Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50

Liste de conținut disponibile la ScienceDirect

Jurnalul de fotochimie și fotobiologie, B: Biologie

p ag i na d e p o r ni re a r ev i s te i : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / j p h o t o b i ol

O investigație biofizică privind legarea proflavinei cu hemoglobina umană:

Perspective din spectroscopie, termodinamică și
Studii AFM
Anirban Basu, Gopinatha Suresh Kumar ⁎
Laboratorul de chimie biofizică, Divizia de chimie organică și medicinală, CSIR-Institutul indian de biologie chimică, Kolkata 700 032, India

a r t i c l ei n f o a b s t r a c t

Istoricul articolului: Interacțiunea proflavinei cu hemoglobina (Hgb) a fost studiată prin spectroscopie, calorimetrie și microscopie de
Primită la 18 iulie 2016 forță atomică. S-a constatat că constanta de echilibru este de ordinul 104 M− 1 . ței Hgb de
Primit în formă revizuită 26 septembrie 2016 că ă s-a datorat formării complexului. Calculul distanței moleculare (r) dintre donor (β-Trp37 din Hgb)
Acceptat 11 octombrie 2016
și acceptor (proflavină) a sugerat că energia poate fi transferată în mod eficient de la reziduul β-Trp37 de la
Disponibil online 12 octombrie 2016
interfața α1β modificări structurale secundare semnificative în
Cuvinte cheie:
ță sincronă au arătat că p
ă triptofan într-o măsură mai mare decât a reziduurilor de tirozină. Studiile spectrale de dicroism circular au arătat că
Hemoglobină ă a conținutului α-helicoidal al Hgb. Testul de activitate esterazică a
Spectroscopie completat și mai mult datele dicroismului circular. Intensitatea benzii Soret a Hgb a scăzut la com- plexare.
Calorimetrie Rezultatele calorimetriei diferențiale de scanare și ale fuziunii prin dicroism circular au arătat că proflavina a in- duit
Spectroscopie destabilizarea Hgb. Legarea a fost determinată atât de entropia pozitivă, cât și de entalpia negativă. Studiile de
Calorimetrie microscopie de forță atomică au arătat că trăsăturile morfologice esențiale ale hemoglobinei au fost păstrate
în prezența proflavinei. În general, sunt prezentate informații privind aspectele fotofizice și energetice ale
legării
© 2016 Elsevier B.V. Toate drepturile rezervate.

1. Introducere
este un nou analog de acridină care constă într-o fracțiune
aromatică monociclică monocationică plană cu două grupe amino care
prezintă o gamă largă de activități farmacologice [1-3]. Proflavina a fost
utilizată ca an- tiseptic, precum și ca dezinfectant bacteriostatic [4,5]. Ea
poate provoca mutații de deplasare a cadrului în virusuri, bacterii și
bacteriofagi [6] și inhibă replicarea în celulele canceroase prin
intercalarea între perechile de baze ale ADN-ului [7-13]. Astfel, are
potențialul de a fi dezvoltat ca agent chimioterapeutic [14-16].
Proteinele îndeplinesc o gamă largă de funcții în organismele vii,
inclusiv transportul moleculelor endogene și exogene de la un loc la
altul și, prin urmare, ele sunt alegerea principală pentru sondarea acțiunii
farmacologice a medicamentelor [17]. Înțelegerea dinamicii și a
consecințelor biochimice ale interacțiunilor medicament-proteină este
esențială în farmacologie și în dezvoltarea medicamentelor. Deși interacțiunea
ac- ridinelor cu acizii nucleici este bine documentată, interacțiunea
acestora cu proteinele nu a fost încă caracterizată corespunzător
[18-27]. Hgb este o proteină importantă a cărei structură și funcție sunt
bine stabilite
⁎ Autor corespondent la: CSIR-Institutul indian de biologie chimică, 4, Raja S. C.
Mullick Road, Jadavpur, Kolkata 700 032, India.
Adresa de e-mail: gskumar@iicb.res.in (G.S. Kumar).
[28-31]. Hgb este prezentă în interiorul globulelor roșii, dar poate
redeveni activă și toxică la hemoliză, în condiții de boală sau datorită
acțiunii unor medicamente. Acest lucru duce la prezența sa în plasmă, fiind
expusă la diverse molecule mici și medicamente. Deoarece Hgb poate
interacționa cu o varietate de molecule mici, metabolismul, distribuția și
eficacitatea multor medicamente și compuși biologic importanți
in vivo pot fi influențate de affinitatea lor față de Hgb [32-34]. Efectul
terapeutic al unui medicament este direct legat de concentrația
acestuia în sânge. Medicamentul nelegat poate difuza cu ușurință din
sânge în țesutul/organul în care are loc activitatea farmaco- logică.
Asocierea puternică dintre proteină și moleculele de medicament
reduce concentrația medicamentului liber în sânge și, de asemenea, de-
crește efectul său farmacocodinamic. Cu toate acestea, legarea
slabă între proteină și moleculele de medicament duce la o durată de
viață mai scurtă [35]. Astfel, com- plexarea dintre proteină și moleculele de
ța eliberarea medicamentelor din sânge către
receptori și, de asemenea, poate inhiba metabolizarea rapidă a acestora
[36]. Din acest motiv, este pertinent să se investigheze interacțiunea
medicamentelor po- tenț
înțelege metabolismul și distribuția lor in vivo. În acest raport, am
investigat efectul ării
Mai mult, am
evaluat energetica interacțiunii folosind tehnici calo- rimetrice
sensibile pentru a corela aspectele structurale cu cele energetice.

h t t p : / / d x . d o i . o r g / 1 0
. 1 0 1 6 / j . j p h o t o b i o l . 2
0 1 6 . 1 0 . 0 1 0 1011-1344/© 2016 Elsevier
B.V. Toate drepturile rezervate.
 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50 43

