IZOLAREA VIRUSURILOR IN

CULTURI CELULARE

EFECTE CITOPATICE
 Direcţiile diagnosticului virusologic
1. Izolare virala in:
• Culturi de celule
• Ou de gaina embrionat
• Animal de laborator

2. Detectia directa a :
 Particulelor virale EM , IEM
 Antigene virale ELISA, IF
 Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:
a. Ac virus- specifici tip IgM
b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG
 Izolare virala in:

–Culturi celulare

–OGE

–animal de laborator
 Alegerea sistemului de izolare
virala
AVANTAJE DEZAVANTAJE

Animalul de Infectie naturala Cost crescut

laborator
Oul de gaina Cost scazut Susceptibilitate
embrionat variabila
Culturi de celule Sensibilitate Susceptibilitate
buna, variabila,
disponibilitate Infectie
nenaturala
Animal Facility from Stefan S. Nicolau Institute of Virology use

Techniplast Sealsafe technology

which combine the barrier at the cage level with a ventilation system controlled by a
microprocessor and HEPA filter decontamination. The system confer a double protection
barrier for the animals involved in experiments and human staff protection during
quarantine period.
 Definitie culturi celulare

• Metodologia propagarii in vitro a unui

fragment de tesut sau a unor celule
dispersate obtinute din tesuturi cu ajutorul
unor enzime proteolitice si introduse intr-
un mediu nutritiv capabil sa le asigure
homeostazia si proliferarea.
 CLASIFICAREA CULTURILOR
CELULARE
• CULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a
unor fragmente de organ in vederea pastrarii arhitecturii
si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile – nu
cultiva decat pe culturi de trahee
• CULTURI DE CELULE DISPERSATE =
provin din disocierea tesuturilor intr-o suspensie de
celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare
mecanica. Se clasifica dupa timpul de supravietuire in
vitro:
• CULTURI PRIMARE
• TULPINI CELULARE
• LINII CELULARE
 Culturi primare
• Direct din dispersia enzimatica a unui tesut
proaspat recoltat
• Formeaza monostrat
• Celulele tind sa mentina caracteristicile
organului din care deriva
• Pot apare proprietati de suprafata noi (devin
susceptibile pentru infectii virale noi) ex: v. polio
care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar
creste si distrugeaceleasi celule renale separate
si aderente la sticla
• Se mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)
 Tulpinile celulare
• Omogene, durata de viata 50-60 de
pasaje
• V. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini
derivate din piele, intestin si amigdale
• Cariotipul cromozomial este cel de origine
diploid
• Pot fi utilizate in producerea de vaccinuri
virale si pentru diagnosticul virusologic
 Liniile celulare
• Populatii de celule derivate dintesut
normal sau malign ce pot fi subcultivate un
timp nelimitat
• Au caracter heteroploid (numar variabil de
cromozomi)
• Nu pot fi folosite in producerea de
vaccinuri din cauza instabilitatii genomului.
Culturile de celule dispersate
componente

• Celule vii dispersate

• Mediu nutritiv
 reflecta tesutul de provenienta

• TESUT EMBRIONAR

• TESUT ADULT

• TESUT TUMORAL
MRC-5 –
fibroblast
(Prod. No. 84101801-1vl)
Hela –
epithelial
(Prod. No. 93021013-1vl)
Culturile de celule dispersate
componente

• Celule dispersate

• Mediu nutritiv
 Săruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5)
NaH2PO4 6) D-glucoză;
Săruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4;
5) CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoză;

Substante nutritive: Aminoacizi esenţiali:

1) L-arginină; 2) L-cistină; 3) L-fenilalanină: 4) L-glutamină; 5) L-histidină; 6) L-
izoleucină; 7) L-leucină; 8) L-lizină; 9) L-metionină; 10) L-tirozină; 11) L-
treonină; 12) L-triptofan; 13) L-valină.

SER DE VIŢEL 2-10%, în funcţie de tipul de cultură folosită:

factori de creştere şi factori de adeziune

Vitamine : 1) Colină HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4)

Nicotinamidă: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g;
7) Riboflavină: 0,001 g; 8) Tiamină HCl: 0,01 g.

