GENETICA GENERALA

LUCRARI PRACTICE

CUPRINS

1. Ciclul celular mitotic

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza

2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare
2.1.1. Metoda rapidă Feulgen de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n =
16)
2.1.2. Metoda rapidă de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n=16) în
mitoză cu soluţie carmin-acetică
2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

3. Meioza

4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza

4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante

5. Cariotip si idiograma
5.1. Definirea termenilor, nomenclatură

6. Ploidia la plante

7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante

8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura

8.1. Studiul aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la unele plante de cultură

9. Drosophila melanogaster – obiect de studiu in genetica

9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster
8.1.1. Cromosomii uriaşi
8.1.2. Cromosomii somatici

Bibliografie
 1. Ciclul celular mitotic
În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive,
prin care sunt dublate structurile funcţionale ale celulei, esenţială fiind dublarea cromosomilor, şi
evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicaţiei este repartizat celulelor fiice
(Tudose, 1992).
Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaţională, este modalitatea de diviziune celulară
prin care, dintr-o celulă somatică rezultă două celule fiice cu număr egal de cromosomi, atât între
ele, cât şi cu celula mamă. Mitoza este diviziunea celulară care are loc în celule somatice şi
asigură transmiterea fidelă a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi însă, diferite influenţe
care adaugă aparentei stabilităţi a caracterelor, noi valenţe. Ciclul celular mitotic, la plante şi
animale, cuprinde în principal următoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (şi a
centrozomului la animale) şi deplasarea spre poli a cromosomilor fii, după care, urmează
diviziunea citoplasmei. În procesul mitozei se organizează aparatul mitotic alcătuit din structuri
cromatice şi acromatice, care este complet în metafază. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare
proteine specifice, a căror sinteză necesită un mare consum de energie.
Totalitatea proceselor prin care trece celula somatică de la formare şi până la scindarea ei
în două celule fiice, cu număr de cromosomi egal cu numărul de cromosomi al celulei din care au
provenit, alcătuiesc ciclul celular.
Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre două diviziuni succesive) şi cele
patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise - profaza, metafaza, anafaza şi telofaza având o
durată variabilă, în funcţie de specie, tipul de celule, temperatură etc., de la câteva ore, la zeci şi
sute de ore.
Interfaza
Interfaza are cea mai mare durată în timp în ciclul mitotic şi este caracterizată de procese
de biosinteză. Durata interfazei este variabilă, de la câteva ore până la zile. La plante, la un ciclu
tipic de 20-24 de ore, mitoza durează 70-110 minute (profaza = 30 - 45 min., metafaza = 5 - 10
min., anafaza = 15 - 20 min. şi telofaza = 20 - 30 min.) (Toma şi Niţă, 1995). La celula animală, un
ciclu tipic durează 18 - 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (în general
variază cel mai mult), faza S (timpul necesar replicării genomului) durează 6 - 8 ore, iar faza G2
este, de regulă, cea mai scurtă (mai ales când mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei
durează mai puţin de o oră (Lewin, 1994).
Cercetările microfotografice şi microradiografice au demonstrat că interfaza este foarte
puţin activă din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activă din punct de vedere metabolic;
cantitatea de ADN se dublează de la 2C la 4C. Pe baza acestor observaţii, Howard şi Pelc, în
1953 au împărţit interfaza în trei perioade:
- perioada G1 (engl. gap = gol) – perioadă presintetică, în care nu are loc sinteza de ADN,
ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizează ARN (în special
ARNm) şi proteine;
- perioada S (engl. synthesis = sinteză) – perioada de sinteză a ADN; până la sfârşitul fazei
S toată cantitatea de ADN se replică (pe parcursul fazei S cantitatea totală de ADN creşte de la 2C
la 4C). La sfârşitul acestei perioade, cromosomii sunt alcătuiţi din două cromatide foarte lungi şi
subţiri;
- perioada G2 – perioadă postsintetică, când sinteza ADN se opreşte; are loc biosinteza
proteinelor şi a ARN, care se desfăşoară şi în celelalte perioade ale interfazei. Celula conţine
cromosomi bicromatidici.
 2cADN
diviziunea
celule
mitotică
fiice

2cADN
4cADN

interfaza

2cADN

Fig. 1. Ciclul celular mitotic (după Alberts şi colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidrataţi, despiralizaţi şi nu se observă la

microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului în interfază, în celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (după Hartl şi
Jones, 1998)

În afară de celulele la care ciclul mitotic se desfăşoară în mod normal, există celule în
repaus sau în perioada G0, asemănătoare fazei G1, dar diferită prin faptul că celulele nu pot intra în
faza S. În faza G0 intră celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla în repaus în faza 4C
(exemplu: celulele embrionare din seminţe), astfel încât, intră direct din G0 în G2; alteori, din G0 pot
intra în G1 timpuriu (Lewin, 1994).
În explicarea cauzelor ce determină intrarea celulei în diviziune mitotică (trecerea din G 2 în
mitoză) există diferite ipoteze. Se pare că declanşarea mitozei este determinată de modificarea
raportului nucleu / citoplasmă.
Profaza
În profază au loc procesele: mărirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor,
stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariţia nucleolilor şi
formarea fusului acromatic.
La începutul acestei faze, cromosomii se prezintă sub formă de filamente subţiri, lungi,
alcătuind un spirem. În profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun în tot spaţiul nuclear (în celulele vii se
observă uşor, având indicele de refracţie 1,50 faţă de cel al carioplasmei de 1,37). În profaza târzie
(Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor creşte şi ei devin mai scurţi şi mai compacţi, apărând
formaţi din două cromatide, foarte apropiate între ele şi înfăşurate una în jurul celeilalte. La
începutul profazei, are loc o primă spiralizare a cromosomilor denumită “spiralizarea mică”, ce se
realizează prin micşorarea numărului de spire şi mărirea diametrului lor. Spre sfârşitul profazei, are
loc a doua spiralizare denumită “spiralizare somatică”, în care numărul de spire continuă să scadă,
ele apropiindu-se tot mai mult.
În profază, distanţa dintre cromosomi creşte treptat şi are loc dezorganizarea nucleului şi a
membranei nucleare, dispariţia nucleolilor şi formarea fusului mitotic. Centriolii migrează spre polii
celulei, plasându-se în două puncte opuse. Între centrioli se organizează fusul de diviziune (fus
acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alcătuit dintr-un număr mare de filamente, cu extremităţile
inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul căruia se realizează
distribuirea egală a cromosomilor în cele două celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de
două tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiţionează
structura fusului şi filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate şi pleacă de la
centromerul fiecărui cromosom şi înaintează simultan, cu aceeaşi viteză, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază
timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază
târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Stadiul final al profazei – prometafaza, se caracterizează prin totala dezorganizare a

membranei nucleare, care se fragmentează în porţiuni relativ mari, ce păstrează infrastructura de
membrană dublă şi rămân, în parte, în interiorul fusului de diviziune, participând mai târziu la
formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercită mişcări neregulate între polii celulei şi
planul ecuatorial al acesteia.
Metafaza
În această fază are loc desăvârşirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizaţi la maxim,
se dispun în placa ecuatorială metafazică (Fig.5). Mişcarea de dispunere a cromosomilor în placa
ecuatorială, la distanţă egală de polii fusului de diviziune prezintă trei componente:
 adunarea cromosomilor într-o poziţie de echilibru între cei doi poli, mişcare datorată
interacţiunii între polii fusului şi centromeri;
 orientarea cromosomilor în placa ecuatorială astfel ca, centromerii să fie situaţi în axul
longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;
 distribuirea cromosomilor în placa metafazică se realizează în jurul unui fus central gol
(în secţiune transversală apare ca un halo), cromosomii fiind dispuşi la periferia fusului, cu braţele
orientate în afară.
Morfologia cromosomilor se studiază în metafază, deoarece în această fază ei sunt
condensaţi în cel mai înalt grad. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide şi prezintă în
lungul acestora, spre sfârşitul metafazei, o fisură longitudinală, care reprezintă spaţiul dintre cele
două cromatide surori. La sfârşitul metafazei (Fig.6), cromatidele surori încep să se separe
(clivarea longitudinală), făcându-se trecerea spre anafază.
 Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în
metafază timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în
metafază târzie(după Hartl şi Jones, 1998)
Anafaza
Anafaza se caracterizează prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii şi
migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debutează în anafaza timpurie,
când are loc clivarea centromerilor, cromatidele rămânând încă apropiate unele de altele. O dată
terminată clivarea centromerilor, începe separarea cromatidelor în lungul fisurii longitudinale
evidenţiate în metafază (Fig.7). După Lewin (1994), la celulele animale, în anafază, centromerul
este duplicat funcţional. Când şi acest proces se încheie, cromatidele fiice, fiecare cu câte un
centromer propriu, încep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii.
Se admite că mişcarea cromosomilor spre poli este o consecinţă a scurtării filamentelor
fusoriale de sprijin, care leagă polii fusului (prin pierderea sau adiţia de tubulină din microtubuli).
Alungirea determină stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat în mişcarea
cromosomilor spre poli. Această mişcare este posibilă datorită existenţei în structura fusului mitotic
a unor proteine de natură actinică. În cazul în care setul de cromosomi migrează aproape perfect
sincron, se formează “placa anafazică” sau “dublul aster”. Chiar dacă mişcarea cromosomilor nu
este sincronă, ea nu începe decât după ce toţi cromosomii sunt plasaţi în placa ecuatorială.
În celulele animale, de regulă, autosomii migrează concomitent, iar heterosomii au o viteză
de migrare diferită. În celulele plantelor, spre sfârşitul anafazei, fusul mitotic se măreşte în volum în
regiunea ecuatorială şi ia formă de butoiaş, formând ulterior fragmoplastul.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază
timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)
Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază
târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Telofaza
Telofaza este ultima fază a mitozei, caracterizată prin prezenţa fenomenelor opuse celor
din profază. Cromosomii suferă un proces de despiralizare şi revin la aspectul interfazic.
Fragmentele de membrană nucleară migrează spre periferia fusului de diviziune; numărul lor
creşte printr-o sinteză suplimentară. Aceste vezicule se agregă în jurul masei cromosomiale, se
turtesc, înconjoară nucleul interfazic şi formează noua membrană nucleară. O parte din veziculele
membranoase ajung la nivelul liniei de demarcaţie dintre cele două celule fiice. Are loc şi
reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce îndeplinesc funcţia de organizatori nucleolari (Fig.9
şi Fig.10).

Fig.9 Celulă din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază timpurie (după Hartl şi
Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparţinând unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată
în telofază târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Citochineza
În mod obişnuit, diviziunea nucleară este urmată de citochineză (plasmodiereză,
citodiereză sau plasmotomie).
Citochineza poate avea loc centripet – la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra),
când membrana ce separă cele două celule fiice apare sub forma unui inel ce creşte centripetal,
asemănător unei diafragme (Toma şi Niţă, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc
centrifug. După Buvat, în zona ecuatorială a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre
care se intercalează fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migrează în această regiune dinspre
poli. Împreună cu elementele microtubulare, se formează o structură fibrilară. În jurul fibrelor
microtubulare se aglomerează vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se măresc, se
contopesc şi vin în contact cu pereţii celulei mame, formând lamela mediană (Fig.11c). Celulele
fiice formate, elaborează membrana primară, străbătută de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale,
separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin ştrangulare(Fig.12 a,
b).

a b c d e
Fig. 11 Formarea peretelui despărţitor, între celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare
(după De Robertis şi De Robertis,1983)

a b
Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formării inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la
organismele animale (după De Robertis şi De Robertis,1983)

În celulele normale, mitoza şi citochineza sunt riguros coordonate. Dacă are loc blocarea
citochinezei, mitoza se desfăşoară normal, producându-se o celulă binucleată.
Odată cu replicarea cromosomilor, are loc şi replicarea organitelor citoplasmatice sau
separarea lor din celula mamă în celulele fiice, după care acestea îşi completează, prin noi
sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. În profază, reticulul endoplasmic este transformat
într-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse în special în regiunile periferice ale
citoplasmei. În metafază, mitocondriile se adună în jurul fusului; în anafază, ele se grupează în
jurul regiunii ecuatoriale, odată cu separarea celulelor fiice având loc şi repartizarea acestora. În
interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipică.
În diviziunea mitotică, metafaza şi anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, în timp
ce profaza, uneori şi telofaza, sunt cele mai lungi. Desfăşurarea în timp a mitozei depinde şi de
tipul celulei, vârstă, starea fiziologică, condiţii de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate fi
blocată prin acţiunea şocurilor de temperatură, narcoticelor, otrăvurilor etc. (Raicu şi colab.,
1973).

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza

2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare

Cromosomii la plantele superioare se evidenţiază în celulele aflate în diviziune mitotică din

ţesuturile meristematice, din zonele de creştere ale organelor vegetative (apex radicular, apex
caulinar), sau în celulele meristemoide din calus.
În lucrările practice de citogenetică vegetală se folosesc mai ales specii de plante cu
cromosomi de dimensiuni mari şi în număr relativ mic. Pentru evidenţierea cromosomilor, în
celulele aflate în diviziune mitotică, se folosesc ţesuturile meristematice din zona de creştere a
rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16), secară – Secale cereale L. (2n = 14), bob – Vicia
faba L. (2n = 12) etc.
Materialul biologic tipic, este reprezentat de ţesutul meristematic din apexul radicular al
rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16).
Rădăcinile de ceapă se obţin după o perioadă de 2-3 zile de la punerea într-un pahar cu
apă a bulbului de ceapă, astfel ca numai discul să pătrundă în lichid. La temperatura camerei,
rădăcinile ating în 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm şi pot fi detaşate (Fig.13).
 Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceapă, în laborator

Pentru obţinerea rădăciniţelor embrionare, seminţele se pun la germinat pe hârtie de filtru,

umectată cu apă, în cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea seminţelor la unele specii de
plante se face în nisip umed , în condiţii speciale. Recoltarea rădăcinilor se realizează când
acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare – când un număr mare de
celule se află în diviziune – se determină prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei
zile este între orele 7 - 10, funcţie de durata ciclului celular la specia respectivă.