2. Experimental 2.6. Studii de microscopie de forță atomică

2.1. Materiale
Hgb și clorhidrat de proflavină (PFV în continuare, Fig. 1) au fost
obținute de la Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, SUA). Toate
soluțiile de probă au fost preparate în soluție tampon citrat-fosfat 10
mM, pH 7,0 la (298,15 ± 0,01) K, cu excepția cazului în care se specifică
altfel. Concentrațiile de PFV și Hgb au fost determinate folosind
absorbție molară (ε) de 42.000 M−1
cm−1 la 444 nm și, respectiv, 1,79.000 M−1 cm−1 la 405 nm [37-
42].
2.2. Studii spectroscopice
Studiile spectrale de absorbție au fost efectuate pe un
spectrofotometru Jasco V660 cu fascicul dublu și monocromator dublu
(Japan International Co., Hachioji, Japonia). Experimentele de
ță în stare stabilă și rezolvate în timp au fost efectuate fie
pe un PC Shimadzu RF-5301 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia), fie
pe o unitate Quanta Master 400 (Horiba PTI, Can- ada) controlată cu
software-ul de spectroscopie FelixGX. Măsurătorile în infraroșu cu
transformată Fourier (FTIR) au fost efectuate pe un spectrometru
Bruker FTIR, TEN- SOR 27 (Bruker Corp, SUA), în timp ce studiile de
dicroism circular (CD) au fost efectuate pe un
spectropolarimetru Jasco J815 (Japan International Co.).
2.3. Studii microcalorimetrice
Experimentele de calorimetrie diferențială de scanare (DSC) și de cal-
orimetrie de titrare izotermică (ITC) au fost efectuate pe unități
MicroCal VP-DSC și, respectiv, MicroCal VP-ITC (MicroCal, Inc.,
Northampton, MA, SUA, în prezent Malvern Instruments, Regatul Unit),
conform procedurilor raportate anterior [24,25,41]. În ITC, căldurile
reacției de legare a PFV-Hgb, după o corecție adecvată pentru diluție, au
fost reprezentate grafic în funcție de corelația dintre PFV și Hgb.
corespunzătoare raportului molar. Datele au fost apoi analizate pentru a obține
parametrii termodinamici și constanta de echilibru (Ka ) [24,25].
S-au efectuat studii de microscopie de forță atomică (AFM) pentru Hgb
și complexele Hgb-PFV. Soluția de Hgb a fost diluată până la o
concentraț ă de 200 nM. Ulterior, aceasta a fost centrifugată și
filtrată prin hârtie - ter de 0,22 μm. O alicotă
adsorbită pe o foaie de muscovită Ruby mica (Ruby Mica de calitate
ASTM V1 de la MICAFAB, Chennai) și uscată timp de 30 de minute în
uscător în vid sub atmosferă inertă. Pentru com- plexul Hgb-PFV, s-a
preparat un amestec echimolar de Hgb și PFV, care a fost incubat timp
de 10 minute și adsorbit pe mica. AFM în modul AAC a fost realizat cu
un Pico plus 5500 ILM AFM (Agilent Technologies, SUA) echipat cu
un scanner piezoelectric. Imaginile au fost procesate cu ajutorul
software-ului Picoview versiunea 1.1 (Agilent Technologies), în timp
ce acestea au fost manipulate cu ajutorul software-ului Pico Image
Advanced version.
3. Rezultate și discuții
3.1. Spectroscopia de absorbție electronică
Hgb prezintă două vârfuri majore în regiunea 190-500 nm. Primul
vârf apare datorită tranziției π-π* a grupărilor carbonil ale reziduurilor
de aminoacizi, în timp ce celălalt (~ 405 nm) provine din tranziț -
benzii porfirină-Soret [39,40]. Banda Soret provine de la grupul heme
încorporat în buzunarul hidrofob format prin plierea
corespunzătoare a coloanei vertebrale a Hgb [45-47]. Ambele benzi au
prezentat o scădere a absorbanței la adăugarea de PFV. Modificările
spectrului de absorbție în spectrul Hgb la adăugarea de PFV sunt
prezentate în Fig. 2A, iar modificările asociate cu banda Soret sunt
evidențiate în Fig. 2B. Poziția benzii Soret a rămas practic neschimbată.
Schimbarea hipocromică a benzii Soret a sugerat că com- plexarea dintre
PFV și Hgb a avut loc la starea fundamentală. Modificările în absorbția
benzii Soret au fost analizate cu ajutorul ecuației Benesi-Hildebrand [48].
1 1 1 1
Fig. 1. Structura moleculară a PFV.

2.4. Experimente de dispersie dinamică a luminii

Măsurătorile de împrăștiere dinamică a luminii (DLS) au fost

efectuate pe un analizor dinamic HORIBA (SZ-100 OZ) de împrăștiere
dinamică a dimensiunilor particulelor [43]. Temperatura a fost
menținută la 298,15 K în timpul măsurătorilor.

2.5. Testarea activității esterazei

Activitatea esterazică a Hgb a fost testată folosind p-nitro fenil

acetat (p-NPA) ca substrat, în conformitate cu procedura raportată
anterior [44]. Reacțiile au fost inițiate prin adăugarea de 1,5 mM de p-NPA
alcoolic la un amestec de reacție care conț și s-a
înregistrat modificarea absorbției la 400 nm ca urmare a adăugării de p-
NPA. Datele de absorbție au fost corectate ulterior pentru hidroliza p-NPA
de către tampon. De asemenea, activitatea relativă a esterazei a fost
reprezentată grafic în funcție de modificarea concentrației de PFV.
44 ¼ þ x ð1Þ& Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry
ΔA ΔAmax KBH ðΔAmax Þ ½PFV]

unde ΔA = modificarea absorbanței la banda Soret, ΔA = ab- sorbanța

maximă sau absorbanța Hgb la banda Soret în absența PFV, KBH =
constanta de legare Benesi-Hildebrand și [PFV] = concentrația
de PFV. Constanta de asociere Benesi-Hildebrand pentru com-
plexarea PFV-Hgb (KBH ) a fost dedusă ca fiind de 2,73 × 104 M−1
(Fig. S1A).

3.2. Efectul Proflavinei asupra fluorescenței intrinsece a hemoglobinei

Fluorescența uorescența intrinsecă a Hgb se datorează fracțiunilor

triptofan (Trp) și tiro- sine (Tyr) din lanțul polipeptidic. uorescența
intrinsecă a Hgb se datorează, în esență, reziduului β-Trp37 de la
interfața α1β2 [49] și indică tranziția de la forma relaxată (R) la forma
tensionată (T). Forma legată de ligand (oxy) este forma R, în timp ce
forma deoxy este forma T [50], iar intensităț ță
ale acestor două forme au diferențe semnificative. Spectrul de emisie de
fluorescență al Hgb a fost monitorizat prin excitare la 295 nm, care a
excitat preferențial reziduurile Trp [51]. Hgb a prezentat un maxim
de emisie la 329 nm, dezvăluind faptul că reziduul β-Trp37 este
îngropat sau se află într-o regiune hidrofobă [52]. Intensitatea
uorescenței Hgb a scăzut constant în prezența unei concentrații
crescute de PFV. Acest lucru a sugerat că PFV a interacționat cu Hgb, iar
stingerea s-a datorat formării unui complex specific.

