Replicarea ADN

CE ESTE REPLICAREA ADN?

• Biosinteza ADN
• Are loc astfel încît să fie asigurată
stabilitatea genetică în organism şi în
cadrul speciei (este o modalitate
specifică de biosinteză care permite
conservarea şi transmiterea informaţiei
genetice de la o generaţie la alta).
Cînd şi unde are loc replicarea ADN?
La eucariote replicare are loc doar în faza S, de sinteză, a ciclului
celular, faza separată de faza mitotică M prin perioadele de gol
(gap) sintetic G1 şi G2.

S
phase
• Faza S a ciclului
celular G1 interphase G2
• Nucleu Mitosis
-prophase
-metaphase
-anaphase
-telophase
 REPLICAREA ADN PE SCURT

• Dublul helix al ADN se desface şi se

construiesc pe fiecare dintre cele două
catene parentale (numite catene matriţă
sau template) cîte o catenă complementară
replica celor parentale.
Replicarea – cu ceva mai multe detalii
1. Dublul helix se desface.

2. La joncţiunea dintre cele două

catene parentale desfăcute ia
naştere bifurcaţia de replicare.

3. O nouă catenă se formează prin

Împerecherea nucleotidelor libere
cu bazele complementare de pe
catena veche.

4. Rezultă două molecule-fiice

de ADN care conţin cîte o catenă
Parentală şi o catenă nouă.
 CARACTERISTICILE REPLICARII ADN

1. semi-conservativă
2. completă
3. bi-direcţională (deşi are loc întotdeauna în
direcţia 5’ 3’ !!!)
4. semi-discontinuă
1. Replicarea ADN este semi-conservativă
(Meselson-Stahl, 1958).
• Fiecare moleculă
fiică de ADN conţine
o catenă parentală
intactă asociată cu o
catenă nou
sintetizată.
Meselson & Stahl’s Famous Experiment (1958)
 2. Replication este completă

• Replicarea ADN antrenează întregul

cromozom, rezultand doi cromozomi
identici.

Cromozom circular
(procariote)
 3. Replicarea ADN este bi-direcţională
(Cairns, 1963).
• Replicarea începe într-un punct bine
determinat numit origine de replicare (ori) şi
pornind din acest punct se derulează simultan
în ambele direcţii.

bidirecţional
 4. Replicarea este semi-discontinuă
• Reiji Okazaki a propus şi demonstrat în 1968 că în timp ce sinteza
unei catene (catena leading) este continuă, sinteza celei de-a doua
catene (catena lagging ) este discontinuă (în runde de 150-250 nt).
 Întrebare:
• Următoarele afirmaţii în ceea ce priveşte
replicarea ADN sunt corecte:
1. Replicarea se realizează pe anumite porţiuni din
cromozom.
2. Sinteza ADN pe catena lagging este continuă.
3. Fiecare moleuclă fiică de ADN conţine două
catene nou sintetizate.
4. Fiecare catenă a ADNdc acţionează ca
matriţă/template pentru o nouă catenă de ADN.
 Elementele esenţiale necesare
replicării
• Sunt necesare cinci elemente esnţiale :

1. ADN parental- matriţa (fiecare catenă de ADN

serveşte ca matriţă)
2. cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfaţi dNTP (dATP,
dGTP, dTTP, dCTP)
3. cele 4 ribonucleozid trifosfaţi NTP (ATP, GTP, UTP,
CTP); aceasta sugerează necesitatea sintezei de ARN
în cursul sintezei de ADN!!!
4. Proteine specifice, majoritatea enzime
5. Mg2+
 Proteine specifice implicate în replicare

Proteina Funcţia
Helicaza Desface dublul helix ADN
Single-stranding Stabilizează ADNmc şi previn renaturarea lui (refacerea
binding proteins (SSB) dublu helixului)

Topoisomeraze Elimină torsiunile produse de helicază printr-un

mecanism de “tăiere-coasere”
ADN primaza Iniţiază sinteza ARN (!!!) primer
ADN polimeraze -ADN Polimerizarea dezoxiribonucleotidelor folosind matriţa
dependente de ADN
ADN ligaza Leagă fragmentele de ADN nou sintetizate
 Enzimele implicate în replicarea ADN