2.1.1. Metoda rapidă Feulgen de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n = 16)
Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanţelor pectice din pereţii celulari
şi colorarea diferenţiată a constituenţilor celulari.
Principiul metodei:
În celulele în diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv în roşu violaceu, de
către o soluţie de fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborată de Feulgen şi
Rossenbeck (1924) şi modificată de Tomasi (1936); se aplică pentru evidenţierea cromosomilor
mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967).
Materiale necesare:
 material biologic (rădăcini de ceapă de 1-1,5 cm);
 sticlărie (pahare Berzelius, flacoane, lame de microscop, lamele, pipete);
 instrumentar (pensete, lame, beţe de chibrit);
 aparatură (microscop optic, termostat, frigider);
 hârtie de filtru
 reactivi
prefixatori:
 soluţie apoasă de colchicină (0,01 - 0,2%);
sau
 apă rece la 2-4C
fixatori nucleari:
 alcool etilic absolut – acid acetic glacial (3 :1), sau;
 fixator Carnoy (6 părţi alcool etilic absolut : 3 părţi cloroform : 1 parte acid acetic
glacial), sau;
 fixator Battaglia (5 părţi alcool etilic absolut : 1 parte acid acetic glacial : 1 parte formol :
1 parte cloroform)
coloranţi:
 reactiv Schiff - preparat după Darlington şi La Cour (1960) (cf. Tudose, 1967).
Soluţia folosită la colorare se recomandă să nu se arunce, deoarece poate fi folosită de
nenumărate ori, până când capacitatea ei de colorare scade.
Etape de lucru:
Prefixarea
Prefixarea este necesară pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinând
acumularea de celule în metafază. Această etapă nu se recomandă să se execute când se
urmăreşte observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesară însă, la
efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realizând o scurtare prin spiralizare, a
cromosomilor.
Materialul biologic (rădăcinile de ceapă de 1 - 1,5 cm lungime) se introduce în flacoane mici
de sticlă, adăugându-se 2 - 3 ml de prefixator. După trecerea timpului necesar prefixării,
prefixatorul se îndepărtează cu o pipetă sau prin decantare. Ca prefixatori se foloseste de
exemplu, soluţie apoasă de colchicină 0,01-0,2% sau apă rece la 2 – 4 0C, 4 - 24 ore, la frigider.
Pentru studiul cromosomilor în mitoză la ceapă, recomandăm prefixarea bulbilor de ceapă
germinaţi, cu rădăcini de 1 - 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-4 0C), sau prefixarea cu soluţie
de colchicină, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei.
Fixarea
Fixarea are rolul de a omorî celulele, în starea în care se află în acel moment şi de a
coagula constituenţii celulari, fără a modifica structura internă şi externă a celulelor. Prin fixare,
biocoloizii celulei se coagulează, constituenţii celulari putându-se colora cu diferiţi coloranţi.
Fixarea se realizează prin adăugarea peste materialul biologic a 2-3 ml de fixator, după
îndepărtarea substanţei de prefixare. La ceapă, se prelevează rădăcinile şi se plasează într-un
flacon de sticlă, în vederea efectuării fixării cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura
camerei. În general, timpul de fixare variază în funcţie de soluţia de fixare şi de consistenţa
materialului fixat.
Dacă prelucrarea materialului biologic nu se continuă imediat, el se conservă la frigider (2 –
40C), în alcool etilic 70%.
Spălarea
Rolul spălării este de a îndepărta urmele de fixator. Spălarea se realizează cu soluţie de
HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se îndepărtează soluţia de fixare şi
se adaugă soluţia de spălare.
Hidroliza
Rolul hidrolizei este de a uşura colorarea, prin dizolvarea parţială a substanţelor pectice
intercelulare, distrugerea parţială a pecto-celulozei parietale, precum şi uşurarea etalării celulelor
între lamă şi lamelă.
După îndepărtarea soluţiei de fixare, sau a alcoolului, se realizează hidroliza la cald sau la
rece. Hidroliza la cald se realizează la temperatura de 60 0C, prin adăugarea de 2 - 3 ml HCl 1N.
Timpul este variabil, funcţie de duritatea ţesuturilor; se stabileşte prin tatonări (la ceapă, 7 - 8 min.).
Hidroliza la rece se realizează prin adăugarea de soluţie HCl 50%, după îndepărtarea soluţiei de
spălare. La ceapă, hidroliza se realizează timp de 10-15 min., la temperatura camerei.
Colorarea
După îndepărtarea soluţiei de hidroliză (cu ajutorul unei hârtii de filtru se îndepărtează
urmele de soluţie de hidroliză), se adaugă 2-3 ml de reactiv Schiff, astfel încât rădăcinile să fie
scufundate în colorant, iar colorantul să rămână incolor. După 15-20 de min., zona meristematică
din vârful rădăcinii începe să se coloreze în roşu-violaceu, apoi în violet intens, deoarece aici se
află celule în diviziune; restul rădăcinii, unde frecvenţa diviziunilor este scăzută, iar celulele sunt
mari şi alungite, rămâne vizibil necolorată. Pentru o bună colorare sunt necesare 30 min. - 1 oră, la
temperatura camerei. O colorare intensă, uniformă, se obţine dacă materialul introdus în colorant
se păstrează la frigider, câteva ore. Pentru mărirea contrastului între cromosomi şi citoplasmă se
recomandă menţinerea rădăcinilor scoase din colorant într-o soluţie de acid acetic 45%, timp de 10
- 15 min. sau în apă, timp de 30 de min., spălând astfel excesul de colorant. În cazul în care nu s-a
realizat o colorare satisfăcătoare, intensificarea ei se realizează prin executarea preparatului într-o
picătură de carmin acetic. În colorant, la frigider, materialul se poate păstra maxim 1-2 zile, după
care se degradează, având loc şi colorarea citoplasmei.
Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash)
Preparatele microscopice rapide se obţin prin etalarea vârfului colorat al rădăcinii (de
preferinţă o porţiune de 1-2 mm), pe o lamă de microscop curată şi degresată (prin spălarea
lamelor în amestecuri oxidante speciale folosite în lucrările de citologie, în alcool etilic 96%, sau în
spirt sanitar, urmate de o bună ştergere cu o bucată de tifon, înaintea efectuării preparatului), într-o
picătură de acid acetic 45%. În prealabil, vârful colorat al rădăcinii se poate trece printr-un
cristalizor cu apă. Aşezând deasupra vârfului detaşat al rădăcinii o lamelă şi ţinând cu un deget o
latură a lamelei, se etalează preparatul prin bătăi ritmice şi sistematice în lamelă, cu un băţ de
chibrit, pentru dispunerea celulelor într-un singur strat şi dispersarea cromosomilor în celule.
Eliminarea excesului de soluţie şi desăvârşirea dispersării celulelor şi a cromosomilor se
realizează cu ajutorul unei hârtii de filtru, apăsând cu degetul mare peste lamelă, fără a o mişca.
Pentru a împiedica împrăştierea cromosomilor şi pentru o bună fixare a celulelor pe lamă, se
recomandă ungerea acesteia înaintea executării preparatului cu albumină glicerinată. Lama unsă
este trecută cu partea uscată deasupra unei flăcări, evitând coagularea albuminei glicerinate.
Cu cât etalarea se efectuează mai bine, cu atât preparatul este mai bun, prezentând
cromosomii bine dispersaţi şi individualizaţi. Trebuie evitată deplasarea lamelei pe lamă în timpul
etalării, fapt ce duce la rostogolirea celulelor şi la compromiterea parţială sau totală a preparatului.
După etalare, între lamă şi lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de
material celular colorat în violet.
Preparatele astfel obţinute, se pot observa la microscop imediat după efectuare, timp de
câteva ore, deoarece la lumină şi la temperatura camerei, colorantul va dispersa în citoplasmă.
Efectuarea preparatelor semipermanente
Pentru studiul preparatelor şi în ziua următoare, acestea se efectuează semipermanent,
pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de
preparate se realizează prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adăugare de glicerină pe
marginile acesteia, la contactul cu lama şi îndepărtarea excesului de glicerină cu ajutorul unei hârtii
de filtru. Lamele semipermanente se pot păstra la frigider timp de 24 - 48 de ore. După o păstrare
îndelungată, colorarea se intensifică, cuprinzând şi citoplasma.
Efectuarea preparatelor permanente prin includere în balsam de Canada
Preparatele microscopice pe care dorim să le păstrăm timp îndelungat, cu scopul de a servi
drept model, sau ca dovadă a unei cercetări ştiinţifice, se montează în balsam de Canada (răşină
miscibilă cu xilenul sau toluenul). În jurul lamelei se pune o picătură de alcool 96% şi cu ajutorul
unei lame de ras, se desprinde cu atenţie lamela de pe lamă, printr-o mişcare de ridicare a lamelei.
Materialul de studiu rămâne prins de lamă şi de lamelă. Atât lama, cât şi lamela, se trec prin două
băi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic şi două băi de xilen sau toluen, timp de 2-5
min., pentru fiecare baie.
Rolul alcoolului este acela de a deshidrata ţesuturile şi de a le spăla de acidul acetic; xilenul
va înlocui apa din ţesuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul.
Lamele se introduc în pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele în capsule de
sticlă sau porţelan, întotdeauna cu preparatul biologic plasat la faţa superioară. Pe lama umedă, în
regiunea unde sunt celule, se pune o picătură de balsam de Canada, iar deasupra se aplică o
lamelă curată şi degresată. Pe aceeaşi lamă, alături (în regiunea fără celule) se pune o altă
picătură de balsam de Canada peste care se aşează lamela iniţială, cu faţa ce conţine celulele, în
jos. Se îndepărtează excesul de balsam de Canada printr-o uşoară apăsare pe lamele, cu o
bucată de hârtie de filtru, realizându-se astfel, şi prinderea lamelelor de lamă. Preparatul se usucă
la termostat, la 400C, timp de câteva zile şi se etichetează (se notează specia şi ţesutul din care s-
a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat
preparatul etc.), putând fi păstrat apoi timp îndelungat.
Examinarea preparatelor la microscopul optic
Examinarea preparatelor se efectuează în lumină puternică, cu folosirea unui filtru verde,
care măreşte contrastul între cromosomi şi citoplasmă. Se recomandă ca observarea să înceapă
cu obiectivul 10x, apoi, se schimbă obiectivele 20x, 40x şi chiar 90x (cu imersie în ulei de cedru).
Deoarece reactivul Schiff colorează selectiv numai ADN-ul, la microscopul optic, se vor
observa cromosomii coloraţi în roşu-violet; nucleolii, citoplasma şi organitele celulare rămânând
incolore. Pereţii celulari nu se colorează, fiind greu vizibili, de culoare gălbuie; uneori se observă
doar cromosomii celulelor în diviziune şi nucleii celulelor în interfază. Pentru a delimita celulele, se
poate realiza o uşoară colorare a citoplasmei, cu o soluţie alcoolică foarte slabă de verde de metil.
Această colorare se realizează înaintea efectuării preparatului permanent, prin trecerea lamei şi a
lamelei pentru un timp foarte scurt (câteva secunde), prin soluţie alcoolică de verde de metil.
Astfel, citoplasma se colorează în verde deschis şi celulele pot fi uşor delimitate, iar cromosomii se
observă mai bine, datorită contrastului de culoare.
La microscopul optic se vor observa celule în interfază cu nuclei mici, coloraţi în roşu-violet,
cu nucleoli incolori, ce apar ca nişte corpusculi luminoşi de formă mai mult sau mai puţin rotundă.
Se observă şi celule în diferite faze ale diviziunii mitotice:
 celule în profază timpurie, când cromosomii încep să devină vizibili la microscopul
optic şi au aspectul unor filamente fine şi subţiri; în profaza târzie, când cromosomii se
individualizează, fiind situaţi în nucleu. Spre sfârşitul profazei se dezorganizează membrana
nucleară;
 celule în metafază (fază cu frecvenţă ridicată în preparatele microscopice, în cazul
în care s-a efectuat prefixarea); se pot număra şi observa morfologic cromosomii care au atins
maximul spiralizării, fiind bine individualizaţi. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu
uşurinţă şi se pot număra 16 cromosomi, de forma unor bastonaşe, cu capetele mai mult sau mai
puţin îndoite. Prin studiu mai amănunţit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia
fiecărui cromosom în parte, putându-se executa microfotografii;
 celule în anafază – în anafază timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se
deplasează spre polii celulei şi anafază târzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub formă
de stea - diaster;
 celule în telofază timpurie, când cromosomii fii au ajuns la polii celulei şi telofază
târzie, caracterizată prin formarea nucleilor fii şi apariţia peretelui despărţitor (fragmoplastul).

2.1.2. Metoda rapidă de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n=16) în mitoză
cu soluţie carmin-acetică
Metoda a fost elaborată în 1926 de către Belling (cf. Tudose, 1967)şi se bazează pe faptul
că acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti),
se comportă ca un colorant acid în soluţie alcalină şi se încarcă negativ, iar în soluţie acidă, ca un
colorant bazic, încărcându-se pozitiv. Această metodă este des folosită în studiile de citogenetică
vegetală, deoarece este uşor de efectuat, necesitând un timp scurt.
Materialul biologic, sticlăria, instrumentarul şi reactivii utilizaţi sunt identici cu cei folosiţi în
cazul metodei Feulgen.
Colorantul utilizat este soluţia carmin acetică (55 cm 3 apă distilată la 1000C, 45 cm3 acid
acetic glacial şi 0,5 g carmin). Amestecul se pune într-un balon de sticlă, se agită şi se aşează în
bain-marie, lăsându-se să fiarbă câteva minute. Se agită din nou şi se lasă să se răcească; se
filtrează şi se adaugă câteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolvă încet în
soluţie, excesul depunându-se la baza vasului. Se păstrează la întuneric şi la rece (la frigider).
Etape de lucru:
Prefixarea
Prefixarea materialului biologic lipseşte, sau poate fi efectuată la fel ca la metoda Feulgen.
Fixarea
Fixarea nu este necesară; se poate realiza în fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 -
12 ore, sau cu alt fixator. Dacă nu se continuă lucrul, materialul poate fi păstrat la rece, în fiole cu
alcool 70%, bine închise.
Hidroliza şi colorarea
Hidroliza şi colorarea se efectuează simultan, în soluţia carmin-acetică. Într-o sticlă de ceas
sau o capsulă de porţelan, se pun 3 - 5 cm 3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat
(rădăciniţe de 10 - 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaugă câteva picături (10 - 15)
de HCl 1N; se încălzeşte 20 - 25 min. la flacăra unei lămpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitând
fierberea şi agitând, până când materialul capătă culoarea roşu închis, devine moale şi se lasă la
baza vasului.
Efectuarea preparatelor microscopice
Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop, într-o picătură de carmin
acetic, în care se aşează vârful unei rădăciniţe. Pentru intensificarea culorii, se amestecă uşor
colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se aşează deasupra o lamelă, se etalează şi se
îndepărtează excesul de colorant, în acelaşi mod ca la metoda Feulgen.

2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct – în ţesuturile cu activitate mitotică
intensă (ţesut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, ţesuturi embrionare sau
de regenerare, cât şi indirect – în culturi de ţesuturi.

Metode pentru studiul cromosomilor în diferite ţesuturi provenite de la animale

adulte
Studiul cromosomilor la peşti (Fam. Cyprinidae). Tehnica Ohno (1965)
Material biologic: splină, rinichi, gonade, branhii.
 Reactivi: colchicină 0,5%, apă distilată, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa.
Instrumentar: lame de microscop, lamele, seringă, foarfece, ac spatulat, pensete etc.
Etape de lucru:
Pretratament
Pretratamentul se realizează cu colchicină. Colchicina blochează celulele în diviziune în
stadiul de metafază, prin inhibarea activităţii fusului nuclear, determinând acumularea în ţesuturile
tratate a unui număr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizaţi, liberi în citoplasmă.
Se injectează animalele adulte intramuscular (în musculatura dorsală) cu soluţie de
colchicină 0,5%, în cantitate de 0,5-1 ml. (în funcţie de talie), cu două ore înainte de sacrificare.
Tratament
Tratamentul se realizează cu soluţie hipotonică (hipotonă), ce determină o umflare şi o
fluidizare a citoplasmei celulare, permiţând astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare
superioară.
După sacrificarea animalului se recoltează splina, rinichiul, gonadele şi branhiile, care se
fragmentează în bucăţi de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizează în apă distilată, la pH
neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei.
Fixare
Fixarea are rolul de a omorî celulele, fără să altereze componentele celulare. Drept fixator
se foloseşte soluţia de acid acetic 50%, timp de 15-30 min., la temperatura camerei.
Hidroliză
Hidroliza se efectuează în scopul macerării ţesuturilor, în vederea facilitării pătrunderii
colorantului în nucleu; se realizează cu HCl 1N, la 600C, timp de 10-15 min.
Colorare
Colorarea se realizează cu soluţie Giemsa, în scopul obţinerii contrastului necesar
examinării microscopice a cromosomilor.
Efectuare de preparate microscopice de tip squash
Pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%, se plasează un fragment de
ţesut, se acoperă cu lamela şi se etalează prin bătăi ritmice cu un băţ de chibrit.
Preparatele se pot realiza permanente în balsam de Canada, după tehnica descrisă.

Studiul cromosomilor la amfibieni. Tehnica Spurway şi Callan (1960)

Această tehnică este utilizată pentru evidenţierea cromosomilor din celulele ţesutului
gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus.
Etape de lucru:
Tratament
Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesară înlocuirea tratamentului hipotonic cu
o colchicinizare cu soluţie de colchicină 0,04% în apă distilată, timp de 30 min., la 370C.
Fixare
Ţesutul gonadal fragmentat se fixează 2-3 ore în fixator alcool acetic 3/1.
Colorare
Colorarea se realizează cu soluţie carmin acetică 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min.
Efectuarea preparatelor microscopice
Preparatele se efectuează prin tehnica squash. Se plasează o porţiune din ţesutul colorat
pe lamă şi se acoperă cu lamela, apoi se presează uşor pentru etalare.
Efectuarea preparatelor permanente
Preparatul se introduce în acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei şi se trece în alcool
acetic 3/1, timp de câteva secunde. Ulterior se trec atât lama, cât şi lamela prin două băi de alcool
şi două băi de xilol, apoi se montează preparatul în balsam de Canada.

Studiul cromosomilor la mamifere. Tehnica Fredga (1964)

Material biologic: cornee de şobolan, şoarece, hamster, cobai.
Hipotonia
Se asfixiază animalul (şobolan, şoarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform şi se extirpă
globii oculari cu un foarfece fin şi o pensă curbă, evitând atingerea corneei. Globii oculari se
plasează într-un vas cu soluţie hipotonă de citrat de sodiu 0,7% (în apă distilată), la 37 0C, timp de
30 min.
Fixarea
 Fixarea materialului se realizează în soluţie de acid acetic 50% - 9 părţi şi o parte HCl 1N, 5
min.
Colorarea
Colorarea se realizează în soluţie de orceină acetică 2%, 2 min.
Efectuarea preparatelor microscopice
Globul ocular se plasează pe o lamă de microscop curată şi cu un ac spatulat se răzuie
celulele din epiteliul cornean într-o picătură de colorant. Se acoperă cu lamela şi se presează cu
grijă, realizându-se un preparat de tip squash.

3. Meioza
Este procesul complex de diviziune, în urma căruia rezultă celule-fiice cu număr de
cromosomi redus la jumătate faţă de celula-mamă (de la care s-a pornit în diviziune). Termenul
provine de la grecescul meiosis (reducere).
Ca rezultat al meiozei se formează gameţii la animale şi sporii la plante, acest tip de
diviziune făcând trecerea de la un nucleu diploid (2n), la unul haploid (n), diplofaza fiind înlocuită
cu haplofaza. Reducerea la jumătate a numărului de cromosomi în cursul meiozei, este un proces
indispensabil, pentru că, prin unirea în procesul fecundaţiei a gameţilor paterni (cu n cromosomi),
cu cei materni (tot cu n cromosomi), are loc, în zigot, restabilirea numărului iniţial (2n) de
cromozomi, şi nu dublarea acestuia.
Deci, pentru toate organismele ce se înmulţesc pe cale sexuată, este obligatoriu procesul
alternării fazelor ce se deosebesc după numărul de cromosomi (haplofaza şi diplofaza); ciclul de
viaţă individual cuprinde ambele faze.
Meioza reprezintă un proces complex, ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni.
Cele două diviziuni, sunt precedate de o interfază premeiotică (identică cu interfaza mitotică) şi
separate de o interfază meiotică scurtă, din care lipseşte perioada sintetică (replicarea ADN).
Prima diviziune meiotică este denumită şi reducţională (heterotipică), iar a doua diviziune este
denumită ecvaţională (homeotipică sau de maturaţie).
Schematic meioza poate fi redată astfel:
n

n
2n
n n
n

Diviziunea I Diviziunea II

Prima diviziune meiotică

Ca şi în cazul diviziunii mitotice, autoreplicarea ADN-ului precede meioza, astfel încât, la
începutul profazei, fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide surori (este bicromatidic).
Profaza І
Această etapă este împărţită în cinci stadii: leptoten, zigoten, pachiten, diploten şi
diachineză.
Leptotenul (leptonemul) - de la grecescul lepto = subţire; tenuis = panglică.
Materialul cromatic din interfază începe să se condenseze. Cromosomii sunt încă foarte
despiralizaţi şi se individualizează sub forma unor filamente lungi şi fine de cromatină. Fiecare
cromosom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate,
ceea ce conferă cromosomului un aspect monocromatidic. Cromosomii sunt ataşaţi cu ambele
capete de învelişul nuclear, prin intermediul unor structuri specializate, numite plăci de ataşare.
 Între leptoten şi zigoten, în mod frecvent, se observă un stadiu intermediar, în care
filamentele cromatice se adună la un loc, formând un ghem compact (spirem).
Spre sfârşitul leptotenului, se observă tendinţa aşezării paralele a cromosomilor omologi.

Fig. 14 Zea mays L. profaza I - leptoten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Zigotenul (zigonemul) – de la grecescul zygo = jug.

Acest stadiu se caracterizează prin conjugarea cromosomilor omologi (unul de origine
maternă şi celălalt de origine paternă), proces denumit sinapsis (sinapsare). Sinapsisul începe
prin condensarea fiecărui cromosom în jurul unei structuri denumită element axial, care este
aparent de natură proteică.
După aceea, elementele axiale ale cromosomilor corespunzători se dispun faţă în faţă, şi
constituie elementele laterale ale unei structuri tripartite (complexul sinaptonemal), fiind separate
de un element central, cu care sunt conectate prin intermediul unor benzi proteice transversale,
dispuse în mod similar treptelor unei scări.
Conjugarea cromosomilor omologi, ce formează bivalenţii, are loc treptat. Din punctul de
iniţiere, conjugarea se extinde progresiv, cuprinzând integral cromosomii prealiniaţi într-o manieră
“zipper - like” (engl. zipper = fermoar; like = ca şi). Când cei doi cromosomi nu sunt perfect
omologi, conjugarea se produce numai între porţiunile omoloage. Conjugarea cromosomilor X şi Y,
este posibilă datorită existenţei la cei doi cromosomi de sex a unei regiuni terminale omoloage. Se
presupune că forţele care determină conjugarea sunt de natură electrostatică sau hidrodinamică.
În acest stadiu cromosomii sunt în număr diploid. La autopoliploizi (3x, 4x etc.) numărul
cromosomilor împerecheaţi poate fi mai mare de doi. Deci, în loc de bivalenţi, vor fi multivalenţi
(trivalenţi, tetravalenţi etc.).
Pachitenul (pachinemul) – de la grecescul pachy = gros
În acest stadiu, continuă scurtarea şi îngroşarea cromosomilor ce formează bivalenţii.
Scurtarea este atât de intensă, încât devine evidentă structura dublu cromatidică a fiecărui
cromosom. Astfel, cei doi omologi ai bivalentului formează o figură tetracromatidică, numită
tetradă. Numărul tetradelor este egal cu jumătate din numărul diploid al cromosomilor.
Orice modificare în structura cromosomilor, care alterează omologia, poate fi eventual
decelată prin analiza bivalenţilor în pachiten.
Spre sfârşitul pachitenului se observă încrucişarea reciprocă a celor doi cromosomi
omologi din acelaşi bivalent. Are loc schimbul reciproc de segmente între cromosomii omologi, ca
rezultat al crossing-overului (recombinarea intracromosomială).