3.3. Efectul hemoglobinei asupra fluorescenței proflavinei

ță foarte fluorescentă, cu emisie maximă la

509 nm atunci când este excitată la 444 nm. Deoarece acest vârf este
departe de maximul de fluo- rescență al Hgb (329 nm), acesta a oferit un
instrument convenabil pentru a cerceta efectul Hgb asupra fluorescenței
PFV. Intensitatea fluorescenței PFV a scăzut treptat la adăugarea unei
concentrații crescânde de Hgb
 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
Fig. 2. (A) Spectre de absorbție reprezentative ale Hgb (curba 1) tratate cu concentrații crescânde de PFV (curbele 2-5). (B) Banda de 405 nm a Hgb este evidențiată aici.
iar poziția maximului de emisie a fost, de asemenea, deplasată în albastru
cu 4 nm la 513 nm, sugerând că moleculele PFV au fost îngropate
într-o regiune mai hidrofobă în interiorul mediului macromolecular
proteic (Fig. 3). Datele de titrare spectrală la maximul de emisie au
fost utilizate în continuare pentru a determina constanta de asociere
folosind protocolul Benesi-Hildebrand menționat anterior. Ecuația
Benesi-Hildebrand a oferit un grafic liniar, sugerând o interacțiune 1:1
între PFV și Hgb. Valoarea KBH pentru complexarea PFV-Hgb a fost
dedusă ca fiind de 3,15 × 104 M−1 (Fig. S1B).
3.4. Studii de fluorescență dependente de temperatură și elucidarea
modului de stingere
Stingerea uorescenței intrinseci la 329 nm a Hgb de către PFV poate fi
statică sau dinamică. Constantele de stingere dinamică cresc odată cu
temperatura, în timp ce în cazul mecanismului de stingere statică,
constanta de echilibru scade odată cu temperatura, datorită slăbirii
legăturii. S-au efectuat titrări de fluorescență dependente de
temperatură la 288,15, 298,15 și 308,15 K și s-a utilizat ecuația clasică
Stern-Volmer pentru a analiza datele [53].
Fo
¼ 1 þ Kq τo ½Q] ¼ 1 þ KSV ½Q]
F
unde Fo ș ța Hgb în absența și, respectiv, în prezența PFV,
KSV = constanta de stingere Stern-Volmer, [Q] = concentrația de PFV, Kq
= constanta de viteză de stingere bimoleculară, τo =
Fig. 3. ță în stare de echilibru ale PFV (curba 1) tratate cu
concentrații crescânde de Hgb (curbele 2-9).
45
durata medie de viață a Hgb și este de ordinul a 10−8 s [54]. Toate
datele au ă în urma
procedurii descrise anterior [55,56]. Valorile KSV și Kq , au scăzut odată cu
creșterea temperaturii exper- imentale. KSV s-a redus de la (3,02 ±
0,19) × 104 la (2,72 ± 0,14) × 104 la (2,24 ± 0,12) × 104 M−1 pe măsură ce
temperatura a in- crecut de la 288,15 la 298,15 la 308,15 K. Această
valoare în scădere a lui KSV odată cu creșterea temperaturii a sugerat
slăbirea com- plexelor PFV-Hgb la temperaturi ridicate. Acest rezultat a
mărturisit că - cenței se datorează complexării specifice a
stării fundamentale care se slăbește odată cu temperatura. În plus,
valorile Kq au fost mai mari decât
2,0 × 1010 M−1 s−1 , sugerând că la complexarea dintre PFV și Hgb a avut
loc un mecanism static de stingere [53].
3.5. Studiu privind durata de viață a fluorescenței
Conform teoriei lui Lakowicz, stingerea fluorescenței prin măsurători de
ță rezolvate în timp poate distinge eficient între procesele
statice și cele dinamice [57]. Stingerea statică este mani- festată prin
valori identice ale timpului de viață al fluorescenței, în timp ce stingerea
dinamică se manifestă prin modificări semnificative ale valorilor timpului
de viață al uorescenței [57]. Din curbele de scădere a fluorescenței rezolvate
ð2Þ în timp a Hgb libere și complexate au fost determinate valorile duratei de
viață a uorescenței lor împreună cu amplitudinile corespunzătoare.
Proba a fost ex- citată la 280 nm cu ajutorul radiației LED, iar lungimea
de undă de emisie a fost ă la 329 nm. Funcția de răspuns a
instrumentului (IRF) a fost determinată pe baza semnalului luminos
împrăștiat de Ludox și aceasta a fost utilizată pentru deconvoluția
semnalului de uorescență. Curbele de descreștere au fost ție
bi-exponențială ței este dat de suma funcțiilor
exponențiale, după cum urmează [57].
X )
t
FðtÞ ¼ αi exp(- ð3Þ
τi
unde F(t)= intensitatea de fluorescență fluorescență la momentul t și αi =
factorul pre-exponențial corespunzător constantei de timp de
dezintegrare ith , τi . Pentru dezintegrarea multi-exponențială,
durata medie de viață τavg este dată de [33].
X
τavg ¼ ai τi ð4Þ
Aici, τi = durata de viață ței și ai = amplitudinea
relativă. Valorile duratei de viață ței au fost τ1 = 0,60
ns și τ2 = 2,96 ns pentru Hgb liber. După adăugarea de PFV, s-a
constatat că valorile medii ale duratei de viață ței au
fost τ1 = 0,58 ns și, respectiv, τ2 = 2,91 ns. Deoarece reziduurile Trp
divulgă descompuneri multi exponențiale [34], astfel încât nu au fost
atribuite componente inde- pendente, în schimb, durata medie de viață a
- rescenței a fost exploatată pentru a obține informații calitative.
Durata medie de viață ței Hgb libere a fost de 2,51 ns, în timp ce
în prezența PFV aceasta a fost modificată marginal la 2,42 ns. Astfel,
durata
46 de viață ță a A.Hgb liber
Basu, G.S. a / Journal
Kumar fost ofaproape
Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
neperturbată în prezența PFV. Acest rezultat
 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
a reafirmat că mecanismul de stingere este în principal static și se
datorează complexării dintre Hgb și PFV.
3.6. Măsurarea transferului de energie
Transferul de energie de rezonanță Förster (FRET) este considerat
ca o "riglă spectro-scopică" pentru determinarea distanțelor moleculare
în sistemele macromoleculare [58]. Pe lângă faptul că divulgă mai
multe detalii despre aspectele legate, măsură ță a
transferului de energie pot oferi, de asemenea, informații despre
distanța dintre PFV legat și situsul său de interacțiune pe Hgb, care este
crucială pentru a obține informații despre aspectele structurale și
conformaționale ale complexului colorant-proteină [59,60]. Teoria
ța transferului de energie (E) să
dependentă de orientarea dipolilor de tranziție ai Hgb, iar distanța dintre
Hgb și PFV ar trebui să -8 nm [60,61]. Valorile lui E, J
( ță al Hgb și a
spectrului de absorbție al PFV), Ro (distanța critică la o efficiență de 50% a
transferului de energie) și r (distanța dintre Hgb și PFV) au fost deduse
0,10, 1,88 × 10−14 cm3 L mol−1 , 2,42 nm și 3,49 nm, re- spectiv,
folosind ecuațiile raportate anterior [62]. Astfel, există o suprapunere
ă ță al Hgb și spectrul de ab-
sorbție al PFV (Fig. 4). Distanța dintre Hgb și PFV este mai mică de 8 nm,
astfel încât există o posibilitate echitabilă de transfer de energie de
la reziduurile Trp din Hgb la PFV [61]. Din aceste rezultate putem
concluziona fără echivoc că legarea PFV la Hgb provine dintr-o
complexare puternică în stare fundamentală.
3.7. Elucidarea parametrilor de legare
După stabilirea formării complexului dintre PFV și Hgb, constanta de
echilibru (KA ) și numărul de situsuri de legare (n) au fost calculate
după cum urmează [63,64]
