MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

CAPITOLUL 1
TEHNICI DE BAZĂ ÎN MICOLOGIA CLINICĂ (M. Mareș)

Ca și în cazul altor tipuri de infecții, diagnosticul de laborator al

micozelor este obligatoriu. Evidențierea agentului cauzal oferă clinicianului
argumente solide pentru alegerea terapiei specifice și adoptarea măsurilor
profilactice corespunzătoare, mai ales în cazul unor îmbolnăviri cu caracter
zoonotic. În acest sens, din zonele sugestive clinic se prelevează probe care
apoi sunt procesate în laborator prin câteva tehnici dedicate astfel încât
agentul cauzal să poată fi caracterizat morfologic și/sau fiziologic. De
asemenea, examenele de laborator sunt utile pentru monitorizarea evoluției
bolii, supravegherea eficienței terapiei, confirmarea vindecării și depistarea
subiecților purtători.

1.1. Formularul de însoțire a probelor

Toate probele expediate către laborator vor fi însoțite de o fișă ce va
cuprinde obligatoriu următoarele informații:
- datele de identificare ale pacientului (specia, rasa, sexul, vârsta,
numărul matricol sau codul cipului subcutanat în cazul carnivorelor și
cabalinelor, numele proprietarului/aparținătorului, denumirea
unității/fermei de proveniență);
- tipul prelevatului;
- data și ora recoltării;
- examenele de laborator cerute;
- datele anamnetice (dacă animalul a fost importat și când, călătorii în
zone endemice pentru anumite tipuri de micoze, contactul cu alte
specii de animale domestice sau sălbatice);
- datele epidemiologice (contagiozitate intra- și interspecifică, leziuni
sugestive la aparținători)
- datele de identificare ale clinicianului (nume și prenume, cod parafă,
număr telefon).
În figurile 1.1. și 1.2 este prezentat un model de Formular de Cerere
Analize (conform ANSVSA).

1
 CAPITOLUL 1

Figura 1.1. - Formular de Cerere Analize (sursa ANSVSA)

2
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Figura 1.2. - Formular de Cerere Analize (sursa ANSVSA)

3
 CAPITOLUL 1

1.2 Recoltarea
Probele sau prelevatele clinice se pot clasifica în funcție de aspectul
lor și implicit de gradul de hidratare al acestora în:
- probe „uscate”: firele de păr, fragmentele de pene, celulele
descuamate și detritusurile cutanate, placardele și crustele,
fragmentele unghiale
- probe „umede”: sângele, lichidele de puncție (pleural, pericardic,
peritoneal, sinovial, cefalorahidian), secreții (spută, mucozități,
secreții vaginale), exsudate, lichide de lavaj (bronhoalveolar etc.),
lapte, urină, materii fecale, fragmente de țesut recoltate prin biopsie.

Reguli generale pentru recoltarea prelevatelor clinice:

- de preferat, probele se recoltează înaintea administrării agenților

antifungici (în cazul preparatelor topice, se recomandă un interval de
minim 5-7 zile de la ultima administrare);
- se recomandă folosirea echipamentului de protecție și manipularea
atentă a tuturor probelor (potențial infecțios);
- dacă recoltarea împlică proceduri chirurgicale (puncție, biopsie), se va
utiliza instrumentar sterilizat și se va decontamina tegumentul cu
produse pe bază de iod (tinctură de iod 1-2%, soluție povidonă-iod
10%);
- cantitatea/volumul prelevatului trebuie să fie suficientă pentru a
asigura materialul biologic pentru procesările ulterioare în laborator
(microscopia directă, însămânțarea pe medii de cultivare, eventual
examenul histopatologic);
- ambalarea prelevatelor în vederea expedierii la laborator trebuie să
asigure păstrarea acestora și să evite contaminarea mediului sau
persoanelor;
- recipientele de transport se etichetează obligatoriu cu nr. matricol,
codul cipului sau numele animalului, data și ora recoltării, numele
medicului.

