CURS OPŢIONAL

MODELARE CHIMICĂ ŞI PROIECTAREA MEDICAMENTULUI

INTRODUCERE

In ultimii 10 ani, în cadrul programelor analitice ale facultăţilor de farmacie din ţările
dezvoltate (SUA, Japonia, Elveţia, Anglia etc.) a fost inclus studiul tehnicilor QSAR1 şi CADD2 pentru
prezicerea structurilor moleculare ale medicamentelor care ar putea avea o activitate biologică optimă.

Cunoaşterea acestor tehnici devine necesară având în vedere faptul că marile companii de
medicamente utilizează în mod curent astfel de tehnici care reduc substanţial costul obţinerii şi lansării
pe piaţă a unui nou medicament.

Conform unui studiu recent, metoda tradiţională pentru găsirea unui medicament se bazează
pe efectuarea unui foarte mare număr de sinteze şi teste clinice corespunzătoare, cu scopul optimizării
acţiunii farmaceutice utilizând procedeul de screening3 a rezultatelor. Lansarea unui nou medicament
pe piaţă de către o companie de medicamente ar dura, în acest caz, între 6 şi 10 ani şi ar costa cam 300
milioane $, bani necesari pentru testarea şi sinteza a 10.000 - 20.000 de substanţe chimice.

Cu ajutorul procedeelor de tip CADD şi QSAR acest efort se reduce până la un sfert.

Aceste tehnici au luat avânt în ultimii ani odată cu apariţia pe piaţă a unor programe dedicate
modelării chimice, calculelor cuantomoleculare a proprietăţilor moleculelor şi a unor programe ce
permit corelarea acestor proprietăţi cu activitatea biologică a substanţelor studiate.

Pe de altă parte au fost studiate structurile chimice ale receptorilor biologici (de obicei,
enzime, proteine, polinucleotide). Există, în momentul de faţă, bănci de date privind structura acestor
receptori biologici.

Studiile QSAR şi CADD au fost posibile şi datorită apariţiei pe piaţă a unor calculatoare
performante, cu o mare capacitate de prelucrare a datelor.

1
Quantitative Structure – Activity Relationships
2
Computer Assisted Drug Design
3
Mod de a căuta substanţa activă medicamentoasă prin selectare/sortare şi testare/examinare dintr-un număr mare de
compuşi disponibili

1
 Proiectarea moleculară a medicamentelor este o lume fascinantă, aflată la graniţa dintre
medicină şi chimie.

Ca orice proces multidimensional, care necesită cunoştinţe din mai multe domenii, cercetarea
medicamentului pare un domeniu extrem de dificil de abordat. Chimistul se aventurează cu timiditate
în acest domeniu din cauza “peisajului prea biologic”, medicul intră cu strângere de inimă din cauza
“decorului prea chimic” şi ambii ezită deoarece studiul în această lume necesită cunoştinţe de statistică
matematică, precum şi stăpânirea unor programe de calculator – fără de care cercetarea
medicamentului ar fi de neconceput astăzi.

In acest sens, prezentul curs reprezintă o introducere în vastul domeniu interdisciplinar al

proiectării medicamentului. In primul capitol sunt introduse câteva noţiuni privind interacţia ligand-
receptor; în al doilea capitol este descris pe scurt domeniul QSAR. Capitolul trei este o introducere în
problematica modelării moleculare, cu accent pe aspectele practice ale chimiei computaţionale.
Hidrofobicitatea este, de departe, cea mai importantă forţă în interacţia ligand-receptor. Din acest
motiv, capitolul trei introduce hidrofobicitatea, caracteristică esenţială în transferul transmembranar şi
prin mucoase.

Ligand (medicament). Receptor

Terapia medicală depinde de interacţiile chimice şi de procesele biologice ale organismului
uman. Sistemele din organismul uman comunică cu alte sisteme prin semnale lansate de celule. Aceste
semnale sunt, de fapt, interacţii între substanţe chimice. Exemplele de semnale ale celulelor includ
hormoni, neurotransmiţători şi factori de creştere. Procesele de semnalizare ale celulelor utilizează
enzime şi substraturi.
O enzimă este un catalizator biochimic format din proteine, constituite la rândul lor din
aminoacizi. Aceşti aminoacizi sunt chirali şi, ca urmare, reacţiile în care sunt implicate enzimele
constituite din aminoacizi chirali vor produce compuşi chirali, dacă structura chimică a substratului
implică apariţia de enantiomeri.
Fiecare enzimă (receptor) conţine un situs activ specific de care se poate lega un substrat
specific (ligand, medicament). La acest situs activ apare activitatea biologică.

2
 Receptor şi regiunea situsului activ

Receptorul - este imaginat ca o structură macromoleculară ce poate fi o enzimă, o proteină, o

polinucleotidă şi care este parte integrată într-o structură moleculară complexă, cum ar fi o membrană
celulară (Figura 1.1).
Elementele de recunoaştere a situsurilor active ale receptorului sunt astfel orientate încât
recunoaşterea şi interacţia cu liganzii poate avea loc optim şi să dea un răspuns biologic sau
farmacologic evident.
Ligandul. Prin ligand se înţelege o moleculă endogenă (moleculă naturală, produsă în mod
normal de organism), având un efect biologic prin acţiune specifică asupra unuia sau mai multor
receptori. Moleculele endogene sunt cele ce se găsesc în mod obişnuit în celule. Liganzii endogeni
sunt selectaţi din categoria hormonilor, a mediatorilor chimici, a neurotransmiţătorilor sau a
substraturilor enzimatice. Ei sunt apoi modificaţi chimic pentru a satisface cerinţele biomedicale, în
vederea folosirii lor ca medicamente în terapia umană.
Există două tipuri de liganzi: specifici, cei care leagă doar o anumită specie moleculară
(modelul anticorp/antigen) şi generali, care formează legături cu grupe specifice ale speciei ţintă.
Termenul „ligand” poate fi substituit celui de „medicament”, deoarece moleculele de
medicament acţionează în acelaşi mod (ca ligand) la nivelul unui receptor.
Câteva situsuri active ale receptorului pot să se acomodeze cu substraturi cum ar fi
medicamentele. Medicamentele, prin similitudine moleculară sau mimetism molecular, pot înlocui cu
succes moleculele endogene recunoscute de către receptor. Intre moleculele endogene şi medicamente
intervine o competiţie pentru ocuparea situsurilor active ale receptorului (agonişti, antagonişti). Acest
lucru face ca înmulţirea unei bacterii invadatoare să fie inhibată sau sinteza anumitor molecule să fie
stopată.
Medicamentele sunt clasificate în două grupe:
- medicamente care produc un răspuns fiziologic în organism şi

3
 - medicamente care ucid sau inhibă creşterea substanţelor ce pot cauza infecţii.
Aspirina, hormonii sintetici şi medicamentele active psihologic fac parte din prima grupă de
medicamente, iar antibioticele, de exemplu, sunt medicamente care ucid intruşii străini.
Un medicament este format din două părţi: farmacofor şi spaţiator. Medicamentul
interacţionează cu receptorul utilizând numai o anumită parte din structura lui moleculară, parte ce se
numeşte farmacofor (functon). Un farmacofor poate fi definit ca un aranjament în spaţiu de atomi sau
grupe funcţionale (-OH, -NH2 etc.) necesar să producă un răspuns biologic dat. Un set de molecule
biologic active, care produc activitatea prin acelaşi mecanism, se presupune că au acelaşi farmacofor.
Cu alte cuvinte, farmacoforul reprezintă partea din ligand (medicament) care este recunoscută şi poate,
prin urmare, interacţiona cu receptorul sau cu un situs activ al acestuia.
Spaţiatorul sau distanţorul (spacer) este partea din ligand care ţine farmacoforul la o distanţă
adecvată de o altă parte din ligand. Exemple: radicali fenil, ciclohexil, duble legături etc.

spatiator

Mimetism molecular
De multe ori moleculele create şi destinate să fie medicament sunt concepute să imite
substanţe cunoscute ce interacţionează cu sistemul biologic considerat. Acest proces se numeşte
mimetism molecular. Dintre aceste substanţe naturale din organismele vii, denumite liganzi, fac parte:
hormoni, peptide etc. De exemplu, moleculele peptidomimetice sunt concepute de om să imite
structura unei peptide naturale endogene şi sunt convertite în molecule organice obişnuite. Se face
acest lucru pentru că nu se pot folosi drept medicament molecule peptidice naturale, deoarece ele sunt
biologic instabile şi sunt absorbite foarte puţin şi metabolizate rapid. O moleculă nepeptidică trebuie să
depăşească acest neajuns.

Este de aşteptat ca moleculele sintetice să aibă o diversitate structurală necesară ca să poată fi

optimizate astfel ca ele să prezinte:
- activitate biologică specifică,

4
 - biodisponibilitate orală proprie multor medicamente şi
- proprietăţi farmacocinetice adecvate.
Se poate considera, din multe puncte de vedere, că mimetismul molecular acoperă multe din
aceste cerinţe. Deşi acest procedeu nu este nou, mulţi compuşi sintetizaţi prin analogie cu structuri ale
unor molecule active de referinţă permit prin modelare moleculară să se înţeleagă mult mai bine
proprietăţile biologice.