ð Fo-FÞ
log ¼ logKA þ n log½Q ]
F
S-a dedus că affinitatea de legare a PFV pentru Hgb la 298,15 K este
de (3,32 ± 0,19) × 104 M−1 . În plus, valorile KA au scăzut odată cu
creșterea temperaturii, sugerând destabilizarea complexului PFV-Hgb la
temperaturi mai ridicate. Numărul de situsuri de legare (n) a fost dedus
ca fiind (1,05 ± 0,05) la 298,15 K, sugerând că există un singur tip de situs
de legare pentru PFV pe Hgb. Prin urmare, este foarte probabil ca
PFV să se lege în apropierea unui situs Trp
reziduu pe Hgb.
Fig. 4. Suprapunerea spectrală (porțiunea umbrită) a spectrului de emisie al Hgb și a
spectrului de absorbție al PFV.
47
3.8. Studii de fluorescență în funcție de sare
Odată cu creșterea [Na+ ], valorile KA au scăzut. Deoarece s-a
constatat că gradul de interacțiune depinde de cantitatea de sare
prezentă în mediu, am efectuat experimentele în soluții tampon care
conțin între 10 și 50 mM [Na+ ]. Creșterea [Na+ ] de la 10 la 20 la 50
mM a scăzut valoarea KA de la (3,32 ± 0,19) × 104 la (2,45 ± 0,19) × 10 .
0,13) × 104 la (1,33 ± 0,08) × 104 M−1 .
PFV este un ligand monocationic și, prin urmare, forțele
electrostatice pot juca un rol critic în procesul de complexare. Panta
graficului log KA versus log [Na+ ] a fost calculată ca fiind (-0,573 ±
0,064) (Fig. 5A) folosind relația raportată anterior [65]. Valorile ΔG0 au fost
determinate ca fiind (-6,17 ± 0,19), (-5,99 ± 0,13) și (-5,63 ± 0,08)
kcal/mol, respectiv, la 10, 20 și 50 mM [Na+ ]. Aceste valori ΔG0 au
fost împărțite între componentele polielectrolitice (ΔG0pe ) și
cele neelectrolitice (ΔG0t ) (Fig. 5B). Contribuția polielectrolitică a
fost estimată cantitativ din ecuația raportată anterior [66]. La 10, 20 și
50 mM [Na+ ], contribuțiile ΔG0pe au fost determinate ca fiind (-
1,57 ± 0,19), (-1,33 ± 0,13) și (-1,02 ± 0,13).08) kcal/mol, respectiv,
care au reprezentat doar 25, 22 și 18 % din ΔG total0 . Ulterior, componenta
neelectrolitică (Δr G0 ) a fost obținută dint diferența dintre ΔG0 și ΔG0 .
Contribuțiile nepolielectrolitice au fost (-4,60 ± 0,19), (-4,66 ±
pe
0,13) și (-4,61 ± 0,08) kcal/mol,
respectiv, la 10, 20 și 50 mM [Na+ ]. Prin urmare, legarea a fost
determinată în principal de forțe neelectrolitice, cum ar fi stivuirea π-π,
legătura H și interacțiunile van der Waals.
3.9. Măsurători de anizotropie
Rezultatele anizotropiei pot fi utilizate ca un ghid pentru a
determina cea mai probabilă localizare a unui ligand în mediul
macromolecular al unei proteine. Experimentele de anizotropie au
fost efectuate conform lui Larsson și colegilor [67]. Sporirea
anizotropiei polariză ței
(r) a PFV în prezența Hgb testată pentru complexarea PFV cu Hgb. La
asocierea cu Hgb, anizotropia PFV a crescut
de la 0,008 la 0,040 la D/P (raportul molar colorant/proteină) 220.
ð5Þ Legarea PFV la Hgb a redus mobilitatea acesteia, conducând astfel la o
creștere a anizotropiei PFV. În plus, aceasta sugerează, de asemenea, că
de PFV -un spațiu
restrâns
mediul înconjurător.
Intensificarea anizotropiei de fluorescență uorescență a PFV la com-
plexarea cu Hgb permite determinarea constantă de legare (Kr ) în mod
independent, folosind ecuațiile date de Ingersoll și Strollo
[68] descrisă mai jos,
1 1 ð6Þ
¼1þ
fB Kr ½L]
unde; f ¼ r-r F ð7Þ
BRðrB -rÞ þ r-r F
Aici, fF și fB = intensitățile de fluorescență fracționată a PFV liber și,
respectiv, a PFV legat de Hgb, rF și rB = magnitudinea valorilor
anizotropiei corelate, iar [L]= [Hgb]. R = factor de corecție obținut
din raportul fB /fF . Din relația de mai sus, s-au trasat diagramele 1/fB versus
1/[L] și, folosind panta, s-a determinat constanta de legare pentru
complexarea PFV-Hgb ca fiind de 3,33 × 104 M−1 . Această valoare
din rezultatul anizotropiei este în concordanță cu cele obținute din
studiile spectroscopice (vide supra) și a sugerat validitatea acestei
metode.
3.10. Testul de deplasare a sondei hidrofobe
Acidul 8-Anilino-1-naftalensulfonic (ANS), o sondă hidrofobă
sensibilă la schimbările de micro-mediu în Hgb, poate fi utilizat pentru a obține
informații despre regiunile de legare hidrofobe de pe suprafața Hb
48 [37,69]. A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
Fig. 5. (A) Variația log KA față de log [Na+ ] pentru complexarea PFV-Hgb. (B) Contribuții polielectrolitice (ΔG0 ) (umbrite)
Există două tipuri de situsuri de legare a ANS pe Hgb, în funcție de
disponibilitatea moleculelor de apă [70]. Primul situs de legare pentru
ANS este determinat în mare măsură de interacțiunea electrostatică
dintre grupul său sulfonat și grupurile cationice ale Hgb. Extremitatea N-
terminală a subunității β a Hgb formează o aglomerare de opt sarcini
pozitive care înconjoară cavitatea centrală, ceea ce permite intercalarea
moleculelor de ANS în cavitatea centrală și, de asemenea, permite ca
aceasta să fie învelită de un mediu hidrofob al globulelor proteice
[71,72]. PFV a fost adăugat la soluția de Hgb liberă și la complexele
Hgb-ANS în proporții de 1:10 și 1:20. Ulterior, a fost trasată intensitatea
relativă ță a Hgb în funcție de concentrația PFV. Acest test
de dis- plasare a arătat că moleculele PFV pot expulza moleculele ANS
legate din cavitatea centrală a Hgb și se pot lega la regiunea hidrofo-
bică.
3.11. Spectroscopie de fluorescență sincronă
Modificările conformaționale ale Hgb ca urmare a legării PFV au fost
studiate folosind spectroscopia de fluorescență sincronă [73].
Spectroscopia sincronă ță a fost introdusă de Lloyd [73] și
este utilizată pe scară largă pentru a caracteriza interacțiunile ligand-
proteină [39-41, 74] ță a Hgb oferă informații
despre microenvi- zulmentul din jurul reziduurilor Tyr atunci când Δλ
= 15 nm și în jurul reziduurilor Trp dues atunci când Δλ = 60 nm.
Stingerea fluorescenței sincrone a Hgb de către PFV sugerează alterarea
polarității în jurul acestor reziduuri de aminoacizi [75]. Spectrele de
uorescență sincronă a Hgb în prezența PFV sunt reprezentate în Fig.
S2. PFV a indus o stingere treptată sistematică a fluorescenței sincrone
a Hgb (Δλ = 60 nm) împreună cu o deplasare batocromică semnificativă de 9
nm (Fig. S2A). În mod similar, pentru Δλ ța sincronă a
Hgb a scăzut, de asemenea, în prezența PFV cu o deplasare roșie de 7 nm
(Fig. S2B). O deplasare spre roșu mai mare
Fig. 6. (A) Modificări spectrale ale Hgb (curba 1) prin dicroism circular (CD UV îndepărtat) la tratamentul cu 2, 6, 8, 10, 12, 14 ș
Soret ale Hgb (curba 1) la adăugarea a 2, 12 și 25 PFV (curbele 2-4).
49
pe și neelectrolitice (ΔG0 ) (negru) împărțite
t la ΔG0 .
în maximul de emisie pentru Δλ = 60 nm indică faptul că mediul din jurul
reziduurilor Trp este alterat într-o măsură mai mare în comparație cu
reziduurile Tyr. Astfel, reziduurile Trp se află într-un mediu mai hidrofil
decât reziduurile Tyr. Acest rezultat reiterează observațiile din
experimentele de stingere ș și mai mult
rolul potențial al reziduurilor Trp în fenomenul de complexare.
