EXECUTAREA, INTERPRETAREA SI DIAGNOSTICUL DIFERENTIAL AL

18
FROTIURILOR SANGUINE DIN LLA SI LLC. CONCORDANTA CU

20
HISTOGRAMELE ANALIZELOR CU 5 DIFF

TA
IN
R
FE
N
BIOLOG MEDICAL PRINCIPAL: NICOLETA STAN

O
C
R
SS
C

NOIEMBRIE 2018
BB
O
 CUPRINS

18
20
TA
1. AVANTAJELE ȘI DEZAVANTAJELE FLOWCITOMETRIEI

IN
2. SCOP ȘI OBIECTIVE

R
3. MATERIALE ȘI METODE

FE
4. REZULTATE ȘI DISCUȚII
4.a LEUCEMIE LIMFATICA ACUTA

N
4.b LEUCEMIE LIMFATICA CRONICA
4.c O
LEUCEMIE CU CELULA PAROASA
C
5. CONCLUZII
R

6. BIBLIOGRAFIE
SS
C
BB
O
 AVANTAJELE CITOMETRIEI ÎN FLUX
• Avantajele flowcitometriei sunt numeroase, cele mai importante sunt: acurateţea rezultatelor, un

18
număr mare de date hematologice, parametri în funcţie de analizor, într-un interval de timp foarte
scurt, ceea ce duce la stabilirea diagnosticului, şi un screening pentru executarea frotiurilor sanguine

20
când sunt necesare detalii în diagnostic.
• O parte dintre parametri sunt măsurați prin impedanță, o altă parte sunt calculați automat, iar

TA
hemoglobina este citită prin spectofotometrie la două lungimi diferite de undă diferite, fiind stabilă
mai mult de 24 de ore.

IN
• Tehnologia VCS este bazată pe măsurarea volumului simultan cu conductivitatea și lumina laser.
• Panelul de reactivi conține 6 anticorpi monoclonali, marcați cu substanță fluorescentă, ce colorează

R
populațiile seriei albe în următoarele culori: neutrofile - albastru deschis, monocite - verde,

FE
limfocite - roșu, eozinofile - portocaliu, bazofile – roșu portocaliu

N
O
C
R
SS
C
BB
O

Fig. 1. Profilul populațiilor celulare din sângele indivizilor cu leucemie (manualul tehnic al analizorului
Mindray 5150).
 DEZAVANTAJELE CITOMETRIEI ÎN FLUX

18
• Erori în numărarea elementelor sanguine, fie prin creșterea, fie prin scăderea lor, (de

20
exemplu: pseudoleucocitoza, pseudoleucopenia, pseudotrombocitoza)

TA
• Modificări tinctoriale și morfologice ale granulațiilor (pseudosindromul trombocitelor gri)

IN
• Modificări ale nucleului (anomalie pseudo Pelger-Huet)

R
FE
• Modificări citoplasmatice (de exemplu: vacuolizarea și picnoza leucocitelor nesegmentate)

N
• Timpul scurs dintre depunerea picături de sânge pe suprafața lamei și întinderea frotiului
sanguin să fie foarte scurt
O
C
• Respectarea timpilor de colorare, pentru evitarea precipitatelor
R
SS

• Respectarea pH-ului soluțiilor de colorare propri afinităților tinctoriale

C

• Efectul agenților activi de suprafață de pe lamele de sticlă pe care se execută frotiurile

BB

sanguine
O
 SCOP ȘI OBIECTIVE
Scopul

18
• Scopul acestui studiu a fost evaluarea corespondenței dintre datele obținute prin

20
flowcitometrie la un analizor cu 5 DIFF (Mindray 5150) și cele obținute prin
analiza manuală a frotiului de sânge în cazul patologiilor asociate seriei

TA
limfocitara

IN
Obiective

R
• Interpretarea corectă a histogramelor furnizate de analizor pentru fiecare

FE
patologie în parte

N
O
• Caracterizarea morfologică a semnelor patognomonice din frotiul sanguin altele
C
decât cele ale seriei limfocitara
R
SS