Fig. 15 Zea mays L. profaza I - pachiten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Diplotenul (diplonemul) – de la grecescul diplo = dublu

Este stadiul în care, între cromosomii omologi încep să acţioneze forţe de respingere,
aceştia îndepărtându-se între ei, începând din zona centromerilor spre extremităţi. Omologii mai
rămân încă uniţi în anumite puncte, denumite chiasme, considerate a reprezenta locul în care s-a
realizat schimbul fizic între cromosomi. Deşi încep să se formeze în pachiten, chiasmele devin
vizibile numai după desinapsarea cromosomilor ce alcătuiesc bivalentul. S-a constatat absenţa
chiasmelor în regiunile heterocromatinice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate în evenimente
crosing-over.
Diachineza – în limba greacă dia = prin şi kinesis = mişcare.
Cromosomii continuă contractarea, fiind uşor vizibili la microscop şi se detaşează de
membrana nucleară. Se remarcă fenomenul de terminalizare a chiasmelor (adică migrarea
chiasmelor intercalare spre capetele cromosomilor), care face ca bivalenţii să capete de regulă
forme inelare, omologii rămânând asociaţi prin capetele lor.
În cursul acestei faze, nucleolul şi membrana nucleară se dezintegrează şi cei doi
centromeri ai fiecărei tetrade se ataşează de fibrele fusului nuclear, ce a apărut concomitent cu
ruperea membranei nucleare.

Fig. 16 Zea mays L. profaza I - diploten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Metafaza I
În această etapă a primei diviziuni, cromosomii ating maximum de scurtare şi îngroşare.
Bivalenţii migrează spre placa metafazică şi se dispun într-un singur plan, perpendicular pe fibrele
fusului. Sunt încă vizibile chiasmele terminale ale fiecărei tetrade. În cadrul fiecărei tetrade,
centromerul unuia din cromosomii bivalenţi este orientat spre un pol, iar centromerul celuilalt
cromosom al aceluiaşi bivalent, spre celălalt pol al fusului. Orientarea centromerilor cromosomilor
de origine maternă ori paternă, către un pol sau celălalt este aleatorie (recombinare
intercromosomială sau „dansul cromosomilor”). În această fază, cromosomii se colorează
intens, astfel încât pot fi uşor număraţi şi studiaţi din punct de vedere morfologic.
Anafaza I
Omologii din cadrul fiecărei tetrade se separă, în urma disjuncţiei rezultând câte doi
cromosomi univalenţi ce încep să migreze spre polii opuşi (în funcţie de orientarea centromerilor).
Segregarea aleatorie a acestor cromosomi, stă la baza principiului mendelian al segregării
independente a factorilor ereditari. Jumătatea de origine paternă a fiecărei tetrade va migra către
unul sau celălalt pol (în mod aleatoriu), iar jumătatea de origine maternă va migra în fiecare caz
către polul opus.
La sfârşitul anafazei I, la fiecare pol al fusului, se află câte un set haploid de cromosomi.

Fig. 17 Zea mays L. profaza I - diakineză (stânga) şi metafaza I (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Dacă nu a avut loc nici un crosing-over în profaza I, fiecare cromosom univalent va fi

alcătuit doar din cromatidele de origine maternă ori paternă.
 Fig. 18 Zea mays L. - anafaza I (Mertens şi Hammersmith, 1998)
Telofaza I
Cromosomii univalenţi, ajunşi la cei doi poli, suferă procese inverse celor din profază (se
despiralizează). În jurul fiecărui set haploid de cromosomi, se formează membrana nucleară. În
final, se formează cei doi nuclei, în fiecare aflându-se câte jumătate din cromosomii nucleului
celulei iniţiale. Apoi, are loc divizarea citoplasmei şi apariţia a două celule (denumite celule în
diadă) cu nuclei haploizi (n).
După telofaza I, urmează o scurtă interchineză, şi apoi începe a doua diviziune meiotică
(diviziune de maturaţie). La majoritatea speciilor, telofaza I şi interchineza sunt foarte scurte. La
unele specii aceste faze lipsesc. În această scurtă interfază, nu are loc replicarea ADN-ului.

Fig. 19 Zea mays L. telofaza I (stânga) şi profaza II (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)
A doua diviziune meiotică
A doua diviziune a meiozei (diviziunea de maturaţie), este de fapt o diviziune mitotică.
Prezentăm fazele pe scurt:
Profaza a II a
Lipseşte la organismele care nu au nici interchineză. Acolo unde este prezentă, are loc
simultan în cele două celule ale diadei. Deci, în fiecare din aceste două celule, cromosomii se
spiralizează, se scurtează şi se individualizează. Sunt bicromatidici (univalenţi).
Se formează fusul de diviziune.
Metafaza a II a
Cromosomii se inseră pe filamentele fusului de diviziune şi migrează în placa ecuatorială,
dispunându-şi centromerii în acelaşi plan.

Fig. 20 Zea mays L. metafaza II (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Anafaza a II a
Cromatidele surori ale fiecărui bivalent se separă şi se deplasează către polii opuşi ai
fusului.
Telofaza a II a
Cromosomii ajunşi la polii fusului de diviziune se despiralizează. În final, dintr-o diadă “n” se
formează o tetradă (patru celule) “n”.
În urma proceselor morfofiziologice, cele patru celule ale tetradei se transformă în gameţi.
 Fig. 21 Zea mays L. anafaza II (stânga) şi telofaza II (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Fig. 22 Zea mays L. - Citokineză şi formarea tetradei (Mertens şi Hammersmith, 1998)

A doua diviziune a meiozei, după mecanismul de desfăşurare este asemănătoare mitozei,

dar prezintă şi deosebiri. Diferenţa principală constă în faptul că, datorită crossing-overelor ce au
loc în profaza I, cromatidele surori nu sunt identice. Cromosomii ce au participat la crosing-over
sunt o combinaţie de informaţie genetică de origine maternă şi paternă. O altă deosebire este că,
în mitoză unitatea funcţională este cromatida, iar în meioză unitatea funcţională este cromosomul
(două cromatide).

4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza

4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante
Metoda de colorare rapidă carmin-acetică
Această metodă a fost elaborată de Belling (1926) şi ea se bazează pe capacitatea
acidului carminic ca în soluţie alcalină să fie încărcat negativ şi să se comporte ca un colorant acid,
iar în soluţie acidă să fie încărcat pozitiv şi să se comporte ca un colorant bazic. Colorantul carmin
care se foloseşte în mod curent în citologie este preparat dintr-un extract al femelelor homopterului
Coccus cacti. Acest colorant nu este pur din punct de vedere chimic, acidul carminic fiind însă
constituentul pe care se bazează activitatea sa. Pentru intensificarea capacităţii sale de colorare,
în soluţia de carmin în acid acetic se adaugă acetat de fier.
Ca material biologic, se foloseşte secara – Secale cereale L. (2n=14).
În general, la secară ca şi la alte cereale, meioza are loc în momentele când tinerele antere
şi-au pierdut transluciditatea. Spicele sunt recoltate în faza de “burduf” când au lungimea de 4-6
cm, fiind învelite în teaca ultimei frunze.
Pentru studiul cromosomilor sunt necesare următoarele operaţii:
Etape de lucru
Fixarea
Se face în fixator (soluţie alcool-acid acetic în proporţie de 3 :1), sau în soluţie Carnoy, în
care anterele se lasă 24-48 de ore. Se pot conserva fie în fixator, fie în alcool de 70 0 (în fiole bine
închise şi la rece 0-40C, materialul se poate păstra timp îndelungat. Operaţia fixării poate lipsi,
după cum nici hidroliza nu este absolut necesară.
Colorarea şi efectuarea preparatelor microscopice
Se ia un spic, se prelevă florile din partea de mijloc şi se scot staminele (câte 3 stamine în
fiecare floare). Fiecare stamină se plasează pe o lamă curată, într-o picătură de soluţie carmin
acetică. Cu un ac spatulat se taie transversal la mijloc şi apoi se apasă încet pe cele două jumătăţi
pentru a goli antera de conţinut, adică de celulele mamă ale granulelor de polen unde are loc
meioza. Se îndepărtează resturile staminei cu o pensetă fină. Peste acest material se pune o
lamelă curată şi uscată, (sau unsă cu albumină glicerinată şi trecută prin flacără), după care cu o
bucată de hârtie de filtru se apasă pe lamelă pentru a etala bine celulele şi pentru a îndepărta
excesul de colorant.
Colorarea materialului are loc foarte repede, astfel că imediat poate începe observarea la
microscop. Pentru intensificarea colorării, se poate încălzi lama câteva minute deasupra unei
flăcări de la o lampă de spirt, evitând fierberea.
Pentru a evita evaporarea soluţiei, se parafinează marginile lamelei sau se pune soluţie de
lipit cauciucul.
Examinând preparatul la microscop, pot fi întâlnite trei situaţii:
1. nu a început diviziunea, anterele fiind prea tinere – în acest caz, celulele mamă ale
granulelor de polen sunt în interfază.
2. a început diviziunea – se observă celule în diferite faze ale meiozei.
3. s-a terminat diviziunea - se vor observa grăuncioarele de polen care au formă
caracteristică.
În general se consideră că staminele din aceeaşi floare se află în aceeaşi fază de diviziune.
Dacă la microscop nu am găsit diviziuni meiotice, se caută flori spre baza sau spre vârful spicului
(înfloritul în cadrul unui spic începe mai întâi la mijlocul spicului şi se propagă apoi spre baza şi
vârful spicului).
Pentru cercetare se recomandă folosirea metodei Feulgen pe care o vom descrie în
continuare (cromosomii se colorează mai bine, contrastul este mai mare între cromosomi şi
citoplasmă şi în general se obţin preparate mai bune).

Studiul cromosomilor în meioză prin metoda de colorare Feulgen

Această metodă a fost elaborată de Feulgen şi Rossenbeck (1924) şi apoi modificată de
De Tomasi (1936). În celulele în diviziune numai cromatina cromosomilor se colorează efectiv în
roşu-violaceu de către fuxină, în timp ce acidul ribonucleic din nucleoli şi citoplasmă nu se
colorează. Reacţia Feulgen pozitivă este considerată ca fiind un indice sigur al prezenţei acidului
dezoxiribonucleic.
Pentru studiul meiozei prin metoda Feulgen se poate folosi ca material biologic secara –
Secale cereale L. (2n=14).
În general meioza are loc în momentele când tinerele antere îşi pierd transluciditatea, acest
moment coincizând la grâu şi la secară cu faza în care spicele sunt în burduf şi au o lungime de 3-
6 cm. Pentru a repera momentul când are loc meioza folosim metoda rapidă carmin-acetică
(descrisă anterior). În cazul în care la microscop am găsit diviziuni meiotice se fixează întregul
spic.
Sunt necesare următoarele operaţii:
Fixarea
Se realizează în soluţie alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3:1). În momentul fixării se
adaugă o picătură de soluţie de perclorură de fier la cca. 5 cm3 de fixator. Fixarea se efectuează în
fiole de sticlă în care se pun 2-3 cm3 de fixator. În fixator anterele se lasă cel puţin o oră la
temperatura camerei, sau cel mult 24-48 de ore în frigider, după care se trec în alcool absolut
pentru o jumătate de oră, pentru îndepărtarea acidului acetic din ţesuturi. De aici materialul se
trece în fiole cu alcool de 700 care se închid ermetic prin parafinare şi se pun în frigider la 0-4 0C,
unde se pot păstra timp îndelungat. Dacă materialul se păstrează în alcool de 70 0 timp mai
îndelungat, se poate renunţa la trecerea prin alcool absolut.
Hidroliza
Materialul se scoate din alcool 700 după ce a stat cel puţin o jumătate de oră şi se spală cu
apă. În acest scop se îndepărtează alcoolul din fiole, se pune apă şi se agită anterele până ce cad
la fund. Materialul se lasă în apă o jumătate de oră, după care se face hidroliza în acid clorhidric
normal, la temperatura de 600C, timp de 12 min. la orz, 8-9 min. în cazul grâului etc.
Colorarea
Se face în soluţie de fuxină bazică (reactivul Schiff) în care materialul se lasă cel puţin o
jumătate de oră. În colorant anterele pot rămâne câteva ore, timp în care se fac preparatele
microscopice. Nu se recomandă ca materialul să rămână prea mult timp în colorant deoarece se
reduce contrastul dintre culoarea cromosomilor şi a citoplasmei, iar preparatele au o calitate mai
slabă.
Efectuare preparatelor microscopice
 Pe o lamă de microscop se pune o picătură de acid acetic 45% şi în aceasta se plasează o
stamină. Cu un ac spatulat se taie transversal stamina în două jumătăţi. Se apasă uşor pe ele
până ce ies celulele mame ale granulelor de polen şi apoi sacii polinici se îndepărtează. Peste
material se pune o lamelă unsă cu albumină glicerinată şi trecută prin flacăra unei lămpi de spirt.
Cu o bucată de hârtie de filtru se apasă pentru etalarea celulelor şi pentru îndepărtarea excesului
de soluţie.
Pentru a păstra preparatele câteva zile se poate parafina marginea lamelei sau se poate
pune soluţie de lipit cauciucul. Preparatele permanente se pot face prin montarea în euparal sau
balsam de Canada.

5. Cariotip si idiograma
5.1. Definirea termenilor, nomenclatură
La conferinţa de la Denver (1960), termenul de cariotip a fost definit ca fiind “o aranjare
sistematică a cromosomilor unei singure celule, preparaţi prin desenare sau fotografiere, în
înţelesul lărgit conform căruia cromosomii unei singure celule pot reprezenta cromosomii unui
individ sau chiar ai unei specii”, iar termenul de idiogramă ca “reprezentarea diagramatică a unui
cariotip, care se bazează pe măsurători ale cromosomilor din câteva sau din mai multe celule”.
Cariotipul, reprezintă în esenţă, numărul, forma şi mărimea cromosomilor, este constant în
ontogenia şi chiar în filogenia unei specii, fiind tot mai des utilizat în taxonomie.
Studiul cariotipului furnizează elemente pentru analiza procesului de speciaţie, pentru
cunoaşterea gradului de înrudire între specii etc.
Pentru fiecare specie, există un cariotip standard. Eventualele rearanjamente
cromosomiale (eliminări de cromosomi, duplicaţii, translocaţii, deleţii etc.), se pot stabili prin
comparaţii cu cariotipul standard.
Indivizii aceleiaşi populaţii care au o altă aranjare a genelor pe cromosomii omologi
(consecinţă a modificărilor structurale ale cromosomilor), sunt denumiţi heterocariotipici, antonimii
lor fiind cei homocariotipici.
În funcţie de tipul cromosomilor pe care îi conţine, un cariotip poate fi simetric (toţi
cromosomii sunt de acelaşi tip) sau asimetric. Cariotipul cu cromosomi uniformi, este considerat
primitiv comparativ cu cel cu cromosomi neuniformi. Sensul evoluţiei cariotipului se consideră a fi
acela al reducerii numărului de bază al cromosomilor şi asimetrizării lui (prin inversii, translocaţii,
fuziuni centrice, etc.).
Metodologia elaborării unei analize cromosomiale
Indiferent de materialul celular din care au fost preparaţi cromosomii, sau de provenienţa de
specie a acestora, pentru a obţine maximum de informaţii citogenetice este necesară adoptarea
unui procedeu de lucru care conţine mai multe etape.
Stadiul de diviziune cel mai adecvat analizei cariotipului, este metafaza mitotică, când
cromosomii prezintă maximum de condensare şi colorabilitate.
În continuare, vom prezenta pe scurt etapele de lucru necesare alcătuirii cariotipului.
Etapa prelucrării microscopice
A. Vizualizarea preparatelor microscopice. Căutarea metafazelor presupune baleierea
(mişcarea lamei microscopice în sens orizontal sau vertical), fără a omite nici o porţiune pe care se
află celule. Are ca scop:
 Alegerea metafazelor potrivite analizei citogenetice. Procentajul metafazelor apte
studiului citogenetic, este extrem de variabil, depinzând de materialul celular studiat, de tehnica de
preparare a cromosomilor, de abilitatea şi experienţa examinatorului. Căutarea metafazelor trebuie
făcută cu un obiectiv cât mai mic (maxim 10x). Se poate schimba obiectivul cu unul mai mare (20x
sau 40x), pentru a rezolva anumite incertitudini. În alegerea metafazelor utilizabile sunt esenţiale
două criterii: să nu existe suprapuneri de cromosomi, sau dacă sunt, numărul lor să fie mic şi să nu
intereseze mai mult de doi cromosomi; cromosomii să nu fie împrăştiaţi pe o suprafaţă prea mare,
iar dispunerea lor să păstreze o formă variabilă între un cerc şi un patrulater. Acest ultim criteriu,
este deosebit de important, deoarece poate elimina metafazele sparte, cu cromosomi pierduţi, care
la examenul ulterior pot să sugereze apariţia de complemente cromosomiale cu cromosomi lipsă.
B. Studiul microscopic al cromosomilor. Etapa observaţiei directe a cromosomilor,
urmăreşte obţinerea primelor rezultate citogenetice asupra materialului celular în studiu prin:
  Numărătoarea de cromosomi, care prezintă o mare importanţă, fiind prima
caracteristică citogenetică a populaţiei celulare examinate. Această numărătoare se poate face
direct în placa metafazică, delimitând eventual anumite regiuni, dar mai precisă este numărarea
după fotografie. Mai demult, se număra după desen (se desenau schematic cromosomii pe o coală
de hârtie, sau prin procedeul clasic , folosind camera clară).
 Identificarea cromosomilor aparţinând la diferite grupe (de exemplu din grupele D şi G
ale cariotipului uman, din grupele M sau S la Vicia faba, etc.
Pentru elaborarea unui cariotip, prima condiţie este identificarea morfologică a
cromosomilor.
Metode de identificare a cromosomilor
Procedeul cel mai larg folosit în studiul cromosomilor metafazici, este acela al
măsurătorilor. Se măsoară lungimea integrală a cromosomilor, lungimea braţelor cromosomiale,
poziţia constricţiilor secundare în raport cu aceea a centromerului etc.
Dar aceste criterii nu permit întotdeauna o identificare precisă a cromosomilor. Dificultăţile
ţin mai ales de existenţa unor fluctuaţii care pot masca considerabil diferenţele reale dintre
cromosomi. La fluctuaţiile strict biologice se pot adăuga: imprecizia măsurătorilor (eroarea
personală, eroarea optică), heteropicnoza unor regiuni cromosomiale sau a unor cromosomi întregi
(cromosomii sexului de exemplu), gradul de întindere al regiunii centromerice, momentul metafazic
pe baza căruia se efectuează analiza etc. Se ştie de exemplu că, maximum de contractare este
atins de către cromosomii mai mari în stadiile mai avansate ale metafazei, în timp ce cromosomii
mici ating acest nivel în stadii mai timpurii.
Deşi metoda analizei cromosomiale prin măsurători a fost contestată (Patau, 1965) ea a
rămas până în prezent una dintre metodele de bază pentru identificarea cromosomilor.
În caracterizarea acestora, conferinţa de la Denver a adoptat următorii trei parametrii:
1. lungimea fiecărui cromosom, raportată la lungimea totală a unui complement
haploid normal exprimată la 1000;
2. raportul braţelor cromosomiale exprimat prin raportul dintre braţul lung / braţul scurt;
3. indexul centromeric exprimat prin raportul dintre braţul scurt şi lungimea totală a
cromosomului, raportat la 100 (braţul scurt / cromosom înmulţit cu 100).
În afara acestor parametrii, Patau, recomanda reprezentarea cromosomilor sub formă de
puncte într-un sistem de coordonate, în care, pe abscisă s-ar nota lungimea braţului lung, iar pe
ordonată lungimea braţului scurt, ambele exprimate în procente din lungimea totală a
complementului cromosomial haploid (cariogramă).
Pentru identificarea morfologică a cromosomilor, poziţia centromerului, una din
caracteristicile cele mai constante ale cromosomului, poate fi exprimată prin relaţiile:
d = l-s; sau r = l/s
în care l şi s reprezintă lungimea braţului lung şi respectiv a celui scurt al cromosomului, d
diferenţa între braţul lung şi scurt, iar r raportul dintre braţe.
Putem calcula lungimea braţului lung conform relaţiei:
l = c(100-i)/100
în care c este lungimea cromosomului iar i, indexul centromeric. Poziţia centromerului,
determinată prin asemenea relaţii, este exprimată simbolic ca mai jos:
Levan şi colab. (1964) au propus denumirea standardizată a cromosomilor în funcţie de
poziţia centromerului:
 Cromosomi metacentrici, cu centromerul situat în punctul median (M) sau în
regiunea mediană (m) şi cu un raport al braţelor 1,0-1,7
 Cromosomi telocentrici, cu centromer terminal (T)
 Cromosomi acrocentrici, cu centromerul în regiunea terminală (t)
 Cromosomi submetacentrici şi subtelocentrici cu centromerul situat în regiunea
submediană şi respectiv subterminală (raportul braţelor 1,7-3,0 şi respectiv 3,0-7,0)
Nomenclatura cromosomilor pe baza poziţiei centromerului (după Levan şi colab., 1964)
Echivalarea cu
Poziţia Nomenclatura Index Raportul nomenclatura
centromerului cromosomului centromeric braţelor citogenetică
curentă

