Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în laboratoarele de biochimie ​4

Recoltarea sângelui ​6
Condiţii de recoltare ​6
Recoltarea sângelui capilar ​7
Recoltarea sângelui venos ​7
Condiţiile de conservare a probelor recoltate ​8
Obţinerea plasmei şi a serului ​9
Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale ​9
Noţiunea de pH ​14
Ionizarea apei şi produsul ionic al apei ​14
Scara de pH ​15
Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici ​15
Demonstrarea capacităţii de tamponare: ​17
Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon ​18
Volumetrie ​19
Principiile analizei volumetrice ​19
Clasificarea metodelor volumetrice ​20
Calcule în analiza volumetrică ​20
Tehnica titrării ​21
Erorile determinărilor volumetrice ​22
Surse de erori ​22
Acidimetria volumetrică ​24
Titrări acido-bazice ​24
Titrarea unui acid tare cu o bază tare ​24
Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii etalon ​25
Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut ​26
Dozarea amoniacului prin diferenţă ​27
Titrarea unui acid slab cu o bază tare ​27
Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH ​28
Titrarea unei baze slabe cu un acid tare ​29
Oxidimetria volumetrică ​30
Permanganometrie ​31
Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N ​31
Determinări permanganometrice în mediu acid ​32
Dozarea acidului oxalic (micrometodă) ​32
Dozarea apei oxigenate (macrometodă) ​33
Iodometrie ​34
Dozarea substanţelor reducătoare ​35
Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N ​35
Dozarea substanţelor oxidante ​36
Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometodă) ​36
Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometodă) ​36
Complexometria volumetrică ​37
Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică (metoda Budesinsky) ​40
Volumetria prin reacţii de precipitare ​41
Dozarea clorurilor prin metoda Volhard ​42
Identificarea glucidelor ​43
Reacţii de reducere ​43
Identificarea dizaharidelor ​50
Identificarea polizaharidelor ​51
Identificarea glucidelor ​52
Identificarea aminoacizilor şi proteinelor ​53
Reacţii de culoare ​53
Reacţii de precipitare ale proteinelor ​57
Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen ​60
Identificarea nucleoproteinelor ​62
Vitamine ​63
Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică ​63
Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină (metoda Palladin) ​65
Enzime ​66
Influenţa concentraţiei substratului asupra vitezei de reacţie enzimatică ​68
Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează ​69
Determinarea activităţii catalazei sanguine ​72
Determinarea activităţii transaminazelor (metoda colorimetrică cu 2,4-
dinitrofenilhidrazină) ​73
Determinarea activităţii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky) ​77
Explorarea echilibrului acido-bazic ​82
Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual) ​83
Metoda Astrup ​83
Ioni anorganici ​84
Determinarea potasiului seric ​84
Dozarea flamfotometrică a potasiului seric ​86
Dozarea calciului şi magneziului ​87
Dozarea calciului ​87
Determinarea cationului calciu în sânge ​87
Dozarea calciului prin metoda permanganometrică ​89
Dozarea calciului prin metoda complexonometrică ​91
Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe ​93
Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales ​96
Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată) ​97
Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare) ​99
Compuşi organici ​103
Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl ​103
Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului ​106
Electroforeza proteinelor serice ​108
Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl ​112
Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează ​114
Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski ​115
Dozarea acidului uric din ser ​119
Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin ​121
Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh ​122
Glucoza ​124
Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică) ​124
Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază) ​128
Teste rapide pentru determinarea glicemiei ​129
Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator ​132
Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein ​132
Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică ​134
Dozarea colesterolului total şi liber ​135
Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou) ​138
Hemoglobina ​141
Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin) ​141
Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină ​141
Analiza urinii ​142
Examenul fizic al urinei ​143
Examenul chimic al urinei ​145
Analiza compuşilor patologici din urină ​146
Identificarea proteinelor urinare ​146
Evidenţierea puroiului ​149
Identificarea glucidelor urinare ​150
Identificarea corpilor cetonici urinari ​155
Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici ​156
Identificarea acizilor biliari ​157
Identificarea pigmenţilor biliari urinari ​157
Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului ​158
Identificarea sângelui ​159
Teste rapide de diagnostic din urină ​160
Test rapid de sarcină ​160
Analiza de laborator a urinei ​161
Determinări în urina din 24 de ore. ​162
Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr) ​162
Dozarea acidului uric din urină ​163
Dozarea creatininei din urină ​163
Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal ​164
Analiza calculilor urinari ​165
Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice: ​165
Analiza salivei ​166
Identificarea unor componenţi ai salivei ​166
Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei ​168
Analiza sucului gastric ​169
Determinarea acidităţii gastrice ​169
Analiza lichidului cefalorahidian ​172
Examenul fizic ​172
Examenul chimic al lichidului cefalorahidian ​173
Analiza scaunului ​174
Metode fizice de analiză folosite în laborator ​176
Fotometria ​176
Spectrofotometru Spekol ​178
Spectrofotometrul de absorbţie atomică ​180
Spectrofotometrul de absorbţie atomică ​180
Flanfotometria ​181
Fotometrul cu flacără (flamfotometrul) ​181
Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi ​183
Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă ​183
Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa ​185

​Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în

laboratoarele de biochimie
1. Întregul personal şi studenţii, trebuie să cu​noască şi să respecte regulile de protecţia muncii
şi asigurarea securităţii, pentru prevenirea accidentelor de muncă.
2. Tot personalul care lucrează în laboratoarele de analize biochimice este obligat să poarte
halate curate.
3. Aparatele electrice (centrifugă, termostate, frigidere, spectro​fotometru etc.) trebuie să aibă
prizele împământate şi izolare electrică per​fectă. Fixarea lor în priză se face numai cu
mâna uscată.
4. Înainte de începerea oricărei lucrări de laborator trebuiesc însuşite tehnic problemele
teoretice.
5. Toate reacţiile chimice se execută în conformitate cu condiţiile prescrise (cantitatea,
concentraţia, vesela, etc.).
6. Masa de lucru se păstrează într-o ordine şi curăţenie exemplară.
7. Nu se execută nici o operaţie în vase murdare.
8. După întrebuinţare toate vasele de laborator se spală cu apă de robinet şi cu apă distilată.
9. Nu se aglomerează masa cu vase şi aparate inutile, pe masă se pun numai reactivii şi vesela
necesară pentru lucrarea respectivă.
10. Sticlele cu reactivi să fie întotdeauna închise cu dop. Dacă se folosesc diferiţi reactivi
trebuie avut grijă să nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu trebuie turnat
înapoi în sticlă.
11. Încăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, solvenţii organici trebuie să fie
prevăzută cu nişă, exhaustor şi ventilaţie electrică.
12. Înainte de folosirea unor substanţe inflamabile (sulfură de carbon, benzină, eter, etc.) se
sting toate becurile de gaz.
13. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor, să se facă instructaj periodic de
utilizarea extinctorului şi să fie precizată o echipă care să inter​vină în caz de incendiu.
14. Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă
electrice, sub nişe cu tiraj convenabil.
15. Trebuie să se lucreze cu mare precauţie cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid
azotic, substanţe toxice şi inflamabile.
16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevăzute cu filtru de vată.
17. Pipetarea acizilor concentraţi şi bazelor se face cu pipetă cu volum mai mare decât
volumul de pipetat şi prevăzute cu filtru de vată.
18. Bromul se măsoară numai sub nişă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de cauciuc
pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului sulfuric concentrat
în vasul cu apă şi nu invers.
19. În timpul încălzirii unei eprubete care conţine un lichid capătul deschis al eprubetei nu se
ţine spre cel care efectuează operaţia şi nici spre vecini.
20. Nu se lasă substanţe în vase neetichetate.
21. Substanţele toxice se ţin sub cheie şi în borcane sau sticle prevăzute cu etichete cu cap de
mort.
22. Este strict oprită gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanţelor chimice folosite
sunt toxice sau caustice.
23. Mirosirea substanţelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul sticlei cu
reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de la gâtul
sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului.
24. Când se lucrează cu substanţe care în cursul operaţiei se pot împrăştia sau se pot produce
mici explozii, se folosesc ochelari de protecţie.
25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid se depozitează, în afara laboratorului.
Când sunt strict necesare anumitor operaţii în labo​rator ele se ancorează cu lanţ în locuri
anume prevăzute.
26. Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului şi
prevăzute cu ventilatoare electrice.
27. În legătură cu lucrarea practică efectuată se notează toate observaţiile precum şi schiţa
instalaţiei folosite.
28. Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu se aruncă în
chiuvete.
29. După terminarea activităţii, se pun toate vasele la loc, se curăţă masa şi se controlează
dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize şi robinetele de apă şi gaz închise.
30. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu o trusă de prim ajutor care să conţină
medicamente şi material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice, antibiotice,
antiseptice, calmante, feşi, tifon etc.).
31. Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice,. pentru a evita
pericolul de infectare.
32. Este necesar ca măsurile de protecţia muncii, asigurarea securităţii, pre​venirea toxicităţii
să fie prelucrate cu fiecare grupă de studenţi la începutul activităţii anului universitar şi
reamintite periodic.
33. În cazul unor accidente se va apela la conducătorul lucrării.
 Recoltarea sângelui
Analizele chimice ale constituenţilor anorganici şi organici sanguini se pot realiza pe
sânge venos, capilar şi arterial (foarte rar).
Investigaţiile comparative pe sânge capilar şi venos au arătat că nu există diferenţe
dependente de modul de prelevare pentru următoarele substanţe: sodiu, potasiu, clor, calciu,
fosfor, colesterol, uree, proteine totale. În schimb pentru glucoză s-au găsit valori mai mici în
sângele venos faţă de cel arterial, pentru piruvat şi lactat valori mai mari în sângele venos
decât în cel capilar iar pentru amoniac valorile din sângele arterial sunt mai mari decât cele
din sângele venos.

Condiţii de recoltare
În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineaţa, à jeun (pe nemâncate).
Analizându-se influenţa micului dejun (masă uşoară) asupra concentraţiei unor constituenţi
sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în cazul dozării
următoarelor elemente: clor, sodiu, potasiu, cal​ciu, bicarbonat, uree, creatinină, acid uric,
proteine totale, colesterol, amilază, ceruloplasmină, fosfatază alcalină, fosfatază acidă,
transaminaze, leucinami​nopeptidază, colinesterază.
În principiu, utilizarea sângelui total în cadrul diferitelor investigaţii este ​admisă
numai în cazul în care concentraţia substanţei urmărite este apro​ximativ aceeaşi în globulele
roşii şi în plasmă, aşa cum este cazul glucozei şi al azotului ureic.
Datorit] conţinutului diferit în apă al sângelui (81%) şi al plasmei sau serului (93%),
valorile glucozei din ser sunt cu 12% mai mari ca cele obţinute în sânge. Concentraţiile medii
ale unor componenţi organici şi anorganici şi activităţile medii ale unor enzime din plasmă şi
eritrocite sunt redate în tabelul de mai jos.

Component (concentraţie) Eritrocite Plasmă Eritrocite

Plasmă
Azot neproteic (mg/100 ml) 44,0 25,0 1,80
Creatinină (mg/100 ml) 1,8 1,1 1,60
Azot ureic (mg/100 ml) 14,0 17,0 0,82
Acid uric (mg/100 ml) 2,5 4,6 0,54
Glucoză (mg/100 ml) 74,0 90,0 0,82
Colesterol (mg/100 ml) 139,0 194,0 0,72
Potasiu (mEq/l) 100,0 4,4 22,7
Sodiu (mEq/l) 16,0 140,0 0,11
Clor (mEq/l) 52,0 104,0 0,50
Calciu (mEq/l) 0,5 5,0 0,10
Magneziu (mEq/l) 5,5 2,2 2,5
Fosfor anorganic (mEq/l) 2,5 3,2 0,78
Bicarbonat (mEq/l) 19,0 26,0 0,73

Utilizarea plasmei în locul serului pentru dozările diferiţilor constituenţi prezintă un

singur avantaj: hemoliza mai slabă a plasmei faţă de hemoliza produsă în timpul obţinerii
serului (recoltare, coagulare, transport).
Cu excepţia unor enzime (fosfataza acidă, lactatdehidrogenază şi aldo​laza) care se
eliberează în timpul coagulării din trombocite, nu se constată diferenţe între concentraţia
plasmatică şi serică a celorlalţi constituenţi.

Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou​ născuţi) sau
din lobul urechii (la pacienţii în stare de şoc), după următoarea tehnică :
- se spală locul cu eter se usucă, se înţeapă suficient de adânc cu un ac steril;
- se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apre​ciabilă din
care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară; dacă sângele nu
curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare: frecarea degetului în
cazul prelevării din pulpă, a gam​bei în cazul prelevării din călcâi sau aplicare de alcool 70° în
cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune pe locul înţepăturii un tampon steril.

Recoltarea sângelui venos

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii
mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici).
Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:
- se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul puncţionării
cu alcool 70 %;
- se puncţionează vena şi se recoltează sângele prin ac fie direct în eprubetă prin
scurgere liberă, fie prin aspirare în seringă ;
- după recoltare se îndepărtează garoul şi se tamponează locul puncţio​nat cu un tampon
de vata îmbibat în alcool.
Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare s-au ace şi vase speciale pentru recoltarea
sângelui, vasele în care se recoltează trebuie să fie în perfecta stare de curăţenie şi uscare
întrucât urmele de alcool, apă etc. pot produce hemoliza sângelui, iar dife​ritele impurităţi pot
falsifica rezultatele dozărilor.
Poziţia corpului şi staza venoasă influenţează rezultatele obţinute în cazul determinării
elementelor figurate (eritrocitele, etc.) şi a celor cu greutate moleculară mare (proteinele
totale, fracţiunile proteice individuale, coles​terolul din complexul lipoproteinelor etc.).
De exemplu: valoarea proteinelor totale creşte de la 6,63 g/100 ml în poziţie de
deccubit la 7,65g/100 ml în ortostatism.
În cazul determinării substanţelor cu greutate moleculară mică, poziţia corpului şi
staza venoasă nu afectează valoarea rezultatelor excepţie, făcând lactatul, piruvatul şi
amoniacul.

Condiţiile de conservare a probelor recoltate

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4° C, iar do​zările trebuie
făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea îndelungată (chiar la 4°C) este
contraindicată. Conservarea probelor la tem​peratura camerei determină perturbări în
compoziţia electroliţilor, enzi​melor şi diferiţilor metaboliţi.
În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie realizate,
de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condi​ţiile păstrării la temperatura camerei.
Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C timp de 24 ore. În cazul
dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie congelat sau liofilizat, formă de
con​servare preferabilă adăugării de conservanţi (amestec timol-fluoru0ră: 10 mg fluorură de
sodiu + 1 mg timol/ml sânge sau streptomicină 1 mg/l0 ml sănge).

Obţinerea plasmei şi a serului

Analizele biochimice se pot efectua pe sânge total, plasmă sau ser. Plasma sanguină se
obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant (fluorură de sodiu,
amestec de oxalaţi de potasiu şi amo​niu, heparină etc.); supernatantul este constituit din
plasma sanguină, iar sedimentul din elementele figurate.
Serul sanguin se obţine prin centrifugarea sau decantarea sângelui recol​tat fără
anticoagulant, după ce a fost lăsat să coaguleze la temperatura ca​merei timp de 30-60 minute.
Serul normal este limpede, de culoare galben pai şi se deosebeşte de plas​ma sanguină
prin faptul că nu mai conţine fibrinogen. În condiţii fiziologice, aspectul serului poate fi :
- opalescent datorită particulelor de grăsime provenite dintr-un regim foarte bogat în
lipide, caz în care clarificarea se poate obţine prin deprotei​nizare sau extracţia
lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1);
- galben-brun datorită substanţelor carotenoide provenite din alimentaţie excesiv
vegetariană ;
- de la roz la roşu intens datorită prezenţei hemoglobinei, rezultat al hemolizei produsă
prin greşeli în tehnica de recoltare a sângelui.
În condiţii patologice, serul poate prezenta următoarele modificări de culoare :
- opalescent în nefroza lipoidică;
- galben-brun în ictere de diferite etiologii; în contact cu aerul, bili​rubina se poate
transforma în biliverdină, sângele devenind verzui.

Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale

​O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe inseparabile prin
mijloace mecanice ca filtrarea sau centrifugarea. La o soluţie se disting două componente:
solventul sau componenta care dizolvă şi solutul(soluţii) sau componenta (componentele) care
se dizolvă. Raportul dintre un solut şi solvent se exprimă prin concentraţia soluţiei.
​Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii:
​a) Concentraţia procentuală care la rândul ei poate fi de trei feluri:
- concentraţia procentuală de masă - grame solut în 100 g soluţie, (m/m)
De exemplu 100 g soluţie 15% (m/m) H2SO4 conţine 15 g H2SO4 şi 85 g
apă.
- concentraţia procentuală volumetrică - ml solut în 100 ml soluţie, (v/v)
De exemplu 100 ml soluţie 4% (v/v) etanol se prepară completând 4 ml
CH3CH2OH până la 100 ml cu apă. În acest caz facem abstracţie de
contracţia de volum, fenomen larg întâlnit în prepararea soluţiilor
procentuale volumetrice. Într-o expresie restrânsă acest fenomen poate fi
scris astfel: v solut + v solvent > v soluţie. Pentru soluţii diluate el poate fi neglijat.
- concentraţia procentuală mixtă - grame solut în 100 ml soluţie, (m/v)
De exemplu 100 ml soluţie 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conţine în acest
volum 0,8 g NaCl
 ​b) Concentraţia molară (m, M) reprezintă numărul de moli de solut aflaţi într-un litru
de soluţie.
​c) Concentraţia molală, mai rar folosită, se defineşte prin numărul de moli de solut
dizolvaţi în 1000 g de solvent.
​d) Concentraţia normală reprezintă numărul de echivalenţi-gram de solut dintr-un litru
de soluţie.
​Se numeşte echivalent cantitatea de substanţă în greutate care într-o reacţie chimică
dată poate înlocui sau lega 8 părţi în greutate de oxigen sau 1,008 părţi în greutate de
hidrogen. Cantitatea de substanţă în grame, egală numeric cu echivalentul, se numeşte
echivalent-gram.
​Pentru calcularea echivalentului-gram se ţine cont de următoarele reguli:
• echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa moleculară (M) a acidului şi
+
numărul de ioni H angajaţi în reacţie. De exemplu, într-o reacţie de neutralizare cu HCl
​E
gHCl
= = 36,5 g HCl,
iar într-o reacţie în care H3PO4 cedează toţi cei 3 ioni H
+
​: ​
= g H3PO4
• echivalentul-gram a unei baze este dat de masa moleculară a sa împărţită la numărul ionilor
- -
HO care participă la reacţie. Dacă toţi ionii HO participă la reacţie echivalentul-gram al
bazei se poate calcula împărţind masa moleculară a acesteia la valenţa metalului. De
exemplu:
​E gNaOH
​ Ca(OH)2
= g NaOH g
​În sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculează cunoscând
numărul de protoni care sunt legaţi.
• pentru săruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa moleculară şi produsul
dintre numărul atomilor de metal din molecula de sare şi valenţa acestui metal, sau raportul
dintre masa moleculară şi produsul dintre numărul radicalilor acid şi valenţa acestora. De
exemplu:
​g Fe2(SO4)3
Ca şi în cazul acizilor, bazelor şi sărurilor, echivalentul-gram a unei substanţe oxidante
sau reducătoare se calculează pe baza stoicheometriei redox a reacţiei la care participă
aceasta. În reacţiile de oxido-reducere atomii îşi schimbă valenţa. Echivalentul se defineşte ca
fiind raportul dintre masa moleculară a compusului chimic şi numărul de electroni cedaţi sau
primiţi în reacţie de atomul (atomii) care se oxidează sau se reduc.
​De exemplu, în permanganometrie, în mediu acid ionul de mangan din KMnO4,
acceptă 5 electroni:
7+ 2+

​2KMnO 4
+ 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]
​Prin urmare, g KMnO4
​- variaţia stării de oxidaţie a ionului de mangan din KMnO4 în mediu slab alcalin sau
neutru este 3.
 7+
​ 4+

​2KMnO 4
+ H2O = 2KOH + MnO2 + 3[O]
​ g KMnO4
- variaţia stării de oxidaţie a manganului din KMnO4 în mediu puternic alcalin este 1
+7 +6

​2KMnO 4
+ 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]

​EgKMnO4 = = 158g KMnO4

​
​1. Soluţii procentuale
a) Prepararea unei soluţii de NaCl 10 % (m/m)
​Conform definiţiei 100 g soluţie NaCl 10 % trebuie să conţină 10 g NaCl şi 90 g apă.
Se cântăresc 10 g NaCl la balanţa tehnică care se introduc într-un pahar Berzelius şi se adaugă
90 ml de H2O distilată. Se omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete de sticlă.
b) Prepararea unei soluţii de CH3COOH 15 % (v/v)
​Conform definiţiei 100 ml soluţie CH3COOH 15 % trebuie să conţină 15 ml
CH3COOH glacial şi restul H2O distilată. Se măsoară într-un cilindru gradat 15 ml CH3COOH
glacial şi se completează volumul cu H2O distilată până la 100 ml. Se omogenizează
amestecul cu ajutorul unei baghete de sticlă.
c) Prepararea unei soluţii de Na2CO3 5%(m/v)
​100 ml soluţie Na2CO3 5 % trebuie să conţină 5 g Na2CO3 anhidru şi H2O distilată. Se
cântăresc 5 g Na2CO3 anhidru la balanţa tehnică, se introduc într-un cilindru gradat şi se
completează cu H2O distilată până la 100 ml. Se omogenizează amestecul cu ajutorul unei
baghete de sticlă. În cazul în care se lucrează cu Na2CO3 . 10 H2O se vor lua în considerare
masele moleculare pentru a se determina cantitatea în grame a sării hidratate ce corespunde
greutăţii de sare anhidră.
​ ​
​106 g Na CO 2 3
anh. ............... 286 g Na2CO3.10 H2O
​ 5 g Na2CO3 anh. ............... x
​ x = 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O

​ e vor cântări 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O la balanţă şi se va proceda în modul descris

S
mai sus.
 ​Regula amestecurilor

​Dintr-o soluţie mai concentrată se poate prepara o soluţie mai diluată cu ajutorul
regulei amestecurilor. ​De exemplu, având la dispoziţie o soluţie de NaCl 2 % (m/m) să se
prepare 20 ml soluţie NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentraţiilor celor două soluţii, având
concentraţia mai mare, respectiv mai mică decât concentraţia soluţiei de preparat, se aşează
în colţurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentraţiei soluţiei de preparat, se
aşează la intersecţia celor două diagonale. Valorile numerelor ce reprezintă concentraţiile se
scad pe diagonală (numerele mai mici se scad din cele mai mari). Rezultatele se scriu în
colţurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere reprezintă părţi în greutate din soluţiile
respective (grame, kilograme, etc.).

2 0
​
0,9
​
MKMnO4
​ 0,9 părţi NaCl 2 % ​ 1,1 părţi H2O distilată…2 părţi NaCl 0,9%(m/m)
1

​Deci, se pot amesteca 0,9 părţi NaCl 2 % cu 1,1 părţi H2O distilată pentru a rezulta 2
părţi soluţie de NaCl 0,9%(m/m). Având în vedere că soluţia NaCl 0,9% (m/m) este diluată
putem tolera conversia părţilor de greutate, în volume. Adică,
​20 ml (soluţie) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y
​x = 9 ml NaCl 2 %
​ = 11 ml H O distilată
y 2

​ proximaţia făcută este utilă deoarece este mai uşoară măsurarea volumetrică a
A
soluţiilor în loc de cea gravimetrică.

​2. Soluţii molare

​a) Prepararea unei soluţii de H SO 2 4

0,1 M având la dispoziţie soluţie de H2 SO4 20
3
% (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm . Conform definiţiei, 1000 ml H2SO4 0,1 M conţin 0,1
moli H2SO4. Deci:

​1000 ml H SO2 4
0,1 M .................. 9,8 g H2SO4 pur

​100 g sol. H SO 2 4
20 % .............. 20 g H2SO4 pur
 ​ x g sol. H2SO4 20 % ​…………..9,8 g H SO 2 4
pur
​ x = 49 g sol. H2SO4 20 %(m/m)
​ ml sol. H SO
2 4
20 %(m/m)
​În balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H2O distilată, se adaugă 43,02
ml soluţie H2SO4 20 % şi apoi se aduce la cotă cu H2O distilată după răcirea amestecului la
temperatura menţionată pe balon (20ºC). După ce se fixează dopul balonului cotat se
omogenizează soluţia prin agitare energică.

​3. Soluţii normale

​Prepararea unei soluţii de H SO 2 4
0,1 N având la dispoziţie soluţie H2SO4 20 % (m/m)
3
cu densitatea 1,139 g/cm . Conform definiţiei 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conţin 0,1 . Deci:
​1000 ml H SO 2 4
0,1 N .............. 4,9 g H2SO4 pur

​
100 g sol. H2SO4 20 % ........... 20 g H2SO4 pur
x g sol. H2SO4 20 % .......... 4,9 g H2SO4 pur
x = 24,5 g sol. H2SO4 20 %(m/m)
ml sol. H2SO4 20 %

Noţiunea de pH
Ionizarea apei şi produsul ionic al apei
Deşi apa pură este considerată neelectrolit, ea conduce totuşi curentul electric. Acest
lucru se datorează faptului că o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea apei poate fi
scrisă conform ecuaţiei:

+ -
H2O + H2O <---------> H3O + OH
Are loc un transfer de protoni ducând la un echilibru. Constanta de aciditate a apei va fi:

Ka=
La temperatura de 25°C apa se află ionizată în proporţie de o moleculă la 555
milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentraţia apei (de la
numitor) rămâne practic constantă şi deci poate fi înmulţită cu constanta de aciditate.
2 + -
Ka × [H2O] = Pi = [H3O ] [OH ]
Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a apei.
-14
Deoarece la temperatura de 25°C produsul ionic al apei are valoarea de 10
2 2
moli /l , înseamnă că în apa pură la 25°C concentraţia ionilor de hidroniu, egală cu cea a
-7
ionilor de hidroxid, este 10 moli/l.
 + - -7
[H3O] = [OH ] = 10 moli/l

Scara de pH
În soluţii diluate, acizii tari pot fi consideraţi practic ionizaţi complet. Astfel, într-o
soluţie apoasă 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentraţia ionilor de hidroniu este practic egală cu
concentraţia totală a acidului. Este comod să se exprime concentraţia ionilor de hidroniu dintr-
o soluţie apoasă în formă logaritmică. Se numeşte exponent al concentraţiei ionilor de
hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de hidroniu din
soluţie (Sørensen, 1909):
+
pH = - lg [H3O ]
Punctul neutru: O soluţie apoasă este neutră când concentraţiile ionilor de hidroniu şi
ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuaţiei:
+ - -7
[H3O ] = [OH ] = 10 moli/l
Punctul neutru, în soluţii apoase, este la pH = 7. O soluţie cu pH < 7 este acidă; o soluţie cu
pH > 7 este bazică.

Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici

Indicatori de pH (acido-bazici) sunt substanţe organice colorate (acizi sau baze slabe)
care îşi modifică culoarea în funcţie de pH. Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un
indicator de pH sunt următoarele: schimbarea de culoare să fie reversibilă, şi să se producă
brusc, deci într-un interval de pH cât mai mic, să fie solubil în apă, să aibă putere de colorare
(culoare intensă), chiar la concentraţii mici; schimbarea de culoare să se producă la adaosul
unor concentraţii mici de acid sau de bază; să fie stabil în condiţiile obişnuite de lucru.
Dacă indicatorul este un acid slab (AH), în soluţie apoasă are loc reacţia protolitică:
+ -
AH + H2O <─────> H3O + A

-
În cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugată A
este albastră. Prin schimbarea acidităţii soluţiei indicatorului îşi schimbă culoarea fenomen
numit viraj, datorită trecerii lui din stare protonată în cea deprotonată sau invers.
Constanta de aciditate al indicatorului va fi:
-
[A ]
+
Ka = [H ] ────
[AH]
În forma logaritmică:
-
[A ]
-
[A ]
+ +
lgKa = lg[H ] + lg ──── sau - lg[H ] = -lgKa + lg ───
[AH] [AH]
Adică:
+
-lg[H ] = pH şi -lgKa = pKa, deci:

[A-] [albastru]
 ________
pH = pKa + lg ─── sau pH = pKa + lg
[AH] [galben]

Ochiul uman nu poate distinge decât cca. 10% dintr-o culoare în prezenţa unei alte culori.
- -
Dacă [A ] = 10[AH], soluţia va fi albastră şi pH1 = pKa + 1. Dacă 10[A ] = [AH], soluţia va fi
galbenă şi pH2 = pKa - 1. Prin urmare:
pH1 - pH2 = DpH = 2
Acest interval de pH se numeşte intervalul de viraj al indicatorului care înseamnă intervalul
de pH în care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben în cazul nostru)
odată cu schimbarea pH-ului soluţiei. Fiecare indicator are un interval de viraj specific. La
valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul îşi păstrează culoarea, iar peste acest
interval la fel. Din culoarea soluţiei unui indicator se poate aprecia pH-ul soluţiei.
Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micşti şi universali. Indicatorii simpli se
caracterizează printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 unităţi de pH).
Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul necunoscut
se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj.
Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale căror intervale de viraj
sunt parţial suprapuse sau, în cazul cel mai bun, unul în continuarea celuilalt. Indicatorii
universali au intervale de viraj mai mari decât ale celor simpli. În comerţ se găsesc hârtii
indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii obţinute cu o scară de
culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluţii cu o precizie de aproximativ + 0,5 unităţi
pH.

În tabelul de mai jos apar câteva exemple de indicatori simpli cu caracteristicile lor:

Intervalul de Sub interval de În cadrul intervalului Peste

Denumirea viraj ( pH) viraj de viraj interval
Metil violet 1,0 - 3,2 verde albastru violet
Metil oranj 3,1 - 4,4 roşu portocaliu galben
Roşu metil 4,4 - 6,2 roşu roz galben
Albastru de
6,2 - 7,6 galben verde albastru
bromtimol
Fenolftaleină 8,2 - 10,0 incolor roz roşu-violet

Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabilă şi acidul slab sau baza slabă
rezultată prin hidroliză. O soluţie care îşi schimbă numai puţin pH-ul, la adăugarea unei
cantităţi mici de acid sau bază tare se numeşte soluţie tampon. O caracteristică a unei soluţii
tampon este capacitatea de tamponare.
Capacitatea de tamponare a unei soluţii este capacitatea ei de a se opune variaţiei de pH la
adaosul de acid tare sau bază tare şi se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid sau bază
care schimbă pH-ul unui litru de soluţie cu o unitate. Ea se micşorează prin diluare.
 Demonstrarea capacităţii de tamponare:

Reactivi: ​Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol, cu

intervalul de viraj între pH 4,4-7,6)
Sol. tampon fosfat pH = 7
Sol.de HCl N/10
Sol. de NaOH N/10

Modul de lucru:
În două pahare Berzelius (1, 1a) se pune apă distilată şi se adaugă câte 2 ml de
indicator. Dacă apa este neutră culoarea soluţiilor este verde. În alte două pahare (2, 2a) de
aceiaşi mărime se prepară soluţie tampon cu pH = 7, la care se adaugă câte 2 ml soluţie de
indicator obţinându-se tot culoarea verde. Se adaugă câte 1 ml HCl N/10 în paharele 1şi 2 şi
se amestecă cu bagheta: se observă o puternică variaţie a culorii soluţiei din paharul 1 ceea ce
indică o mare variaţie a pH-ului. În paharele 1a şi 2a se adaugă câte 1 ml NaOH N/10, se
amestecă cu bagheta şi se observă la fel o mare variaţie a culorii soluţiei din paharul 1a. În
paharele 2 şi 2a culoarea se schimbă foarte puţin, deoarece pH-ul s-a modificat foarte puţin.
În două pahare Berzelius (1, 1a) se prepară soluţie tampon cu pH = 7 şi se adaugă câte 2
ml indicator. În alte 2 pahare (2, 2a) se prepară soluţie tampon cu acelaşi pH, însă de zece ori
mai diluat, adăugând câte 2 ml indicator şi în aceste pahare. Se pipetează câte 1 ml HCl N/10
în paharele 1 şi 2, şi câte 1 ml NaOH N/10 în paharele 1a şi 2a. Se amestecă cu bagheta. În
paharele 2 şi 2a se observă schimbarea mai pronunţată a culorii indicatorului deoarece,
soluţiile tampon fiind mai diluate, li s-a micşorat capacitatea de tamponare.

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon

Principiu:
Se adaugă soluţiei de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit şi se
compară culoarea pe care o capătă soluţia, cu culoarea produsă de aceiaşi cantitate de
indicator adăugată unei serii de soluţii tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluţiei de cercetat
va fi egal cu pH-ul soluţiei de referinţă cu culoarea identică.
Reactivi: ​- Sol. de CH3COOH N/10
- Sol. de CH3COONa N/10
- Sol. de KH2PO4 M/15
- Sol. de Na2HPO4 M/15
- Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol)
Modul de lucru:
Se prepară în două serii de eprubete soluţii tampon cu pH diferit conform tabelelor:

Tampon acetat (Walpole)

CH3COOH N/10 ml 8,2 6,3 4,0 2,1 1,0

CH3COONa N/10 ml 1,8 3,7 6,0 7,9 9,0
pH 4 4,4 4,8 5,2 5,6

Tampon fosfat (Sørensen)

KH2PO4 M/15 ml 8,8 7,3 5,1 2,8 1,3 0,5

Na2HPO4 M/15 ml 1,2 2,7 4,9 7,2 8,7 9,5
pH 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0
​
În fiecare soluţie se adaugă câte 0,2 ml indicator Bogen. Eprubetele se agită energic
pentru omogenizarea culorii. Culoarea soluţiilor va fi diferită în fiecare eprubetă în funcţie de
pH. Se adaugă 0,2 ml indicator la 10 ml din soluţia de cercetat şi se omogenizează. Se
compară culoarea obţinută cu culorile seriei. Dacă culoarea soluţiei cercetate este identică cu
culoarea uneia din soluţiile tampon (acetat sau fosfat), pH-ul lor este identic. Dacă culoarea se
încadrează între culorile a două soluţii tampon consecutive se consideră că pH-ul soluţiei
cercetate este media aritmetică a valorilor de pH a celor două soluţii tampon.

Volumetrie
Principiile analizei volumetrice
Analiza volumetrică se bazează pe măsurarea de volume, operaţie ce se execută comod
cu vase calibrate (cilindrii gradaţi, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul analizelor
volumetrice constă în măsurarea volumului de reactiv necesar producerii reacţiei cantitative
cu substanţa de determinat ce se află în soluţia de analizat. Operaţia de adaos a soluţiei de
reactiv se face în pică- turi, din biuretă şi se numeşte titrare.
​Pot fi urmărite volumetric numai acele reacţii care au loc univoc, (fără reacţii
secundare şi cantitativ) şi cu viteză foarte mare. Pentru marcarea sfârşitului reacţiei, respectiv
a punctului de echivalenţă, se folosesc fenomene ce pot fi puse în evidenţă prin observare
vizuală (schimbări de culoare, apariţii de precipitate) sau instrumentală (potenţiometru,
conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizuală a sfârşitului titrării în modul cel
mai obişnuit se folosesc indicatorii, substanţe care îşi schimbă culoarea în punctul de
echivalenţă.
​La punctul de echivalenţă reactanţii sunt prezenţi în cantităţi echivalente, deci în
amestecul de reactivi nu se află în exces nici substanţa de dozat şi nici reactivul titrat.
Volumul de reactiv adăugat pentru atingerea punctului de echivalenţă se numeşte volum de
echivalenţă.
Spre a putea stabili concentraţia substanţei de analizat este necesar ca soluţia de
reactiv folosită la titrare să fie de concentraţie cunoscută, să fie suficient de stabilă şi să se
prepare relativ uşor.
​Metodele volumetrice se caracterizează prin rapiditate, în majoritatea cazurilor o
determinare volumetrică se face în câteva minute.
​
Clasificarea metodelor volumetrice
​Metodele volumetrice pot fi: a) directe
 ​ b) indirecte - prin retitrare ​
​ - prin intermediul unui substituent
​În cazul metodelor de titrare directă, reacţia dintre componentul de determinat şi
reactivul de titrare este de echivalent la echivalent. Prin retitrare se titrează excesul unui
reactant adăugat soluţie de analizat (vezi dozarea NH3). În cazul folosirii unui substituent,
produsul de reacţie titrabil rezultat prin substituţie se formează în cantitate echivalentă cu
componentul de determinat (ex. complexometria).

​În ceea ce priveşte natura reacţiilor care stau la baza metodelor volumetrice,
clasificarea acestora este:
a.) metode de titrare acido-bazică sau neutralizare
b.) metode de titrare redox (permanganometria, iodometria)
c.) metode de titrare prin formare de complecşi (complexometria)
d.) metode de titrare prin formare de precipitat (ex. argentometria)

Calcule în analiza volumetrică

​Raportul de concentraţie între soluţia reală (aproximativ normală) şi cea teoretică
(exact normală) se numeşte factorul soluţiei.
​Factorul exprimă numărul de ml de soluţie exact normală care echivalează cu 1 ml din
soluţia preparată:
​ unde: Vt - volumul teoretic (a soluţiei exact normale)
​ Vr - volumul real ( a soluţiei preparate)

​Factorul soluţiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluţii etalon şi cu
ajutorul lor se determină factorul soluţiilor aproximativ normale. Soluţiile mai diluate au un
factor subunitar, soluţiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic valoarea factorului
trebuie să fie între 0,8000-1,2000.
​Pe lângă factor concentraţia exactă a soluţiilor se poate exprima şi cu ajutorul titrului.
Titrul unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame din 1 ml soluţie. De
exemplu: pentru o soluţie de NaOH care conţine 4,653 g pe litru titrul are valoarea de
0,004653.

Tehnica titrării
​Pregătirea instrumentelor pentru titrare
​Biureta se spală cu apă distilată şi apoi se clăteşte cu soluţia de titrare de două ori.
După utilizarea mai îndelungată a biuretei este necesară degresarea tubului gradat al acesteia.
Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluţie de detergent.
Se umple biureta cu soluţia de titrare peste gradaţia 0, apoi se scoate pâlnia care a
servit pentru introducerea lichidului în biuretă şi se potriveşte la zero nivelul lichidului lăsând
să cadă încet lichidul în exces într-un vas colector. Dacă robinetul se mişcă greu sau biureta
picură, se scoate robinetul, se şterge de umezeală şi se unge cu un strat subţire şi uniform de
vaselină. Partea inferioară a manşonului robinetului se usucă cu ajutorul hârtiei de filtru şi
apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer prezente în biuretă pot să cauzeze
erori la titrare ceea ce impune îndepărtarea lor.
​Modul de lucru:
​La începutul titrării dăm drumul soluţiei din biuretă în picături repezi agitând în
continuu conţinutul flaconului Erlenmayer, în care se găsesc, exact măsurat, volumul soluţiei
de titrat plus indicatorul. De obicei se observă o schimbare temporară de culoare a
indicatorului în locul unde cad picături de reactiv în soluţie. Spre sfârşitul titrării concentraţia
substanţei de dozat scade şi la contactul picăturilor de reactiv cu soluţia de dozat schimbarea
temporară a culorii soluţiei este mai persistentă. În această fază viteza de picurare se reduce
treptat în aşa fel încât după adăugarea ultimei picături necesare, să fie posibilă închiderea
rapidă a robinetului. Picătura aderată pe vârful biuretei se introduce în vasul de titrare prin
atingerea de peretele interior al acestuia şi se amestecă cu lichidul de titrat aplecând vasul în
direcţia lichidului ce se prelinge pe peretele vasului. Titrarea se consideră terminată când
ultima picătură produce o schimbare slabă dar sesizabilă şi stabilă a culorii lichidului.
Erorile determinărilor volumetrice
​În analizele chimice pot interveni două tipuri de erori:
​- erori sistematice
​- erori întâmplătoare
​Erorile sistematice au valori constante şi sunt întotdeauna pozitive sau negative.
​Erorile întâmplătoare au valori şi semne diferite. Ele se pot elimina prin efectuarea
unui mare număr de determinări şi prin calcularea mediei aritmetice a volumelor de
echivalenţă cu valori apropiate. Volumele de echivalenţă ale căror valori sunt exagerat de
îndepărtate se exclud
​Practic se efectuează titrarea a trei probe paralele efectuându-se media aritmetică între
volumele de echivalenţă identice sau cele cu valoare foarte apropiată. Se acceptă o diferenţă
între volumele de echivalenţă mai mică sau egală cu 0,2 ml. Să luăm un exemplu. Volumele
de echivalenţă obţinute la titrarea a trei probe paralele sunt: V1 = 7 ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4
ml. Diferenţele V3 - V1 şi V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml, deci V3 se exclude. Volumul mediu
() luat în calcul va fi în acest caz media aritmetică dintre V1 şi V2 şi are valoarea de 7,05 ml.
Dacă toate probele au valori foarte diferite rezultatele nu sunt interpretabile iar titrările trebuie
să fie repetate.
Surse de erori
​Eroarea de paralaxă ( eroarea de citire) intervine la citirea incorectă a nivelului soluţiei
din vasul de măsurat. Volumul de soluţie într-un vas de măsurat este egal cu volumul nominal
al vasului în cazul în care punctul inferior al meniscului lichidului este tangent la cota de pe
vas. Pentru citirea corectă a poziţiei meniscului ochiul observatorului trebuie să fie pe
orizontală într-un plan tangent la menisc iar vasul trebuie să aibă o poziţie verticală.
 Vorbim despre eroarea de paralaxă în minus când ochiul observatorului este deasupra
acestei orizontale, respectiv eroare de paralaxă în plus, când ochiul se găseşte sub nivelul
orizontului. Pentru evitarea erorii de paralaxă se folosesc biuretele Schellbach care sunt
prevăzute cu o dungă albastră pe un fond alb. La nivelul meniscului dunga albastră se
întrerupe formând două vârfuri ascuţite care se ating într-un punct. Se citeşte poziţia acestui
punct de contact.
​Eroarea de scurgere se datorează faptului că soluţiile apoase umezesc sticla şi, la
golirea rapidă o parte din lichid aderă pe suprafaţa biuretei, deci soluţia nu se scurge cantitativ
în vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe parcursul titrării trebuie
să fie mică.
​Eroarea de picurare
​În analiza volumetrică, soluţiei de analizat i se adaugă soluţia titrată până când ultima
picătură produce o schimbare sesizabilă şi stabilă a culorii soluţiei. În cele mai multe cazuri
acest efect se datorează unui exces a soluţiei cu care se titrează. Pentru reducerea acestui
exces, ciocul biuretei trebuie să fie cât mai subţire pentru ca picăturile de titrant să fie cât mai
mici.
​Eroarea de temperatură
​Vasele de măsurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o
0
anumită temperatură (20 C). Diferenţa dintre temperatura de etalonare a vasului şi
temperatura reală a soluţiei de măsurat determină o diferenţă de volum, care poartă denumirea
de eroare de temperatură. Se poate evita această eroare prin respectarea temperaturii de
0
etalonare. Diferenţele mici de 1-2 C sunt, în majoritatea cazurilor, neglijabile.