• Concordanța între interpretarea histogramelor și descrierea frotiului sanguin, în

vederea stabilirii unui diagnostic de certitudine
C
BB

• Acuratețea datelor hematologice

O
 MATERIALE ȘI METODE
Cazuri luate în studiu

18
Studiul s-a realizat în Centrul Medical Nicomed din Alexandria, în perioada 2014 -

20
2016. S-au luat în studiu 200 de pacienți (57femei, 78 bărbați și 65copii) cu vârste cuprinse între
3 - 70, media de vârsta fiind de 46.5 ani (Tabel 1). Din cei 78 pacienti barbati se regasesc

TA
urmatoarele patologii,18LLC,1 haircelleukemia, 10TBC, 10intoxicatie cu Pb, 57 femei dintre
care 7 LLC, 1 LLA, 2 limfocitoza de etiologie virala, 65copi idintre care 15 LLA, 30 reactie

IN
leucemoida, 5 tuse convulsiva,1 parotidita epidemica, 14 infectiicu adenovirus.

R
Tabel 1: Numărul de pacienți pe grupe de vârstă luați în studiu

FE
Număr pacienți Sex Intervale de vârstă (ani)

N
65 M/F 3-15

O
57 F 40-70
78 M 40-70
C
Recoltarea sângelui
R

Sângele a fost recoltat prin puncţie venoasă din vena brahială în vacumuri speciale de
SS

hematologie (cod de culoare mov) în cantitate minimă de 3 ml. Fiecare probă a fost prelucrată
prin două metode: analiza hemoleucogramei la un analizor automat cu 5 diff (flowcitometrie) și
C

realizarea unui frotiu de sânge colorat May-Gruwald-Giemsa.

BB
O
 18
Realizarea și colorarea frotiului de sânge

20
Frotiul realizat prin întinderea unui picături de sânge pe o lamă de sticlă a fost colorat
cu tehnica May-Grunwald-Giemsa, care se bazează pe folosirea unui amestec de coloranţi acizi,

TA
bazici şi neutri care pun în evidență elementele structurale ale elementelor sanguine.

IN
Modul de lucru

R
Fixarea frotiului în alcool metilic, 3-5 minute. Acoperirea frotiului cu soluția May-

FE
Grunwald. Adăugarea peste soluția May-Grunwald a unui volum egal de apă distilată neutră care
se amestecă cu ajutorul unei pipete Pasteur. Se lasă în repaus 2 minute. Se varsă soluția May-

N
Grunwald de pe lamă, după care se acoperă lama cu soluția Giemsa preparată extemporaneu (1-2
picături de soluție Giemsa stoc la 1 ml apă distilată neutră). Colorarea se realizează 25 - 30
O
minute. Spălare ușoară cu apă de robinet. Uscarea frotiului. Examinarea frotiului de sânge s-a
C
realizat cu obiectivul cu imersie la un microscop (Micros Austria) echipat cu cameră.
R
SS

Mod de lucru Mindray 5150

S-a utilizat un analizator Mindray 5150 (Shenzhen Mindray Bio-Medicalelectronics
C

Co, China) care foloseşte metoda impedanţei electronice pentru numărătoarea celulelor și
BB

flowcitometrie pentru departajarea celor cinci populații celulare.

O
 LIMFOCITOZA

18
20
• Limfocitoza este caracterizata prin cresterea nr absolut

TA
de limfocite 3.5x10ꝰiar in formula leucocitara peste

IN
35% din totalul leucocitelor. Limfocitoza constituie
raspunsul obisnuit al organismuluil a numeroase

R
FE
infectii virale. De ex in mononucleoza infectioasa
numarul crescut de limfocite este asociat cu prezenta