Helicase desface SSB stabilizează Primaza sintetizează

dublu helix ADNmc un ARN primer pe
matriţă de ADN

ADN polimeraza III ADN polimeraza I Ligaza leagă /coase

leagă nucleotidele (exonucleaza) fragmentele de ADN
pt. a forma noul ADN înlocuieşte ARN primer (frag. Okazaki).
cu ADN
 Helicaza desface dublul helix

• Proteina DnaB
• Hexamer
• Catalizează un fel de denaturare in vivo a
ADN (catenele dezrăsucite pot fi citite de
către enzimele replicării)
• necesită energie; consumă 2 molecule de
ATP per 2 legături de hidrogen desfăcute.
Single stranded proteins (SSBs)
• Tetramer
• Se leagă de cele două catene ADN şi le
menţine separate prevenind renaturarea lor
• Trebuie să fie îndepartate înainte ca noua
catenă de ADN să poată fi sintetizată
 Topoisomerazele

• enzime care rezolvă tensiunile sterice

(torsiuni +, de dreapta) apărute în cursul
dezrăsucirii (cu o viteză de 100 revoluţii/sec
!!!) duplexului ADN, şi care ar putea bloca
replicarea
 Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I
• acţionează ca o endonuclează reversibilă, printr-un mecanism de
tăiere-coasere care permite rotaţia liberă a ADNmc (acţiune de
suveică) .
• “economică” (nu necesită aport energetic): hidrolizează o
legătură fosfat diesterică a cărei energie o conservă într-o legătură
fosfat esterică implicînd Tyr din centrul activ al enzimei şi
ulterior o foloseşte la refacerea catenei incizate

Enzima Enzima

tăiere coasere
ADN
relaxare
Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II

• ADN-giraza
• Dimer
• Introduce în molecula de ADN supertorsiuni (-),
spre stînga, în sens contrar celor create de
înaintarea bifurcaţiei de replicare; astfel
compesează în avans constrîngerile impuse de
desrăsucirea duplexului de ADN
• Necesită energie (consum de ATP)
 ADN polimerazele-ADN dependente:
• Copiază catena matriţă în direcţia 3’ 5’

• Sintetizează catena nouă în direcţia 5’ 3’: formează legături

fosfat diesterice între două dNTP vecine dictate de template, prin atacul nucleofil
realizat de către gruparea 3’-OH al primului nucleotid asupra grupării
α fosfat din dNTP următor)

• Necesită un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-
ul sintetizat de primază serveşte drept primer)

• AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazică, care stă la baza

capacităţii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele
greşit împerecheiate de la capătul 3’ al catenei în creştere.

• PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menţine

legată de matriţă; este o expresie a numărului de nucleotide adăugate la lanţul
ADN în creştere înainte ca polimeraza să se disocieze de matirţă)
 REACTIA CATALIZATĂ DE ADN POLIMERAZĂ
Cap 5'
P P

CH2 Base CH2 Base

O O

P P

CH2 Base CH2 Base

O O

H20
+
P 3'
P P
P OH P Piro-
fosfat
P CH2 Base
O
5' CH2 Base
O

OH
3'
Cap 3‘ (în creştere)
OH
 Clase ADN polimeraze -ADN
dependente:

• procariote:
– ADN pol I, II, III, IV, V

• eucariote:
- ADN pol α, β, γ, ε, δ
 Proprietăţile ADN polimerazelor la procariote

ADN polimeraza I II III

Gena Pol A Pol B Pol C

Nr. subunităţi 1 >4 >10

Activitate exonucleazică (3' -> 5') da da da
sau proofreading?
Activitate exonucleazică 5' -> 3'? da nu nu
Viteza polimerizării (nucleotide 16-20 5-10 250-1000
adăugate/sec)
Procesivitatea (nucleotide mică mare foarte mare
adăugate înainte de disociere) (3-200) (10,000) (500,000)
Este ADN polimeraza I polimeraza
replicativă principală?
 DNA polimeraza I nu este
polimeraza replicativă principală!
• Enzima este prea lentă!
ADN polimeraza I cataliează încorporarea dNTP cu o viteză maximă de 20
nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E. coli,
care în realitate se divide la fiecare 20 min.