Similitudine structurală şi tehnici de suprapunere

Vizualizarea 3D a proprietăţilor moleculare (aspecte sterice, potenţiale electrostatice şi
hidrofobicitate) este un pas spre determinarea asemănărilor şi diferenţelor între compuşii activi şi
inactivi.
Prin modelare chimică, utilizând mimetismul molecular, apare procedeul de suprapunere a
structurilor moleculare cu scopul de a scoate în evidenţă asemănările dintre molecule; cu speranţa
evidentă că în aceste asemănări ar consta activitatea biologică asemănătoare.
De exemplu, Horn şi Snyder (1964) au observat că structurile de raze X ale clorpromazinei şi
dopaminei permit o suprapunere într-o anumită regiune a celor două molecule. Clorpromazina şi
dopamina au o activitate evidentă neuroleptică (antipsihotică).
Analize extensive, efectuate în diferite domenii terapeutice, arată că molecule diferite pot
exercita activităţi biologice asemănătoare dacă au trăsături stereochimice comune în 3D. Acest lucru a
dus la modele farmacoforice 3D, care sunt necesare pentru proiectarea raţională de noi compuşi lideri.

5
 Structurile sunt, de obicei, aliniate pe baza poziţiei atomilor lor, dar această aliniere poate fi
subiectivă. De multe ori, tehnicile de suprapunere moleculară se bazează pe intuiţia chimică a
cercetătorului şi pe experienţa lui privind structurile moleculare. Tehnicile de suprapunere moleculară
trebuie privite, însă, cu multă precauţie pentru că pot duce la concluzii greşite.
Dacă în cazul clorpromazinei şi dopaminei s-a reuşit corelarea activităţilor biologice cu
asemănările structurale, în alte cazuri tehnicile de suprapunere nu dau rezultate bune.
De exemplu, în cazul derivaţilor 1, 2 şi 4-fenilimidazol, care sunt inhibitori ai reacţiei de
hidroxilare a camforului cu ajutorul citocromului P450 din unele bacterii,

H
N

N
N
N
1-fenil imidazol 2-fenil imidazol

HN

4-fenil imidazol
O
camfor

dacă se folosesc tehnicile de suprapunere pentru a vedea de ce derivaţii fenilimidazolici acţionează ca

inhibitori în reacţia de hidroxilare a camforului, se vor găsi 2 posibilităţi:
1) să se suprapună fenilii derivaţilor sau
2) să se suprapună inelele imidazolice.

Cele două posibilităţi nu conduc, însă, la nici un rezultat corect. Pentru prima posibilitate
trebuie să se ţină seama de faptul că activitatea inhibitorie a derivaţilor fenilimidazolici este
asemănătoare cu cea a camforului, acţionând competitiv în acelaşi situs activ al citocromului P450.
Fenilimidazolii se comportă ca antagonişti, iar camforul (ce reprezintă molecula endogenă a
citocromului P450) este agonist.
6
 Realitatea, dovedită prin studii de raze X, arată următoarele: camforul se leagă printr-o
legătură de hidrogen cu Tyr (tirozina)-96 (hidrogenul se leagă de camfor, ce este astfel hidroxilat exo)
şi printr-o legătură σ prin care este orientat spre partea hemică a citocromului P450 CAM. Ciclul
hemic este legat de un atom de sulf provenit de la cisteina 357 (Cys 357).
Acţiunea inhibitorie a fenilimidazolilor se dovedeşte a fi diferită pentru fiecare derivat în
parte, astfel că speranţa de a găsi similitudini între comportamentul biologic şi structurile chimice ale
fenilimidazolilor nu a putut fi realizată. In realitate, 2-fenilimidazolul se leagă prin legături de hidrogen
cu o moleculă de apă, care la rândul ei formează legături de hidrogen cu atomul de oxigen din P450
CAM.
1-Fenilimidazolul se leagă în mod diferit prin atomul de azot din ciclul imidazolic cu fierul
din hem.
Aceste exemple sugerează următoarele lucruri:
- condiţiile optime pentru modelarea moleculară directă constau în a avea cunoştinţe
temeinice despre ţinta macromoleculară (receptorul) sau, şi mai bine, despre structura de raze X a
complexului molecular realizat între ligand şi proteină.
- în modelarea indirectă cele mai bune modele pot fi obţinute prin proiectarea unor
experimente care să rezolve contradicţiile observate.
- condiţiile optime într-un proiect se obţin dacă se corelează armonios ipotezele de lucru
cu faptele experimentale.

Mecanismul producerii acţiunii biologice

Noţiunile prezentate sunt esenţiale în teoria interacţiei ligand – receptor sau cheie în lacăt.
Această teorie a fost dezvoltată de Paul Erlich la începutul secolului XX.
Conform principiului cheie–lacăt, ligandul se acomodează în situsul activ al receptorului
biologic aşa după cum se poate vedea schematic în figura de mai jos:

Interacţia dintre ligand şi receptor are loc în două etape de recunoaştere moleculară:

7
 - Prima etapă a recunoaşterii moleculare a farmacoforului de către receptor constă în
acomodarea sterică a ligandului în situsul activ al receptorului. Această acomodare sterică se bazează
pe flexibilitatea structurii moleculare a ligandului sau a unei părţi din aceasta (pe care am denumit-o
farmacofor), prin rotirea unor grupări de atomi în jurul unei legături chimice σ etc.
- Al doilea pas este interacţia electrostatică, dacă ligandul şi receptorul au o distribuţie
adecvată a sarcinilor electrice pe atomi. Recunoaşterea are loc dacă sarcinile electrice pe ligand
(farmacofor) sunt complementare (de semn opus) cu sarcinile electrice ale atomilor din situsul activ al
receptorului. Acest stadiu al recunoaşterii moleculare are loc dacă ligandul şi receptorul sunt situaţi la
mai mult decât 2 raze van der Waals.
Acomodarea ligandului (farmacoforului) la receptor se numeşte docking, în acest proces cei 2
parteneri se orientează astfel încât energia de interacţie între ei să fie cât mai mare. Prin docare se
investighează posibilităţile teoretice de legare ale unui ligand în situsul de legare al receptorului sau ale
unei proteine cu alta sau chiar ale unei proteine cu un acid nucleic, prin calculul energiilor
intermoleculare.
Interacţia dintre receptor şi ligand este, de cele mai multe ori, factorul determinant în
producerea activităţii biologice.
Prin interacţia substanţei bioactive cu receptorul, interacţie care duce la formarea unor
complecşi, se stabilesc, în general, legături variate. Formarea lor este favorizată de faptul că
moleculele multor substanţe bioactive manifestă flexibilitate, dar şi de faptul că molecula receptorului
posedă, într-o oarecare măsură, această proprietate. Legăturile mai des întâlnite sunt de natură
electrostatică (ion-ion), forţe dipol-ion, forţe dipol-dipol, legături de hidrogen şi atracţii reciproce prin
forţe van der Waals. Legăturile covalente apar mult mai rar. In afara legăturilor chimice propriu-zise,
la formarea complecşilor un rol important îl joacă legăturile de hidrogen, deoarece ele se
caracterizează printr-o specificitate avansată, o labilitate cinetică şi o energie de legătură mică,
parametri care le fac apte pentru formarea acestora. Atracţiile prin forţe van der Waals, deşi
manifestate pe distanţe mici, prezintă o importanţă semnificativă.
Conform teoriei receptorului, o interacţiune substanţă bioactivă – receptor depinde de
afinitatea chimică între moleculelor substanţei şi receptorului, precum şi de o aranjare cât mai
favorabilă - întocmai ca şi cheia pentru lacăt (broască) (Emil Fischer) (Figura). Potrivirea constă atât
în mărimea, forma moleculei, natura şi poziţia grupelor reactive în molecula substanţei, cât şi în
capacitatea ei de reacţie, la structura şi reactivitatea receptorului.

8
 Principiul cheie – lacăt

Astfel, în cercetarea medicamentelor, o parte a receptorului este considerată drept broasca în

care trebuie să se potrivească substanţa activă (cheia) încât să poată deschide/activa sau
închide/dezactiva broasca. Un exemplu sugestiv este prezentat în Figura: legarea vitaminei A
(retinolului) de un receptor specific. „Broasca” este, de fapt, denumită situs de legare şi este în acest
caz o cavitate cu caracter hidrofob din interiorul macromoleculei, fiind formată din catenele laterale şi
lanţurile peptidice ale unor aminoacizi cu importanţă deosebită pentru legarea retinolului. In cazul de
faţă, situsul de legare este format din mai multe fenilalanine, o tirozină şi o metionină, care
interacţionează cu retinolul, acesta având complementaritate sterică şi electrostatică cu situsul de
legare. Numai grupa hidroxil este exterioară buzunarului de legare, fiind expusă mediului apos care
înconjoară proteina. Teoria cheii în broască (lock and key theory) a lui Fischer continuă să aibă un
impact enorm asupra chimiei medicinale.