4
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Tabelul 1.1.
Tipuri de prelevate clinice recoltate pentru diagnosticul micozelor
(după Samanta 2015, modificat)
Regiunea anatomică
Prelevatul clinic Agenți etiologici
(aparatul/sistemul)

Cryptococcus, Coccidioides,
Lichid cefalorahidian Histoplasma, Blastomyces,
Sistem nervos central Penicillium marneffei, Sporothrix,
Material purulent
Cladophialophora
(abces cerebral)

Raclat cornean, fluide Fusarium, Aspergillus,

Ochi intraoculare, exsudat Blastomyces, Coccidioides,
conjunctival Histoplasma, Candida,
Pseudallescheria

Conduct auditiv Secreție otică, exsudat Aspergillus, Malassezia, Candida

Exsudat, secreții,
Cavitate nazală, sinusuri raclat, aspirat cu ac Cryptococcus, Aspergillus,
fin, biopsie Rhinosporidium

Spălătură oro-
faringeală, raclat
Cavitate orală Penicillium marneffei, Candida
ulcerații, diverse
depozite

Lavaj gastric, materii Histoplasma, Penicillium

Tract gastro-intestinal
fecale marneffei, Candida, Rhizopus

Aspergillus, Blastomyces,
Spută, aspirat traheal, Coccidioides, Histoplasma,
Aparat respirator lavaj bronhoalveolar, Penicillium marneffei, Mucor,
aspirat pulmonar Rhizopus, Candida, Cryptococcus,
Pneumocystis

Blastomyces, Candida,
Cryptococcus, Histoplasma,
Tract urinar Urină
Penicillium marneffei, Sporothrix,
Trichosporon

Glanda mamară Lapte Aspergillus, Candida,

Cryptococcus, Mucor
Conținut abomasal,
Fetus avortat tegument, ficat, Aspergillus, Lichtheimia, Rhizopus
pulmon

5
 CAPITOLUL 1

Tabelul 1.1.
Tipuri de prelevate clinice recoltate pentru diagnosticul micozelor
(continuare)
Regiunea anatomică
Prelevatul clinic Agenți etiologici
(aparatul/sistemul)

Blastomyces, Coccidioides,
Limfonoduri Aspirat, biopsie Cryptococcus, Penicillium marneffei,
Pythium insidiosum

Articulații Lichid sinovial Blastomyces, Sporothrix

Fragmente Epidermophyton, Microsporum,

Unghii
unghiale Trichophyton

Păr Fire păr Microsporum, Trichophyton

Microsporum, Trichophyton,
Raclat, cruste, Aspergillus, Candida, Cryptococcus,
Tegument amprentă cu bandă Malassezia, Mucor, Rhizopus,
adezivă Pythium insidiosum, Coccidioides,
Penicillium marneffei

Material purulent,
alte exsudate, Blastomyces, Coccidioides,
Tegument
aspirate cu ac fin, Histoplasma, Madurella, Sporothrix
probe biopsice

Blastomyces, Candida, Cryptococcus,

Fragmente
Histoplasma, Penicillium marneffei,
Viscere biopsice, aspirate
Pythium insidiosum, Sporothrix,
cu ac fin
Rhizopus, Rhinosporidium

Candida, Cryptococcus, Histoplasma,

Aparatul circulator Sânge
Penicillium marneffei, Sporothrix

Lichidul cefalorahidian se obține prin puncție lombară (spațiul L3-

L4), respectându-se cele mai severe reguli de asepsie și antisepsie. După
plasarea cateterului în spațiul subarahnoidian, extragerea LCR se face lent
pentru a preveni complicațiile legate de reducerea presiunii acestuia.
Volumul recoltat variază între 0,5 – 3 ml, în funcție de talia animalului.
Proba se expediază rapid la laborator (15-30 minute), fără a se refrigera.

