatea obţinerii unei cantităţi suficiente de material pentru
studiu.
 După 1970 s-au descoperit:
 enzimele de restricţie, veritabile "bisturie" genetice, cu ajutorul cărora
a devenit posibilă secţionarea ADN şi izolarea genelor.
 tehnici de amplificare a unui fragment specific de ADN = clonarea
genelor (celulară sau acelulară – PCR).
 tehnici de analiză şi secvenţiere
39
U.M.F IAŞI

TEHNOLOGIA ADN
a inaugurat “era ingineriei
moleculare” cu multiple şi
importante aplicaţii practice:
• analiza structurii, cartografierii
lu funcţiei genelor;
• elucidarea patogeniei bolilor
genetice şi dobândite (infecţii,
cancere);
• diagnosticul bolilor:
preimplantator, prenatal,
presimptomatic;
• biosinteza unor molecule
terapeutice (insulină, hormon de
creştere, eritropoietină etc)
• tratamentul bolilor genetice şi
terapia genică 40
 U.M.F IAŞI

1. OBŢINEREA UNOR GENE SAU

FRAGMENTE DE ADN

Trei metode:

(1). Secţionarea ADN

genomic, cu ajutorul
enzimelor de restricţie;

Enzimele de restricţie (Pr.

Nobel, 1978) – recunosc şi taie
ADN la nivelul unor secvenţe
nucleotidice specifice
(“situsuri de restricţie”)
producând fragmente de ADN
cu capete adezive.
41
 U.M.F IAŞI

OBŢINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(2). Obţinerea de ADN

complementar unei
molecule de ARNm, cu
ajutorul transcriptazei
inverse

Transcriptaza inversă (Pr.

Nobel, 1975) – sintetizează o
catenă de ADNc pe baza unei
molecule de ARNm extrasă din
celule.

42
 U.M.F IAŞI

OBŢINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(3). Sinteza artificială (chimică) a unor fragmente de

ADN prin polmerizarea dezoxiribo-nucleotidelor într-o
ordine determinată anterior (de ex., pe baza
secvenţei de aminoacizi şi codului genetic).

Fragmentele de ADN vor fi utilizate

ca sonde sau amorse în alte tehnici.

43
 U.M.F IAŞI

2. CLONAREA ADN

 Clonarea ADN este amplificarea selectivă a unei

gene sau fragment de ADN – prin multiple runde de
replicare – care vor produce un număr mare de copii a
fragmentului respectiv, ce vor permit analiza structurii şi
funcţiei sale.
 2 tipuri majore de clonare:
 Celulară, in vivo, utilizează mecanismul natural de replicare
a unor fragmente de ADN – obţinute prin diferite metode şi
introduse cu ajutorul unor vectori (plasmide, bacteriofagi,
cromozomi artificiali) în celule gazdă (bacterii, levuri)
 Acelulară, in vitro, folosind o reacţie de plomerizare în lanţ
(PCR)
44
 U.M.F IAŞI

CLONAREA ADN ÎN CELULE

Clonarea ADN in vivo utilizează

mecanismul natural de
replicare al ADN în celule
Ea permite multiplicarea unor
segmente de ADN introduse în
celule cu ajutorul unor vectori
• formarea ADN recombinant, prin
ataşarea in vitro a fragmentelor de
ADN uman la "un vector sau
replicon " capabil de replicare
independentă;
 transferarea moleculelor de
ADN recombinant în celule gazdă,
în care vectorul recombinant se
replică independent de
cromosomul celulei gazdă;
 amplificarea sau producerea de
clone celulare multiple.
45
izolarea clonelor de ADN
recombinant.
 U.M.F IAŞI

1.3. CLONAREA ACELULARĂ A ADN (metoda PCR)

 Foloseşte tehnica "polymerase

chain reaction" (PCR) (Mullis şi
Smith; Premiul Nobel, 1993)
 se poate amplifica selectiv o
secvenţă scurtă de ADN sau ARN.
 Amplificarea se realizează pe baza
principiului extensiei unei amorse
("primer").
 PCR este o reacţie în lanţ deoarece
catenele de ADN nou sintetizate
vor acţiona ca matriţe pentru
sinteza ADN în ciclurile următoare.
 Amplificarea este considerabilă (de
miliarde de ori) şi rapidă (în câteva
ore), fiind integral automatizată.
46
 U.M.F IAŞI

2. METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI

În medicina practică analiza directă a genei sau

produselor sale este folosită pentru:

 studiul patologiei moleculare;

 diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al
unor boli, chiar şi atunci când gena şi efectele ei nu sunt
cunoscute sau nu sunt evidente;
 recunoaşterea unei infecţii virale.

47
 U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII

 Pentru a identifica o genă este necesară o sondă

genotipică adecvată care să permită:
 fie recunoaşterea genei (sonde directe)
 fie recunoaşterea unor markeri genotipici (secvenţe
necodante) situaţi în vecinătatea genei (sonde
indirecte).

 Această recunoaştere se realizează pe principiul

hibridizării moleculare a acizilor nucleici.

48
 U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII

 Hibridizarea moleculară se bazează pe capacitatea unor

sonde monocatenare de acid nucleic de a forma, pe
bază de complementaritate, molecule bicatenare cu o
secvenţă de acid nucleic “ţintă” (monocatenar).

Fragment ADN:
...T T A T A C G G T C A T C G T C G C A T G C T A G
        
A T* G C C A*G T A
Sondă oligonucleotidică marcată

 Pentru a identifica şi izola hibridul molecular sonda este

marcată cu un trasor radioactiv (32P) sau cu un compus
fluorescent.
49
 U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI:

TEHNICI

a). Analiza ADN genomic uman

prin metoda de transfer
Southern
b). Analiza cu sonde oligo-
nucleotidice specifice unei
alele (ASO) (dot blot).
c). Analiza ARNm prin Northern
blot.
d). Analiza proteinelor prin
Western blot.
e). Secvenţierea unor gene
50
21/10/11
21/10/11
21/10/11
21/10/11
21/10/11
 SECVENTIERE SANGER

21/10/11
21/10/11
21/10/11
21/10/11
21/10/11
21/10/11