3.12. Studii FTIR
Spectroscopia FTIR este utilă pentru a studia calitativ structura
medie sec- ondară a Hgb [45,76]. Spectrele FTIR ale Hgb și ale
complexelor Hgb-PFV sunt prezentate Fig. S3. Cea mai importantă
bandă vibrațională în Hgb este banda amidică I (1700-1600 cm−1 ) care
apare datorită vibrațiilor de întindere C_O și C \ \ \ N și este asociată cu con-
formația coloanei vertebrale a Hgb. Banda amidei I s-a deplasat de la
1649 cm−1 în Hgb liber la 1644 cm−1 în complexul PFV-Hgb (Fig. S3).
Această deplasare către un număr de undă mai mic este rezultatul
interacțiunii dintre Hgb și PFV, iar fenomenul de com- plexare a fost
posibil să fie determinat de legături de hidrogen, interacțiuni
hidrofobe și hidrofile [77]. Mai mult, o schimbare
conformațională în Hgb de la structura elicoidală la structura agregată de
tip β-sheet poate explica, de asemenea, mica deplasare spre un număr de
undă mai mic [78].
3.13. Spectroscopia cu dicroism circular
Curba 1 din Fig. 6A arată că spectrul CD al Hgb în regiunea UV
îndepărtată conține două benzi negative la 209 și 222 nm, care sunt
caracteristice structurii sale α-helicoidale [79,80]. Semnalul CD al Hgb a de-
crecut în magnitudine la adăugarea de PFV, ceea ce
sugerează modificări conformaționale în Hgb (Fig. 6A). Conținutul
elicoidal al Hgb libere
2-8). (B) Modificări spectrale CD în banda
50 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
Fig. 7. Panoul superior reprezintă termograma ITC pentru complexarea PFV-Hgb la
298,15 K (curba de sus), împreună ție (curba de jos decalată pentru
claritate). Panoul de jos prezintă datele privind căldura integrată după corecția căldurii de
diluție. Simbolurile (■) reprezintă punctele de date, iar linia continuă reprezintă datele
best-
și Hgb legată de PFV a fost calculată folosind ecuația raportată
anterior [62,81,82]. S-a dedus că conținutul α-helicoidal al Hgb libere este
de 75 %. În urma complexării cu PFV, acesta a fost redus la 27%. Prin
urmare, legarea la PFV a dus la o pierdere remarcabilă a stabilității
elicoidale a Hgb, lanțurile polipeptidice extinse expunând cavitățile
hidrofobe.
Banda Soret a Hgb provine dintr-o mișcare de dipol electronic care
permite tranziția π-π* întâlnită în mod obișnuit în porfirine [40,83].
Banda Soret permite monitorizarea modificărilor induse de ligand în
natura inelului porfirinic. Hgb a prezentat un spectru CD în regiunea
Soret cu un maxim pozitiv la 414 nm și un mic gol negativ la 398 nm
(Fig. 6B). Intensitatea benzii pozitive a scăzut cu
Fig. 8. (A) Modificări ale spectrelor de fluorescență ale PFV (1 μM) complexat cu Hgb (10 μM) în prezența a 0-7 M uree (curbele 1-5). Inset: variația anizotropiei complexului PFV-Hgb în funcție de
creșterea concentrației de PFV, ceea ce sugerează că planaritatea
inelului de porfirină a fost modificată în urma complexării cu
moleculele de PFV.
3.14. Studii de topire a CD-urilor
Stabilitatea termică a Hgb poate fi afectată în mod
semnificativ la legarea PFV. Pentru a obține informații în acest sens, au
fost monitorizate modificările CD la 222 nm odată cu creșterea
temperaturii. Profilele de topire CD ale Hgb și ale complexului Hgb-PFV
sunt prezentate în Fig. S4. S-a constatat că temperatura de
denaturare CD a Hgb necomplexat a fost de 336,11 K, în timp ce
complexul Hgb-PFV s-a topit la 331,05 K. Studiul de topire CD a
arătat astfel că legarea a redus stabilitatea termică a Hgb (ΔTm ) cu
5,06 K. Astfel, PFV a destabilizat Hgb în urma complexării, ceea ce
confirmă rezultatele studiilor CD în UV îndepărtate.
3.15. Calorimetrie diferențială de scanare
DSC este utilă pentru a monitoriza energetica procesului de pliere-
dezvoltare a proteinelor în funcție de temperatură [84-87]. Hgb a
prezentat un singur vârf endotermic la (335,02 ± 0,04) K (Fig. S5, curba 1)
la dena- turarea termică. În prezența PFV, temperatura de denaturare
termică a Hgb a fost redusă la (330,68 ± 0,03) K (Fig. S5, curba 2). Astfel,
temperatura de topire a Hgb a scăzut cu 4,34 K în prezența PFV, ceea ce
indică faptul că legarea colorantului destabilizează Hgb. Excesul
aparent de entalpie de tranziție a Hgb liber a scăzut de la (77,37 ±
0,07) la (76,57 ± 0,06) kcal/mol în forma complexată. Prin urmare,
datele DSC au coroborat și mai mult rezultatele obținute din studiile
de topire CD.
3.16. Calorimetrie de titrare izotermă
ITC este utilizat pe scară largă pentru a studia energetica
reacțiilor de legare a ligandului la proteină [84,86-88]. Fig. 7 prezintă
termograma ITC pentru asocierea PFV-Hgb la 298,15 K. Valoarea Ka
pentru complexarea Hgb-PFV a fost evaluată ca fiind (3,27 ± 0,05) ×
104 M−1 . Schimbarea entalpiei (ΔH0 ) a fost dedusă ca fiind de (-3,20 ±
0,03) kcal/mol. Întărirea legăturilor H- în mediul hidrofob al Hgb
împreună cu interacțiunile van der Waals pot explica această valoare
ΔH 0[89]. Contribuția entropică (TΔS0 ), care provine probabil din
eliberarea moleculelor de apă și a contraionilor legați de pro- teină,
a fost de (2,96 ± 0,02) kcal/ mol. Schimbarea energiei Gibbs (ΔG0 ) pentru
procesul de complexare a fost calculată ca fiind de (-6,16 ± 0,05)
kcal/mol.
3.17. Studii de denaturare indusă de Chaotrope
După descifrarea aspectelor structurale ale reacției de legare a PFV-
ța denatură ății sale de
legare. În Fig. 8A sunt reprezentate modificările în spectrele de
uorescență ale PFV
concentrația de uree. (B) Reprezentarea grafică aA.
variației intensităț
Basu, G.S. ței Hgb la 329 nm
Kumar / Journal of Photochemistry cu creșterea B:
& Photobiology, concentrației de uree.
Biology 165 (2016) 42-50 51
52 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
Fig. 9. Variația activității esterazei relative a Hgb la creșterea concentrației de VPF.
legată de Hgb în prezența ureei. Este evident că adăugarea de uree la
complexul PFV și Hgb duce la creșterea intensității benzii de emisie a PFV.
Adăugarea de chaotropă a dus la destabilizarea complexului PFV-Hgb,
expunând astfel mai mult PFV la soluția tampon. Această expunere a
moleculelor de PFV legate anterior a explicat o creștere a
fluorescenței uorescente a PFV. Chaotropele pot expulza moleculele
de apă de lângă sondă în micro-mediul proteic cu denaturarea
concomitentă a Hgb [53,90,91]. Prin urmare, destabilizarea indusă de
haotropi a PFV-
Fig. 10. Imagini AFM ale Hgb (A, B și C) și ale complexului său cu PFV (D, E și F).
complexul Hgb este legat de un grad mai mare de expunere a sondei
la soluția tampon în comparație cu starea sa complexată în con- formația
nativă a Hgb [91].
Pentru a înțelege dacă PFV este complet liber sau se află într-un
mediu comparativ mai puțin restrictiv, dar totuși oarecum restricționat, în
prezența ureei, au fost efectuate studii de anizotropie. Anizotropia
uorescenței a scăzut odată cu creșterea concentrației de uree (inset din
Fig. 8A). Cu toate acestea, în ciuda scăderii anizotropiei PFV legat de