• Enzima nu este suficient de procesivă.

• Enzima este prea abundentă.
Există aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celulă E. coli şi
doar 2 bifurcaţii de replicare per celulă.

• Celulele prezentînd mutaţii polA1 sunt viabile.

 DNA polimeraza III este
polimeraza replicativă

• Proprietăţile ADN pol III sunt potrivite pentru o

enzimă care deţine un rol central în replicarea
ADN: are o procesivitate foarte mare şi
catalizează polimerizarea la o viteză foarte
înaltă (250-1000 nt/sec).
• Sinteza catenei leading.
 Care este rolul ADN polimerazei I ?
• La ce foloseşte activitatea 5’-
3’exonucleozică, specifică
acestei polimeraze?
• La ce foloseşte activitatea
polimerazică a ADN pol I ?
• Îndepărtarea primerului de la
capătul 5’ al lanţului în
creştere
• Sinteza catenei lagging,
înlocuirea cu dNTP a locului
lăsat liber de primer şi
repararea leziunilor ADN (ex.
leagă dNTP pe locul liber
apărut după îndepărtarea baze
greşit împerechiate)
 ADN polimerazele la procariote
(continuare)
• ADN pol II este implicată în reparea leziunilor ADN (are activitate
3' -> 5‘ exonucleazică.

• ADN pol IV
- Pol IV este o ADN polimerază predispusă la erori de împerechere
(nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II şi pol I)
- Pol IV este responsibilă de 50% din mutaţiile adaptative.

• ADN pol V
- Pol V aparţine unei căi speciale de reparare (un fel de “ultima
barieră“) denumită calea SOS de reparare a ADN.
- Pol V este sintetizată cînd celula este expusă la doze mari de
radiaţii sau de mutageni, cînd pot să apară lez. majore ADN.
 Proprietăţile ADN polimerazelor la eucariote

ADN pol α β γ δ ε

localizare nucleu nucleu mitocondrie nucleu nucleu

funcţie Înlocuire reparare sinteza ADN Replicaza reparare

primer mitocondrial

Sinteza Sinteza
catena catenă
lagging leading
similaritate Pol I Pol II Pol II Pol III Pol II
cu enzime
de la
procariote
Primaza:
- Sintetizează
oligoribonucleotidul
(ARN primer) iniţial
pe care se ataşează
ADN polimeraza.

- ARN primer este

format din 4-12
ribonucleotide.

- Noua catenă de ADN

se constuieşte prin
adăugarea de
nucelotide la capătul 3
al ARN primer.

- ARN primer e înlocuit

în final cu ADN.
 Întrebare:
ADN polimeraza:
A. Initiază sinteza lanţului polinucleotidic
B. Sintetizează un lanţ polinucleotidic în diercţia 3’- 5’
C. Citeşte matriţa de ADN în direcţia 5’- 3’
D. Produce cîte o moleculă de pirofosfat la adăugarea
fiecărei nucleotide la catena în creştere.
 ETAPELE REPLICĂRII ADN
(şi elementele-cheie ale fiecărei etape)

Iniţierea: primozomul- un complex de proteine

şi originea replicării ori

Elongarea: replizomul- un complex de proteine,

asociate cu ADN cu rol în sinteza
catenelor noi de ADN

Terminarea: proteina Tus- situsul de

terminare ter
REPLICAREA ADN LA
PROCARIOTE
 1. INIŢIEREA

controlează întregul proces de

replicare!
 Originea replicării
Iniţierea replicării 5’ 3’
• Identificarea originii de 3’ 5’
replicare

• Dezrăsucirea mediată de
către helicază (denaturarea) 5’ 3’
duplexului ADN cu fomarea 3’ 5’
ADNmc şi a bifurcaţiilor de
replicare

5’ 3’
• Legarea SSB la ADNmc 3’ 5’

• Formarea primozomului 5’ 3’
(conţine şi primaza) 3’ 5’