9
 H3C

H3C

H3C CH3
CH 3

OH

Structura retinolului în situsul de legare

(indicată printr-o săgeată)

Gradul de interacţiune substanţă medicamentoasă (bioactivă) – receptor este determinat de

concentraţia substanţei în compartimentul „ţintă“ şi de afinitatea moleculelor celor doi parteneri. In
afara afinităţii, substanţa trebuie să producă schimbări în conformaţia sau distribuţia de sarcini a
receptorului, schimbări necesare formării unui anumit stimul. Toate aceste schimbări pot fi cauzate de
activitatea intrinsecă.
Mecanismul producerii acţiunii biologice de către o substanţă denumită ligand (L) implică,
deci, combinarea moleculelor acestei substanţe cu receptorul (R), intensitatea acţiunii biologice fiind
exprimată, de obicei, prin logaritmul inversului concentraţiei molare (C), concentraţie la care se
produce un răspuns biologic specificat:
A = log (1/C) = - log C
De remarcat că, în multe situaţii, se utilizează concentraţia C50 (doza toxică), adică acea
concentraţie molară care produce 50% din activitatea biologică maximă. Activitatea biologică, A, este
proporţională cu afinitatea moleculei ligandului L pentru receptor (R), receptor care stă la baza acţiunii
biologice specificate.
In afara acestui mecanism specific de acţiune există şi un mecanism nespecific, caracteristic
anestezicelor, acţiunii toxice a alcoolilor, cetonelor, aldehidelor sau detergenţilor. Doza toxică pentru
aceste substanţe, C50, corespunde, de obicei, unei concentraţii de peste 10-3 M (calculată pentru un
volum total de aproximativ 50 l, ce corespunde soluţiilor apoase din organismul uman). Aceste
substanţe au, de regulă, un coeficient de partiţie octanol/apă destul de mare. In cazul anestezicelor
generale, este inhibată capacitatea de excitare şi transmitere a influxului nervos în membranele
excitabile prin legarea puţin specifică de proteinele implicate în funcţionarea unor sinapse. Pentru o
clasă mare de anestezice, activitatea biologică A corelează bine coeficientul de partiţie octanol/apă, P,
cu o variabilă indicator pentru prezenţa unui atom de hidrogen polar (specific punţii de hidrogen).

10
 Antagonism competitiv şi necompetitiv
In cazul mecanismului specific, mecanism ce implică receptorii, al acţiunii xenobioticelor
(substanţe străine organismului, care în majoritate pătrund în organism prin tubul digestiv datorită
proprietăţilor hidrofobe), liganzii pot fi clasaţi ca agonişti şi respectiv antagonişti ai diferiţilor
receptori. Agonistul este substanţa chimică care, prin stimularea receptorului, produce un efect
fiziologic maximal de acelaşi tip cu ligandul endogen al receptorului.
La rândul său, antagonistul este o substanţă chimică care, prin legarea la receptor, opreşte
acţiunea agonistului (Schema). Antagoniştii pot fi, deci, caracterizaţi experimental numai în prezenţa
agoniştilor. Ecuaţiile de mai jos sunt valabile pentru o cinetică simplă, în care se aplică stoechiometria
de 1:1, iar antagonistul este competitiv de asemenea cu stoechiometrie 1:1 (ceea ce nu este întotdeauna
valabil).

k1 Ago - R
Agonist + Receptor EFECT
k-1 complex

Antagonist+ Receptor Antag - R

complex

Definiţia agonismului, respectiv a antagonismului.

Ligandul este, în acest caz, agonistul, iar formarea complexului
ligand – receptor este urmată de un efect fiziologic
După cum au dovedit lucrările lui U'Pritchard, antagoniştii şi agoniştii unui receptor se leagă,
de regulă, de situsuri diferite ale receptorului. In cazul mediatorului chimic natural şi al agoniştilor,
combinarea acestora cu receptorul îl aduce pe acesta din urmă din conformaţia de cea mai joasă
energie, inactivă biologic, în conformaţia biologic-activă (complex activat, C#). Legarea mediatorului
natural sau a antagoniştilor produce adesea dimerizarea sau oligomerizarea proteinei-receptor, forma
biologic-activă fiind proteina dimerizată. Legarea antagonistului de receptor în conformaţia de cea mai
joasă energie împiedică aducerea receptorului în forma biologic-activă şi poate avea loc în acelaşi situs
cu agoniştii (inhibiţie competitivă) sau la situsuri diferite (inhibiţie necompetitivă).
Antagonismul este, deci, un proces de inhibare sau împiedicare a răspunsului produs de
interacţia agonist – receptor. Antagonismul poate fi: competitiv sau necompetitiv.
Antagonismul competitiv este bazat pe principiul că un antagonist sau un agonist poate să se
lege de acelaşi situs activ pe receptor, iar dacă agonistul şi antagonistul sunt prezenţi concomitent, ei
intră în competiţie pentru ocuparea situsurilor pe receptor.

11
 Acest lucru este sugestiv ilustrat în figura următoare, unde conform principiului cheie – lacăt,
antagoniştii şi agoniştii pot intra în competiţie pentru ocuparea situsurilor active ale receptorului
biologic:

Interacţia ligand-receptor

Antagonismul competitiv reversibil apare fie dacă legarea antagonistului poate fi eliminată
prin creşterea concentraţiei de agonist sau dacă antagonistul se disociază sau este distrus prin
metabolizare.
Abilitatea antagonistului de a influenţa ocuparea receptorului de către un agonist este
determinată de afinitatea relativă a antagonistului faţă de receptor şi de concentraţia relativă de
antagonist.
Antagonismul poate fi privit sub forma a 2 echilibre independente ce apar pentru antagonist
(B) şi agonist (A), în interacţia lor cu receptorul (R).
A + R A–R
B + R B–R
Din cinetica acestor 2 echilibre, Gaddum a obţinut o relaţie care prezice efectele
antagoniştilor asupra funcţiei de receptori ocupaţi de agonişti:
A  R  [ A' ]
,
[ R ]T  [ B] 
[ A' ]  K A 1  
 K B 

în care: [R] T – reprezintă populaţia totală de receptori;

[A’] – concentraţia de agonist în prezenţa antagonistului;
[A] – concentraţia de agonist;
[B] – concentraţia necesară de antagonist;

12
 KA, KB – constante de disociere pentru reacţiile în care sunt implicaţi agonistul A şi
antagonistul B.

Efectele antagonistului B competitiv asupra răspunsului indus de A sunt studiate prin

determinarea relativă Doză – Răspuns pentru A în absenţa sau prezenţa concentraţiei crescânde de B.
Acest sistem presupune că răspunsul depinde numai de ocuparea agonistă şi, prin urmare, ocupările
agoniste în absenţa sau prezenţa antagoniştilor ar da acelaşi răspuns. Creşterea multiplă în concentraţia
de agonist necesită obţinerea unui răspuns numit Raportul Dozei (Dose Ratio), aşa după cum se poate
vedea în figura de mai jos, în care am reprezentat grafic răspunsul dat de interacţia receptorului cu A şi
B pentru diferite concentraţii de B. Se obţin în acest fel următoarele curbe (Figura):

[B] = 0 [B1] [B2]

Raspuns

(% din
raspunsul
maxim)

[A], mol/l

Efectele a două concentraţii de antagonist asupra răspunsului agonistului

Schild a simplificat foarte mult expresia lui Gaddum:

[ A' ] [ B]
  1.
[ A] K B
Această formulare permite ipoteza că relaţia dintre ocuparea parţială şi răspunsul dat în urma
interacţiei cu receptorul R este descrisă de constanta KB.
In antagonismul necompetitiv, agonistul şi antagonistul ocupă fiecare situsuri diferite ale
receptorului biologic. Se presupune că legarea antagonistului la situs perturbă activarea receptorului de
către agonist. Antagonismul necompetitiv elimină în acest fel capacitatea sistemului de a răspunde,
făcând ca agonistul să nu răspundă maxim.

Activitatea biologică şi afinitatea ligand (L) – receptor (R)

Cel mai raţional mod de acţiune al substanţelor bioactive presupune că activitatea biologică
produsă de un ligand (L) este proporţională cu gradul de complexare al receptorului R de către

13
molecula L. In această situaţie, considerând o activitate biologică de  % (faţă de maximul admis de
100%) produsă de o concentraţie [L] de efector (ligand) şi aplicând legile echilibrului chimic, sunt
valabile următoarele relaţii:

L  R  [ L  R]

[R]  [L]  ΔG
 K D  e RT
[L - R]

α [L-R] [L]
 
100 [L-R]  [R] [L]  K

Incadrarea în paranteze pătrate notează concentraţiile molare ale ligandului L, receptorului R

sau complexului activat, [L-R]. KD reprezintă constanta de disociere a complexului, iar ΔG - variaţia
entalpiei libere Gibbs.
In cazul în care [L] = C50, rezultă că  = 50% şi, evident, K = C50. Prin logaritmare:
ΔG
A  log C 50  log K 
D 2,3RT

ΔG  2,3RT  A
se obţine relaţia între afinitatea ΔG a receptorului pentru ligandul L şi activitatea biologică A a
ligandului.
Uneori se folosesc activităţile biologice relative,  , pentru o anumită concentraţie C – aceeaşi
pentru toate moleculele L. In acest caz, prin rearanjarea ultimelor relaţii se obţine expresia:
α
A  log K  log C  log
D 100  α ,
care poate fi folosită pentru evaluarea activităţii A. O problemă delicată apare atunci când  = 0% sau
 = 100%. Se recomandă, pentru aceste cazuri, să se înlocuiască 0% sau 100% prin  min şi, respectiv,
 max . In acest caz,  min reprezintă cea mai mică activitate măsurată pentru seria în cauză, iar  max =
100 -  min .