Hgb odată cu creșterea concentrației de uree, valoarea anizotropiei a
rămas mai mare decât cea observată pentru PFV liber, ceea ce permite să se
ajungă la concluzia că PFV nu a fost eliberat în totalitate în tampon.
S-a monitorizat, de ța haotropei asupra
ței Hgb. Adăugarea de uree a determinat o creștere a
ței Hgb la 329 nm. În figura 8B este reprezentată o
diagramă a modificării intensității emisiei la 329 nm în funcție de
concentraț ța intrinsecă a Hgb pentru
reziduurile Trp crește la adăugarea de uree datorită unei conformații
structurale în care reziduurile Trp care emit și grupul heme sunt la
distanță mare pentru ca transferul de energie să fie restricționat [92-94].
Aceeași tendință ă atunci când în locul
ureei a fost utilizată clorhidrat de guanidină, un alt chaotrop bine
cunoscut (nu este prezentat).
3.18. Studii de dispersie dinamică a luminii
Experimentul DLS a evidențiat distribuția dimensională (diametru
hidrodinamic, dh și în prezența PFV. Diametrul
hidrodinamic mediu al Hgb în absența și în prezența PFV a fost de (77 ± 9)
și, respectiv, (207 ± 70) nm (Fig. S6). Această creștere a
diametrului hidrodinamic mediu poate fi atribuită unei
 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
creșterea tendinței de agregare a moleculelor de Hgb la complexare.
3.19. Testarea activității esterazei
Hgb este, de asemenea, înzestrată cu o proprietate enzimatică
interesantă, cunoscută sub numele de activitate de tip esterază.
Activitatea de tip esterază a Hgb este determinată prin monitorizarea
absorbției p-nitrofenolului produs prin hidroliza acetatului de p-
nitrofenil sub acțiunea Hgb. Fig. 9 prezintă modificările activității
esterazice relative a Hgb în prezența PFV. Se poate observa că
complexarea Hgb-PFV a dus la o scădere a activității esterazice a Hgb, ceea
ce reiterează și mai mult observația anterioară conform căreia structura
nativă a Hgb este alterată în urma asocierii cu PFV.
3.20. Imagistica prin microscopie de forță atomică
Am utilizat AFM pentru a monitoriza dacă PFV induce modificări
morfologice semnificative în Hgb datorită interacțiunii sale. Fig. 10A
reprezintă în mod clar imaginea AFM a Hgb libere din punct de vedere
topografic. Fig. 10B este o reprezentare a imaginii în termeni de
amplitudine. Fig. 10C este imaginea AFM tridimensională a Hgb. Imaginile
dezvăluie clar morfologia configurării tetramerice a Hgb. Fig. 10D,E repre-
zintă imaginile AFM ale complexului Hgb-PFV în termeni de
topografie și, respectiv, de amplitudine. Fig. 10F este reprezentarea
tridimensională a complexului Hgb-PFV. Imaginile AFM au arătat că
caracteristicile morfologice es- ării tetramerice a
moleculelor de Hgb au fost păstrate în prezența PFV. Așadar, această
observație valorează că PFV este mai puțin probabil să provoace daune sau să
modifice morfologia unor biomolecule importante precum Hgb și, prin
urmare, să reprezinte amenințări toxice mai puțin importante.
4. Concluzii
Acest studiu definește aspectele structurale și termodinamice ale
interacțiunii PFV cu Hgb. Dovezile spectroscopice au arătat că PFV se leagă
de Hgb prin formarea unui complex în starea de bază. Datele spectrale
de fluorescență au sugerat că interacțiunea a implicat un contact strâns
al PFV cu reziduul β-Trp37 al Hgb la interfața α1β2. Rezultatele
sincronizate de fluorescență, FTIR și dicroism circular au sugerat modificări
conformaționale semnificative în Hgb la legarea cu PFV. Parametrii
termodinamici obținuți din ITC au arătat că com- plexarea a fost
favorizată de o entalpie negativă și o entropie pozitivă. Imagistica AFM a
sugerat că morfologia Hgb a rămas intactă în urma complexării cu PFV.
Această lucrare oferă informații biofizice cruciale privind legarea PFV cu Hgb,
care sunt esențiale pentru a înțelege de- livery de PFV la diferite ținte
fiziologice. Merită menționat aici că
rezonabil de slabă în comparație cu cele raportate pentru alte molecule
terapeutice [37,39]. Așadar, utilizarea potențială a PFV în terapeutică poate fi
ă pe baza faptului că biodis- tribuția PFV ar fi uniformă și ar
prezenta mai puține amenințări toxice.
Recunoștințe
Această lucrare a fost finanțată de GenCODE (BSC0123) al Consiliului
de Cercetare Științifică și Industrială (CSIR), Guvernul Indiei. Dr.
Anirban Basu a fost susținut de Research Associateship din partea
proiectului GenCODE.
Anexa A. Date suplimentare
Datele suplimentare la acest articol pot fi găsite online la
http://dx. doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2016.10.010.
53
Referințe
[1] N. Pal Singh, R. Kumar, D.N. Prasad, S. Sharma, O. Silakari, Synthesis and antibacterial
activity of benzotriazole substituted acridines, Int. J. Biol. Chem. 5 (2011) 193-199.
[2] L. Ngadi, A. Galy, J. Galy, J. Barbe, A. Crémieux, J. Chevalier, D. Sharples, Some new 1-
nitro acridine derivatives as antimicrobial agents, Eur. J. Med. Chem. 25 (1990) 67-
70.
[3] P. Belmont, J. Bosson, T. Godet, M. Tiano, Acridine and acridone derivatives, antican-
cer properties and synthetic methods: where are we are now? Anti Cancer
Agents Med. Chem. 7 (2007) 139-169.
[4] S.C. Nash, A.S. Ketcham, R.R. Smith, Efectul irigării locale cu hemisulfat de
ă asupra rănilor însămânțate cu celule tumorale: un studiu
experimental, Ann. Surg. 155 (1962) 465-471.
[5] P. Ascenzi, M. Colosanti, M. Fasano, A. Bertollini, Stabilization of the T-
state of human hemoglobin by proflavine, an antiseptic drug, IUBMB Life
47 (2008) 991-995.
[6] L.R. Ferguson, W.A. Denny, The genetic toxicology of acridines, Mutat. Res. 258
(1991) 123-160.
[7] A.K. Todd, A. Adams, J.H. Thorpe, W.A. Denny, L.P.G. Wakelin, C.J. Cardin, Major
groove binding and 'DNA-induced'
mixed topoisomerase i/ii poison N-(2-(Dimethylamino) ethyl) acridine-4-
carboxamide (DACA) into DNA: X-ray, J. Med. Chem. 42 (1999) 536-540.
[8] G.W. Rewcastle, G.J. Atwell, D. Chambers, B.C. Baguley, W.A. Denny, Potențiali agenți
antitu- morali. 46. Relații de structură-activitate pentru d e r i v a ț i i
monosubstituiți cu acridină ai agentului antitumoral N-[2-(dimetilamino)etil]-9-
aminoacridină-4- carboxamidă, J. Med. Chem. 29 (1986) 472-477.
[9] G.J. Atwell, G.W. Rewcastle, B.C. Baguley, W.A. Denny, Potențiali agenți antitumorali.
50. Activitatea tumorală solidă in vivo a derivaților de N[2-(dimetilamino)etil]-acri-
dină 4-carboxamidă, J. Med. Chem. 30 (1987) 664-669.
[10] J.M. Crenshaw, D.E. Graves, W.A. Denny, Interactions of acridine antitumor agent
with DNA: binding energies and groove preferences, Biochemistry 34 (1995)
13682-13687.
[11] -DNA
intercalation, Nucleic Acids Res. 16 (1988) 8999-9016.
[12] P. Tang, C.L. Juang, G.S. Harbison, Intercalation complex of proflavine with DNA:
structure and dynamics by solid-state NMR, Science 249 (1990) 70-72.
[13] M. Aslanoglu, Electrochemical and spectroscopic studies of the interaction of
proflavine with DNA, Anal. Sci. 22 (2006) 439-443.