• Sinteza ARN primer

5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
 Originea replicării
• Originea replicării
(oriC) este o regiune de
245 perechi baze bogată
în AT
• OriC este recunoscută oriC
de către proteina dnaA
care se leagă la oriC, şi
care împreună cu
proteina dnaB (helicaza)
desface ADNdc
(folosind ATP).
 Primozomul
- elementul cheie al iniţierii-
• Primozomul este un complex de proteine care este
format din:
- dnaB (helicază)
- dnaC (şaperon al dnaB: asistă plicaturarea dnaB)
- primaza
- alte proteine
• Primozomul se deplasează împreună cu
bifurcaţuia de replicare, consumînd ATP
• Primozomul este responsabil pentru sinteza ARN
primer.
2. ETAPA DE ELONGARE
 Etapa de elongare
-Sinteza de ADN prin adăugarea de dezoxiribonucleotide (una cîte
una) iniţial la capătul 3’ al ARN primer, ulterior la capătul 3’ end
al catenei în creştere.

3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’

3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
 Etapa de elongare
-Catena parentală 3’- 5’ (care este citită în aceeşi direcţie cu
deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiată continu.
-Catena nouă astfel sintetizată este catena “leading”.
 Etapa de elongare
-Catena parentală 5’- 3’ (care este citită în direcţie opusă faţă de
deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiată discontinu.
Catena nouă astfel sintetizată este catena “lagging” şi este sintetizată
în fragmente mici (1fragment per rundă sinteză)-fragmentele Okazaki
 Etapa de elongare
• Replicarea ADN la E. coli are viteza ~1000 nt/s
• Polimeraza III (subunitatea b) formează un inel care
alunecă pe ADN matriţă şi care creşte procesivitatea
miezului Pol III de la 10-15 la>5000 perechi bază
– 35Å diametru; (+) interior, (-) exterior
 Replicarea bidirectionala
a cromozomului circular la
procariote produce un
intermediar în forma literei
Theta.
ori

ter

Replication
Forks
 Replizomul
- elementul cheie al elongarii-
• complex de proteins care cuprinde toate
enzimele şi factorii necesari replicării ADN.
• Probabil ataşat de membrana nucleară, iar
ADN ar străbate replizomul.
• este responsibil pentru sinteza a două catene
noi de ADN.
 Schema etapelor de iniţiere şi elongare
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ Primase
Single strand
Laging Strand binding
5’ proteins
Okazaki 5’
fragment 3’
5’
RNA
Primers
DNA
Polymerase
5’
3’
Helicase

Leading Strand
5’
3’
3. ETAPA DE TERMINARE
 Terminarea replicării
• Regiunea de terminare :
- situată la 180 grade faţă de ori;
conţine “capcane” petur bifurca’ia
de replicare
- la acest nivel bifurcaţiile de TerD
replicare se întîlnesc şi dezleagă
catenele de ADN încă asociate. TerA

• Situsurile de terminare oriC TerC

- sunt porţi care permit trecerea TerB
bifurcaţiei de replicare într-un
singur sens;
- conţin 23 perechi de baze
 Terminarea Replicarii
Un set de situsuri Ter opresc bifurcaţia de replicare
care progresează în sensul acelor de ceasornic, al 2-lea
set blochează bifurcaţia de replicare care avansează în
Invers acelor de ceasornic:

Situsurile Ter
forţează cele două
bifurcaţii de
Cromozom replicare să se
întîlnească într-un
punct specific.

TerB TerA
ELEMENTELE CHEIE ALE TERMINĂRII REPLICĂRII:
SITUSURILE TER ŞI PROTEINA TUS

 Situsurile Ter sites sunt locurile de legare ale proteinei Tus.

 Tus: 35.8 kD
activitate de legare la Ter
Monomer
Bifurcaţia de replicare
Tus
oprită într-o
DNA manieră polară

Ter

 Tus poate inhiba progresiunea bifurcaţiei de replicare

direct prin legarea de DnaB helicază, inhibînd dezrăsucirea
helixului.
Repetiţia este “mama”
învăţăturii…
 Replicarea
3’
3’ 5’
5’
3’

5’ 3’
5’

Helicaza se leagă la originea de replicare şi

dezrăsuceşte dublu helixul ADN.
SSB previn renaturarea ADN.
Primaza sintetizează ARN primer.
 Replicarea
Direcţia de avansare a 3’
bifurcaţiei de replicare
3’ 5’
5’

3’

5’ 3’
5’

DNA pol adaugă nucleotide la ARN primer.