N
unor limfocite mari atipice care sint limfocite T
O
activate. O infectie bacteriena acuta care in mod
C
obisnuit si caracteristic este asociata cu un numar mare
R

de limfocite uneori peste 50x10ꝰ/L este tusea

SS

convulsiva .Multe infectii bacteriene care la adult

cauzeaza leucocitoza pot provoca limfocitoza la copii
C
BB

pina in 7 ani.
O
 18
20
TA
LIMFOCITOZA

IN
CLINIC: Un pacient se prezintă la
spital cu febra și tuse, precum și cu

R
un număr scăzut de trombocite (34

FE
x 10³/µl). La puncția medulara s-a
găsit un nivel al megacariocitelor de
172/µl (nivel normal 50-150/µl) si s-

N
a pus diagnosticul de purpură
trombocitopenică idiopatică. Dupa
O
tratament pacientul a fost externat.
C
Datele de mai jos au fost obținute
R
cu ocazia unui control în policlinică.
SS
C
BB
O
 LIMFOCITOZA

18
Deoarece acest canal este dedicat în special
În zona pentru limfocite se măsurării numarului total de leucocite și al

20
bazofilelor, limita între zona pentru
găsește o multitudine de puncte limfocite/monocite și cea pentru
roz corespunzătoare limfocitelor neutrofile/eozinofile este neclară. În zona

TA
pentru limfocite/monocite se găsesc o
(indicate de săgeata galbenă). multitudine de puncte roz (limfocite).

IN
R
FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 LEUCEMIE LIMFATICA ACUTA

18
20
• Leucemia acuta este rezultatul acumularia unor precusori limfoizi in maduva,singesau alte

TA
tesuturisi se presupune ca apar dintro mutatie somatica aunei singure celluleintro populatie
minora de celule stemsau celule progenitoare dindin maduva sau timus .Leucemiile acute pot
aprea de novosau cau eveniment terminala unor afectiunui hematologiceca de ex

IN
:policitemia vera,LGC,sau SMD.Aceste afectiuni sint divizate in doua sub grupeprincipaleLAM
siLLA si grupate in subdiviziunu pe criterii morfologice in prezentarea de fata sau urmarit

R
doua subdiviziuni Lla si LLC

FE
• In LLA limfadenopatia este cea mai comuna.In varianta T-LLA este adesea o marire a
mediastinului superior determinat de masa timica care raspunde rapid la tratament De
asemenea meningele este frecvent implicatla subiecti tinerisi copii ciu LLA dar pot aparea la

N
toate virstele prezentind,greata varsaturi,dureri de cap ,probleme de vedere si fotofobie
,dureri osoase
O
•
C
Limfoblasti au mici diferentieri morfologice .Cazuri cu celula mica predominant si citoplasma
putina se regasescin LLA1,blasti diferiti ca marime si nucleoli proeminenti si citoplasma
R
abundenta se incadreazain LLA2Foarte rar acesta subdiviziune prezinta granulatii sau
eozinofilie reactiva Varianta LLA3 prezinta multiple vacuole intr-o citoplasma intens bazofila si
SS

adesea suprapuse peste nucleu Acestea corespund celulelor B sau limfomului Burkitt
• Frotiul medular in toate variantele este hipercelular cu blasti aproximativ 80%.blasti pot fi
C

observati si in LCR
BB
O
 • 1,2 limfoblasti mici cu citoplasma redusa si aspect uniform
• 3 PMN segmentat

18
• 4 umbre nucleare
Leucemia limfatica acuta LAL1 • 5 hematii aglutinatev in fisic

20
TA
Pacient de sex masculin in virsta
de 7ani se prezinta cu cefalee

IN
,varsaturi ,tulburari de vedere si
usoara infiltratie gingivala

R
hemoleucograma are urmatorii

FE
parametri

N
Frotiul de singe periferic
S=20% Lf=70%,Mo=6%,Eo=4%
O
C
hematii normocrome normocitare
,anizocitoza trombocitara cu
R
numar crescut pe lama,limfocite
de tale mica cu citoplasma putina
SS

intens bazofila
C
BB
O
LEUCEMIE LIMFATICA ACUTA

18
20
TA
IN
R
FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 LEUCEMIE LIMFATICA ACUTA

18
20
Deoarece granulocitele sunt în număr extrem de Punctele care reprezintă limfoblastii se întind din
mic, se observă un singur nor care se întinde

TA
zona pentru limfocite/monocite până în zona în
din zona pentru limfocite până în zona pentru care se găsesc umbrele de eritrocite
monocite.

