MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

1. OBIECTUL MICROBIOLOGIEI. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. CLASIFICAREA GENERAL A MICROORGANISMELOR

1.1. OBIECTUL MICROBIOLOGIEI Microbiologia este o tiin fundamental care studiaz morfologia, fiziologia i sistematica microorganismelor, originea i evoluia lor, fenomenele de ereditate i variabilitate microbian. Etimologia cuvntului provine din limba greac: micros = mic; bios = via; logos = tiin. Microorganismele sunt sisteme cu organizare complex, monocelulare sau pluricelulare, cu metabolism propriu i continuitate genetic, cu o infinit diversitate a caracterelor morfologice i fiziologice. n sensul acestei definiii din imensul grup al microorganismelor fac parte fungii (drojdii levuri i mucegaiuri fungi filamentoi), bacterii, alge microscopice, protozoare etc. n funcie de natura microorganismelor i caracterul lor aplicativ, s-au dezvoltat n timp, urmtoarele tiine microbiologice independente: Microbiologia general studiaz legile de dezvoltare a tuturor grupelor de microorganisme i a rolului lor n circuitul substanelor n natur. Fiind o tiin de sintez, n funcie de natura microorganismelor studiate s-au desprins urmtoarele discipline: Virusologia (inframicrobiologia) studiaz virusuri entiti acelulare cu dimensiuni submicroscopice, ageni ai bolilor virale la om, animale, plante, insecte, microorganisme (bacterii, fungi). Bacteriologia studiaz bacteriile, celule monocelulare de tip procariot, care pot produce mbolnviri ale omului, animalelor, plantelor. Micologia studiaz fungi cu celule monocelulare sau pluricelulare de tip eucariot. Dintre tiinele microbiologice cu caracter aplicativ fac parte: - microbiologia chimic este o ramur a microbiologiei generale care s-a dezvoltat n ultimii 50 de ani, are ca obiect de studiu chimia i biochimia microorganismelor (compoziia chimic, structura, topologia, funcia moleculelor libere i asociate, metabolismul substanelor n celula microbian; - microbiologia solului, a apei, microbiologia geologic, fitopatologia, microbiologia sanitar, agricol, ecologic, cosmic, genetica microbian, biologia molecular; - microbiologia produselor alimentare are drept obiect de studiu cunoaterea naturii i activitii metabolice a microorganismelor care pot contamina ntregul lan alimentar, de la materiile prime la produsele finite, n scopul prevenirii alterrii lor i pierderea valorii alimentare sau a mbolnvirii prin consum de alimente, contaminate cu microorganisme patogene-toxicogene; - microbiologia industrial (tehnic) reprezint tiina de investigare i control al fermentaiilor, respectiv de folosire a microorganismelor n calitate de reactivi, n scopul obinerii industriale a unor produse cu valoare economic. Prin dezvoltarea microbiologiei industriale, cu ajutorul microorganismelor se obin avantajos aproximativ 200 de produse, printre care: alcoolul etilic i butanolul, acetona, acidul citric, acidul lactic, aminoacizi, enzime, proteine, vitamine, insecticide biologice, produse de biosintez ce se obin pe plan mondial n cantiti mari (milioane tone per an) sau vaccinuri, vitamine i enzime purificate, hormoni de cretere, interferonul, antibiotice, n cantiti 1