14
 Teorii privind interacţia ligand – receptor
Din perspectivă farmacologică, acţiunea unui medicament (ligand) se poate simplifica astfel:
L + R → [L - R] → Răspuns biologic,
L – ligand, medicament
R – receptor
[L - R] – complex activat
Ideal, se doreşte înţelegerea şi apoi prezicerea tuturor proprietăţilor şi, mai ales, a modului în
care un medicament poate cauza un răspuns în orice ţesut. Din nefericire sunt mulţi factori ce fac acest
scop greu de realizat, ba chiar imposibil. De exemplu, evenimente ce afectează accesul
medicamentului la receptor (difuzie limitată la scară macro sau microscopică, metabolismul etc.) pot
da rezultate experimentale ce se abat de la teoria enunţată schematic mai sus.
Nu există, deci, o corespondenţă biunivocă între producerea de stimuli şi răspunsul măsurat
experimental. Răspunsul cauzat de receptorul activat prin legarea medicamentului poate implica o
varietate de mecanisme diferite (Figura). Unii receptori efectuează direct răspunsul dorit (de exemplu,
receptorul ionotropic – Figura - A). In aceste cazuri, factorii precum modulatorii alosterici sau
cofactorii pot influenţa răspunsul observat. In alte cazuri, precum tirosinkinaza (Figura - B), receptorii
pot fi ei însuşi modificaţi (de exemplu fosforilaţi) în procesul de catalizare a reacţiei (în acest caz, de
fosforilare). In cazul proteinei G cuplată pe receptor (Figura - C), receptorul poate provoca în cascadă
evenimente biochimice cauzate de acţiunea mai multor efectori, uneori putând fi de asemenea
fosforilat.

Răspunsul unui receptor activat poate implica o varietate

de mecanisme:
A. Receptorul ionotropic (receptorii generează direct răspunsul dorit);
B. Cazul tirozinkinazei – receptorul este modificat în procesul de catalizare a unei reacţii;
C. Cazul unei proteine G cuplate cu un receptor – receptorul poate intra într-o serie de reacţii chimice în
cascadă datorită acţiunii mai multor efectori.

15
 S-a notat cu R – receptorul; P – produşii de fosforilare a receptorului; Y – componenta
specifică a receptorului secundar ce conduce la fosforilare; E – efectorul rezultat; α, β, γ - receptorii
specifici rezultaţi; E1, E2 – enzimele efectori; ATP – adenozintrifosfatul

Teoriile privind interacţia medicament (ligand) – receptor sunt:

1) Teoria ocupării – se bazează pe ideea că răspunsul produs de un receptor apare
numai dacă acesta interacţionează cu un ligand adecvat.
2) Teoria vitezei de interacţie ligand–receptor - se bazează pe faptul că răspunsul
produs de un receptor este direct proporţional cu viteza cinetică a legării sau a dezlegării
ligandului de receptor.
3) Modelul operaţional este o aproximaţie semiempirică a teoriei ocupării ce
încorporează un factor privind complexul format între ligandul agonist – receptor şi răspunsul
produs.
Toate aceste teorii sunt interesante, dar nu acoperă 100% faptele experimentale. Dintre ele,
foarte utilă este teoria vitezei de interacţie ligand – receptor şi este considerată astăzi utilă chiar şi în
descrierea cantitativă a celorlalte teorii.

Legea acţiunii maselor

In cazul interacţiei ligand (medicament) (L) – receptor (R), cu o populaţie omogenă de
receptori, această interacţie poate fi exprimată astfel:
k on
L + R [L – R]
k off

unde kon semnifică constanta vitezei pentru reacţia “de asociere”, iar koff pentru reacţia “de
disociere”.
Legarea apare dacă L şi R se ciocnesc datorită difuziei într-o orientare corectă a acestora şi cu
energie suficientă (energia de activare).
Viteza de asociere (numărul de evenimente de legare pe unitatea de timp) este exprimată,
conform teoriei cineticii chimice, prin relaţia:
viteza de asociere = kon [L][R].
Odată legătura apărută, L şi R rămân împreună un anumit timp (complex activat). Viteza de
disociere (numărul de evenimente de disociere pe unitatea de timp) este exprimată astfel:
viteza de disociere = koff [L - R].

16
 Probabilitatea de disociere este aceeaşi în orice moment, deoarece receptorul biologic R “nu
ştie” pe cât timp a fost legat de ligand, iar după disociere L şi R sunt aceiaşi ca înainte de legare. Dacă
L şi R sunt modificaţi nu se mai aplică legea acţiunii maselor. Echilibrul este atins dacă:
kon [L][R] = koff [L - R],
iar constanta de disociere

KD 
k off

LR .
k on L  R
In mod curent se utilizează, de asemenea, expresia
1/KD = KA ,
unde KA se numeşte constantă de asociere.
Un termen foarte util în descrierea cantităţii farmacologice a interacţiei ligand – receptor îl
reprezintă factorul de ocupare parţială FO (Fractional Occupancy).

FO 
L  R  L  R
RT R  L  R
Din relaţia stabilită anterior pentru KD obţinem
K D L  R 
[ R]  ,
L
iar din
[R]T = [R] + [L – R]
obţinem
K D L  R
R   L  R,
T
L
de unde:
RT 
KD K  [ L]
1  D
L  R L [ L]
sau
[ L  R] [ L]
FO   .
[ R]T K D  [ L]
Ultima expresie obţinută reprezintă matematic o hiperbolă rectangulară.
 ax 
 y  hiperbola , n  1, 
 b x
n m

hiperbola rectangula ra Hill  Langmuir 
Pentru [L] = KD (constanta de disociere KD are dimensiunea unei concentraţii), din ultima
relaţie se vede că, procentual, FO = 50%.

17
 Egalitatea [L] = KD, pentru care FO = 50%, este valabil numai dacă [R] = [L-R], adică toată
„concentraţia de receptor” este implicată şi se regăseşte în concentraţia de complex activat [L-R].
Deşi legea acţiunii maselor este un model simplu, el poate fi utilizat să explice datele
experimentale. De notat că acest model nu este util în toate situaţiile, deoarece:
- modelul presupune că toţi receptorii sunt în model egal accesibili liganzilor;
- modelul ignoră stările de legare parţială. Conform modelului, receptorii sunt fie liberi,
fie legaţi.
- modelul presupune că ligandul nu este alterat de legare;
- modelul presupune că legarea este reversibilă.

METODA QSAR
Definirea domeniului QSAR
Pentru a putea parametriza interacţia substanţelor medicamentoase cu receptorii biologici ai
organismului, trebuie luate în considerare toate etapele prin care substanţa medicamentoasă pătrunde în
organism, anume: eliberarea din matricea farmaceutică, absorbţia, distribuţia, metabolizarea, interacţia
cu receptorul şi, în final, eliminarea. Este evident deci că, o singură etapă, oricât de importantă ar fi ea,
nu poate caracteriza întreaga evoluţie a substanţei medicamentoase în organism. Cercetările mai noi
arată că nici interacţia substanţă medicamentoasă – receptor nu este de cele mai multe ori “specifică”,
adică nu este de natură pur chimică. Acest proces poate fi fizic sau fizico-chimic. Din acest motiv, o
adevărată relaţie cantitativă structură – activitate biologică trebuie să cuprindă mai mulţi parametri,
care să reflecte calea urmată de substanţa medicamentoasă de la locul administrării până la receptor,
cât şi interacţia substanţei medicamentoase cu centrii activi. Toate acestea fac dificilă teoretizarea unei
astfel de interacţii, deosebit de complexă şi ca durată şi ca ramificaţii. Există, din această cauză, foarte
mulţi parametri de care ar trebui să se ţină cont într-un astfel de studiu, util în prospectarea unor serii
de medicamente pentru sintetizarea unui optim farmaceutic. Aceşti parametri fizico-chimici,
dependenţi de structura electronică a moleculei, reflectă interacţia „specifică” substanţă
medicamentoasă – receptor. Tocmai această complexitate a determinat apariţia unor noi metode de
abordare, dintre care cea mai eficientă este QSAR.
Domeniul QSAR poate fi sintetic definit astfel: „Plecând de la un set de molecule date, Li, i =
1, 2, …, N, pentru care se cunoaşte un anume tip de activitate biologică, Ai (de exemplu, o acţiune
bactericidă specifică), se va căuta o relaţie între această activitate şi anumite proprietăţi structurale ale
moleculelor considerate“.

18
 Se presupune că activitatea biologică studiată se măsoară în aceleaşi condiţii (temperatură,
solvent etc.) pentru toţi compuşii Li şi că măsurătorile au aceeaşi acurateţe şi precizie.
Practic, se urmăreşte obţinerea unei ecuaţii (de preferinţă liniară) între intensitatea activităţii
biologice, Ai, a fiecărei molecule i şi măsurile cantitative ale proprietăţilor structurale qij, j = 1, 2, …,
M, evidenţiate pentru întregul set de molecule.
Coeficienţii regresionali ai liniarizării (aj) conferă gradul de influenţare a activităţii de către
respectivele proprietăţi măsurate:
Âi = a0 + a1 ∙ qi,1 + a2 ∙ qi,2 + a3 ∙ qi,3 + …
Relaţia de acest tip poate fi utilizată pentru predicţii în sinteze de noi molecule cu activitate
biologică dorită şi, totodată, poate să dea anumite sugestii privind mecanismul acţiunii biologice.
Coeficienţii regresionali aj exprimă importanţa relativă a parametrilor qij. Aceşti coeficienţi şi
termenul liber, a0, se obţin prin tehnica regresiei liniare multiple MLR, şi anume, se caută minimul
sumei S a pătratelor diferenţelor între activitatea experimentală Ai şi cea calculată Âi, în raport cu
coeficienţii regresionali.
N ^
S   (A  A ) 2 ,
i i
i 1

Cu alte cuvinte, o condiţie necesară pentru ca S să fie minimă constă în satisfacerea

următoarelor egalităţi:
 S
 a  0
 0
 S
 0
 a 1
.....