Acidimetria volumetrică
Titrări acido-bazice
În titrările de neutralizare, stabilirea volumului de echivalenţă sau de neutralizare se
face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am arătat sunt în formă neionizată acizi
slabi (AH) sau baze slabe (B). În tabelul de mai jos sunt exemplificaţi mai mulţi indicatori
acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau bază. Sunt incluşi şi câţiva din indicatorii
utilizaţi la determinarea pH-ului (vezi mai sus). Evident, tăria acestor acizi creşte către cel al
cărui interval de pH este cel mai mult sub valoarea 7.
Pentru prepararea soluţiilor de indicatori se folosesc ca solvenţi apa, dar mai ales
alcool apos, cei mai mulţi în concentraţie de 0,1 %.

Indicatorul AH = acid; B = bază Interval de pH Culorile limită

Acidă Alcalină
Albastru de timol (AH) 1,2 - 2,8 roşie galbenă
Albastru de bromfenol (AH) 3,0 - 4,6 galbenă vilet-albastră
Metiloranj (B) 3,1 - 4,4 roşie oranj
Verde de bromcrezol (AH) 4,0 - 5,6 galbenă albastră
Roşu de metil (AH) 4,4 - 6,2 roşie galbenă
Purpură de bromcrezol (AH) 5,2 - 6,8 galbenă purpurie
Albastru de bromtimol (AH) 6,2 - 7,6 galbenă albastră
Roşu neutral (B) 6,8 - 8,0 roşie galbenă
Roşu de crezol (AH) 7,2 - 8,8 galben roşie
Fenolftaleină (AH) 8,0 - 10,0 incoloră roşie
Albastru de timol (AH) 8,0 - 9,6 galbenă albastră
Timolftaleină (AH) 9,4 - 10,6 incoloră albastră
Galben de alizarină (AH) 10,0 - 12,0 galben liliachie

Titrarea unui acid tare cu o bază tare

​Principiu: În cazul titrării unui acid tare, de exemplu HCl, cu o bază tare, de exemplu
NaOH, la echivalenţă se formează o sare nehidrolizabilă, în exemplul dat NaCl şi mediul
devine perfect neutru. La neutralitate avem:
​ ioni g/l ​pH echiv.
=7
​ pe parcursul titrării este egală cu concentraţia acidului rămas netitrat. După
echivalenţă este egală cu concentraţia bazei introdusă în exces. Pentru alegerea indicatorului
adecvat, este necesară cunoaşterea pH-ului la punctul de echivalenţă. La un exces (eroare) de
1% reactiv pH-ul soluţiei variază brusc. La titrarea unui acid tare cu o bază tare intervalul de
eroare corespunde aproximativ intervalului de pH 4-10, ceea ce înseamnă că se poate folosi
orice indicator care are un interval de viraj între pH 4-10. În figura de mai jos apare curba de
titrare a unui acid tare cu o bază tare cu precizarea a doi indicatori ce permit punerea în
 evidenţă a punctului de echivalenţă (P.E.) al
reacţiei

Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii etalon
​Prepararea unei soluţii de HCl aproximativ 0,1 N
​Ne propunem să preparăm 1 litru sol. HCl aproximativ 0,1 N având la dispoziţie o
soluţie HCl 15% (g/100 g) cu r = 1,075 g/cm .
3

​Din definiţia concentraţiei normale:

​1000 ml HCl 0,1 N conţin 0,1 Eq = 3,65 g HCl
HCl

​100 g HCl 15 % .............15 g HCl

​ x g HCl 15 %............. 3,65 g HCl
​x = 24,33 g HCl 15 %
​r = ​ = = 22,6 ml HCl 15 %
V

​Într-un balon cotat de 1000 ml se introduce o cantitate mică de H O bidistilată, se

2
adaugă 22,6 ml HCl 15 % şi se completează cu H2O bidistilată până la cotă. Omogenizarea
soluţiei se realizează prin agitarea energică.
​Stabilirea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată
​Pentru stabilirea factorului soluţiilor se folosesc soluţiile etalon, stabile din punct de
vedere chimic şi cu factor cunoscut (eventual F = 1,000). O astfel de soluţie etalon se poate
prepara prin cântărirea şi dizolvarea în apă a KHCO3, necesar în titrarea de mai jos.
​Pentru determinarea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată anterior se măsoară
exact cu ajutorul unei pipete câte 10 ml sol. KHCO3 în 3 pahare Erlenmeyer. Se adaugă câte 3
picături de metiloranj şi se titrează, cele trei probe paralele, până la virajul indicatorului de la
galben la portocaliu. CO2 format în urma reacţiei se îndepărtează prin fierberea probelor 2-3
minute. În cazul în care după răcirea probelor culoarea a revenit la galben, se continuă titrarea
până la portocaliu.
​ in cele 3 volume de echivalenţă se face media aritmetică şi se obţine
D HCl
. La baza
calcului stă relaţia:
 ​
HCl
. FHCl = .

​
10 x FKHCO3
de unde ​F HCl = ————
HCl

Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut

​În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml sol. NaOH, se adaugă câte 3
picături de metiloranj şi se titrează cu soluţie titrată de HCl 0,1 N până la virajul indicatorului
de la galben la portocaliu. Concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de NaOH se exprimă în
g/100 ml şi se calculează în felul următor:
​- se face media aritmetică a celor trei volume de echivalenţă şi se obţine HCl

​- conform definiţiei concentraţiei normale, 1000 ml HCl 1 N conţin 1 E gHCl

​- din ecuaţia reacţiei chimice NaOH + HCl = NaCl + H2O rezultă că 1 EqHCl
reacţionează cu 1 EqNaOH deci:
​1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH
1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH
F
HCl HCl
................... x g NaOH
​x = ​- reprezintă g NaOH conţinute în volumul sol. de
​ NaOH titrate (10 ml).
​CNaOH%(m/v) = 10 • x, reprezintă concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de NaOH.
Dozarea amoniacului prin diferenţă

​Principiu:
Metoda directă de dozare a amoniacului cu o soluţie titrată de HCl 0,1 N, în prezenţă
de metiloranj, este în general evitată datorită pierderilor de amoniac prin desorbţie. Este
preferată metoda dozării amoniacului prin diferenţă. Soluţia de amoniac se tratează cu un
volum de soluţie titrată de HCl, ce conţine un exces de acid şi se determină excesul de HCl
prin titrare cu o soluţie titrată de NaOH în prezenţă de metiloranj. Reacţiile sunt următoarele:
NH3 + HCl = NH4Cl; ​NaOH + HCl = NaCl + H O.
2

​Reactivi: ​- Soluţie de HCl 0,1N cu factor cunoscut

​- Metilorange, soluţie alcoolică 0,1% ​
​Modul de lucru:
​În trei flacoane Erlenmeyer se introduc câte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluţie de NH3, 1-
2 picături de metiloranj şi se titrează excesul de acid cu o soluţie titrată de NaOH 0,1 N până
la virajul indicatorului de la roşu la portocaliu.
​Calcul:
 ​1000ml HCl 0,1 N ................……. ​1,7 g NH 3

​v HCl
FHCl - NaOH FNaOH ...........…x
​x = g NH3/ 5 ml
vHCl FHCl - NaOH FNaOH = volumul teoretic de HCl, obţinut pe cale titrimetrică, ce
conţine cantitatea de HCl care a reacţionat cu NH3 din probă; vHCl = 10 ml; NaOH
0,1 N
= media aritmetică a volumelor de echivalenţă obţinute la titrarea celor 3
probe paralele.
Concentraţia soluţiei de amoniac se exprimă în g/100 ml, adică C NH3 %(m/v) = 20 • x
Titrarea unui acid slab cu o bază tare
​Principiu:
La titrarea unui acid slab cu o bază tare se formează o sare hidrolizabilă. De exemplu
titrarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH implică următoarele procese chimice:

​
​ ​

​Din ecuaţii reiese că anionii acidului slab, rezultaţi

+
prin ionizarea completă a sării, se combină cu H rezultaţi în urma procesului de disociere a
H2O . Astfel descreşte, iar > ceea ce determină reacţia alcalină a soluţiei. La punctul de
echivalenţă soluţia are un pH > 7. În general, soluţiile apoase ale sărurilor acizilor slabi cu
baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al cărui interval de viraj conţine valoarea pH-
ului soluţiei sării hidrolizabile. În cazul de faţă este folosit indicatorul fenolftaleină, al cărui
interval de viraj este cuprins între 8-10 unităţi de pH. Aşa cum se vede în figura de mai jos, în
care acidul slab este CH3COOH, folosirea unui indicator cu interval de viraj în mediul acid
nu permite punerea în evidenţă cu precizie punctul de echivalenţă al reacţiei

Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH

​Reactivi: ​- Soluţie NaOH 0,1N cu factorul cunoscut
- Soluţie alcoolică de fenolftaleină 0,1%
​Modul de lucru:
 ​În trei flacoane Erlenmayer se măsoară câte 10 ml soluţie acid lactic, se adaugă 3-4
picături de fenolftaleină şi se titrează cele trei probe cu o soluţie titrată de NaOH 0,1 N, până
la virajul indicatorului de la incolor la roz slab persistent cel puţin 20 de secunde .
​ oncentraţia acidului lactic se exprimă în procente mixte şi se calculează în felul
C
următor:
​1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic
​F NaOH
............................ x
​ x = g/10 ml c% (m/v) = 10 • x

Titrarea unei baze slabe cu un acid tare

​Principiu: ​
La titrarea unei baze slabe cu un acid tare se formează o sare hidrolizabilă, pH-ul în
punctul de echivalenţă fiind mai mic decât 7. În general soluţiile apoase ale sărurilor acizilor
tari cu baze slabe sunt acide. De exemplu titrarea unei soluţii de NH3 cu o soluţie titrată de
HCl implică următoarele procese chimice:

​
​Ionii OH -
rezultaţi în urma procesului de disociere a H2O au tendinţa de a reacţiona cu
o parte din ionii de amoniu formaţi. Astfel descreşte, iar > ceea ce determină reacţia acidă a
soluţiei. La punctul de echivalenţă soluţia are un pH < 7. Prin urmare se alege acel indicator
al cărui interval de viraj conţine pH-ul soluţiei sării rezultate în urma titrării (NH4Cl). În acest
caz se poate folosi metiloranjul (figura de mai jos).

Titrările acizilor slabi cu baze slabe (şi invers), nu produc variaţii bruşte şi mari a pH-
ului în jurul punctului de echivalenţă. De aceea ele sunt rar utilizate în titrimetria acido-
bazică.

Oxidimetria volumetrică
 ​Date generale
​În oxidimetrie toate reacţiile chimice au loc cu transfer de electroni, ele denumindu-se
oxido-reduceri sau reacţii redox.
După reactivii utilizaţi oxidimetria se poate împărţi în:
a) Permanganometria, care foloseşte drept componentă oxidantă KMnO4.
-
b) Iodometrie, în care ca reactiv se foloseşte I2 sau I , ca oxidant respectiv reducător, după caz.
c) Alte procedee [bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie (K2Cr2O7),
iodatometrie (KIO3)] utilizează compuşii precizaţi între paranteze ca oxidanţi.

​Reacţiile redox pot fi utilizate în vederea unor dozări, dacă ele întrunesc anumite
condiţii:
- să fie totale în sensul dorit ( adică să fie cantitative),
- să decurgă cu viteză mare, pentru ca deteminările să se efectueze într-un timp scurt,
- să se poată observa uşor punctul de echivalenţă, care arată sfârşitul reacţiei chimice.
​Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacţii redox cuprinde procedee de
determinare cantitativă, care se realizează prin titrarea substanţelor reducătoare cu oxidanţi şi
a substanţelor oxidante cu reducători.
​ ajoritatea reacţiilor redox sunt reversibile, al căror echilibru dinamic poate fi
M
deplasat într-un sens sau altul în funcţie de condiţiile de lucru.
​Ca în oricare altă metodă volumetrică şi în oxidimetrie (titrimetria redox) se urmăreşte
atingerea punctului de echivalenţă care se poate indica vizual sau instrumental. De exemplu,
în permanganometrie, permanganatul de potasiu este o substanţă colorată ce poate să
funcţioneze ca indicator, fiindcă un mic exces de reactiv produce o schimbare de culoare uşor
sesizabilă. În cazul titrărilor iodometrice, la punctul de echivalenţă poate să apară un exces de
iod molecular sau să dispară acest exces, ceea ce se poate indica cu ajutorul amidonului ştiut
fiind că amidonul formează cu I2 un complex violet intens colorat.

Permanganometrie
​Principii: ​
Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanţii cei mai folosiţi, datorită
- 2+
potenţialului de oxidare mare al sistemului MnO4 /Mn . Oxidarea se poate efectua atât în
mediu acid cât şi în mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidantă a permanganatului scade mult
cu creşterea pH-lui soluţiei. Reacţiile care se petrec în diferite medii sunt cele arătate mai
înainte la calcularea echivalenţilor-gram ai KMnO4.
Rescrierea simplificată a lor pune în evidenţă numărul de electroni acceptaţi de o
moleculă de oxidant:
​- în mediu acid KMnO acceptă 5 electroni/moleculă:
4

​MnO + 8H + 5e <=> Mn + 4H O; ​
4
- + - 2+
2

​- în mediu neutru sau aproape neutru se transferă 3 electroni:

​MnO + 4H + 3e <=> MnO + 2H O
4
- + -
2 2
​
 ​- în mediu alcalin, acceptă un singur electron:
​MnO + e <=> MnO
4
- -
4
2-
​
​Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violetă, aproape neagră. Lumina,
creşterea temperaturii, a diluării, a acidităţii sau a alcalinităţii soluţiei, prezenţa corpilor străini
mai ales în pulbere, accelerează descompunerea permanganatului. De aceea soluţiile de
KMnO4 se păstrează în soluţie neutră, în sticle brune (la întuneric) şi la temperatura obişnuită.

Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N

Având în vedere instabilitatea KMnO4 este necesară determinarea periodică a
factorului soluţiei de KMnO4 folosindu-se ca substanţă etalon acidul oxalic.
Reactivi: ​- Soluţie (COOH) 0,1N cu factor cunoscut
2

​- Soluţie H SO 20% 2 4
Modul de lucru:
În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de acid oxalic 0,1N cu factor
cunoscut, se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%, se încălzeşte la 70-80°C şi se titrează cu KMnO4
0,1N până la roz slab, persistent cel puţin 10 secunde.
Factorul soluţiei de KmnO4 se calculează după formula:
VKMnO4 × F KMnO4 = V acid oxalic × F acid oxalic unde VKMnO4 este media aritmetică a volumelor de
echivalenţă a celor trei probe paralele.
​ Vacid oxalic • Facid

oxalic ​
​F KMnO4
= ———————

VKMnO4

Determinări permanganometrice în mediu acid

​Permanganatul de potasiu în mediu puternic acid (H SO 2 4
20%), la temperatura de 70-
80 °C, se reduce la sarea manganoasă (MnSO4) punând în libertate oxigen, conform reacţiei
cunoscute
​2KMnO 4
+ 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O +5[O]

​Reacţia
decurge autocatalitic deoarece ionii manganoşi (Mn şi Mn ) formaţi în
2+ 3+

primul moment catalizează reducerea în continuare a permanganatului de potasiu.

Decolorarea soluţiei se produce datorită faptului că MnSO4 format este incolor în soluţii
diluate.
​Soluţia acidă de permanganat serveşte în oxidimetrie, pentru dozarea volumetrică a
acidului oxalic, a apei oxigenate şi a altor substanţe (acidului azotos, etc). Sfârşitul titrării se
-
recunoaşte prin dispariţia sau apariţia culorii violete determinate în soluţie de ionul MnO4 .
 ​
Dozarea acidului oxalic (micrometodă)
Principiu:
Reacţia titrimetrică este următoarea:
5(COOH)2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +10CO2 +8H2O
Reactivi: ​- Soluţie H SO 2 4
20%
-​ Soluţie KMnO4 0,01 N cu factor, FKMnO4, cunoscut
Modul de lucru:
​În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 1 ml soluţie de acid oxalic de dozat. Se
adaugă câte 1 ml H2SO4, 2 ml apă bidistilată şi se încălzeşte până la 70-80°C. Se titrează cu
KMnO4 0,01N până când soluţia rămâne colorată în roz slab cel puţin 10 secunde.
​Calcul
1000 ml KMnO4 0,01N reacţionează cu 0,01 Eq-gram de acid oxalic= 0,45 g acid oxalic
​V KMnO 4
F KMnO4 ............................................................ x g acid oxalic

​x g (COOH) ………...........................……………………
2
​1 ml soluţie
​ ​c%(m/v) = 100•x
​Această reacţie nu se produce direct: o picătură de soluţie de permanganat nu se
decolorează imediat când este adăugată într-o soluţie conţinând exces de acid oxalic şi
-
sulfuric. Culoarea roz a soluţiei (datorată prezenţei ionului MnO4 ) persistă, dispărând numai
după un anumit interval de timp deoarece reacţia redox corespunzătoare are o cinetică lentă
3+ 3+ +2
până la formarea catalizatorului (Mn ). Apoi ionii Mn se reduc la Mn , care este un proces
-
instantaneu. În ultima etapă manganul (II) format reacţionează rapid cu ionul MnO4 (VII),
formându-se Mn (III) foarte reactiv care oxidează acidul oxalic, finalul titrării fiind
-
determinat de epuizarea (COOH)2 din probă şi apariţia unui mic exces de ioni MnO4 care
colorează persistent soluţia de titrat. Secvenţa de reacţii ale procesului autocatalitic este
următoarea:
​(1) Mn(VII) + (COOH)2 -------> Mn(III) +CO2 (lent)
​(2) Mn(III) + (COOH)2 -------> Mn(II) + CO2 (instantaneu)

​(3) Mn(II) + Mn(VII) ---------> Mn(III) ​ (rapid).

În stadiul iniţial viteza reacţiei este controlată de etapa lentă (1). De îndată ce concentraţia
ionilor Mn(II) devine apreciabilă, reducerea permanganatului poate să se desfăşoare rapid pe
-
calea procesului (3). Spre finalul titrării culoarea MnO4 dispare tot mai greu datorită scăderii
concentraţiei acidului oxalic. Reacţia este accelerată în final, ca şi la început, prin încălzire la
70-80ºC .

Dozarea apei oxigenate (macrometodă)

Principiu:
Dozarea se poate face tot prin titrarea directă cu permanganat în soluţie de acid
sulfuric. Apa oxigenată (peroxid de hidrogen) funcţionează atât ca oxidant, după reacţia:
 H2O2+2H +2e
+ -
® 2H O; cât şi ca reducător, după reacţia: H O Û 2H +O ;
2 2 2
+
2

​În soluţie acidă permanganatul de potasiu este redus după reacţia:

5H2O2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +8H2O +5O2

Modul de lucru:
În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de apă ​oxigenată de dozat.
Se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%. Se titrează cu soluţie de KMnO4 0,1N cu factor, FKMnO4,
cunoscut până când soluţia rămâne colorată în roz slab.

​Calcul: ​
​1000 ml KMnO 4
0,1N sunt echivalenţi cu ​...................1,7 g apă oxigenată
​V KMnO4 F KMnO4
............................................................ x g apă oxigenată

​x g H O …………………………………………………
2 2
10 ml soluţie
​c% (m/v) = 10•x

Iodometrie
​Principiu:
Metoda se bazează pe sistemul redox:
-
I2 + 2e <=> 2I- al cărui potenţial redox standard biochimic este E0¢ = 0,62 V (pH = 7)
-
În soluţii de iodură conţinând ionul I3 , reacţia redox şi valoarea potenţialului redox standard
biochimic sunt:
​I 3
-
+ 2e
-
<=> 3 I -
​E ¢ = 0,54 V
0
​(pH=7)
​În aceste reacţii, iodul molecular este oxidant, iar substanţele care au un potenţial
redox mai mic decât + 0,54V vor fi oxidate de către iod şi se vor putea determina uşor. Un
exemplu este reacţia cu tiosulfat:
​I 2
+ 2S2O3
2-
® 2I +S O-
4 6
2-
(ioni tetrationat)

​Substanţele care au potenţial redox mai mare (substanţele oxidante), cum este ionul
3+
Fe , pun în libertate iodul molecular conform reacţiei:
​2Fe 3+
+ 2I
-
® 2Fe 2+
+ I2

​Calculul de bază al iodometriei este deci următorul: din cantitatea de iod eliberat de un
oxidant sau din cantitatea de I2 redusă de un reducător se poate calcula cantitatea oxidantului
sau reducătorului.
​Sfârşitul reacţiei dintre substanţa de analizat şi iod, în prezenţă de iodură, este
determinată cu ajutorul amidonului, care formează un compus colorat intens albastru, de
forma [(C6H10O5)4I]4 ·KI. Sensibilitatea indicatorului este mare, punându-se în evidenţă circa
1,5 mg iod la litru de soluţie, (~10 N) acidulată cu HCl sau H2SO4. Creşterea temperaturii
-5

soluţiei de titrat sau prezenţa alcoolului metilic sau etilic micşorează sensibilitatea
indicatorului.
​Tot ca indicator în iodometrie se poate folosi o soluţie alcoolică 0,2% de a-naftol-
flavonă, care cu iodul dă un compus colorat tot în albastru. Acest indicator este însă mult mai
sensibil decât amidonul şi se poate folosi la titrarea soluţiilor mai diluate de iod (~10 n) sau
-3

la titrarea iodometrică a soluţiilor colorate, în lumină ultravioletă când, la un exces de iod,

fluorescenţa albastră a indicatorului dispare. În acelaşi mod se foloseşte şi rodamina B, a cărei
fluorescenţă roşie la lumina ultravioletă dispare în prezenţa unui mic exces de iod.

Dozarea substanţelor reducătoare

​Substanţele reducătoare pot fi dozate în două feluri:
- substanţa de dozat se titrează direct cu soluţie de iod,
- substanţei de dozat i se adaugă soluţie de iod în exces şi excesul de iod se titrează cu o
soluţie de tiosulfat de sodiu cu factor cunoscut. Sfârşitul acestor titrări poate fi determinat cu
unul din indicatorii prezentaţi mai sus.
​Reacţia titrimetrică este: 2Na S O
2 2 3
+ I2 → 2NaI + Na2S4O6
​
Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N
​Principiu:
​În cazul soluţiei etalon de permanganat de potasiu au loc următoarele reacţii:
10 KI + 2 KMnO4 + 16 HCl = 12 KCl + 2 MnCl2 + 5 I2 + 8 H2O
I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
​Reactivi: ​- Soluţie de KMnO 4
0,01 N cu factorul FKMnO4
​- Soluţie de HCl 15%
​- Soluţie de KI 0,5%
​Modul de lucru:
​În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de permanganat 0,01 N, se
adaugă câte 5 ml soluţie de HCl 15% şi 10 ml soluţie de KI 0,5%.
​După 5 minute de repaus se titrează cu tiosulfat de sodiu iodul pus în libertate până la
culoarea galben-deschisă a soluţiei. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon 0,5% şi se continuă
titrarea până la albastru pal agitând puternic. O picătură de soluţie de tiosulfat în exces
decolorează complet soluţia.
​Calcul:
​Se foloseşte formula VNa2S2O3•FNa2S2O3 = VKMnO4•FKMnO4

VKMnO4•FKMnO4
 adică FNa2S2O3 = —————— ​
VNa2S2O3

Dozarea substanţelor oxidante

​Din soluţia de KI oxidanţii pun în libertate iod elementar. Cantitatea de iod pus în
libertate este echivalentă cu cantitatea substanţei oxidante adăugate. Iodul elementar pus în
libertate se dozează prin titrare cu tiosulfat de sodiu care reduce iodul la ioni de iodură
conform reacţiei de mai sus.
​
Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometodă)
Principiu:
- 3-
Iodul rezultat prin oxidarea ionilor I de către ionii [Fe(CN)6] conform reacţiei,
3- - 4-
2 [Fe(CN)6] + 2 I ↔ 2 [Fe(CN)6] + I2, este titrat cu tiosulfat de sodiu în prezenţa
amidonului ca indicator. Reacţia are loc în mediu slab acid (CH3COOH) însă, fiind
2+
reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin adaosul de ioni Zn din amestecul
CH3COOH – ZnSO4. Are loc reacţia:
2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 → K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4
Ireversibilitatea acestei reacţii se datorează insolubilităţii sării duble a ferocianurii.
​Reactivi: ​- Soluţie KI 0,5 %
​- Soluţie CH COOH - ZnSO
3 4
(3% fiecare)
​- Soluţie Na S O 2 2 3
0,01 N cu factor cunoscut
​- Soluţie amidon 0,5 %
Modul de lucru:
În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă câte
10 ml soluţie de KI şi 15 ml CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează cu soluţie de
tiosulfat de sodiu 0,01N iodul pus în libertate până la decolorarea aproape completă a soluţiei.
Se adaugă 2 ml soluţie de amidon şi se continuă titrarea până la dispariţia culorii albastre.
​Calcul:
1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]
​V•F Na2S2O3.
......................................…………....x g

​x g K [Fe(CN) ]……………………………….10 ml sol

3 6

​c%(m/v) = 10 • x
Dozarea K [Fe(CN) ] (micrometodă)
3 6

Principiu şi reactivi: sunt aceeaşi ca şi la macrometodă.

Modul de lucru:
În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 2 ml apă bidistilată. Se adaugă cu ajutorul
micropipetei câte 0,10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă câte 1 ml soluţie de KI şi 1,5 ml
CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează iodul eliberat cu soluţie de tiosulfat de sodiu
0,01N în prezenţa de 0,2 ml amidon până la dispariţia culorii albastre.

Calcul:
1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]
​V•F Na2S2O3.
......................................…………....x g

​x g K [Fe(CN) ]……………………………….0,1 ml sol

3 6

​c%(m/v) = 1000 • x
​
-
Sistemul I2/I se găseşte în concentraţie foarte mică în apa de mare (0,05 mg/l), deoarece iodul
este legat în cea mai mare parte sub formă organică. Plantele marine extrag iodura din apa de
mare. Iodura se regăseşte în cenuşa acestor plante. Se mai găseşte iodură în cantităţi variabile
3
(7-46 g/m ) în apele fosile care însoţesc petrolul şi, în concentraţii mai mici, în unele ape
minerale.
​Iodul apare, în concentraţii foarte mici, în toate vieţuitoarele şi este indispensabil
pentru viaţa acestora. La animalele superioare, iodul este concentrat în glanda tiroidă într-o
proteină numită tireoglobulină. Lipsa de iod în apa de băut, în special în unele regiuni
muntoase, determină apariţia, la populaţia acelor regiuni, a unor maladii ale glandei tiroide
(guşă).

Complexometria volumetrică
​Metodele complexometrice servesc la dozarea cationilor prin titrare cu soluţia
agentului complexant. Prin metodele indirecte se pot doza complexometric şi anioni, precum
şi substanţele organice. Din numărul mare de reactivi unul frecvent folosit este complexonul
2+
III (EDTA Na2) utilizat spre exemplu pentru titrarea ionilor Ca .

complexon III ​complexonat de

(etilendiamino-tetraacetatul disodic) ​ calciu ​
​
 ​Existenţa mai multor cicluri pentaatomice imprimă moleculei o mare stabilitate.
Stabilitatea complexului format este una din condiţiile pe care trebuie să o îndeplinească o
reacţie care stă la baza unei metode complexometrice. Stabilitatea se exprimă cantitativ prin
constanta de stabilitate KMY. Dacă notăm cu M ionul de metal şi cu Y agentul de complexare,
reacţia de complexare este următoarea:
​ ​
Constanta de stabilitate este exprimată prin relaţia:
Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului şi de o serie de alţi factori,
cum ar fi pH-ul soluţiei.
​Indicatorii folosiţi în complexometrie sunt indicatorii metalocromici, coloranţi
organici, care formează complecşi interni cu cationii metalici, de altă culoare decât aceea a
indicatorului liber. ​ ​
​Indicatorul trebuie să fie ales în aşa fel încât stabilitatea complexului format de el cu
ionii de metal să fie mai mică decât stabilitatea complexului format agentul de complexare cu
ionii metalici. În tabelul de mai jos sunt prezentaţi principalii indicatori metalocromici,
cationii pentru care sunt folosiţi şi logaritmul constantelor de stabilitate ale lor în mediile
precizate.

Indicator lg KMY
Cationi Mediu
metalcromic
Eriocrom negru T Cd2+ NaClO4 0,3N 12,74
Co2+ - 20,00
Cu2+ NaClO4 0,3N 21,38
Mg2+ - 7,00
Pb2+ NaClO4 0,3N NaClO4 13,19
Zn2+ 0,3N 12,31
Murexid Ca2+ - 2,68
Cu2+ - 3,50
Ni2+ KNO3 0,1N 3,36
Acid sulfosalicilic Al3+ NaClO4 0,2N 10,01
Cu2+ NH4ClO4 0,2N 9,04
Fe3+ - 14,05
 Ftaleincomplexon Ba, Sr, Ca
Xilenoloranj Be2+ NaClO4 3,92
Bi3+ NaNO3 0,2N NaClO4 75,60
La3+ 0,2N 11,67
Pb2+, Zn2+, - -
2+ 2+
Hg , Sn - -
Acid calconcarbonic Ca2+ - -
Cromazurol S Al3+ KCl 0,2N 4,32
Cu2+ NaClO4 0,1N 4,10
Fe3+ KCl 0,1N 15,60
Ni2+ - 9,30
, `- Dipiridil Fe2+ KCl 0,1N 3,70
Zn2+ KCl 0,1N 4,35

Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică

(metoda Budesinsky)
Principiu :
​Fosfatul cupric, greu solubil în apă, reacţionează în mediu neutru cu aminoacizii
formând complecşi de tipul chelaţilor. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic
2+
complexează ionii Cu în raport de 2:1 formând un complex solubil în apă. Reacţia este
următoarea:

​
​Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare. Prin
adăugare de HCl la filtrat se eliberează ionii cuprici din complex conform reacţiei:

​Ionii cuprici eliberaţi se dizolvă prin titrare cu complexon III în prezenţa indicatorului
metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacţia titrimetrică de complexare este următoarea:
 ​Reactivi: ​- soluţie complexon III 0,01N cu factor cunoscut
- soluţie HCl 0,01N
- indicator PAN 0,1 % în soluţie etanolică
- suspensie de Cu3(PO4)2
Modul de lucru:
​În trei flacoane Erlenmeyer se pipetează câte 5 ml soluţie aminoacid, 5 ml suspensie
agitată de Cu3(PO4)2, se agită bine şi apoi se lasă 5 minute în repaos. Amestecul se filtrează şi
din filtrate se pipetează câte 5 ml în trei flacoane Erlenmeyer curate. Se adaugă către 1 ml
2+
soluţie HCl, 3 picături indicator PAN şi se titrează ionii Cu eliberaţi cu o soluţie de
complexon III 0,01 M până la virajul indicatorului de la roşu violet la galben-verzui.
Calcul:
​Dacă se cunoaşte natura aminoacidului prezent se ia în calcul masa moleculară a lui.
Dacă este vorba de un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici rezultatul se
exprimă în mg N a-aminic/100 ml sau mmoli N a-aminic/l.

​1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01 2 14 g N

​ FComplexon III
................................... .............................. x

​x = .......g/ 2,5 ml c% (m/v) = 40 • x

Volumetria prin reacţii de precipitare

Principii:
​Soluţia de reactiv formează cu componentul de dozat un precipitat insolubil. Din
volumul reactivului folosit pentru precipitarea completă a componentului de dozat se
calculează cantitatea componentului respectiv. Pot fi utilizate numai acele reacţii, la care
precipitatul format are compoziţie constantă, reacţia decurge rapid şi punctul de echivalenţă
poate fi indicat. Fiecare metodă necesită indicator aparte. Dacă în cursul titrării se formează
precipitat alb sau de culoare deschisă, putem folosi un indicator care cu ionul de dozat sau cu
excesul reactivului dă reacţie de culoare sau precipitat colorat. Dintre metodele bazate pe
reacţii de precipitare cea mai des utilizată este argentometria, în care se întrebuinţează ca
+ - - - -
reactiv AgNO3. Azotatul de argint (ionii de Ag ) formează cu ionii Cl , Br , I , SCN
precipitate practic insolubile.
 ​Prepararea unei soluţii de AgNO 3
0,01N
​Azotatul de argint chimic pur se deshidratează la 210-250ºC. După răcire se cântăreşte
cantitatea necesară (1,6989 g/l) se dizolvă şi se completează cu apă distilată la volumul
necesar. Dacă nu se măsoară exact cantitatea teoretică de AgNO3, soluţia va avea factorul:
​ ​ Cantitatea măsurată
F AgNO3 = ————————
​ 1,6989

Soluţia se păstrează în sticlă brună.

​
Stabilirea factorului soluţiei de NH4SCN 0,01 N
​Principiu: ​
În vederea determinării, un volum precis de AgNO3 0,01 N (cu factorul cunoscut) se
titrează cu NH4SCN. Are loc reacţia:
AgNO3 + NH4SCN = AgSCN + NH4NO3
Drept indicator serveşte alaunul feric. Indicarea sfârşitului titrării are loc prin
3+ -
următoarea reacţie: Fe + 3 SCN = Fe(SCN)3
Formarea sulfocianurii de fer, substanţă intens colorată în roşu, indică un mic exces de
NH4SCN.
Modul de lucru:
În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie 0,01 N AgNO3 cu factorul
cunoscut. Se adaugă 5 ml HNO3 10% şi 2 ml alaun feric ca indicator. Se titrează cu soluţia de
NH4SCN 0,01 N, agitând puternic, până la roz pal persistent. Se calculează factorul din
relaţia:
VSCN¯•F SCN¯ = VAgNO3•F AgNO3

Dozarea clorurilor prin metoda Volhard

​Principiu:
​Dozarea indirectă a ionului de clor după Volhard constă în următoarele etape. La
soluţia de analizat, acidulată cu HNO3, se adaugă în exces o soluţie titrată de AgNO3. Are loc
reacţia:
AgNO3 + Cl¯ = AgCl + NO3¯ Excesul de azotat de argint se titrează cu sulfocianură în
3+
prezenţă de Fe ca indicator. AgNO3 + SCN¯ = AgSCN + NO3¯
​Modul de lucru:
​În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie care conţine ionii de Cl¯, se
adaugă 20 ml soluţie 0,01N de azotat de argint 10 ml acid azotic 10% se aduce la fierbere, se
adaugă 2 ml alaun feric 20%. Se titrează cu o soluţie 0,01 N de NH4SCN agitând puternic,
până la roz slab, persistent timp de 5 – 10 secunde.
​Calcul:
 ​Rezultatul se va exprima în mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferenţă,
raţionamentul este identic cu cel din cazul determinării amoniacului.

Identificarea glucidelor

Reacţii de reducere
​Reacţiile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reducătoare, ele fiind date şi de
alte substanţe neglucidice cu caracter reducător. Caracterul reducător al monozaharidelor şi a
unor dizaharide este datorat prezenţei în molecula lor a funcţiunii carbonilice, care se poate
oxida, reducând la cald şi în mediu alcalin cationii metalelor grele: Cu, Ag, Bi, precum şi
unele substanţe organice ca acidul picric, indigoul, etc.

​1. Reacţia Fehling

Principiu:
​Gruparea 2+
carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu până la Cu din
+

complexul solubil format în mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu şi
potasiu). Se formează Cu2O, pulbere de culoare roşie-cărămizie, conform reacţiilor:
CuSO4 + 2KOH → Cu(OH)2 + K2SO4
C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
acid gluconic

Reactivi: ​- Reactivul Fehling se obţine în urma amestecării soluţiei I şi II în

volume egale, operaţie ce se desfăşoară în momentul întrebuinţării.
​- Soluţia I: CuSO 4
35 g/1000 ml soluţie
​- Soluţia II: 150 g sare Seignette şi 90 g NaOH la 1000 ml soluţie
-​ Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Modul de lucru:
​Se amestecă într-o eprubetă 1 ml reactiv Fehling I cu 1 ml reactiv Fehling II se adaugă
2 ml soluţie de glucid şi se încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În prezenţa unui
glucid reducător se formesază un precipitat roşu-cărămiziu de Cu2O.

​2. Reacţia Benedict

Principiu:
​Glucidele reducătoare reduc la cald în mediu alcalin hidroxidul de cupru de culoare
albastră în oxid de cupru (I) de culoare roşie-cărămiziu. Reacţia Benedict prezintă avantajul
2+
că se foloseşte un singur reactiv, ionul de Cu fiind complexat în soluţie de către citratul de
sodiu.
Reactivi: ​- Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu şi 100 g Na2CO3 anhidru se
dizolvă în 800 ml H2O distilată fierbinte, se filtrează şi se aduce
 volumul la 850 ml. Se dizolvă separat 17,3 g CuSO4• 5 H2O în 100 ml
H2O distilată, se adaugă sub agitare primei soluţii şi se completează
volumul soluţiei finale la 1000 ml.
​- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Mod de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucid şi 3 ml reactiv Benedict, se
încălzeşte până la fierbere agitând continuu. Apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu implică
existenţa în soluţie a glucidului reducător.

​3. Reacţia Tollens

Principiu:
​Glucidele +
reducătoare reduc la cald Ag , din azotatul de argint amoniacal, la Ag
metalic care se depune pe pereţii eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint),
conform reacţiilor:
AgNO3 + NaOH → AgOH + NaNO3
AgOH + 2 NH3 → [Ag(NH3)2]OH
C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH → C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O
Reactivi: ​- soluţie AgNO 3
5% în apă distilată
​- soluţie NH OH
4
20%
-​ soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml AgNO3, se adaugă picătură cu picătură soluţie de
amoniac până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 1 ml soluţie glucidică şi se
introduce eprubeta într-o baie de apă încălzită la fierbere. În cazul existenţei unui glucid
reducător în soluţia glucidică se formează oglinda de argint. Încălzirea eprubetei se poate face
şi direct la flacără sub agitare blândă.
​4. Reacţia Nylander
Principiu:
​Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce azotatul de bismut în bismut
metalic de culoare neagră.
Reactivi: -​ Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare Seignette
şi 100g NaOH se dizolvă în apă pentru 1000 ml soluţie.
​- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 1 ml reactiv Nylander, se
încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În prezenţa unui glucid reducător în soluţie apare
un precipitat negru-brun.

​5. Reacţia Barfoed

 Principiu:
​Reacţia ​ Barfoed permite diferenţierea monozaharidelor reducătoare, pentru care
reacţia este pozitivă, de dizaharidelor reducătoare pentru care reacţia este negativă. Principiul
2+ +
reacţiei constă în reducerea în mediu acid a ionilor de Cu la Cu din Cu2O, care se depune pe
fundul eprubetei sub forma unui precipitat roşu-cărămiziu. De fapt reacţia este potrivită atât
pentru monozaharide cât şi pentru dizaharide reducătoare. Diferenţa constă în vitezele de
reacţie foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici pentru dizaharidele reducătoare.
Reactivi: -​ Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de ​cupru se dizolvă în 200 ml
H2O distilată, se filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.
-​ Soluţii 2% de glucoză, fructoză
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 2 ml reactiv Barfoed, se încălzeşte
până la fierbere agitând continuu timp de 1-2 minute. Apariţia unui inel de precipitat roşu-
cărămiziu la suprafaţa soluţiei şi depunerea de precipitat roşu-cărămiziu pe fundul eprubetei
pune în evidenţă prezenţa monozaharidelor.

​6. Reacţia cu acidul picric

Principiu:
​ lucidele reducătoare reduc una din grupările nitro ale acidului picric (de culoare
G
galbenă) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roşie).

Această reacţie poate servi la dozarea colorimetrică a glucidelor reducătoare (metoda

Crecelius-Seifert).
Reactivi: ​- acid picric 0,5%
​- glucoză 1%
-​ NaOH 10%
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucoză, 2 ml acid picric şi 1 ml NaOH. Se
încălzeşte până la fierbere, agitând continuu până la apariţia unei coloraţii roşii-brune.
​
​Reacţii de culoare
​Reacţiile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub acţiunea acizilor minerali
concentraţi se deshidratează şi se transformă în furfurol sau în derivaţi ai lui.
 ​

​ urfurolul şi derivaţii lui pot reacţiona cu fenolii, în urma reacţiei rezultând compuşi
F
coloraţi.

​1. Reacţia Molisch

Principiu:
​În prezenţa acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se
transformă în furfurol (hidroximetil furfurol) care reacţionează cu -naftolul în raportul 1:2
formând produşi de condensare de culoare violetă. Această reacţie o dau la cald toate
glucidele deorece, sub acţiunea H2SO4 conc. ele hidrolizează punând în libertate
monozaharidele.
 Reactivi: ​- reactivul Molisch: soluţie alcoolică 5% de alfa-naftol
​- H SO
2 4
conc.
​- soluţie de glucoză 1%
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucoză 1%, se adaugă 1-2 picături din soluţia
de alfa-naftol şi apoi se toarnă cu precauţie pe peretele înclinat al eprubetei H2SO4 conc. La
suprafaţa de contact a celor două straturi de lichide cu densităţi diferite se formează un inel
violet.

​2. Reacţia Bial

Principiu:
​Reacţia Bial serveşte la identificarea pentozelor, pentru care reacţia este pozitivă, faţă
de hexoze, ea fiind negativă.
​În prezenţa acizilor minerali tari, pentozele reacţionează cu orcina (5-metil-rezorcina)
formând produşi de condensare de culoare violetă sau albastru-verde în funcţie de natura
acidului folosit.
Reactivi: ​- reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96% şi se
adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%
​- HCl conc.
-​ soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduc 2 ml sol. de pentoză, iar în altă eprubetă 2 ml soluţie de
glucoză. Se adaugă în fiecare eprubetă 10 picături reactiv Bial şi câte 2 ml HCl conc. Se agită
conţinutul eprubetelor, se astupă cu dopuri de vată şi se lasă într-o baie de apă ce fierbe timp
de 10 minute. Conţinutul eprubetei în care se găseşte soluţia de pentoză devine albastru-
verzui.

​3. Reacţia Seliwanoff

Principiu:
​Reacţia Seliwanoff serveşte la diferenţierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele în
prezenţa HCl conc. reacţionează cu rezorcina (sau alţi polifenoli) formând produşii de
condensare coloraţi. Reacţia este mai rapidă şi mai intensă în prezenţa cetozelor, când se obţin
produşi coloraţi în roşu decât în prezenţa aldozelor, când se obţin produşi coloraţi în roz
deschis.
Reactivi: -​ reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină, 100 ml HCl conc., 200 ml
H2O distilată.
 -​ soluţie de fructoză, glucoză 2%
Modul de lucru:
​Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie fructoză şi în altă eprubetă 1 ml soluţie de
glucoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv Seliwanoff şi se încălzesc probele
până la fierbere. După răcire, conţinutul eprubetei cu fructoză se colorează în roşu, iar a celei
cu glucoză în roz slab.

​Reacţia cu fenilhidrazina

​Reacţia este specifică glucidelor reducătoare şi are ca rezultat formarea osazonelor.