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE mici. Primul patent nregistrat pentru un produs de biosintez microbian dateaz din 1882 pentru enzime proteolitice folosite la tbcirea pieilor; biotehnologia reprezint un domeniu multidisciplinar al tiinei, tehnicii, tehnologiei i al produciei industriale ce se bazeaz pe potenialul microorganismelor rezultate prin tehnici de inginerie genetic i a enzimelor microbiene, n scopul obinerii de bunuri industriale, energetice, agricole, farmaceutice, alimentare i protecia mediului. 1.2. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Dac apariia vieii pe pmnt se aproximeaz c a avut loc cu 3,8-4 miliarde de ani n urm, cele mai vechi celule aparinnd bacteriilor metanogene i bacterii ale genului Clostridium descoperite n lave vulcanice pietrificate, au existat de cel puin 2 miliarde de ani. Celulele eucariote s-au transformat cu 1500 milioane de ani n urm i diversificarea acestora acum 400 milioane de ani, a condus la apariia ntr-o lung perioad de timp a strmoilor plantelor de astzi. n contrast cu dimensiunile att de mici ale microorganismelor, rolul lor n natur este imens. Implicate direct n uriaele transformri ale materiei organice nevii, prin procese de putrefacie-putrezire, fermentaii etc., microorganismele asigur n natur un circuit al principalelor elemente universale ce intr n structura organismelor vii i au rol vital n meninerea ecosistemelor, deoarece fr activitatea lor pmntul s-ar transforma ntr-un uria cimitir. Dei procesele microbiene sunt cunoscute de la nceputul omenirii, explicaia tiinific a cauzelor care le determin, a fost posibil numai odat cu descoperirea microscopului. Cel care a utilizat pentru prima dat microscopul pentru studiul microorganismelor a fost Anthonie van Leeuwenhoek. Microbiologia apare ca tiin n a doua jumtate a secolului XVII i debuteaz cu o perioad lung de observaii morfologice cnd se acumuleaz un material vast privind caracterele i rspndirea n natur a microorganismelor. Cea de a doua perioad n dezvoltarea microbiologiei este perioada fiziologic, inaugurat de lucrrile marelui savant, chimist i medic, Louis Pasteur care a stabilit principiile de baz ale microbiologiei prin descoperiri de importan fundamental. Louis Pasteur studiaz condiiile de distrugere a microorganismelor stabilind procedee de sterilizare. Studiaz bolile microbiene ale vinului i berii produse de microorganisme ageni ai fermentaiei lactice i butirice i care pot s triasc i n absena aerului. Pasteur stabilete modalitatea de tratare a vinului prin nclzire la 60C care i asigur conservabilitatea, operaie denumit n prezent pasteurizare i este pe drept cuvnt, considerat printele microbiologiei industriale. Visul lui Pasteur era s descopere microorganismele care provocau mbolnviri ale omului i animalelor. A studiat boli ca holera ginilor, infecia crbunoas, rabia etc. i a realizat vaccinurile antiholeric i antirabic, dovedind c unul i acelai microb este cel care poate produce moartea, n schimb dup un tratament adecvat poate da doar forme uoare de boal i concomitent o imunitate organismului vaccinat. Pn n ultima clip a vieii a muncit neobosit pentru binele omenirii. Impresionant este crezul vieii lui, exprimat simplu n cuvintele: Voina, munca i succesul sunt cuprinsul vieii omeneti. Voina deschide porile, munca te trece prin ele, iar la sfritul drumului vine succesul ca o ncoronare a tuturor eforturilor.