 Replicarea
Direcţia de avansare a
3’
bifurcaţiei de replicare
3’ 5’

5’
3’

5’ 3’
5’

DNA pol verifică bazele împerecheate şi le înlocuieşte

pe cele greşit împerecheate.
 Replicarea
Direcţia de avansare a
3’
bifurcaţiei de replicare
3’ 5’

5’
3’

5’ 3’
5’

Sinteza catenei leading continuă în direcţia 5’ to 3’.

 Replicarea
Direcţia de avansare a
3’
bifurcaţiei de replicare
3’ 5’

5’
Fragment Okazaki
3’

5’ 3’ 5’ 3’
5’

Sinteza discontinuă produce segmente ADN numite

fragmente Okazaki.
 Replicarea
Direcţia de avansare a
3’
bifurcaţiei de replicare
3’ 5’

5’
Okazaki fragment
3’

5’ 3’ 5’ 3’
5’

Alungirea fragmentului Okazaki.

 Replicarea

3’
3’ 5’

5’
3’
5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’
5’

Alungirea catenei leading şi sinteza de noi fragmente

pe Okazaki măsură de bifurcaţia mai avansează.
 Replicarea

3’
3’ 5’

5’
3’
5’ 3’5’ 3’5’ 3’
5’

Alungirea noului fragment Okazaki, în paralel cu

alungirea catenei leading .
 Replicarea

3’
3’ 5’

5’
3’
5’ 3’5’ 3’5’ 3’
5’

Activitatea exonucleazică a ADN pol I

îndepărtează ARN primer.
 Replicarea

3’
3’

5’
3’
5’ 3’5’ 3’
5’

Activitatea polimerazică a ADN pol I umple golurile.

Ligaza formează legături fosfatdiesterice între
gruparea 3’ OH de la capătul unui fragment Okazaki cu
gruparea 5’ fosfat de la capătul altui fragment Okazaki.
.
 REPLICAREA ADN

3 Pol III synthesises leading strand

2 1 Helicase opens helix
Topoisomerase
nicks DNA to 4 Primase synthesises RNA primer
relieve tension
from unwinding 5 Pol I excises RNA primer; fills gap
6
7

Pol III elongates primer; DNA ligase links Okazaki

produces Okazaki fragment fragments to form
continuous strand
 Întrebare:
Fragmentele Okazaky sunt:
• Produsul acţiunii helicazei
• Lanţuri ADN sintetizate în cadrul catenei leading
în cursul replicării
• Regiuni ale ADN care nu codifică informaţie
pentru sinteza de ADN.
• Fragmente relativ scurte de
polidezoxiribonucleotide cu cîteva ribonucleotide
la capătul 5’.
Replicarea simultană prin formarea
de bucle ale matriţei catenei
lagging.
Replicarea simultană: molecula ADN pol III este
responsabilă de sinteza ambelor catene de ADN.
 Caracteristici ale replicării la
eucariote
• Multiple origini de replicare
• Replicarea este bidirectională
• Are mai multe origini de replicare
deoarece molecula de ADN este foarte
lungă şi viteza de acţiune a replizomului
este mică
• Histonele vechi se asociază cu duplexul
nou care conţine catena leading.
Multiple regiuni ori la eucariote

Bubbles Bubbles
 Tabel comparativ:
Procariote Eucariote
1 ori region Multiple ori regions
2 bifurcaţii de replicare per 100 bifurcaţii de replicare per
cromozom cromozom
Viteza replicării Viteza replicării
1.000 perechi baze/sec 100 perechi baze/sec

Lungime frag. Okazaki Lungime fragmente Okazaki

1000-2000 nucleotide 150-200 nucleotide

1 eoare la 1mil-10mil 1 eroare la 1000 mil

replication.swf