Osazonele diferitelor glucide se deosebesc între ele prin structura cristalină ceea ce determină
imagini microscopice diferite, aşa cum se vede în figura de mai jos. De asemenea ele se
deosebesc prin solubilitate, puncte de topire.

Principiu:
​Reacţia glucidelor reducătoare cu fenilhidrazina decurge în două etape:
​- la rece, se formează fenilhidrazina
- la cald, în prezenţa unui exces de reactiv, se formează osazona specifică
glucidului folosit. Cetonele reacţionează ca şi aldozele. Prin RMN s-a dovedit
că osazonele au o structură chelatică ciclică.
Reactivi: ​- fenilhidrazină solidă
​- CH COONa •H O
3 2

​- acid acetic glacial

​- soluţii 10% de glucoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:
​Se introduc câte 5 ml soluţie de glucoză, lactoză şi maltoză în câte o eprubetă, se
adaugă 0,5 ml acid acetic glacial, puţină fenilhidrazină şi o cantitate dublă de acetat de sodiu.
Se agită şi se introduc eprubetele într-o baie de apă la fierbere timp de 1/2 de oră. După răcire
apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punând 1-2 picături din
fiecare probă pe o lamelă de sticlă.

Identificarea dizaharidelor
​Dizaharidele pot fi reducătoare - maltoză, lactoză sau nereducătoare - zaharoza. După
o prealabilă hidroliză a legăturii glicozidice şi cele nereducătoare vor da reacţiile
caracteristice de reducere şi culoare ale monozaharidelor.
 Reactivi: ​- reactiv Benedict
​- reactiv Barfoed
​- acid clorhidric 10%
​- hidroxid de sodiu 10%
-​ soluţii 2% de zaharoză, lactoză, maltoză
Modul de lucru:
​Se introduc câte 2 ml soluţie maltoză, zaharoză şi lactoză în câte o eprubetă, se adaugă
2 ml reactiv Benedict şi se încălzesc soluţiile pănâ la fierbere. Reacţia este pozitivă în cazul
maltozei şi a lactozei care sunt dizaharide reducătoare. Într-o altă eprubetă se introduc 2 ml
zaharoză, 3 picături HCl 10% şi se aduce soluţia la fierbere. După răcire se neutralizează cu 3
picături de NaOH 10%, se adaugă apoi 2 ml reactiv Benedict şi se încălzeşte din nou la
fierbere. Reacţia va fi pozitivă pentru că în urma hidrolizei au rezultat două monozaharide
reducătoare.
​
Identificarea polizaharidelor
Principiu:
​Polizaharidele cu importanţă biologică - amidonul, dextrinele, glicogenul - formează
cu iodul la rece combinaţii colorate diferit:
​- amidonul cu iodul - albastru
​- dextrinele cu iodul - brun-roşu clar
​- glicogenul cu iodul - cărămiziu opalescent
Aceste combinaţii sunt termolabile, la cald culoarea dispare şi reapare la răcire ceea ce
sugerează termodisocierea lor.
Reactivi: ​- soluţie apoasă de iod: se amestecă 0,2 g I2 cu 1 g KI şi 2 ml apă
distilată. După dizolvare se completează la 100 ml cu apă distilată.
-​ soluţii 2% de amidon, dextrine, glicogen
Modul de lucru:
​Se introduc câte 2 ml soluţie amidon, dextrină, glicogen în câte o eprubetă. Se adaugă
apoi 1-2 picături soluţie de iod şi se observă culorile obţinute. Se verifică dispariţia culorilor
prin încălzirea eprubetelor şi reapariţia lor la răcire.

Identificarea glucidelor

1. Reacţia cu iod
 ​
​ incolor roşu-brun ​ albastru
​ amidon
​ monozaharide clar opalescent
​ dizaharide dextrine glicogen
​ sol.fără glucid

2. Reacţia Benedict (sau Fehling)

​pozitivă ​ negativă
​ glucid reducător ​glucid nereducător
​soluţie fără glucid

​3. Reacţia Barfoed

pozitivă negativă ​3'.Hidroliză acidă

monozaharid dizaharid

4.Reacţia Bial 4".Reacţia de formare a osazonelor

​ ​4'.Reacţia Benedict
pozitivă negativă ​maltosazona lactosazona
pentoze hexoze

​ pozitivă ​ negativă
​ zaharoza sol.fără glucid

​ 5. Reacţia Selivanov
 ​pozitivă negativă
fructoză glucoza

Identificarea aminoacizilor şi proteinelor

Reacţii de culoare
Reacţiile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date de
prezenţa în molecula proteică a unor componente structurale, cum ar fi legăturile peptidice în
cazul reacţiei biuretului sau prezenţa unor anumiţi aminoacizi în cazul celorlalte reacţii.

Reacţia biuretului
Principiu:
Substanţele care conţin legături peptidice (începând cu tripeptidele) reacţionează cu
2+
Cu în soluţie puternic alcalină dând o coloraţie caracteristică violetă, purpurie, datorită
2+
formării unui complex colorat în care ionul Cu este unit prin legături coordinative cu
heteroatomi ai aminoacizilor angajaţi în legătura peptidică. Această reacţie se foloseşte şi
pentru dozarea substanţelor proteice prin metodă spectrofometrică.

Simbolizând cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai

aminoacizilor legaţi prin legătura peptidică, această legătură se poate reprezenta în felul
următor:
​

Cel mai simplu compus care dă această reacţie este

biuretul, de unde şi numele reacţiei. Formula biuretului este:
Reactivi: ​- Sol. CuSO4 1%
- Sol. NaOH 10%
Mod de lucru:
La 1-2 ml soluţie de cercetat se adaugă un volum egal de NaOH şi 3-5 picături de
soluţie de CuSO4. Se obţine o coloraţie albastră - violetă, fotometrabilă.

Reacţia ninhidrinei
Principiu:
Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacţionează cu aminoacizii în soluţie apoasă,
neutră sau slab alcalină şi la cald, cu formarea unui compus colorat. Coloraţia variază pentru
diverşii aminoacizi de la roz, roşu la albastru-violet (purpura lui Ruhemann) şi este galbenă
pentru prolină, galben-brun pentru hidroxiprolină. Această reacţie este dată nu numai de
aminoacizi, ci şi de peptide şi proteine. Reacţia cu ninhidrină este una din reacţiile generale
folosite pentru identificarea şi dozarea aminoacizilor în special la metoda cromatografică.
Reactiv: ​- Sol. de ninhidrină 0,1% cu adaos de piridină.
Mod de lucru:
La 2-3 ml soluţie de cercetat se adaugă 0,5 ml soluţie de ninhidrină, se încălzeşte
soluţia la fierbere cca 30 secunde, apoi se răceşte. Se observă formarea unei coloraţii albastru-
violet (fiindcă se lucrează cu un amestec de aminoacizi).
Reacţia xantoproteică
Principiu:

Această
reacţie este caracteristică aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina, tirozina, triptofanul
dau o coloraţie galbenă la încălzire cu acidul azotic concentrat. Reacţia este datorată nitrării
nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca exemplu reacţia fenilalaninei cu
acidul azotic:

Reactivi: ​- HNO3 conc.

- Sol. NaOH 5%
Mod de lucru:
La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă câteva picături de HNO3 concentrat. Apare un
precipitat alb sau o tulburare. După fierberea conţinutului 1-2 minute apare o culoare galbenă.
La fierbere precipitatul se poate dizolva parţial sau complet. Dacă după răcire soluţia se
alcalinizează, culoarea se intensifică, se schimbă în galben portocaliu. Apariţia petelor
galbene pe piele în urma acţiunii acidului azotic concentrat se explică tot prin reacţia
xantoproteică.
Reacţia Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacţia triptofanului)
Principiu:
Triptofanul (aminoacid care se găseşte în aproape toate proteinele) dă cu acidul
glioxilic (OHC-COOH) o coloraţie violetă. Se foloseşte ca reactiv acidul acetic glacial, care
conţine ca impuritate acid glioxilic.
Reacţia este specifică nucleului indolic, astfel produşii obţinuţi prin descompunerea
triptofanului (indolul şi derivaţii săi) dau şi ei reacţia pozitivă.
Reactivi: ​- Acid acetic glacial
- Acid sulfuric concentrat
Mod de lucru:
La 2 ml soluţie de cercetat se adaugă 2 ml acid acetic glacial, se amestecă şi se
introduc pe fundul eprubetei 2 ml H2SO4 concentrat. La suprafaţa de separaţie se formează un
inel violet. Reacţia se foloseşte în laboratoarele clinice pentru diferenţierea meningitei
tuberculoase de meningitele de altă etiologie, această reacţie fiind pozitivă numai din lichidul
cefalo-rahidian al pacienţilor cu meningită tuberculoasă. Meningita este inflamaţia
membranelor care învelesc creierul şi măduva spinării.

Reacţia tioaminoacizilor (reacţia cisteinei, cistinei)

Principiu:
Prin fierberea unei soluţii alcaline conţinând tioaminoacizi sau proteine ce conţin în
moleculă aminoacizi cu sulf, sulful se eliberează ca sulfură de sodiu (Na2S). Sulfura de sodiu
rezultată se tratează cu acetat de plumb şi se formează un precipitat negru-brun de sulfură de
plumb.
Reactivi: ​- Sol. de NaOH 30%
- Sol. de acetat de plumb 10%
Mod de lucru:
La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă acelaşi volum de NaOH 30% şi se fierbe 3-5
minute. După fierbere se adaugă 1-2 ml soluţie de acetat de plumb şi se fierbe din nou. Se
obţine un precipitat sau numai o coloraţie brun-neagră.

Reacţia Pauli (reacţia histidinei şi tirozinei)

Principiu:
Tirozina, histidina şi proteinele conţinând aceşti aminoacizi, formează prin cuplare cu
acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensifică la roşu prin alcalinizare.
Sinteza sării de diazoniu are loc prin reacţia:

Reacţia de cuplare este următoarea (se ia în considerare şi alcalinizarea):

- +
SO3 Na +
H 2O -
O
+
Na ​Sarea de diazoniu + tirozină + NaOH
CH2
I
H - C -
NH2
I
Colo COO-
rant azoic
 +
Na

N
=N

Reactivi: ​- Sol. de acid sulfanilic 1% în HCl 10%

- Sol. de NaNO2 5%
- Sol. de Na2CO3 30% sau NaOH 10%

Mod de lucru:
Se diazotează 1 ml soluţie de acid sulfanilic adăugând 1 ml soluţie de nitrit de sodiu.
Se amestecă acidul diazobenzensulfonic obţinut cu 1 ml soluţie de cercetat şi după
neutralizare cu 3-4 ml soluţie de Na2CO3 (sau câteva picături de NaOH) se obţine o coloraţie
roşie.

Reacţia Sakaguchi (reacţia argininei)

Principiu:
Soluţiile care conţin substanţe cu radicalul guanidinic în moleculă, dau în mediu
alcalin în prezenţa alfa-naftolului şi a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu combinaţii
colorate în roşu.
Reactivi: ​- Soluţie de hipoclorit de sodiu
- Soluţie alfa-naftol: se dizolvă 0,1 g alfa-naftol în aprox. 25 ml alcool
etilic şi se diluează cu apă la 100 ml.
- Soluţie de NaOH 10%
Mod de lucru:
Se ia într-o eprubetă 1 ml soluţie proteică diluată şi se alcalinizează cu 1 ml soluţie
NaOH 10%. Se adaugă 1 ml soluţie alfa-naftol şi soluţia de hipoclorit de sodiu picătură cu
picătură până la apariţia unei culori vişinii. Culoarea dispare la cald.

Reacţii de precipitare ale proteinelor

Principiu:
Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H2SO4, HNO3, HCl) sau organici (acid
tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluţii concentrate de săruri (sulfat de sodiu,
sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), acetonă, ioni de metale grele (săruri de
argint, mercur, cupru, plumb), încălzire. Precipitarea poate fi reversibilă sau ireversibilă.
 Precipitarea salină
Principiu:
Proteinele sunt macromolecule hidratate în soluţie apoasă. Dacă sărurile metalelor
uşoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorură de sodiu, sulfat de magneziu)
adăugate soluţiilor proteice ating o anumită concentraţie, deshidratează particulele proteice,
care precipită. Precipitatul de proteină obţinut prin precipitare salină poate fi redizolvat prin
micşorarea concentraţiei sării (prin dializă, diluare), deci este o precipitare reversibilă.
Deoarece proteinele precipită la concentraţii diferite de săruri, precipitarea salină
(salting-out) poate fi folosită şi pentru fracţionarea proteinelor. Astfel globulinele precipită în
soluţii semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai în soluţii saturate de sulfat de
amoniu.
Reactivi: ​- Sol. de proteină (ser sanguin uman, bovin sau cabalin)
- Sol. saturată de (NH4)2SO4
- (NH4)2SO4 solid
- NaCl solid
- MgSO4 solid
- Acid acetic glacial
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se toarnă 3 ml soluţie de proteină. Se adaugă acelaşi volum de soluţie
saturată de sulfat de amoniu. Astfel obţinem o soluţie semisaturată de (NH4)2SO4. După
câteva minute precipită globulinele. Precipitatul se separă prin filtrare. Filtratul conţine
albuminele. Se pune în filtrat sulfat de amoniu solid până la saturare (când noi cantităţi de
sare nu se mai solvă). În această soluţie vor precipita albuminele.
În două eprubete se toarnă câte 3 ml soluţie de proteină. Într-una din eprubete se
adaugă NaCl, în cealaltă MgSO4, până la saturare. După câteva minute în ambele eprubete
precipită globulinele. Precipitatul se filtrează. Filtratul conţine albuminele deoarece sărurile
adăugate nu precipită albuminele în soluţie neutră. Filtratul se acidulează cu câteva picături de
acid acetic glacial. În această soluţie slab acidă precipită albuminele.

Precipitarea cu ionii metalelor grele

Principiu:
Proteinele cu sărurile metalelor grele (plumb, cupru, mercur, argint, etc.) formează
combinaţii greu solubile. Precipitarea se produce deja la concentraţii mici de săruri şi
precipitatul obţinut în acest caz nu se mai dizolvă după micşorarea concentraţiei sării prin
diluare sau dializă, deci este o precipitare ireversibilă.
Reactivi: ​- Sol. de HgCl2 10%
- Sol. de CuSO4 10%
- Sol. de Pb(CH3COO)2 10%
- Sol. de AgNO3 5%
Mod de lucru:
În 4 eprubete se toarnă câte 1 ml soluţie de proteină. În fiecare eprubetă se adaugă
picătură cu picătură soluţie din fiecare reactiv. În toate eprubetele se formează precipitate.
Acetatul de plumb şi sulfatul de cupru nu trebuiesc adăugate în exces, deoarece precipitatul
format se solvă în exces de reactiv (salting-in).
 Precipitarea cu acizii minerali
Reactivi: ​- HNO3 conc.
- HCl conc.
- H2SO4 conc.
Mod de lucru:
În 3 eprubete se toarnă câte 1 ml de acid azotic, clorhidric respectiv sulfuric. În fiecare
eprubetă se stratifică cu precauţie câte 1 ml din soluţia de proteină. La suprafaţa de separare
dintre cele două soluţii se obţin precipitate albe sub formă de disc (inel). Apoi eprubetele se
agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de acid clorhidric şi sulfuric, dar nu şi în exces
de acid azotic. Precipitarea proteinelor cu acid azotic concentrat serveşte pentru punerea în
evidenţă a proteinelor din urină patologică.

Precipitarea cu acizi organici

Acidul tricloracetic şi acidul sulfosalicilic sunt reactivii specifici pentru precipitarea
proteinelor. Acidul tricloracetic este foarte adecvat pentru deproteinizarea lichidelor biologice
(de ex. ser sanguin), deoarece precipită numai proteinele din soluţie, nu şi produşii de
degradare ai acestora. Se mai foloseşte ca precipitant amestecul de acid picric cu acid citric
(reactiv Esbach), util în determinarea cantitativă a proteinelor.
Reactivi: ​- Sol. de acid sulfosalicilic 20%
- Sol. de acid tricloracetic 10%
- Sol. de acid picric 1,2%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă la 1-2 ml soluţie de proteină se adaugă câteva picături de reactiv. Se
formează un precipitat abundent.

Precipitarea prin încălzire

Principiu:
Proteinele la încălzire coagulează. Coagularea este cea mai rapidă la punctul
izoelectric. În mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coagulează la încălzire, deoarece
sarcina electrică le conferă o mai mare stabilitate în stare dizolvată.
Reactivi: ​- Sol. de CH3COOH 1%
- Sol. de CH3COOH 10%
- Sol. de NaOH 10%
- NaCl crist.
Mod de lucru: ​
În 5 eprubete se toarnă câte 1-2 ml soluţie de proteină. Se adaugă reactivi conform
tabelului.

Nr. eprubetei ​Adaos

1. …………………………. ​-
2. …………………………. ​2-3 pic. acid acetic 1%
3. …………………………. ​10-15 pic. acid acetic 10%
 4. …………………………. ​10-15 pic. acid acetic 10% + NaCl (câteva cristale)
5. …………………………. ​10-15 pic. NaOH 10%
Aceste eprubete se supun încălzirii şi se observă apariţia precipitatelor.

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen

Principiu:
Aminoacizii au o structură amfiionică. Din această cauză soluţiile lor, datorită
capacităţii de tamponare, micşorează saltul de pH la adaosul de acid sau bază sare. În
consecinţă aminoacizii nu pot fi titraţi prin metode acidimetrice sau alcalimetrice curente.
Adăugându-se soluţiei de aminoacid un exces de formaldehidă, se blochează gruparea
amoniu. Rezultă o bază Schiff, care se comportă ca un acid slab (carboxilic). Aciditatea
grupării carboxilice se titrează cu NaOH, în prezenţa fenolftaleinei ca indicator.
- - +
R - CH - COO + H2C = O R - CH - COO + H2O + H
I I
+
NH3 N = CH2
Bază Schiff
- + - +
R - CH - COO + H + NaOH R - CH - COO Na + H2O
I I
N = CH2 N = CH2

Reactivi: ​- Sol. de NaOH N/10 cu factorul FNaOH

- Fenolftaleină 0,1% în soluţie alcoolică
- Formaldehidă (substanţa este foarte reactivă, se autooxidează, deci
conţine şi acid formic ca impuritate. Prezenţa acestui acid ar da eroare
la titrare. Din acest considerent formaldehida este alcalinizată cu NaOH
în prezenţă de fenolftaleină până la virajul indicatorului).
Mod de lucru:
În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10,0 ml soluţie probă de aminoacid (pH »
6). Trebuie adusă şi această soluţie la pH = 9, de aceea se pun câte 3 picături de fenolftaleină
şi se adaugă picătură cu picătură sol. de NaOH până la apariţia culorii roz. Acest volum de
NaOH folosit nu se ia în considerare la calcul. În fiecare balon se adaugă câte 2 ml soluţie de
formaldehidă, sub acţiunea căreia soluţia devine acidă (pH » 3). Astfel dispare culoarea roz,
soluţia devenind incoloră. Fiecare soluţie se titrează cu soluţie de NaOH până la virajul
indicatorului. Variaţiile de pH sunt reprezentate pe următoarea schemă:
Titrar
e cu NaOH
 +C
H 2O

Alc
alini-zare

p
H

14

6
3 Calcul:
Întrucât se lucrează cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau cu un
amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea moleculară la
calcul. Din acest considerent rezultatul se exprimă în mg % azot alfa-aminic sau în mmoli N
aminic/l. Dacă volumul mediu de titrare a probelor se notează cu Vm, calculul este următorul:
1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic
0
Vm ´ FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml probă

​ ​ Y mg . . . . . .100 ml probă
100
Y = 10 ´ X mg N % = ´ X mmoli N aminic/l.
​ 14

Identificarea nucleoproteinelor
Principiu:
​ cheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze şi acid
S
fosforic. Prin hidroliză acidă aceste aceste subunităţi se eliberează şi pot fi puse în evidenţă
​Reactivi: ​- Sol de H SO 2 4
5%
​- Sol. de NH 3
10%
​- HNO 3
conc.
​- Sol. de molibdat de amoniu ​
​- Sol. amoniacală de AgNO 3

​- Reactiv Bial
-​ HCl conc.
Modul de lucru:
​a) Hidroliza: într-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la care se
adaugă 40 ml H2SO4 5%. Se astupă balonul cu un dop prevăzut cu un refrigerent ascendent şi
se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtrează şi se împarte în 3 eprubete în care se
identifică părţile componente ale acizilor nucleici.
​b) Identificarea pentozelor: în prima eprubetă se adaugă 10 picături reactiv Bial şi 2
ml HCl conc. Se agită conţinutul eprubetei se astupă cu un dop de vată şi se lasă pe o baie de
apă ce fierbe timp de 10 minute. Conţinutul eprubetei se colorează în albastru verde.
​c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până la reacţia
slab alcalină, apoi câteva picături de HNO3 conc., 1 ml soluţie de molibdat de amoniu. La
încălzire se obţine un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.
​d) Identificarea nucleobazelor: în a treia eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până la
reacţia alcalină, se filtrează şi se adaugă cca. 1 ml soluţiei amoniacală de AgNO3. După câtva
timp se formează un precipitat floconos galben-brun de săruri ale bazelor purinice.
Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face şi cu ajutorul reacţiei murexidului.
Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO3 conc. a bazelor
purinice şi amoniac.
Modul de lucru:
​1-2 picături din soluţia de analizat se usucă pe o placă de porţelan pe baie de apă. Cu
baghetă se adaugă o picătură de HNO3 conc. După evaporare se atinge cu o baghetă înmuiată
în amoniac. Apare o coloraţie roşie care se schimbă spre albastru violaceu când se adaugă o
picătură de NaOH.

Vitamine

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică

Principiu:
​Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a componenţilor unui
amestec, care utilizează fenomenele ce au loc la interfaţa a două faze. Ea poate fi folosită în
scopuri analitice sau preparative. Pe suprafaţa dintre două faze dintre care una este staţionară
(faza solidă sau lichidă adsorbită pe un material poros) şi una mobilă (solvent lichid sau gaz)
pot avea loc fenomene de adsorbţie, schimb de ioni sau partiţie între două faze lichide
nemiscibile.
​Faza staţionară la cromatografia în strat subţire este constituită dintr-un strat de
silicagel sau oxid de aluminiu în stare dispersă depus pe o lamă de sticlă. Developarea se face
cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solvenţi apolari.
​Dacă substanţele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor) formate
pe placa cromatografică se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacţii de culoare cu
substanţele amintite.
​Identificarea componenţilor se poate face:
- prin decuparea spoturilor şi analiza lor ulterioară prin metode chimice sau fizice.
- prin aplicarea simultană pe placă a substanţelor etalon, spotul format de o anumită substanţă
cunoscută se va găsi după developare la aceeaşi distanţă de punctul de start ca şi acela dat de
componentul identic din amestec.
- prin determinarea valorii (raportul dintre distanţa parcursă de spot şi de frontul solventului
în acelaşi interval de timp) Rf este caracteristic pentru fiecare substanţă în condiţii de lucru
standardizate.
​
Modul de lucru:
​a) Pregătirea plăcii cromatografice
Se prepară prin agitarea silicagelului în alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o suspensie
care se toarnă pe suprafaţa unei plăci de sticlă. Prin mişcarea plăcii se întinde cât mai uniform
suspensia şi se continuă mişcarea plăcii până când prin evaporarea alcoolului mobilitatea
suspensiei scade şi suspensia rămâne nemişcată. După uscarea completă a plăcii laturile
longitudinale se şterg pe o lăţime de 0,5 cm.
​b) Aplicarea amestecului de analizat
 ​La o distanţă de 1 cm de la unul din capetele plăcii, cu ajutorul unei capilare se aplică
soluţia de cercetat precum şi soluţiile etalon din vitamine urmărite. Diametrul maxim admis al
probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minimă de vitamină aplicată este aproximativ 3
g.
​c) Developarea
​Plăcile se introduc într-un vas cu toluen cu capătul pe care s-au aplicat soluţiile, aşezat
în solvent. Placa în timpul developării are o poziţie înclinată la 20-30º faţă de orizontală.
Solventul migrează prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant. Pentru a împiedica
evaporarea, cromatografia se face într-o atmosferă saturată cu vaporii solventului, adică vasul
este ermetic închis.
​d) Localizarea petelor
​După uscarea plăcilor, componentele migrate sunt evidenţiate cu ajutorul unui strat
subţire de H2SO4 98% turnat pe placă cu ajutorul unei pipete în aceeaşi parte în care au fost
aplicate probele. Poziţia plăcii trebuie să asigure deplasarea acid sulfuric în sensul în care s-a
făcut developarea. Vitaminele liposolubile în contact cu acid sulfuric se colorează astfel:
vitamina A – albastru-violet, - carotenul – albastru, vitamina D2 – galben-portocaliu,
vitaminele E, K1, K2, K3 – brun.

Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină

(metoda Palladin)
​Principiu:
Acidul ascorbic este oxidat în mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic

Iodul necesar oxidării rezultă din interacţiunea KIO3 cu KI în mediu acid.

După oxidarea completă a vitaminei C iodul în exces dă o culoare albastră în prezenţa
amidonului.
Reactivi: ​- soluţie HCl 2%;
- soluţie KI 0,1N;
​- soluţie KIO 0,004N;
3

​- soluţie amidon 0,5%. ​

Modul de lucru:
 Se cântăreşte 1 g din produsul vegetal de analizat (ace de brad, fructe de măceşe, etc.) şi
se triturează cu o soluţie de HCl 2% şi 5g nisip de cuarţ spălat prealabil cu HCl. Triturarea
începe cu o mică cantitate de HCl. După aceea masa omogenă se pune într-un vas de 50ml, se
spală mojarul cu acid clorhidric 2% şi după introducerea soluţiei de spălare în vasul cotat, se
aduce la semn cu HCl 2%. Lichidul se lasă să se limpezească, decantează şi se filtrează prin
vată. Primii 10ml se aruncă.
Când se lucrează cu urină se iau 10ml urină în vasul gradat, se aduce la cotă cu HCl 2%,
se amestecă şi se filtrează.
10 ml din filtrat se pun într-un flacon conic, se adaugă 30ml apă distilată, 5ml soluţie de
iodură de potasiu şi 5ml HCl 2%. Se titrează cu o soluţie de iodat de potasiu 0,004N folosind
ca indicator amidon. Culoarea albastră trebuie să se menţină 30 secunde.
​Calculul: se efectuează ţinând cont de faptul că 1ml soluţie KIO3 0,004N corespunde
la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raportează la 100g produs
analizat sau la cantitatea de urină eliminată in 24 ore.
​Valori normale 50-150 µmol/zi (10-30mg/zi). Variaţiile lor nu sunt concludente din
punct de vedere clinic. De aceea se foloseşte proba încărcării cu acid ascorbic.
​Se administrează intravenos 1000mg acid ascorbic şi după ce se colectează urină timp
de 5 ore, adăugând la fiecare fracţiune de urină câte 10% acid acetic glacial.
​În mod normal se elimină in 5 ore cel puţin 400mg acid ascorbic. O eliminare mai
scăzută pledează pentru hipovitaminoză sau avitaminoză C.

Enzime
​Introducere
Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie şi prezenţa lor este
necesară pentru desfăşurarea reacţiilor chimice în toate sistemele biologice. Enzimele au şi
însuşiri ale catalizatorilor utilizaţi în reacţiile chimice din lumea nevie. Ele sunt însă
superioare acestor catalizatori în mai multe privinţe:
a) Asigură reacţiilor chimice pe care le catalizează viteze cu câteva ordine de mărime
mai mari,
b) Reacţiile pe care le catalizează au loc în condiţii blânde: temperatură sub 50°C,
presiune atmosferică, pH în jurul valorii 7, forţă ionică moderată. Comparativ, catalizatorii
chimici acţionează la temperaturi ridicate, presiuni mari şi valori extreme de pH;
c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigură ca în reacţiile pe care le catalizează să
nu participe decât substraturile pentru care enzimele sunt specifice.
​Multe enzime au şi însuşiri neîntâlnite la catalizatorii chimici cum sunt:
a) Activitatea lor poate fi reglată (mărită sau micşorată) de anumiţi efectori;
b) Catalizează reacţii endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin transferul
energiei libere necesare de la reacţii exergonice.
​Cinetica enzimatică studiază viteza reacţiilor catalizate de enzime în funcţie de
concentraţia substratului [S], de concentraţia enzimei [E] şi de influenţele unor factori fizico-
chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepţia unanim admisă în
enzimologie că formarea din substrat a produsului de reacţie implică existenţa complexului
enzimă-substrat (ES), redată prin ecuaţia:
 ​K1 K3
E + S Û ES ------> E + P,

​ ​K2
a fost statuată în primul rând ţinând cont de alura dependenţei vitezei reacţiilor catalizate de
enzime de concentraţia de substrat (Leonor Michaelis şi Maud Menten, 1913).
Din punct de vedere al localizării enzimele se clasifică în:
​Enzimele secretate cu rol activ în plasmă, ca de exemplu:
a) enzimele plasmatice funcţionale, produse în special în ficat (ceruloplasmina)
b) enzimele coagulării, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza (LCAT).
Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor producătoare.
​Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine şi pancreas. Ele sunt
excretate şi acţionează la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza, tripsina.
Activităţile lor cresc în plasmă prin lezarea celulelor de origine sau prin prezenţa unui
obstacol la nivelul căilor excretorii precum şi prin creşterea permeabilităţii membranei
celulelor secretorii;
​Enzimele celulare cu loc de acţiune în celulele din care provin, a căror activitate
plasmatică creşte prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic
transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza (LDH),
fosfataza alcalină şi acidă, creatin kinaza (CK), etc.
​Concentraţia majorităţiilor enzimelor celulare este constantă în timp. Fac excepţie
enzimele inductibile/represibile şi enzimele plasmatice funcţionale intracelular cum ar fi CK
(creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), gGT (g-glutamil-
transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarba-milaza) fosfatazele
acidă şi alcalină, ale căror concentraţii cresc sau scad în anumite stări patologice (leziuni de
ţesut).
Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astăzi în măsură hotărâtoare la
cunoaşterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul şi urmărirea evoluţiei acestora,
elaborarea pe baze ştiinţifice a medicamentelor.

Influenţa concentraţiei substratului asupra

vitezei de reacţie enzimatică
Concentraţia substraturilor celor mai multe enzime variază destul de mult în funcţia de
starea metabolică a ţesutului şi de alţi factori. Dependenţa vitezei de reacţie de concentraţia
substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice. Una din principalele
mărimi ale cineticii enzimatice este activitatea enzimatică.
Pentru exprimarea activităţii enzimatice se folosesc în prezent mai multe sisteme de
unităţi ceea ce îngreunează interpretarea rezultatelor. Uniunea Internaţională de Biochimie
recomandă exprimarea activităţii enzimelor în mod unitar, în ”unităţi internaţionale” (UI sau
U). Unitatea internaţională de activitate enzimatică reprezintă cantitatea de enzimă care
transformă un mol de substrat într-un minut, la 25 ºC, în condiţii optime (concentraţia
maximală a substratului, forţa ionică a tamponului, pH optim).
1UI = 1 mol substrat /min.
 Conform SI unitatea de măsură a activităţii enzimatice este katalul.
1 katal = 1 mol substrat / sec
Se folosesc subunităţile ( m, , n, p) katalului. În determinările pe lichide biologice se
raportează activitatea enzimei la 1000 ml (vezi tabelul „limitele valorilor normale. Se
foloseşte de asemenea exprimarea şi în miliunităţi internaţionale pe mililitru (mU/ml) ceea ce
de fapt nu modifică valorile numerice respective. Chiar şi atunci când se utilizează UI, apar
diferenţe ale valorilor limitelor normale, datorită varietăţii metodelor folosite pentru
determinări.
​Principiu:
Pentru o cantitate dată de enzimă, viteza,v, a
reacţiei enzimatice creşte odată cu creşterea
concentraţiei substratului [S], până când întreaga
cantitate de enzimă se saturează cu substrat. Se
atinge astfel viteza maximă,vmax, care nu va fi
depăşită chiar dacă în continuare concentraţia
substratului va creşte, în cazul în care substratul în
exces nu inhibă propria enzimă. Acest principiu este
descris de ecuaţia Michaelis-Menten (pentru
deducere vezi cursurile de biochimie):

unde KM, constanta lui Michaelis.

Reprezentarea grafică a lui v în funcţie de [S] (temperatura, pH-ul şi [E] fiind

constante) este o curbă cu alură hiperbolică. Din analiza curbei reiese că v creşte liniar cu
creşterea [S] numai pentru valori mici ale acesteia, apoi creşterea se face tot mai lent pentru
ca la concentaţii mari de substrat, viteza reacţiei să rămână constantă. Fiecare enzimă se
caracterizează prin valorile particulare KM şi vmax ale lor.

Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează

​Principiu: ​
În determinarea experimentală se va folosi ca substrat ureea şi ca enzimă ureaza din
boabe de soia. Ureaza catalizează următoarea reacţie:

Viteza de reacţie este proporţională cu cantitatea de amoniac eliberat în unitatea de timp

(1min). Aceasta se determină prin titrare cu o soluţie de HCl cu factor cunoscut.
​ HCl + NH3 ---------> NH4Cl
Cunoscând concentraţiile substratului din probe care se consideră constante pe parcursul fazei
de incubaţie şi calculând vitezele de reacţie, exprimate în mmoli uree transformaţi într-un
minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafică (v, [S]) din care se poate
calcula KM pentru urează.

Reactivi: ​- Soluţie de uree 0,1 M

- Soluţie de uree 1,0 M
- Soluţie de urează: fie o soluţie de enzimă cristalizată, fie o suspensie
de făină de soia. Se păstrează în frigider.
- Soluţie de tampon fosfat 0,1 M, pH=7
- Soluţie de CuSO4 5%
- Indicator roşu de metil 0,1% în soluţie alcoolică

Modul de lucru:

​Conform tabelului se prepară o serie de 6 probe introducându-se în toate aceeaşi

cantitate de enzimă şi soluţii de concentraţii crescătoare ale substratului. În tabel vor fi
consemnate pe baza datelor experimentale (titrimetrice) şi a efectuării calculelor, valorile ai ,
m şi vi (i=1,6).

​În proba martor se inactivează enzima, înainte de a se introduce substratul, adăugând 5

picături soluţie CuSO4 5%. Reacţiile chimice (în cazul probelor 1-6), declanşate în momentul
amestecării enzimelor cu substratul, sunt lăsate să se desfăşoare timp de 25 min., apoi sunt
întrerupte prin adaosul inhibitorului, adică a câte 5 picături soluţie CuSO4. Se măsoară în
fiecare probă cantitatea de NH3 format, prin titrarea cu soluţie de HCl în prezenţa
indicatorului roşu metil (3 picături) care virează de la galben la roşu. Culoarea galben dată de
indicator, înaintea virajului, se datorează amestecului coloristic cu culoarea albastră dată de
2+
ionii Cu hidrataţi.

​Calculul:
​1mol HCl........................................1 mol NH ..................1/2moli uree
3

​1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree

​ ​2.20 ​(a -
i
m) ml..............................................................................xi____________
xi = (ai-m)•25 mmoli uree transformaţi în 25 minute
​v = (a -m)•25/25 = a -m mmoli uree/ 1 min.
i i i

Reprezentarea grafică
​Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hârtie milimetrică se aplică pe
ordonată o scară a valorilor vitezelor de reacţie. Pe abscisă se trec concentraţiile molare ale
ureei din cele şase probe menţionate în tabel. Se reprezintă grafic punctele (vi, [S]). Curba
hiperbolică se trasează printre punctele experimentale. Porţiunea dreaptă, paralelă cu abscisa
(corespunzătoare saturării E cu S), se prelungeşte până la intersecţia cu ordonata, intersecţia
corespunzând valorii vmax. La valoarea vmax/2, se duce o dreaptă paralelă cu abscisa până la
intersecţia cu curba şi de la această intersecţie se duce o dreaptă paralelă cu ordonata până la
intersecţia cu abscisa. Acest punct corespunde valorii KM (concentraţia de substrat
corespunzătoare semi-vitezei maxime). Ea este într-o primă aproximaţie constanta de
disociere a complexului enzimă-substrat (urează-uree). Deci, se stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 şi
(3) KM.
 Interpretarea rezultatelor
​Valorile mari ale KM corespund unei legături slabe între E şi S iar valorile mici ale KM
corespund unei legături puternice între E şi S. Valorile lui KM pentru diverse enzime sunt
cuprinse între 10 - 10 moli/litru. În cazul ureazei, KM~10 moli/litru ceea ce plasează
-1 -6 -2

această enzimă în rândul celor cu afinitate (constantă de stabilitate a complexului E-S) mică
faţă de substrat.

Determinarea activităţii catalazei sanguine

Principiu: Catalaza din sânge este o oxidoreductază foarte activă, care descompune
apa oxigenată, în apă şi oxigen molecular: 2 H2O2 → 2 H2O + O2
​Activitatea ei se determină prin dozarea apei oxigenate rămasă nedescompusă într-un
sistem cu concentraţia iniţială a H2O2 cunoscută. Este o metodă indirectă: catalaza dintr-un
microlitru de sânge acţionează asupra unei cantităţi determinate de apă oxigenată; excesul de
apă oxigenată se dozează prin titrare cu KMnO4 în mediu acid; din diferenţă se calculează
numărul catalazic.
+7 -1 +2 0
2 KMnO4 + 5 H2O2 + 3 H2SO4 → 2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O + 5 O2

+7 + 5e +2

​Mn ―――→ Mn

-2 - 2e 0

​ O2 ―――→ O2

Reactivi: ​- Sânge diluat ​1‰ (v/v)

- Soluţie de H2O2 ​2%
- Soluţie de H2SO4 ​20%
- Soluţie de KMnO4 ​N/10 cu factorul F
KMnO4
cunoscut
Mod de lucru: În patru flacoane Erlenmeyer se pipetează:
Proba 1 Proba 2 Martor 1 Martor 2
Apă distilată (ml) 2 2 2 2
 Sânge diluat (ml) 1 1 1 1
- - se fierbe şi se răceşte
Apă oxigenată (ml) 2 2 2 2
Repaus 30’ la temperatura camerei
Acid sulfuric (ml) 5 5 5 5
Titrare cu KMnO4 până la roz
slab stabil (ml) b1 b2 a1 a2
Media =b1 +b2 / 2 = bm Media =a1 +a2 / 2 = am
Calculul:
Volumul mediu de titrare pentru probe (bm) este mai mic decât cel pentru martori (am)
deoarece catalaza descompune o parte din apa oxigenată din probe.

1ml KMnO4 N/10----------------------------------------------------------1,7 mg H2O2

(am-bm)FKMnO4 --------------------------------------------------------------x

​x = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 mg H2O2 descompuse de catalaza din 1 ml sânge diluat 1/1000

(1 l sânge integral). Această valoare se numeşte număr catalazic.
​Interpretarea rezultatelor
​Valorile normale ale numărul catalazic (cifre catalazice) sunt cuprinse înte 14-18.
Acatalazemia este o deficienţă înnăscută, a catalazei din eritrocite şi alte ţesuturi,
având ca principal simptom gangrena cavităţii bucale. Dacă se face concomitent şi
hemograma, se poate calcula şi Indicele catalazic = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 / nr. globule roşii (în
milioane).
I​ ndicele catalazic este cel care are valoare de diagnostic. Este scăzut în cancer,
anemie, caşexie şi în 80 % din afecţiunilor hepatice.

Determinarea activităţii transaminazelor

(metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină)

Principiu:
Transaminazele catalizează reacţia de transfer a grupării amino de la un alfa-
aminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea maix 2mare importanţă clinică sunt:
glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) şi glutamic-piruvic-
transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizează următoarele procese
x5
reversibile:
 ​GOT este o enzimă localizată în proporţie de 60% în citoplasmă şi 40% în
mitocondrii, în special în muşchiul scheletic, miocard şi ficat. În reacţia catalizată de GOT se
foloseşte ca substrat amestecul aspartat- -cetoglutarat din care rezultă oxalacetat şi glutamat.
Oxalacetatul se decarboxilează spontan trecând în piruvat. Piruvat rezultă şi din reacţia
catalizată de GPT având ca substrat amestecul alanina- -cetoglutarat Piruvatul
rezultat din aceste reacţii reacţionează cu 2,4-dinitro-fenil-hidrazina în mediu alcalin dând
dinitro-fenil-hidrazona corespunzătoare de culoare roşie, care se determină fotometric:

Datorită faptului că şi ceilalţi alfa-cetoacizi prezenţi (alfa-cetoglutarat) formează fenil-

hidrazone, cu absorbţii la diferite lungimi de undă, se măsoară extincţia dinitro-fenil-
hidrazonei piruvatului la lungimea de undă de 520 nm unde fenil-hidrazona alfa-
cetoglutaratului absoarbe slab.
Intensitatea coloraţiei produse este proporţională cu intensitatea activităţii enzimei.
Activitatea transaminazelor se calculează în funcţie de cantitatea de acid piruvic care se
formează într-un minut.
Reactivi: ​- Substrat GOT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039 g alfa-
cetoglutarat de sodiu (sau 0,030 g acid alfa-cetoglutaric) şi 1,57 g aspartat
de sodiu (sau 1,32 g acid aspartic) se dizolvă în aproximativ 80 ml apă
bidistilată. Se ajustează cu NaOH 0,4N pH-ul soluţiei la 7,4 apoi se
completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată.
- Substrat GPT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030 g acid alfa-
cetoglutaric (sau 0,039 g alfa-cetoglutarat de sodiu) şi 1,78 g alanină se
dizolvă în aproximativ 80 ml apă bidistilată, se aduce pH-ul la 7,4 cu
NaOH 0,4N, apoi se completează la 100 ml cu apă bidistilată.
- Soluţie de 2,4-dinitro-fenil-hidrazină 1 mM în HCl 2M: se dizolvă 19,8
3
mg dinitro-fenil-hidrazină în 10 ml HCl (d = 1,19 g/cm ) şi se completează
la 100 ml cu apă bidistilată.
- Soluţie standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolvă în 100 ml apă
bidistilată 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluţie conţine 2 µmoli piruvat).
Se adaugă 0,3 ml cloroform pentru conservare.
- Soluţie NaOH 0,4N
Modul de lucru:
 Atât pentru GOT cât şi pentru GPT se pregătesc câte trei eprubete: probă (P),
standard (S) şi blanc (B).

GOT GPT
P S B P S B
Sol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 - - -
Sol.substrat GPT (ml) - - - 0,5 0,5 0,5
Se incubează 5 minute la 37°C
Ser (ml) 0,1 - - 0,1 - -
Sol.standard PIR (ml) - 0,1 - - 0,1 -
Se incubează la 37°C 60 minute 30 minute
Sol.2,4-dinitrofenilhidrazină (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ser (ml) - - 0,1 - - 0,1
Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 5 minute se citeşte extincţia probelor

(EP) şi a standardului (ES) faţă de blanc, la 520 nm, în cuva de 1 cm.