IN
R
FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 18
Leucemie limfatica LLA1

20
TA
WBC=52000/mmc

IN
Hb=10.3g/dl

R
RBC=4.490000/mmc

FE
Ht=34.2%
MCV=68.5fl

N
PLT=660000/mmc

O
C
R
SS
C
BB
O
 18
LLA1

20
TA
IN
Frotiu de singe periferic al
aceluiasi pacient recoltat la 2zile

R
de la internare

FE
1.2.3 limfoblasti cu cromatina
nucleara neregulata si nucleol

N
unic vizibil

O
C
R
SS
C
BB
O
 • 1limfocit mic
• 2,3limfocite cu nucleu pleimorfic

18
• 4 umbra Gumprecht formatiunu nucleare intinse fara resturi
citoplasmatice care provin din limfocitele distruse in momentul intinderii
LLA2 frotiului denota friabilitatea elementelor exagerata asociata cu patologia

20
• 5 acantocit
• 6 PMN nesegmentat

TA
IN
Frotiul de singe periferic

R
S=21%,Lf=68%,Mo=12% limfocite

FE
cu nucleu pleiomorfic,anizocitoza
eritrocitara cu (microcite )

N
hipocromie moderata spre severa,
anizocitoza trombocitara cu nr
scazut pe lama poichilocitoza cu
O
C
eliptocite si acantocite
R
SS
C
BB
O
 • Hemoleucograama are urmatorii parametri :
• WBC=700/mmc

18
• RBC=1.780.000/mmc
• Hb=5g/dl
LLA2

20
• Ht=16%
• MCV=89.9
• PLT=141000/mmc

TA
IN
Pacient de sex masculin

R
trasferat in ATI dupa internare

FE
in sectia pneumologie cu
diagnostic de panmieloftizie

N
pentru reevalurea
hematologica
O
C
R
SS
C
BB
O
 • 1,2,4 limfocite de talie medie sau mare cu citoplasma
Leucemie limfatica acuta mai abundenta bazofila cu numeroase vacuole

18
LAL3 • 3 eozinofil

20
TA
IN
R
Frotiu de sange periferic

FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 • 1 grup de limfocite mature
Leucemie limfatica in • 2 umbra nucleara

18
transformare blastica – • 3 trombocite
Sindrom Richter • 4 microcit

20
• 5ovalocit hipocrom
Transformarea blastica sau

TA
sindromul Richter - stare
care debuteaza cind intr-

IN
un organ exista o crestere

R
a tumorii.In singele

FE
periferic apar limfocite
mari cu nucleoli bine

N
vizibili,tabloul sanguin fiind
asemanator cu al LLA. O
C
R
SS
C
BB
O
 LEUCEMIE LIMFATICA CRONICA

18
20
• LLC poate fi clasificat in LLC –b si si LLC-T .Este o boala predominant

TA
a adultului si se caracterizeaza printr-un mare numar de limfocite
care se acumuleaza in singe ,splina ,ficat si ganglioni limfatici. In

IN
majoritatea cazurilor celulele sint o populatie monoclonala de

R
celule B imature cu o desitate scazuta a imunoglobulinelor pe

FE
suprafata membranei.
• Cei mai multi pacienti sint asimptomatici si diagnosticul se pune

N
intimplator cind acestia se prezinta pentru teste de rutina
O
• Numaratoarea de celule in LLc arata o limfocitoza absoluta si frotiul
C
de singe periferic are o caracteristica limfoida. In stadii avansate se
observa o anemie normocroma si trombocitopenie. Un nr scazut de
R

pacienti dezvolta o anemie hemolitica autoimuna si foarte putini

SS

trombocitopenie autoimuna.
C
BB
O
 LEUCEMIA LIMFATICA CRONICA

18
• Clasificarea WHO2008 este definita ca o dezordine limfoproliferativa alcatuita din