Median “sensu
stricto” M 50,0 1,0 Metacentric
Regiunea mediană m 37,5 1,7 Submetacentric
Submedian sm 25,0 3,0 Subtelocentric
Subterminal st 12,5 7,0 Acrocentric
Regiunea terminală t - - Telocentric
Terminal “sensu T 0,0 -
stricto”

Constricţiile cromosomiale includ constricţiile primare sau centromerice şi constricţiile

secundare. Constricţiile secundare, cuprind regiuni cromosomiale diferite ca structură şi funcţie,
cum sunt regiunile organizatoare nucleolare (regiunile SAT), care delimitează sateliţii de restul
cromosomului şi constricţiile localizate în general interstiţial pe braţele cromosomilor.
 Identificarea aberaţiilor cromosomiale are loc în primul rând în această etapă.
Observaţiile privind prezenţa anumitor aberaţii cromosomiale se vor nota pe fotografia (desenul)
mitozei examinate, precizând tipul de aberaţie, localizarea sa pe cromosom şi pe braţ etc. Atunci
când se urmăreşte efectul citogenetic al unui agent fizic, chimic sau biologic (radiaţii ionizate,
substanţe chimice mutagene, virusuri etc.), înregistrarea aberaţiilor cromosomiale reprezintă
obiectivul central al analizei cromosomiale.
Etapa prelucrării fotografice
Microfotografierea se desfăşoară în mai multe etape:
 O primă etapă este alegerea mitozelor pentru fotografiere (o dată cu studiul
microscopic al mitozelor). Se vor alege pentru fotografiat doar metafaze foarte clare (este de dorit
ca numărul acestora să fie cât mai mare, minimum 10% din mitozele examinate).
 A doua etapă, fotografierea mitozelor se face cu orice dispozitiv de microfotografie.
Se utilizează filme alb-negru cu granulaţie foarte fină, cu contrast scăzut spre mediu.
Pentru obţinerea de fotografii corespunzătoare, calitatea superioară a microscopului este
decisivă, în special a lentilelor utilizate la ocular şi obiectiv. Pentru fotografiere se aleg doar
metafazele extrem de clare. După aceea, cromosomii sunt decupaţi şi aranjaţi în cariotip.
Prepararea cariotipurilor
Se recomandă ca alcătuirea cariotipului să se desfăşoare pe baza a cel puţin două copii
fotografice ale metafazei şi imaginii microscopice însăşi a metafazei, luată cu un obiectiv cu
imersie. Înainte de a trece la decuparea propriu-zisă a cromosomilor, este indicat să se verifice
încă o dată toate particularităţile metafazei respective, eventualele aberaţii, limitele cromosomilor,
eventuale suprapuneri, etc. Decuparea cromosomilor se face cu atenţie, tăind cu foarfeca fiecare
cromosom în parte şi lăsând întotdeauna o margine albă în jurul imaginii fotografice negre.
Cromosomii decupaţi se aşează pe o coală de carton, sau hârtie mai tare, albă, pe care urmează
să fie aranjat şi lipit cariotipul. Pentru decuparea cromosomilor suprapuşi se taie un cromosom
dintr-o copie şi al doilea cromosom din altă copie. În această situaţie, numai imaginea la microscop
precizează limitele cromosomilor.
Aranjarea cromosomilor în cariotip, (cu excepţia studiilor ce urmăresc stabilirea
cariotipului unor specii nestudiate încă), trebuie să pornească de la cunoaşterea cariotipului normal
al speciei.
Primul criteriu de aranjare a cromosomilor în cariotip este cel al lungimii, cromosomii fiind
dispuşi în ordine descrescătoare. Se măsoară de obicei ambele cromatide (de-a lungul axelor lor
individuale) şi se face o medie a rezultatelor. Regiunea centromerică se include în măsurătoare, iar
sateliţii nu se măsoară.
Al doilea criteriu, este cel al dispunerii pe grupe morfologice. Cariotipurile normale au
adesea perechile de cromosomi aranjate pe grupe morfologice, care se notează cu litere
majuscule în ordine alfabetică, sau cu cifre. Aceste grupe cuprind două sau mai multe perechi de
cromosomi care se identifică greu sau deloc prin mijloace uzuale ale analizei citogenetice.
Al treilea criteriu folosit în aranjarea cromosomilor în cariotip, este acela al împerecherii
cromosomilor omologi. Plecând de la premisa că omologia genetică corespunde unei omologii
morfologice, cromosomii presupuşi omologi sunt dispuşi în perechi sau grupe în funcţie de gradul
de gradul de poliploidie al celulei respective (diploid, triploid, tetraploid etc.).
Aranjarea cromosomilor pe perechi, notate de obicei cu numere în cadrul cariotipului
normal, presupune folosirea a cel puţin doi parametrii de caracterizare a cromosomilor respectivi:
lungimea şi raportul braţelor.
Împerecherea cromosomilor omologi, prin simpla observaţie vizuală, se poate realiza
ţinându-se seama de anumite condiţii:
1. se pot împerechea cu mai multă precizie cromosomii dintr-o metafază mai puţin
avansată, cu braţele puţin contractate;
2. pentru împerecherea cromosomilor din cadrul unei grupe morfologice primul criteriu
luat în considerare este raportul braţelor şi nu cel al lungimii;
3. la cromosomii mici, împerecherea pe criteriul raportului braţelor este relativă,
deoarece diferenţele dintre măsurători la acest indice sunt mici;
4. se va ţine cont de condiţiile în care fotografierea poate modifica realitatea
microscopică, mărind anumiţi cromosomi sau micşorându-i pe alţii, în funcţie de gradul de
expunere şi de copiere.
Cariotipul uman normal
La Conferinţa de la Denver (1960), s-a căzut de acord asupra unui sistem standard de
nomenclatură a cromosomilor din cariotipul uman normal. Principiile enunţate la această conferinţă
au fost confirmate şi dezvoltate la Conferinţa de la Londra (1963) şi cea de la Chicago (1966).
Cariotipul uman normal este reprezentat prin 7 grupe distincte de cromosomi autozomali,
aranjaţi în ordine descrescătoare a lungimii lor şi numerotaţi de la 1 la 22 cât şi o pereche de
cromosomi sexuali (X şi Y). În cadrul aceluiaşi grup, cromosomii sunt aranjaţi după mărime.
Identificarea cromosomilor din aceste grupe nu este foarte simplă. De exemplu, în grupa de
cromosomi numerotaţi 6-12, incluzând şi cromosomul X, deosebirile dintre cromosomi sunt extrem
de dificil de precizat. Se disting ceva mai uşor cromosomii 6 şi X de restul grupei. Pentru
desemnarea grupelor cromosomiale se folosesc cifrele indicând extremele fiecărei grupe unite
printr-o liniuţă sau litere de la A la G.
Conferinţa de Londra (1963) a considerat drept caracteristici importante ale cromosomilor
constricţiile secundare şi modul diferenţiat de încorporare a timidinei marcate radioactiv
demonstrabil prin autoradiografie.
Atât la Conferinţa de la Londra (1963), cât şi la cea de la Chicago (1966) s-a stabilit că
anumiţi cromosomi umani prezintă variaţii morfologice la indivizi normali fenotipic.
Pentru descrierea complementului cromosomial Conferinţa de la Chicago (1966) propune
folosirea unor simboluri care permit o înţelegere uşoară, scrisă şi codificată, a acestora.
Nomenclatura acestor simboluri este următoarea:

A-G grupurile de cromosomi

1-22 numerele autosomilor (sistemul Denver)
X, Y cromosomii sexuali
(/) separă linii celulare la descrierea
mozaicismului
(+) sau (-) aşezat imediat după desemnarea numărului
de autosomi sau a literei de grup, indică
faptul că acel cromosom este în plus sau
lipseşte; aşezat imediat după indicatorul de
braţ sau de structură, semnalează că acel
braţ sau acea structură este mai mare sau
mai mică decât normal
(?) indică o identificare discutabilă a
cromosomului sau structurii
Cromosomiale
 Asterisc (‘) indică un cromosom sau o structură
cromosomială explicată în text sau în notă
de subsol
Ace acentric
Cen centromer
Dic dicentric
End endoduplicaţie
Ih constricţie secundară sau regiune
necolorată (colorată negativ) izocromosom
Inv inversiune
inv (p + q - ) sau inv (p – q + ) inversiune pericentrică
Mar cromosom marcher
Mat origine maternă
P braţul scurt al cromosomului
Pat origine paternă
Q braţul lung al cromosomului
R cromosom inelar
S satelit
T translocaţie
Tri tricentric
simboluri repetate duplicare de structură cromosomială.

Raportul Conferinţei de la Chicago completează folosirea simbolurilor prezentate atât

pentru aberaţiile numerice, cât şi pentru cele structurale.
Într-o descriere de cariotip, primul care trebuie înregistrat este numărul total de cromosomi,
inclusiv cromosomii sexuali, despărţiţi printr-o virgulă. Constituţia cromosomilor sexuali este
indicată ulterior. De exemplu:
45,X 45 de cromosomi, un cromosom X;
47,XXY 47 de cromosomi, cromosomi sexuali XXY.
Autosomii se specifică în cazul în care există o anomalie. Dacă există o aberaţie numerică
a autosomilor, litera grupului din care face parte autosomul extra sau lipsă este urmată de semnul
(+) sau (-), aşezat după indicarea cromosomilor sexuali. De exemplu:
45, XX, C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lipsă în grupul C.
Atunci când cromosomul sau cromosomii lipsă sau suplimentari pot fi identificaţi cu
siguranţă, se poate folosi numărul cromosomului:
45, XX, 16- 45 de cromosomi, doi cromosomi X, un cromosom numărul 16 absent.
Semnul (?) indică incertitudine. De exemplu:
45, XX, ? C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lipsă, care face
parte probabil din grupul C.
O celulă triploidă sau poliploidă este evidenţiată prin numărul de cromosomi şi prin alte
indicative. De exemplu:
69, XXY sau 70, XXY, G +.
O metafază endoreduplicată poate fi indicată punând abrevierea “end” înaintea indicativului
cariotipului astfel: end 46, XX.
Mozaicisme cromosomiale. Constituţia cromosomială a diferitelor linii celulare este
înregistrată în ordine numerică sau alfabetică, indiferent de frecvenţa tipurilor celulare la individul
studiat. Indicarea cariotipului se separă printr-o diagonală (/). De exemplu:
45, X / 46, XY mozaicism cromosomial cu două tipuri celulare, unul cu 45 de cromosomi şi
un singur X, celălalt cu 46 de cromosomi şi cromosomi sexuali XY.
Braţul scurt al unui cromosom este indicat prin litera “p”, braţul lung prin litera “q”, un satelit
prin litera “s”, o constricţie secundară prin litera “h”, iar centromerul prin abrevierea “cen”.
 Creşterea în lungime a unui braţ cromosomial, se indică punând semnul (+), iar micşorarea
lungimii, punând semnul (-) după indicativul braţului. De exemplu: 2p+; Gq-.
Pentru o modificare a unui braţ la un cromosom mediocentric (1, 3, 19 şi 20) se pune un
semn de întrebare între indicativul cromosomului şi semnul + sau -. De exemplu, un cromosom
nr.3 cu un braţ alungit va fi indicat astfel: 3?+.
Rezultatul unei inversiuni pericentrice se indică prin p+q- sau p-q+, care se închide în
paranteză şi este precedat de abrevierea “inv”. De exemplu: inv (D p+q-).
O translocaţie este indicată prin litera “t”, urmată de paranteze care includ cromosomul
interesat. De exemplu:
46, XY, t (Bp-;Dq+) o translocaţie reciprocă balansată între braţul scurt al unui cromosom
B şi braţul lung al unui cromosom D
Translocaţiile care afectează un cromosom sexual şi un autozom, vor fi desemnate astfel:
46, X, t (Xq + ; 16p-) o translocaţie reciprocă între braţul lung al unui cromosom X şi braţul
scurt al unui cromosom 16 la o femelă.
Separarea cromosomilor dintr-o paranteză prin punct şi virgulă (;), indică prezenţa a doi
cromosomi alteraţi structural şi balansarea translocaţiei. Într-o translocaţie de tip “fuziune centrică”,
în care un singur cromosom translocat este prezent, semnul de punct şi virgulă se omite. De
exemplu:
45, XX, D - ,G - , t (DqGq) + 45 de cromosomi, cromosomii sexuali XX, un cromosom este
absent din grupul D şi unul din grupul G, braţele lor lungi formând pin unire un cromosom
translocat DG.
Dacă un anume cromosom a fost moştenit de la mamă sau de la tată, aceasta se poate
nota prin abrevierile “mat” sau”pat”.
Structurile cromosomiale duplicate se indică prin repetarea indicativului.
Izocromosomii se indică prin litera “i” aşezată după braţul cromosomial interesat.
Cromosomii inelari se indică prin litera “r” aşezată după cromosomul afectat.
În cazul celulelor cu complemente cromosomiale profund dezechilibrate şi anormale,
Conferinţa de la Chicago propune aplicarea următoarei convenţii în nomenclatura cariotipurilor:
numărul de cromosomi într-o celulă dată va include toate structurile cromosomiale centrice
prezente în celulă, indiferent de numărul de centromeri. Cromosomii neidentificaţi, sunt indicaţi prin
“mar” (marker). Fragmentele acentrice nu se include în număr, dar se vor indica prin abreviaţia
“ace”. Cromosomii dicentrici şi tricentrici se vor număra ca unul singur şi se vor indica prin “dic” şi
“tri”.
Pentru indicative care nu figurează în sistemul de nomenclatură propus de Conferinţa de la
Chicago, se sugerează folosirea primelor trei litere mici, definite cu claritate şi aşezate imediat
înaintea sau după simbolul cromosomului sau al indicativului cromosomului la care se referă în
paranteze.
Cariotipul la animale
Cariotipul la hamsterul auriu
Cariotipul la hamsterul auriu (Fig.23) (unul dintre animalele de laborator larg studiate în
laborator), a fost elaborat de mai multe grupe de cercetători (Ishihara şi colab., 1962, Lehman şi
colab., 1963 şi Nachtigal, 1965).
Complementul cromosomial al celulelor somatice este constituit din 44 de cromosomi (21
de perechi de autosomi şi 2 cromosomi sexuali heteromorfi, X şi Y). Cromosomii autosomali se
distribuie în cinci grupe morfologice, notate cu primele litere ale alfabetului. Perechile de autosomi
se numerotează de la 1 la 21. Cromosomul X este caracteristic şi uşor de recunoscut.
Grupa A (prima grupă), cuprinde perechile 1-4. Prima pereche (A1) este mai mare sau de
aceeaşi mărime cu perechea a doua (A2) fiind de asemenea mai submetacentrică. Celelalte
perechi se dispun în ordinea descrescătoare a raportului braţelor.
Grupa B cuprinde perechile 5-10. Perechile 5 şi 10 reprezintă cromosomi metacentrici, uşor
de identificată. Perechea B6 este formată din subtelocentrici, cu un raport mare al braţelor şi se
poate relativ uşor identifica. Perechile B7-B9 se dispun în ordinea descrescătoare a raportului
braţelor cromosomiale.
Grupa C cuprinde perechile 11-15. Prima pereche a acestei grupe, se poate uşor identifica,
fiind vorba de cromosomi subtelocentrici. Ultima pereche a grupei se identifică mai greu
(constituind cei mai mici submetacentrici). În cadrul acestei grupe, perechile 13 şi 14 se deosebesc
greu, fiind cromosomi submetacentrici asemănători.
 Grupa D cuprinde 4 perechi de cromosomi subtelocentrici asemănători între ei, dar
deosebiţi uşor de toţi ceilalţi.
Grupa E este constituită dintr-o singură pereche de cromosomi metacentrici mici, iar grupa
F din perechea 21 de cromosomi subtelocentrici.