 S
 a  0
 M
Calitatea corelaţiei obţinute se măsoară prin coeficientul de corelare, R2. Valoarea acestui
coeficient oferă o primă indicaţie asupra calităţii ecuaţiilor regresionale prezentate mai sus. Domeniul
valorilor lui R este 0 ≤ R2 ≤ 1: R2 = 0 corespunde absenţei oricărei corelări între Âi şi parametrii qij, pe
când R2 = 1 indică o corelare liniară perfectă. Trebuie subliniat faptul că un coeficient de corelare R 2 =
0 nu implică în mod necesar independenţa variabilelor; el poate indica doar faptul că variabilele
respective sunt necorelate.
Orice model QSAR corect trebuie să prezinte anumite proprietăţi:
- Robusteţe – caracteristici statistice bune;
- Putere de predicţie bună, acesta fiind şi unul din scopurile oricărui studiu QSAR;

19
 - Putere de explicare – dacă în fazele preliminare ale studiului acest aspect eventual se
poate neglija, mai târziu pentru proiectarea unor noi compuşi activi, el devine crucial în înţelegerea
mecanismului de acţiune cu situsul de legare a liganzilor individuali;
- Relevanţă – descriptorii utilizaţi trebuie să fie interpretabili pentru a obţine informaţii
despre comportarea la nivel molecular a liganzilor, având în vedere faptul că proiectarea unui nou
medicament se produce la nivel molecular;
- Simplitate – descriptorii simpli sunt mai uşor de interpretat şi de tradus în informaţii
pertinente la nivel molecular.

Scurt istoric
Primele idei ce stau la baza QSAR - ului se conturau la sfârşitul secolului al XVIII-lea, odată
cu observaţiile lui Richet, Meyer şi Overton asupra relaţiei între solubilitate apă/lipide şi toxicitate sau
narcoză, apoi, în strânsă legătură cu acestea, teoria lui Emil Fischer, care subliniază importanţa
configuraţiei sterice a substratului medicamentos în reacţiile enzimatice. Studiile de chimioterapie
antibacteriană ale lui Ehrlich, de la începutul secolului al XIX-lea, l-au condus la formularea
conceptului de receptor.
Cercetările din acest domeniu au fost inspirate de studiul relaţiilor structură – reactivitate din
chimia organică (studii de natură calitativă până în anii '30 ai secolului trecut), de studiile lui Hammett
asupra influenţei capacităţii donoare sau acceptoare de electroni a unor substituenţi, asupra vitezei
relative de reacţie a compusului substituit comparativ cu cea a compusului nesubstituit.
Anul de naştere propriu-zisă a QSAR-ului poate fi considerat 1964, prin apariţia lucrării lui
Hansch şi Fujita privind relaţia dintre proprietăţile fizico – chimice şi activitatea biologică a
medicamentelor, dar şi cu lucrarea lui Free şi Wilson privind modelul aditiv al contribuţiilor de grup la
activitatea biologică. Prima şcoală care a activat în acest domeniu a fost cea creată de Corwin Hansch.
In prezent, domeniul QSAR este puternic dezvoltat pe mai multe linii de cercetare, beneficiază din plin
de progresele din tehnica de calcul, utilizează tehnici bazate pe chimia cuantică, mecanică şi modelare
moleculară. In ţara noastră, cercetările în domeniul QSAR au apărut la începutul anilor ’70, la
Institutul de Cercetări Chimico-Farmaceutice Bucureşti (C. Simionovici), la Facultatea de Farmacie
din Cluj-Napoca (I. Simiti şi I. Schwartz), precum şi în cadrul unui grup din Centrul Universitar
Timişoara, care a adus contribuţii importante la includerea stereochimiei moleculare în QSAR, prin
dezvoltarea metodelor MSD şi MTD elaborate de Prof. Dr. Z. Simon şi grupul QSAR din Timişoara.
Beneficiile s-au manifestat, în special, în două domenii:
a. Elucidare, la nivel molecular, a mecanismului de interacţiune între medicament şi
receptor, ceea ce a permis raţionalizarea unor rezultate experimentale anterior greu explicabile;

20
 b. Predicţia activităţii biologice în baza modelelor QSAR pentru compuşi nesintetizaţi
încă, ceea ce a deschis drumul proiectării „raţionale” de liganzi, orientând sinteza chimică spre
optimizarea liganzilor endogeni în drumul lor spre stadiul de medicament.
Predictivitatea sau puterea de predicţie a unui model este cu atât mai mare, cu cât poate
calcula mai exact valoarea unei proprietăţi ţintă (de exemplu, activitatea biologică) pentru molecule
care nu au fost prezente în deducerea matematică a modelului.

QSAR ca metodă - unealtă în cercetarea medicamentului

Tehnica QSAR, atât cea clasică cât şi procedeele moderne – care apelează la o multitudine de
descriptori – şi-au câştigat un loc bine stabilit în proiectarea de medicamente şi substanţe biologic
active cu ajutorul calculatorului (CADD). Aplicarea lor corectă necesită şi o bună cunoaşterea a
limitelor acestor tehnici. Din acest punct de vedere, se pot indica câteva dificultăţi în aplicarea QSAR-
ului:
- mecanismul interacţiei ligand - receptor este complicat, fiind dependent de o multitudine de
caracteristici structurale ale moleculelor studiate.
- în cadrul mecanismului complex al acţiunii biologice pentru o serie de molecule studiate,
etapa determinantă poate să nu fie aceeaşi pentru toate moleculele;
- informaţia adusă de datele experimentale, activităţi şi structuri moleculare, pentru câteva
zeci de molecule este, în general, insuficientă pentru caracterizarea structurii situsului activ al
receptorului.
In ceea ce priveşte primul tip de dificultăţi, experienţa QSAR arată că activitatea biologică
este dependentă de un număr redus de parametri structurali. Totuşi, este destul de greu de indicat
domeniul de variaţie al structurii moleculare în care un anumit QSAR este valabil. Primul tip de
dificultăţi poate fi înlăturat printr-un studiu mai atent al mecanismului acţiunii biologice sau prin
determinarea directă a afinităţii ligand - receptor. Prezicerea afinităţii unui anumit receptor pentru orice
ligand se loveşte de al treilea tip de dificultăţi. Orice QSAR, bun pentru seria de molecule studiată,
prezintă o informaţie lacunară despre situsul receptorului. Această informaţie poate fi, eventual,
completată prin comparare cu situsuri active ale receptorilor pentru care există studii cristalografice de
raze X sau prin considerente generale privind structura proteinelor receptorului.
Astăzi tehnica QSAR a luat o importantă amploare, cu rezultate impresionante în proiectarea
de noi medicamente, beneficiind de progresele chimiei cuantice şi modelării moleculare, puse în
valoare de avântul impresionant al tehnicii de calcul.
Cercetarea fundamentală a medicamentelor se desfăşoară, în prezent, la două nivele, adesea
întrepătrunse: academic şi industrial. Forţa motrice în cercetarea medicamentului este obţinerea de noi

21
agenţi farmacologici, cu ajutorul cărora se caracterizează, la nivel molecular, aspecte fundamentale de
fiziologie şi farmacologie. Acest proces conduce, în final, la obţinerea de noi medicamente.
In ultimul deceniu s-au dezvoltat tehnici de tip QSAR sau QSPR4, care se bazează pe relaţii
matematice de regresie liniară ce leagă cantitativ structura chimică şi activitatea biologică sau
proprietăţile fizice şi chimice pentru o serie de compuşi. In felul acesta se reduce numărul de sinteze şi
teste de la 10.000 - 20.000 de substanţe la 300 - 500 substanţe chimice şi, implicit, se reduce şi costul
obţinerii unui nou medicament.
Tehnicile de tip QSAR pot fi utilizate ca un ghid pentru sinteza chimică şi fac parte din ceea
ce se numeşte procedeul CADD, pe româneşte proiectul medicamentului.
Proiectul medicamentului reprezintă un proces care începe în momentul în care se identifică
un compus chimic cu proprietăţi farmaceutice deosebite şi se termină atunci când activitatea biologică
şi sinteza chimică a noului compus sunt optimizate.
Relaţiile care există sau pot exista între structura chimică şi activitatea biologică a unei
substanţe au atras atenţia cercetătorilor din domeniul medicamentului de multă vreme, pornind de la
ipoteza că „orice asemănare de structură implică şi o activitate asemănătoare”.
In ultimii ani s-au conturat două concepţii de bază privind relaţia cantitativă dintre structura
chimică şi activitatea biologică, amândouă necesitând calculatoare electronice. Conform primei
concepţii, care îşi are originea în lucrările lui Bruice, Kharasch şi Winzler şi care a fost generalizată de
Free şi Wilson, corelarea se abordează cu ajutorul unui model matematic, care se bazează pe ideea unei
contribuţii independente şi aditive a substituenţilor grefaţi pe un schelet molecular ce se menţine
constant de-a lungul întregii serii.
Această idee de bază a fost aplicată şi aprofundată de Purcell şi colaboratori şi respectiv de
japonezii T. Fujita şi T. Ban. A doua metodă corelează activitatea biologică cu parametrii fizico-
chimici definiţi termodinamic, deci în cadrul unor relaţii liniare de energie liberă de tipul ecuaţiilor
Hammett şi Taft. Acest model a fost elaborat de Hansch şi colaboratorii săi pe baza unor lucrări de
tatonare în domeniul reglatorilor creşterii plantelor şi a fost denumit extratermodinamic – deoarece,
deşi parametrii folosiţi sunt definiţi termodinamic, ei nu sunt legaţi direct termodinamic de sistemul
biologic. Aceste ipoteze stau la baza QSAR-ului actual.