Raclatul cornean se obține cu ajutorul unei microchiurete

oftalmologice sterile (Meyhoefer sau Kimura), după o prealabilă anestezie

6
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

topică (tetracaină 0,5%). Se raclează atât baza, cât și marginile zonei

ulcerate, iar materialul obținut se transferă în bulion Sabouraud sau se
însămânțează direct pe medii solide, prin înțepare cu instrumentul de
recoltare.Fluidele intraoculare se prelevează prin puncție cu ac fin sau prin
vitrotomie, în volum de 0,2-0,5 ml, în condiții de asepsie riguroasă. Proba se
expediază rapid către laborator.

Secrețiile otice se prelevează, în funcție de consistența și volumul lor,

cu ajutorul tampoanelor pentru exsudate sau cu microperii de tipul ESwab™
- Copan Diagnostics (figura 1.3.), apoi se transferă în medii solide sau
lichide de transport. În vederea unei recoltări corecte, se va ține cont de
lungimea și conformația conductului auditiv extern, care la unele specii
necesită manopere particulare (de exemplu, la câini, forma în „L” a
conductului necesită tracțiunea laterală a pavilionului urechii pentru
orizontalizarea porțiunii verticale și facilitarea pătrunderii tamponului în
profunzime).

Figura 1.3. - Microperie tip ESwab™ pentru recoltare probe

- Copan Diagnostics

Exsudatele și secrețiile nazale pot recolta cu tampoane sterile

preumectate în ser fiziologic sau prin aspirație în seringi de unică folosință
sterile. Polipii nazali sau leziunile ulcerate se pot biopsia pe cale
endoscopică sau se pot puncționa cu un ac fin dacă sunt ușor accesibile.
Prelevarea materiilor fecale se face în recipiente sterile cu capac
filetat (coprocultoare, de preferat cu mediu lichid de transport). În cazul

7
 CAPITOLUL 1

prelevării de tampoane rectale sau cloacale, acestea se trimit la laborator în

recipiente cu mediu de transport. Spălătura gastrică se recoltează cu ajutorul
endoscopului, folosindu-se ser fiziologic, și se colectează în recipente sterile.

La animale, sputa se obține destul de dificil. Jetajul este mai facil de

obținut, mai ales dacă este eliminat spontan de către animal. Pentru
accentuarea eliminării secrețiilor respiratorii se recomandă provocarea tusei
prin supunerea animalului la efort fizic (mers accelerat, fugă) sau provocarea
unei scurte perioade apneice prin obturarea manuală a orificiilor nazale.
Lavajul bronho-alveolarse practică la animale sub anestezie generală sau
tranchilizare. Se va ține cont de faptul că manipularea bronhoscopului prin
căile aeriene superioare poate contamina suplimentar proba obținută în urma
lavajului. Lichidul, recoltat în volum suficient, se expediază la laborator în
flacoane sterile și va fi prelucrat în maxim 2 ore (dacă este menținut la
temperatura camerei) sau în 24 ore (dacă este păstrat la frigider).

Urina se colectează, în funcție de specie și talia animalului, în timpul

emisiei spontane sau prin compresiune abdominală manuală (fracțiunea
mijlocie), în recipiente sterile, cu capac ermetic. Pentru a ușura prelevarea
probelor se recomandă utilizarea unor dispozitive de tipul Urikone/Uripot -
Rocket Medical, Marea Britanie (figura 1.4. și 1.5.).În unele situații se poate
apela la sondaj (cateterism) vezical sau puncție suprapubiană (cistocenteză).