Calcul:
Ştiind că soluţia standard conţine 0,2 mmoli piruvat /0,1 ml se calculează cantitatea
de piruvat rezultat din reacţia pentru fiecare enzimă şi se exprimă activitatea enzimatică în
mmoli piruvat format/min./1000 ml ser (în condiţiile de lucru) şi se notează cu X:

Pentru GOT: ​X=(EP/EB) • 0,2 • (1/60) • (1/0,1) • 1 000 mmoli piruvat

Pentru GPT: ​X=(EP/EB) • 0,2 • (1/30) • 1 000 mmoli piruvat

Activitatea enzimatică reală nu este dată direct de valoarea obţinută colorimetric,

deoarece hidrazona colorată se formează şi cu alfa-cetoglutarat din substrat, iar pe de altă
parte, condiţiile nu sunt cele optime (37°C în loc de 25°C şi prezenţa alfa-cetoglutaratului
care formează hidrazonă). S-au calculat tabele de corecţie prin comparaţie cu datele obţinute
cu metoda de referinţă, care exprimă activitatea enzimatică reală, măsurând spectrofotometric
+
în UV transformarea NADH + H+ in NAD , în prezenţa enzimelor indicatoare: malat-
dehidrogenaza (MDH) în amestec cu GOT şi lactat-dehidrogenaza (LDH) în amestec cu GPT.
Reacţiile enzimatice sunt următoarele:
GOT

alfa-cetoglutarat + L-aspartat --------------> L-glutamat + oxalacetat

MDH
 + +
oxalacetat + NADH + H ----------------> L-malat + NAD
GPT

alfa-cetoglutarat + L-alanina --------------> L-glutamat + piruvat

LDH
+ +
piruvat + NADH + H ----------------> L-lactat + NAD

Din tabelul de corecţie se citeşte activitatea enzimatică reală (determinată prin metoda
enzimatică) exprimată în Unităţi Internaţionale (UI = mmoli/min./l, 25°C) care corespunde
valorilor X calculate.

UI UI UI UI
X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT
2 2 1 26 23 9,5 54 60 23 80 38
4 3 2 28 25 10 56 24 82 39
6 5 2,5 30 27 11 58 25 84 40
8 6 3 32 29 12 60 26 86 42
10 7 4 34 31 13 62 27 88 44
12 9 4,5 36 33 14 64 29 90 46
14 11 5 38 35 15 66 30 92 48
16 13 6 40 37 16 68 31 94 50
18 15 7 42 39 17 70 33 96 52
20 17 7,5 44,46 41,44 18,19 72 34 98 54
22 19 8 48 47 20 74 35 100 56
23 20 8,5 50 51 21 76 36 102 60
24 21 9 52 55 22 78 37

Observaţii:
1. Dacă activitatea enzimatică depăşeşte 60 UI se va repeta determinarea cu incubaţie scurtă:
20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obţinute se vor înmulţi cu
3. Este de preferat ca în locul scurtării timpului de incubaţie să se facă diluţii ale serului
1:5, 1:10, 1:20 în apă distilată şi se reia cu fiecare diluţie tehnica de lucru de la început. La
calcul se ţine seama de diluţie.
2. Sticlăria utilizată trebuie să fie perfect curată, spălată în final cu multă apă distilată,
deoarece urme de detergenţi pot inhiba considerabil activitatea enzimatică.
​Interpretarea valorilor obţinute
Valori normale: ​ OT: Adulţi: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: până la 40 UI
G
GPT: Adulţi: 2-16,5 UI. Copii până la 5 ani: 0,2-13 UI
Valori patologice: În cazul leziunilor celulare mai uşoare creşte activitatea GPT, ea
fiind o enzimă citoplasmatică, iar în cazul leziunilor mai grave creşte şi activitatea GOT
(GOT este prezentă şi în microsomi)
GOT : -​ creşteri marcate ( 10-100 ori ) în: infarct miocardic, hepatită virală acută, necroza
 toxică a ficatului
- creşteri moderate în: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecţioasă,
anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate
GPT: ​- creşteri marcate ( ~ 100 ori ) în: hepatita virală acută, necroza toxică a ficatului
- creşteri moderate în: hepatite cronice, ciroză, mononucleoza infecţioasă, hepatita de
stază cardiacă.
Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. În leziunile inflamatorii ale ficatului acest
raport scade datorită creşterii mai mari ale activităţii GPT. În leziunile necrotice raportul
creşte datorită creşterii mai marcate a activităţii GOT.

Determinarea activităţii fosfatezei alcaline

(Metoda Bodansky)

​Fosfatazele sunt un grup de enzime cu rol important în metabolism, capabile să

hidrolizeze esterii fosforici, eliberând acid ortofosforic. În sânge întâlnim în special un grup
de fosfomonoesteraze care acţionează diferit, în funcţie de pH-ul mediului şi de prezenţa unor
2+
efectori (ionul de Mg ).
​Cele mai importante enzime din grupa fosfomonoesterazelor sanguine sunt: ​fosfatază
alcalină ​- acţionează la pH 8,4 - 9,1
​fosfatază acidă -​ acţionează la pH 5,1 - 6,0
​Fosfatazele alcaline sunt foarte răspândite în corpul animal. Cele mai bogate surse
sunt: epiteliul intestinal, părţile în creştere ale oaselor, rinichi, glandele mamare, leucocite.
​Principiu:
Sub acţiunea catalitică a fosfatazei alcaline serice glicerolfosfatul de sodiu este
hidrolizat eliberându-se fosfat monosodic.

​ ctivitatea enzimei se determină dozând cantitatea de ioni fosfat eliberat, printr-o

A
metodă colorimetrică.
​Ionul fosfat reacţionează cu acidul molibdenic rezultând un complex fosfomolibdenic
care este redus de sulfitul de sodiu şi hidrochinonă la albastru de molibden, care este alcătuit
dintr-un amestec de oxizi de molibden în stări de oxidare diferite.
2- 2- + +
HPO4 +12 MoO4 + 23 H + 3 NH4 → (NH4)3PMo12O40 + 12H2O
​Oxizii de molibden sunt atât de fin dispersaţi încât intensitatea culorii obţinute este
proporţională cu cantitatea de molibden din fosfomolibdat, deci cu cantitatea de fosfor din
probă. Deci global, procesul respectă legea Lambert – Beer în ce priveşte concentraţia
fosforului.
 ​Reactivi: ​- soluţie de substrat de glicerolfosfat de sodiu pH -9,6, 0,5g
glicerolfosfat de sodiu la care se adaugă 0,425 g veronal sodic, totul se dizolvă în cca 50
ml de apă, în balon cotat de 100 de ml Se adaugă 2,2 ml NaOH 0,1 N. Se completează la 100
ml cu apă distilată şi se ajustează la pH 9,6
- NaOH N/10
- Hidrochinonă 1%
- Sulfit de sodiu 20%
- Acid tricloracetic 10%
- Molibdat de amoniu 2,5%
- Soluţie etalon de fosfat: KH2PO4 p.a. se usucă câteva zile în exicator.
Se cântăresc 4,3866 g, se dizolvă în puţină apă şi cu apă, se aduce la semn la balon cotat de
1000 ml, se adaugă câteva picături de cloroform drept conservant. Această soluţie conţine 1
mg de fosfor / 1 ml.
Curba de etalonare
Pentru realizarea curbei de etalonare, se diluează de 50 de ori soluţia etalon, astfel 1ml
soluţie conţine 20 g fosfor. Se măsoară într-o serie de eprubete 0,5; 1; 2; 3; 4 şi 5 ml din
această soluţie standard. La fiecare probă se adaugă câte 2 ml acid tricloracetic 20% şi apă
până la 10 ml. După amestecare, din acest amestec se măsoară câte 5 ml într-o alta eprubetă,
după care se adaugă 2 ml molibdat de amoniu 2,5%, 1 ml hidrochinonă şi 2 ml sulfit de sodiu.
După 5 minute se citeşte exticţia şi se reprezintă grafic luând pe ordonată extincţia la 610
nm în cuvă de 1 cm, iar pe abscisă cantitatea de fosfor în g (adică 5, 10, 20, 30, 40, 50 g)
Modul de lucru:
În două eprubete se măsoară câte 5 ml substrat (pH = 9,6). Prima eprubetă se menţine
timp de 5 minute la 37º C după care se introduce 1 ml ser şi se lasă astupată jumătate de oră la
37º C.
În eprubeta a doua se măsoară 1 ml ser şi deoarece acesta constituie martorul, se
introduc 4 ml acid tricloracetic 10% pentru inactivarea enzimei. După incubarea de o jumătate
de oră, prima eprubetă se tratează cu 4 ml acid tricloacetic 10%. Atât proba cât şi martorul se
agită energic 1-2 minute şi se filtrează, iar din filtrat se iau câte 5 ml în două pahare
Erlenmeyer şi se dozează cantitatea de fosfat anorganic după cum urmează.
Se adaugă în fiecare pahar, în ordine, 1 ml molibdat de amoniu, 1 ml sulfit de sodiu, 1
ml hidrochinonă şi 2 ml apă bidistilată. După 20 de minute de repaus se citeşte extincţia
probei faţă de martor la 610 nm.
Calcul:
Se face pe baza curbei de etalonare. Rezultatul se exprima în unităţi Bodansky (UB).
O unitate Bodansky este activitatea fosfatazică pentru care 1 mg fosfor este eliberat într-o oră
la 37º C şi pH = 9,6 de 100 ml ser din substratul de glicerolfosfat.
Valori normale: ​Adulţi: ​2 - 4 U.B. / 100 ml ser
​Copii: ​2 - 8 U.B. / 100 ml ser
​Sugari: ​3 – 10 U.B. / 100 ml ser
Transformarea unităţilor Bodansky, în unităţi internaţionale (mU/ml sau UI/l) se face
înmulţind cu factorul de conversie 8,3.
Modificările patologice apar în două mari categorii de afecţiuni: osoase şi
hepatobiliare. Astfel creşte mult în boli în care există o activitate crescută a osteoblastelor:
Boala Paget (osteodistrofie deformentă), hipoparatiroidismul primar şi secundar, rahitism
infantil, osteomalacie, metastaze osoase ale unor tumori maligne, icter prin obstrucţie
(dozarea fosfatazei constituind în acest caz un mijloc biochimic de diagnostic diferenţial al
icterelor).
O creştere fiziologică se observă în sângele matern aproximativ în trimestrul trei al
sarcinii şi atinge maximumul în timpul travaliului. La făt, concentraţia serică a fosfatazei
2+
creşte, dar este sub valoarea maternă şi se însoţeşte de fixarea ionilor Ca şi .
Concentraţia mai mare în sângele matern se explică printr-o trecere transplacentară de la făt la
mamă.
Scăderea fosfatazei alcaline apare în ciroză hepatică, hepatită cronică.
Fosfataza acidă are valori normale cuprinse în intervalul 4,5 – 13,5 UI/l (enzimă
totală) şi 0,05 – 3,6 UI/l (fracţiunea prostatică). Valorile cresc în carcinomul de prostată (cu
metastaze osoase), boala Gaucher, prostatită acută şi cronică, necroză hepatică datorată
hepatitelor acute şi cornice.

​Determinarea activităţii amilazei serice prin

metoda Wohlgemuth.
​Prin acţiunea amilazei salivare (a-amilaza) asupra amidonului, în cavitatea bucală, se
rup legăturile 1,4-glicozidice. Cum legăturile 1,6 ca şi cele 1,4 din vecinătatea ramificaţiilor,
nu pot fi desfăcute de către a-amilază, produşii de digestie a amidonului vor fi, pe lângă
maltoză, fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine limită. Dextrinele
limită sunt hidrolizate ulterior, sub acţiunea unei hidrolaze, amilo-1,6-glucozidaza, la maltoză
care, în intestin este hidrolizată la glucoză de maltază. Activitatea amilazică a intestinului se
datorează trecerii amilazelor pancreatice şi salivare în sânge. pH-ul optim al amilazei salivare
-
este aproape de neutralitate, cofactorul fiind ionul Cl .
Prin adăugarea de iod, amidonul rămas după reacţia enzimatică dă un compus de
adiţie iod-amidon, de culoare albastră a cărei intensitate este proporţională cu concentraţia
amidonului rămas după incubaţie şi invers proporţională cu activitatea enzimatică. Coloraţia
roşie care poate să apară în soluţiile cu amidonul parţial hidrolizat se datorează complexelor
iod-dextrine.
Principiu:
Se determină cantitatea minimă de amilază serică necesară pentru a hidroliza complet
2 mg amidon, în 30 minute la 38°C.

Reactivi: ​- Soluţie de NaCl 0,9%

- Soluţie de amidon 0,1%
- Soluţie de KI3 N/10
Modul de lucru:
​Se iau 8 eprubete care se numerotează de la 1 la 8. În fiecare se introduce câte un ml
soluţie NaCl 0,9%. În prima eprubetă se adaugă 1 ml ser. Pipeta se spală de 3 ori prin aspirare
în amestecul din prima eprubetă şi cu aceeaşi pipetă se trece 1 ml din amestec în a doua
eprubetă. Din nou se spală pipeta prin aspirare în a doua eprubetă şi se trece 1 ml în a treia.
Operaţia se repetă până la ultima eprubetă din care se aruncă 1 ml din amestec. În acest mod
se obţine următoarea serie de diluţii succesive ale serului: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64,
n
1/128, 1/256, adică 1/2 unde n este numărul de ordine al eprubetei.
​Se adaugă apoi în fiecare eprubetă câte 2 ml soluţie amidon. Se agită şi se aşează în
baie de apă la 38ºC. După 30 de minute se scot, se răcesc repede la un curent de apă, apoi în
fiecare se introduc câte 1-2 picături de soluţie de iod. Se agită şi se observă culoarea formată.
Culoarea galbenă indică lipsa amidonului, cea roşie arată prezenţa produşilor intermediari de
hidroliză (dextrine), iar cea albastră semnalează prezenţa amidonului nehidrolizat. Se notează
ultima eprubetă în care amidonul a fost hidrolizat.
Cu această metodă nu se poate face diferenţă între amilaza salivară şi cea pancreatică.
Există, însă, metode electroforetice pentru a diferenţia cele două izoenzime: migrarea
electroforetică a amilazei salivare este mai rapidă decât a celei pancreatice.
Calcul:
Rezultatul se exprimă în unităţi Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazică Wohlgemuth
reprezintă cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza un mg amidon în 30 minute la
38ºC. Pentru calcul se consideră ultima diluţie în care nu apare culoarea albastră. Rezultatul în
unităţi Wohlgemuth se obţine înmulţind diluţia cu 2. De exemplu, dacă coloraţia albastră
apare în eprubeta a 5-a înseamnă că amidonul a fost hidrolizat până la a 4-a eprubetă.
Calculăm diluţia acestei eprubete care este 1/16 faţă de serul iniţial. Dacă: 1/16 ml ser
hidrolizează 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizează x ml sol. amidon 0,1% sau x
mg amidon.
​ 1•2 ​
x = ─── = 32 UW
​ 1/16

​Interpretarea valorilor obţinute:

Valori fiziologice: î​ n sânge: 8-32 U.W.
​în urină : 8-64 U.W.
Valori patologice: -​ activitatea amilazică scăzută apare în afecţiunile
pancreatice, gastrice şi duodenale.
- activitatea amilazică crescută apare în afecţiuni ale ficatului,
vezicii biliare, în alterări ale funcţiei renale, afecţiuni ale glandei salivare (parotidită acută,
sialadenită), sarcină extrauterină, fiindcă cantităţi mici de amilază există în trompele uterine,
infarct intestinal. Valoarea diagnostică a amilazemiei se corelează cu tulburările digestive,
pancreatita acută, parotidita epidemică.

Observaţii:
1. Amilaza serică este stabilă timp de o săptămână dacă serul se ţine la frigider sau congelator.
2. Saliva conţine de 1000 ori mai multă amilază decât serul de aceea este necesar ca pipetările
să se facă cu atenţie evitându-se scurgerea salivei în pipetă.
3. Eprubetele vor fi bine spălate cu apă distilată, de asemenea şi pipetele, înlăturându-se
urmele de detergent care ar putea influenţa reacţia enzimatică.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Modificările echilibrului acido-bazic a lichidelor din organismul viu, duc la acidoză
sau alcaloză. pH-ul sângelui este cuprins în intervalul 7,35-7,45. În mod normal, raportul
-
echivalenţilor de HCO3 şi H2CO3 este de 20/1, de exemplu 24 mEq bicarbonat şi 1,2 mEq
- -
acid carbonic. În locul raportului [HCO3 ]/[H2CO3], un raport mai practic este [HCO3 ]/pCO2
unde pCO2 este presiunea parţială a CO2 din sânge.
Scăderea acestui raport duce la acidoză, iar creşterea lui la alcaloză. Dacă scade numărătorul,
este vorba de acidoză respiratorie (reducerea eliminării prin expiraţie a CO2) sau metabolică.
Creşterea raportului datorită creşterii numărătorului indică o alcaloză metabolică. Scăderea
-
raportului [HCO3 ]/pCO2 datorat creşterii pCO2 produce acidoză respiratorie. Creşterea
raportului determinat de scăderea pCO2 produce alcaloză respiratorie. În funcţie de
modificările pH-lui se realizează acidoza sau alcaloza compensată sau decompensată. Când
pH-ul nu este modificat este vorba de acidoză sau alcaloză compensată. Când pH-ul scade sub
7,35 este vorba de acidoză decompensată, iar când pH-ul creşte peste 7,45 se poate vorbi de
alcaloză decompensată. Valori ale pH-ului sângelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile
cu viaţa. Cele mai importante sisteme tampon care funcţionează permanent în organism sunt:
2- -
sistemul bicarbonat/acid carbonic, sistemul fosfaţilor (HPO4 /H2PO4 ), sistemul proteinelor si
sistemul hemoglobinei (deprotonată/protonată).

Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual)

Principiu:
Bicarbonaţii din ser sunt descompuşi cu acid azotic, cu degajare de CO2, iar excesul de
acid azotic se titrează în prezenţă de roşu de fenol cu soluţie de hidroxid de sodiu.
Reactivi: ​- soluţie acid azotic 0,1 N cu factorul FHNO3
- soluţie roşu de fenol 0,04% în alcool etilic de 60%;
- soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N cu factorul FNaOH
Modul de lucru:
La 1 ml ser nehemolizat se adaugă 1 ml soluţie acid azotic 0,1N şi 4 picături soluţie
roşu de fenol 0,04%. Se agită timp de 2 minute pentru îndepărtarea dioxidului de carbon. Se
microtitrează cu v ml soluţie de hidroxid de sodiu 0,1N până la primul viraj portocaliu.
Calcul:
1 ml NaOH 0,1N ..................................................0,1mEq
................................................... x mEq
x = rezerva alcalină dintr-un ml ser.

Obsevaţie: Factorul soluţiei de HNO3 0,1N se determină prin titrare cu soluţia de

NaOH 0,1N cu factor cunoscut, folosind roşu de fenol ca indicator.

Metoda Astrup
Spre deosebire de măsurătorile de bicarbonaţi şi de pH efectuate în plasmă, metoda
Astrup ţine cont şi de rolul tamponului de hemoglobină şi de intervenţia anhidrazei carbonice
din eritrocite. Metoda se bazează pe relaţia invers proporţională dintre pCO2 şi valorile de pH
din sânge. Este o micrometodă în care se utilizează un electrod capilar de sticlă pentru
măsurarea pH-ului (dozarea potenţiometrică a pH-ului cu electrod de sticlă, pag.183).
Determinările se fac din sânge capilar. Se măsoară trei valori de pH (în condiţii anaerobe, în
condiţii de pCO2 scăzut şi pCO2 crescut). Cu ajutorul acestor trei valori se pot calcula factorii
principali ai echilibrului acido-bazic dintr-o nomogramă.
 Ioni anorganici

Determinarea potasiului seric

​Potasiul este un important cation intracelular pentru organism. În celulă, parţial, el este
slab legat cu proteinele şi cu ionul fosfat. În tulburările metabolice celulare însoţite de o
scădere a potenţialului energetic (diabet zaharat, acidoze, hipertiroidism etc.) celula pierde din
+
acest motiv şi potasiul care este ulterior eliminat. Cation principal în fluidul intracelular, K
+ +
este implicat în funcţia nervoasă şi musculară, în funcţionarea Na /K -ATP-azei. În timpul
contracţiei musculare, potasiul din spaţiul intracelular trece în cel extracelular, iar în locul lui
+
în celulă intră sodiul. Supradozarea cu ioni K determină scăderea (oprirea) activităţii
cardiace, ulcerul intestinului subţire. Necesarul zilnic de potasiu este de 1,875-5,625 g
/kilocorp
Sursele: vegetale, fructe (nuci, banane, mere, struguri, portocale) boabe de cereale seminţe de
floarea soarelui, carne slabă.
Principiu:
Hexanitrocobaltiatul (III) trisodic (Reactiv Konninck) formează cu ionul K în soluţii
+

neutre, un precipitat galben cristalin de hexanitrocobaltiat (III) dipotasic-monosodic.

Grupările nitro din compus se oxidează în mediu acid cu KMnO4 în exces. Excesul de KMnO4
se titrează iodometric cu tiosulfat de sodiu.
​Na [Co(NO ) ] + 2 KCl-------------> NaK [Co(NO ) ] + 2NaCl
3 2 6 2 2 6

​5 NaNO + 2 KMnO + 3 H SO ----> 5 NaNO + 2 MnSO + K SO +3 H O

2 4 2 4 3 4 2 4 2

​2 KMnO + 10 KI + 8 H SO ------------> 5 I + 2 MnSO + 6 K SO +8 H O

4 2 4 2 4 2 4 2

​I + 2 Na S O --------------------------------> Na S O + 2 NaI
2 2 2 3 2 4 6

Reactivi: - Reactiv Konninck (hexanitrocobaltat (III) trisodic). Prepararea reactivului

Konninck: ​
- Soluţia A: Se dizolvă 1,25 g Co(NO3)3 în 2,5 ml H2O. După dizolvare se adaugă 0,0625 ml
CH3COOH glacial.
- Soluţia B: Se dizolvă 56 g NaNO2 în 9 ml H2O bidistilată, prin încălzire.
Soluţia A se amestecă cu soluţia B. Pentru îndepărtarea vaporilor nitroşi se trece
prin soluţie un curent de aer timp de 60 minute (trompă de vid). Se lasă în repaus 2
ore după care se filtrează. Dacă culoarea se închide din nou se trece din nou un
curent de aer.
- Alcool etilic 70°
- Soluţie fosfat disodic 5%
- H2SO4 20%
- KMnO4 0,01N
- KI 10%
- Amidon 1%
- Na2S2O3 0,05N
Modul de lucru:
 Într-o eprubetă de centrifugă se măsoară:
​- 1 ml reactiv Konninck (Sol.A + B), apoi 1 ml ser. Se agită şi se lasă în repaos 20
minute. Eprubeta se supune centrifugării la 2000 rpm timp de 10 minute. După decantarea
lichidului supernatant, precipitatul sedimentat se spală cu 5 ml etanol iar dispersia etanolică se
supune din nou centrifugării şi decantării
​Precipitatul rămas se dizolvă cu 5 ml fosfat disodic, prin fierbere 5 minute. Soluţia se
goleşte într-un flacon Erlenmeyer de 100 ml iar eprubeta se spală în flacon cu 1 ml H2SO4
20%. În tabel apar cantităţile de reactivi care se introduc în flaconul Erlenmeyer cu probă şi în
unul cu martor.
​
Probă Martor
Precipitat dizolvat -
H2O bidistilată (ml) - 5
H2SO4 20% (ml) 1 2
KMnO4 0,01N (ml) 20 20
Repaus 20 minute (ml)
KI 10% (ml) 3 3
Amidon 1% (ml) 2 2

​Proba şi martorul se titrează cu Na2S2O3 0,05N până la dispariţia culorii albastre

determinate de prezenţa I2.
Calcul:
​1 ml Na S O
2 2 3
0,05N corespunde la 0,065 • 5 mg K
​mg K% = (v1 - v2) • 5 • 0,065 • 100; unde v1 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea
martorului şi v2 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea probei
Valori normale: 13-21 mg/100 ml ser; 3,3-5,4 mmol/l

Variaţii patologice: ​- Hiperpotasemii: arsuri intense, hemoragii, infarct

miocardic, sindroame maligne, pancreatite acute hemoragice, necroze viscerale, insuficienţă
suprarenală acută sau cronică, sindrom hemolitic, nefrită acută sau cronică. - Hipopotasemii:
diaree, vomismente, nefropatii tubulare, acidoze diabetice, comă diabetică, administrare
prelungită de diuretice, hipercorticism suprarenal, boala Cushing, tumoră suprarenală,
tratament cortizonic.
Deficienţa de potasiu apare după răniri sau terapie cu diuretice. Deficienţa de potasiu
determină slăbirea tonusului muscular, paralizii, confuzii mentale.

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric

În ultimul timp, metodele chimice de determinare ale potasiului au fost înlocuite prin
analiza flamfotometrică. Factorii care au favorizat utilizarea flamfotometriei ca metodă uzuală
+
în laboratoarele clinice pentru determinarea în lichidele biologice a metalelor alcaline (Na şi
+ 2+ 2+
K ) şi metalelor alcalino-pământoase (Ca şi Mg ), au fost: simplitatea metodei, rapiditatea
metodei, consumul minim de substanţe, limita de eroare (2-3%) apropiată de limita de eroare
din determinările chimice.

Principiu:
Serul nehemolizat se diluează cu apă bidistilată, apoi se pulverizează într-un dispozitiv
special cu ajutorul unui curent de gaz purtător. Aerosolii formaţi în urma pulverizării se
amestecă cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau acetilenă-aer care arde
într-un arzător special (Brenner), dând naştere la spectre caracteristice. Liniile spectrale ale
potasiului pot fi selecţionate cu ajutorul unui filtru. Lumina flăcării este proiectată cu ajutorul
unei oglinzi concave, prin filtrul de selecţie, pe o celulă fotoelectrică, ceea ce produce un
fotocurent, care se poate măsura cu ajutorul unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos
+
este proporţională cu concentraţia ionilor K din ser. Alte detalii privind această analiză
instrumentală sunt cuprinse în capitolul privind unele aparate de analiză fizică de la sfârşitul
îndrumătorului.

Dozarea calciului şi magneziului

Dozarea calciului

​Rolul calciului în organism

​Calciu este cel mai abundent mineral din organismul uman. Un adult de 70 kg conţine
în ţesuturi aproximativ 1,2 kg calciu. Aportul zilnic necesar de calciu este 1 gram, din care se
absorb doar 10-20%. Calcemia (concentraţia plasmatica a calciului) normală este 9-11 mg%,
4,5-5,5 mEq/l sau 2,25 -2,75 mmol/l. Calciul îndeplineşte în organism un rol plastic
participând prin combinaţiile sale insolubile la structura scheletului osos a cărui principală
componentă minerală este hidroxiapatita, 3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2 şi un rol dinamic sub formă
2+
de ioni Ca prezenţi în fluidele, cum ar fi plasma sau urină, sub forma a trei fracţiuni:
1. Calciu legat de proteine (proteinate de calciu) aproximativ 1 mmol/l. Această formă
depinde de concentraţia relativă a proteinelor şi calciului din plasmă. Pe baza acestei
dependenţe se poate aprecia fracţiunea de calciu ionizat, cunoscând calciul total din ser
sau plasmă şi nivelul proteinei din ser sau plasmă. Tehnica constă în folosirea
nomogramei MacLean şi Hastings, cunoscând cei doi parametri amintiţi anterior se citeşte
direct valoarea calciului ionizat de pe nomogramă.
2. Calciul legat de molecule mici (complecşi de calciu sau chelaţi) acizi organici, numit şi
calciu complexat dializabil. Acesta poate străbate membranele semipermeabile (celofan)
spre deosebire de calciul legat de proteine.
3. Calciul liber, forma biologică activă ce intervine în coagularea sângelui în activarea
enzimelor (proteaze), în buna funcţionare a inimii, muşchilor şi nervilor.

Determinarea cationului calciu în sânge

Calciul este cationul prezent predominant în spaţiul extracelular. În laboratoarele de
analize clinice, calciul din sânge se poate doza prin diferite metode. Metodele fizice folosite
sunt: fotometria de flacără, spectroscopie de absorbţie atomică, folosirea electrozilor ion-
selectivi. Metodele chimice folosite sunt precipitarea calciului sub formă de oxalat şi apoi
dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului de potasiu şi metoda
complexonometrică. Metodele optice sunt descrise în principiu la sfârşitul îndrumătorului.
 2+
Metodele potenţiometrice cu electrod pentru Ca utilizează un milivolmetru cu impedanţă de
intrare mare similar cu pH-metrului care în locul electrodului de sticlă utilizează electrodul
2+
selectiv pentru ionii de Ca .
​ Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie, spectroscopie
de absorbţie atomică) permit determinarea concentraţiei totale a calciului. Singurele metode
care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ) sunt metodele
nernstiene, adică cele care folosesc electrozi selectivi.
​Toţi electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numită în mod curent
“membrană”. Această membrană conferă selectivitatea electrodului. Membranele sunt de mai
multe tipuri: membrane de sticlă (pentru măsurarea pH-ului), membrane solide (pentru
- - 2+ 2+
măsurare concentraţiei F , CN ) şi membrane lichide (pentru măsurarea Ca , Mg ).
​Electrodul membrană-lichidă pentru Ca 2+
este constituit din următoarele componente
principale:
- Un fir de argint metalic acoperit cu clorură de argint, scufundat într-o soluţie de CaCl2
- Un rezervor central în care se află CaCl2 şi firul de argint
- O membrană poroasă “millipor” de PVC care joacă rolul unui suport inert, impregnat
cu o soluţie organică compusă din sarea de calciu a acidului didecilfosforic dizolvată
într-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di – n - octil fenil fosfat).
Ionul de calciu este comun atât soluţiei apoase (soluţie a cărei concentraţie vrem s-o
determinăm) cât şi soluţiei organice cu care este impregnată membrana “millipor”. În această
soluţie organică se va reţine ionul de calciu de către un contraion (ion cu semn opus), în cazul
de faţă didecil fosfatul, care fiind insolubil în apă nu poate părăsi soluţia organică. Între cele
două soluţii (apoasă şi organică) apare o diferenţă de potenţial nernstiană (respectă legea lui
Nernst).
Diferenţa de potenţial este măsurată cu ajutorul instrumentului, care este gradat direct în
2+
unităţi de concentraţie a ionilor de Ca (pCa). Concentraţia ionilor de calciu, poate fi
apreciata şi indirect folosindu-se nomograme. Sunt două tipuri de nomograme utilizate în
acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul căreia se poate deduce concentraţia
calciului ionizat, cunoscând calciu total din ser sau plasmă şi concentraţia totală a proteinelor
din ser sau plasmă.
2+
Cea de a doua nomogramă utilizabilă pentru deducerea concentraţiei Ca , se bazează pe
faptul că ionizarea ionilor de calciu variază linear în funcţie de pH-ul serului sau plasmei.
Acest tip de extrapolare se poate face numai între limitele variaţiei pH-ului fiziologic (6,8 -
7,8), pentru că numai în această plajă de pH variaţia este lineară (vezi figura de mai jos).
 2+ 2+
În diagrama pH-Ca liber prezentată, ordonata (concentraţia ionilor de Ca ) este
divizată nelinear. Cunoscând valorile pCa şi pH (măsurate cu electrozii selectivi
corespunzători) se poate stabili natura tulburării de care suferă pacientul
(hiper/hipoparatiroidism primar, acidoză/alcaloză acută, etc.).

Dozarea calciului prin metoda permanganometrică

Principiu
Se precipită ionul de calciu sub formă de oxalat de calciu. Precipitatul format se
dizolvă în acid sulfuric, iar acidul oxalic eliberat se va titra cu o soluţie de permanganat de
potasiu, până la apariţia unei coloraţii slab roz.
CaCl2 + (COONH4)2 → (COO)2Ca + 2NH4Cl
(COO)2Ca + H2SO4 → (COOH)2+ CaSO4
5(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O
Reactivi: ​- soluţie de oxalat de amoniu 4% (soluţie saturată)
- soluţie de hidroxid de amoniu 2%
- soluţie de acid sulfuric 1N
- soluţie de permanganat de potasiu 0,01 N cu factorul FKMnO4

Modul de lucru:
​Se pipetează 1 ml ser, 1 ml soluţie saturată de oxalat de amoniu şi 2 ml de apă
bidistilată într-o eprubetă de centrifugă. Se amestecă prin agitare şi se lasă minim 30 de
minute în repaus. Se centrifughează timp de 10 minute la 4000 turaţii pe minut. Supernatantul
se îndepărtează printr-o singură răsturnare a eprubetei şi peste precipitat se adaugă 4 ml din
soluţia de hidroxid de amoniu 2%, se agită, apoi se centrifughează. Se îndepărtează
supernatantul cum s-a arătat mai sus şi se mai face o spălare cu soluţia de hidroxid de amoniu,
se centrifughează şi se elimină supernatantul. Peste precipitatul astfel spălat se adaugă 2 ml
acid sulfuric 1N şi se ajută dizolvarea prin încălzire pe o baie de apă la 60-70ºC. Se
recomandă ca temperatura să nu depăşească 70°C pentru a se evita descompunerea acidului
oxalic. Se titrează cu soluţia de permanganat de potasiu la cald până la apariţia unei coloraţii
roz palid care trebuie să persiste minimum un minut. În paralel se face şi o probă martor. Tot
într-o eprubetă de centrifugă, se introduc 2 ml acid sulfuric 1 N, se încălzeşte pe o baie de apă
la 70°C şi se titrează cu soluţia de permanganat de potasiu la cald până la apariţia unei
coloraţii roz palid care trebuie să persiste minimum un minut.
Calcul:
1 ml soluţie KMnO4 0,01 N conţine 0,01 miliechivalenţi de KMnO4. Stoichiometric
0,01 miliechivalenţi de KMnO4 vor reacţiona cu 0,01 miliechivalenţi de Ca ceea ce reprezintă
0,2 mg de calciu.
x = (a-b) • F KMnO4 • 0,20 (mg Ca /1ml ser)
x•100 = mg Ca /100 ml ser sau
(a-b) • F KMnO4 • 5 (mmol Ca /l)
în care: a = număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea probei de analizat iar b =
număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea martorului.
​Valori normale: ser ​9-11 mg / 100 ml la adulţi sau
​2,2-2,8 mmol / l
​7-14 mg / 100 ml la copii sau
​1,8-3,5mol / l
​Valori scăzute: -​ hipofuncţie paratiroidiană
- avitaminoză sau hipovitaminoză D
- uremie
​La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie.

​Valori crescute: - hiperfuncţie paratiroidiană ​

- neoplazii osoase (osteosarcom, mielom multiplu, unele leucemii)
- hipervitaminoză D
- deshidratare
​
Dozarea calciului prin metoda complexonometrică
Eliminarea calciului în urină este în funcţie de conţinutul de calciu din alimente şi de
rata de absorbţie digestivă.

Principiu:
Ionii de calciu din urină în mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa2, adică
complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) în prezenţa murexidului
(purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu (culoarea soluţiei va fi
roz) care prin titrare vor fi apoi complexaţi cu EDTA. Indicatorul eliberat va colora soluţia în
violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu şi alţi cationi) are gradul de ionizare
2+
în funcţie de pH-ul mediului. Reacţiile prin care ionii Ca sunt complexaţi de indicator şi de
complexon sunt:
2+ 3- -
Ca + Ind ↔ CaInd
roz
2+ 4- 2-
Ca + Y ↔ CaY
complexonul
deprotonat
Reacţia titrimetrică care produce virajul indicatorului este:

- 4- 2- 3-
CaInd + Y → CaY + Ind
violet

Reactivi: ​- soluţie complexon III 0,001 N .

- soluţie de NaOH 9 N
- soluţie indicator murexid 0,1%
​Modul de lucru:
​Se foloseşte urină proaspătă, fără conservanţi. Se pregătesc două pahare Erlenmeyer
de câte 100 ml şi se pipetează în fiecare următoarele:
Exprimarea
Proba Martor
cantităţilor
Urină ml 2 -
Apă bidistilată ml 50 52
Soluţie de NaOH 9 N ml 0,2 0,2
Indicator murexid pic. 1 1
Culoare roz roz-violaceu
Se titrează cu EDTA 0,01N până la violet A ml B ml
​
​Se execută o probă şi un martor, martorul se titrează dacă este necesar până la culoarea
violet stabilă, pentru a se lua în calcul şi urmele de calciu din reactivi. ​
Calcul:
În calcularea rezultatelor se are în vedere că complexul din 1 ml soluţie complexează
2+
0,2 mg Ca :
1ml EDTA 0,01N-----------------------------------------------0,2 mg Ca
(A-B)•FEDTA------------------------------------------------------x
x= (A-B)• FEDTA•0,2 mg Ca / 2ml
Considerând că urina de 24 ore are volumul de 1500 ml:
g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,2 • 1500 / 2 • 1000

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,15

 Valori normale:
- sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore - copii şi adulţi 0,1 - 0,2 g/24 ore
sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore
Valori crescute apar în boala Recklinghausen, osteoporoze, după fracturi, intoxicaţii
cu vitamina D, hipercalciurie ideopatică.
Valori scăzute apar în spasmofilie, tetanie infantilă, osteomalacie, rahitism, hipopara-
tiroidism.
Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe

​Un adult de 70 kg conţine aproximativ 24 g de magneziu, care este distribuit inegal în

organism, având o concentraţie mai mare în ţesuturile cu activitate metabolică mai intensă,
cum ar fi creierul, inima, ficatul, rinichii, tiroida. Totuşi scheletul conţine 60% din magneziu.
Muşchii scheletici şi miocardul conţine 35%, iar 1% se găseşte în compartimentul extra-
celular, din acesta aproximativ două treimi fiind sub formă ionizată, restul fiind legat de
albumine. Principalele organe implicate în metabolismul Mg sunt intestinul şi rinichii.
Magneziul are un rol cheie în numeroase funcţii mediate enzimatic, fiind implicat în
formarea de substrate enzimatice (ATP Mg, GTP Mg) precum şi în activarea directă a
enzimelor. Funcţiile membranare care sunt influenţate de magneziu includ conducerea
impulsului nervos şi modularea activităţii canalelor de calciu.
Principiu:
Colorantul Mann şi Joe (1- azo - 2 – hidroxi – 3- (2,4 – dimetil carboxamilido)
naftalin – 1’ (2 - hidroxibenzen) – 4 – sulfonat de sodiu) este albastru. În mediu alcoolic, la
2+
pH 9-10, acesta formează cu Mg (în cantităţi de ordinul microgramelor) un complex de
culoare roşie, iar intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia cationului.

Materiale necesare: ​- spectrofotometru

- micropipete de 20 l (0,02ml)
Reactivi: ​- Reactivul Mann şi Yoe: se dizolvă 8 mg colorant în 75 ml alcool
absolut (eventual prin fierbere cu reflux) şi după dizolvare se aduce la
100 ml cu alcool absolut.
- Soluţie tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu 10
molecule de apă, se dizolvă la cald în 500 ml apă bidistilată, apoi se
completează cu apă bidistilată la 1000 ml.
2+
- Soluţie standard de Mg 2 mg/ 100ml: se dizolvă 203 mg MgSO4
cristalizat cu 7 molecule de apă în 500 ml apă bidistilată, se adaugă 1
ml cloroform (conservant), apoi se completează la 1000 ml cu apă
bidistilată
- Soluţie acid percloric 0,33 N: se dizolvă 2,85 ml HClO4 70% în 100
ml apă distilată
Modul de lucru:
Se pregătesc în trei eprubete următoarele mixturi:
Probă Blanc Standard
Soluţie tampon (ml) 1,0 1,0 1,0
Ser (ml) 0,02 - -
Standard de Mg2+ (ml) - - 0,02
Apă bidistilată (ml) - 0,02 -
Se amestecă bine
Reactiv Mann şi Yoe (ml) 1,0 1,0 1,0

Se agită bine mixturile şi după 15-30 de minute se citeşte exticţia probei şi a

standardului faţă de blanc în cuva de 1cm la 505 nm.
Calcul:
Ep/Es x 2 = mg Mg% Ep/Es x 1,64 = mEq/l
Valori normale
​nou născuţi: 1​ ,6 - 2,3 mg% sau 1,32 -1,90 mEq/l sau 0,66-0,95 mmol/l
​adulţi: ​ ,6 - 2,4 mg% sau 1,56-2,38 mEq/l sau 0,8-1,2 mmol/l
1
Modificări patologice
În practica medicală deficitul de magneziu este întâlnit relativ frecvent, dar el nu este
întotdeauna identificat deoarece are expresie medicală mai puţin specifică comparativ cu
carenţa altor elemente (exemplu ferul) şi apare într-un context complex în asociere cu alte
afecţiuni care pot domina tabloul.

Deficitul de magneziu apare în următoarele cazuri: ​

​Aport deficitar, alimentaţie parenterală, cure drastice de slăbire, alcoolismul cronic,
vărsături datorate alimentaţiei dezechilibrate, hipersudoraţie, eliminarea crescută a
magneziului prin urină (etanolul antrenează diureza osmotică). Afecţiunile care evoluează cu
malabsorbţie, rezecţiile intestinale, enteropatiile acute sau cronice, diarea, steatoreea, terapia
cu diuretice, provoacă de asemenea depleţia de magneziu. În practica pediatrică, deficitul
poate apărea din următoarele cauze: disgravidia - sărăcire a organismului matern cu
repercusiuni asupra capitalului de magneziu al nou născutului, creşterea rapidă a copilului în
primele luni, lapte matern sărac în magneziu, tulburări gastrointestinale la această vârstă.
Terapia cu calciu şi vitamina D în doze mari favorizează pierderile urinare de magneziu. În
diabetul zaharat apare hipomagnezemia datorită pierderilor urinare de magneziu antrenate de
diureza osmotică. Stresul fizic şi psihic favorizează depleţia de magneziu.
​
​Manifestări clinice ale deficitului de magneziu (hipomagnezemie) sunt polimorfe şi
nespecifice. Ele pot fi: insomnie, anxietate, depresie , cefalee, slăbiciune musculară, crampe,
parestezii, hiperreflexe, dificultăţi de înghiţire, senzaţie de constricţie toracică, tulburări de
adaptare a vederii.
​
​Supraîncărcare de magneziu se constată la nou născuţii ai căror mame au fost tratate
cu sulfat de magneziu în contextul eclampsiei de sarcină. În insuficienţa renală, în special
2+
concomitent cu medicaţia pe bază de Mg (antacizi, laxative), se produce hipermagnezemie.
Simptomele hipermagnezemiei sunt: hipotensiune, greţuri, vărsături, bradicardie, hiporeflex
osteotendinos, hipotonie musculară.
 Dozarea ionului de clor din ser prin
metoda Schales

Principiu:

-
Ionul Cl , principal anion al plasmei sanguine, în mediu acid se titrează cu Hg(NO3)2
formând HgCl2, moleculă nedisociată. Se foloseşte ca indicator difenilcarbazona care
2+
formează un compus de culoare violet cu ionii Hg în exces. Nu este necesară
deproteinizarea, cu excepţia serurilor puternic icterice.