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Robert Koch considerat printele colii germane de microbiologie stabilete c microbii sunt cauzele bolilor infecioase i descoper vibrionul holerei, agentul tuberculozei etc., studii ce-i aduc n 1905 premiul Nobel pentru fiziologie i medicin. Koch introduce n practica de laborator mediile de cultur solidificate ceea ce a permis izolarea n culturi pure a microorganismelor din natur. Folosirea culturilor pure s-a extins odat cu realizarea de aparatur destinat sterilizrii mediilor necesare pentru cultivare. Un rol important n introducerea culturilor pure n industrie aparine savantului german E.H. Hansen care a utilizat microorganismele drept inocul ai fermentaiilor, fapt ce a condus la microbiologia industrial modern. Descoperirea primului antibiotic, penicilina de ctre A. Fleming i stabilirea tehnologiei de producere i purificare a acestui antibiotic de ctre Florey i Chain reprezint una dintre cele mai importante realizri ale nceputului de secol XX. Omenirea devine astfel posesoarea unei noi arme mpotriva microorganismelor patogene i sunt intens stimulate cercetrile de descoperire i aplicare n terapeutic a noi antibiotice cu spectru specific de aciune. Fondatorul microbiologiei romneti este Victor Babe, care a condus prima catedr de nvmnt medical de anatomie patologic i bacteriologic. mpreun cu francezul V. Cornil este autorul primului tratat de bacteriologie aprut n lume: Les bactries, n anul 1885. Victor Babe a studiat boli ca turbarea, morva, lepra, holera, tuberculoza, parazitoze i a introdus pentru prima dat n ara noastr tratamentul prin serotapie imunizare cu serul provenit de la animale n prealabil vaccinate. Este considerat unul dintre cei mai mari savani, a rmas n microbiologie prin numeroasele sale descoperiri. Ioan Cantacuzino a creat o coal de microbiologie avnd ca centru institutul care i poart numele, organiznd i dezvoltnd activitatea de producie a serurilor i vaccinurilor folosite n combaterea bolilor infecioase. n domeniul imunologiei, virusologiei i microbiologiei generale, se remarc savanii: C. Lavaditi, D. Combiescu, M. Ciuc, t. Nicolau etc. care i-au consacrat activitatea tiinific, combaterii i eradicrii unor boli, pentru formarea i dezvoltarea colii contemporane de microbiologie. 1.3. CLASIFICAREA GENERAL A MICROORGANISMELOR Variabilitatea extraordinar a microorganismelor i capacitatea lor de adaptare la cele mai diferite condiii ale mediului ambiant, fac ca lumea microbian la nivel planetar s fie deosebit de numeroas i greu de clasificat. Clasificarea biologic a lumii vii propus de Whittaker (1969), acceptat de numeroi taxonomiti cuprinde un sistem de cinci regnuri n funcie de modul de organizare celular i modaliti de nutriie, avnd urmtoarea structur: - regnul Monera include organisme monocelulare de tip procariot cu nutriie de tip absorbtiv, cu metabolism fotosintetic sau chimiosintetic i reproducere prin diviziune asexuat; - regnul Protista include organisme monocelulare de tip eucariot (inclusiv drojdii). Modul de nutriie este diferit de la un grup la altul, prin absorbie sau ingestie i reproducere sexuat/asexuat; - regnul Fungi cuprinde organisme multinucleate de tip eucariot (mucegaiuri) cu nuclei dispersai n citosolul hifelor adesea septate, lipsite de plastide i

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE pigmeni fotosintetici, cu nutriie de tip absorbtiv i reproducere pe cale sexuat i asexuat; - regnul Plantae, cu organisme multicelulare de tip eucariot, cu perete celulozic, vacuole n citoplasm i pigmeni fotosintetici n plasmide. Modul principal de nutriie este cel fotosintetic i reproducerea predominant sexuat; - regnul Animalia, cu organisme multinucleate de tip eucariot fr perete celular, cu nutriie predominant prin ingestie i reproducere sexuat. Celula de tip procariot ce aparine primelor forme de via pe Pmnt, prezint un nucleoid nedifereniat, lipsit de membran nuclear. Molecula de ADN conine ntreaga informaie genetic; celula procariot nu conine n citozol organite libere (cu membran) i ribozomii au dimensiuni mici. Sunt puin difereniate din punct de vedere morfologic. Celula de tip eucariot, mai evoluat, prezint un nucleu bine difereniat n care este inclus partea predominant a genomului alctuit dintr-un set de cromozomi, care n timpul procesului de nmulire se divizeaz i se repartizeaz ntre celulele rezultate. n cromozomi, ADN-ul este cuplat cu proteine de tipul histonelor. n celula eucariot exist organe simple prevzute cu membran, iar ribozomii au dimensiuni mai mari dect la procariote. Pentru sistematizarea microorganismelor, se studiaz ntotdeauna caracterele morfologice, fiziologice, biochimice etc. ale culturii pure, cultur ce rezult prin nmulire dintr-o singur celul (sau unitate formatoare de colonie), n mediu nutritiv steril i deci cuprinde celule aparinnd unei singure specii. n clasificri, pe baz de criterii morfologice i fiziologice riguroase, stabilite de la general la particular, principalele grupe de microorganisme componente ale regnurilor citate sunt clasate n diviziuni, clase i subclase, ordine, familii, triburi, genuri i specii. La baza tuturor clasificrilor este situat specia, produs al evoluiei materiei vii, ca rezultat al adaptrii la condiiile existente ale mediului ambiant. Specia corespunde populaiei de indivizi cu numeroase proprieti comune, denumite caractere cu specificitate de specie, care le disting de alte specii. Microorganismele aparinnd unei specii au aceeai origine, sunt adaptate la un anumit mediu de via, au metabolism asemntor i sunt apropiate ntre ele prin caractere genetice. Specia la microorganisme este denumit din dou cuvinte, primul fiind numele genului, care include mai multe specii. Cel de al doilea cuvnt scris ntotdeauna cu liter mic, de obicei definete un caracter specific. n cadrul speciei se difereniaz prin caractere distinctive limitate, subspecii, tulpini, varieti. Genul cuprinde una sau mai multe specii pe baza unor caractere comune, specifice de gen. Denumirea genului este n limba latin. Tribul reprezint un grup de genuri nrudite. Familia este un grup de triburi sau genuri nrudite. Ordinul reprezint un grup de familii nrudite. Clasa reprezint gruparea ordinelor nrudite.