Figura 1.4. - Dispozitiv Urikone pentru recoltarea probelor de urină

(Rocket Medical, Marea Britanie)

8
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Figura 1.5. - Dispozitiv Uripot pentru recoltarea probelor de urină

(Rocket Medical, Marea Britanie)

Laptele reprezintă un prelevat clinic important, a cărui examinare

micologică este obligatorie în mastitele rezistente la antibioticoterapia cu
spectru larg sau în cele survenite post-antibioticoterapie. Igienizarea întregii
glande mamare prin spălare cu un produs antimicrobian (săpun lichid pe
bază de povidonă-iod sau clorhexidină) și uscare cu prosoape de hârtie este
obligatorie. Înainte de prelevarea probei, zona din jurul sfincterului papilar
se decontaminează din nou și se îndepărtează prin mulgere primele jeturi de
lapte. Urmează apoi prelevarea unui volum de 10-30 ml lapte într-un
recipient steril, de tip urocultor, care se etichetează corespunzător și se
expediază rapid la laborator (în lăzi izoterme pentru a preveni alterarea
probei)

Fetușii avortați sunt de interes diagnostic mai ales la specia bovină, la

care unele micoze pot evolua cu placentită necrotică și avort consecutiv. Se
recoltează, în condiții de asepsie, probe din fluidul abomasal, fragmente de
tegument, organe interne și placentă, care se ambalează apoi în flacoane
sterile cu capac ermetic.

Prelevatele cutanate uscate (fire de păr, raclate tegumentare, scuame,

placarde, raclate și fragmente unghiale) se recoltează din zonele sugestive
clinic, de la periferia leziunilor (interfața țesut sănătos - țesut afectat). Când

9
 CAPITOLUL 1

se suspicionează o dermatofitoză la animalele de companie, se recomandă

examinarea învelișului pilos al acestora cu ajutorul lămpii Wood, într-o
cameră obscură, pentru a evidenția eventualele zone fluorescente produse de
fungi și a identifica astfel cu acuratețe zonele de prelevare a probelor (figura
1.6.).

Figura 1.6 .- Lampă Wood portabilă

Firele de păr se prelevează prin smulgere cu ajutorul unei pense

hemostatice sau prin cupare cu un foarfece. De interes este și metoda
MacKenzie, care presupune perierea învelișului pilos al animalului folosind
o perie circulară, igienizată în prealabil. Peria se poate folosi și la
însămânțarea prin înțepare a mediului selectiv de cultivare (figura 1.7.).

Figura 1.7. - Perie pentru însămânțare

Scuamele se obțin prin raclare cu ajutorul unei lame de bisturiu, lame

de sticlă sau microchiurete. Nu se recomandă decontaminarea prealabilă a

10
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

zonei de recoltare, deoarece poate fi afectată viabilitatea elementelor fungice

și obținerea unor culturi negative. Toate prelevatele uscate se ambalează în
plicuri obișnuite de hartie sau în dispozitive de transport tip Dermapak
(Dermaco Ltd., Marea Britanie) (figura 1.8.).

Figura 1.8.- Dispozitiv de transport scuame și unghii tip Dermapak

(Dermaco Ltd., Marea Britanie)

Probele cutanate umede (material purulent, alte exsudate, fragmente

biopsice) pot fi obținute prin ștergere cu un tampon steril sau puncție cu ac
fin. Se recomandă ca transportul lor către laborator să se facă în medii de
transport pentru a preveni desicarea și pierderea viabilității germenilor.

Fragmentele de țesut se recoltează prin biopsie, sub anestezie locală

sau tranchilizare, după caz. În funcție de localizarea leziunii, se practică
excizia chirurgicală clasică sau puncția cu ac fin (sub ghidaj radiologic sau
ecografic). Fragmentul recoltat se divizează pentru a obține atât material
biologic de însămânțat pe medii de cultivare, cât și pentru examenul
histopatologic. În acest ultim caz, fragmentul se imersează imediat în soluție
de formaldehidă 10%, în vederea fixării.