Reactivi: ​- Soluţie de azotat mercuric 0,01 N

- Soluţie indicator de difenilcarbazonă 0,01 M
- Soluţie H2SO4 2/3 N
- Soluţie standard de clorură de potasiu 0,1 N

Modul de lucru:

​În două flacoane Erlenmeyer de 25 ml se pipetează:

Probă Standard
Apă distilată ml 1,0 1,0
Ser ml 0,1 -
Standard KCl ml - 0,1
H2SO4 2/3 N 1 pic. 1 pic.
Indicator difenilcarbazonă 2 pic. 2 pic.

Ambele probe se titrează până la aceiaşi culoare violet cu Hg(NO3)2 0,01 N. Se notează
volumul în ml folosit la titrarea probei (v1) şi cel folosit la titrarea standardului (v2).
Calcul:
-
1 ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la______________________________0,355 mg Cl
​v
1
/ v2 ________________________________________________________ x
​x = mg Cl /0,1 ml ser ​= v / v • 0,355
-
1 2

​mg Cl / 100 ml ser =​ v / v • 355

-
1 2

​mEq Cl / l = v
-
1
/ v2 • 100
 Observaţii: ​În cazul serurilor puternic icterice se efectuează deproteinizarea.
După deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe când la ser
neproteinizat spre violet.

Valori normale pentru adulţi:

​340 – 390 mg clor/100 ml ser ​
​96 – 110 mEq clor/ litru de ser
Valori scăzute până la 250 mg/100 ml ser se întâlnesc în insuficienţă corticosuprarenală
(boala Addison), în diaree sau vărsături prelungite, când organismul pierde pe lângă apă şi o
cantitate apreciabilă de NaCl.
Valori crescute se întâlnesc în stări de sete, în hiperfuncţia corticosuprarenală şi în insuficienţa
renală.

Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată)

Principiu:

Se
3+
tratează serul sanguin cu acid clorhidric când se eliberează Fe din legătura sa cu proteinele
3+
(transferina). Se precipită proteinele serice cu acid tricloracetic, după filtrare Fe din filtrat
2+ 2+
este redus cu hidrochinonă la Fe . Ionii de Fe formează cu ortofenantrolina şi, mai specific,
cu a,a -dipiridil, un complex colorat în roşu. Intensitatea coloraţiei roşii va fi proporţională
’

cu concentraţia ferului din probă.

Reactivi: ​- Soluţie HCl 1N;

- Soluţie CCl3COOH 20%;
- Soluţie hidrochinonă 2%;
- Soluţie ortofenantrolină clorhidrică 1% (se poate utiliza şi ortofenantrolină,
iar pentru dizolvare se acidulează iniţial cu 2-3 picături de HCl concentrat)
- Soluţie semisaturată de CH3COONa. Se diluează extemporaneu o soluţie
saturată (la temperatura camerei cu apă bidistilată) în proporţie de 1:1
- Soluţie standard concentrată de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO4· 7H2O, ad 100
 ml cu apă bidistilată sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2· 6H2O, ad 100 ml cu apă
bidistilată. Standardul concentrat se păstrează la frigider. Se diluează
extemporaneu 1 ml la 100 ml cu apă bidistilată obţinându-se un standard de
lucru de 100 µg Fe % cu stabilitate limitată la 1-2 luni.

Modul de lucru:

În trei eprubete se pipetează conform tabelului:

Probă (ml) Standard (ml) Blanc (ml)

sol. HCl 1 N 1 1 1
ser (nehemolizat) 2 - -
apă bidistilată - - 2
sol. standard de fier (100 mg%) - 2 -

Agitare, 10 min. repaus

acid tricloracetic 20% 2 2 2
10 min. repaus, filtrare şi apoi în eprubete
filtrat 2 2 2
sol. hidrochinonă 2% 0,2 0,2 0,2
sol. o-fenantrolină 1% 0,1 0,1 0,1
sol. acetat de sodiu 2 2 2

Fiecare eprubetă se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia probei (Ep) şi a standardului (Es)
faţă de blanc, în cuva de 1 cm, la l = 510 nm.
Calcul:
Sideremia se calculează cu următoarea formulă:
Fe mg% = Ep/Es•Cst = Ep/Es•100 (Cst = concentraţia standardului de fer = 100 mg%)

Valori normale: ​- femei: 80-130 mg% (14,3-23,3 mmoli/l)

- bărbaţi: 90-160 mg% (16,1-28,6 mmoli/l)
Valori crescute: creşterea reabsorbţiei (absenţa blocadei mucoasei), depozitarea
excesivă a ferului în organism (hemosideroză, hemocromatoză), tratament cu fer în exces, etc.
Valori scăzute: scăderea aportului (dietă inadecvată, regim făinos-lactat), scăderea
absorbţiei (rezecţii de stomac/intestin, diaree cronică, sindrom de malabsorbţie), aclorhidrie,
pierderi mari de sânge.
Proteina plasmatică transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizată în ficat.
Capacitatea totală de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantităţii totale de siderofilină şi se
exprimă în mg Fe/100 ml plasmă. Valorile normale ale CTFFe se încadrează între 250-420
mg% Fe. În deficitul de transferină sunt scăzute atât sideremia cât şi, evident, CTFFE. În
anemia feriprivă sideremia este mult scăzută, în timp ce CTFFe este mult crescută, cauza fiind
utilizarea ferului plasmatic pentru producţia de hemoglobină. La rândul ei producţia
accelerată de hemoglobină poate fi cauzată de pierderile cronice de sânge, sarcini repetate,
hemoragii puternice.

Dozarea fosfatului anorganic din ser prin

metoda Briggs ( cu deproteinizare)

În serul sanguin şi alte lichide biologice fosforul se găseşte sub trei forme:
1. Combinat în proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca:
​(a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din gălbenuşul de ou)
​(b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.).
​2. Sub formă acidosolubilă, adică neprecitabilă cu acid tricloracetic:
​a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H PO ), H PO , HPO , Me4P2O7), b.
3 4 2
-
4 4
2-

nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid fosfopiruvic, f. acid

creatinfosforic, g. acizi trifosforici
​3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc.
​Fosfaţii anorganici îndeplinesc unele roluri în lichidele şi ţesuturile biologice:
​a) Sistemul tampon al fosfaţilor (H PO - 2-
/ HPO4 ). În organismul uman mediul intern
2 4
are bazicitatea uşor crescută peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Menţinerea constantă a pH-
ului în mediu intern este realizată, alături de alte sisteme tampon, prin sistemul tampon al
fosfaţilor. Acest sistem poate fi alcătuit din două săruri: fosfat monoacid (Na2HPO4 sau
K2HPO4) - care constituie componenta bazică a sistemului - şi fosfatul diacid ​(NaH2PO4 sau
KH2PO4) care este componenta acidă. De fapt, componentele funcţionale în cursul tamponării
2- -
sunt anionii acestor săruri: HPO4 şi H2PO4 . La pH-ul normal (7,4), concentraţia anionului
2- -
HPO4 este aproximativ de 5 ori mai mare decât cea a anionului H2PO4 .
​Componenta bazică, HPO , tamponează aciditatea mediului prin reacţia:
4
2-

​HPO + H ---------> H PO
2-
4
+
2 4
-

​Componenta acidă, H PO , eliberează protoni care neutralizează ionii OH ai bazelor:

2 4
- -

​H PO + OH ------------> H O + HPO
2 4
- -
2 4
2-

​După cum se observă, produşii rezultaţi în ambele cazuri sunt componentele

sistemului tampon.
​ istemul tampon al fosfaţilor este operant în special în hematii, dar şi în celulele
S
tubulilor renali.
​b) În sânge există un raport aproximativ invers proporţional între ionii fosfat şi calciu.
La nivel renal, hormonul paratiroidian creşte reabsorbţia calciului şi inhibă reabsorbţia ionilor
fosfat (acţiune fosfaturică). Efectele la nivelul oaselor şi rinichilor, ale hormonului cresc
calcemia, fără o creştere echivalentă a concentraţiei fosfatului, împiedicându-se astfel
atingerea unor concentraţii critice la care aceşti ioni să formeze fosfat tricalcic insolubil. De
fapt concentraţiile serice ale acestor ioni depăşesc pragul de solubilitate al fosfatului tricalcic.
Totuşi, conţinutul în proteine şi alţi metaboliţi din ser previne precipitarea sării tricalcice.
Principiu:
Se precipită proteinele cu acid tricloracetic şi se separă prin filtrare. În filtratul
acidulat fosfatul anorganic, împreună cu molibdatul de amoniu, formează fosfomolibdatul de
amoniu ( un complex de culoare galbenă):

​12 (NH ) MoO

4 2 4
+ +
+ H3PO4 + 21H -----> (NH4)3PO4 × 12MoO3 + 21NH4 +12H2O

​(galben)

​HPO 4
2- 2- +
+ 12MoO4 + 3NH4 +23H
+
® (NH ) [P(Mo O
4 3 3
) ].6H2O + 6H2O
10 4

​Aceasta este redus la albastru de molibden (un amestec de oxizi de molibden,

(MoO2)2.MoO4, fin dispersaţi în apă) de către hidrochinonă şi apoi sulfit de sodiu. Intensitatea
culorii albastre este proporţională cu concentraţia complexului, deci cu cantitatea de fosfat
anorganic din probă, adică culoarea produsă de oxizii de molibden este fotometrabilă (se
supune legii Lambert-Beer).
Aparatură: ​- Spectrofotometru Spekol.
Reactivi: - Acid tricloracetic 20%
- Soluţie de molibdat de amoniu în mediu acid obţinut prin dizolvarea a 25g
molibdat de amoniu în 300ml H2O la care se adaugă 75ml H2SO4
concentrat iar apoi se completează la 500ml cu apă.
- Soluţie de hidrochinonă 1% acidulată cu o picătură de H2SO4 concentrat.
- Soluţie sulfit de sodiu 20% care se împrospătează la fiecare serie de
determinări.
- Soluţie standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparată folosind ca substanţă
etalon KH2PO4.
- Soluţie standard de lucru (20 mgP/ml) obţinută prin diluarea soluţiei stoc
de fosfat.
Curba de calibrare

1 234
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Sol. Standard de lucru de P
(1ml=20mgP), ml ​ 0,5 1 3 5
Acid tricloracetic 20%, ml ​ 2 222
Apă bidistilată, ml ​ 7,5 7 5 3
Din acest amestec se măsoară în
baloane Erlenmeyer: 5 555
Molibdat de amoniu, ml​ 1 111
Sulfit de sodiu 20%, ml ​ 1 111
Hidrochinonă 1%, ml ​ 1 111
Apă bidistilată, ml ​ 2 222

Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min. se citeşte extincţia faţă de blanc la

=600 nm.

Modul de lucru:
Se prepară o probă şi un blanc în conformitate cu tabelul de mai jos:
​
Proba Blanc
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Ser, ml 2 -
Apă bidistilată, ml 4 5
Acid triloracetic 20%, ml 4 -
Agitare energică şi repaus 10 min
Filtrare în eprubete + -
În baloane Erlenmeyer se măsoară:
Din filtrat, ml 5 -
Molibdat de amoniu, ml 1 1
Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1
Hidrochinonă 1%, ml 1 1
Apă bidistilată, ml ​ 2 2
​
Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min se citeşte extincţia probei faţă
de blanc la 600 nm.
Determinarea fosfatemiei se face raportând extincţia probei citită faţă de blanc la
curba de etalonare.

Valori normale: ​- adulţi:2,5-4,5 mg/100 ml ser (0,8-1,5 mmol/l)

​- copii: 4-6 mg/100 ml ser (1,3-1,9 mmol/l)

Variaţii patologice:
Valori scăzute: Hipofosfatemii apar în hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie.
Valori crescute: Hiperfosfatemii apar în hipoparatiroidism, acromegalie,
hipervitaminoză D, tubulopatii renale, insuficienţe renale acute şi
cronice.

Compuşi organici

Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl

 Principiu:
​Dozarea azotului din materiale biologice se face după metoda pusă la punct de către
Kjeldahl în 1883. Componentele organice azotate din ser se transformă prin mineralizare în
săruri de amoniu care în aparatul Wagner-Parnas eliberează amoniac. Amoniacul este captat
într-o soluţie de H2SO4 în exces iar excesul de H2SO4 se titrează cu o soluţie de NaOH în
prezenţa indicatorului Groak.
Reactivi: ​- H SO2 4
conc.
​- Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O şi K2SO4 (1:3), (m:m)
​- H O 2 2
3 %;
​- NaOH 30 %;
​- H SO2 4
N/100;
​- NaOH N/100;
- Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolică saturată de roşu metil se
adaugă 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %;
​Dozarea decurge în trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori şi titrarea
​Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H2SO4 conc., la
temperatură ridicată şi în prezenţa ionilor de cupru:
​2 N + 3 C + 3H2SO4 ® 2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2

​Sulfatul de potasiu ridică temperatura de fierbere la 350-400 0

C iar ionii de cupru, din
sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacţia. În cazul mineralizării NH3 reacţionează cu
H2SO4 prezent, transformându-se în sulfat de amoniu, conform reacţiei:
​2 NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4
Înaintea antrenării cu vapori, NH3 se eliberează din sulfatul de amoniu cu NaOH
concentrat:
​(NH4)2SO4 + 2 NaOH ® Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O
şi se antrenează cu vapori în aparatul Wagner-Parnas, într-un volum cunoscut de H2SO4
N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titrează cu NaOH N/100 în prezenţă de indicator Groak.
Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas este alcătuit din balonul A (generator de vapori) în
care se formează vaporii de apă, care prin vasul B (deflegmator) trec în balonul de antrenare
C antrenând de aici amoniacul. Aburii sunt condensaţi în refrigerentul descendent D, iar
soluţia apoasă de amoniac se colectează în flaconul Erlenmayer E care conţine soluţia de
H2SO4 N/100.
​Modul de lucru:
​1) Mineralizarea :
​Într-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H2O distilată, 0,1 ml ser, 2 ml
H2SO4 conc., un vârf de spatulă amestec catalizator şi 2-3 picături soluţie de H2O2.
Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl se răceşte la
temperatura camerei fiind lăsat în repaos sub nişă (atenţie, emană vapori corozivi de H2SO4 !).
 .

​2) Spălarea aparatului Wagner-Parnas:

​Înaintea acestei distilări aparatul Wagner-Parnas, cu reziduuri de la antrenarea
precedentă se spală. Pentru aceasta se procedează în felul următor: Se înlocuieşte flaconul E
cu un pahar Berzelius care conţine apă distilată. Se spală pâlnia F cu H2O distilată, apoi se
închide din nou robinetul ei. Prin răcirea şi condensarea vaporilor de apă presiunea din aparat
scade sub cea atmosferică şi astfel conţinutul vasului de distilare C este aspirat în vasul B, din
care apa se îndepărtează prin robinetul H în paharul Berzelius. Se răceşte balonul A cu
ajutorul unei cârpe ude până când apa distilată din pahar este aspirată până în vasul B de unde
se îndepărtează prin robinetul H iar după terminarea spălării se deschide robinetul de
siguranţă G şi se poate pregăti distilarea.
​
3) Antrenarea NH3 cu vapori de apă.
Într-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipetează 20 ml H2SO4 N/100, se adaugă
2-3 picături de indicator Groak şi flaconul se aşează sub refrigerentul D în aşa fel încât
capătul acestuia să fie introdus în soluţie. Conţinutul mineralizat al balonului Kjeldahl se
diluează cu precauţie cu 2 ml H2O distilată şi se introduce prin pâlnia F în vasul de distilare C.
Balonul Kjeldahl se spală de 3 ori cu câţiva ml de apa distilată iar aceasta se colectează tot în
pâlnia F.
​Se adaugă prin pâlnia F 20 ml NaOH 30%. Se închide robinetul pâlniei F, se
introduce flacăra sub balonul A şi apoi se închide robinetul de siguranţă G se aşteaptă până
când vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind închise.
Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, după ce prima picătură de condens
cade pe tubul refrigerentului descendet D. În acest timp amoniacul trece cantitativ în flaconul
E.
​După terminarea distilării se coboară flaconul în care s-a colectat condensul şi se lasă
să mai picure câteva picături. Cu ajutorul unei pisete se spală capătul refrigerentului D în
acest flacon. Numai după aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. După aceasta se
poate trece la spălarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Conţinutul flaconului
Erlenmayer E se supune titrării.
 4) Titrarea
​Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titrează cu NaOH N/100 în
prezenţa indicatorului Groak.

​Calcul :
​1 ml sol. H SO
2 4
N/100 ................. 0,14 mg N
​ ​ ................... x

​ x = ( ) 0,14 mg N/0,1 ml sol.

​
​a = 20 ml H2SO4 N/100
​b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.

Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului

Principiu:
​Proteinele reacţionează cu ionii de cupru în soluţie alcalină formând un complex
proteic de culoare violetă. Avantajul constă în faptul că se foloseşte un singur reactiv în care
hidroxidul de cupru este menţinut în soluţie sub formă de complex format cu tartratul dublu
2+
de sodiu şi potasiu, stabilizat cu iodură de potasiu. Reacţia de complexare cu ionii Cu este
dată de compuşi care conţin în molecula lor cel puţin două legături peptidice.
​Cel mai simplu compus care dă această reacţie este biuretul, compus care ia naştere
prin încălzirea ureei.

​
​ biuret

​
 Aparatura: Spectrofotometru sau fotometru cu filtre
Reactivi: ​- Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se dizolvă în 40 ml NaOH
0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4.5 H2O dizolvat în 10 ml H2O,
apoi 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N până la 100 ml. Se
conservă în sticlă brună timp nelimitat.
- Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se conservă
în sticlă brună timp nelimitat.
- Soluţia de lucru: se diluează 1 volum soluţie A cu 4 volume soluţie B.
Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă brună.
​ ​- NaCl 0,9 %.

​Modul de lucru:

​Se lucrează în 2 eprubete conform tabelului:

Proba Blanc
Sol. de lucru ml 5,0 5,0
NaCl 0,9% ml - 0,1
Ser ml 0,1 -

​Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 30 de minute se măsoară extincţia

probei (E) faţă de blanc, la = 546 nm, folosind cuva de 1 cm.

Calcul:
​c (g/100ml) =
E18,4 = g proteine/100 ml ser
; VF -volumul final; VP -volumul serului; -coeficientul de extincţie
procentual
​
Valori normale:
6,5 - 8,2 g/100 ml
​
​Valori crescute se întâlnesc în: deshidratări acute produse de vărsături, diaree, diabet,
diabet insipid, poliurie; Hiperproteinemii apar şi în: mielom multiplu macroglobulinemia
Waldenstrőm, boala Osler, boala Besnier-Boeck-Schaumann, anemie pernicioasă, infecţii
acute şi cronice
​Valori scăzute: se întâlnesc în: afecţiuni hepatice, ciroze hepatice, intoxicaţii cu
benzen, CCl4; Proteinemia scade şi în stări de şoc produse de arsuri, hemoragii;
Hipoproteinemii se întâlnesc în: afecţiuni renale, tumori maligne, inaniţie.
Hiperproteinemie relativă apare în deshidratări acute produse de vărsături, diaree,
poliurie care apare la pacienţii cu diabet insipid şi diabet zaharat. În cazurile enumerate nu
creşte de fapt cantitatea de proteine circulante ci creşte doar concentraţia lor din cauza
pierderii de lichid din organism. ​
Hiperproteinemie absolută apare în boli inflamatorii cronice (tuberculoză pulmonară,
lupus eritematos sistemic, sarcoidoză). În mielomul multiplu (plasmocitom) se produce
proliferarea canceroasă a unei clone de plasmocite producătoare de imunoglobuline al căror
nivel creşte în sânge. Macroglobulinemia Waldenström este un limfom malign cu
hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie şi în unele forme de leucemie.
Hipoproteinemie relativă apare în cadrul diluării sângelui circulant prin administrare
de perfuzii sau prin ingerare excesivă de lichide.
Hipoproteinemie absolută apare în deficitul genetic de anticorpi sau albumină,
afecţiuni hepatice grave (ciroză cu evoluţie spre insuficienţă hepatică, intoxicaţii cu benzen,
CCl4) în care este compromisă funcţia hepatică de sinteză a proteinelor. Pacienţii cu tumori
maligne prezintă hipoproteinemie datorită catabolismului proteic accentuat. În inaniţie şi
sindrom de malabsorbţie apare carenţă de proteine datorită aportului insuficient, sau datorită
tulburării de absorbţiei intestinală. Se pot pierde cantităţi însemnate de proteine în sindromul
nefrotic (prin filtrul renal lezat trec numeroase molecule de proteină şi se elimină prin urină),
sau poate avea loc pierdere de proteine pe cale intestinală (enterocolită). Hipoproteinemie
mai apare în arsuri extinse, hemoragii, ascită (lichid bogat în proteine apărut în cavitatea
abdominală în cadrul insuficienţei hepatice).

Electroforeza proteinelor serice

Principiu:
Electroforeza se bazează pe proprietatea particulelor încărcate electric de a migra spre
polul pozitiv sau negativ sub acţiunea tensiunii electrice. În funcţie de pH proteinele se
comportă ca anioni şi vor migra spre anod (+), sau ca şi cationi şi vor migra spre catod (-). În
cursul electroforezei componenţii amestecului de analizat se vor separa datorită vitezelor de
deplasare diferite. În funcţie de mediul în care are loc migrarea există două tipuri de
electroforeză: electroforeza în fază liberă şi electroforeza zonală. În cazul electroforezei în
fază liberă migrarea are loc în fază lichidă. Electroforeza zonală foloseşte o fază solidă sau
un gel de amidon, agar, agaroză etc. pentru migrare. Electroforeza zonală este tipul cel mai
folosit în laborator.
Aparate şi materiale: ​- Sursă de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA)
- Cameră de electroforeză confecţionată din material plastic
care conţine două cuve prevăzute cu electrozi de platină, şi o
punte mobilă pe care se vor pune lamele cu probele de analizat.
În camera de electroforeză închisă cu un capac se realizează
echilibrul lichid (tampon)-vapori de apă.
 Schema aparatului de elecroforeză.
a) plăcuţă de sticlă acoperită cu gel de agaroză; b) suport; c) benzi de hârtie de filtru; d)
soluţie tampon; e) electrozi.
Reactivi:
- Soluţie tampon: tampon Tris-barbital [tris-hidroximetil-aminometan 7,2 g/l;
acid dietilbarbituric (veronal) 1,82 g/l; dietilbarbiturat de sodiu (medinal)
10,2 g/l; etiltiosalicilat de mercur (conservant) 0,02 g/l], pH = 8,6
- Gel de agaroză: se prepară o soluţie de agaroză 1% în soluţia tampon, prin
încălzire la fierbere, care se toarnă pe plăcuţe de sticlă degresate anterior
cu alcool. Gelurile se pot păstra în frigider 2-3 zile în cutii umede de
plastic.
- Soluţie de fixare: se amestecă 90 ml metanol cu 20 ml acid acetic glacial şi
cu 90 ml apă bidistilată. Compoziţia ei este metanol 45% şi acid acetic
10%.
- Colorant: roşu de Ponceau 0,1% în soluţie de acid tricloracetic 10%.

Modul de lucru:

a.) În camera umedă se introduc în cele două cuve laterale volume egale de soluţie tampon,
măsurate cu cilindrul gradat. Aceste două compartimente nu comunică între ele, deoarece
numai în felul acesta curentul electric trece numai prin gel.
b.) Se scoate lama de sticlă cu gel din cutia de plastic. Se aşează o bandă de hârtie de filtru pe
o zonă a gelului unde urmează să fie depusă proba. După umectare se îndepărtează
imediat hârtia de filtru şi se pune în locul ei o matriţă pentru probe. Matriţa trebuie să
adere la gel. Cu o seringă cu Hamilton se introduce 1 µl de ser în şanţul creat de matriţă
şi se aşteaptă 5 minute pentru absorbţia serului în gel. După 5 minute se îndepărtează
excesul de ser cu o bandă de hârtie de filtru. Se scoate matriţa şi se pune lama pe puntea
care se află în mijlocul camerei de electroforeză. La extremităţile lamelor se aplică două
hârtii de filtru Whatman îmbibate cu soluţie tampon. Aceste hârtii de filtru sunt îndoite la
capete astfel încât cu un capăt să acopere aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei
(gelului), iar celălalt capăt să facă legătura cu soluţia tampon din cuvele cu electrozi.
c.) Se închide etanş aparatul, se conectează cuvele la redresor şi se lasă probele la migrat 1 h
la 170 V.
d.) După migrare se scot lamele din camera de electroforeză şi se introduc 10 minute în
soluţia de fixare, aflată într-o cutie Petri.
e.) Colorarea se face prin îmbibare timp de 5 minute într-o soluţie de colorant aflat într-o
cutie Petri. Excesul de colorant de pe plăcuţe se îndepărtează prin spălare cu apă distilată.
f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea
consistenţa unui film.
g.) Determinarea cantitativă a fracţiunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru optic.
 Acesta trasează automat curba de extincţie (reflexie optică), care prezintă atâtea maxime
câte fracţiuni sunt. Aparatul calculează valorile procentuale ale fracţiunilor proteice. În
cazul serului normal, prin electroforeza în gel de agaroză, rezultă următoarele 6 fracţiuni:

Fracţiunea Valoarea procentuală g/100ml

Albumine 50-59 3,50-4,20
1 - Globuline 3-5 0,25-0,40
- Globuline 7-9 0,50-0,65
2
d
1 + 2- Globuline 11-14 0,80-1,02
- Globuline 16-20 1,10-1,40
​
​Interpretarea valorilor fracţiunilor proteice.

1. Hiperalbuminemiile apar în puţine stări patologice, mai importante fiind leucozele limfatice
cronice.
2. Hiperglobulinemie globală ( ) se întâlneşte în cazul tumorilor maligne, bolilor
infecţioase acute sau cronice, afecţiunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice.
3. Hiperalfaglobulinemia asociată sau nu cu hiperbetaglobulinemia se întâlneşte în inflamaţii
acute (reumatism poliarticular acut, boli infecţioase acute, infarct miocardic), sindrom
nefrotic (cresc îndeosebi 2 – globulinele), tumorile maligne, poliartrita reumatoidă.
4. Hiperbetaglobulinemia izolată se întâlneşte în ​- plasmocitom, hepatite acute
virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit.
5. Hiperalfa şi hipergamaglobulinemia sunt întâlnite în inflamaţiile acute şi cronice, în tumori
maligne.
6. Hipergamaglobulinemie izolată se întâlneşte în afecţiunile cu implicaţie imunologică cum
sunt: ​
- boli infecţioase acute sau cronice: hepatită virotică, mononucleoză infecţioasă;
- limfogranulomatoză benignă, tuberculoză, sifilis, stafilococi, streptococi endocardită
bacteriană subacută;
- colagenaze: poliartrită reumatoidă, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie;
- afecţiuni hepatice: hepatite cronice, ciroze;
- afecţiuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii.
7. Hipogamaglobulinemia se întâlneşte în :
- agamaglobulinemie şi hipogamaglobulinemie congenitală;
- afecţiuni digestive: inflamaţia mucoasei digestive, neoplasm digestiv;
- sindrom nefrotic;
- insuficienţă cardiacă;
- arsuri întinse;
- eczeme generalizate.
 ​În figură sunt prezentate proteinogramele obţinute prin citirea electroforegramelor la
densitometru optic, în câteva cazuri patologice precum şi în cazul normal. a) Normal (vezi
tabelul de mai sus), b) Inflamaţie acută, c) Inflamaţie cronică, d) Sindrom nefrotic, e)
Enteropatie exudativă, f) Ciroză hepatică, g) Mielom multiplu, h) Hipogamaglobulinemie.

Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:
​Azotul neproteic reprezintă azotul din substanţele ce rămân în soluţie după
deproteinizarea serului (uree, acid uric, creatină, creatinină, aminoacizi, amoniac, etc.). Dintre
acestea azotul ureic reprezintă mai mult de 50 %. Diferenţa dintre azotul total neproteic şi
azotul ureic se numeşte azot rezidual.
​După precipitarea şi îndepărtarea proteinelor conţinutul de azot neproteic se determină
după acelaşi principiu ca şi în cazul dozării azotului total din ser prin metoda Kjeldahl.
​Aparatură: ​Aparatul Wagner-Parnas.
Reactivi: ​- Fosfowolframat de sodiu 10 %
​- H SO
2 4
0,58 N
​- H SO
2 4
conc.
​- Amestec catalizator CuSO .5H O 4 2
şi K2SO4 (1:3)
​- H O
2 2
3%
​- NaOH 30 %
​- H SO
2 4
N/100 cu factorul FH2SO4
 ​- NaOH N/100 cu factorul FNaOH
​- Indicator Groak
​Modul de lucru: ​
1) Deproteinizarea serului: Într-un flacon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml H2O
bidistilată, 2 ml soluţie de fosfowolframat de sodiu şi 2 ml H2SO4 0,58 N. Se agită energic şi
după 10 minute proba se filtrează.
​2) Mineralizarea : Într-un balon Kjeldahl se introduc 2 ml filtrat, 2 ml H2SO4 conc., 2-
3 picături soluţie de H2O2 şi un vârf de spatulă de amestec catalizator. Mineralizarea are loc pe
flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl se răceşte la temperatura camerei.
​3) Spălarea aparatului Wagner-Parnas: se face ca mai sus.
4) Antrenarea NH3 cu vapori de apă : Se efectuează după modul descris la dozarea
azotului total, cu excepţia faptului că amoniacul pus în libertate se va capta în 10 ml H2SO4
N/100.
​5) Titrarea: Excesul de H2SO4 se titrează cu o soluţie de NaOH N/100 în prezenţa
indicatorului Groak.
Calcul :
​1 ml sol. H SO 2 4
N/100 ................. 0,14 mg N
​ .................. x
​ x = () 0,14 mg N/0,4 ml ser
​ ​a = 10 ml H2SO4 N/100
​ ​b = volumul NaOH N/100 consumat la titrare
​Rezultatul se exprimă în mg N neprot./100 ml ser.
​Având în vedere că 50% din azotul neproteic este reprezentat de azotul ureic,
interpretarea ese aceeaşi cu cea de la uree.
Valori normale : 20 - 40 mg N neprot./ 100 ml ser
​Valori crescute: se întâlnesc în afecţiuni renale ca insuficienţa renală cronică sau în
obstrucţii ale căilor urinare. Aceste valori se mai întâlnesc în arsuri, hemoragii digestive,
boala Addison.

Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează

Principiu:

Ureea din ser este

hidrolizată sub acţiunea unei enzime specifice, ureaza, şi se descompune în amoniac şi dioxid
de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe baza reacţiei pe care o dă cu fenolul şi
hipocloritul de sodiu în mediu alcalin. (Reacţia Ber​thelot).
parachinoncloroimina formată astfel, reacţionează cu o altă moleculă de fenol pentru a forma
indofenol care dezvoltă în mediu alcalin o intensă culoare albastră. Reacţia este catalizată de
nitroprusiatul de sodiu.

Reactivi:
- urează tamponată: se dizolvă 1 g EDTA în 80 ml apă bidistilată şi se ajustează, pH-
ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaugă apoi 150 mg urează şi se completează
volumul la 100 ml cu apă bidistilată. Se agită bine şi se păsrează într-un vas de
plastic.
- soluţie etalon de uree: 40 mg uree pură, uscată în prealabil în exicator, se dizolvă în
apă bidistilată aducându-se la 100 ml.
- reactiv fenolic. Se dizolvă 25 g fenol chimic pur în 400 ml apă bidistilată. Separat
se dizolvă 125 mg nitroprusiat de sodiu în 50 ml apă distilată. Se amestecă cele
două soluţii şi se aduce volumul la 500 m1.
- reactiv hipoclorit. Într-un balon de 500 ml se dizolvă 12,5 g NaOH în 400 ml apa
bidistilată. Se adaugă apoi un volum de hipoclorit co​mercial conţinând 1,10 g
hipoclorit de sodiu (de regulă 20 ml soluţie). Se aduce volumul la 500 ml.
Modul de lucru:
Se pipetează 0,2 ml suspensie urează într-o serie de eprubete. Se adaugă apoi cu o
pipetă câte 0,02 ml ser în probele de analizat, 0,02 ml apă distilată pentru proba oarbă şi 0,02
ml soluţie de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubează eprubetele la 37°C pe baia de
apa timp de 15 minute. Se scot epru​betele de la incubat şi se adaugă 1 ml reactiv fenolic, se
agită uşor şi se adaugă 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se incubează din nou la 37°C timp de
15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din baie eprubetele şi se diluează prin adăugarea
a 10 ml apă distilată. Se amestecă continuu eprubetele şi se citeşte extincţia la 630 nm fată de
proba oarbă.
Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului )• 40

Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski

Principiu: ​Ureea este descompusă în mediu alcalin cu ajutorul soluţiei de

hipobromit de sodiu rezultând azot molecular, dioxid de carbon şi apă. Soluţia de hipobromit
de sodiu se prepară din Br2 şi NaOH .
Br2 + 2NaOH → NaOBr + H2O

​
​Dioxidul de carbon este fixat de către NaOH, aflat în exces în soluţia de hipobromit de
sodiu, sub formă de Na2CO3 conform reacţiei:
CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O
​Azotul molecular degajat este măsurat volumetric în aparatul Kowarski.
 Aparatură : Aparatul Kowarski are forma unui tub în formă de "U". Ramura stângă
(A) este prevăzută în partea superioară cu un robinet (a) şi este gradată atât deasupra cât şi
dedesubtul robinetului. Ramura dreaptă (B) nu este gradată şi are în partea inferioară un
robinet (b) cu trei căi în formă de T. De aici se ramifică şi tubul de scurgere (C). Pe robinetul
cu trei căi (b) direcţia căii verticale a T-ului este evidenţiată de obicei ca o umflătură sau
adâncitură (semn). Prin răsucirea acestui robinet se obţin trei poziţii în funcţie de poziţia
umflăturii robinetului: 1) semnul în spate : comunică A cu B. 2) semnul în jos : comunică A
cu C. 3) semnul în sus : comunică B cu C. 4) semnul în faţă : comunică A şi B cu C
Reactivi: ​- Acid tricloracetic 10 %.
- Soluţie Kowarski : 350 g NaCl şi 150 g K2SO4 se dizolvă la fierbere
în 1000 ml H2O, se răceşte şi se filtrează.
- Soluţie NaOBr : se prepară proaspăt, adăugând sub nişă, sub agitare,
 12 picături de brom la 6 ml NaOH 33 %. Se păstrează la gheaţă cel
mult o săptămână.
​Modul de lucru:
​Deproteinizarea serului: într-un flacon Erlenmayer se pipetează 2,5 ml ser şi 2,5 ml
acid tricloracetic 10 %. Se agită şi după 10 minute se filtrează.
Manipularea aparatului : Se umple aparatul cu soluţie Kowarski. Pentru aceasta se stabileşte
legătura între ramurile A şi B, se deschide robinetul "a" şi se toarnă soluţia Kowarski în aparat
prin ramura B până când lichidul depăşeşte nivelul robinetului "a" cu 1-2 ml. Dacă rămâne aer
în aparat, el se îndepărtează prin tubul de scurgere C (semnul în jos), apoi se completează
lichidul până la nivel. Se închide robinetul "a", se îndepărtează cu o pipetă lichidul de
deasupra şi se usucă cu o fâşie de hârtie de filtru. Robinetul "b" se aşează cu semnul în jos. În
ramura A se toarnă aproximativ 3,5 ml filtrat. Se lasă să pătrundă în aparat, prin deschiderea
robinetului "a", exact 2,5 ml filtrat. Excesul de soluţie Kowarski se va scurge prin tubul C. Se
îndepărtează cu o pipetă restul filtratului, se spală cu H2O distilată şi se usucă din nou cu
hârtie de filtru. Se introduc apoi, prin ramura A, 6 ml soluţie de NaOBr. Se lasă să intre în
aparat cca. 5 ml. Degajarea azotului începe imediat împingând în jos soluţia Kowarski care se
scurge prin tubul C. După 10 minute se aduce la nivelul ramurei A soluţia din ramura B,
lăsând să curgă din ramura B lichidul în exces (semnul în sus). Apoi se stabileşte comunicarea
între ramurile A şi B (semnul în spate). În acest fel azotul din aparat va avea aceiaşi presiune
cu cea a mediului înconjurător. Se citeşte volumul azotului degajat (vN2) precum şi
temperatura şi presiunea atmosferică. După dozare aparatul Kowarski se goleşte şi se spală
cu apă distilată pentru a evita blocarea robinetelor.
Calcul:
​ = mg uree/100 ml ser
​ - volumul de azot degajat
​ ​F - factor de conversie din ml N 2
în mg uree
​Se caută în tabelul Kowarski factorul F care corespunde temperaturii şi presiunii
barometrice din timpul determinării. Această valoare se introduce în formula de mai sus.
Baro-
metru 10º C 12º C 14º C 16º C 18º C 20º C 22º C 24º C 25º C
710 1,91 1,90 1,88 1,86 1,84 1,83 1,81 1,80 1,79
720 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87 1,85 1,84 1,82 1,80
725 1,95 1,93 1,92 1,90 1,89 1,87 1,85 1,83 1,82
730 1,97 1,94 1,93 1,91 1,90 1,88 1,87 1,85 1,83
735 1,98 1,96 1,94 1,93 1,91 1,89 1,88 1,86 1,84
740 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92 1,90 1,89 1,87 1,86
745 2,01 1,99 1,98 1,96 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87
750 2,02 2,00 1,99 1,97 1,95 1,93 1,92 1,90 1,88
755 2,04 2,02 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,92 1,90
760 2,05 2,03 2,01 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,91
765 2,06 2,05 2,03 2,01 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92
770 2,08 2,06 2,04 2,02 2,00 1,98 1,97 1,95 1,93
 ​Valori normale : 21 - 54 mg uree/100 ml ser sau 3,5 – 9,0 mmoli/l
​Valori crescute : Patologic creşterea ureei poate fi de origine renală sau extrarenală.
Cauze de origine renală: i​ nsuficienţă renală acută sau cronică; (eliminare scăzută),
glomerulonefrită acută sau cronică, nefroangioscleroză benignă
sau malignă, tuberculoză renală, tumori renale, rinichi
polichistic, calculoză.
Cauze de origine extrarenlă: stări de exsicoză şi şoc provocate de hemoragii, arsuri,
traumatisme;
​Valori scăzute : - insuficienţă hepatică gravă (ciroză)(sinteză scăzută)

Dozarea acidului uric din ser

Principiu:
Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce în mediu alcalin
reactivul fosfowolframic până la un produs de culoare albastră. Intensitatea culorii este
proporţională cu concentraţia acidului uric în proba de analizat.
Reactivi: ​- Acid tricloracetic 20%
- Reactiv fosfowolframic: într-un balon de 1000 ml prevăzut cu
refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40 ml
3
H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm ) şi 350 ml apă bidistilată. Se fierbe lent
aproximativ 6 ore. Se răceşte balonul şi conţinutul său se trece
cantitativ într-un balon cotat de 500 ml. Se aduce la semn cu apă
bidistilată. Dacă reactivul este verde se adaugă 1-2 picături de brom
şi se fierbe câteva minute fără refrigerent pentru îndepărtarea
excesului de brom. Reactivul are culoarea galben-verde deschis,
păstrat în sticlă brună, el nu se alterează. Reacţia este următoarea:
12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O
- Na2CO3 crist 22%
- Soluţie stoc de acid uric: se introduc în aproximativ 60 ml apă
bidistilată caldă (60°C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic, 100
mg fosfat monosodic şi se agită până la dizolvare completă. După
răcire se completează la 100 ml cu apă bidistilată într-un balon cotat.
Soluţia stoc, închisă ermetic prin parafinare (după adăugare de 3-4
picături de cloroform) se poate păstra 4-5 luni la temperatura de +4°C.
- Soluţia standard de acid uric se prepară prin diluarea soluţiei stoc: 1
ml se aduce la 100 cu apă bidistilată.
Modul de lucru:
a) Deproteinizarea serului: Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml apă bidistilată
si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agită puternic şi după 10 minute se filtrează.
b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizează efectuând următoarele amestecuri în
eprubete care apoi se agită energic:
 Probă Standard Blanc
Filtrat, ml 2,0 - -
Sol. standard, ml - 2,0 -
Apă distilată, ml - - 2,0
Na2CO3 22%, ml 0,9 0,9 0,9
Reactiv fosfowolframic, ml 0,1 0,1 0,1

Se lasă eprubetele în repaus 10 minute la temperatura camerei, apoi se măsoară

extincţia probei şi a standardului faţă de blanc la =610 nm în cuva de 1 cm.
Observaţie: În cazul că proba prezintă opalescenţă, ea se centrifughează înainte de
măsurarea estincţiei.
Calcul:
concentraţia standardului = 1 mg%
2 ml filtrat corespunde la 0,5 ml ser ( diluţia serului= 2/0,5 = 4)
Ep/Es x 1 x 4 = mg acid uric/100 ml ser iar mg % x 60 = mmoli/l

Valori normale: ​2-8 mg acid uric/100 ml ser ( 119 - 476 mmoli/l )

Valori crescute: ​fiziologic: după efort fizic accentuat sau după ingestia unor cantităţi
crescute de alimente bogate în acizi nucleici (ficat, testicule).
patologic: ​a) hiperuricemie primară (biosinteză crescută sau
eliminare renală scăzută)
b) hiperuricemie secundară, destrucţie celulară
accentuată în tumori maligne, anemie hemolitică,
pneumonie severă etc.; eliminare renală scăzută
(insuficienţă renală, acidoză metabolică si respiratorie)
Hiperuricemia de durată determină acumularea acidului uric în organism şi apariţia gutei.
Valori scăzute: mai rar întâlnite, apar în urma administrării unor medicamente, defecte
enzimatice (xantinurie ereditară), afecţiuni hepatice grave.

Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin

Principiu:
Creatinina reacţionează cu acidul picric (galben) în mediu alcalin dând naştere unui
produs a cărui coloraţie poate fi de la orange la roşu aprins. Intensitatea coloraţiei roşii este
proporţională cu concentraţia creatininei din probă. Coloraţia se datorează formării unor
tautomeri coloraţi ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin complexare de un mezomer al
acidului picric (reacţia Jaffé).
 Reactivi: ​- Wolframat de sodiu 10%.
- H2SO4 2/3N.
- Soluţie saturată de acid picric.
- NaOH 10%.
- Soluţie picrat alcalin; se prepară înainte de utilizare prin amestecarea
unui volum de soluţie de acid picric cu 2 volume NaOH 10%
- Soluţie stoc de creatinină: se dizolvă în HCl 0,1N 100 mg creatinină
pură sau 160,2 mg clorură de zinc creatinină şi se aduce volumul la 100
ml cu HCl 0,1N
- Soluţia standard de creatinină se obţine diluându-se 1 ml din soluţia
standard stoc la 100 ml cu apă bidistilată. Această soluţie conţinând
0,01 mg creatinină/ml trebuie reînnoită săptămânal.
Modul de lucru:
Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml de ser şi 6 ml acid picric saturat şi se agită
energic. Se introduce balonul pentru 15-20 secunde într-o baie de apă fierbinte. După răcire se
filtrează într-o eprubetă iar din filtrat se măsoară 5 ml. Se adaugă 0,25 ml soluţie de NaOH
10% se agită şi peste 15 minute se citeşte extincţia probei (Ep) faţă de martor la = 530 nm.
Martorul este soluţia de picrat alcalin, căreia în loc de ser i s-au adăugat 2 ml apă bidistilată.
În paralel se efectuează aceleaşi operaţii, în locul serului folosindu-se soluţie standard de
creatinină. Extincţia obţinută este Es.
Calcul:
​Ep/Es = mg creatinină/100ml ser.
Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 moli/l.
Variaţii fiziologice: nivelul seric al creatininei suferă doar foarte mici variaţii în
condiţii fiziologice. El poate creşte în condiţiile unei diete foarte bogate în proteine.
Clearance-ul endogen de creatinină (fără aport exogen de creatinină) este un indicator al
filtrării glomerulare la subiecţii normali.
Valori patologice crescute: se întâlnesc în insuficienţă renală cronică (este ultima
substanţă azotată care creşte în sânge în aceste condiţii, ca şi în condiţiile fiziologice),
distrofia musculară progresivă, eclampsie, acromegalie.

Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh

Principiu:
Bilirubina reacţionează cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) şi
formează azopigmenţi, care au culoare roşie în mediu slab acid sau neutru (reacţia van den
Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubină cuplată cu sarea de diazoniu a
acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubină conjugată cuplată cu
aceiaşi sare de diazoniu. Intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia bilirubinei
din ser.
 Complex roşu portocaliu de titrat
Reactivi: de creatinină
​-Soluţie HCl 1N;
- Soluţie de cofeină-benzoat-acetat: se cântăresc şi se amestecă 20 g cofeină
pură, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaugă 400 ml apă
bidistilată şi se dizolvă încălzind uşor. După răcire se filtrează.
- Reactiv diazo: Sol.A: se măsoară 0,5 g acid sulfanilic într-un balon cotat de
500 ml, se adaugă 125 ml HCl 1N şi se completează până la semn cu apă
bidistilată
​Sol.B: NaNO2 0,5%
Înainte de întrebuinţare se amestecă 10 ml soluţie A cu 0,3 ml soluţie B.
- NaCl 0,9%

Bilirubina neconjugată (bilirubina indirectă) în stare liberă nu este hidrosolubilă, este

menţinută în soluţie apoasă prin legarea sa strânsă pe albumină. Această bilirubină nu
reacţionează direct cu reactivul diazo ci doar în prezenţă de acceleratori (alcooli inferiori,
cofeină, etc.), care o eliberează din legătura cu albumina şi o menţin în soluţie. Nu se filtrează
la nivel glomerular, deci în mod normal nu apare în urină.
Bilirubina conjugată (bilirubina directă) hidrosolubilă reacţionează direct cu reactivul
diazo. Se filtrează la nivel glomerular şi apare în urină.
Se dozează paralel bilirubina totală (directă + indirectă) si bilirubina directă.
Modul de lucru: Se lucrează în trei eprubete după tabelul de mai jos:
Bilirubina totală Bilirubina directă Blanc
reactiv Ehrlich ml 0,5 0,5 -

sol. de cofeină ml 3,5 - -

NaCl 0,9% ml - 3,5 4,0
ser ml 1,0 1,0 1,0

După amestecarea reactivilor se agită energic eprubetele iar după 5 minute se citesc
extincţiile la l = 530 nm, în cuva de 1 cm faţă de blanc.
Calcul:
Rezultatul se calculează cu ajutorul coeficientului de extincţie specific procentual (a)
al azopigmentului la = 530 nm:
1g% 1mg%
a = E1cm = 943, de unde E1cm = 0,943

Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (Vp) = 1,0 ml; diluţia probei = Vf/Vp = 5
 Ep = extincţia citită
Concentraţia bilirubinei (bilirubinemia) se calculează cu formulele:

mg bilirubină/100 ml ser =
mmoli bilirubină/l ser = Ep
x 91 ştiind că Mbilirubină = 584

Se calculează separat valoarea bilirubinemiei totale şi a celei directe iar diferenţa între
aceste două valori reprezintă bilirubinemia indirectă.
Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 mmoli/l) bilirubină totală, din care bilirubina
directă cca. 0,25 mg% (4,3 µmoli/l).
Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinând apariţia unei coloraţii gălbui a
scleroticelor şi a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51mmoli/l).
Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:
- creşterea vitezei de formare a bilirubinei în urma degradării excesive a
hemoglobinei (hemoliză) în icterul hemolitic;
- scăderea capacităţii de conjugare a ficatului cauzează hiperbilirubinemia
indirectă (10-40mg%) la homozigoţi (sindromul Crigler-Najjar de tip I);
- scăderea capacităţii de eliminare a bilirubinei de către ficat (boala Gilbert);
- perturbarea eliminării prin bilă a bilirubinei în urma blocării căilor biliare
(calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) în icterul
mecanic;
- deficitul intrahepatic de eliminare activă a bilirubinei conjugate de la nivelul
microsomilor hepatici în canaliculele biliare (sindrom Dubin-Johnson)
determină hiperbilirubinemie directă (2-10 mg%);
- icterul neonatal, datorat imaturităţii sistemelor de epurare a bilirubinei la nou
născut când bilirubinemia este crescută (4-5 mg%) temporar (1-2 zile)
după care revine la normal.

Glucoza
Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică)
Glucoza este repartizată în mod inegal şi variabil între plasmă şi eritrocite, de aceea
dozarea ei se face din sângele total, recoltat pe florură de sodiu. Aceasta previne coagularea
sângelui şi inhibă glicoliza.

Principiu:
Glucoza prezentă în filtratul de sânge (deproteinizat), reduce cantitativ fericianura de
potasiu în ferocianură de potasiu.

K3[Fe(CN)6] + glucoză K4[Fe(CN)6] + acid gluconic

Excesul de fericianură eliberează iodul din iodura de potasiu în mediu acid.

 CH COOH
2 K3[Fe(CN)6] + 2 KI 3
2 K4[Fe(CN)6] + I2

Această reacţie fiind reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin

precipitarea ferocianurii sub formă de sare dublă de zinc şi de potasiu. Acelaşi rol are şi
asigurarea mediului acid (CH3COOH).

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 K2Zn3[Fe(CN)6] ¯ + 3 K2SO4

Iodul pus în libertate se titrează cu tiosulfat de sodiu, în prezenţa amidonului ca

indicator.
2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2 NaI

Reactivi: ​- NaOH N/10

- ZnSO4 0,45 % (se păstrează aproximativ trei săptămâni)
- K3[Fe(CN)6] N/200 (într-un balon cotat de 1000 ml se măsoară 1,65
g fericianură de potasiu pură, 10,6 g carbonat de sodiu pur anhidru şi
apă distilată până la semn)
- ZnSO4 - NaCl (se măsoară 100 g sulfat de zinc, 500 g clorură de
sodiu şi apă distilată până la 1600 ml)
- KI 2,5 %
- CH3COOH 3 % (3 ml acid acetic glacial, H2O distilată până la 100
ml)
- Reactivul KI – ZnSO4 – NaCl: 5 ml KI 2,5% + 20 ml sol. ZnSO4 –
NaCl
- Amidon 1%
- KIO3 N/200 F KIO3= 1,000
- Na2S2O3 N/200 (factorul soluţiei se verifică prin titrare cu soluţia de
KIO3 N/200)

Modul de lucru:
Se lucrează cu 4 eprubete, din care primele două vor fi pentru probe, celelalte două
pentru blancul reactivilor.

Deproteinizarea: În fiecare eprubetă se măsoară1 ml NaOH N/10 + 5 ml ZnSO4 0,45

%. Se formează un precipitat gelatinos de hidroxid de zinc care serveşte la deproteinizarea
prin adsorbţie a proteinelor coagulate ale sângelui. Se adaugă apoi numai în primele două
eprubete, pentru probe câte 0,1 ml sânge. În continuare nu există nici o deosebire între
prelucrarea probelor şi a blancului. După agitare se pun toate eprubetele pe un stativ, se
introduc într-o baie de apă clocotind şi se fierb 5 minute. După fierbere se filtrează conţinutul
eprubetelor prin filtrele pregătite în prealabil, în tuburi Hagedorn (sau baloane Erlenmeyer de
50 ml). Pentru a evita pierderi de glucoză se spală eprubetele, de 2 ori cu câte 3 ml apă
distilată fiartă trecând şi această apă distilată prin filtru.
Reducerea fericianurii: Se adaugă la filtratul din fiecare balon câte 2 ml fericianură de
potasiu N/200 (măsuraţi foarte exact). Se agită uşor şi se introduc baloanele pentru 15 minute
într-o baie de apă în fierbere. După răcirea baloanelor într-un curent de apă, se introduc câte:
- 2 ml din reactivul KI - ZnSO4 - NaCl.
- 2 ml acid acetic 3 %
- 2 picături amidon 1 %.
Se titrează soluţiile din tuburile Hagedorn (baloane Erlenmeyer) cu tiosulfat de sodiu
N/200 până la dispariţia culorii albastre.
Calcul:
Calculul se face cu ajutorul unui tabel care dă echivalenţa dintre numărul de ml de
tiosulfat folosit la titrare şi concentraţia glucozei în mg/100 ml. Se ia media probelor paralele
şi cifra obţinută se înmulţeşte cu factorul tiosulfatului. Se procedează la fel şi în cazul
blancurilor, care ne oferă o măsură a impurităţilor reducătoare din reactivi. Se caută în tabelul
dat concentraţiile de glucoză corespunzătoare. Din "glicemia" probei se scade "glicemia"
blancului. Diferenţa obţinută exprimă concentraţia de glucoză în mg/100 ml de sânge analizat.

TABEL
Relaţia dintre ml de Na2S2O3 N/200 consumat la titrare şi glicemia în mg %

Na2S2O3 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
0,0 385 382 379 376 373 370 367 364 361 358
0,1 355 352 350 348 345 343 341 338 336 333
0,2 331 329 327 325 323 321 318 316 314 312
0,3 310 308 306 304 302 300 298 296 294 292
0,4 290 288 286 284 282 280 278 276 274 272
0,5 270 268 266 264 262 260 259 257 255 253
0,6 251 249 247 245 243 241 240 239 236 234
0,7 232 230 228 226 224 222 221 219 217 215
0,8 213 211 209 208 206 204 202 200 199 197
0,9 195 193 191 190 188 186 184 182 181 179
1,0 177 175 173 172 170 168 166 164 163 161
1,1 159 157 155 154 152 150 148 146 145 143
1,2 141 139 138 136 134 132 131 129 127 125
1,3 124 122 120 119 117 115 113 111 110 108
1,4 106 105 102 101 99 97 95 93 92 90
1,5 88 86 84 83 81 79 77 75 74 72
1,6 70 68 66 65 63 61 59 57 56 54
1,7 52 50 48 47 45 43 41 39 38 36
1,8 34 32 31 29 27 25 24 22 20 19
1,9 17 15 14 12 10 8 7 5 3 2
 Exemplu: media volumelor soluţiei de tiosulfat întrebuinţată pentru titrare celor 2
probe să o presupunem 1,53. Aceasta se înmulţeşte cu factorul pe care îl presupunem 0,9660.
1,53 ´ 0,9660 = 1,47798 » 1,48 ml tiosulfat N/200
Media probelor în alb (blancuri) să fie 1,85 care se înmulţeşte cu factorul, adică,
1,85 ´ 0,9660 = 1,7871 » 1,79 ml tiosulfat N/200.
La 1,48 ml tiosulfat corespund în tabel 92 mg glucoză/100 ml, iar la 1,79 ml, 36 mg
%.
Rezultatul este dat de diferenţa: 92 - 36 = 56 mg/100 ml.
Mmoli/l = (mg/100 ml) ´ 10/180 = (mg/100 ml) ´ 0,055; (M glucoză = 180)
În condiţiile de mai sus, mmoli/l = 56 x 0,055 = 3,08. Valoarea obţinută indică
hipoglicemie.
Valori normale: 4,4 - 6,6 mmoli/l (80 - 120 mg %)

Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)

Principiu:
Glucoza, sub acţiunea glucozoxidazei, se transformă în acid gluconic. H2O2 rezultată
va fi descompusă de peroxidază, în urma reacţiei la care participă şi indicatorul Trinder (fenol
şi 4-aminoantipirină), rezultând un produs de condensare colorat în roşu cu absorbţie maximă
la = 505 nm. Extincţia este direct proporţională cu concentraţia glucozei. Reacţiile care stau
la baza metodei sunt următoarele:
glucozoxidază
Glucoză + O2 + H2O acid gluconic + H2O2

peroxidază
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimină + 4 H2O
(roşu)

Reactiv ​i: 1). Reactiv 1 conţine: tampon TRIS-Cl sau Sörensen 90 mmoli/l şi fenol 0,3
mmoli/l (pH = 7,5 ).
​ 2). Reactiv 2 conţine: glucozoxidază 10000 U/l, peroxidază 1000 U/l şi
4-aminoantipirină 2,6 mmoli/l
​3). Reactiv 3 conţine: standard de glucoză 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100 mg %)
Probe: ser nehemolizat, plasmă heparinată, sânge deproteinizat, LCR (lichid
cefalorahidian).

Modul de lucru:
Se amestecă conţinutul unei sticluţe de reactiv 2 cu conţinutul unei sticluţe de reactiv
o
1, obţinând astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluţiei la 20 - 25 C este 2 săptămâni, iar la
o
2 - 8 C este de o lună.
Se prepară următoarele soluţii:
 Blanc Standard Probă
H2O distilată 10 ml - -
Standard - 10 ml -
Probă - - 10 ml
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml

o
Se agită conţinutul eprubetelor şi se incubează timp de 10 minute la 37 C sau 30
o
minute la temperatura camerei (20 - 25 C). Se măsoară extincţia probei faţă de blanc la 505
nm (490 - 550 nm). Culoarea formată este stabilă 30 minute.
Calcul:
E probă
Cprobă = ´C standard

E standard

Cstandard este 5,56 mmoli/l, sau 100 mg %, în funcţie de unităţile de măsură folosite la
exprimarea concentraţiei glucozei din soluţia standard.
Linearitate: Extincţia este direct proporţională cu concentraţia glucozei până la 22,22
mmoli/l (sau 400 mg %). Dacă concentraţia glucozei depăşeşte această valoare, se diluează
proba cu ser fiziologic şi se repetă determinarea. La calcularea rezultatului se ia în considerare
diluţia.
Valori normale: ​ser, plasmă: 3,9 - 5,8 mmoli/l (70,2 – 104,45 mg %)
​LCR: 2,8 - 3,9 mmoli/l (50,4 – 70,2 mg %)

Teste rapide pentru determinarea glicemiei

În practica medicală curentă se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici,
asemănătoare cu un calculator de buzunar), care determină glicemia prin metodă enzimatică
specifică pentru glucoză. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri (kituri, benzi de
hârtie impregnate cu reactivi).
Mod de utilizare:
Efectuăm pregătirile pentru prelevarea sângelui din pulpa degetului, apoi pornim
aparatul, care începe numărătoarea inversă. Înţepăm un deget şi punem o picătură de sânge pe
strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, înlăturăm prin tamponare cu hârtie
excesul de sânge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul în aparat şi, la unele tipuri, apăsăm
butonul de măsurare. Peste câteva momente apare pe ecran valoarea glicemiei în unitatea de
măsură folosită de aparatul respectiv.
Avantajele metodei: - Este o metodă rapidă, precisă şi specifică pentru glucoză
​- Se poate folosi în dispensare medicale şi la domiciliu, fiind
foarte utilă în monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici
​- Unele aparate au şi memorie în care sunt păstrate ultimele
valori ale glicemiei
​- Necesită o cantitate foarte mică de sânge (o picătură).
 Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l)
Valorile obţinute la determinarea glicemiei depind de metoda folosită.
În sânge, alături de glucoză, sunt şi alte substanţe reducătoare (glutation, acid
ascorbic, acid uric, cisteină). Din acest motiv valorile glicemiei obţinute prin metode chimice,
care se bazează pe proprietatea reducătoare a glucozei (metoda Hagedorn-Jensen, colorimetrie
cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate decât cele obţinute prin metoda enzimatică
specifică cu glucozoxidază. Metoda colorimetrică cu o-toluidină dă rezultate mai apropiate de
valorile obţinute prin metoda enzimatică.

Interpretarea medicală a valorilor glicemiei

Valori crescute: Hiperglicemia trecătoare poate fi de origine alimentară sau în legătură
cu stări emoţionale. Postprandial glicemia creşte uşor, în cazul consumului excesiv de glucide
chiar până la instalarea unei glicozurii.
Hiperglicemia de durată este caracteristică în primul rând pentru diabetul zaharat
(diabetes mellitus). În formele de diabet asimptomatic (diabet chimic) glicemia este adesea
normală şi tulburările metabolice (insuficienta de insulină) pot fi stabilite numai prin proba de
încărcare cu glucoză (proba hiperglicemiei provocate).
Proba numită test oral de toleranţă pentru glucoză (TOTG) constă din administrarea
orală la pacient a unei cantităţi de aproximativ 70 g glucoză (1 g/kg corp). Se urmăreşte din
jumătate în jumătate de oră variaţia glicemiei faţă de valoarea iniţială măsurată pe nemâncate
(vezi schema). În cazuri fiziologice, creşterea maximă a glicemiei după încărcare nu
depăşeşte valoarea de 8,8 mmoli/l (160 mg %) în prima oră, iar după 2 ore revine sub 6,6
mmoli/l (120 mg %), şi atinge nivelul iniţial la cca. 3 ore .

În cazurile uşoare de diabet, când glicemia nu depăşeşte valoarea de 180 mg % (10

mmoli/l), glicozuria este absentă. În cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei este de 200-
300 mg %, iar în cazuri grave poate creşte până la 39 mmoli/l (702 mg %) sau mai mult, fiind
însoţită de glicozurie masivă. Evidenţierea accidentală a glicozuriei este uneori semnul care
atrage atenţia asupra unui diabet asimptomatic.
Sarcina este o stare care scade toleranţa la glucoză şi produce diabet gestaţional la
aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra fătului. Monitorizarea
glicemiei şi glicozuriei este foarte importantă în aceste cazuri pentru stabilirea dozelor de
insulină.
Informaţii suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizează nivelul
hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se corelează bine cu nivele mari de
glicemie pe perioade lungi.
 Creşteri ale glicemiei apar în diferite disfuncţii endocrine cum ar fi hipersecreţia de
adrenalină, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon somatotrop), cortizol
- hormonii enumeraţi având acţiune antagonistă cu cea a insulinei. Ei stimulează adenilat
ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensifică glicogenoliza şi gluconeogeneza.
Persoanele care sunt tratate timp îndelungat cu corticosteroizi (astm bronşic, poliartrită
reumatoidă) pot dezvolta aşa numitul diabet steroid. Hormonii tiroidieni (T3, T4) au acţiune
hiperglicemiantă prin creşterea absorbţiei glucidelor la nivel intestinal, stimularea
gluconeogenezei şi a secreţiei de adrenalină.
Valori scăzute ale glicemiei survin în primul rând după administrarea de doze excesive
de insulină. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate prin stări
convulsive în urma deficienţei de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale. Hipoglicemie
apare şi în cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumoră care secretă cantităţi
mari de insulină. Disfuncţii endocrine cum ar fi insuficienţa hipofizară, tiroidiană,
corticosuprarenală precum şi afecţiunile hepatice grave şi tulburări de absorbţie pot induce
stări hipoglicemice. O uşoară şi trecătoare hipoglicemie poate să fie de origine alimentară.

Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator

Metoda cu o-toluidină
Principiu:
Glucoza, în mediu de acid acetic, formează la cald cu o-toluidină un produs colorat în
verde, care se fotometrează.
Metoda Nelson-Somogyi
Principiu:
Glucoza reduce la cald soluţia bazică a complexului cupri-tartric. Ionii cuproşi formaţi
reduc în mediu acid ionul complex arsenomolibdenic cu formarea de substanţe de culoare
albastră fotometrabilă.
Metoda enzimatică cu hexokinază şi glucozo-6-fosfat dehidrogenază
Principiu:
​ ​ hexokinază
Glucoză + ATP Glucozo-6-fosfat + ADP
​ G-6-P DH
+ +
Glucozo-6-fosfat + NADP Gluconat-6-P + NADPH + H
Se măsoară extincţia în UV a probei şi a soluţiei standard cu concentraţie cunoscută, şi
se calculează glicemia.

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein

Principiu:
Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu în soluţie
de clorură de calciu cu forţă ionică joasă. Se măsoară turbiditatea soluţiei şi se exprimă în
unităţi arbitrare.
Reactivi: ​- Clorură de calciu 0,025 M
- Sol. heparină 0,2%
 Modul de lucru:
Se pipetează în două erubete, proba (P) şi blanc (B), următoarele soluţii:
P B
Clorură de calciu ml 5,0 5,0

H2O bidistilată ml - 0,1

Sol. de heparină ml 0,1 -

Ser ml 0,1 0,1

Se agită şi se lasă în repaus 5 minute la temperatura camerei. Apoi se măsoară

extincţia probei (EP) şi a blancului (EB), faţă de H2O bidistilată la 6 45 nm în cuva de 1
cm. Turbiditatea serului depinde de numărul de chilomicroni şi de conţinutul în grăsimi
neutre. Din această cauză serul trebuie să provină din sânge recoltat pe nemâncate.
Determinarea trebuie să se facă în ziua recoltării sângelui.
Calcul:
Rezultatele sunt exprimate direct în unităţi de extincţie:
1) Turbiditatea serului: E = EB × Vfinal/Vser = EB × 52
2) Conţinutul în beta lipoproteine:
E = (EP - EB) × 52
Valori normale: ​1) Turbiditatea serului: 0-0,1 U. extincţie
​2) Beta-lipoproteine: 4,0-10,0 U. extincţie
Fracţionarea electroforetică a lipoproteinelor în gel de agaroză produce următoarele
fracţiuni care sunt în următoarea corespondenţă aproximativă cu fracţiunile separabile în
câmp centrifugal: chilomicronii corespunzători alfa2 – lipoproteinelor şi care rămân pe linia
de start, beta-lipoproteinele care corespund LDL, pre-beta lipoproteinele care corespund
VLDL şi alfa1-lipoproteinele care corespund HDL.
Tipurile de dislipidemie: Pe baza modificărilor cantitative ale fracţiunilor lipoproteice
şi ale conţinutului acestora în colesterol, fosfolipide şi trigliceride, Fredrickson a stabilit 5
fenotipuri de dislipidemie:
​Tipul I.: chilomicronemie şi hiper-VLDL, cu creşterea trigliceridelor şi cu
ser lactescent datorate deficitului de lipoproteinlipază sau de apoCII. Se mai numeşte
hipertrigliceridemie familială.
​Tipul II.a: creşterea colesterolului şi a LDL, cu ser clar datorată deficitului în
receptori apoB100. Se mai numeşte hipercolesterolemie familială.
​Tipul II.b: creşterea concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser clar,
sau opalescent. Cresc concomitent LDL şi VLDL. Se mai numeşte hiperlipidemie combinată
familială.
​Tipul III.: anomalie ereditară rar întâlnită (boala "betei late") cu creştera
concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser lactescent. Se datorează deficitului de
clarificare hepatică a IDL şi chilomicronilor remanenţi. Este cauzat de lipsa de apoE şi de
lipoproteinlipază hepatică.
 ​Tipul IV.: creşterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau opalescent.
​Tipul V.: creşterea chilomicronilor endogeni şi exogeni, a colesterolului, cu
LDL şi VLDL crescute, HDL scăzute, ser opalescent sau uneori lactescent.

Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică

Principiu:
Kit-ul enzimatic conţine următoarele enzime care catalizează reacţiile indicate mai
jos:
Colesterol esteraza catalizează reacţia de hidroliză a esterilor de colesterol rezultând
colesterol liber şi acizi graşi:
​ colesterol-estează

esteri de colesterol + H2O <-----------------> colesterol + acizi graşi

În prezenţa colesterol oxidazei colesterolul suferă o reacţie de oxidare cu formarea a
4-D colestenonei şi a apei oxigenate:

​ colesterol-oxidază

colesterol + O2 --------------> 4-D colestenona + H2O2

Sub acţiunea peroxidazei apa oxigenată reacţionează cu fenolul şi 4-amino antipirina

formând un compus chinonic de culoarea roşie, fotometrabilă:
​ peroxidază

2 H2O2 + fenol + 4-amino-antipirină ----------------> compus chinonic + 4H2O

Reactivi: Reactivul pentru colesterol conţine în soluţie tampon: colesterol esteraza,
colesterol oxidaza, peroxidaza, fenol, 4-amino-antipirină.
Mod de lucru:
Se pregătesc 3 eprubete în care se pipetează:

P S B
Reactiv pt. colesterol 2 ml 2 ml 2 ml
H2O bidistilată - - 20 ml
Sol. standard de colesterol (200 mg%) - 20 ml -
Ser 20 ml - -

Se agită şi se incubează 5 minute la 37°C. Apoi se citeşte extincţia probei (P) şi a

standardului (S) faţă de blanc (B) la l = 500 nm în cuva de 1 cm.
Calcul: mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es × 200
Valori normale: 150-250 mg%

Dozarea colesterolului total şi liber

 Principiu:
Colesterolul liber din ser se extrage cu etanol şi apoi se precipită cu digitonină.
Diferenţa dintre colesterolul total şi colesterolul liber reprezintă colesterolul esterificat.
Reactivi: ​- Soluţie de clorură ferică: se prepară din 2,5g FeCl3. 6H2O în urma
adăugării a 100ml H3PO4 85%.
- Reactivul de culoare: 4ml soluţie de clorură ferică se dizolvă în 50ml
H2SO4 concentrat.
- Soluţie de digitonină 1%: se dizolvă 1g digitonină în 50ml etanol 95%
şi se aduce la 100ml cu apă bidistilată. Se păstrează la întuneric max.
timp de 6 luni.
- Standard de colesterol (0,2%): se dizolvă 2000mg colesterol pur în
100ml acid acetic glacial şi se diluează de 10 ori (1ml în 10ml) cu acid
acetic glacial.
Observaţii: ​1. Eprubetele şi pipetele trebuie să fie perfect curate şi uscate,
reacţia fiind influenţată de urmele de apă.
2. Puritatea acidului sulfuric şi a acidului acetic este o condiţie
indispensabilă pentru dozare. În particular, acidul acetic nu trebuie să
conţină acid glioxilic. Pentru îndepărtarea acidului glioxilic, eventual
prezent, se recomandă distilarea acidului acetic în prezenţa anhidridei
cromice.
Dozarea colesterolului total
Modul de lucru:
Proba: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml ser. Se
agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine. Se citeşte extincţia probei după 10
min. de aşteptare la 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc (prepararea acestuia apare
mai jos). Rezultă extincţia Ep.
Soluţia standard: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi
0,1ml standard de colesterol. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine. Se
citeşte extincţia standardului la 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc. Rezultă extincţia
Es.
Blanc: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml apă
bidistilată. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine.
Calcul: mg% colesterol total = (EP/ES) x conc. standard
Dozarea colesterolului liber
Se pipetează în eprubete de centrifugă o probă P, un standard S şi un blanc B.
P S B
Ser ml 0,1 - -
Standard de colesterol ml - 0,1 -
Apă bidistilată ml - - 0,1
Acetonă-95% etanol (1:1,v/v) ml 1 - -
Sol. digitonină ml 1 1 1

Se amestecă, se lasă în repaus 10min şi apoi se centrifughează (la 3000 rpm, 5min). Se
aruncă supernatantul. Se usucă precipitatul timp de 5 min. în curent de N2. Resuspendarea
rezidiului se face cu 4 ml acetonă, apoi se agită cu Vortexul. Se centrifughează, se decantează
(cu grijă) supernatantul, se usucă precipitatul timp de 5min.
Precipitat ++ -
CH3COOH glacial ml 6 6 6

Se agită, se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită energic cu Vortexul.

După 10 minute de repaus se citeşte extincţia probei la 550 nm în cuva de 1 cm faţă de
blanc. Blancul constă doar din 6 ml CH3COOH glacial.
Calcul:
​mg% colesterol liber
= (EP/ES) x conc.standard
​mg% colesterol esterificat
= mg% colesterol total - mg% colesterol liber
Valori normale: 60-80% din colesterol total. Prin urmare, raportul colesterol
esterificat/colesterol total se încadrează în mod normal în intervalul 0,60-0,80.
Variaţii fiziologice: Colesterolemia este strâns corelată cu lipidemia şi prezintă, în
mare, aceleaşi variaţii fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la naştere este
scăzută, începe să crească în câteva ore sau zile şi variază în funcţie de vârstă, sex, rasă,
alimentaţie, echilibru neuro-endocrin, profesie.
Există diferenţe ale colesterolemiei în funcţie de sex şi de vârstă. De exemplu: la
bărbaţi valoarea medie este de 250mg/100ml la vârsta de 50 de ani, după care scade uşor; la
femei valorile cresc odată cu vârsta atingând valoarea maximă de 280 mg/100ml în jurul
vârstei de 50 ani, după care scad uşor.
Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogenă, aportul de
colesterol exogen influenţând în mică măsură colesterolemia.
Variaţii patologice: Acest raport este scăzut în afecţiuni hepatice grave (comă
hepatică).
Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferenţierea şi
diagnosticul icterelor şi este:
- normal în icterele obstructive
- moderat scăzut în icterele catarale
- scăzut în icterele parenchimatoase grave.
Valori crescute (hipercolesterolemii) se întâlnesc în: hipercolesterolemie esenţială,
hiperlipemie esenţială, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom nefrotic (nefroze
lipoidice), ateroscleroză, intoxicaţii cu fosfor, CCl4, alcool, morfină, icter obstructiv (calea de
excreţie a colesterolului fiind cea biliară), pancreatite, alcoolism.
Valori scăzute (hipocolesterolemii) se întâlnesc în: afecţiuni genetice ca: analfalipo
proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite cronice şi ciroze
decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecţii bacteriene: pneumonie,
tuberculoză, difterie, lepră; hemopatii severe: leucemii.

Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou)

​Obţinerea lecitinei purificată
Reactivi: ​ gălbenuş de ou
1
​75 ml acetona (reactiv)
​75 ml cloroform (reactiv)
 Modul de lucru:
Se separă într-un mojar gălbenuşul de ou în aşa fel încât să nu se amestece cu albuşul.
Se adaugă peste gălbenuş amestecând 25 ml acetonă. Solventul deshidratează gălbenuşul şi
dizolvă grăsimile cu excepţia lecitinei. După ce a rămas în repaus câteva minute acetona se
decantează sau se filtrează. Se repetă operaţia de trei ori, ultima cantitate de acetonă adăugată
nu se mai lasă în contact cu materialul din mojar şi este rapid decantată. Reziduul obţinut se
întinde pe o hârtie de filtru. Pudra obţinută după uscare se trece într-un balon Erlenmeyer şi se
agită cu 25 ml amestec cloroform şi alcool metilic ( 2:1). Se filtrează lichidul. Pudra rămasă
pe hârtia de filtru este reluată cu aceiaşi cantitate de amestec cloroform-alcool, repetându-se
operaţia anterioară. Se obţine astfel o soluţie cloroformică-alcoolică de lecitină. Pentru
obţinerea substanţei pure filtratul se concentrează prin încălzirea amestecului la 63°C.
Produsul obţinut în urma extracţiei cu solvenţi organici se prezintă ca o masă galbenă de
consistenţă moale care poate fi uscată prin evaporare în vid.
Purificarea lecitinei se face prin cromatografie pe coloană de celuloză pentru
îndepărtarea impurităţilor azotate nelipidice, urmată de cromatografia pe alumină, care reţine
cefalinele, şi apoi pe coloană de Silicagel, echilibrată cu soluţia CHCl3-CH3OH (2:1; v:v),
pentru separarea lizofosfatidelor şi sfingolipidelor.
Caracterizarea fizico - chimică a lecitinei
​Lecitina formează o masă alb-gălbuie, higroscopică, alterabilă, se brunifică după
păstrare. Este solubilă în eter, cloroform, uleiuri, alcool concentrat. ( 1p. lecitina: 20 p. alcool
concentrat; 1p. lecitină; 9,8p. eter de petrol).

​Identificarea lecitinei
Identificarea lecitinei se face astfel:
- adăugarea 2 ml de acid sulfuric concentrat la 2 ml de soluţie de molibdat de amoniu
0,1% care conţine câteva picături de soluţie eterică de lecitină, la încălzire determină formarea
unei zone de separaţie colorată în albastru;
- o soluţie alcoolică de lecitină la care se adaugă o soluţie alcoolică de aloxan se
colorează în roz, apoi în roşu şi în final formează un precipitat de culoare roşie.
- dacă se adaugă cu precauţie la 2 ml de acid sulfuric concentrat, 2 ml alcool conţinând
urme de lecitină şi 4 picături de soluţie alcoolică 0,01% de benzaldehidă, furfurol sau
vanilină, apare la suprafaţa de separare a lichidelor o coloraţie roşie-brună.
Hidroliza lecitinei şi observarea microscopica a cristalelor de colina
​Lecitinele prin hidroliză se descompun într-o moleculă de glicerol, 2 molecule de acid
gras, o molecula de acid fosforic şi o moleculă de colină.
Reactivi: ​- soluţie de hidroxid de sodiu 10%
​- soluţie de acid acetic 10%
​- soluţie de iod 5% ( 1 g iod, + 2 g KI, + 20 ml apă)
​- hârtie de turnesol
​Modul de lucru:
​Lecitina obţinută din gălbenuşul de ou se trece într-un pahar Erlenmeyer, se tratează cu
20 ml NaOH 10%. Se fierbe 10 min. Lichidul obţinut se neutralizează în prezenţa hârtiei de
turnesol cu acid acetic. Se adaugă apoi în exces o picătură de acid. Se răceşte, se filtrează. Pe
o lamă de sticlă se ia o picătură din soluţia obţinută, se adaugă o picătură de iod, se acoperă cu
lamela. Se observă apariţia cristalelor de periodură de colină (cristale Florence).

Imaginea la microscopul optic a cristalelor de colină (desen).

Stabilitatea lecitinei
​Stabilitatea lecitinei include determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de peroxid,
şi a indicelui de iod.
1. Determinarea indicelui de aciditate (Ia): Prin indice de aciditate se înţelege numărul de
miligrame de hidroxid de potasiu necesare pentru neutralizarea acizilor graşi liberi conţinuţi
într-un gram de lecitină
Modul de lucru:
​5 g lecitină se dizolvă în 50 ml amestec preparat în părţi egale din alcool şi eter
neutralizat în prezenţa fenolftaleinei ca indicator (0,1g fenolftaleină dizolvate în 100 ml alcool
din care se folosesc 3 picături) şi se titrează cu KOH 0,1 N până la coloraţie roz care trebuie
să persiste minimum 30 de secunde.
​ nde v = ml KOH 0,1 N folosiţi la titrare şi G = grame substanţă luată
Ia = 5,61 v / G u
în lucru

2. Determinarea indicelui de peroxid (Ip): Indicele de peroxid reprezintă numărul de

miliechivalenţi oxigen activ din 1000 g lipid (lecitină), respectiv numărul de mililitri de
tiosulfat de sodiu 0,01 N oxidaţi de iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea
peroxizilor din 1g lipid.
Modul de lucru:
5 g lecitină (G) se dizolvă într-un flacon cu dop rodat într-un amestec de 18 ml acid
acetic şi 12 ml cloroform. Se adaugă o soluţie proaspăt preparată dintr-un gram de iodură de
potasiu şi un ml apă şi se agită puternic. După un minut se adaugă 30 ml apă, 2 ml soluţie de
amidon 0,1% şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,01 N (v2). În paralel se efectuează titrarea
unui martor fără lecitină (v1).
Ip = 10 ( v2 - v1 )/ G

3. Determinarea indicelui de iod: Indicele de iod reprezintă numărul de grame de iod fixat de
100g lipid nesaturat.
Modul de lucru:
​Intr-un flacon cu dop rodat de 300 ml se întroduc 0,15 g de lecitină (G) şi se dizolvă în
20 ml de cloroform, se adaugă 25 ml soluţie monobromură de iod 0,2N, se închide flaconul şi
se lasă la întuneric 30 min, agitând din 5 în 5 minute. Se adauga 15 ml iodură de potasiu 10%
,10 ml apă şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N (v1) până la decolorare adăugând 2 ml
soluţie de amidon spre sfârşitul titrării. Se face o probă martor cu aceleaşi cantităţi de reactivi
în aceleaşi condiţii, fără lecitină, care se titrează (v2).

Indice de iod = (v1 - v2) 1,269 / G

Hemoglobina
Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin)

Principiu:
2+ 3+
Fericianura de potasiu oxidează Fe din hemoglobina la Fe . Astfel hemoglobina se
transformă în methemoglobină. Methemoglobina în prezenţa cianurii de potasiu trece în
cianmethemoglobină, derivat de hemoglobină stabil, fotometrabil la 540 nm.
Materiale: - pipetă de hemoglobină de 0,02 ml.
Reactiv Drabkin: - 50 mg KCN, 1 g NaHCO3 şi 200 mg fericianură de potasiu se
dizolvă în apă bidistilată şi se aduce volumul la 1000 ml cu apă bidistilată. Atenţie! Reactivul
Drabkin este extrem de toxic.
Modul de lucru:
În două eprubete se pipetează câte 5 ml de reactiv Drabkin. În una din eprubete se
pipetează cu o micropipetă 0,02 ml soluţie standard de hemoglobină (preparat comercial), iar
în cealaltă se pipetează 0,02 ml sânge în prealabil agitat pentru resuspendarea celulelor
sanguine. Se omogenizează eprubetele prin agitare, apoi după 20 de minute se citeşte extincţia
probei de analizat şi a probei standard faţă de apă distilată la 540 nm în cuvă de 1 cm.
Calcul:
g hemoglobină/100 ml sânge=Ep/Es x Cst (Cst = concentraţia standardului în g%)
Observaţie: Metoda cu cianmethemoglobină detectează toate formele de hemoglobină
şi permite determinări foarte precise.

Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină

Principiu:
În prezenţă de amoniac globulele roşii se hemolizează şi hemoglobina se transformă în
oxihemoglobină care prezintă un maxim de absorbţie la l = 540 nm.
Reactivi şi materiale: ​- soluţie de amoniac 0,1%
- pipetă de hemoglobină de 0,02 ml
Modul de lucru:
Într-o eprubetă se măsoară 5 ml de soluţie de amoniac. În acesta se introduc cu pipeta
de hemoglobină 0,02 ml de sânge în prealabil agitat. După agitare se citeşte extincţia probei
faţă de apă distilată la l= 540 nm în cuva de 1 cm.Rezultatul se raportează la o curbă de
calibrare obţinută cu diluţii dintr-o probă de concentrat de eritrocite cu concentraţia
hemoglobinei cunoscută.
Valori normale: ​femei: 14-17 g/100 ml sânge
​bărbaţi: 15-20 g/100 ml sânge
Dozarea hemoglobinei din sângele total prezintă importanţă pentru diagnosticul unor forme
de anemii.
 Observaţie: Ca metodă de referinţă (pentru obţinerea unei curbe de calibrare în
absenţa unui standard de hemoglobină) se poate folosi metoda bazată pe dozarea ferului
eritrocitar.

Analiza urinei
Urina este un produs de filtrare, reabsorbţie şi excreţie, reprezentând exercitarea
funcţiei renale. Este un lichid biologic uşor accesibil, care dă multe informaţii utile în
diagnostic.
Urina "de dimineaţă" serveşte la determinări calitative (albumină, glucoză, pH,
acetonă şi sediment urinar). Se goleşte vezica de urina acumulată în timpul nopţii şi se
colectează urina proaspătă de dimineaţă, care este mai concentrată.
Urina de 24 ore se foloseşte la determinările cantitative. Este necesar să se măsoare
volumul diurn de urină fiindcă rezultatele dozărilor se raportează la acest volum. Se goleşte
vezica de urina "de dimineaţă" şi se începe la oră fixă recoltarea urinii în intervalul de 24 de
ore.
Pentru prevenirea contaminării probelor de urină cu microorganisme se recomandă
efectuarea analizelor în cel mult 2-3 ore de la recoltare. Păstrarea nealterată se poate realiza la
o
rece (+4 C) sau prin tratare cu substanţe conservante, de preferat cu timol (0,1 g la 100 ml de
urină). Nu se recomandă folosirea de cloroform, fenol, formol fiindcă acestea falsifică
rezultatele obţinute.

Examenul fizic al urinei

Volumul. Cantitatea de urină emisă în 24 ore depinde de ingestia de lichide, de
pierderile de apă (piele, intestin, plămâni) şi de cantitatea de substanţe excretate prin urină.
Volumul se măsoară cu cilindrul gradat.
Valori normale: 1500 - 2000 ml/24 ore (bărbaţi); 1000 - 1500 ml/24 ore (femei).
Valori patologice: ​- sub 200 ml/24 ore (anurie)
- între 200-800 ml/24 ore (oligurie)
- peste 2000 ml/24 ore (poliurie)
Oligo-anuria este semnul cel mai important al insuficienţei renale acute. Cauzele
acesteia se pot clasifica în trei grupe:
- Cauze prerenale: hipovolemie (diaree severă, stare de şoc cu prăbuşirea presiunii
arteriale), insuficienţă cardiacă stângă - în aceste cazuri nu se realizează presiunea
hidrostatică necesară funcţiei de filtrare a rinichiului.
- Cauze renale: boli inflamatorii ale rinichiului (glomerulonefrită acută), necroză
tubulară acută (ischemică, toxică), boli autoimune cu afectare renală.
- Cauze postrenale: obstrucţia mecanică a căilor urinare (calculi, malformaţii). Se
formează urină, dar nu se poate elimina.
Poliuria se întâlneşte în: diabet zaharat, diabet insipid (se constată o poliurie extremă
de 5-20 l/24 ore, cauza fiind lipsa secreţiei de hormon antidiuretic-ADH; poliuria este însoţită
de polidipsie, adică consumul excesiv de lichide), alcoolism cronic (inhibarea secreţiei de
ADH), hiperparatiroidism (se elimină cantităţi mari de calciu prin urină care antrenează
eliminarea unui volum mare de lichid), insuficienţă renală cronică (capacitatea de concentrare
a rinichilor este alterată).
Alte noţiuni patologice legate de distribuţia volumului urinar sunt:
- Polakiurie: micţiuni dese cu eliminarea unor cantităţi mici de urină (apare în cistită,
hipertrofie de prostată, tumori ale vezicii urinare). Deseori este însoţită de disurie
(durere sau senzaţie de arsură la emisia de urină).
- Nicturie: urinare nocturnă (diabet insipid, insuficienţă cardiacă dreaptă - semnalează
evoluţia spre decompensare).
Aspectul. În condiţii fiziologice urina proaspătă este limpede şi transparentă. Urina tulbure în
momentul emisiei poate fi datorată conţinutului excesiv de săruri (uraţi, fosfaţi,
carbonaţi), mucusului, puroiului, celulelor epiteliale, grăsimilor sau microbilor. Dacă
într-o urină clară în momentul eliminării după un timp se formează un depozit în
formă de nor, el se datorează unui proces de descuamare epitelială a căilor urinare.
Acest depozit nu are nici o valoare diagnostică.
Situaţiile patologice se diferenţiază în felul următor:
a). Dispariţia tulburării prin încălzire indică prezenţa uraţilor, oxalaţilor şi a acidului
uric.
b). Dispariţia tulburării care a devenit mai abundentă în urma încălzirii, prin adăugare
de acid acetic 10 % indică prezenţa fosfaţilor şi carbonaţilor (dacă se produce efervescenţă).
c). Dacă tulburarea apare la cald şi se intensifică prin adăugare de acid acetic, urina
conţine albumină.
d). Dispariţia tulburării numai la adaus de HCl 12,5 % după încălzire prealabilă, indică
prezenţa oxalatului de calciu.
e). Din urina tulbure, chiar în momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele
epiteliale se pot îndepărta prin centrifugare.
f). Dispariţia tulburării după adăugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v) indică
prezenţa grăsimilor.