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

2. CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME UTILIZATE N SCOPURI INDUSTRIALE

n procesele microbiologice industriale microorganismele sunt utilizate pentru urmtoarele scopuri: - multiplicarea celulelor n scopul obinerii de culturi starter sau biomas; - supersinteza intra/extracelular a metaboliilor primari, metaboliilor secundari, poliglucide capsulare i a enzimelor microbiene cu importan practic deosebit; - procese de bioconversie (biotransformarea substraturilor specifice) cu aplicaii industriale diverse i depoluarea mediului ambiant. Utilizarea microorganismelor n bioprocesele industriale este avantajoas datorit proprietilor lor biologice particulare i anume: - viteza deosebit de mare a reaciilor metabolice specifice microorganismelor face ca procesele de biosintez s aib loc extrem de rapid comparativ cu procesele similare la plante sau animale; - se dezvolt rapid pe diverse medii producnd degradri, modificri i substituiri ale componentelor diferitelor substraturi pe care se dezvolt i realizeaz cu uurin transformri a cror realizare prin procedee chimice ar necesita un numr mare de operaii laborioase i o tehnicitate ridicat; - datorit capacitii de adaptare la medii cu compoziii chimice foarte diferite, microorganismele pot utiliza o gam extins de materii prime, uneori lipsite de valoare economic, ceea ce permite utilizarea unor substraturi ieftine pentru obinerea pe cale biologic a unei game largi de produse utile; - posibilitatea creterii randamentului de biosintez prin metode culturale sau manipulri genetice. n orice proces microbiologic cultura microbian utilizat are importan primordial n desfurarea procesului i randamentelor obinute, ea reprezentnd cheia succesului sau eecului proceselor. Microorganismele utilizate n procesele microbiologice industriale trebuie s posede urmtoarele caliti: - s prezinte tulpini stabile genetic; - s produc mai multe tipuri de celule (vegetative, spori sau alte uniti reproductive); - s nu fie contaminate cu alte microorganisme; - s creasc viguros i rapid dup inoculare n vasele de cultivare utilizate pentru prepararea inoculului nainte de fermentaia industrial; - s realizeze bioprocesul dorit ntr-o perioad scurt de timp (preferabil n 3 zile sau mai puin) i s aib capacitatea de a crete pe medii cu componente ieftine i uor de procurat; - cultura microbian s poat fi uor conservat n timp fr a-i schimba proprietile biochimice i genetice; - s prezinte stabilitate metabolic i s asigure desfurarea de procese metabolice reproductibile; - s se preteze la schimbri sub aciunea agenilor mutageni sau prin inginerie genetic, n vederea obinerii de tulpini programate cu randamente sporite de biosintez i stabilitate metabolic deosebit.