[14] M. Demeunynck, F. Chamantray, A. Martelli, Interest of acridine derivatives in the
anticancer chemotherapy, Curr. Pharm. Des. 7 (2001) 1703-1724.
[15] W.A. Denny, Acridine derivatives as chemotherapeutic agents, Curr. Med. Chem. 9
(2002) 1655-1665.
[16] W.A. Denny, Efectele chimioterapeutice ale derivaților de acridină, Med. Chem.
Rev. 1 (2004) 257-266.
[17] U. Kragh-Hansen, S.O. Brennan, M. Galliano, O. Sugita, Binding of warfarin, salicilat și
diazepam la variantele genetice ale albuminei serice umane cu mutații cunoscute,
Mol. Pharmacol. 37 (1990) 238-242.
[18] F. Quadrifoglio, V. Crescenzi, V. Giancotti, Calorimetry of DNA-dye interactions in
aqueous solution: I. Proflavine and ethidium bromide, Biophys. Chem. 1 (1974)
319-324.
[19] T. Biver, F. Secco, M.R. Tiné, M. Venturini, Equilibria și cinetica intercalării Pt-
ș -ul din timusul de vițel, Arch. Biochem. Biophys.
418 (2003) 63-70.
[20] B. García, J.M. Leal, R. Ruiz, T. Biver, F. Secco, M. Venturini, Change of the binding
mode of the DNA/proflavine system induced by etanol, J. Phys. Chem. B 114
(2010) 8555-8564.
[21] W.D. Sasikala, A. Mukherjee, Mecanismul molecular al interacțiunii directe
proflavină-ADN: dovezi pentru calea de penalizare minimă de suprapunere a bazei
indusă de medicament, J. Phys. Chem. B 116 (2012) 12208-12212.
[22] M. Dourlent, C. Hélenè, O analiză cantitativă a legă acidul
poliadenilic, acidul poliuridilic și ARN de transfer, Eur. J. Biochem. 23 (1971) 86-
95.
[23] V. Kumar, A. Sengupta, K. Gavvala, R.K. Koninti, P. Hazra, Spectroscopic and
thermo-
telomeric G- quadruplex DNA, J. Phys. Chem. B 118 (2014) 11090-11099.
[24] A. Basu, G. Suresh Kumar, caracterizarea termodinamică a legăturii ă-
ADN prin studii microcalorimetrice, J. Chem. Thermodyn. 87 (2015) 1-7.
[25] A. Basu, G. Suresh Kumar, Investigație calorimetrică privind interacț cu
ADN-ul telomeric uman G-quadruplex, J. Chem. Thermodyn. 98 (2016) 208-213.
[26] S.M.H. Evans, I.G.C. Robertson, J.W. Paxton, legarea la proteinele plasmatice a
agentului antitumoral experimental acridină-4-carboxamidă la om, câine,
șobolan și iepure, J. Pharm. Pharmacol. 46 (1994) 63-67.
[27] B. Chakraborty, S. Basu, Interaction of BSA with : a spectroscopic approach,
J. Lumin. 129 (2009) 34-39.
[28] M.M. Cox, G.N. Phillips Jr., Handbook of Proteins: Structure, Function and Methods,
2, Wiley, West Sussex, 2007.
[29] M.F. Perutz, Haemoglobina: structură, funcție și sinteză, Br. Med. Bull. 32 (1976)
193-194.
[30] M.F. Perutz, M.G. Rossmann, A.F. Cullis, H. Muirhead, G. Will, A.C.T. North, Structure
of haemoglobin: a three-dimensional Fourier synthesis at 5.5-Å resolution, obtained by X-ray
analysis, Nature 185 (1960) 416-422.
[31] M.F. Perutz, Analiza cu raze X a hemoglobinei, Science 140 (1963) 863-869.
[32] R.W. Lucek, C.B. Coutinho, The role of substituents in the hydrophobic binding of the
1,4-benzodiazepines by human plasma proteins, Mol. Pharmacol. 12 (1976) 612-619.
[33] N. Shahabadi, M. Maghsudi, Z. Kiani, M. Pourfoulad, Multispectroscopic studies on
the interaction of 2-tert-butylhydroquinone (TBHQ), a food additive, with bovine
serum albumin, Food Chem. 124 (2011) 1063-1068.
54 A. Basu, G.S. Kumar / Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 165 (2016) 42-50
[34] W. Peng, F. Ding, Y.-K. Peng, Y. Sun, Molecular recognition of malachite green by he-
interactions: insights from in silico docking and
molec- ular spectroscopy, Mol. BioSyst. 10 (2014) 138-148.
[35] S. Tunç, O. Duman, B.K. Bozoğlan, Studies on the interactions of chloroquine diphos-
phate and phenelzine sulfate drugs with human serum albumin and human hemo-
globin proteins by spectroscopic techniques, J. Lumin. 140 (2013) 87-94.
[36] O. Duman, S. Tunç, B.K. Bozoğlan, Characterization of the binding of metoprolol tar-
trate and guaifenesin drugs to human serum albumin and human hemoglobin pro-
(2013) 659-669.
[37] S. Hazra, G. Suresh Kumar, Studii structurale și termodinamice privind interacțiunea
formelor de iminiu și alcanolamină ale sanguinarinei cu hemoglobina, J. Phys.
Chem. B 118 (2014) 3771-3784.
[38] E. Antonini, M. Brunori, Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions With Li-
gands, North-Holland publishing Co., Amsterdam, Olanda, 1971.
[39] S. Hazra, G. Suresh Kumar, Legătura alcaloizilor de izochinolină berberină,
palmatină și coralină la hemoglobină: studii de caracterizare structurală și
termodinamică, Mol. BioSyst. 9 (2013) 143-153.
[40] S. Chatterjee, G. Suresh Kumar, Targeting the heme proteins hemoglobin and myo-
globin by janus green blue and study of the dye-protein association by spectroscopy
and calorimetry, RSC Adv. 4 (2014) 42706-42715.
[41] A. Basu, G. Suresh Kumar, Binding of carmoisine, a food colorant, with hemoglobin:
spectroscopic and calorimetric studies, Food Res. Int. 72 (2015) 54-61.
[42] R. Sinha, M. Hossain, G. Suresh Kumar, Interaction of small molecules with double-
stranded RNA: spectroscopic, viscometric, and calorimetric study of hoechst and
structures, DNA Cell Biol. 28 (2009) 209-219.
[43] S. Pramanik, A. Saha, P. Sujatha Devi, Nano-particule de aliaj AuAg solubile în apă care
emit albastru și platforme solide fluorescente pentru îndepărtarea coloranților
din apă, RSC Adv. 5 (2015) 3946-33954.
[44] S. Sen, T. Bose, A. Roy, A.S. Chakraborti, Effect of non-enzymatic glycation on esterase
activities of hemoglobin and myoglobin, Mol. Cell. Biochem. 301 (2007) 251-257.
[45] M. Matsui, A. Nakahara, A. Takatsu, K. Kato, N. Matsuda, In situ observation of the
state and stability of hemoglobin adsorbed onto glass surface by slab optical wave-
guide (SOWG) spectroscopy, Int. J. Chem. Biomol. Eng. 1 (2008) 72-75.
[46] A.F. Nassar, J.F. Rusling, N. Nakashima, Electron transfer between electrodes and
heme proteins in protein-DNA films, J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 3043-3044.
[47] M. Mahato, P. Pal, B. Tah, M. Ghosh, G.B. Talapatra, Studiul interacțiunii dintre
nanoparticulele de argint și moglobina și formarea compozitului, Colloids Surf. B:
Biointerfaces 88 (2011) 141-149.
[48] H.A. Benesi, J.H. Hildebrand, O investigație spectrofotometrică a interacțiunii iodului
cu hidrocarburile aromatice, J. Am. Chem. Soc. 71 (1949) 2703-2707.
[49] B. Alpert, D.M. Jameson, G. Weber, Tryptophan emission from human hemoglobin
and its isolated subunits, J. Photochem. Photobiol. 31 (1980) 1-4.
[50] M.F. Perutz, G. Fermi, D.J. Abraham, C. Poyart, E. Bursaux, Hemoglobina ca
receptor de medicamente și peptide: studii cu raze X ale stereochimiei de legare, J.
Am. Chem. Soc. 108 (1986) 1064-1078.
[51] J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York,
1983.
[52] E.A. Burstein, N.S. Vedenkina, M.N. Ivkova, Fluorescența și localizarea reziduurilor
tripto- phan în moleculele proteice, Photochem. Photobiol. 18 (1973) 263-279.
[53] J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York,
1999.