20
limfocite B majoritatea in singele periferic,maduva si organe limfoide. LLC este pozitiv
pentru CD19 caracterizat pentru un profil atipic imunofenotipic cu CD5 si CD23

TA
impreuna cu CD20. Din cauza imbatrinirii populatiei, incidenta creste cu virsta pacienti
fiind mai in virsta de 65 de ani.Virsta medie de 72 de ani,dar in ultimi 10 ani se

IN
diagnosticheaza pacienti in jurul virstei de 55 ani. Exista o predispozitie de gen. LLC este
mai frecvent la barbati decit la femei

R
• Studiile epidemiologice au tintit indentificarea factorilor de risc, dar nu toti factorii

FE
incriminati conduc la dezvoltarea LLC .O predispozitie genetica este cu siguranta
demonstrata in aparitia LLC si este sustinuta de citeva demonstratii. S-a demonstrat ca

N
in toate familiile cu un istoric de malignitate hematologica pot sa apara LLC. Acest lucru
O
este demonstrat prin cazuri foarte rare din orientul indepartat si aceasta incidenta este
C
scazuta si mentinuta la emigranti si copii lor. Diferite studii sugereaza o legatura intre
LLC: profesie si stilul de viata, oameni care lucreaza si traiesc in ferme ar avea risc
R

crescut in dezvoltarea LLC desi expunerea la soare ar avea rol protector. Sa mai emis
SS

ipoteza ca purtatorii de virus HCV ar putea dezvolta LLC desi infectia cu HCV este
asociata cu o varietate larga de sindroame limfoproliferative
C

• In cazul LLC frotiurile de singe periferic arata un numar mare de limfocite mici cu
BB

citoplasma putina si cromatina grosolana in grunji.

O
 LEUCEMIE LIMFATICA CRONICA

18
20
• Prezinta celule smulse si umbre Grumprecht foarte frecvente ,foarte fragile
considerate semne patognomonice. Prolimfocitele,celule mari cu nucleol

TA
central se pot gasi printre celule mici in proportii variabile,dar destul de

IN
putine. O crestere de 10 15% este frecvent asociata cu o forma clinica destul
de agresiva. Diagnosticul nu impune biopsia ganglionilor si nici frotiu medular.

R
Acesta se executa pentu diagnosticul diferential MCL,SMZL,PLL,SLL.

FE
N
Stadiu caracteristici Medie de supravietuire si risc

O
o
C Limfocite in periferie 10 ani ,risc scazut

I Prezinta limfadenopatie 10 ani, risc intermediar

R
SS

II Prezinta hepatosplenomegalie 5 ani, risc intermediar

III Prezinta Hb11cel mai adesea 1 an, risc crescut

C

AIHA anemie hemolitica

BB

autoimuna
IV Trombocitopenie 100000 1 an, risc crescut
O
 Boala minima reziduala

18
20
• MRD - semnificatia bolii minime reziduale

TA
• Eradicarea bolii este un deziderat. Ghidurile internationale,

IN
definesc boala minima reziduala negativ prezența a mai
putin de o celula blastica printre 10000 de leucocite

R
detectata prin PCR sau Flowcitometrie. Citeva studii au

FE
demonstrat ca boala minima reziduala este cel mai puternic

N
markerde progresie si supravietuire. In zilele noastre MRD
O
nu este recomandata in practica dar este inclusa in cele mai
C
recente studii clinice care au doua tinte
R

• 1 sa valideze un marker de progresie si supravietuire

SS

• 2 sa defineasca un parametru care sa poata ghida deciziile

in tratament, sa evite oprirea tratamentului mai devreme
C

sau recaderea
BB
O
 LLC

18
20
Pacientă de sex feminin în

TA
vârstă de 60 ani, se
prezintă la un examen

IN
medical de rutină cu
simptomatologie

R
asemănătoare unei viroze,

FE
astenie fizică şi o mărire
uşoară de volum a

N
ganglionilor superficiali.
Parametrii O
C
hemoleucogramei sunt: 
R

WBC = 335000/mmc 
SS

RBC = 3.150000/mmc 
Hb = 8.6g/dl  Ht = 27.3%
C

 MCV = 103fl  PLT =

BB

65000/mmc
O
 LLC - Frotiul de sânge periferic: S = 20% Lf = 78% Eo = 2%
Anizocitoza eritrocitară cu normo şi macrocite anizocromie cu hipocromie moderată, anizocitoza