Fig. 23 Cariotipul (sus) şi metafaza care a stat la baza întocmirii acestuia (jos), la Mesocricetus auratus (2n = 44)
(Raicu şi Nachtigal, 1969)
Cariotipul la unele plante de cultură
Metodele de alcătuire a cariotipului sunt relativ diferite în funcţie de specie şi de autori.
Prezentăm în cele ce urmează cariotipurile la câteva specii de plante cultivate.
Cariotipul şi idiograma la Allium cepa L. (2n=16)
Conform studiilor noastre (utilizând o prefixare a rădăcinilor, timp de 2 ore la temperatura
camerei, cu o soluţie de colchicină 0,2%; după prefixare, prelucrarea materialului s-a realizat după
metoda Feulgen), raportând datele obţinute la nomenclatura după Levan şi colab., 1964, am
realizat cariotipul şi idiograma la Allium cepa L. (2n = 16) (Fig. 25). Utilizând sistemul de stabilire
a tipurilor de cromosomi după Levan şi colab. (1964), am încadrat cele opt perechi de cromosomi
de la ceapă în două grupe:
 cromosomi metacentrici – mediani în sens strict – M (perechea VII) - în regiune
mediană – m (per. I, II, III, IV, V, VIII);
 cromosomi subtelocentrici – cu satelit, la nivelul braţului scurt (perechea VI).
Perechile de cromosomi omologi au fost numerotate de la I la VIII în ordinea
descrescătoare a lungimii totale.
 10

I II III IV V V I V II V III

Fig.25 Metafază, cariotip (sus) şi idiograma (jos) la Allium cepa L. (original)

Cariotipul şi idiograma la Secale cereale L. (2n = 14)

Secara, ca şi ceapa, este un material mult folosit în cercetările de citogenetică vegetală. Ca
atare, descrierea cromosomilor mitotici la secară a fost realizată de mulţi cercetători;
caracteristicile cromosomilor de secară studiaţi de diferiţi autori prezintă diferenţe datorate probabil
polimorfismului cromosomial al acestei specii, precum şi metodelor de lucru. Diferenţele între
autori apar şi datorită sistemului diferit de clasificare a cromosomilor.
Tudose (1970), utilizând prefixarea cu soluţie de colchicină 0,2% şi colorarea prin metoda
Feulgen, grupează cromosomii la Secale cereale L. (2n = 14), în patru tipuri morfologice (Fig. 26):
 Tipul A – două perechi de cromosomi (II şi III), cu centromer median;
 Tipul B – două perechi de cromosomi (I şi VI), cu centromer submedian;
 Tipul C – o pereche de cromosomi (VIII), cu centromer submedian şi sateliţi mari,
constricţia secundară fiind uşor de evidenţiat, în regiunea ei formându-se nucleul;
 Tipul D – două perechi de cromosomi (IV şi V) cu centromer submedian, pe braţul
scurt cu o constricţie secundară şi sateliţi mici care pot fi puşi în evidenţă numai folosind
tratamente speciale (temperaturi scăzute 0°C, timp de 24-48 ore), ei apărând ca urmare a
evidenţierii zonelor heterocromatice.
Caracteristicile cantitative ale cromosomilor la Secale cereale L. (după I.Gh.Tudose, 1970)

Lungimea
Braţ totală a
Perechea de Poziţia Braţ lung Suma Indicele
scurt cromosomului
cromosomi centromerului (m) braţelor braţelor
(m)

I Submediană 7,38 4,57 11,95 12,550,12 1,61

II Mediană 5,88 5,22 11,10 11,74 0,10 1,12
III Mediană 5,72 5,19 10,91 11,550,09 1,10
IV* Submediană 5,98 3,97 9,95 11,480,12 1,50
V* Submediană 5,87 3,76 9,63 10,960,10 1,54
VI Submediană 5,75 3,57 9,32 9,950,11 1,60
VII* Submediană 6,05 2,98 9,03 11,340,12 2,03
 cromosomi cu satelit, pe braţul scurt.
 Fig.26 Cariotip (sus) şi idiogramă (jos la Secale cereale (2n = 14) (Tudose, 1970)

6. Ploidia la plante

În celulele plantelor superioare se găseşte un număr dublu de cromosomi 2n (celule

diploide), faţă de n cromosomi în spori şi gameţi (celule haploide). Datorită unor dereglări ale
diviziunii celulare, produse ca urmare a acţiunii diferiţilor factori mutageni naturali sau artificiali – de
exemplu, colchicina – numărul de cromosomi din celule se poate modifica.
Poliploidia constă în multiplicarea numărului de cromosomi din celulele somatice faţă de
numărul de bază.
Numărul de bază sau numărul fundamental (numărul de origine), notat cu x, reprezintă
setul haploid, cu cel mai mic număr de cromosomi al numărului somatic diploid de cromosomi ai
unei specii.
În anul 1916, Winkler introduce noţiunea de genom (numărul de cromosomi din garnitura
de bază x, diferenţiaţi morfologic şi genetic) şi defineşte poliploidia ca fenomenul de multiplicare a
numărului de cromosomi (Anghel şi Ignat, 1974).
După numărul de garnituri de cromosomi în celulele somatice ale plantelor, acestea pot fi:
haploide (x), diploide (2x), triploide (3x), tetraploide (4x), pentaploide (5x) etc. Gradul de ploidie (P)
al unei specii se apreciază din relaţia 2n/x. De exemplu, aplicând această relaţie, se poate afla
gradul de ploidie la speciile:
Secale cereale L. - secara diploidă (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2.
- secara tetraploidă (4x)are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4.
Triticum monococcum – grâul diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2.
Triticum durum - grâul tetraploid (4x) are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4.
Triticum aestivum - grâul hexaploid (6x) are 2n=42; n=21; x=7, deci P=2n/x=6.
Prin cercetări de citogenetică s-a constatat că, la plante, în cadrul aceluiaşi gen numărul de
cromosomi este, de obicei, un multiplu al numărului de bază x. În cadrul unor genuri există mai
multe specii cu diferite grade de ploidie, constituind serii (şiruri) poliploide, ca în cazul genului
Triticum.
În cadrul genului Rosa, se întâlnesc specii cu 2n=14; 21; 28; 35; 42; 56 de cromosomi. În
natură s-au descoperit o serie de astfel de genuri, ca: genul Chrysantemum cu x=9 - cu specii 2n=18
(2x); 36 (4x); 54 (6x); 72 (8x) şi 90 (10x) cromosomi; genul Solanum cu x=12 - cu specii 2n=24 (2x);
36 (3x); 48 (4x); 60 (5x); 72 (6x); 96 (8x); 108 (9x); 120 (10x) şi 144 (12x).
Seriile poliploide, în funcţie de numărul par sau impar de garnituri cromosomiale sau
genomuri, pot fi clasificate în:
- artioploide (artiopoliploide), cu număr par de genomuri (4x, 6x, 8x etc.);
- perisoploide (perisopoliploide), cu număr impar de genomuri (3x, 5x, 7x, 9x etc.), de
obicei sterile.
Primele organisme poliploide au apărut după apariţia procesului sexual, respectiv a fecundării,
prin care, organismele nou formate dobândesc un număr dublu de cromosomi (2n), faţă de cel al
gameţilor (n) (Tudose, 1967).
După originea cromosomilor, Kihara şi Ono (1926), clasifică pentru prima dată fenomenul de
poliploidie în:
1. Autopoliploidie (autoploidie) - multiplicarea numărului propriu de genomuri sau de seturi
(garnituri) cromosomiale.
Forme autopoliploide se cunosc la Secale cereale, Beta vulgaris, Trifolium pratensis etc.
Poliploidia este întotdeauna însoţită de importante modificări morfo-fiziologice. Creşterea
numărului de cromosomi determină mărirea nucleului, a celulei, a ţesutului şi organului şi / sau a
organismului, ajungându-se astfel la gigantism.Se pare că fiecărui gen de organisme îi este
caracteristic un nivel optim al efectului pozitiv al poliploidizării, nivel care dacă este depăşit, poate
determina efecte negative (Coman, 1991).
La plante, care se înmulţesc şi vegetativ, poliploidia s-a dovedit a fi avantajoasă. La
Angiosperme 64% din genurile actuale posedă serii poliploide naturale. Pentru speciile ce se
înmulţesc exclusiv pe cale sexuată, poliploidia este dezavantajoasă determinând dereglarea meiozei
şi scăderea fertilităţii. Poliploidia este prezentă şi în grupul Gimnospermelor şi al Pteridofitelor, dar
în procente mai mici. Prezenţa poliploidiei în regnul vegetal este mult mai mare decât în cadrul
regnului animal (Coman, 1991).
Poliploidia este foarte răspândită în special în special în regiunile cu climat mai aspru: regiuni
nordice, montane, deşerturi. Un procent ridicat de specii poliploide se întâlneşte în flora Saharei, în
regiunile de ţărm ale Japoniei, unde se întâlnesc variaţii mari de temperatură, în regiunile sărăturoase
etc. Este interesant de remarcat că procesul de apariţie al autopoliploidiei este mai intens la plantele
cultivate, deoarece acestea sunt puse în condiţii foarte variate de mediu, fapt care măreşte
posibilitatea de apariţie a plantelor poliploide (Anghel şi Ignat, 1974).
2. Allopoliploidie (amfipoliploidie) - multiplicarea numărului de genoame prin hibridare
interspecifică şi însumarea lor la hibrid, urmată de dublarea numărului diploid de cromosomi.
De exemplu, la grâu s-a demonstrat că formele diploide au genomul A provenit de la
specia Triticum monococcum; formele tetraploide au genomul AB, cu genomul B provenit de
la specia Aegilops speltoides; formele hexaploide au genomul ABD, cu genomul D provenit
de la specia Aegilops squarrosa.
În afară de Triticum aestivum (2n=42) se cunosc în natură mai multe specii amfiploide:
Gossypium hirsutum (2n=52), provenit din hibridarea speciilor Gossypium arboreum (2n=26) cu
Gossypium raimondii (2n=26); Nicotiana tabacum (2n=42) provenită din încrucişarea speciilor
Nicotiana silvestris (2n=24) cu Nicotiana tomentosiformis (2n=24) etc.
Pseudopoliploidia - multiplicarea numărului de cromosomi are loc prin fragmentarea
cromosomilor cu centromeri multipli sau difuzi, fără a avea loc o mărire corespunzătoare a cantităţii de
ADN.
Pseudopoliploidia poate fi evidenţiată prin măsurarea lungimii cromosomilor, atunci când
fragmentarea lor este transversală; prin studiul citofotometric al cantităţii de ADN din celule sau prin
studiul comportării cromosomilor în profaza sau metafaza diviziunii mitotice reducţionale.
Pseudopoliploidia a fost observată la speciile câtorva genuri de plante (Carex) sau animale
(Ascaris) etc.
Metode pentru inducerea autopoliploidiei la plante
În general, pentru ploidizare se folosesc specii de plante ce prezintă un număr redus de
cromosomi în celulele somatice, plante alogame, plante cultivate pentru organele lor vegetative etc.
Obţinerea autotetraploizilor se poate realiza prin distrugerea fusului de diviziune sau oprirea
plasmodierezei din timpul diviziunii celulare. În acest scop se folosesc mai multe metode:
a. Metoda centrifugării, elaborată de Kostoff (1937) constă în centrifugarea plantelor cu
ţesuturi meristematice, în vederea distrugerii fusului de diviziune şi formarea celulelor cu număr dublu
de cromosomi. Metoda este greoaie şi prezintă o serie de dezavantaje. Astfel, numai o mică parte din
celulele meristematice devin poliploide, ele fiind de obicei eliminate ulterior, deoarece viteza lor de
diviziune este mai mică decât a majorităţii celulelor diploide.
b. Metoda şocurilor de temperatură, elaborată de Randolph (1932) se bazează pe
influenţa şocurilor de temperatură ridicată asupra primelor mitoze ale zigotului. Astfel, un şoc de
temperatură de 43-45, timp de 24 de ore, asupra zigotului la Zea mays produce 5% plante poliploide.
c. Metoda poliembrioniei, bazată pe observaţiile lui Muntzing (1938) conform cărora la
majoritatea plantelor superioare se află un procent redus de seminţe cu doi sau mai mulţi embrioni (la
Gramineae, aproximativ 0,007-0,15%), dintre care o parte (5%) au un număr diferit de cromosomi.
d. Metoda acţionării cu insecte parazite asupra vârfurilor de creştere ale plantelor,
bazată pe observaţia că galele prezintă celule poliploide. Metoda este dificilă, obţinându-se un
procent mic de plante poliploide.
e. Metoda regenerării, elaborată de Winkler (1916) şi Joergensen (1928), se bazează pe
observaţia că o parte din lăstarii proveniţi din rănirea calusului format în urma tăierii altoiului de la locul
de altoire, sunt poliploizi. Metoda se utilizează la speciile care se pretează la altoire (din genurile
Solanum, Nicotiana etc.).
f. Metoda iradierii, utilizată în vederea distrugerii fusului de diviziune, urmată de formarea
gameţilor diploizi sau a celulelor somatice poliploide (prin autopoliploidie), precum şi fragmentarea
cromosomilor. Astfel, în mod experimental, în urma iradierii cu radiaţii gamma a seminţelor uscate de
Lactuca sativa soiul "Polul Nord" (2n=18) s-au obţinut celule somatice tetraploide (2n=36) şi
octoploide (2n=72). Celulele tetraploide au fost obţinute printr-un proces de autopoliploidie, în urma
distrugerii fusului de diviziune, iar celulele octoploide datorită fenomenului de pseudoautopoliploidie,
prin fragmentarea ulterioară a tuturor cromosomilor unei celule autotetraploide.
g. Acţiunea substanţelor de tipul paradiclorbenzenului împiedică plasmodiereza,
rezultând celule cu două sau mai multe nuclee ce pot fuziona ulterior.
h. Metoda colchicinizării, bazată pe proprietatea colchicinei şi a altor substanţe (acenaften,
feniluretan etc.) de a inhiba sau e a distruge fusul de diviziune, rezultând, în urma diviziunilor, celule al
căror nucleu de restituţie are număr dublu de cromosomi.
Descoperirea în 1937 de către Blakeslee şi Avery a efectului poliploidizant al
colchicinei asupra plantelor a deschis noi perspective de obţinere experimentală a
poliploizilor (Anghel şi Igat, 1974).
Colchicinizarea se efectuează cu o soluţie de 0,05 -1% colchicină în care se introduc seminţe
negerminate, seminţe germinate sau plantule. Soluţia de colchicină poate fi aplicată şi pe vârfurile de
creştere: direct (Bragdo, 1955 - la secară; Sears, 1941 - la grâu; Mihăilescu şi Raicu, 1968 - la orz;
Raicu şi Anghel, 1966 - la Citrullus vulgare) sau în amestec cu agar-agar (Swaminathan, 1951 - la
cartof), sau ca pastă de lanolină-cu acid indolil-3-acetic (Howard şi Swaminathan, 1953 - la
Solanum demissum), în vederea împiedicării evaporării ei rapide. La pomi şi viţă de vie se tratează
mugurii cu soluţie de colchicină. Timpul de acţiune şi concentraţia diferă de la o specie la alta. Soluţia
de colchicină se consideră cu acţiune optimă atunci când: o parte din plante pier, o parte din plantele
tratate devin mixoploide (cu celulele în diferite grade de ploidie) datorită unei colchicinizări parţiale, iar
o parte din plante devin autotetraploide.

7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante

Pentru depistarea organismelor poliploide naturale din cadrul populaţiei unei specii sau pentru
evidenţierea speciilor poliploide ale unui gen, ca şi pentru determinarea indivizilor poliploizi produşi pe
cale artificială în vederea separării lor dintr-un amestec, au fost elaborate o serie de metode directe şi
indirecte.
Metodele directe sunt metodele prin care se determină cu precizie gradul de ploidie. Prin
cercetări de citogenetică s-a constatat că, la plante, în cadrul aceluiaşi gen numărul de cromosomi
este, de obicei, un multiplu al numărului de bază x.
Metodele indirecte sunt metodele bazate pe corelaţia existentă între gradul de ploidie şi
anumite caracteristici macroscopice şi microscopice ale plantelor. Deşi aceste metode nu sunt atât de
precise ca metodele directe, ele se pot utiliza cu succes, în special pentru deosebirea plantelor
poliploide de cele diploide de la care au provenit, în general pentru trierea materialului biologic.

Metode directe de determinare a gradului de ploidie la plante

Pentru evidenţierea cromosomilor în diviziune mitotică şi meiotică la plante au fost descrise în
capitolele anterioare o serie de metode. Ca exemplu de determinare a numărului de cromosomi la o
serie poliploidă naturală s-a ales seria amfiploidă a genului Triticum, în cadrul căreia există specii
diploide, tetraploide şi hexaploide.

Metoda Feulgen pentru evidenţierea şi numărarea cromosomilor în diviziune mitotică

la Triticum monococcum, Triticum dicoccum şi Triticum aestivum
Studiul cromosomilor se realizează în diviziunea mitotică a celulelor meristematice din
apexul radicular, la cele trei specii de grâu.
Etape de lucru:
Germinarea
Se pun la germinat cariopse din cele trei specii de Triticum în cutii Petri, pe hârtie de filtru
umectata cu apă, la temperatura camerei(se recomandă plasarea hârtiei de filtru şi pe capacul cutiilor
Petri pentru crearea unei atmosfere umede şi pentru împiedicarea pătrunderii luminii puternice).
Germinarea se realizează în timp relativ scurt, în 2-3 zile rădăciniţele atingând dimensiunea de 10-15
mm.
Prefixare
 Rădăciniţele se prelevă, realizându-se prefixarea în fiole de sticlă, în soluţie de colchicină
0,2%, timp de 2 ore, la temperatura camerei. Se poate realiza şi o prefixare a cariopselor cu
rădăciniţe (plasate în cutii Petri) la temperaturi scăzute (0-4C), timp de 12-24 de ore.
Prefixarea este necesara deoarece, cele trei specii de Triticum, în special Triticum
aestivum, prezintă un număr relativ mare de cromosomi, cromosomi relativ lungi. Ca urmare a
prefixarii se produce o scurtare apreciabilă a cromosomilor, o individualizare şi colorare intensă, astfel
încât cromosomii se pot observa şi număra uşor.
Fixarea
Fixarea rădăciniţelor se realizează în fixator Battaglia, la temperatura camerei, timp de 20-25
de minute.
Spălarea
Spălarea rădăciniţelor de urmele de fixator se realizează în HCl 1N, timp de 5 minute, la
temperatura camerei; se îndepărtează soluţia de fixare şi se adaugă soluţia de spălare.
Hidroliza
Hidroliza se efectuează în soluţie de HCl 50%, timp de 25-30 de minute, la temperatura
camerei.
Colorarea
După îndepărtarea soluţiei de hidroliză se efectuează colorarea cu fuxină bazică decolorată
(reactiv Schiff), la temperatura camerei, timp de 15-30 de minute, până când vârfurile rădăciniţelor
prezintă culoarea roşu-violet închis.
Efectuarea preparatelor microscopice
Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop curată şi uscată, într-o
picătură de acid acetic 45%. Se procedează ca la metoda Feulgen pentru studiul cromosomilor în
mitoză la ceapă, dar se recomandă realizarea unei cât mai bune etalări pentru dispersarea
cromosomilor, în vederea observării lor individuale şi a numărării cu uşurinţă.
Studiul preparatelor la microscop
Preparatele se studiază la microscop, la un obiectiv cu putere de mărire ridicată, în lumină
puternică, utilizând un filtru verde care măreşte contrastul între cromosomi şi citoplasmă. Se studiază
doar metafazele, când cromosomii sunt spiralizaţi şi contractaţi, sunt puternic coloraţi şi datorită
dispersării prin etalare, se observă individual şi pot fi uşor număraţi.
Pe cele mai bune preparate se pot observa şi număra pentru Triticum monococcum 14
cromosomi, pentru Triticum dicoccum 28 de cromosomi şi pentru Triticum aestivum 42 de
cromosomi. Morfologia cromosomilor poate fi studiată folosind obiectivul de imersie. Atunci când
dorim să efectuăm cariotipul şi idiograma speciilor studiate se efectuează microfotografii, se
decupează cromosomii şi se aşează în ordinea descrescândă a lungimii lor, luându-se în consideraţie
poziţia centromerului, a constricţiilor secundare etc.
Astfel se constată originea hexaploidă a speciei Triticum aestivum (2n=6x=42), precum şi
tetraploidia speciei Triticum dicoccum (2n=4x=28) şi diploidia speciei Triticum monococcum
(2n=2x=14).
Efectuarea preparatelor semipermanente şi permanente
Cele mai reuşite preparate, pe care se pot uşor număra cromosomii se pot efectua
semipermanent sau permanent, după metodele descrise anterior. Preparatele permanente pot servi
drept model.