Ecuaţia Hansch
Metodele moderne utilizate în scopul „proiectării” unor structuri moleculare cu activitate
biologică specificată se bazează pe cuantificarea bioactivităţii ca o funcţie de structura moleculară.

4
Quantitative Structure Property Relationships

22
Meyer şi Overton au demonstrat cu succes, pentru prima dată, o dependenţă a bioactivităţii de un
parametru fizico-chimic, coeficientul de partiţie, care este o funcţie de structura moleculară. Dar, fără
nici o îndoială, pasul hotărâtor pentru dezvoltarea şi progresul acestui domeniu se datorează lui Hansch
şi Fujita, care au modelat cu succes bioactivitatea pe baza efectelor electronice, hidrofobice şi sterice.
Hansch, plecând de la lucrările lui Collander, presupune folosirea coeficienţilor de partiţie
dintre lichide organice şi apă (notaţi prin P) drept proces - model pentru modul în care substanţa
medicamentoasă interacţionează hidrofob cu biomembranele şi cu macromoleculele. Rezultatele lui
Collander indicau o relaţie liniară între mişcarea moleculelor organice prin ţesuturi şi coeficienţii lor
de partiţie. Postulatul extratermodinamic al lui Hansch se poate explicita printr-o ecuaţie liniară în
modul următor:
log P  a  log P b,
bio sol.R
unde Pbio este coeficientul de partiţie al substanţei medicamentoase între faza apoasă (în care
este aplicat medicamentul) şi biofaza critică (în care se produce răspunsul biologic standard observat);
Psol.R este coeficientul de partiţie determinat experimental într-un solvent de referinţă.
Literatura prezintă multe cazuri în care, după o creştere paralelă a activităţii biologice cu cea a
coeficientului de partiţie, urmează o scădere a activităţii cu creşterea pe mai departe a caracterului
lipofil. Explicaţia ar fi următoarea: dacă se consideră un membru al unei serii de substanţe
asemănătoare care are coeficientul de partiţie (octanol/apă) foarte apropiat de zero, această substanţă
este atât de solubilă în apă încât nu poate traversa o membrană lipofilă. Dimpotrivă, acei membri ai
seriei care vor avea coeficientul de partiţie foarte mare (spre ∞) nu vor putea trece de o barieră apoasă.
Aceasta înseamnă că, între valorile limită ale coeficientului de partiţie P = 0 şi P = ∞, va exista un
coeficient de partiţie ideal, P0. Moleculele având această valoare vor fi cele mai puţin împiedicate în
deplasarea lor printr-o multitudine de faze lipidice şi apoase.

Modelul biliniar Kubinyi

Succesul obţinut de Hansch prin aplicarea relaţiilor de energie liberă proceselor biologice a
condus la reexaminarea bazelor fizice ale ecuaţiei Hansch şi la dezvoltarea unor noi modele.
Principala neconcordanţă dintre modelul parabolic (ecuaţia

) şi modelul liniar (ecuaţia ) se referă la

faptul că cel puţin una din porţiunile parabolei ar trebui să fie strict liniară pe când în cazul modelului
parabolic ambele porţiuni ale relaţiei structură chimică – bioactivitate sunt mai mult sau mai puţin
curbate.

23
 Modelul lui Kubinyi utilizează un sistem ipotetic, deosebit de simplu constând din faze
apoase şi lipidice (membrane) dispuse alternativ şi având volume egale, în cadrul căruia este estimată
probabilitatea unei molecule bioactive de a străbate un număr dat de astfel de bariere. In modelul său,
Kubinyi ia în considerare patru faze relevante pentru a modela o celulă bacteriană simplă sau o celulă
izolată a unui ţesut: o fază apoasă exterioară A1, o fază lipidică L1 (membrana biologică), o fază
apoasă interioară A2 şi receptorul R (fază lipidică) (Figura):

Modelul biliniar Kubinyi.

Modelul lui Kubinyi poate fi reprezentat prin ecuaţia următoare:

,
care descrie modelul biliniar. Parametrul β reprezintă raportul volumelor fazei lipidice şi apoase, Vl /
Va. Parametri a, b, c şi β prezenţi în această ecuaţie se pot determina experimental prin analiza
regresională neliniară.
Trebuie subliniat faptul că modelul biliniar nu este altceva decât o tentativă de simulare a unui
proces complex printr-o abordare simplificatoare. De obicei, în cadrul interacţiunilor biologice intervin
şi alţi factori care trebuie luaţi în considerare. In general, se consideră că dacă sunt disponibile mai
puţine date experimentale iar valorile log P variază într-un domeniu restrâns, modelul probabilistic
este mult superior celui biliniar. In caz contrar este preferabil să fie utilizat modelul biliniar care, în
plus, este condiţionat şi de o acurateţe mai mare a valorilor biologice măsurate.

Validarea ecuaţiilor QSAR şi valoarea lor predictivă

Inainte de utilizare în sens predictiv sau explicativ, ecuaţiile regresionale de tip Hansch
trebuie validate statistic, adică trebuie verificată calitatea statistică a modelului multiliniar care oferă
ecuaţia Hansch. Acurateţea modelului ales se caracterizează prin coeficientul de corelare (R2),
abaterea standard (s), statistica Fisher (F) şi statistica t-Student.
Valoarea coeficientului de corelare R2 oferă prima indicaţie asupra calităţii ecuaţiilor
regresionale Âi = a0 + a1 ∙ qi,1 + a2 ∙ qi,2 + a3 ∙ qi,3 + … . Dar, ca orice mărime statistică, acest coeficient

24
este supus fluctuaţiilor de selecţie; cu alte cuvinte, dacă numărul observaţiilor este mic atunci valorilor
mici sau chiar suficient de mari ale lui R2 nu li se poate acorda o semnificaţie sigură deoarece ele nu
indică o corelare reală în populaţia originară. De asemenea, nu se poate utiliza R2 pentru compararea
unor ecuaţii regresionale liniare dacă numărul de date N (i = 1, 2, ..., N) este diferit; cu alte cuvinte,
acest coeficient nu este un indicator suficient pentru a caracteriza calitatea ecuaţiei corelaţionale.
Din acest motiv, se impune testarea semnificaţiei statistice a coeficientului de corelare, lucru
care se realizează cel mai bine prin aplicarea testelor Fisher şi Student pentru coeficientul de corelare
şi conversia lui în valori f şi t corespunzătoare.
Testul Fisher pentru coeficientul de corelare se face pornind de la ipoteza că R2 = 0 (aşa-
numita ipoteză nulă). Se utilizează relaţia:

,
în care N reprezintă numărul de valori măsurate, M este numărul de parametri utilizaţi, iar σ = 1 pentru
a0 ≠ 0 şi σ = 0 pentru a0 = 0. Ipoteza nulă se respinge în favoarea ipotezei alternative R2 ≠ 0 dacă

,
F fiind valoarea tabelată pentru o probabilitate P, respectiv un nivel de încredere α. Cu cât valoarea f
este mai mare comparativ cu valoarea tabelată, cu atât ecuaţia de regresie multiliniară estimată este
mai eficientă. Dacă f este mai mare decât valoarea tabelată de peste patru ori, se recomandă utilizarea
ecuaţiei multiliniare în scopuri predictive. Dacă f < 0, atunci se admite ipoteza nulă, ecuaţia
multiliniară fiind lipsită de semnificaţie statistică.
Deoarece testul Fisher relativ la coeficientul de corelare nu este aplicabil pentru valori mari şi
/ sau mici ale lui R2, din cauza repartiţiei pronunţat asimetrice, se utilizează testul Student în condiţiile
aceleeaşi ipoteze nule, R2 = 0; valoarea lui t este dată de relaţia:

.
Ipoteza nulă se respinge în favoarea ipotezei alternative R2 ≠ 0 (adică R2 > 0 sau R2 < 0),
dacă valoarea etimată este mai mare decât valoarea tabelată corespunzătoare probabilităţii adoptate şi
numărului de grade de libertate cunoscut. Statistica t se utilizează pentru determinarea semnificaţiei
statistice a fiecărui coeficient aj (j = 1, 2, ..., M) din ecuaţia regresională.
Deci f şi t furnizează informaţii complementare.