Sângele este un prelevat clinic important pentru diagnosticul

infecțiilor fungice profunde/sistemice – afecțiuni de obicei grave și dificil de
diagnosticat. Pentru hemoculturi, se preferă flacoanele special dedicate
acestui scop: BacT/ALERTSA(bioMérieux), BD BACTEC- Mycosis IC/F
Medium (BD Diagnostics) (figura 1.9.). Recoltarea se face în condiții
riguroase de asepsie și antisepsie, direct în flacoanele de hemocultură,

11
 CAPITOLUL 1

folosind truse speciale.Volumul de sânge este de cca. 1-10 ml, iar pentru
creșterea sensibilității diagnostic se recomandă prelevarea seriată a
hemoculturilor, în zile diferite.

Figura 1.9 .- Flacoane pentru hemoculturi (BD Diagnostics)

1.3. Transportul probelor biologice

Probele umede se expediază la laborator în cel mai scurt timp
posibil, la temperatură corespunzătoare; când temperatura ambientală este
ridicată, se preferă ambalajele izoterme. Probele uscate se ambalează în
plicuri de hârtie sau carton, nefiind pericol de desicare. Elementele fungice
prezente în aceste prelevate își mențin viabilitatea peste o săptămână la
temperatura camerei.
Expedierea pe distanțe mari, cu firme de curierat, impune
respectarea unor norme specifice de ambalare pentru bunuri periculoase
(http://www.iata.org/publications/dgr) care presupune un set de trei
containere succesive. Deoarece, fungii potențial patogeni pentru om și
animale (cu excepția culturilor active de Coccidioides immitis) nu sunt
incluși în lista agenților infecțioși periculoși, coletele vor fi etichetate ca
“produs biologic categoria B” (figura 1.10).

12
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Figura 1.10. - Etichete “produs biologic categoria B”

1.4. Examenul microscopic direct

Examinarea microscopică a prelevatelor pre-tratate cu diverși
reactivi/coloranți este un demers obligatoriu în laboratorul clinic. El poate
aduce informații importante despre agentul etiologic și poate ajuta hotărâtor
la precizarea precoce a diagnosticului, cu mult înaintea obținerii rezultatelor
culturii sau examenului histopatologic.
Ca regulă generală, probele uscate (fire de păr, scuame, raclate
cutanate, fragmente unghiale etc.) se tratează 30 de minute cu soluție 10-
20% hidroxid de potasiu (KOH) pentru „clarificarea” preparatului. Peretele
fungic este rezistent la acțiunea KOH, în timp ce detritusurile celulare și
formațiunile cheratinizate ale gazdei sunt lizate, ceea ce conduce la o mai
bună vizibilitate în timpul examinării. Pentru creșterea sensibilității metodei,
în soluția de KOH se poate adăuga o substanță fluorescentă cu electivitate
pentru peretele fungic (Blankophor, Calcofluor – 0,1%) (figura 1.11).

Figura 1.11. - Evidențierea peretelui fungic (col. Calcofluor – 0,1%)

Examinarea se face la microscopul cu modul de epifluorescență, în
lumină ultravioletă (figura 1.12.).

13
 CAPITOLUL 1

Figura 1.12. - Microscop cu modul de epifluorescență în lumină UV

(Micros, Austria)

Lichidele de puncție și laptele se concentrează prin centrifugare la

1500 rpm timp de 10 minute, apoi sedimentul se examinează microscopic
după o prealabilă colorare Diff-Quik (Giemsa) sau cu tuș de India (când se
suspicionează Cryptococcus, pentru evidențierea capsulei).
Din fragmentele biopsice se pregătesc frotiuri prin amprentă sau
ștergere, care apoi se colorează Gram sau se tratează cu o soluție 0,1% de
calcofluor. Alte produse patologice (material purulent, alte exsudate, aspirat
traheal) se etalează pe lamă în strat subțire, se usucă, se fixează și apoi se
colorează Gram, Giemsa, Diff-Quik sau cu albastru de metilen 3%.
Sedimentul urinar, obținut în urma centrifugării probei de urină la 2000 rpm
timp de 5 minute, se examinează între lamă și lamelă, fără colorare
prealabilă. Frotiurile de sânge se colorează May-Grunwald-Giemsa, deoarece
se pot evidenția și levurile intracelulare (Histoplasma).