Metode indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante

Metodele indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante sunt mai puţin precise în
comparaţie cu metodele directe, dar sunt mai rapide şi mai puţin costisitoare, folosindu-se cu
succes în staţiunile de ameliorare a plantelor de cultură pentru a tria plantele poliploide dintr-un
amestec sau pentru a separa plantele tetraploide de cele diploide, obţinute ca urmare a
tratamentului cu colchicină.
Aceste metode se bazează, în esenţă, pe corelaţia dintre gradul de ploidie al plantelor şi
diferite caractere morfologice macroscopice şi microscopice ale plantelor.

Metoda determinării gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere

morfologice macroscopice
Primii cercetători ai fenomenului de poliploidie au remarcat existenţa unei corelaţii între
numărul de garnituri cromosomiale şi unele caractere morfologice macroscopice. Modificările de
ordin morfologic afectează diverse organe sau planta în întregime; ele sunt într-o anumită măsură
diferite la diferitele specii de plante, dar unele prezintă un caracter general.

Metode de determinare a gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere

microscopice
Aceste metode se bazează pe corelaţia existentă la plante între numărul garniturilor
cromosomiale şi unele caractere microscopice, cum ar fi: mărimea şi densitatea stomatelor, numărul
de cloroplaste din celulele stomatelor, numărul cromocentrilor nucleolari, diametrul grăuncioarelor de
polen, numărul de pori germinativi ai grăuncioarelor de polen etc.
A. Metoda examinării stomatelor
a. Determinarea mărimii stomatelor
De regulă, se studiază lungimea stomatelor, care este mai constantă decât lăţimea, care
variază cu gradul de deschidere al ostiolei. Astfel, s-a constatat o corelaţie pozitivă între lungimea
stomatelor şi numărul de garnituri cromosomiale din celule la speciile diploide, triploide şi tetraploide.
Prin studiul comparativ al dimensiunii stomatelor la plantele 2x şi 4x, aparţinând la 9 specii
diferite Raicu şi colab., în 1965, au constatat că la formele tetraploide lungimea stomatelor este cu
29,2-85,7% mai mare decât la speciile diploide, diferenţele fiind în toate cazurile semnificative.
Mod de lucru:
Se aleg frunze de Triticum monococcum L. (2n=2x=14) şi Triticum aestivum L.
(2n=6x=42); se desprinde cu o lamă de bărbierit o porţiune de câţiva mm. de epidermă inferioară şi
se plasează pe lamă într-o picătură de apă; se studiază la microscop, determinându-se lungimea
stomatelor.
Se calculează media şi abaterea standard a mediei la cel puţin 100 de stomate; valorile sunt
exprimate în microni.
Amplitudinea variaţiei lungimii stomatelor la formele poliploide este mai mare decât la formele
diploide, recomandându-se ca numărul măsurătorilor efectuate sa fie suficient de mare (peste 100).
b. Determinarea densităţii stomatelor pe unitatea de suprafaţă foliară
Densitatea stomatelor pe unitatea de suprafaţă foliară este invers proporţională cu gradul
de ploidie, fiind mai mică la formele poliploide, datorită faptului că celulele, respectiv stomatele
plantelor poliploide au dimensiuni superioare diploizilor. S-a constatat că valorile relative ale
frecvenţei stomatelor la poliploizi nu reprezintă decât 31,5-71,8% din valoarea de 100% la diploizi.
Mod de lucru:
Se aleg frunze de sfeclă de zahăr - Beta vulgaris (2x, 3x şi 4x); se desprinde cu o lamă de
bărbierit o porţiune de câţiva mm. de epidermă inferioară şi se plasează pe o lamă de microscop într-
o picătură de apă; se studiază la microscop, determinându-se densitatea stomatelor. Pentru
calcularea densităţii stomatelor se notează numărul de stomate din aproximativ 100 de câmpuri
microscopice, calculându-se apoi media şi eroarea ei. se calculează suprafaţa câmpului microscopic
după formula r2 şi se raportează, utilizând regula de trei simple, numărul de stomate la unitatea de
suprafaţă folosită (1mm2).
c. Stabilirea numărului de cloroplaste din celulele stomatelor
Mochizuki şi Sueoka, în 1955, au demonstrat existenţa unei corelaţii directe între numărul
de cloroplaste din celulele stomatelor şi gradul de ploidie al plantelor. Cercetările au arătat că
numărul de cloroplaste din stomate variază puţin faţă de condiţiile de mediu; la sfecla de zahăr
numărul este identic în diferite porţiuni ale frunzei (bază, mijloc sau vârf), precum şi pe cele două
feţe ale frunzei. În schimb, numărul de cloroplaste variază cu vârsta ontogenetică a plantelor.
Materiale necesare:
- lame de microscop, lamele, hârtie de filtru, lame de bărbierit, pensete
Reactivi:
- soluţie I în KI – 1g. iod metalic, 2g. KI la 30 cc apă distilată
- fixator alcool - acid acetic (3/1)
Mod de lucru:
Alegerea plantelor
Pentru studiul cloroplastelor se aleg plante tinere de sfeclă de zahăr, aflate în aceeaşi fază
de vegetaţie (3-4 frunze). Se recomandă ca recoltarea frunzelor să se efectueze dimineaţa, la o
oră după răsăritul soarelui, atunci când frunzele sunt turgescente şi conţin maximum de clorofilă;
excesul de lumină şi căldură provoacă închiderea stomatelor.
 Numărarea cloroplastelor din cele două celule ale unei stomate poate fi efectuată la
frunzele proaspete sau la frunzele conservate.
Conservarea materialului
Conservarea se realizează în fixator alcool - acid acetic (3/1), materialul putând fi păstrat
timp de 2 - 4 ani de la recoltare.
Efectuarea preparatelor microscopice
Numărarea cloroplastelor se poate efectua direct, cu ajutorul microscopului cu contrast de
fază, tehnică ce nu dă rezultate precise. De aceea, se recomandă evidenţierea cloroplastelor prin
colorare cu o soluţie de I în KI.
Cu ajutorul unei pensete cu vârfurile ascuţite, cu un bisturiu, ac spatulat sau cu o lamă de
bărbierit, se desprinde o porţiune de epidermă inferioară, de aproximativ 0,5 - 1 cm 2, şi se
plasează pe o lamă de microscop, într-o picătură de iod în iodură de potasiu. Se acoperă
preparatul cu o lamelă, evitându-se formarea bulelor de aer între lamă şi lamelă. Colorarea se
realizează aproape instantaneu, dar se recomandă o perioadă de 3-4 minute pentru colorarea
intensă a cloroplastelor. Cu o bucată de hârtie de filtru se îndepărtează excesul de substanţă; nu
se recomandă etalarea.
Examinarea preparatelor la microscop
Preparatele se studiază imediat după realizare la microscopul optic, în lumină puternică, cu
obiective mai mici (până la 40x) deoarece stomatele sunt mari, cloroplastele sunt evidente, se
colorează bine şi pot fi observate şi numărate cu uşurinţă.
În cazul în care colorarea s-a efectuat cu iod în iodură de potasiu pe material proaspăt,
cloroplastele se colorează în bleu, datorită conţinutului în amidon. Când materialul este conservat,
amidonul se degradează şi cloroplastele se colorează în brun închis. Celelalte elemente celulare
apar colorate în galben deschis.
La microscop se observă celulele epidermice cu pereţi sinuoşi şi stomatele reniforme; se
numără cloroplastele din cele două celule stomatice, la minim 25-30 stomate, calculându-se media şi
abaterea ei.
În cazul acestei metode, corelaţia existentă între gradul de ploidie la sfecla de zahăr şi
numărul de cloroplaste din cele două celule ale unei stomate este următoarea:
Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploidă (2x), 18 cromosomi într-o celulă somatică =
18 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate.
Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploidă (3x), 27 de cromosomi într-o celulă somatică =
27 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate.
Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploidă (4x), 36 de cromosomi într-o celulă
somatică = 36 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate.
Subliniem faptul că, la microscop, se pot observa la formele 2x de sfeclă de zahăr câte 9
cloroplaste în fiecare celulă stomatică, cât şi celule care au repartizate cloroplastele în mod inegal în
cele două celule stomatice; se întâlnesc adesea şi celule stomatice cu un număr mai mic de
cloroplaste. Întotdeauna pentru formele diploide (2n=18) se obţine o medie a numărului de cloroplaste
mai mică de 18 şi foarte rar mult apropiată de 18. Atunci când media numărului de cloroplaste nu
depăşeşte 18, se consideră că forma respectivă este diploidă.
Când numărul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 27, forma respectivă este
triploidă, iar când numărul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 36 este o formă de sfeclă
de zahăr tetraploidă.
Această metodă se foloseşte cu succes la trierea materialului la sfecla de zahăr, în vederea
separării formelor triploide şi tetraploide de cele diploide, dintr-un amestec.
Preparatele microscopice (Fig. 32) se studiază imediat după realizare şi se pot efectua
microfotografii. Preparatele se pot păstra doar un timp scurt, prin efectuarea lor semipermanente.
 Fig. 32 Imaginea microscopică a unei stomate şi a cloroplastelor la Beta vulgaris (coloraţie cu iod în iodură de
potasiu, 40x) (original)

B. Metoda evidenţierii cromocentrilor nucleolari

Metoda a fost elaborată de Reitberger, în 1956, pe baza cercetărilor sale la Beta vulgaris L.,
şi se bazează pe corelaţia între numărul de cromocentri nucleolari şi gradul de ploidie al plantelor. La
sfecla de zahăr fiecare garnitură de cromosomi prezintă un cromosom cu satelit (heterocromatic).
Constricţia secundară este organizatoare nucleolară, astfel că, la nivelul său se formează un nucleol.
În telofază, partea heterocromatică reprezentată de satelit rămâne ataşată de nucleol; formând un
cromocentru, care poate fi evidenţiat prin colorare cu coloranţi specifici nucleului, nu numai în timpul
diviziunii celulare, ci şi în interfază.
Metoda elaborată de Reitberger se bazează tocmai pe capacitatea cromocentrilor de a se
colora în interfază şi pe existenţa unui cromocentru pentru fiecare garnitură de cromosomi; mărirea
numărului de garnituri cromosomiale implică mărirea numărului de cromocentri nucleolari.
Astfel, formele diploide (2x) prezintă doi cromocentri, formele triploide (3x) – trei
cromocentri şi formele tetraploide (4x) – patru cromocentri nucleolari. Cromocentrii se află de
obicei grupaţi în jurul unui singur nucleol; uneori, însă, sunt mai mulţi nucleoli în jurul cărora se
grupează cromocentrii (Fig. 33).

Fig. 33 Schema distribuţiei cromocentrilor nucleolari la nivelul nucleului, la Beta vulgaris L. (original)

Cercetările lui Reitberger au arătat că, la plantele diploide, cei doi cromocentri sunt aşezaţi
în jurul unui singur nucleol, întâlnindu-se mai rar situaţia când ei sunt plasaţi pe câte un nucleol; la
fel şi pentru plantele triploide, unde se întâlnesc frecvent celule cu trei cromocentri plasaţi pe un
nucleol, mai rar fiind grupaţi pe doi sau pe trei nucleoli; la plantele tetraploide, în majoritatea
cazurilor cei patru cromocentri sunt plasaţi pe un singur nucleol, mai rar pe doi, pe trei sau patru
nucleoli. În general, cromocentrii se dispun simetric în jurul nucleolului, al cărui volum este în
raport direct cu numărul de cromocentri; astfel, nucleolul cu patru cromocentri are un volum mai
mare faţă de nucleolul cu trei, doi sau un cromocentru.
Mod de lucru:
Alegerea materialului
Se utilizează frunze de 4-5 cm. lungime, recoltate de la plante de sfeclă de zahăr – Beta
vulgaris L., în vârstă de 2 luni, provenite din seminţe.
Fixarea
 Fixarea frunzelor se realizează în fixatorul alcool-acid acetic (3/1), în care materialul se
poate păstra timp îndelungat.
Colorarea
Colorarea se realizează în soluţie carmin-acetică, timp de 15 min.
Efectuarea preparatelor microscopice
Preparatul se realizează pe o lamă de microscop, în 1-2 picături de carmin acetic. Cu
ajutorul unei lame de bărbierit, se desprinde o porţiune (de 0,5-1 cm.2) din epiderma inferioară a
unei frunze şi se plasează pe o lamă de microscop, în 1-2 picături de carmin-acetic. Se agită
colorantul cu un ac spatulat în vederea unei mai bune colorări. Colorarea se realizează la
temperatura camerei, timp de 15-20 de minute (eventual, lama poate fi încălzită 10-15 min. la
flacăra unei spirtiere, evitând fierberea şi adăugând noi picături de colorant). Se acoperă
preparatul cu lamela, fără a realiza etalarea, ce poate duce la deplasarea cromocentrilor.
Examinarea preparatelor la microscop
Preparatele se studiază la microscop, în lumină puternică, cu filtru verde. Studiul se
realizează în nucleele celulelor epidermei inferioare, colorate în roşu carmin, nucleolii rămânând
slab coloraţi. Cromocentrii se observă ca nişte corpusculi mici, de formă sferică, plasaţi la periferia
nucleolului sau a nucleolilor, coloraţi în roşu intens spre negru, mai intens în comparaţie cu nucleul
şi foarte intens faţă de nucleol. Prin mişcarea fină a şurubului micrometric, cromocentrii pot fi
observaţi cu uşurinţă. Prin observarea câtorva celule se poate constata gradul de ploidie.
La Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploidă (2x), 18 cromosomi într-o celulă
somatică (două garnituri cromosomiale) = 2 cromocentri nucleolari.
Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploidă (3x), 27 de cromosomi într-o celulă somatică (3
garnituri cromosomiale) = 3 cromocentri nucleolari.
Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploidă (4x), 36 de cromosomi într-o celulă
somatică (4 garnituri cromosomiale) = 4 cromocentri nucleolari.
Cercetările au arătat că, la plantele 2x, cromocentrii sunt mult mai vizibili la microscopul
optic, în comparaţie cu cei de la plantele 3x şi 4x. S-a constatat că, pentru plantele virozate şi
bolnave, utilizarea acestei metode dă rezultate eronate; în acest caz se recomandă folosirea
metodei determinării numărului de cloroplaste din celulele stomatelor.
Preparatele microscopice nu se pot efectua permanent, astfel încât se recomandă
studierea lor imediat după realizare şi efectuarea de microfotografii. Preparatele se pot efectua
semipermanente şi vor fi examinate a doua zi.
C. Metoda examinării grăuncioarelor de polen
Metoda vizează două aspecte morfologice ale grăuncioarelor de polen (diametrul şi
numărul de pori germinativi) cu ajutorul cărora se poate aprecia gradul de ploidie la unele plante.

8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura

Anomaliile de structură sunt evidenţiate de modificările morfologiei cromosomilor, însoţite
de modificări cantitative ale materialului genetic sau de modificări ale poziţiilor genelor în
cromosomi. Ele apar fie ca urmare a lezionării cromosomului în faza G1 prereplicativă a ciclului
celular (aberaţii de tip cromosomial), fie în urma lezionării cromatidelor surori în faza S şi G2
(aberaţii de tip cromatidic).
Anomalii structurale ale cromosomilor şi cauzele lor [Socaciu, 1996].