25
 Deviaţia standard a coeficientului aj, notată cu s, a fost considerată iniţial de către Hammet o
măsură a calităţii corelării, deoarece reflectă împrăştierea valorilor calculate Ai în jurul valorilor . Ea se
calculează cu relaţia următoare:

.
O valoare mare a lui s indică o fitare slabă care se poate datora fie împrăştierii nerezonabile a
valorilor experimentale în jurul dreptei de regresie, fie uneia sau mai multor valori Ai eronate. In acest
caz se vor examina erorile individuale pentru a vedea dacă ele nu prezintă o anumită formă. Dacă
analiza listei erorilor individuale sugerează că un anumit punct este eronat, atunci acesta va trebui
remăsurat (dacă este posibil) sau eliminat. Eliminarea trebuie făcută, însă, cu mare grijă deoarece o
excludere nejustificată a unui punct poate reduce capacitatea de extrapolare şi predicţie a ecuaţiei.
In afara necesităţii stabilirii valorii predictive a ecuaţiilor corelaţionale de bună calitate, o
atenţie deosebită trebuie acordată stabilităţii acestor ecuaţii. O ecuaţie corelaţională se numeşte stabilă,
dacă o perturbare (rezonabilă) a valorilor Ai determină o modificare nesemnificativă statistic a
coeficienţilor regresionali aj (j = 1, 2, ..., M). In general, pentru testarea stabilităţii se foloseşte
statistica t-Student.
Un QSAR predictiv şi stabil permite atât propuneri de modificare a structurii chimice în
sensul ameliorării activităţii biologice, cât şi îmbunătăţirea înţelegerii mecanismelor de acţiune pentru
compusul chimic respectiv. Pentru obţinerea unui model QSAR stabil, robust şi predictiv trebuie
satisfăcute o serie de condiţii ce derivă din premisele de aplicabilitate şi proprietăţile metodelor
statistice implicate în deducerea modelului:
 datele să aibă o distribuţie normală;

 să existe omogenitate în varianţa valorilor A;

 independenţa descriptorilor moleculari: interdependenţa dintre aceşti parametri determină

scăderea stabilităţii şi a puterii de predicţie a ecuaţiei corelaţionale;

 condiţia numărului mic de parametri ajustabili faţă de numărul de molecule studiate.

Etapele modelării moleculare

Modelarea pe calculator a moleculelor chimice se face cu scopul calculării proprietăţilor
fizico-chimice. Aceste proprietăţi reprezintă, de fapt, molecula şi sunt calculate prin diverse metode:

26
MM (Mecanică Moleculară) sau procedee cuantomoleculare semiempirice sau ab initio care descriu
cel mai bine interacţiile atomilor în moleculă.
Ultima etapă în procedeele QSAR este de corelare între aceste proprietăţi moleculare şi
activitatea biologică a moleculelor determinată experimental prin metode medico-farmaceutice.
Succint, se poate scrie:

Modelare Calcul Corelare

moleculară → proprietăţi → proprietăţi -
moleculare activitate
- HYPERCHEM - MOPAC - CODESSA
- CHEMOFFICE - GAMESS - CHEMOFFICE
- ALCHEMY - GAUSSIAN
- PCMODEL - ARGUS

Programul HYPERCHEM este cel mai bun pentru modelarea moleculară, obţinându-se
geometrii moleculare fie prin mecanică moleculară fie utilizând metode cuantomoleculare
semiempirice sau ab initio.
Cu programul CHEMOFFICE se poate face cam acelaşi lucru ca şi cu HYPERCHEM,
insistându-se pe utilizarea metodelor MM şi seemiempirice.
ALCHEMY şi PC MODEL se bazează pe mecanica moleculară.
Programul MOPAC (Molecular Orbital Package) efectuează calcule cuantomoleculare
semiempirice, dar nu conţine date privind ionii metalici tranziţionali, fiind utilizat mai ales pentru
substanţe organice.
Programul ARGUS utilizează aproximaţii cuantice semiempirice pentru toate elementele
chimice.
GAMESS şi GAUSSIAN sunt pachete de programe cuantomoleculare de tip ab initio, în care
sunt luate în considerare toate interacţiile electronilor atomilor care formează o moleculă. Aceste
programe necesită un volum mare de calcule, motiv pentru care este nevoie de calculatoare
performante sau supercalculatoare ce conţin mai multe calculatoare de tip PC conectate în paralel.
CODESSA (Comprehensive Descriptors for Structural and Statistical Analysis) este cel mai
bun program dedicat corelării între proprietăţile moleculare şi activitatea biologică a moleculelor.
Proprietăţile moleculare acceptate de programul CODESSA sunt cele furnizate de programul MOPAC.
Programul CHEMOFFICE acceptă proprietăţi moleculare obţinute prin metodele MM sau
MOPAC, din care “pregăteşte” o serie de descriptori în vederea corelării proprietate – activitate.

27
 DESCRIPTORI MOLECULARI

Introducere

In metodele QSAR, structura unei substanţe chimice este reprezentată prin diferiţi descriptori
(variabile) care pot fi de natură fizico-chimică (constante de partiţie, polarizabilitate, constante de
disociere, călduri de formare etc.) sau descriptori structurali, topologici, electrostatici, electronici etc.
calculaţi prin diferite metode cuantomoleculare semiempirice sau ab initio. Aceşti descriptori pot fi
corelaţi cu activitatea farmacologică care urmează să fie optimizată prin modulare chimică, adică prin
grefarea diferitelor grupe chimice cu scopul modificării unei proprietăţi fizico-chimice sau biologice.
O asemenea relaţie cantitativă poate fi folosită în prospectarea medicamentelor. Prospectarea trebuie să
stabilească, prin compararea activităţii a două sau mai multe serii de substanţe bioactive, care compus
dintr-o serie va fi mai activ, deci care merită să fie sintetizat. In cele ce urmează sunt prezentaţi câţiva
dintre descriptorii moleculari folosiţi în explicarea interacţiei ligand-receptor.

Numărul descriptorilor existenţi în literatura QSAR a ajuns deja de ordinul câtorva mii. Acest
lucru se datorează cunoştinţelor reduse privitoare la structura receptorilor biologici şi, mai ales, la
structura situsurilor active precum şi necunoaşterea, în majoritatea cazurilor, a mecanismelor prin care
un ligand (medicament) interacţionează cu un receptor biologic. Din acest motiv, răspunsul biologic al
unei clase omoloage de substanţe este „legat” de structurile chimice ale acestora utilizând un număr
mare de descriptori având diferite semnificaţii, în speranţa unei cât mai bune descrieri a interacţiei
ligand – receptor.

La ora actuală există tendinţa să se reducă numărul de descriptori utilizaţi în procedeele

QSAR, reţinându-se aşa-numiţii descriptori „raţionali”. Din acest motiv, există tendinţa de
raţionalizare şi selectare a descriptorilor astfel încât să se utilizeze un număr cât mai mic de descriptori
care sunt în acord cu principiile unanim acceptate privind afinitatea ligandului la receptor (principiul
cheie - lacăt) şi etapele recunoaşterii moleculare între ligand şi receptor.

Descriptorii joacă rol de interfaţă între structura chimică şi răspunsul biologic:

{Structuri chimice}→{Descriptori}→{Activitate biologică}

Aceşti descriptori pot fi corelaţi cu activitatea farmacologică care urmează să fie optimizată
prin modulare chimică, adică prin grefarea diferitelor grupe chimice cu scopul modificării unei
proprietăţi fizico-chimice sau biologice. O asemenea relaţie cantitativă poate fi folosită în prospectarea

28
medicamentelor. Prospectarea trebuie să stabilească, prin compararea activităţii a două sau mai multe
serii de substanţe bioactive, care compus dintr-o serie va fi mai activ, deci care merită să fie sintetizat.

Descriptori calculabili prin metode cuantochimice

In cazul în care efectele electronice sunt implicate în determinarea activităţii biologice a unor
compuşi chimici, utilizarea descriptorilor cuantomoleculari singuri sau alături de descriptorii sterici
duce la corelări cu valoarea predictivă şi ermite formularea unor ipoteze privind posibile mecanisme de
acţiune, harta electrostatică a farmacoforului sau conformaţia acestuia.

In general, descriptorii cuantomoleculari sunt legaţi de repartiţia electronilor în moleculă şi

sunt utilizaţi pentru compararea reactivităţii diferiţilor atomi ai unei molecule sau pentru compararea
reactivităţii unui anumit atom într-o serie de molecule înrudite.

Exemple de astfel de descriptori:

Densitatea electronică pe un atom: In funcţie de valoarea acestui descriptor se pot face

estimări ale poziţiilor reactive din moleculă. Astfel, substituţiile electrofile vor avea loc la atomii cu
cele mai mari valori ale densităţii electronice, pe când cele nucleofile la atomii cu cele mai mici valori
ale densităţii electronice.

Densitatea electronului de frontieră

Energia celei mai înalte orbitale moleculare ocupate, EHOMO, este considerată o măsură a
potenţialului de ionizare, I, al unei molecule, definit ca energia necesară extragerii unui electron din
molecula aflată în fază gazoasă: EHOMO = - I.

Valoarea acestui descriptor permite o apreciere a proprietăţilor donoare ale unei molecule,
respectiv a tendinţelor ei de oxidare.

Energia celei mai joase orbitale moleculare neocupate, ELUMO, este considerată o măsură a
afinităţii pentru electron, A, a moleculei, definită ca energia eliberată prin adăugarea unui electron la o
moleculă aflată în fază gazoasă: ELUMO = - A.

Valoarea acestui descriptor permite aprecierea proprietăţilor acceptoare ale unei molecule,
respectiv a tendinţelor ei de reducere.

29
 Hidrofobicitatea – proprietate esenţială a medicamentelor

Multe din interacţiile biochimice apar atât în mediul apos cât şi în mediul lipofilic din
interiorul membranelor biologice sau la situsurile active ale unor enzime sau proteine. Natura acestor
medii poate influenţa profund procesele biologice, cum ar fi reactivitatea legării receptor - ligand sau
transportul molecular prin biomembrane.