1.5. Însămânțarea prelevatelor clinice

Cultivarea prelevatelor clinice pe medii dedicate fungilor permite
izolarea agentului etiologic și studierea caracterelor sale morfo-fiziologice în
vederea identificării ulterioare.Compoziția celor mai importante medii de
cultivare pentru fungi este prezentată în Anexă. Pentru cultivarea prelevatelor
provenind din situsuri nesterile este obligatorie folosirea mediilor neselective
(Agar Sabouraud) cu adaos de antibiotice pentru inhibarea dezvoltării
bacteriene. Mediile ce conțin cicloheximidă (Actidion) sunt indicate pentru

14
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

cultivarea prelevatelor cutanate din leziuni produse de dermatofiți. Acestea

inhibă dezvoltarea fungilor contaminanți, obișnuit prezenți în mediu, și o
favorizează pe cea a fungilor dermatofiți care sunt rezistenți la
cicloheximidă. Pentru izolarea și identificarea într-o singură etapă a levurilor
din prelevatele polimicrobiene, se recomandă utilizarea mediilor speciale
cromogene - CandiSelect (Bio-Rad), CHROMagar Candida (BD Sciences),
Candida ID2 (bioMérieux), Candichrom II (International Microbio),
Chromogenic Candida Agar (Oxoid), care permit determinarea speciei pe
baza aspectului și culorii coloniilor (figura 1.13.).

Figura 1.13. - Chromogenic Candida Agar (Oxoid)

Cele mai utilizate tehnici de însămânțare în micologia clinică sunt:

- striere de epuizare pe medii solide, preturnate în plăci Petri sau în
tuburi(se pretează în cazul diverselor exsudate, secreții, material purulent,
fecale)
- etalare pe toată suprafața mediului / inundare (lapte, urină)
- etalare în puncte izolate prin spotare (LCR, sedimente, pasaje din
hemoculturi, fragmente de țesut)
- etalare în puncte izolate prin înțepare (scuame, fragmente unghiale, fire de
păr)
- înglobare în medii solide pretopite la 50°C (diverse raclate, scuame, fire
de păr, fragmente unghiale)
- inoculare în flacoane de hemocultură (se recomandă pentru prelevatele
lichide obținute din situsuri normal sterile).

15
 CAPITOLUL 1

1.6. Examinarea microscopică a fungilor din culturi

După izolarea fungilor prin cultivarea prelevatelor clinice, coloniile
de interes se examinează macroscopic și microscopic în vederea încadrării
taxonomice (identificării genului, eventual și a speciei căreia aparține
izolatul). Din punct de vedere microscopic, se vor avea în vedere aspectul
hifelor (septate sau nu), aspectul miceliului (hialin, pigmentat), prezența și
morfologia corpilor fructificanți, modul de producere a sporilor, forma și
aspectul acestora, prezența unor structuri particulare (rizoizi, celule Hulle,
clamidospori etc.). Este important de menționat că examinarea unui preparat
se face prin observarea a cât mai multor câmpuri pentru a surprinde
elementele caracteristice predominante și în dinamică, la intervale regulate
de timp (2-3 zile), deoarece formațiunile utile pentru diagnostic apar odată
cu învechirea culturii.
Pentru levuri se folosește colorația Gram sau colorația simplă cu
albastru de metilen, iar în cazul fungilor filamentoși preparatul
extemporaneu cu bandă adezivă (figura 1.14.), cu excepția coloniilor de
Aspergillus și Penicillium intens sporulate. În acest sens, se amprentează cu
bandă tip scotch 2-3 zone diferite ale coloniei de examinat și fragmentele de
bandă adezivă se etalează mai apoi într-o picătură de lactofenol plasată pe o
lamelă de sticlă.

Figura 1.14. - Preparatul extemporaneu cu bandă adezivă

(schema tehnicii de lucru)

16