Anomalia
A. Aberaţii de tip cromosomial
I. Intracromosomiale
1. Deleţii de fragmente acentrice
2. Inele acentrice
3. Cromosomi inelari
4. Inversii pericentrice şi paracentrice
5. Translocaţia intracromosomială
6. Discontinuităţi cromosomiale
7. Izocromosomi (cromosomi metacentrici
Cauza
Lezionarea cromosomilor în faza G1
deleţii cromosomiale terminale sau intercalare
deleţii ale cromatidelor (asocieri interbraţe)
deleţii ale ambelor braţe ale cromosomilor şi
unirea capetelor
răsuciri de 180o ale segmentelor între două
puncte de deleţie
dislocare prin deleţie a unui fragment şi fixare pe
celălalt braţ al cromosomului
lipsa materialului genetic (AND) pe porţiunile
afectate
clivaj intercromatidic transversal la nivelul
 neomologi) centromerului
II: Intercromosomiale simetrice sau asimetrice
1. Translocaţii reciproce schimb de segmente acentrice distale din doi
cromosomi neomologi
2. Fuziuni centrice intercromosomiale (translocaţie fuziunea a doi cromosomi neomologi acentrici
robertsoniană)
3. Cromosomi policentrici fuziune de fragmente centrice după o deleţie
terminală
4. Cromosomi duplicaţi fixare pe cromosom a unui fragment acentric,
dislocat prin deleţie de la un cromosom omolog
B. Aberaţii de tip cromatidic Lezionarea cromatidelor surori
1. Fragmente izolate lezionarea unei cromatide
2. Translocaţia intracromatidică (inversie dislocare de fragmente de la fiecare braţ al
pericentrică) cromatidei şi sudare la braţe diferite
3. Ruptura cromosomială separarea unui fragment cromatidic de restul
cromosomilor
4. Lacuna cromosomială ruptură cromatidică neexteriorizată în metafază
datorită plierii cromatinei

T ip u l d e a b era ţie D iag ram a T ip u l d e a b era ţie D iag ra m a

1 . G a p s a u la c u n ă cro m o so m ic ă 1 0 . S ch im in te rcro m o so m ia l sim e tric

2 . D e le ţie cro m o so m ia lă - fra g m e n t

11 . S ch im b in tra c ro m o s o m ia l a sim e tric

3 . C ro m o s o m d ic e n tric
şi frg a m e n t

4 . C ro m o s o m in e la r
şi fra g m e n t 1 2 . S ch im b in tra cro m o so m ia l sim e tric

5 . In e l a c e n tric

6 . G a p s a u la c u n ă cro m a tid ic ă 1 3 . D e le ţie in te rs tiţia lă

(la n iv e lu l u n e i cro m a tid e )

7 . D e le ţie cro m a tid ic ă

fra g m e n t cro m a tid ic
1 4 . S ch im b u ri
iz o c ro m a tid ic e /cro m a tid ic e

a . C ro m o s o m d ic e n tric
trira d ia l ş i fra g m e n t

8 . D e le ţie izo c ro m a tid ic ă

b . C ro m o s o m
m o n o ce n tric trira d ia l

1 5 . Izo c ro m o s o m i

9 . S c h im b in te rcro m o so m ia l a s im e tric

Fig. 34 Principalele tipuri de aberaţii cromosomiale (modificat după Scott şi colab., 1983 şi Gavrilă,1986)

8.1. Studiul aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la unele plante de

cultură
Ca rezultat al deleţiilor cromosomiale apar în ana-telofaza mitozei aberaţii cromosomiale,
vizibile la microscopul optic (colorând materialul biologic mutagenizat cu un colorant specific
nuclear), de tipul:
- fragmente acentrice (lipsite de centromer) - nu migrează spre poli, se pierd în cursul
diviziunilor succesive, fiind metabolizate. Se produce astfel un dezechilibru în doza genelor, ceea
ce, în general conduce la moartea celulei respective.
- fragmente centrice (cromosomi inelari, inele centrice) - formate în urma a două deleţii
terminale la nivelul unui cromosom, ca urmare a reunirii capetelor fără telomeri. Fragmentele
centrice, deoarece posedă centromerul cromosomului, pot participa la diviziune.
- inele acentrice - rezultate în urma reunirii capetelor unor fragmente acentrice mari, în
cazul în care deleţia a fost produsă în aşa fel încât nici un capăt al fragmentului nu posedă
telomer.
- punţi (cromosomi dicentrici sau policentrici)- de regulă sunt rezultatul reunirii a doi
cromosomi ce au suferit deleţii terminale. Respectivii cromosomi formează una sau mai multe
punţi, vizibile între cele două mase cromatidice separate la polii celulei.
- micronuclee
Există şi alte tipuri de aberaţii ce se pot evidenţia în ana-telofaza mitozei, la microscopul
optic:
- cromosomi retardartari - sunt cromosomi la care centromerul şi-a pierdut capacitatea de
cuplare la fibra fusorială. Ei nu pot participa la diviziune, nu pot migra spre polii celulei,
dezechilibrând repartiţia cromosomilor între cele două celule fiice.
- ana-telofaze tripolare, tetrapolare, multipolare - provocate de formarea defectuoasă a
fusului de diviziune. Apar fusuri de diviziune cu 3, 4 sau mai mulţi poli. Cromatidele cromosomilor,
după clivare, migrează în 3, 4 sau mai multe direcţii, ceea ce va conduce la repartizarea inegală a
cromatidelor între celulele fiice rezultate.
Frecvent, multe dintre aberaţiile cromosomiale descrise se pot asocia. Cele mai frecvente
asocieri sunt de tipul: punţi + fragmente, punţi + cromosomi retardatari, punţi + micronuclee etc.
Material biologic:
- cariopse de grâu – Triticum aestivum L.(2n=42)
- boabe de bob – Vicia faba L. (2n=12)
Reactivi:
- soluţii de cafeină de diferite concentraţii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%)
- soluţii de nicotină de diferite concentraţii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%)
- apă distilată
- fixator (alcool-acid acetic 3/1 sau Battaglia)
- HCl 1N
- HCl 50%
- acid acetic 45%
- reactiv Schiff
Instrumentar, sticlărie:
- cutii Petri
- hârtie de filtru
- pensete
- lame
- lame şi lamele pentru microscop
Mod de lucru:
1. Germinarea
- în cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru, umectată cu apă distilată. Germinarea se va
desfăşura la întuneric, la 23-240C, până în momentul în care rădăciniţele vor avea cca. 10 mm
lungime.
2. Tratamentul mutagen
- prin imersia materialului în soluţiile de mutagen, timp de expunere 3 ore.
3. Spălare
-în apă distilată, de trei ori, câte 10 minute
4. Fixarea
-detaşarea rădăciniţelor de pe cariopse şi fixare în fixator Battaglia pentru 25 minute, la
temperatura camerei
5. Spălare
- cu HCl 1N timp de 5 minute, la temperatura camerei
6. Hidroliză
- cu HCl 50%, cca. 30 minute, la temperatura camerei
7. Colorare
 - cu reactiv Schiff, 15-30 minute, la temperatura camerei
8. Efectuarea preparatelor microscopice
- radăciniţa la bob, sau rădăciniţele unei cariopse de grâu se plasează pe o lamă de
microscop, într-o picătură de acid acetic 45%. Preparatul microscopic se realizează prin tehnica
squash
9. Studiul preparatelor
- se studiază ana-telofazele normale şi aberante, notâdu-se tipurile de aberaţii şi numărul
aberaţiilor cromosomiale
10. Efectuarea preparatelor permanente
- dacă materialul prezintă frecvente aberaţii, preparatele respective se efectuează
permanent.
În Fig. 35 – 38 sunt prezentate aspecte ale aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei
la bob, induse prin tratamente cu mutageni chimici.

Fig. 35 Ana-telofază cu punte la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 36 Ana-telofază cu punte şi fragment la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 37 Ana-telofază cu punţi la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 38 Interfază cu micronucleu la Vicia faba (40x) (original)

9. Drosophila melanogaster – obiect de studiu in genetica

Utilizarea musculiţei de oţet (Drosophila melanogaster) drept obiect de studiu în genetică

se datorează câtorva avantaje pe care această insectă le oferă cercetătorilor:
 creştere relativ uşoară în laborator, pe o largă varietate de medii simple;
  timpul scurt necesar obţinerii unei noi generaţii - 9-11 zile la 25oC;
 prolificitate mare (câteva sute de descendenţi dintr-un singur cuplu de adulţi);
 dimensiuni reduse;
 caractere de sex bine definite, uşor de recunoscut;
 numărul mic de cromosomi (2n=8), cu morfologie caracteristică;
 prezenţa în celulele glandelor salivare de la larve a cromosomilor uriaşi.
Ciclul vital
Succesiunea rapidă a generaţiilor precum şi marea prolificitate a unui organism reprezintă
caracteristici atractive în studiile de genetică. Ciclul vital la Drosophila melanogaster (Ord.
Diptera, Fam. Drosophilidae) cuprinde patru stadii (Fig. 39):
 ou;
 larvă;
 pupă;
 adult.

ou larvă larvă larvă pupă

(stadiul I) (stadiul II) (stadiul III)
Fig.39 Etapele de dezvoltare la Drosophila melanogaster (ou - pupă)

Timpul necesar parcurgerii acestor stadii depinde de temperatura la care musculiţele sunt
menţinute. La 250C, ciclul vital se poate derula complet în circa 10 zile, în schimb, la 20 0C se poate
prelungi la 15 zile.
Cercetările au demonstrat că expunerea culturilor de Drosophila melanogaster la
temperaturi ridicate (cca. 300C), determină sterilitate, în special în rândurile masculilor şi moartea
culturii respective, iar temperaturile scăzute (de exemplu, 10 0C) prelungesc foarte mult ciclul vital
(cca. 57 zile) şi reduc viabilitatea.
Optimul de temperatură pentru creşterea musculiţelor de oţet în laborator este deci, 250C.
Oul
Femele adulte de Drosophila melanogaster încep să depună ouă la circa două zile după
ieşirea din pupă, în cazul în care au avut la dispoziţie parteneri pentru împerechere. Fiecare ou are
lungimea de aprox. 0,5 mm, este ovoidal şi de culoare albă. Pe faţa anterodorsală prezintă două
expansiuni, cu regiunile distale lăţite, sub formă de linguriţă. Aceste structuri au rol în ataşarea
oului de suprafaţa pe care este depus, împiedicând, de asemenea, scufundarea acestuia în mediu.
Dezvoltarea embrionară se realizează foarte rapid, după o zi la 25 0C, de la momentul
depunerii, din ou ieşind o larvă.
Larva
Larvele de Drosophila melanogaster au culoarea albă şi sunt segmentate. Mandibulele,
de culoare neagră, sunt bine vizibile în regiunea cefalică. Larvele sunt lipsite de orice fel de
apendici locomotori, deplasarea realizându-se prin târâre.
Stadiul larvar este caracterizat de o hrănire şi creştere deosebit de intensă. Acest stadiu se
subîmparte în trei periode, separate prin etape de năpârlire. Fiecare năpârlire conduce la
înlocuirea completă a tegumentului şi armăturii bucale, fenomenul stând la baza creşterii larvei.
Cea de-a treia perioadă (consecutivă celei de-a doua năpârliri) se finalizează cu împuparea. Cu
puţin timp înaintea declanşării acestui proces, larvele încetează să se mai hrănească şi caută
suprafeţe relativ uscate (de exemplu, pereţii vasului de cultură) de care se fixează.
Stadiul larvar durează (incluzând năpârlirile), 4-5 zile la 25 0C. In momentul declanşării
procesului de împupare, larvele au o lungime de aprox. 4,5 mm.
 Pupa
Pupa reprezintă stadiul de reorganizare morfo-fiziologică din ciclul vital de la Drosophila
melanogaster. In această etapă, cele mai multe structuri larvare sunt distruse, iar structurile
caracteristice adultului se dezvoltă pe seama ţesutului embrionar denumit disc imaginal. Aceste
ţesuturi există la nivelul larvei, dar de la formarea lor, în embriogeneză, rămân în stadiu dormind,
până în faza de pupă.
Larvele împupează în ultimul lor tegument, care iniţial moale şi de culoare albă, se întăreşte
şi se brunifică progresiv. Transformările care se petrec în interiorul pupei (deosebit de complexe,
făcând obiectul unei ramuri speciale a geneticii - genetica dezvoltării), conduc la apariţia
structurilor caracteristice adultului (imago).
Stadiul pupal durează circa 4 zile la 25 0C, iar la finele acestuia, din pupă va emerge un
adult.
Adultul
Adulţii reprezintă stadiul reproductiv din ciclul vital la Drosophila melanogaster (Fig. 40).
Adulţii se eliberează din pupe forţând regiunea anterioară a acestora. Iniţial, orice musculiţă ieşită
din pupă are corpul foarte alungit, de culoare deschisă şi aripile pliate (împachetate). După circa o
oră, aripile se extind la dimensiunea lor normală, iar corpul dobândeşte formele şi culoarea
caracteristică adultului.
Musculiţele adulte se pot împerechea la aproximativ 6 ore de la ieşirea din pupă. Sperma
este depozitată în spermateca şi receptaculele ventrale ale femelei, fiind gradual eliberată în
oviduct, pe măsura producerii ouălelor şi trecerii acestora prin oviduct spre vagin. Femele depun
astfel, câteva zile, câte 50-75 ouă pe zi. Producţia de ouă va descreşte apoi în timp, până la
dispariţia sa totală.
Durata de viaţă a unui adult de Drosophila melanogaster, la 250C, este de aprox. 37 zile.

Fig. 40 Adulţi de Drosophila melanogaster (stânga – mascul şi dreapta – femelă)

Creşterea musculiţelor de oţet în laborator

Medii
Drosophila melanogaster (2n = 8) este frecvent întâlnită în natură pe fructe şi legume
care au început să fermenteze (struguri, pere, prune, banane, roşii, etc.).
Pentru creşterea în laborator a acestei insecte, în mediul de cultură sunt absolut necesare
două componente principale: zahărul şi drojdia de bere care realizează fermentaţia. In laborator,
creşterea se realizează pe medii sintetice din compoziţia cărora nu trebuie să lipsească cele două
componente menţionate.
Mediul cu gris
Compoziţia acestui mediu este:

Griş 50 g
Zahăr 50 g
Agar fibră 10 g
Drojdie de bere 15 g
Apă de robinet 1000 ml
Acid propionic 5 ml
 Intr-un vas smălţuit în care se află 2/3 din cantitatea de apă, se dizolvă prin fierbere agarul,
apoi se adaugă drojdia, continuându-se fierberea, 45 minute, până la obţinerea unei suspensii. In
restul de 1/3 apă se pune grişul şi zahărul şi se adaugă suspensiei de agar cu drojdie. Fierberea
va fi continuată încă 15 minute, până la obţinerea unui mediu de consistenţa mierei de albine. Se
lasă câteva minute să se răcească şi se distribuie, ca şi în cazul mediului cu făină de porumb în
vase de cultură.
Similar, se pot pregăti medii în care grişul sau mălaiul să fie înlocuit de făina de grâu,
melasă, uruială de ovăz.
Mediul de banane
Larg utilizat în ţările unde aceste fructe se găsesc din abundenţă, sau au un preţ redus,
mediul de banane este cel mai simplu mediu de cultură pentru Drosophila melanogaster. Acest
mediu se prepară introducând un fragment de banană bine coaptă, în vasul de cultură, după ce, în
prealabil, banana fusese imersionată într-o suspensie de drojdie de bere.
Mediul de banane are însă şi un dezavantaj - se înmoaie foarte repede la căldură, ceea ce
face dificilă scoaterea insectelor din vas, în momentul eclozării, acestea scufundându-se în mediu.
In locul bananelor se pot folosi şi alte fructe - fragmente de pere, prune, struguri, imersionate în
suspensie de drojdie de bere.
Din cele prezentate, putem concluziona că un mediu de cultură pentru Drosophila
melanogaster, pentru a putea fi folosit cu bune rezultate, trebuie să îndeplinească următoarele
condiţii:
 să fie consistent, pentru a nu permite scufundarea adulţilor;
 să conţină suficient zahăr, necesar hrănirii larvelor şi adulţilor, cât şi pentru
declanşarea înmulţirii drojdiilor care să producă fermentaţia.
Mediul astfel pregătit poate fi folosit imediat, sau poate fi păstrat câteva zile la frigider
(+40C).
Dacă mediul oferă condiţii optime de dezvoltare, larvele ieşite din ouă vor fi în număr mare
şi foarte active, vorace, brăzdând mediul în toate direcţiile.

Tehnici de manipulare în laborator, la Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster este o insectă de dimensiuni destul de mici pentru a putea fi
manipulată cu uşurinţă în condiţii de laborator, dar pentru aceste manevre este nevoie de:
 utilizarea unei lupe sau a unui stereomicroscop pentru observaţii;
 eterizarea musculiţelor, pentru ca acestea să poată fi examinate.
Echipamentul necesar pentru cercetările în laborator efectuate pe Drosophila
melanogaster cuprinde:
 lupă binoculară (stereomicroscop) cu sursă de lumină;
 flacoane de eterizare;
 cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru pentru re-eterizarea musculiţelor ce se trezesc
în timpul examinării;
 plăci de sticlă în două culori (alb-negru) pe care vor fi plasate musculiţele, pentru
efectuarea observaţiilor;
 pensule de dimensiuni mici, din păr moale;
 ace de disecţie (ace entomologice).
Eterizarea
Musculiţele trebuie eterizate pentru a fi menţinute inactive, în vederea examinării sau
transferării în vase de cultură. Eterizatorul constă într-un flacon ce conţine un tampon de vată, care
va fi umezit cu eter etilic. Este necesară şi o pâlnie metalică, închisă la extremitatea mai mică cu o
plasă fină de sârmă, iar extremitatea opusă cu deschiderea de un diametru cu puţin superior celui
al vasului de cultură. Vasul de cultură va fi răsturnat în pâlnie, capătul închis cu plasă a acesteia
fiind introdus în eterizator. După introducerea adulţilor în pâlnie, deschiderea acesteia va fi imediat
acoperită cu un tifon, sau o placă Petri. Ansamblul va fi ulterior agitat uşor, musculiţele fiind astfel
menţinute în partea de jos a pâlniei, în atmosfera saturată cu vapori de eter. In mai puţin de 1
minut insectele vor fi eterizate, putând fi răsturnate pe placa de observaţie.
Precauţii:
  vata din flaconul eterizatorului nu va fi prea îmbibată în eter şi în nici un caz în
flacon nu trebuie să fie eter lichid, deoarece prin manevrele care se execută, eterul poate ajunge
pe corpul insectelor, provocându-le arsuri;
 expunerea la eter nu trebuie să fie îndelungată, deoarece poate duce la omorârea
musculiţelor;
 toate manevrele trebuie făcute cu delicateţe, insectele fiind extrem de fragile;
 eterul etilic este un compus toxic. Se va evita pe cât posibil inhalarea lui directă şi
expunerea prelungită.
Re-eterizarea
In cazul în care, pe parcursul observaţiilor, musculiţele încep să se trezească, deasupra lor
se aşează o placă Petri tapetată cu hârtie de filtru, stropită cu eter. Placa se lasă câteva zeci de
secunde, pe parcursul cărora musculiţele vor fi re-eterizate.
Atenţie! Manevra nu poate fi repetată de prea multe ori pentru că omoară insectele.
Identificarea sexului la adulţii de Drosophila melanogaster
Masculii şi femelele de Drosophila melanogaster se diferenţiază printr-o serie de
caractere morfologice, relativ uşor de recunoscut, caractere care se generează dimorfismul sexual.
În cazul efectuării încrucişărilor de analiză genetică, recunoaşterea sexului este vitală, deoarece,
în cele mai multe dintre aceste încrucişări, femelele genitoare trebuie să nu se fi împerecheat în
prealabil, deci, trebuie să fie virgine. Această stare a femelelor se păstrează maxim 12 ore de la
ieşirea din pupă, astfel încât, atunci când intenţionăm efectuarea de încrucişări, este important să
separăm indivizii conform sexului lor.
Identificarea sexului adulţilor are la bază următoarele criterii:
1] pieptenele sexual. Este o formaţiune întâlnită doar la mascul, care constă dintr-un
mănunchi de perişori (cca.10) chitinoşi, de culoare neagră, reuniţi, plasaţi în apropierea
încheieturilor tarsale, pe prima pereche de picioare. Structura poate fi vizualizată din stadiul pupal,
cu puţin înainte de ieşirea adultului din pupă, peretele acesteia devenind în acel moment
transparent (Fig. 41).