[54] structural
uctuations in macromolecules, Biochemistry 12 (1973) 4161-4170.
[55] R.F. Steiner, L. Weinry, Excited States of Protein and Nucleic Acid, Plenum Press, New
York.
York, 1971.
[56] Y.-Q. Wang, H.-M. Zhang, B.-P. Tang, The interaction of C.I. acid red 27 with human
hemoglobin in solution, J. Photochem. Photobiol. B 100 (2010) 76-83.
[57] J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, ed. a treia, Springer Science
+ Business Media, New York, 2006 63-606.
[58] A.N. Kapanidis, T.A. Laurence, N.K. Lee, E. Margeat, X. Kong, S. Weiss, Alternating-
laser excitation of single molecules, Acc. Chem. Res. 38 (2005) 523-533.
[59] A. Mallick, B. Haldar, N. Chattopadhyay, Spectroscopic investigation on the interac-
tion of ICT probe 3-Acetyl-4-oxo-6,7-dihydro-12H Indolo-[2,3-a] quinolizine with
serum albumins, J. Phys. Chem. B 109 (2005) 14683-14690.
[60] C. Jash, G. Suresh Kumar, Binding of alkaloids berberine, palmatine and coralyne to
lysozyme: a combined structural and thermodynamic study, RSC Adv. 4 (2014)
12514-12525.
[61] B. Valeur, J.C. Brochon, New Trends in Fluorescence Spectroscopy, Springer-
Verlag, Berlin, 2001.
[62] A. Basu, G. Suresh Kumar, Studii multispectroscopice și calorimetrice privind legarea
colorantului alimentar tartrazină cu hemoglobina umană, J. Hazard. Mater. (2016),
http://dx.doi.org/10.1016/j.jhazmat.2016.07.023.
[63] O.K. Abou-Zied, O.L.K. Al-Shihihi, Caracterizarea situsului de legare a
subdomeniului IIA al albuminei serice umane în stările sale native, desfășurate și
repliate utilizând sonde mo- leculare mici, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008)
10790-10801.
[64] G.W. Zhang, Q.M. Que, J.H. Pan, J.B. Guo, Studiul interacțiunii dintre icariină și albumina
serică umană prin spectroscopie de fluorescență fluorescentă, J. Mol. Struct. 81 (2008)
132-138.
[65] M.T. Record Jr., T.M. Lohman, P. De Haseth, Ion effects on ligand-nucleic acid inter-
actions, J. Mol. Biol. 107 (1976) 145-158.
[66] M.T. Record Jr., R.S. Spolar, în: M.T. Record Jr: A. Revzin (Ed.), The Biology of
-Pro- tein Interactions, CRC Press, Boca Raton, FL 1990, pp.
33-69.
[67] A. Larsson, C. Carlsson, M. Jonsson, B. Albinsson, Characterization of the binding of
the uorescent dyes YO and YOYO to DNA by polarized light spectroscopy, J.
Am. Chem. Soc. 116 (1994) 8459-8465.
[68] C.M. Ingersoll, C.M. Strollo, anizotropie de fluorescență fluorescentă în stare staționară
pentru a investiga legarea a- vonoizilor la proteine, J. Chem. Educ. 84
(2007) 1313-1315.
[69] L. Stryer, The interaction of a naphthalene dye with apomyoglobin and
apohemoglobin: a fluorescent probe of non-polar binding sites, J. Mol. Biol. 13
(1965) 482-495.
[70] D.A. Parul, S.B. Bokut, A.A. Milyutin, E.P. Petrov, N.A. Nemkovich, A.N. Sobchuk, B.M.
Dzhagarov, Time-resolved fluorescence reveals two binding sites of 1,8-ANS in in-
tact human oxyhemoglobin, J. Photochem. Photobiol. B 58 (2000) 156-162.
[71] D. Matulis, R. Lovrien, 1-Anilino-8-naphthalene sulfonate anion-proteine binding de-
pends primarily on ion pair formation, Biophys. J. 74 (1998) 422-429.
[72] V.E. Syakhovich, D.A. Parul, E.Y. Ruta, B.A. Bushuk, S.B. Bokut, 1,8-
Anilinonaftalină sulfonat se leagă de cavitatea centrală a hemoglobinei umane,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 317 (2004) 761-767.
[73] J.B.F. Lloyd,
Sci. 231 (1971) 64-65.
[74] A. Basu, G. Suresh Kumar, Interacțiunea coloranților azoici toxici cu proteina heme:
perspective biofizice în ceea ce privește aspectul de legare a aditivului alimentar
amarant cu hemoglobina umană, J. Hazard. Mater. 289 (2015) 204-209.
[75] J.N. Miller, Recent advances in molecular luminescence analysis, Proc. Anal. Div.
Chem. Soc. 16 (1979) 203-208.
[76] P. Mandal, T. Ganguly, Caracterizarea spectroscopică de fluorescență a interacțiunii dintre
hemoglobina umană adultă și două izatine, 1-metilisatin și 1-fenilisatin: un studiu
comparativ, J. Phys. Chem. B 113 (2009) 14904-14913.
[77] X. Lu, G. Zou, J. Li, Hemoglobina prinsă în cadrul unui nanocompozit spongios
stratificat pe bază de Co 3O 4care prezintă transfer direct de electroni și activitate
peroxidazică, J. Mater. Chem. 17 (2007) 1427-1432.
[78] T. Kamilya, P. Pal, M. Mahato, G.B. Talapatra, Effect of salt on the formation of alco-
hol-dehydrogenease monolayer: a study by the Langmuir-Blodgett technique, J.
Phys. Chem. B 113 (2009) 5128-5135.
[79] R.W. Woody, Circular dicroism, Methods Enzymol. 246 (1995) 34-71.
[80] R.W. Woody, Theory of Circular Dichroism of Proteins, în Circular Dichroism and the
Conformational Analysis of Biomolecules, Plenum Press, New York, 1996 25-30.
[81] Y.H. Chen, J.T. Yang, H.M. Martinez, Determinarea structurilor secundare ale
proteinelor prin dicroism circular și dispersie rotativă optică, Biochimie 11 (1972)
4120-4131.
[82] Z.X. Lu, T. Cui, Q.L. Shi, Molecular Biology: Applications of Circular Dichroism and
Optical Rotatory Dispersion, 1st ed. Science Press, Beijing, 1987.
[83] M. Nagai, Y. Sugita, Y. Yoneyama, Dicroismul circular al hemoglobinei și al
subunităților sale în regiunea Soret, J. Biol. Chem. 244 (1969) 1651-1653.
[84] L. Bernazzani, C. Ferrari, P. Gianni, V. Mollica, E. Tombari, Calorimetric investigation
on the interaction of sodium taurodeoxycholate with human serum albumin,
Thermochim. Acta 555 (2013) 7-16.
[85] G.I. Makhatadze, P.L. Privalov, Energetics of protein structure, Adv. Protein Chem. 47
(1995) 307-425.
[86] A. Basu, G. Suresh Kumar, Studiu privind interacțiunea aditivului alimentar toxic
carmoizină cu albuminele serice: o investigație microcalorimetrică, J. Hazard.
Mater. 273 (2014) 200-206.
[87] A. Basu, G. Suresh Kumar, Interacțiunea pigmentului alimentar curcumină cu hemo-
globina: energetica complexării, Food Funct. 5 (2014) 1949-1955.
[88] L. Damian, Calorimetria de titrare izotermă pentru studiul interacțiunilor proteină-
ligand, Methods Mol. Biol. 1008 (2013) 103-118.
[89] P.D. Ross, S. Subramanian, Thermodynamics of protein association reactions:
forces contributing to stability, Biochemistry 20 (1981) 3096-3102.
[90] R. Breslow, T. Guo, Surface tension measurements show that chaotropic salting-
in denaturants are not just water-structure breakers, Proc. Natl. acad. Sci. U. S. A.
87 (1990) 167-169.
[91] A. Ganguly, B. Kumar Paul, S. Ghosh, S. Dalapati, N. Guchhait, Interaction of a poten-
tial chloride channel blocker with a model transport protein: a spectroscopic and
molecular docking investigation, Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (2014) 8465-8475.
[92] E.D. Goddard, în: K. Ananthapadmanmanabhan (Ed.), Protein Surfactant
Interactions, CRC Press, Boca Raton, NY, 1993 (cap. 8).
[93] M.N. Jones, Biological Interfaces, Elsevier, Amsterdam, 1975 101 (cap. 5).
[94] circular dichroism study of
haemoglobin- effect of pH and anionic amphiphiles, J. Colloid Interface
Sci. 296 (2006) 324-331.