Este cunoscut faptul că transportul prin membranele celulare reprezintă fenomenul fizico-
chimic prin care medicamentele sunt absorbite de către organism, mai ales prin procesul de difuziune.
Acest ultim proces este condiţionat de solubilitatea medicamentelor în membranele biologice şi de
coeficientul de partiţie al acestora, care exprimă solubilitatea diferenţiată a substanţelor în solvenţi
apoşi şi organici. Cel mai semnificativ solvent organic pentru studiul sistemelor biologice este 1-
octanolul, care simulează cel mai bine membranele lipidice ale celulelor.

Prin urmare, hidrofobicitatea sau lipofilicitatea este o caracteristică esenţială în ceea ce

priveşte transferul transmembranar şi prin mucoase. Coeficientul de partiţie descrie hidrofobicitatea
sau, mai bine zis, lipofilia substanţelor care joacă un rol important în adsorbţia şi absorbţia acestora de
către membranele biologice.

Importanţa coeficientului de partiţie pentru solvenţii apă şi 1-octanol a fost scoasă în evidenţă
încă de la primele încercări de analiză QSAR şi a constituit baza unui model biliniar în care un ligand
sau medicament trebuie să traverseze o serie de faze apoase şi lipidice (modelul Kubinyi).

In acest model este reprezentat schematic mediul apos exterior unei celule biologice (A1),
membrana celulară (L1) imaginată ca o fază lipidică, interiorul apos al celulei (A2) şi receptorul (R)
care poate fi imaginat ca o fază lipidică.

Prin definiţie, coeficientul de partiţie reprezintă raportul dintre concentraţia de substanţă în

solventul organic (C1) şi în apă (C2), care se stabileşte după dizolvarea substanţei în sistemul format
de cei doi solvenţi nemiscibili. In practica curentă se utilizează logaritmul în bază zece al acestui
raport, log P.

C1
Coeficientul de partiţie: log P = log = log C1 – log C2
C2

Substanţa este, prin urmare, hidrofobă dacă log P > 0 sau hidrofilă dacă log P < 0.

30
 Substanţele cu hidrofobicitate pozitivă (log P > 0) pătrund mai uşor prin membrane, pe
măsură ce log P creşte. La valori mai mari decât 5, hidrofobicitatea devine nefavorabilă întrucât reduce
semnificativ posibilitatea de transfer a moleculei de ligand în faza apoasă şi, respectiv, abilitatea
acesteia de a ajunge în contact cu receptorul/celula ţintă.

Datele din literatură sugerează valoarea 2,0 ca fiind ideală pentru coeficientul de partiţie.
Această valoare are dublă impoprtanţă: pe de o parte, la această valoare 99% din compus este în faza
lipidică şi 1% în fază apoasă, iar pe de altă parte o valoare de 2,0 asigură transportul optim prin bariera
hematoencefalică, fiind deci esenţială pentru penetrarea unui medicament administrat sistemic în
sistemul nervos central (SNC). De menţionat că 99% este, în medie, şi cantitatea de medicament
(hidrofob) care circulă legat de proteinele plasmatice şi, de asemenea, că un log P cuprins între 0 şi 4
este frecvent întâlnit la medicamentele active pe SNC.

Deoarece 1-octanolul este cel mai adecvat solvent organic care simulează membranele
biologice, s-a ales sistemul apolar/polar, 1-octanol/apă, ca un sistem standard pentru măsurarea
coeficienţilor de partiţie.

Solventul 1-octanolul este solventul organic care simulează cel mai bine membranele
biologice, datorită structurii lui speciale, de unde caracterul amfipatic, fiind pe de o parte hidrofil
specific grupei –OH şi având un caracter hidrofob (lipofil) datorat catenei lungi de atomi de carbon:

Simularea unei membrane biologice prin 1-octanol

Prin urmare, o astfel de aranjare a moleculelor din faza apoasă şi cea 1-octanolică poate
simula destul de bine membranele celulare.

31
 In proiectarea medicamentelor (Drug Design) se face o optimizare a vitezei de transport prin
creşterea solubilităţii în apă pentru substanţele foarte hidrofobe şi creşterea liofiliei (solubilităţii în
lipide) pentru substanţele hidrofile.

Acest lucru se poate face prin indroducerea în molecula unei substanţe medicamentoase a
unor grupe hidrofobe cum ar fi resturi alchilice, halogeni etc., pentru optimizarea lipofiliei sau, la fel
de bine, prin îndepărtarea grupelor hidrofile cum ar fi grupa oxidril.

Descriptori moleculari de formă

Dintre descriptorii moleculari ce caracterizează în mod efectiv forma moleculei de ligand,

formă care joacă un rol esenţial în interacţia ligand (medicament) - receptor biologic fac parte mărimile
Connolly: aria suprafeţei Connolly accesibilă solventului (Connolly Accessible Surface Area, CSAA),
aria suprafeţei moleculare Connolly (Connolly Molecular Surface Area, CMSA), volumul Connolly de
solut exclus solventului (Connolly Solvent Excluded Volume, CSEV); descriptorii cavităţii moleculare
(Cavity Surface Area, CA) şi (Cavity Volume, CV) şi indicele de ovalitate (OV).

Semnificaţia descriptorilor structurali care pot descrie forma moleculară este următoarea:
mărimile Connolly reprezintă suprafaţa sau volumul exclus unui solvent, dacă atomii din molecula de
ligand (medicament) se află în atingere (contact) cu moleculele de solvent reprezentate printr-o
înfăşurătoare a sferelor atomice van der Waals având o anumită “rază de probă”. Pentru apă se acceptă
raza de probă 1.4 Å, iar pentru 1-octanol (care simulează cel mai bine faza lipidică a membranelor
celulare) se consideră că raza de probă este de aproximativ 3.25 Å. Aceste mărimi Connolly sunt, în
mod sugestiv, reprezentate în figurile următoare:

CSAA (Connolly Accessible Surface Area) CSEV (Connolly Solvent Excluded Volume)

32
 Se observă că suprafaţa accesibilă solventului se poate obţine intuitiv ca o suprafaţă creată
prin “rostogolirea” moleculei de solvent, de o anumită “rază de probă”, pe suprafeţele van der Waals
ale atomilor din molecula de solut. Evident, volumul exclus solventului este volumul acelei părţi din
molecula de solut care este inaccesibilă contactului direct cu molecula de solvent.

Descriptori electrostatici de interacţie ligand – receptor

Recunoaşterea unui ligand de către receptorii biologici se bazează pe abilitatea de acomodare

sterică a acestora în situsurile active ale receptorului. Aceasta este prima etapă de recunoaştere
moleculară denumită principiul cheie - lacăt, acomodarea fiind cu atât mai bună cu cât forma
moleculei şi, mai ales, flexibilitatea unor grupe din ea (farmacofori) prin rotirea acestora în jurul unor
legături chimice σ permite acest lucru.

Cel de-al doilea pas al recunoaşterii moleculare este interacţia electrostatică, dacă ligandul şi
receptorul biologic au o distribuţie adecvată a sarcinilor electrice pe atomi. Recunoaşterea are loc dacă
sarcinile electrice ale atomilor pe ligand (medicament) sau pe farmacofor sunt complementare (de
semn opus) cu sarcinile electrice ale atomilor din situsul activ al receptorului. Acest stadiu al
recunoaşterii moleculare are loc dacă ligandul şi receptorul sunt separaţi la mai puţin de două raze van
der Waals. In felul acesta are loc acomodarea ligandului sau farmacoforului cu receptorul biologic, caz
în care cei doi parteneri se orientează astfel încât energia de interacţie să fie cât mai mare.

Un mod simplu şi eficient de a estima interacţiile electrostatice, ţinând în acelaşi timp seama
de forma moleculei de ligand (medicament) care s-ar îmbina în forma complementară a situsului activ
al receptorului biologic, este utilizarea modelului PCM care a luat amploare în ultimul deceniu în
fizică şi chimie, mai ales în studiul influenţei solventului asupra diferitelor proprietăţi fizice, chimice
sau chiar spectrale ale unei specii chimice (solut) imersată într-un solvent.

Interacţia ligand – receptor în modelul PCM

33
 Energiile de interacţie solut - solvent se pot calcula cu ajutorul programului cuantomolecular
ab initio GAMESS în care este încorporat modelul PCM. Interacţiile solut - solvent sunt descrise ca o
reacţie a câmpului electrostatic al moleculei de solut datorată prezenţei unui mediu dielectric care
reprezintă solventul.

Energiile interacţiei electrostatice solut – solvent sunt următoarele: energia liberă totală a
solutului în solvent (Total Free Energy in Solvent, TFES), energia liberă de repulsie (Repulsion Free
Energy, RFE), energia Pierroti de cavitate (Pierroti Cavity Energy, PCE) privind energia formării
cavităţii moleculare prin “decuparea acestei cavităţi din mediul omogen şi continuu cu o constantă
dielectrică dată (solvent)“, precum şi energia electrostatică de interacţie (Electrostatic Energy, EI) şi, în
fine, energia totală de interacţie (Total Interaction, TI), TI = RFE + PCE + EI, TFES = IES + TI, unde
IES reprezintă energia internă a solutului în lipsa solventului (Internal Energy of Solute, IES).

34
 APLICAŢII

1. Glosar de termeni QSAR, CADD http://www.drugdesign.com/web/teaching/glossary

2. Analize QSAR privind activitatea sapoforică a edulcoranţilor

3. Activitatea antivirală a unor benzimidazoli

4. Lipofilia substanţelor medicamentoase

35