18
trombocitară cu număr scăzut pe lamă, limfocite mature şi numeroase umbre nucleare.
• Leucemie limfatica cronica: 1. Umbra • Leucemie limfatica cronica: 1. Grup de limfocite

20
nucleară; 2 şi 3. Limfocite mature. mature; 2. Umbră nucleară; 3. Trombocite;
• 4. Microcit; 5. Ovalocit hipocrom.

TA
IN
R
FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 LEUCEMIE CU

18
CELULA PAROASA

20
Citoplasma celulelor păroase

TA
este abundentă, raportul
nucleu/citoplasmă este

IN
scăzut. Citoplasma este slab
bazofilă, fără granule

R
azurofile. Se observă

FE
prelungiri citoplasmatice
tipice. Nucleul este localizat

N
central, cromatina este
uniformă. Celulele păroase au O
C
dimensiuni egale cu
R

limfocitele mari.
SS
C
BB
O
 LEUCEMIE CU CELULA PAROASA

18
20
Se observă un singur nor de puncte
care se întinde din zona pentru limfocite până în Fără modificări deosebite.

TA
zona pentru monocite. În aria dintre aceste două
zone se gasesc celulele păroase de dimensiuni
mari. (v. săgeata galbenă).

IN
R
• DIFF • WBC/BASO

FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
Este o forma de leucemie cronica care apare de obicei la pacienti peste 40 ani,
preponderent la sexul mascului. Boala se caracterizeaza prin pancitopenie. Se

18
considera ca celula originara este limfocitul B care adesea produce o Ig monoclonala.
In sangele periferic sunt de obicei celule paroase cu diametrul de 20 µ cu citoplasma

20
cu aspect spumos si nucleu excentric. Se pot observa prelungiri citoplasmatice
caracteristice.

TA
Frotiu haircelleukemie Limfom vilos

IN
R
FE
N
O
C
R
SS
C
BB
O
 200
Corespondenta intre 190

18
metoda manuala si 180

metoda automata

20
170

160 corespondenta
Legenda : 99,3 %
150

TA
140
78 bărbați : 130

IN
120
18 LLC

R
110
1 Hair cell Leukemia

FE
100
49 limfocitoză :
90

N
29 insuficiență cardiacă acută 80

O
10 TBC 70

10 intocxicație cu Pb 60
C
50
R
57 femei : 40
corespondenta
7 LLC
SS

30 99,1 %
corespondenta
1 LLA 89,7 %
20
49 limfocitoză de etiologie corespondenta
C

10
virală 100 %
0
BB

Limfocitoza LLC LLA Hair cell Leukemia

15 copii : 15 LLA
Metoda Automata Metoda Manuala
O
 CONCLUZII

18
20
• Descrierea tipului morfologic al celulelor in stabilirea subtipului de
leucemie este definitoriu in punerea diagnosticului, evaluarea

TA
riscului si stadializarea bolii.Un studiu facut de Pierre si Novis au
raportat ca echipamentele automate de hematologie au o acuratete

IN
mai mare in detectarea probelor cu anormalitati de distributie si
morfologice decit metodele manuale . De exemplu val de Hb, indici

R
eritrocitari,t rombocite si leucocite statistic arata o diferenta

FE
semnificativa pe metodele automate dar se coreleaza pozitiv petru
tinta si valorile S.E

N
• Prin urmare examinarea microscopica ar trebui folosita pentru
O
validarea metodelor automate . Procedurile de laborator( Lantis et
C
al) ar trebui optimizate folosind standarde manuale de examinare
R

microscopica in special pentru diferentierea liniilor celuare atit ca

SS

numaratoare cit si morfologie.

C
BB
O
 18
20
TA
IN
R
FE
Mulțumesc pentru atenție!

N
O
C
R
SS
C
BB
O