Antibiotice si antifungice: penicilină şi streptomicină //

griseofulvina
SER DE VIŢEL 2-10%

• pentru cultivarea celulelor renale de maimuţă si

liniei celulare ICRM23 se adaugă 2% ser de viţel,

• pentru cultivarea celulelor de embrion de găină şi

unele linii celulare (BSC, Vero, FL etc.), se
adaugă 5% ser de viţel,

• pentru cultivarea celulelor embrionare de

hamster, rinichi de hamster, alte linii celulare (KB,
HeLa, Hep, etc.) se adaugă 10% ser de viţel.

De importanţă deosebită este calitatea serului de

viţel utilizat, care trebuie testat în prealabil.
Condiţii necesare pentru păstrarea
în viaţă a celulelor din cultura
celulară
• pH adecvat

• temperatură constantă

• atmosferă cu 10% CO2

• condiţii aseptice
ECHIPAMENTE

Diagram of microbiological
safety cabinet airflow patterns
 Obtinerea unei culturi celulare
-se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice

- se fragmentează ţesutul în bucăţi, se spală cu soluţie salină tamponată

- disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea în soluţie de tripsină 0,25%

-suspendarea celulelor în mediu nutritiv

-controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan

- repartizarea celulelor in volume egale în flacoane de culturi celulare

-incubare în poziţie culcată

- urmărirea formării culturii cu microscopul invers

 Subcultivarea culturilor celulare
După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează substanţele nutritive,
sursele de energie, se acidifică mediul.

Pentru menţinerea celulelor în viaţă, acestea trebuie pasate, subcultivate.

Celulele se detaşează de pe peretele flaconului cu soluţie de tripsina si

EDTA , se centrifughează, se spală cu soluţie salina tamponata şi se
resuspendează în mediu nutritiv.

Se verifică viabilitatea celulelor, se numără celulele şi se ajustează la

concentraţia optimă.

Se repartizează volume egale în flacoane de cultură celulară.

• Culturile primare pot fi subcultivate de câteva ori, 3-5x.

• Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

• Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Culturi provenite din celule

- normale: celulele se ataşează de peretele

flaconului, se multiplică până acoperă
peretele flaconului, realizează o cultură
monostrat

- tumorale: se multiplică şi după acoperirea

suprafeţei disponibile, cresc în mai
multe straturi şi în suspensie
 CELULELE TRANSFORMATE
Sunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana
sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii),
modificare care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro
sau transplant in vivo.

• Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat

• Inoculate la animale produc tumori
• Multiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera
la substratul de izolare
• Cerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de
ser fetal de vitel
• Prezinta antigene de suprafata diferite de celulele
normale
• Prezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid
 Inocularea virusurilor în culturile celulare

• Se arunca mediul nutritiv şi se introduce suspensia

virală.
• Incubare 1 oră (adsorbtia virusurilor în celulele
receptive).
• Se adaugă mediu de întreţinere, se incubează.
• În 3-5 zile apar modificările survenite în cultura celulară.

Izolare:
urmărirea efectelor citopatice = ECP
 ECP

fara ECP Vero

MA-104

Huh-7

pCMK

COS

MEK
 EFECTE CITOPATICE
• SINCITIAL: HIV, v rujeolos,
VRS
• PICNOTIC LITIC:
enterovirusuri
INCLUZIONAR:
• Intranuclear acidofil: papovavirusuri
• Intranuclear bazofil: adenovirusuri
• Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v
vaccina
• Mixt: v herpetice, v rujeolos
ECP SINCITIAL Binding

Reverse transcription Fusion

Integration
Endocytosi
Transcription Nuclear localization s
Splicing Uncoating
RNA export Lysosome
Maturation
Genomic RNA Assembly
Modification
mRNA Budding
Translation
EFECT CITOPATIC SINCITIAL
(HIV)
SINCYTIA
 INCLUZII
CITOPLASMATICE
(RABIE)
Sus - neuron fara incluzii Negri
Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)
INCLUZII INTRANUCLEARE
(BOALA CU INCLUZII CMV)
HSV corpii Cowdry tip A
 Infectia CU
adenovirusuri
se multiplica in nucleu
unde proteinele
capsidare, produse in
exces, formeaza
incluziile intranucleare
reovirus
HPV
ECP picnotic litic
 Robert Hooke's microscope (1665)
- an engineered device used to study living systems.
An old pocket microscope