Culoarea. Urina normală are culoare galben-deschisă până la galben-aurie. Urina din timpul
nopţii fiind mai concentrată, are o culoare mai închisă. Culoarea urinii poate fi
modificată de diferite substanţe pe care le conţine.
Substanţe endogene: sângele imprimă urinii culoare roşie, brună sau maronie; porfirinele dau
o culoare roşie sau brun-roşcată; pigmenţii biliari conferă culoare galben verzuie;
alcaptonul (compus apărut în urină datorită dereglării catabolizării Phe şi Tyr) dă în
contact cu aerul o culoare brună-neagră.
Substanţe exogene: albastrul de metilen colorează urina în verde-albăstrui; piramidonul în
roşu-cărămiziu; fenolul îi dă o coloraţie brună.
Mirosul. Mirosul urinii proaspete se datorează acizilor volatili din compoziţia sa. În urinile
concentrate mirosul este mai accentuat. În cazurile de acidoză apare un miros de
fructe sau cloroform. Urinile infectate au un miros amoniacal datorită descompunerii
ureei de către ureaza bacteriană. Mirosul fecaloid al urinii poate atrage atenţia asupra
existenţei unei fistule (comunicare patologică între tubul digestiv şi urinar). Miros
fecaloid apare şi în infecţiile cu Escherichia coli (E. coli este o componentă a florei
intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent infecţii urinare).
Densitatea. Greutatea specifică sau densitatea urinii se măsoară cu un densimetru special
numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticlă care se termină la partea inferioară
 printr-un rezervor cu mercur. În partea superioară se află o tijă pe care este înscrisă
3 o
scara gradată pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm la 15 C, fiind anexată şi o scală
termometrică, pentru că densitatea urinii variază în funcţie de temperatură.
Densitatea depinde de substanţele dizolvate: sărurile în general şi ureea la indivizi
sănătoşi; glucoza şi albumina în cazurile patologice. Densitatea este de obicei invers
proporţională cu diluţia urinii şi direct proporţională cu intensitatea culorii. Excepţie
face diabetul zaharat, când, cu toate că volumul urinar este mare, ceea ce ar
determina o diluţie mare, densitatea este mare datorită prezenţei glucozei.
Modul de lucru:
Urina de 24 ore se amestecă pentru omogenizare, apoi se toarnă într-un cilindru
gradat, evitându-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie să plutească
fără a atinge pereţii cilindrului. Se citeşte diviziunea care este tangentă la meniscul inferior al
suprafeţei urinii. Valoarea citită trebuie corectată prin mărire cu 0,001 pentru fiecare depăşire
o o o
cu 3 C respectiv prin micşorare cu 0,001 pentru fiecare scădere cu 3 C sub 15 C. Când urina
conţine cantităţi mari de proteine, peste 7 g%, se vor scădea câte 0,03 pentru fiecare gram de
proteină în plus.
3
Valori: 1,015 - 1,025 g/cm , putându-se modifica fiziologic la valori extreme de 1,001
3
- 1,035 g/cm în funcţie de aportul sporit sau de eliminarea abundentă de lichide. Scăderea
densităţii urinare se întâlneşte în diabet insipid (se elimină o cantitate mare de urină foarte
diluată), insuficienţă renală cronică (datorită incapacităţii de concentrare a rinichiului).
Creşterea densităţii urinare apare în diabetul zaharat, nefroză (boală renală în care se elimină
o cantitate mare de proteine prin urină).

Examenul chimic al urinei

pH-ul urinei. Valoarea pH-ului urinei normale depinde de dietă. O alimentaţie bogată
în proteine produce aciditate urinară, pe când un regim vegetarian determină alcalinizarea
urinei. Aciditatea urinei provine din acizi organici (uric, hipuric, citric, acetic, oxalic) şi din
+ + +
sărurile acide (fosfaţi primari de Na , K , NH4 ). Regimul carnat determină o creştere a
acidităţii urinei datorită eliminării crescute de acid uric, uraţi şi fosfaţi acizi. Un regim
alimentar vegetarian determină o alcalinizare a urinei prin excesul de săruri minerale şi
organice.
Măsurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hârtie indicator universal sau cu
pH-metrul.
Modul de lucru:
Se introduce în urina proaspătă, pentru câteva secunde, o bucată de hârtie indicator. Se
stabileşte valoarea pH-ului după 30 de secunde comparând culoarea hârtiei cu cea a scalei de
culori care însoţeşte fiecare pachet de hârtie indicator.
Prin metoda potenţiometrică (cu pH-metrul), după calibrarea aparatului cu soluţii
standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH şi de referinţă) într-un volum adecvat de
urină a cărei temperatură se cunoaşte şi se citeşte valoarea pH-ului.
Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variaţii în jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la un
individ cu alimentaţie mixtă. Urini puternic acide se produc în cursul proceselor maligne
datorită distrugerii crescute de proteine, în febră, diaree abundentă şi acidoză metabolică. pH
puternic alcalin se constată în infecţii urinare (prin fermentare microbiană) şi în alcaloză
metabolică. pH-ul se măsoară din urina proaspăt emisă, deoarece în timp se produce
contaminarea produsului cu bacterii, care determină schimbarea reacţiei în sensul alcalinizării
urinei.
 Analiza compuşilor patologici din urină
Identificarea proteinelor urinare
Urina normală conţine doar urme de proteine (albumine şi globuline provenite din
plasmă), în cantitate de 20-40 mg%o, care nu se pot decela prin tehnici uzuale.
Proteinurii apar în stări patologice cum ar fi:
- afecţiuni renale: filtrul renal lezat nu mai poate reţine moleculele proteice şi acestea
ajung în urină în cantitate mare. Proteinuria poate fi selectivă (numai albuminurie) de
exemplu în glomerulonefrite, sau neselectivă în cazuri mai grave (albuminurie şi globulinurie)
cum ar fi glomerulonefrozele. În afară de bolile inflamatorii renale enumerate, leziuni ale
nefronului pot apare şi în intoxicaţii sau în rinichiul de şoc. Proteinuria este pusă în evidenţă
şi în leziuni mai grave ale filtrului glomerular, caz în care se pune în evidenţă chiar hematuria.
- afecţiuni postrenale: leziuni ale mucoasei căilor urinare (litiază, inflamaţie, tumori,
etc). În aceste cazuri proteinuria se asociază obligatoriu cu hematurie (apariţia sângelui în
urină).
- afecţiuni prerenale: stări febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariţia în urină a
proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) în mielomul multiplu
(plasmocitom). Datorită hiperproteinemiei (creşterea cantităţii proteinelor în sânge), se
saturează capacitatea maximă de transport a celulelor mucoasei tubulare renale, şi proteinele
care nu s-au reabsorbit se elimină prin urină.
În mod fiziologic, în cursul efortului fizic are loc o creştere a proteinuriei care poate
atinge de 5 ori valoarea normală. Cantitatea de proteine eliminată variază în timpul zilei, de
aceea trebuie să se facă analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 30-40 mg/1500 ml).
Procedeul cu acid acetic la cald
Principiu:
Proteinele precipită prin încălzirea şi acidularea urinei îmbogăţite cu săruri de sodiu.
Reactivi: ​- Acid acetic 10%
- NaCl cristale
Mod de lucru:
În 10 ml de urină filtrată se adaugă câteva cristale de NaCl şi se încălzeşte eprubeta în
flacără pentru aducerea la fierbere doar a părţii superioare a coloanei de lichid. Se adaugă
câteva picături din soluţia de acid acetic. Apariţia unui precipitat persistent indică prezenţa
albuminei.
Aprecieri semicantitative asupra cantităţii de albumină:
- opalescenţă, urmată de sedimentare la câteva minute . . . . cca 10 mg%
- precipitare şi sedimentare imediată . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg%
Înălţimea coloanei de precipitat raportată la înălţimea coloanei de urină după
staţionarea amestecului timp de 30 secunde:
- 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg%
- 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg%
- 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg%
Proba cu acid sulfosalicilic la rece
Principiu:
Proteinele sunt precipitate în mediu de acid sulfosalicilic.
Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20%
Mod de lucru:
La 5 ml urină filtrată se adaugă 10-15 picături din soluţia de acid sulfosalicilic. Se
agită şi se apreciază reacţia ţinând eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile sunt:
- urina rămâne limpede . . . . . . . albumină absentă
 - uşoară opalescenţă . . . . . . . . cca 15 mg% albumină
- opalescenţă apreciabilă . . . . . cca 20 mg% albumină
- floculare abundentă . . . . . . . . > 20 mg% albumină
Reacţii fals pozitive se observă în terapia diabetului cu antidiabetice orale
(tolbutamid), după administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc.
Reacţia cu acid azotic (proba Heller)
Reactiv: Acid azotic concentrat
Mod de lucru:
În cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se lasă să se prelingă pe peretele eprubetei 1-2 ml
urină. Apariţia unui precipitat sub formă de inel la zona de contact dintre cel două soluţii
indică prezenţa proteinelor.
Reacţii fals pozitive pot fi date de urina conservată cu timol sau care conţine uree şi
uraţi în cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa căilor urinare pot da numai o
tulbureală care nu este delimitată sub formă de inel.
Proba cu acid tricloracetic
Reactiv: Acid tricloracetic 15%
Mod de lucru:
La 5 ml urină se adaugă 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb floconos
arată prezenţa proteinelor.
Evidenţierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile)
Principiu:
o
În urina slab acidă proteinele Bence-Jones precipită între 45-55 C şi se redizolvă în
o
apropiere de 100 C.
Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9)
Mod de lucru:
Se lucrează din urinele la care am obţinut rezultat pozitiv la reacţiile de precipitare a
proteinelor. Într-o eprubetă se pun 4 ml de urină, se adaugă 1 ml tampon acetat şi se incubează
o
în baie de apă la 56 C până la apariţia unui precipitat. Apoi se introduce eprubeta în apă la
fierbere timp de 3 minute. Descreşterea cantităţii de precipitat, clarificarea tulburării,
o
confirmă prezenţa proteinelor Bence-Jones. Prin răcire la 56 C reapare precipitatul iniţial.
Proteinele Bence-Jones sunt lanţurile uşoare ale imunoglobulinelor. Ele apar în 60%
din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroasă a unei clone de plasmocite care
produce imunoglobuline) şi ocazional în alte boli care afectează măduva osoasă: leucemii,
osteosarcoame (tumori canceroase ale ţesutului osos), metastaze osoase, unele disproteinemii.
Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare
Principiu:
Hârtia reactivă impregnată cu albastru de tetra-bromfenol este colorată în galben
deschis în mediu acid (pH ≈ 3). În prezenţa proteinelor urinare, culoarea virează spre verde,
verde-albăstrui, albastru sau violet, nuanţa depinzând de tipul de proteină şi de concentraţia
acesteia în urină.
Mod de lucru:
Se înmoaie capătul benzii în urina de analizat. După 2 minute se apreciază prezenţa
proteinelor urinare prin compararea culorii obţinute cu o scală de etalonare. Cantitativ urmele
de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumină. Testul are valoare orientativă.
Evidenţierea puroiului
Proba Donné
Principiu:
Cu ajutorul NaOH se lezează membrana leucocitară din care astfel se eliberează
mucină, care măreşte vâscozitatea urinei şi împiedică ridicarea imediată a bulelor de aer.
 Reactiv: Sol. NaOH 20%
Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 5 ml urină, se adaugă câteva picături de NaOH 20%, se astupă
eprubeta şi se răstoarnă brusc, apoi se readuce în poziţia iniţială. Apariţia unor bule de aer în
lichid, care rămân mai mult timp în suspensie şi se ridică încet la suprafaţă denotă prezenţa
puroiului.
În cazul în care bulele de aer se ridică rapid, testul este negativ. Dacă toate bulele de
are se ridică încet la suprafaţă rezultatul se notează cu +. În cazul în care bulele mici rămân pe
fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dacă nici bulele mai mari nu se ridică datorită prezenţei
unei cantităţi mari de mucină, proba se notează cu +++.
Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar în urină în urma
proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrită, cistită, uretrită). Probe fals pozitive
pot apare în albuminurie masivă, datorită prezenţei polizaharidelor, a mucinei, etc. Testele
pozitive trebuie întotdeauna verificate prin examenul microscopic al sedimentului urinar.

Identificarea glucidelor urinare

În mod normal, urina nu conţine decât cantităţi mici de glucide. În mod patologic însă,
glucoza poate apărea în cantităţi apreciabile, prezenţa ei în urină fiind denumită glicozurie şi
este caracteristică diabetului zaharat. În anumite stări patologice particulare, urina mai poate
conţine în afară de glucoză şi alte glucide: fructoză, galactoză, lactoză, maltoză şi pentoze.
Fiziologic poate apare glicozurie după ingerarea unor cantităţi mari de glucide. De
asemenea, lăuzele şi 40% din gravidele în a doua jumătate a sarcinii prezintă lactozurie.
Evidenţierea glucidelor urinare se face pe baza proprietăţii reducătoare a acestora faţă
de sărurile unor metale (Cu, Bi). Pe lângă glucide, în urină pot exista şi alte substanţe
reducătoare care pot da rezultate fals pozitive (cantităţi mari de creatinină, acid ascorbic, acid
uric, fenoli, etc.). Unele medicamente eliminate prin urină cum ar fi penicilina, streptomicina,
dextranul pot reduce sărurile metalice. Din acest considerent, înaintea cercetării calitative a
diferitelor tipuri de glucide urinare, se efectuează operaţia de defecare - adică înlăturarea
substanţelor reducătoare neglucidice din urină.
Defecarea urinii
Defecarea urinii se efectuează cu reactivul Courtonne, care se prepară în felul
următor: se dizolvă 100 g acetat de plumb în apă distilată, se neutralizează cu acid acetic
glacial (control cu hârtie indicator), se filtrează într-un balon cotat de 1000 ml şi se
completează cu apă distilată până la semn.
Mod de lucru:
Se iau într-un cilindru 45 ml urină şi 5 ml reactiv Courtonne, se amestecă cu o
baghetă, se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează.
Majoritatea reacţiilor de reducere nu sunt considerate suficient de specifice pentru a fi
utilizate pentru depistarea glicozuriei. Mai specifice sunt reacţiile Nylander şi Benedict,
ultima având avantajul de a da indicaţii orientative asupra cantităţii de substanţă reducătoare
din urină. O metodă specifică de evidenţiere a glucozei este metoda cu glucozoxidază.

Reacţia Nylander
Principiu:
3+
Glucidele reducătoare reduc în mediu bazic ionii de Bi la Bi metalic.
Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu şi potasiu)
şi 100 g NaOH se dizolvă în apă până la 1000 ml soluţie.
Mod de lucru:
 Într-o eprubetă, la 5 ml urină se adaugă 1 ml reactiv Nylander şi se încălzeşte la
flacără timp de 4 minute.
În prezenţa glucozei apare un precipitat brun până la negru. Reacţii fals pozitive pot
exista în proteinurie masivă, când apare un precipitat brun de sulfură de bismut datorită
reacţiilor de reducere date de unele grupări funcţionale ale radicalilor aminoacizilor.

Reacţia Benedict (semicantitativă)

2+
Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu din
+ 2+
reactivul Benedict la Cu (menţinerea în soluţie a Cu se face prin complexare cu citrat de
sodiu). În urma reacţiei se formează Cu2O de culoare roşie-cărămizie. Reacţia este pozitivă
pentru toate glucidele reducătoare. Reactivul Benedict are compoziţia prezentată la pag. ??
Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Benedict. Se amestecă şi se pune
într-o baie de apă la fierbere timp de 5 minute. Se răceşte la temperatura camerei şi se
interpretează rezultatul astfel:
Culoare Rezultat Substanţe reducătoare g‰
albastru - absente
albastru-verzui urme urme
verde + cca 0,5
brun-verzui ++ cca 1,0
galben +++ cca 1,5
roşu-cărămiziu ++++ cca 2,0

Reacţia Barfoed

Principiu:
2+ +
Reacţia de reducere a Cu la Cu din Cu2O în mediu slab acid este pozitivă numai în
prezenţa monozaharidelor şi ea serveşte la identificarea acestora în prezenţa dizaharidelor
reducătoare (lactoză, maltoză), pentru care această reacţie este negativă în condiţiile de lucru.
2+ +
În mediu slab acid viteza reducerii Cu → Cu este mult mai mică decât în mediu alcalin (se
formează un precipitat roşu-cărămiziu), totuşi mecanismul reacţiei Barfoed încă nu este pe
deplin cunoscut.
Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml apă distilată, se
filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.
Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 2 ml urină şi 2 ml reactiv Barfoed. Se amestecă şi se încălzeşte
eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacţii, adică apariţia pulberii roşii
de Cu2O la suprafaţa şi la fundul eprubetei, indică existenţa monozaharidelor reducătoare.

Reacţia Wöhlk

Se foloseşte tot în scopul diferenţierii glucozei de lactoză.

Principiu:
o
Urina care conţine lactoză, încălzită la 60 C în prezenţa NH3 şi KOH, se colorează în
roşu.
Reactivi: ​- Sol. NH3 25%
- Sol. KOH 20%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă, la 5 ml urină, se adaugă 3 ml soluţie NH3 şi 5 pic. soluţie KOH.
o
Eprubeta se agită şi se introduce în baie de apă la 60 C, 30 minute. Prezenţa lactozei
determină apariţia coloraţiei roşii. Galactoza produce culoare galben deschisă, iar glucoza în
concentraţii ridicate dă o coloraţie brună.
Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare în ultimele luni de
sarcină sau la începutul alăptării.

Reacţia Seliwanoff

Se foloseşte pentru identificarea fructozei urinare.

Principiu:
Monozaharidele în prezenţa acidului clorhidric concentrat reacţionează cu rezorcina
(sau alţi polifenoli) formând produşi de condensare coloraţi. Reacţia este mai rapidă şi intensă
în prezenţa cetozelor, când se obţin produşi coloraţi în roşu. În prezenţa aldozelor, în aceleaşi
condiţii, coloraţia este slab roză. Această reacţie serveşte la diferenţierea aldozelor de cetoze.

Reactivi: ​- Reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină şi 100 ml acid clorhidric

concentrat se dizolvă în apă distilată până la 200 ml.
- Soluţie fructoză 1%

Mod de lucru:
Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Selivanoff. În paralel se execută doi
martori, unul cu 0,5 ml urină normală şi celălalt cu 0,5 ml urină normală care conţine fructoză
1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete.
Prezenţa fructozei este indicată de apariţia unei coloraţii roşu intens. Prin răcire se
poate depune un precipitat roşu care se dizolvă în alcool.
Interpretare: Fructozuria esenţială este o boală ereditară rară datorată blocării
conversiei normale a fructozei în glucoză în ficat (deficit de fructokinază). Se poate produce o
fructozurie alimentară în diabet şi în unele boli hepatice.

Reacţia Bial
Se foloseşte pentru identificarea pentozelor urinare.
Principiu:
În mediu puternic acid pentozele dau reacţie de culoare cu orcina (metilrezorcina).
Reactivi: ​- reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96% şi se
adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%
​- HCl conc.
​- soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză
 Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 5 ml reactiv Bial şi 0,5 ml urină. Se execută în paralel doi
martori, unul cu urină normală şi altul cu o urină normală la care se adaugă 1 ml soluţie de
pentoze 0,1% (arabinoză sau xiloză). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se lasă în
repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dacă sunt prezente în cantităţi mari, un
precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extrasă prin agitare în alcool amilic.
Interpretare:
Pentozuria alimentară apare după un consum substanţial de fructe bogate în pentoze.
Pentozele sunt adesea excretate în urina diabeticilor. Pentozuria esenţială (în care se elimină
xiluloza) este o boală ereditară rară în care apar cantităţi considerabile de L-xiluloză în urină
datorită deficitului de reductază care converteşte pentoza în xilitol.

Reacţia cu fenilhidrazina
În laboratorul clinic formarea glucosazonei şi a lactosazonei este utilizată ca test
pentru diferenţierea glucozei de lactoză în urina femeilor gravide.
Reactivi: ​- Soluţie fenilhidrazină în acid acetic glacial 10%;
- Soluţie acetat de sodiu 25%;
- Acid acetic glacial;
- Reactiv Patein: se dizolvă 200 g acetat de mercur în 600 ml apă
distilată, se alcalinizează (indicator hârtie de turnesol) cu soluţie de
hidroxid de sodiu 10%. Se trece într-un balon cotat de 1000 ml şi se
completează cu apă distilată la semn. Reactivul nu se alterează.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se pipetează 1 ml soluţie fenilhidrazină, 1 ml acid acetic glacial şi 1 ml
soluţie acetat de sodiu 25%, apoi se adaugă 10 ml urină defecată cu reactiv Patein. Prin
defecare se elimină celelalte substanţe reducătoare pe care le-ar putea conţine urina trecând în
filtrat numai glucidele. Se filtrează şi eprubeta cu filtrat se ţine o oră în baia de apă la fierbere,
apoi se filtrează imediat la cald într-o altă eprubetă care se lasă să se răcească.
În prezenţa glucozei (în cantitate mai mare de 4 g%o) se obţine glucosazonă insolubilă
la cald care rămâne pe al doilea filtru şi care examinată la microscop, se prezintă sub formă de
ace galbene aurii dispuse în snopi (vezi pag. 49). Fructosazona are aspect asemănător. Dacă
urina conţine şi lactoză sau maltoză, osazonele acestora se vor cristaliza în ultima eprubetă, la
rece. Cristalele de lactosazonă apar la microscop sub formă de rozete, iar cele de
maltosazonă au formă de lame aproape rectangulare unite prin una din extremităţi.

Identificarea corpilor cetonici urinari

Corpii cetonici (acetona, acidul acetoacetic şi acidul b-hidroxibutiric) sunt implicaţi
în metabolismul lipidic. În condiţii patologice de dereglare a catabolismului acizilor graşi se
excretă prin urină în special acidul b-hidroxibutiric şi acidul acetoacetic, ultimul fiind
convertit în acetonă prin decarboxilare dacă urina este păstrată la temperatura camerei.

Reacţia Legal
Serveşte la identificarea acetonei. În scop diagnostic este suficientă identificarea
acesteia, fiindcă acetona, acidul acetoacetic şi b-hidroxibutiratul sunt întotdeauna prezenţi
împreună.
Reactivi: ​- Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspătă)
- Acid acetic glacial
- NaOH 10%
Mod de lucru:
Se iau într-o eprubetă 3 ml urină, se adaugă 5 picături de soluţie de nitroprusiat de Na
10% şi 2-3 pic. de NaOH 10% până la reacţie alcalină. Apariţia unei culori roşii sau portocalii
se datorează acetonei sau creatininei urinare. Se adaugă apoi 1-2 ml acid acetic glacial.
Dispariţia culorii indică absenţa acetonei, iar intensificarea culorii cu virare spre roşu-violet
indică prezenţa acetonei. Intensitatea culorii variază în raport direct cu concentraţia corpilor
cetonici din urină.
Reacţia poate fi dată şi de unele medicamente (salicilaţi - de ex. aspirina).
Diferenţierea se face fierbând în prealabil câteva minute urina, operaţie prin care acetona se
îndepărtează. O reacţie pozitivă iniţială, care nu mai apare după fierberea unei alte probe din
urina respectivă, indică prezenţa acetonei.

Reacţia Lieben
Principiu:
În reacţia dintre acetonă şi iod în mediu alcalin, ia naştere iodoformul care poate fi
recunoscut prin miros.
H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O

CH3 - CO - CI3 + NaOH CH3 - COONa + CHI3

tri-iod-acetona ​ ​ iodoform
Reactivi: ​- Sol. de iod - iodură de potasiu 0,1 N
- Sol. NaOH 10%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se iau 5 ml urină, se adaugă 1-2 ml NaOH 10% şi 1-2 ml iod 0,1 N.
Apariţia unui precipitat galben şi a mirosului de iodoform indică prezenţa acetonei.
Interpretare: Corpii cetonici apar în urină în diabetul zaharat netratat (datorită lipsei de
insulină, celulele nu pot internaliza glucoza din sânge. Acizii graşi vor fi principala sursă de
energie, ceea ce intensifică exagerat cetogeneza hepatică. Ficatul exportă mari cantităţi de
corpii cetonici care sunt folosiţi în scop energetic de ţesuturile extrahepatice). Acetonurie
apare în toate cazurile în care aportul de glucide sau utilizarea lor este deficitară: înfometare,
regim alimentar dezechilibrat (bogat în lipide şi proteine, sărac în glucide), diaree, vărsături
(accentuate de sarcină), malabsorbţie intestinală, boli metabolice.

Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici

Corpii cetonici se pot evidenţia cu pulbere reactivă sau cu tablete "Acetotest" sau
baghete "Ketostix" care conţin nitroprusiat de sodiu şi substanţe alcalinizante, care se
colorează în roşu în cazul reacţiei pozitive. Aceste teste rapide se bazează pe reacţia Legal
clasică. Cu ajutorul lor putem detecta corpii cetonici chiar în concentraţii de 0,5-1 mmol/l,
prin apariţia culorii roşii la 15 secunde de la contactul urinei cu bagheta cu reactivi.
Identificarea acizilor biliari
Eliminarea acizilor biliari în urină se mai numeşte colalurie. Apare în special în caz de
icter mecanic (din cauze obstrucţiei tubului coledoc, sărurile acizilor biliari nu mai sunt
excretate în bilă. Datorită presiunii ele trec în curentul sanguin şi se elimină în urină).
Colaluria mai apare în ictere date de hepatită, când celula hepatică bolnavă nu mai poate
excreta acizii biliari.
Proba Hay
Principiu:
Sărurile acizilor biliari scad tensiunea superficială a urinei permiţând sedimentarea
florii de sulf.
Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf).
Mod de lucru:
Se presară floarea de sulf pe suprafaţa urinei pusă într-o eprubetă. Dacă urina conţine
acizi biliari, sulful sedimentează în 5 minute. În absenţa acizilor biliari sulful pluteşte câteva
ore.
Reacţia Pettenkoffer
Principiu:
Acidul sulfuric transformă glucidele în derivaţi furfurolici care se condensează cu
acizii biliari dând produşi coloraţi.
Reactivi: ​- Acid sulfuric concentrat
- Zaharoză 10%
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se iau 1 ml apă distilată, 1-2 ml urină, 5-6 picături zaharoză 10% şi se
agită. Se adaugă cu grijă, prelingându-se pe peretele eprubetei ţinută într-o poziţie înclinată,
1-2 ml acid sulfuric. Apariţia unui inel roşu-violet la limita de separaţie a reactivului cu proba
indică prezenţa acizilor biliari. În paralel se execută o probă martor în aceleaşi condiţii,
înlocuind urina cu apă. Inelul obţinut are o nuanţă brună cărămizie.

Identificarea pigmenţilor biliari urinari

Pigmenţii biliari sunt derivaţi pirolici care provin din catabolismul hemului. Principalii
reprezentanţi sunt biliverdina, bilirubina, urobilinogenul, urobilina, stercobilinogenul,
stercobilina. Urobilinogenul şi stercobilinogenul, rezultaţi prin reducerea bilirubinei, sunt
compuşi incolori, care în contact cu aerul se oxidează parţial, trecând în urobilină, respectiv
stercobilină, care sunt compuşi coloraţi.

Identificarea bilirubinei

După cantitatea de bilirubină eliminată, culoarea urinei variază între galben şi brun-
închis, cu nuanţă verzuie. Bilirubina eliminată în urină, fiind instabilă, reacţiile de identificare
trebuiesc făcute în timp cât mai scurt de la emisie. Bilirubina fiind fotosensibilă, urina trebuie
conservată la întuneric.
Urina normală conţine doar urme de bilirubină, care nu dă reacţia de identificare
pozitivă. Creşterea eliminării urinare a bilirubinei apare, ca şi în cazul acizilor biliari, în
icterele prin obstrucţia căilor biliare şi în icterele prin hepatită.

Proba Popper
Principiu:
Oxidarea bilirubinei în biliverdină (de culoare verde) cu ajutorul iodului.
o
Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestecă 525 ml apă distilată, 125 ml alcool 95 , 3,5 ml
tinctură de iod 10% şi se adaugă 12 g KI şi 27 g NaCl.
 Mod de lucru:
Se pun 5 ml urină într-o eprubetă. Se adaugă cu precauţie, cu o pipetă, 2 ml reactiv,
astfel ca cele două lichide să nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se introduce la fundul
eprubetei. În prezenţa bilirubinei apare un inel verde la suprafaţa de contact dintre coloanele
celor două lichide.
Reacţii fals pozitive: după consum de antipirină (analgetic) şi piramidon.
Testele rapide de determinare a bilirubinei din urină au la bază reacţia de condensare a
bilirubinei cu un alt compus în mediu puternic acid, cu apariţia unei coloraţii maronii de
intensitate diferită. Reacţia completă necesită 20 de minute.

Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului

Urobilinoizii sunt derivaţii hidrogenaţi ai bilirubinei: urobilinogenul,
stercobilinogenul, urobilina şi stercobilina. Reducerea bilirubinei se produce în intestin sub
influenţa bacteriilor. O parte din urobilinoizi este reabsorbită şi ajunge din nou la ficat prin
vena portă (circuitul hepatoenterohepatic al pigmenţilor biliari). Cea mai mare parte este
metabolizată, în timp ce 35-140 mg sunt excretate în urina de 24 de ore.

Identificarea urobilinoizilor urinari

Reacţia Ehrlich
Principiu:
În prezenţa p-dimetilaminobenzaldehidei în mediu puternic acid, urobilinogenul şi
stercobilinogenul dau o coloraţie roşie intensă prin formarea unui compus chinoid.
Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolvă 2 g p-dimetilaminobenzaldehidă în 100

ml HCl 20%.
- Cloroform
Mod de lucru:
La 3 ml de urină se adaugă 2-3 picături reactiv Ehrlich. Se lasă în repaus un minut.
Apariţia unei coloraţii roşii intense la temperatura ambiantă denotă o eliminare crescută de
urobilinogen. Colorantul se poate extrage în cloroform. Porfobilinogenul intermediar al
sintezei hemului, care apare în urină în porfiria intermitentă acută, dă o coloraţie
asemănătoare. El nu este însă solubil în cloroform. Dacă după agitare cu cloroform acesta
rămâne incolor, reacţia pozitivă se datoreşte prezenţei porfobilinogenului.
Observaţie: Urina de analizat trebuie să fie rece. În urina caldă indolul eliberat în
condiţiile de reacţie poate da şi el culoare roşie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o
coloraţie galbenă care poate masca reacţia bilinogenilor.
Interpretare: Eliminarea crescută a urobilinoizilor apare în următoarele situaţii:
1). Hemoliză exagerată: funcţia hepatică este în general intactă, dar posibilităţile de
glucuronoconjugare ale ficatului sunt depăşite.
2). Tulburarea funcţiei hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroză sau intoxicaţii
chimice cu cloroform şi în special cu tetraclorură de carbon.
3). Icter prin obstrucţie, în stadiile precoce, de obstrucţie incompletă.

Identificarea sângelui
În urină apare fie hemoglobina liberă (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie).
Diferenţierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, şi anume
în primul caz în sediment nu se observă hematii.
 Se foloseşte urina proaspătă fiindcă majoritatea testelor se bazează pe acţiunea
pseudoperoxidazică a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina, fenolftaleină
redusă în mediu alcalin, etc.) este oxidat cu apă oxigenată, în prezenţa hemoglobinei, în
colorantul respectiv. Întrucât leucocitele dau o reacţie peroxidazică adevărată (enzimatică)
este necesar să se fiarbă urina câteva minute, după acidularea prealabilă cu acid acetic.
Reacţia cu benzidină
Reactivi: ​- Sol. benzidină: 5 g benzidină se dizolvă în 50 ml acid acetic glacial
şi se completează cu apă distilată la 1000 ml.
- Apă oxigenată 3%

Mod de lucru:
Se iau 3 ml urină, 2-3 pic. sol. benzidină şi 2 ml apă oxigenată 3%. Se agită, reacţia
pozitivă prezintă o culoare albastră. Ordinea de adăugare a reactivilor este esenţială.
Interpretare:
Hematuria macroscopică (vizibilă cu ochiul liber) apare în caz de: calculi renali,
tumori renale sau ale căilor urinare (cancerul renal deseori are ca primă manifestare
hematuria), tuberculoză urogenitală, traumatisme, chisturi renale, diateză hemoragică
(sângerări multiple, în diferite ţesuturi), cistită hemoragică. Hematuria microscopică, deseori
renală apare în caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei, pielonefrită, nefrită
interstiţială, în colagenoze (boli autoimune cu frecventă afectare renală), de însoţire în boli
infecţioase, efort fizic, glomerulonefrită (lezarea gravă a filtrului glomerular face posibilă
traversarea lui de către hematii) . ​

Teste rapide de diagnostic din urină

Stripsurile pentru analiza urinei sunt plăci de celuloid care conţin mai multe benzi de
hârtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importanţi care se analizează sunt: densitatea,
pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici, leucocitele, nitriţii şi
sângele. Stripsul se introduce în proba de urină pentru câteva secunde, timp în care au loc
reacţiile corespunzătoare. Culoarea se compară cu o scală de culori care arată aproximativ
cantitatea de substanţe conţinute, pH-ul, etc, sau se introduce stripsul într-un aparat special
care citeşte rezultatele.

Test rapid de sarcină

Se bazează pe determinarea hormonului coriogonadotrop uman (hCG). Dacă acesta se
găseşte în urină în cantitate mare (peste 800 U/l), testul este pozitiv, iar la valori sub 500 U/l
testul este negativ. Principiul de determinare se bazează pe latex-aglutinare, hemaglutinare,
sau o metodă imunoenzimatică, în funcţie de testul folosit.
La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plăcii de reacţie a kitului sunt
acoperite cu hCG. Antiserul folosit conţine anticorpi monoclonali specifici pentru beta-hCG.
În caz pozitiv (dacă este sarcină) hCG din urină în concentraţie de peste 800 U/l se leagă de
anticorpii monoclonali ai antiserului, împiedicând astfel aglutinarea elementelor de latex
acoperite cu anticorpi. În caz negativ, dacă nivelul hCG în urină este sub 500 U/l, atunci hCG
de pe suprafaţa elementelor de latex se poate lega de anticorpii monoclonali cu locusurile de
legare libere, astfel se produce aglutinarea.
În cadrul metodei imunoenzimatice în prima etapă se adaugă într-o eprubetă proba de
urină la anticorpul anti-hCG legat de o enzimă, apoi acest amestec este pus pe o placă de
reacţie. Dacă proba conţine hCG, acesta se leagă de anticorpul monoclonal şi complexul se
leagă de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacţie. În a doua etapă se adaugă un
substrat care este transformat de către enzima din complex într-un compus colorat. Această
reacţie este foarte sensibilă, fiind pozitivă peste valoarea de 25 U/l hCG.

Analiza de laborator a urinei

Analiza de rutina evidenţiază: Aspect: clar. Cilindri: absenţi, eventual prezenţa
cilindrilor hialini. Culoare: galben pai. Cristale: prezente. Celule epiteliale: absente. Miros:
3
uşor aromatic. pH: 4,5-8,0. Densitate: 1,025-1,030g/cm . Glucide: absente. Hematii: 2-3/câmp
vizual. Leucocite: 0-4/câmp vizual.
3
Proba de concentrare pune în evidenţă: Densitatea: 1,025-1,032g/cm . Osmolaritatea: >
800 mOsm/kg apă
Proba de diluţie pune în evidenţă: Densitatea: < 1,003. Osmolaritatea: < 100 mOsm/kg
apă.

Determinări în urina din 24 de ore.

Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr)
Principiu.
Azotatul de argint precipită cantitativ ionul clor din urină sub formă de clorură de
argint, iar excesul de azotat de argint dă cu cromatul de potasiu folosit ca indicator, cromat de
argint de culoare roşie, care indică sfârşitul reacţiei.
NaCl + AgNO3 → AgCl + NaNO3
K2CrO4 + 2AgNO3 → Ag2CrO4 + 2KNO3
Reactivi: ​- soluţie de acid acetic 10% ;
- carbonat de calciu pulbere ;
- soluţie cromat de potasiu10%;
- soluţie azotat de argint 0,1N.
Modul de lucru:
Într-un vas Erlenmeyer se pipetează 10 ml urină de analizat, se adaugă 5 picături din
soluţia de acid acetic 10% pentru a dizolva precipitatul de fosfaţi neutri care ar împiedica
observarea sfârşitului reacţiei şi 1 g de carbonat de calciu pulbere pentru neutralizarea
completă a amestecului deoarece cromatul de argint care se formează şi care indică sfârşitul
reacţiei este solubil în mediu acid.
La acest amestec se mai adaugă 50 ml de apă distilată şi 5-6 picături din soluţia de
cromat de potasiu. Se titrează cu soluţia de azotat de argint 0,1 N până la apariţia unei
coloraţii roşu-cărămiziu a precipitatului.
Calcularea rezultatelor
1 ml AgNO3 0,1 N corespunde la 0,00585 g NaCl
g/l NaCl = n x 0,00585 x 100
n = ml soluţie AgNO3, 0,l N folosiţi la titrare.
Variaţii patologice
Rezultatul se poate raporta la cantitatea de urină emisă în 24 de ore. În mod normal
urina din 24 de ore conţine 9-12 g NaCl.
- valori crescute: regim hiperclorurat, insuficienţă suprarenală, nefropatii tubulare sau
interstiţiale:
- valori scăzute: retenţii tisulare, nefrite, transpiraţii excesive, vomă, maladii cardiace, dietă
fără sare.
Persoana la care se face analiza clorurilor în urină nu trebuie ca înaintea analizei să
consume bromuri sau ioduri, deoarece şi acestea precipită cu azotatul de argint şi rezultatele
nu vor fi concludente.
Analiza chimică a urinei evidenţiază:
- Amilază: 10-80 UI/oră
- 17 cetosteroizi: -​ bărbaţi: 6-21 mg/24 ore
​ ​- femei: 4-17 mg/24 ore
-​ bărbaţi (20 ani): 90 ml/min/1,73 m
2
- Clearance de creatinină:
​ - femei (20 ani): 84 ml/min/1,73 m
2

- Proteine: < 150 mg/24 ore. Acid uric: 250-750 mg/24 ore. Glucozoxidază: negativ. Corpi
cetonici: negativ
- Calciu: ​- bărbaţi: < 275 mg/24 ore
​ ​- femei: < 250 mg/24 ore
- Fosfat: < 1000 mg/24 ore. Sodiu: 30-290 mEq/24 ore. Clor: 110-250 mEq/24 ore

Dozarea acidului uric din urină

Recoltarea urinii de 24 ore se face într-un recipient de sticlă cu 10 ml NaOH 5%
pentru a preveni precipitarea uraţilor.
Modul de lucru:
În loc de 2 ml filtrat se lucrează cu 2 ml urină diluată 1:100.
Calcul:
Ep/Es x 100 x 15 = mg acid uric/1500 ml urină (pe 24 de ore)
Valori normale:
0,25 - 1,00 g acid uric eliminat/24 h
Valori crescute: În gută (după puseuri), tumori maligne
Valori scăzute: în gută (înainte si în cursul puseurilor), boli renale

Dozarea creatininei din urină

Principiu şi reactivii: acelaşi ca pentru ser
Modul de lucru:
Se diluează urina de 50 ori. Din această soluţie se pipetează 1,5 ml, se adaugă 4,5 ml
acid picric saturat şi se introduce vasul pentru 15-20 secunde în baie de apă fierbinte. Dacă
soluţia rămâne limpede, după răcire se scot 5 ml de probă la care se adaugă 0,25 ml NaOH
10%. După 15 minute se citeşte extincţia probei faţă de martor la 530 nm. Martorul va conţine
2 ml de apă bidistilată, 6 ml acid picric saturat şi 0,25 ml NaOH 10%. În paralel se execută
aceleaşi operaţii folosind în locul urinei diluate o soluţie standard de creatinină de
concentraţie cS = 10 g/ml pentru care se obţine extincţia Es.

Calcul:
 Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal
Pornind de la faptul că constituenţii urinii provin din sânge, cunoscând cantitatea lor
în sânge şi în urină, putem calcula volumul de sânge epurat de aceste substanţe. Pentru orice
substanţă din sânge, care se elimină în urină, putem scrie formula: mp = mu unde: mp =
cantitatea absolută a substanţei dintr-un volum de plasmă care va fi epurată de aceea
substanţă. mu = cantitatea absolută a substanţei ajunse prin epurare în urină.
mp = Vp × cp/100. mu = Vu × cu/100. Vp × cp = Vu × cu
cp, cu = concentraţiile plasmatică şi urinară a substanţei. Vu = volumul de urină eliminat în
ml/min. Vp = C (clearance = coeficient de epurare) = acel volum virtual de plasmă care este
epurat într-un minut de această substanţă (ml/min) pe cale renală. Deci coeficientul de epurare
este exprimat prin raportul dintre debitul urinar al unei substanţe pe minut şi concentraţia sa în
plasmă:
cu
C = ---- × Vu
cp
La nivelul nefronului au loc 3 procese importante: filtrarea glomerulară, reabsorbţia
tubulară şi secreţia tubulară. Clearance-ul este egal cu volumul filtrării glomerulare pe minut
în cazul substanţelor care se filtrează liber, adică nu sunt reabsorbite şi secretate la nivel
tubular, nu se transformă, nu se depozitează, nu influenţează funcţia renală, nu sunt toxice.
Astfel de substanţe pot fi endogene (creatinină) şi exogene (inulină, manitol-polizaharide cu
masă moleculară mare etc.). Astfel determinarea clearance-ului de creatinină endogenă
permite explorarea filtrării glomerulare. Clearance-ul de creatinină endogenă este egal cu 120
2
ml/min pentru o suprafaţă corporală medie de 1,7 m şi o greutate medie de 70 kg.
Fiecare substanţă din plasmă are un coeficient de epurare indiferent de concentraţia sa
în urină. Majoritatea constituenţilor obişnuiţi ai urinei au un coeficient de epurare mai mic de
120 ml/min, datorită reabsorbţiei tubulare parţiale sau totale (de ex. Cglucoză = 0). O altă
categorie de substanţe au un clearance superior filtratului glomerular, deoarece ele ajung în
urina finală şi printr-un proces de secreţie tubulară. Determinarea clearance-ului de creatinină
permite deci explorarea capacităţii de filtrare glomerulară.
Calcul:
Calculul clearence-lui de creatinină (C) se poate face cu următoarea formulă
C = Eurină/Eser × 50 × 1500/24 × 60
unde: Eurină şi Eser sunt extincţiile optice citite pentru probele de urină, respectiv ser în
metodele de dozare descrise la pag. 121.
Valori normale: 80-120 ml/min

Analiza calculilor urinari

​Calculii urinari se formează prin precipitarea unor substanţe organice şi anorganice
des întâlnite în sedimentul urinar: oxalat de calciu, acid uric, uraţi, fosfaţi de calciu şi
magneziu, xantina, colesterolul. Acestea se depun sub formă de straturi alternante în jurul
unui nucleu sau sunt amestecate intim. Calculi omogeni se întâlnesc rar.

Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice:

2-
1) CO3 : Pulberea de calcul urinar se dizolvă cu efervescenţă în soluţie de HCl 2N la cald.
3-
2) PO4 : Într-o eprubetă se introduce un vârf de cuţit de pulbere de calcul, se adaugă câteva
picături de HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) şi 1-2 ml soluţie de molibdat de amoniu 5%.
Se încălzeşte şi se lasă în repaus. Apariţia unei coloraţii sau precipitat galben de
fosfomolibdat de amoniu indică prezenţa fosfatului.
2-
3) (COO)2 : Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere de calcul, 1 ml H2SO4 5%
şi 2 picături KMnO4 1%o. Se încălzeşte eprubeta. Dacă oxalatul este prezent, va reduce
KMnO4 producând decolorarea soluţiei.
4) Cistină: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere, 1 ml soluţie de NaOH 10%
şi 2-3 picături soluţie de Pb(CH3COO)2 saturată. Eprubeta se încălzeşte la fierbere 1-2
minute. Prezenţa cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru).
5) Urat (reacţia murexidului): Într-o capsulă de porţelan se introduce un vârf de cuţit de
pulbere care apoi se umectează cu 2-3 picături HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) şi se
evaporă pe flacără la sec. Apariţia unei culori roşii indică formarea acidului purpuric prin
oxidarea acidului uric de către HNO3. Adăugând o picătură de soluţie NH3 25% şi o
picătură soluţie NaOH 10% apare o culoare violetă datorită murexidului (purpurat de
amoniu).
6) Xantina: Se face reacţia cu HNO3 concentrat ca şi în cazul evidenţierii uratului. Prezenţa
xantinei determină un reziduu galben care nu-şi schimbă culoarea la adăugarea soluţiei de
NaOH. Adăugând soluţie de NH3 culoarea virează spre roşu.
7) Colesterolul: (reacţia Liebermann-Burchardt): Într-o eprubetă se introduc 1 vârf de cuţit de
pulbere, 1 ml cloroform, 4 picături H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) şi 2 picături
anhidridă acetică.
Prezenţa colesterolului determină formarea dicolestendienei de culoare ce variază de la roz la
verde, extractibilă în cloroform.
Calculii urinari apar în litiaza urinară cu următoarea frecvenţă relativă: Oxalat de Ca
34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%. Oxalat de
Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca 2,2%. Cistină
1,7%.

Analiza salivei

Identificarea unor componenţi ai salivei

​Saliva – reprezintă produsul de secreţie al glandelor salivare. Este un lichid incolor,

3
transparent, insipid, având densitatea între 1,002-1,006g/cm şi pH în jur de 6,8 în momentul
secreţiei, devenind mai alcalin în timpul masticaţiei.Volumul salivar mediu zilnic este de
aproximativ 800 ml.
Compoziţia salivei diferă în funcţie de următorii factori: perioada de zi în care se face
recoltarea; înainte sau după mese; alimentele consumate; igiena bucală; stimulul aplicat la
recoltare.
Compoziţia chimică a salivei este următoare:
- apă: 99,4%
+ + 2+ 2+ - - - 2-
- substanţe anorganice 0,2%: Na , K , Ca , Mg , HCO3 , Cl , SCN , PO4
- substanţe organice 0,4%: proteine, enzime salivare (amilază, lizozim), mucine
(glicoproteine), micromolecule azotate (uree, creatină, etc.), micromolecule
neazotate (acid lactic, acid citric).
Reactivi: ​- CH3COOH 5%.
- NaOH 5%.
​- Reactivul biuret - Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se
dizolvă în 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4•5H2O dizolvat în 10 ml
apă, apoi se adaugă 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N până la 100 ml. Se conservă
în sticlă brună timp nelimitat.
​ - Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de NaOH 0,2
N. Se conservă timp nelimitat, în sticla brună.
- Soluţia de lucru: se dizolvă 1 volum soluţie A cu 4
volume soluţie B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă brună.
- HCl 5%.
- Na2CO3 20%.
​- Reactivul Benedict ( 173 g citrat de sodiu şi 100 g carbonat de sodiu anhidru se
dizolvă în 800 ml apă distilată fierbinte, se filtrează şi se aduce volumul la 850 ml. Se dizolvă
apoi separat 17,3 g sulfat de cupru cristalizat în 100 ml apă distilată, se adaugă sub agitare în
prima soluţie şi se completează volumul soluţiei finale la 1000 ml.
- HNO3 5%. ​
- AgNO3 5%.
- HNO3 concentrat.
- (NH4)2MoO4 5%.
- BaCl2 5%.
- (COO NH4)2 5%.
- FeCl3 5%

​Identificarea mucinei: Mucinele au ca grupare prostetică compuşi din clasa

glucidelor ce derivă de la aminozaharuri.
a) Precipitarea mucinei: la 5 ml salivă se adaugă 1 ml acid acetic 5%. Mucina precipită, se
filtrează. Filtratul se păstrează pentru identificarea altor componenţi, iar din precipitat
se pune în evidenţă partea proteică şi cea glucidica a mucinei.
b) Identificarea părţii proteice: o parte a precipitatului se dizolvă în 1 ml NaOH 5% şi se
adaugă 1 ml din reactivul biuret. Datorită componentei proteice se formează
complexul de culoare violetă.
c) Identificarea părţii glucidice: partea ce rămâne din precipitat se fierbe câteva minute în
5 ml HCl 5%. Se răceşte, se alcalinizează cu Na2CO3 20% şi se efectuează reacţia
Benedict. Reacţia va fi pozitivă datorită apariţiei glucidelor reducătoare în urma
hidrolizei părţii glucidice.
 -
Identificarea Cl : La porţiunea de filtrat de salivă (lipsită de mucină) se adaugă HNO3
-
5% ş AgNO3 5%. Formarea unui precipitat alb de clorură de argint indica prezenţa ionilor Cl
3-
Identificarea PO4 : Filtratul de salivă se acidulează cu HNO3 conc., se adaugă câteva
3-
picături de molibdat de amoniu 5% şi se încălzeşte. Prezenţa ionilor de PO4 este indicată
prin apariţia unui percipitat galben sau o coloraţie galbenă.
2-
Identificarea SO4 : Se acidulează filtratul de salivă cu HCl 5% şi se aduga BaCl2 5%.
2-
În prezenţa ionilor SO4 apare un precipitat alb de sulfat de bariu.
2+
Identificarea Ca : Se adaugă la filtratul de salivă oxalat de amoniu 5%. În prezenţa
2+
ionului de Ca apare un precipitat alb de oxalat de calciu.
-
Identificarea SCN : La filtratul de salivă se adaugă 1-2 picături de HCl 5% şi 1-2
-
picături FeCl3 5%. În prezenţa ionilor de SCN se formează Fe(SCN)3 de culoare roşie. La
-
fumători, în general, concentraţia ionului SCN este mai mare ca la nefumători.

Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei

Determinarea pH-ului: Se face cu hârtie de indicator universal sau mai exact prin
metoda electrometrică. În mod normal, pH-ul salivei (salivă proaspătă) este de 6,5-7,0 deci
neutru.
​Scăderea pH-ului salivei (până la valori slab acide 6,0), ca şi creşterea (până la valori
slab bazice 7,9) poate apărea în anumite stări fiziologice
​- scăderi în timpul nopţii
​- scăderi după mese
​- scăderi la gravide
cât şi în unele stări patologice ​ ​- tulburări sanguine acido-bazice
​- leziuni ale cavităţii bucale
În timpul păstrării salivei recoltate, pH-ul iniţial neutru devine alcalin, din cauza pierderii de
CO2.
​Determinarea capacităţii tampon:
Principiu: Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de următoarele
sisteme tampon: dicarbonat, fosfat şi proteină (mucină)
​Capacitatea sistemelor tampon se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid sau
bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie tampon cu o unitate. În scopuri practice
capacitatea poate fi exprimată şi prin numărul mililitrilor de acid sau bază de concentraţie
cunoscută, tamponate de un anumit volum de soluţie tampon.
Reactivi: -​ HCl 0,01 N;
​- NaOH 0,01 N;
-​ Metilorange (soluţie de indicator) 0,1%;
​- Fenolftaleină (soluţie de indicator) 0,1% în alcool.
 Modul de lucru:
​6 ml salivă se diluează cu 14 ml apă distilată. Saliva diluată se împarte în două probe
de câte 10 ml. Într-una din probe se pune 3 picături de metilorange, iar în cealaltă 3 picături
de fenolftaleină. Cu ajutorul microbiuretei se adaugă primei probe HCl N/100 iar celei de-a
doua probă NaOH N/100, până la virajul indicatorilor. Se notează volumul de HCl N/100 şi
de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se înmulţesc cu factorii soluţiilor respective şi se
raportează la 1000 ml salivă.

Analiza sucului gastric

Determinarea acidităţii gastrice

​Sucul gastric provine din secreţia unui mare şi variat număr de celule ale mucoasei
gastrice. Zona glandelor fundice elaborează secreţia primară acidă (secreţie parietală) care
este de fapt o soluţie apoasă de acid clorhidric. Zona antropilorică elaborează secreţia primară
alcalină (secreţia neparietală), care este un amestec de proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu,
calciu, clorură şi bicarbonat. Secreţia alcalină are rolul de a reduce aciditatea gastrică prin
neutralizare şi diluţie.
​Sucul gastric rezultă deci din amestecul celor două secreţii parietale şi neparietale din
care rezultă lichidul intens acidulat (pH = 1-2).
Principiu:
​În laborator se determină aciditatea totală, liberă şi legată. Aciditatea liberă reprezintă
concentraţia ionilor de hidroniu proveniţi din acidul clorhidric liber. Aciditatea legată
reprezintă concentraţia ionilor de hidroniu legaţi de proteine, fosfaţi acizi, acizi carboxilici şi
alte substanţe. Aciditatea totală este dată de însumarea celor două acidităţi (liberă şi legată) şi
se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu titrabili cu NaOH 0,1 N.

Sucul gastric filtrat se titrează cu NaOH 0,1 N în prezenţă de indicator Tőpfer.

​Figura redă curba de titrare (variaţia pH-ului în funcţie de NaOH 0,1N adăugat) în
cazul unui suc gastric normal.
​Indicatorul Tőpfer este un indicator universal preparat din p-dietilaminoazobenzen şi
fenolftaleină. În tabel este prezentat virajul indicatorului Tőpfer în funcţie de pH (vezi curba
de titrare de mai sus).

Indicator Tőpfer pH Culoarea

0 - 2,9 roşu
p-dimetilaminoazobenzen 2,9 - 4,1 portocaliu
4,1 - 14 galben
0-8 incolor
fenolftaleină 8 - 10 roz
10 - 14 roşu

Reactivi: ​- Indicatorul Tőpfer : ​p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g

​fenolftaleină 2g
a​ lcool etilic 96%. 100 ml
​- Sol. NaOH 0,1 N cu factorul F NaOH

​Modul de lucru:
​În trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se măsoară câte 10 ml suc gastric şi se adaugă
1-2 picături de indicator Tőpfer. Soluţia se titrează cu NaOH 0,1 N până la portocaliu şi se
notează cantitatea de NaOH 0,1 N folosită. Această cantitate reprezintă volumul folosit pentru
dozarea acidităţii libere şi se notează cu v. Se continuă titrarea trecând prin culoarea galbenă
până la apariţia culorii roşii. Totalul mililitrilor de NaOH 0,1 N consumaţi de la începutul
titrării se notează cu v' şi vor fi luaţi în considerare pentru calculul acidităţii totale.
​Calcul: Rezultatul se exprimă în unităţi clinice (UC, numărul de ml de NaOH 0,1 N
folosiţi la titrarea a 100 ml suc gastric).
​aciditatea liberă = v FNaOH 10 UC
​aciditatea totală = v' FNaOH 10 UC
​Valoarea acidităţii legată se obţine făcând diferenţa dintre aciditatea totală şi cea
liberă.
​Valori normale:
aciditatea liberă = 30 UC; aciditatea totală = 50 UC.
Valori patologice:
Valori crescute: Hiperaciditate se întâlneşte în stări de stres (stimulul simpatic induce
creşterea secreţiei de HCl în mucoasa gastrică), în gastrite hiperacide, ulcer gastric şi
duodenal. În tumori pancreatice secretoare de gastrină (gastrinoame), se produc ulceraţii
multiple datorită hiperstimulării secreţiei de HCl de către gastrină (sindromul Zollinger-
Ellison).
Valori scăzute: Hipoaciditatea apare în unele tipuri de gastrită. Aclorhidria, lipsa totală
de HCl se datorează atrofiei mucoasei gastrice sau proliferării ei tumorale (celulele
canceroase îşi pierd funcţiile fiziologice). O stare şi mai gravă este aclorhidria histamino-
refractară, când nici la stimulare cu histamină nu se secretă HCl. În afară de HCl, celulele
parietale ale mucoasei gastrice mai secretă şi o glicoproteină numită factor extrinsec care
leagă vitamina B12 şi o transportă la celulele intestinale pentru a se absorbi. În cazul atrofiei
mucoasei sau proliferării ei canceroase, nu se secretă acest factor intrinsec şi apare anemia
pernicioasă (prin deficitul de absorbţie a vitaminei B12).

Analiza lichidului cefalorahidian

Componentele lichidului cefalorahidian (LCR) provin din plasmă prin difuzie liberă şi
printr-un proces de secreţie. Aceasta se observă comparând compoziţia chimică a lichidului
cefalorahidian cu aceea a plasmei:

Componente LCR (mg%) Plasmă (mg%)

sodiu 325 325
potasiu 10 20

calciu 5 10
magneziu 3 3
Cl- 449 360
HCO3- 40 60
HPO42- 2 1
SO42- 0,5 1
proteine 30 7000
uree 24 30
acid uric 0,5-2,6 4
glucide reducătoare 72 90
bilirubină 0,2 0,8
acizi organici urme urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian se face prin puncţie lombară, suboccipitală sau

ventriculară, în eprubete perfect curate şi sterilizate. După recoltare, în primul rând se
efectuează examenul microbiologic şi citologic, iar restul probei se foloseşte pentru
examenele fizice şi chimice.

Examenul fizic
Culoarea: LCR normal este incolor şi limpede. În unele afecţiuni este colorat în
galben, roz sau verzui. Această culoare se datorează prezenţei bilirubinei sau biliverdinei şi
este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. LCR poate fi colorat în roşu
datorită sângelui care poate proveni fie în mod accidental datorită unei puncţii greşit
efectuate, fie datorită unei afecţiuni.
Transparenţa: În mod normal, LCR este transparent. În unele afecţiuni poate fi
opalescent datorită prezenţei în cantitate mare a leucocitelor, albuminei sau
microorganismelor. LCR este tulbure în meningitele purulente. Un aspect particular îl
prezintă în cazul meningitei tuberculoase când probele vor forma o peliculă de fibrină la
suprafaţă.
Densitatea: Densitatea normală a LCR este foarte apropiată de aceea a apei: 1,006-
 3
1,008 g/cm . Densitatea creşte în unele afecţiuni patologice. Ea se determină cu areometre
speciale de dimensiuni mici.

Examenul chimic al lichidului cefalorahidian

Examenul chimic se face numai pe un LCR centrifugat. Cele mai frecvente
determinări care se efectuează pe lichidul cefalorahidian şi care prezintă interes pentru
diagnostic sunt: determinarea proteinelor, a glucozei, a clorurilor, al ureei, a permeabilităţii
faţă de nitraţi (această reacţie este utilizată pentru decelarea unei permeabilităţi menigiene
alterate). Dintre aceste metode vom descrie doar o metodă de determinare orientativă a hipo-
şi hiperglicorahiei.

Cercetarea hipo- şi hiperglicorahiei:

Principiu:
Alegând în mod convenabil diluţiile LCR şi ale reactivului Fehling se poate obţine o
reducere uşoară sau nulă a reactivului. La aceste diluţii LCR cu concentraţii scăzute, normale
şi crescute de glucoză se comportă diferit.

Modul de lucru:
În două eprubete (I pentru cercetarea hipoglicorahiei şi II pentru cercetarea
hiperglicorahiei) se măsoară:
I II
L.C.R. ml 2,0 0,6
H2O dist. ml - 2,0
Reactiv Fehling ml 0,2 1,0
​
Fierbere 5 minute în baie de apă
​Interpretarea: ​- I şi II negativ (albastru) - hipoglicorahie
- I negativ (albastru) şi II pozitiv (roşu) - normoglicorahie
- I şi II pozitiv (roşu) - hiperglicorahie
Dozarea glucozei din LCR se poate efectua prin metoda enzimatică cu glucozo-oxidază.
Valorile fiziologice ale glicorahiei: 55-70 mg/100 ml, sunt valoari cuprinse între
jumătate şi 2/3 din glicemie. Acest raport, în cazuri normale, rămâne constant, iar variaţiile
glicorahiei sunt aceleaşi cu ale glicemiei.
Valori patologice: Valori crescute numai pentru glicorahie se întâlnesc în tumori,
encefalite, abcese cerebrale. Glicorahia scade mult în meningita tuberculoasă.

Analiza scaunului

Identificarea sângelui din scaun (Proba Gregersen)

Reactivi: ​- acid acetic glacial;
- eter etilic;
 - H2O2 10%.
- soluţie de benzidină 2% în acid acetic glacial.
Mod de lucru:
Se zdrobeşte o bucată din scaunul de analizat cu puţină apă, se adaugă acid acetic
glacial (raport 2:1) şi se agită cu cantitate egală de eter într-o pâlnie de agitare. După
scurgerea fazei apoase (inferioare) se lucrează mai departe cu faza eterică (superioară): se
adaugă câteva picături de soluţie de H2O2 la 2 ml soluţie de benzidină şi în această soluţie
punem o cantitate din extractul obţinut. În caz pozitiv proba se va colora în verde.
Identificarea se poate efectua şi fără etapa de extracţie eterică. Se toarnă un amestec de
soluţie de benzidină în acid acetic glacial cu apă oxigenată peste scaunul de analizat. Lichidul
care se scurge de pe probă este verde în caz de prezenţă a sângelui.
Această analiză se efectuează după trei zile de regim strict: pacientul trebuie să evite
carnea şi alimentele bogate în clorofilă, deoarece această probă este pozitivă şi în cazul
prezenţei mioglobinei şi clorofilei.
Există şi un test specific care identifică doar hemoglobina umană din scaun prin
latexaglutinare. Acest test imunologic nu necesită dietă specială.
Patologie: Sângele apare în scaun cel mai frecvent datorită lezării hemoroizilor în
timpul defecării. Tumorile colonului (benigne şi maligne) pot determina o sângerare de obicei
ocultă (invizibilă cu ochiul liber), care se poate decela cu această probă. Uneori chiar
sângerările gastrice se pot exterioriza pe cale fecală prin sânge proaspăt (când tranzitul
intestinal este accelerat sângele nu are timp să fie digerat), dar cel mai frecvent în caz de
hemoragie digestivă superioară apare melena (scaun negru, ca păcura).
Semnele de malabsorbţie/maldigestie în scaun
Evidenţierea glucidelor din scaun
- În scaun pot apare glucide reducătoare (glucoză, fructoză, lactoză) detectabile cu
reacţiile Benedict, Barfoed, etc. (v. cap. Analiza glucidelor). Aceste glucide sunt eliminate
prin scaune diareice în caz de malabsorbţie glucidică.
- Se pot detecta şi polizaharidele nedigerate din materiile fecale.
Mod de lucru:
Se adaugă câteva picături de soluţie Lugol (cu conţinut de iod) la scaunul proaspăt
eliminat. Amidonul nedigerat dă o coloraţie albastră cu iodul, iar în caz de digestie
incompletă compuşii intermediari de degradare (dextrinele) dau o coloraţie roşie.
Patologie: În cazul secreţiei deficitare de amilază pancreatică apar amidonul şi
dextrinele în materiile fecale.
Evidenţierea lipidelor din scaun
În condiţii normale materiile fecale conţin o cantitate foarte mică de lipide. Dacă
creşte această cantitate (steatoree), scaunul capătă un luciu caracteristic şi, prin amestecarea
fecalelor cu apă, apar pete de grăsime pe suprafaţa apei.
Mod de lucru:
Scaunul proaspăt eliminat se colorează cu Sudan III (roşu Sudan). Cu acest colorant se
pot evidenţia lipidele nedigerate, deoarece trigliceridele şi esterii colesterolului se colorează
în roşu.

Patologie:
În scaun apar lipide nedigerate în secreţia insuficientă de lipază pancreatică şi în
deficitul de acizi biliari datorat obstrucţiei cailor biliare sau incapacităţii hepatice de secreţie a
acestora, stări care au consecinţă malabsorbţia lipidică.
 Evidenţierea proteinelor din scaun

Mod de lucru:
Se examinează la microscop preparatul nativ (fără coloraţie) al probei de scaun. Se pot
recunoaşte uşor mai ales fibrele musculare nedigerate, care arată deficitul digestiei proteice.
Patologie: Maldigestia proteică este datorată secreţiei insuficiente de proteaze
pancreatice.

Metode fizice de analiză folosite în laborator

​Fotometria
Principiu:
​Fotometria se bazează pe excitarea luminoasă a electronilor moleculelor substanţei.
​ upă lungimea de undă, exprimată în nanometri (nm) sau în Ångströmi (Å), spectrul
D
undelor electromagnetice folosite în fotometrie se împarte în 3 regiuni:
​- ultraviolet 200 - 450 nm, ​
- vizibil ​ 400 - 800 nm,
​- infraroşu ​ 800 - 20000 nm,
​Metoda spectrofotometrică de analiză se bazează pe determinarea extincţiei unui strat
de soluţie colorată cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de undă
​Pentru obţinerea radiaţiilor de diferite lungimi de undă spectrofotometrele conţin trei
tipuri de monocromaoare: prisme, reţele de difracţie sau filtre.
​Lungimile de undă corespunzătoare diferitelor culori sunt redate în tabelul de mai jos:

Culoarea Domeniul lungimilor de undă

Violet 400 - 450 nm
Albastru 450 - 500 nm
Verde 500 - 570 nm
Galben 570 - 590 nm
Portocaliu 590 - 620 nm
Roşu 620 - 760 nm
​
Efectuarea analizelor prin metoda colorimetrică prezintă avantajul că necesită cantităţi
mici de substanţă şi un timp relativ redus în comparaţie cu analizele chimice.
Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamentală a colorimetriei
În condiţii similare, straturile de substanţă colorată de aceeaşi grosime absorb aceeaşi
cantitate de lumină incidentă, absorbţie ce se exprimă matematic prin ecuaţia:

în care ​I este intensitatea fluxului luminos după trecerea prin soluţie; I0 - intensitatea fluxului
luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K - coeficient de
absorbţie optică.
​Dacă se ia ca bază zecimală de logaritmare, rezultă ecuaţia:
–k•l
I = I0 • 10
Din această ecuaţie, în care coeficientul k reprezintă coeficientul de extincţie, rezultă că:
a. Raportul între intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluţie şi intensitatea
luminii incidente nu depinde de intensitatea absolută a lu​minii incidente.
b. Când grosimea stratului de soluţie se măreşte în progresie aritmetică, intensitatea
luminii care trece prin aceasta descreşte în progresie geometrică.
c. Coeficientul de extincţie k, depinde numai de natura substanţei dizolvate şi lungimea
de undă a luminii incidente şi este valabilă numai pentru lumină monocromatică. Această lege
a fost stabilită de către P.Bouguer şi I.Lam​bert.
Beer a stabilit că, coeficientul de extincţie k este liniar proporţional cu con​centraţia
substanţei absorbante, adică :
k= •C
în care C este concentraţia substanţei colorate iar este un coeficient care nu depinde de
concentraţie.
Legea lui Beer stabileşte dependenţa absorbţiei luminii de către stratul cu grosime
constantă de concentraţia substanţei colorante.
Din ultimele două ecuaţii rezultă ecuaţia legii fundamentale a colorime​triei - legea
Bouguer-Lambert-Beer:
– •C•l
I = I0 • 10
Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluţie şi intensitatea
luminii incidente, I0, poartă denumirea de transparenţă sau trans​misie şi se notează cu litera T:
– •C•l
T = I/I0 = 10
Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numeşte coefi​cient de transmisie.
Logaritmul mărimii inverse transmisiei se numeşte extincţie, E, sau den​sitate optică,
D.O.:
E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = • C • l
Din această ecuaţie rezultă că extincţia E este liniar proporţională cu concentraţia
substanţei colorate din soluţie.

Spectrofotometru Spekol

​Spectrofotometrul Spekol constă dintr-un monocromator, care este o reţea de difracţie,

un fotoelement şi echipamentul de măsurarea fotocurentului (amplificator + galvanometru).
Lumina emisă de sursa (1) după colimare cade pe reţeaua de difracţie optică
reflectantă (2) şi formează spectrul de difracţie care, în planul fantei de ieşire (3), se poate
plimba cu ajutorul dispozitivului micrometric (4), gradat în nm ce corespund lungimii de undă
a luminii emergente.
​Aceasta trece prin cuva (5, 5') ce conţine lichidul de măsurat şi cade pe fotoelementul
(6). Fotocurentul obţinut este amplificat de amplificatorul (7) şi este indicat de instrumentul
(8). Calea luminii monocromatice se poate deschide sau închide cu ajutorul obturatorului (9).
Cuvele cu soluţia de compensare şi cea de măsurat se pot introduce alternativ în calea luminii
cu ajutorul port-cuvei glisante (10). Punctul 0 şi sensibilitatea amplificatorului se reglează cu
butoanele 0 şi 100. Aparatul se alimentează de la reţea prin transformatorul (11).

Schema de principiu al unui spectrofotometru

Spectrofotometru Spekol

​Îndreptar pentru folosirea aparatului

1) Se verifică dacă maneta obturatorului (9) se găseşte în poziţia 0.

2) Aparatul se conectează la reţea cu ajutorul întrerupătorului (12). Se aşteaptă aproximativ
10 min. până la prima citire.
3) Se alege lungimea de undă prevăzută în metodă prin rotirea tamburului micrometrului
(4).
4) Se aşează cuvele în glisorul (10).
5) Cuva cu proba martor se va muta în dreptul fantei.
6) Acul galvanometrului se aduce în poziţia 0 pe scara inferioară cu ajutorul butonului 0.
Pentru a evita eroarea de paralaxă, capul se aduce în poziţia în care acul şi imaginea lui
în oglinda instrumentului se suprapun.
7) Obturatorul se va aduce în poziţia I (deschis). Indicatorul galvanometrului se va mişca
spre dreapta.
8) Cu ajutorul butonului 100 acul galvanometrului se potriveşte la diviziunea 100 a scării
inferioare.
 9) Se închide fanta (obturatorul în poziţia 0). Acul indicator trebuie să revină la poziţia 0. În
caz contrar se repetă operaţiile de la punctul 6-9.
10) Se va muta proba în faţa fantei şi se deschide obturatorul.
11) Se citeşte extincţia (E) pe scara superioară. Se apreciază şi fracţiunile de diviziune.
12) Se închide obturatorul.

​Recomandări:
• Fotoelementul îşi pierde din sensibilitate dacă este expus luminii timp îndelungat. De aceea
timpul de iluminare a fotoelementului va fi redus la minimul posibil.
• Pentru a evita spargerea cuvelor se va lucra cu ele exclusiv deasupra mesei, la mică
înălţime.
• Suprafeţele optice ale cuvelor trebuie să fie perfect curate, de aceea se va evita atingerea
pereţilor transparenţi.
º
• Umplerea cuvei se va face ţinând cuva înclinată la aproximativ 45 şi turnând lichidul până
la circa 2/3 din înălţime.
• Cuva se va goli prin răsturnare bruscă în poziţia cu gura în jos şi păstrând această poziţie se
va aşeza pe o hârtie de filtru curată.
• După folosirea cuvelor se spală cu apă distilată şi se aşează cu gura în jos pe o hârtie curată.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Principiu:
O parte din atomii speciei ce urmează a fi analizaţi sunt excitaţi în fllacără la un nivel
energetic superior emiţând apoi prin revenirea la nivelul iniţial o radiaţie corespunzătoare
liniei de rezo​nanţă. Dar majoritatea atomilor rămân în starea fundamentală. În spec​troscopia
de absorbţie atomică se trece prin flacără o radiaţie având frecvenţa liniei de rezonanţă.
Atomii rămaşi în starea fundamentală absorb această radiaţie (pe care ar emite-o dacă ar fi
excitaţi) şi absorb​ţia este proporţională cu concentraţia atomilor în flacără şi grosimea
stratului străbătut de radiaţia monocromatică.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Spectrofotometrul de absorbţie atomică se compune din:
1. Sursa de radiaţie care emite linia de rezonanţă a elementului de determinat. Emisia lămpii
este modulată pentru ca detectorul să înregistreze doar lumina emisă de lampă nu şi cea emisă
din flacără (de către atomii excitaţi). Se folosesc în general lămpi de, descărcare cu ca​tod
tubular. Catodul trebuie să fie făcut din elementul pe care vrem să-l determinăm. Sunt şi lămpi
care au catozi făcuţi din aliaje astfel că pot fi folosite pentru determinarea tuturor elementelor
din care este făcut aliajul.
2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub formă de atomi. Se folosesc
atomizoare de flacără sau cu cuptor de grafit.
a) Atomizoarele de flacără sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi:
aer-acetilenă; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilenă etc. Proba de analizat este introdusă în
atomizor prin aspirare şi pulverizare.
b) Atomizorul cu cuptor de grafit este încălzit cu curent electric după un program
reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de protecţie. În
general, ca gaz de protecţie se foloseşte argonul sau azotul. La aparatele dotate cu atomizor cu
cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele lichide se introduc cu ajutorul
unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete.
3. Monocromatorul izolează linia de rezonanţă şi o focalizează asupra detectorului.
4. Fotomultiplicatorul detectează şi amplifică intensitatea lumi​nii care cade asupra sa.
Practic, aparatul este ajustat la extincţia zero când o soluţie mar​tor este vaporizată în
probă şi lumina lămpii ajunge la fotomultiplica​tor. Când se introduc soluţii conţinând specii
absorbante o parte din lumină este absorbită şi rezultă o diminuare a intensităţii luminii ce
ajunge la fotomultiplicator. Se determină extincţiile obţinute cu soluţii standard ale
elementului de analizat cu care se construieşte o curbă de eta​lonare a aparatului. Se introduc
apoi probele de analizat prelucrate în mod corespunzător iar din compararea extincţiilor
probelor cu curba de etalonare se calculează concentraţia elementului de analizat.

Flamfotometria
Fotometrul cu flacără (flamfotometrul)
Principiu:
Soluţia de analizat este pulverizată automat într-un dispo​zitiv, numit pulverizator şi se
introduce sub formă de aerosoli in flacăra unui arzător special (Brenner). Soluţia, sub formă
de aero​soli, ajunsă în flacără suferă diferite transformări: apa în care este dizol​vată sarea se
evaporă, componentele dizolvate sunt excitate de temperatura ridicată a flăcării, reîntoarcerea
electronilor din starea excitată pe un nivel energetic inferior eliberează energia absorbită sub
formă de lumină cu lungime de undă caracteristică elementelor chimice ai cărui atomi sunt
excitaţi.
Prin excitarea în flacără a acestui amestec complex iau naştere diferite spectre de
emisie. Radiaţia emisă este focalizată pe o celulă fotoelectrică, după ce au trecut prin filtre
optice de selecţie. Ia naştere astfel un fotocurent care se măsoară cu ajutorul unui
galvanometru. În cazul determinării unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.),
intensitatea fotocurentului este proporţională cu concentraţia elementului respectiv din
soluţie.
Pulverizatorul pulverizează automat în picături foarte fine soluţia de analizat. El este
confecţionat din sticlă, cuarţ sau material plastic. Pulverizarea se realizează în felul următor:
gazul purtător comprimat, care iese cu viteză mare în apropierea tubului cu soluţie, antrenează
soluţia de analizat şi o pulverizează în particule foarte fine. Soluţia pulveri​zată ajunge in
flacăra arzătorului, unde se vaporizează iar ionii absorbiţi se excită. Pentru ca analiza să se
desfăşoare în condiţii optime este necesară menţinerea unei presiuni constante atât pentru aer
cât şi pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii se realizează cu ajutorul unor reductoare de
presiune şi se măsoară cu manometrul. Gazul purtător poate fi aerul sau oxigenul.
 În figura de mai sus apar principalele componente ale unui flamfotometru.
Arzătorul este dispozitivul cu flacără în care substanţa de analizat se vaporizează şi se
excită, emanând radialii luminoase. Pentru întreţinerea flăcării, care se aprinde automat, se
utilizează diferite amestecuri de gaze în funcţie de temperatura necesară pentru excitarea
substanţei de analizat.

Amestec de gaze Temperatura flăcării măsurată în ºC

Gaz de iluminat – aer 1700 –1840
Propan – aer 1925
Hidrogen – aer 2000 – 2045
Acetilenă – aer 2125 – 2397
Hidrogen – oxigen 2550 – 2660
Propan – oxigen 2850 (calculată)
Acetilenă – oxigen 3100 – 3137

În tabelul de mai sus sunt redate câteva amestecuri de gaze folosite în flamfotometrie
precum şi temperaura flăcării acestora. În funcţie de potenţialul de ionizare al elementului
care urmează a fi determinat se alege şi temperatura dorită şi deci gazul combustibil capabil
să o realizeze. Pentru a fi activaţi, sodiul şi potasiul necesită o temperatură relativ joasă cum
ar fi cea a amestecului: propan-aer (1925°C), iar calciul şi magneziul o temperatură mult mai
ridicată (fla​cără de acetilenă-oxigen).
Determinarea cantitativă a elementelor din soluţia de analizat se face după mai multe
metode: metoda curbei de calibrare, metoda soluţiilor limitative, metoda adaosurilor, etc.
Soluţiile de analizat şi standardele respective (soluţiile etalon) trebuie să posede, pe
cât posibil, aceleaşi proprietăţi fizice, în aşa fel încât condiţiile de pulverizare sa fie identice.

Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi

Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă
Metoda necesită un pH-metru şi doi electrozi: unul selectiv pentru ionii de hidroniu -
electrodul de sticlă şi unul de referinţă. Acesta din urmă este un electrod metalic de speţa a II-
a în contact cu o soluţie saturată a anionului sării metalice, Ag/AgCl/KClsat. sau, în cazul celui
de calomel, Hg/Hg2Cl2/KClsat. Electrodul de sticlă este confecţionat din sticlă specială care se
comportă ca o membrană permeabilă pentru ionii de hidroniu. Acest electrod în formă de
balonaş sferic este umplut cu o soluţie tampon cu pH dat care nu-şi schimbă compoziţia (pH-
ul) în timpul măsurătorilor. El se cufundă în soluţia probă cu pH necunoscut. Diferenţa de
potenţial dintre aceste soluţii este dată de relaţia lui Nernst. Rescrisă în termeni de pH această
relaţie devine:
​RT
​DE = ——— ( pHelectrod – pHprobă )

​ 2,303 F

Această diferenţă de potenţial este, cum se vede, într-o relaţie lineară cu pH-ul soluţiei probei,
deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate măsura cu pH-metrul. Acesta este un milivoltmetru
cu impedanţă de intrare mare, datorită rezistenţei electrice mari a electrodului de sticlă, cu
scală de pH, numit pH-metru. Pentru măsurarea pH-ului unei soluţii necunoscute este
necesară în prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a două soluţii tampon cu pH
cunoscut.
Avantajele pe care le prezintă metoda potenţiometrică faţă de cea colorimetrică sunt:
- exactitate mare, ± 0,01 în cazul pH-metrelor obişnuite ca de exemplu cel de
tip MV-84, sau chiar ± 0,001 în cazul pH-metrelor performante ca de
exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.
- pot fi analizate soluţii colorate, vâscoase, cu proprietăţi redox
- timp de măsurare foarte scurt (1-2 minute)

Schema de principiu al unui pH – metru

 Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa
Na seric sub 120 mmol/l peste 160 mmol/l
K seric sub 3 mmol/l peste 8 mmol/l
Ca seric sub 1 mmol/l peste 4 mmol/l
Cl seric sub 80 mmol/l peste 120 mmol/l
HCO3- seric sub 10 mmol/l peste 40 mmol/l
pH sub 7,00 peste 7,7
PCO2 sub 20 mmHg peste 80 mmHg
PO2 sub 40 mmHg peste 400 mmHg
Glicemie sub 2,5 mmol/l peste 56 mmol/l
Hematocrit sub 20% (pierdere acută)
Indice de protrombină sub 20%

Limitele valorilor normale

St – sânge total ​U - urină
Pl – plasmă ​SG – suc gastric
Se – ser ​FBG - fibrinogen
L – LCR ​GC – greutate corporală

Acid uric Se Bărbaţi 4,3 – 8 mg/100 ml (256 – 476 mol/ l)

Femei 2,3 – 6 mg/100 ml (137 – 357 mol/ l)
2 - 8 mg/100 ml (119 –476 mol/ l)
U 400 – 1000 mg/ 24 ore (2,4 – 6 mmol/24 h)
L 0,5 – 2,6 mg/100 m (29 – 155 mol/ l )
Aminoacizi Se 35 – 55 mg N /l (3,5 – 5,5 mg N/100 ml)
U 0,5 g/24 ore
Amoniac Se 50 – 80 mg/100 ml (29 – 47 mmol/l)
U 0,3 – 1,2 g/24 ore (17,6 – 71 mmol/24 ore)
Bilirubina Se totală cca. 1mg/100ml (17mmol/l);
directă cca. 0,25 mg/100ml (4,3mmol/l)
Calciu (total) Se Copii 7 – 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,5–7 mEq/l)
 Adulţi 9– 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l)
U Sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore)
Copii 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore)
Adulţi 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore)
L 4 – 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l)
Clor St 280 – 320 mg/100ml (79 – 90 mmol/l)
Se 340 – 390 mg/100ml (96 – 110mmol/l)
L 410 – 460 mg/100ml (115 – 130mmol/l)
U 600 – 900 mg/100ml (169 – 254mmol/l)
SG 300 – 530 mg/100ml (85 – 149mmol/l)
Colesterol Se total 150 – 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l)
esterificat 60 – 80% din colesterolul total sau
colesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8
Creatinină Se Bărbaţi 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 –159 mmol/l)
Femei 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 –80 mmol/l)
0,6 – 1,8 mg/100 ml (53 - 159 mmol/l)
U Bărbaţi 26 mg/kg GC (230 mmol/kg GC)
Femei 22 mg/kg GC (190 mmol/kg GC)
Fer Se Bărbaţi 90 – 160 mg/ 100ml (16,1 – 28,6 mmol/l)
Femei 80 – 130 mg/ 100ml (14,3 – 23,3 mmol/l)
Fosfatază alcalină Se Sugari 3 – 10 UB/100 ml (25 – 83 UI/l)
Copii 2 – 8 UB/100 ml (16,6 – 66,4 UI/l)
Adulţi 2 – 4 UB/100 ml (16,6 – 33,2 UI/l)
Fosfatază acidă Se
totală 4,5 – 13,5 UI/l
prostatică 0,05 – 3,6 UI/l
Glucoză St Iodo- 80 –120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l)
metric
o-tolu- 70 –100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)
idină
Se Glocoz- 70 –104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l)
Pl oxidază
L 50 - 70 mg/100ml (2,8 – 3,9 mmol/l)
U <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l)
GOT Se adulţi 2 - 20 UI/l
copii sub 3 → 40 UI/l
luni
GPT Se Adulţi 2 – 16,5 UI/l
Copii sun 5 10,2 – 13 UI/ l
ani
Hemoglobină St Bărbaţi 15 – 20 g/100ml (9,3 - 12,4 (Hb/4) mmol/l)
Femei 14,0 – 17,0 g/100ml (8,7 - 10,5 (Hb/4) mmol/l
Potasiu Se 13– 21mg/100ml (3,3 -5,4 mmol/l)
L 8 – 11 mg/100ml (2,0 -2,8 mmol/l)
U 1,9 – 3,9 mg/100ml (0,5 –1,0 mmol/l)
Lipide Se totale 400 – 700 mg/100ml
fosfolipide 150 – 250 mg/100ml
trigliceride 80 – 200 mg/100ml
Magneziu St 3,7- 4,7 mg/100ml(1,5-1,9 mmol/l; 3,0-3,9 mEq/l)
Se Nou
născuţi 1,6-2,3mg/100ml(0,66-0,95mmol/l; 1,3-1,9mEq/l)
Adulţi 1,9-2,9 mg/100ml (0,8-1,2 mmol/l; 1,6-2,4 mEq/l)
L 2,5 mg/100ml (1,0 mmol/l; 2,0 mEq/l)
Azot neproteic Se 20 – 40 mg/100ml (14,3 - 28,6 mmol/l)
L 15 – 18 mg/100ml (11 - 13 mmol/l)
Sodiu Se 315-350mg/100ml(137-152mmol/l)
L 300-340mg/100ml(130-148mmol/l)
U 4 – 6 g/24 ore (174 – 261 mmol/24 ore)

Fosfor anorganic St 30 –50 mg/100ml (9,7 – 16,1 mmol/l)

Se Copii 4 –6 mg/100ml (1,3 – 1,9 mmol/l)
Adulţi 2,5 –4,5 mg/100ml (0,8 – 1,15 mmol/l)
L 1 –1,8 mg/100ml (0,3 – 0,6 mmol/l)
Proteine totale Se 6,5 - 8,2 g/100ml
Pl Copii 5 – 7,5 g/100ml
Adulţi 6,5 - 8,5 g/100ml
L 10 – 30 mg/100ml
Fracţiuni proteice Se Alb. 3,50-4,20 g/100ml
1 0,25-0,40 g/100ml
0,50-0,65 g/100ml
+
1 0,80-1,02 g/100ml
1,10-1,40 g/100ml
FBG 0,2 – 0,4 100 g/100 ml
Uree Se 21 – 54 mg/100ml (3,5 – 9 mmol/l)
U 20 – 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore)
L 20 – 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)

Sistemul internaţional de unităţi

 Cantitatea fizică Unitatea de măsură Simbol
lungime metru m
masă kilogram kg
timp secundă s
intensitatea c. electric amper A
intensitate luminoasă candelă cd
cantitate de subst. mol mol
temp. termodinamică Kelvin K

115