Fig. 41 Identificarea sexului la Drosophila melanogaster pe baza prezenţei pieptenului sexual la mascul

2] abdomenul. Femelele au abdomenul format din 7 segmente vizibile, alungite posterior, în

timp ce masculii posedă doar 5 segmente, ultimul fiind rotunjit. La masculi, ultimele benzi
întunecate ce separă segmentele abdominale fuzionează, astfel încât toţi masculii au regiunea
teminală a abdomenului de culoare mai închisă decât restul corpului.
3] regiunea genitală. Armătura genitală a femelei include ovopozitorul şi este de culoare
deschisă, în timp ce piesele armăturii genitale a masculilor (inclusiv penisul) au culoare închisă.
Simboluri utilizate în genetica la Drosophila melanogaster
Tipul normal, aşa numit - sălbatic (wild type) la Drosophila melanogaster are caracterele
determinate de gene care se notează cu 2-3 litere provenite din denumirea în limba engleză a
caracterului respectiv, cu indice "+".
 In cazul mutantelor, acest indice lipseşte. Dacă mutaţia respectivă este recesivă faţă de
tipul sălbatic, prescurtarea numele său se scrie cu literă mică, iar în cazul mutaţiilor dominante, cu
literă mare.
O musculiţă poate să fie purtătoarea unei singure mutaţii, caz în care poartă denumirea de
mutantă, sau a mai multor mutaţii, situaţie în care se numeşte linie mutantă. Mutaţiile morfologice
la Drosophila melanogaster se clasifică în funcţie de organul afectat în mutaţii ale formei aripilor,
culorii ochilor, corpului, formei perişorilor de pe corp, formei ochilor, etc.
Exemple:
1] Mutante:
 ochi de culoare albă - w (engl. white = alb);
 ochi de culoare normală, roşii - w+;
 aripi vestigiale, rudimentare - vg (engl.vestigial - vestigial);
 aripi întregi - vg+;
 ochi baraţi, mutaţie dominantă asupra tipului normal (apare prin reducerea
numărului de omatidii) - B (engl.Bar = bară);
 ochi întregi - B+;
 corp de culoare galbenă - y (engl.yellow = galben);
 corp de culoare cafenie, normal - y+
2] Linii mutante:
 w, vg - linie cu două caractere mutante, ochi de culoare albă, aripi vestigiale;
 Cy, L, Pm (Curly = creţ; Lobe = lobat; Plume = vineţiu, de culoarea prunelor) - linie
triplu mutantă, cu aripile curbate la capete, ochii reduşi dimensional, lobaţi şi de culoare vineţie;
 y, ct, v, f (yellow = galben; cut = retezat; vermillon = portocaliu aprins; forked =
măciucat) - linie cu patru caractere mutante - corp de culoare galbenă, aripi retezate la capete
(tipul sălbatic are aripile rotunjite), ochii de culoare portocaliu aprins şi perişorii de pe corp
măciucaţi.

9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster

8.1.1. Cromosomii uriaşi

Unul dintre avantajele cele mai importante oferite de Drosophila melanogaster, ca obiect
de studiu în genetică, este relativa uşurinţă în studiul cromosomilor acestei specii. Studiile asupra
cromosomilor nu oferă doar informaţii legate de numărul acestora la diferite specii, ci şi
posibilitatea elucidării cauzelor unor anormalităţi de ordin fizic sau mental (în cazul omului), care,
aşa cum s-a dovedit, pot fi puse pe seama variaţiilor numerice sau anomaliilor structurale ale
cromosomilor faţă de complementul cromosomial normal.
Deşi de multe ori, studiul cromosomilor se dovedeşte o întreprindere destul de dificilă, care
solicită timp şi echipament specific, în cazul musculiţei de oţet, preparatele microscopice conţinând
celule în care se pot observa cromosomii, sunt destul de uşor de realizat. Mai mult decât atât, la
Drosophila melanogaster, la larve, în celulele glandelor salivare, există cromosomi de dimensiuni
foarte mari, cu o structură aparte, care odată evidenţiaţi, oferă posibilitatea efectuării de studii
amănunţite de structură precum şi de localizare a genelor în cromosomi (întocmirea hărţilor fizice).
Aceşti cromosomi au primit denumirea de cromosomi uriaşi (Fig.42).

Fig. 42 Cromosomii uriaşi la Drosophila melanogaster, vedere de ansamblu

 In celulele glandelor salivare de la larve (fenomenul este caracteristic şi altor specii de
diptere), cromosomii omologi se află într-o stare de permanentă sinapsare. Celulele din aceste
ţesuturi nu se divid, crescând doar în dimensiuni pe parcursul stadiului larvar. Cu toate acestea,
cromosomii lor suferă runde succesive de replicare. Procesul de replicare a cromosomilor, fără ca
respectiva celulă să se dividă, poartă denumirea de endomitoză, cromosomii lor primind
denumirea de cromosomi politenici (lat. tenuis = panglică; lat. poly = mai multe).
Dimensiunile foarte mari ale acestor cromosomi sunt completate şi de o aranjare foarte
specială a lor. In preparatele microscopice, apar sub forma a 5 braţe foarte lungi şi unul extrem de
scurt, unite la nivelul unei regiuni care se colorează cu coloranţi specifici pentru acizi nucleici,
foarte intens, şi care a primit denumirea de cromocentru. Cromocentrul reprezintă regiunea
centromerică a fiecărui cromosom, în timp ce braţele corespund după cum urmează: cele cinci
braţe lungi reprezintă 3 perechi de cromosomi alungiţi, iar cel de-al şaselea braţ, scurt, perechea a
IV-a de cromosomi.
Cromosomii perechii I (XX la femele) sunt strâns uniţi pe toată lungimea lor şi având
centromerul plasat terminal, formează un unic braţ. La masculi, deoarece cei doi cromosomi ai
perechii a-I-a (XY) nu sunt omologi şi nu pot sinapsa, braţul I este format de fapt doar din
cromosomul X, cromosomul Y fiind inclus, alături de regiunile centromerice ale celorlalţi
cromosomi, în cromocentru (Fig. 43).
Cromosomii perechii II, sinapsaţi pe toată lungimea lor, formează două braţe, II dreapta
(engl. 2R) şi II stânga (engl. 2L), deoarece au centromerii plasaţi submetacentric (Fig. 44).
Cromosomii perechii III, de asemenea sinapsaţi pe toată lungimea lor, formează două
braţe, III dreapta (engl. 2R) şi III stânga (engl. 2L), şi aceşti cromosomi fiind aproximativ
submetacentrici (Fig.45).
Braţul scurt al cromosomilor uriaşi este format din cromosomii perechii a-IV-a, telocentrici,
care în preparatele microscopice cu cromosomi somatici, apar punctiformi (Fig.46).

Fig. 43 Cromosomii perechii I (braţul 1)

Fig. 44 Cromosomii perechii II (braţul 2L – sus şi braţul 2R – jos)

Fig.45 Cromosomii perechii III (braţul 3L – sus şi braţul 3R – jos)

Fig. 46 Cromosomii perechii IV

Fiecare braţ al unui cromosom uriaş este deci format din doi cromosomi, omologi, unul de
origine maternă şi altul de origine paternă. De obicei, cromosomii omologi care alcătuiesc braţele
sunt foarte greu de identificat, datorită sinapsării lor extreme, dictată de omologia regiunilor
corespunzătoare genelor de pe aceşti cromosomi (homozigoţie). In cazul în care organismul
respectiv este heterozigot după o genă dată, la nivelul regiunii corespunzătoare genei respective,
sinapsarea nu mai este atât de strânsă, se formează bucle, permiţând vizualizarea celor doi
cromosomi ce alcătuiesc de fapt, braţul. Tot astfel de bucle apar şi în cazul în care la nivelul unor
regiuni s-au produs inversii, translocaţii, deci mutaţii structural cromosomiale.
In lungul braţelor cromosomilor uriaşi, apar în urma aplicării unor metode specifice de
colorare (cu coloranţi selectivi pentru ADN), benzi transversale care se colorează mai intens,
alternând cu benzi mai slab colorate. Se consideră că regiunile mai intens colorate ar corespunde
porţiunilor de cromatină cu o spiralizare mai intensă, în timp ce cele mai slab colorate, unor porţiuni
în care cromatina este mai relaxată. Regiunile ar corespunde deci, heterocromatinei (cele mai
dense, care se colorează mai intens) şi eucromatinei (cele mai relaxate, mai slab colorabile). Dat
fiind faptul că virtual fiecare cromatidă are aceeaşi dispoziţie a regiunilor eu- şi heterocromatice, iar
la nivelul unui braţ, cei doi omologi s-au replicat de nenumărate ori, iar numărul de cromatide este
foarte mare, alăturarea acestor regiuni conduce la apariţia benzilor. Au fost identificate peste 5000
de benzi. Stabilindu-se o corespondenţă între locii genelor şi distribuţia benzilor, a fost revizuită şi
corectată harta genetică la Drosophila melanogaster, fiind întocmită şi harta fizică a cromosomilor
uriaşi la această specie.
Lungimea totală a cromosomilor uriaşi este de 1180, ei fiind de 157x mai lungi decât
cromosomii somatici. Braţele au următoarele dimensiuni:
 perechea I (XX) - 220
 perechea II - 215 şi 245
 perechea III - 210 şi 275
 perechea IV - 15
Deci, cromosomii uriaşi au aceste dimensiuni din două motive:
a] se replică normal, dar replicarea lor nefiind urmată de diviziunea celulei, cromatidele
surori rămân împreună, ceea ce conduce la îngroşarea lor;
b] nu suferă procese de condensare pentru formarea structurii de tip cromosom metafazic,
celulele în care se găsesc aflându-se într-o continuă interfază, astfel încât lungimea lor este
deosebit de mare, faţă de cromosomii somatici obişnuiţi.
Evidenţierea cromosomilor uriaşi la Drosophila melanogaster
Material biologic
 larve aflate în stadiul III de creştere, bine dezvoltate, cu o lungime de cca. 4mm.
Numărul de larve din mediul de cultură în fiolele destinate pentru această lucrare nu trebuie să fie
foarte mare, pentru a permite dezvoltarea viguroasă a larvelor.
 de la larve se vor recolta glandele salivare.
Recoltarea glandelor salivare
 se plasează larva pe placa de sticlă pe care se efectuează observaţiile, în jumătatea
neagră, în câteva picături de ser fiziologic, sau apă;
 se aşează placa de observaţie la un stereomicroscop binocular şi se reglează
imaginea, până la observarea clară a larvei;
 cu un ac entomologic se fixează bine larva, fără a o înţepa, acul fiind plasat imediat
sub regiunea armăturii bucale, uşor vizibile, de culoare neagră;
 cu un al doilea ac de disecţie, plasat transversal peste corpul larvei, fără a o înţepa,
aproximativ la mijlocul distanţei dintre cele două extremităţi, se efectuează o mişcare de întindere
în direcţia axului longitudinal al corpului larvei;
 această manevră, corect executată, va conduce la decapitarea larvei, de
extremitatea cefalică rămânând ataşate şi glandele salivare, saciforme, de culoare alb argintie şi
translucide. Resturile de tub digestiv, eventual antrenate, vor fi îndepărtate (Fig. 47).

1
2

Fig. 47 Larva de Drosophila melanogaster (disecţie) (1 – glande salivare; 2 – ganglioni nervoşi)

Colorarea materialului
 glandele salivare se preiau cu acul de disecţie, fiind trecute pe o lamă curată şi bine
degresată de microscop, într-o picătură de colorant carmin acetic, sau orceină 2%;
 colorarea durează cca.3-5 minute. Materialul poate fi apoi, eventual, trecut pe o
nouă lamă de microscop, într-o picătură de colorant proaspăt;
  peste material se aşează o lamelă, peste aceasta o bucată de hârtie de filtru care va
absorbi excesul de colorant şi se presează uşor cu degetul mare, sau se trece un rulou de cauciuc
pe deasupra, ceea ce va permite etalarea uşoară (de tip squash). Sub nici o formă nu se va
efectua o etalare energică, prin bătăi repetate în lamelă, care conduce inevitabil la fragmentarea
cromosomilor şi compromiterea preparatului.
Observarea preparatelor la microscop
 metoda de coloraţie aplicată va conduce la evidenţierea cromosomilor uriaşi coloraţi
în roşu deschis, transversal pe braţele acestora apărând benzi de culoare roşu întunecat;
 distribuţia benzilor este constantă şi caracteristică fiecărui cromosom;
 observaţiile se efectuează de preferinţă, la obiectivul cu imersie, pentru observarea
cât mai multor detalii.

8.1.2. Cromosomii somatici

Cromosomii somatici pot fi evidenţiaţi la Drosophila melanogaster, în celulele
neuroblastice din ganglionii nervoşi ai larvei aflate în stadiul III de dezvoltare.
Celulele din ţesutul nervos se divid mitotic normal, motiv pentru care, alături de celulele în
interfază vom putea găsi şi celule aflate în diviziune. Vom căuta celule aflate în metafază, la care
cromosomii sunt condensaţi, eliberaţi de sub membrana nucleară care s-a fragmentat la finele
profazei şi dispuşi în regiunea ecuatorială a celulei. Pentru mai buna lor dispersare este
recomandat ca în mediul de cultură în care se află larvele, să se adauge o soluţie de colchicină
0,04%, cu cca. 2 ore înainte de disecţia acestora. In acest fel, colchicina ingerată de larve, va
produce blocarea formării fusului mitotic de diviziune, şi acumularea de metafaze cu cromosomii
dispersaţi în celulă.
Numărul de cromosomilor la Drosophila melanogaster este 8.
Femela are o pereche de cromosomi de sex omologi XX, în timp ce masculul are o pereche
de cromosomi neomologi, XY, aceşti cromosomi primind denumirea de perechea a-I-a.
Determinismul cromosomial al sexelor la Drosophila melanogaster este identic celui uman.
Aceşti cromosomi poartă denumirea de heterosomi, spre deosebire de ceilalţi cromosomi din
complement – autosomii. Cromosomul X are forma unui baston, în timp ce cromosomul Y are
formă de baston frânt.
Autosomii formează perechile II, III şi IV. Perechile a-II-a şi a-III-a, la ambele sexe, sunt
reprezentate de cromosomi cu forma literei “V”, cu braţe mai mult sau mai puţin egale (cromosomi
submetacentrici), în timp ce cromosomii perechii IV sunt extrem de mici, punctiformi (Fig. 48).

Fig. 48 Cromosomii somatici la Drosophila melanogaster (2n = 8)

Materialul biologic , prelevarea sa şi colorarea sunt identice ca şi în cazul cromosomilor

uriaşi, dar la extremitatea cefalică detaşată de corpul larvei, în urma disecţiei, se află ataşaţi,
împreună cu glandele salivare şi ganglionii nervoşi, care interesează în cazul studiului
cromosomilor somatici. Aceştia sunt două structuri translucide, gri-albăstrui, plasate imediat
deasupra glandelor salivare. Ganglionii se detaşează de restul materialului (de fapt, disecţia larvei
se poate finaliza cu prelevarea atât a glandelor salivare, cât şi a ganglionilor cerebroizi) şi se trec
pe o lamă de microscop, într-o picătură de orceină 2%, sau colorant carmin-acetic. După 2-3
minute, materialul se acoperă cu o lamelă şi se etalează uşor.
Observarea preparatelor la microscop
Observaţiile se vor efectua cu obiectivul de imersie (90x) şi în lumină puternică (cu
condensorul ridicat) pentru vizualizarea cât mai bună a cromosomilor, care vor avea o coloraţie
roşu închis.
Bibliografie
Băra, I.I.
Butnaru, Gallia
Carr, D.H., Walker, J.E.
Hartl, D.L., Jones, Elizabeth
W.
Kao, K.N.
Keller, W.A., Harvey, B.L.,
Kao, K.N., Miller, R.A.,
Gamborg, O.L.
Klug, S.W., Cummings, M.R.
Mertens, T.R.,
Hammersmith, R.L.
Miller, R.A., Gamborg, O.L.,
Keller, W.A., Kao, K.N.
Nicolae, I.
Nikonorow, M.
Raicu, P.
Snustad, P.D., Simmons
M.J., Jenkins, J.B.
Socaciu, Carmen
Tudose, I. Gh., Cîmpeanu -
Pricop Mirela - Mihaela,
Maniu - Tudose Marilena
Tudose, I. Gh., Megyeri,
Cristina, Cîmpeanu - Pricop
Mirela - Mihaela, Maniu -
Tudose Marilena
Tudose, I. Gh., Truţă, Elena,
Cîmpeanu - Pricop Mirela -
Mihaela
Tudose, I.Gh.
Tudose, I.Gh.
1999 Genetica, Ed. Corson, Iaşi
1985 Genetica, Ed. Institutului Agronomic, Timişoara
1961 Carbol – fuchsin, a dye for human chromosomes. Stain Technol., 36
: 233-236
1998 Genetics – Principles and Analysis, 4th edition, Jones and Bartlett
Publishers, Boston, London, Singapore
1975 A chromosomal staining method for cultured cells. In Plant Tissue
Culture Methods (edited by O.L. Gamborg and L.R. Wetter), NRCC,
Saskatoon, Saskatchewan, Canada : 63-64
1973 Determination of the frequency of interspecific protoplast fusion by
differential staining. Colloq. Int. Cent. Natl. Rech. Sci., 212 : 455-463
2000 Concepts of Genetics, 6th edition, Prentice Hall International, Inc.,
USA
1998 Genetics – Laboratory Investigations, 11th edition, Prentice Hall
International, Inc., USA
1971 Fusion and division of nuclei in multinucleated soybean protoplasts.
Can. J. Genet. Cytol., 13 : 347-353
1978 Mutageneza experimentală, Ed. Ceres, Bucureşti
1981 Pesticidele în lumina toxicologiei mediului, Ed. Ceres, Bucureşti
1997 Genetică generală şi umană, Ed. Humanitas, Bucureşti
1997 Principles of Genetics, John Wiley & Sons, Inc., New York
1996 Mutageneza chimică, Ed. Genesis, Cluj-Napoca
1991 Cytogenetic effects induced by nicotinic acid in Vicia faba L. (2n=12)
and Triticum aestivum L. (2n=42). An. şt. Univ. ”Al. I. Cuza” Iasi, T
XXXVII, s. II. a, Biologie vegetală: 23-25
1992 Cytogenetic action of a new biostimulator on rye - Secale cereale L.
(2n=14). An. şt. Univ. ”Al. I. Cuza” Iasi, T XXXVIII, s.II.a, Biologie
vegetala: 53-56
1994 Bandarea cromosomilor la plante si importanţa sa. Buletinul SNBC,
a XII a Sesiune a SNBC, Tg.Mureş, 10-11 iunie, 30
1993 Genetica, vol.II, Ed. Univ. „Al.I.Cuza”, Iaşi
1967 Genetica – Îndrumător de laborator, Lito, Ed. Univ. „Al.I.Cuza”, Iaşi