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Microorganisme cele mai utilizate n scopuri industriale aparin urmtoarelor grupuri: - fungi: o drojdii (levuri); o mucegaiuri (micromicete, fungi filamentoi); - bacterii; - alge microscopice. 2.1. DROJDII (LEVURI) Drojdiile reprezint un grup complex i eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot (celule cu nucleu difereniat), care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori formai pe cale asexuat i sexuat. 2.1.1. Istoric Denumirea de drojdie semnific, n general, sedimentul care se formeaz dup ce a avut loc fermentaia alcoolic a musturilor dulci. Denumirea de levuri provine de la verbul lever (limba francez a ridica) ce sugereaz creterea n volum a aluatului la fabricarea pinii. Cunoscute din timpuri strvechi pentru activitatea lor fermentativ, drojdiile sunt studiate de Louis Pasteur (1863), studiu continuat de microbiologii: Meyen, Rees i Hansen care realizeaz o clasificare a drojdiilor n 1896, completat de Guillermond n 1928. Un studiu taxonomic de referin aparine lui Lodder (1952, 1970) i mai recent, lui Kreger van Rij (1984). 2.1.2. Importan i rol Drojdiile joac un rol foarte important n industria alimentar, biotehnologie, n natur. Avnd drept caracteristic principal capacitatea de a produce fermentarea glucidelor simple cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate n biotehnologii alimentare la fabricarea alcoolului, a vinului, berii i pinii. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i dup cultivare n condiii de aerare i prelucrare sunt utilizate ca surs de proteine n alimentaia uman, cu denumirea de SCP (single cell protein proteine din monocelulare) sau n alimentaia animalelor, deoarece pe lng 45-55% protein brut/100 g s.u., aduc n raie aminoacizi (lizin etc.) i vitamine ale grupului B (tiamin i riboflavin). n microbiologia industrial, din biomas de drojdie se obin: - extracte (plasmolizate, autolizate), folosite ca aditivi alimentari sau pentru mbogirea n substane azotate a mediilor de cultur destinate fermentaiilor; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: -fructofuranozidaza i -galactozidaza; - prin hibridizri i inginerie genetic, din mutani ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obinut interferonul substan cu efect antiviral i citostatic. 2.1.3.Rspndire n natur Drojdiile au o larg rspndire n mediul ambiant, fiind ntlnite n toate habitaturile naturale. n sol, celulele de drojdie se ntlnesc n straturile superficiale pn la adncimi de aproximativ 30 cm, n concentraii de 102- 2105/g. Din sol, prin aciunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar n aer i s se rspndeasc la distane mari; din sol i aer drojdiile pot

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ajunge n ape i unele specii pot fi ntlnite chiar la adncimi de 4000 m. n regnul vegetal drojdiile se ntlnesc pe suprafaa frunzelor, fructelor, florilor, n rdcini. Rspndirea drojdiilor este favorizat de insecte care odat cu nectarul/sucul preiau i celulele de drojdie. O parte din drojdii supravieuiesc iarna n tubul digestiv al insectelor, iar primvara sunt eliminate. n regnul animal drojdiile sunt prezente n microflora intestinal i se elimin natural prin produse de dejecie; n cantiti mai reduse se ntlnesc n cavitatea bucal i pe piele. 2.1.4. Caractere morfologice generale Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval sau cilindric, cu dimensiuni medii de 4-14 m. Forma i dimensiunea celulelor este un caracter de gen i specie i acestea pot fi influenate de starea fiziologic i condiiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri cu importan industrial se menioneaz: - forma oval (elipsoidal) specific drojdiilor fermentative ce aparin genului Saccharomyces; - forma sferic predomin la drojdii din genul Torulopsis; - forma apiculat (de lmie) la genurile Kloeckera i Hanseniaspora; - forma de sticl la drojdii din genul Saccharomycodes. Prin cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de mal cu agar), n cazul n care la suprafa se afl o celul unic, cu caractere morfologice specifice. Coloniile de drojdii au diametrul ntre 0,2-2 cm au aspect cremos, lucioase sau mate, de culoare n general alb-crem; drojdii din g. Rhodotorula i Sporobolomyces formeaz colonii colorate n rou-portocaliu datorit pigmenilor carotenoizi sintetizai intracelular. n funcie de specie, colonia n seciune poate avea un profil lenticular, semicircular sau triunghiular cu perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate. Caracterele morfocoloniale reprezint criterii valoroase pentru identificarea drojdiilor. 2.1.5. Structura celulei de drojdie Ca i celelalte celule eucariote, drojdiile au structura compus din nveliuri celulare, citozol, nucleu, mitocondrii, ribozomi, vacuole i alte organite intracelulare. Fig.1. Organizarea intern a celulei de drojdie: cm - cicatrice mugural G - corp Golgi L - incluziuni lipidice Lz - lizozomi Mt - mitocondrie N - nucleu n - nucleol Pc - perete celular Pl - plasmalem RE - reticul endoplasmatic V - vacuol In - nveli nuclear prevzut cu pori Ipl - nvaginri plasmalemale

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE nveliurile celulare peretele celular i plasmalema sunt structuri ce limiteaz celula i determin forma de baz a acesteia i intervin n toate procesele biologice fundamentale care se desfoar la nivel celular. Peretele celular are o grosime cuprins ntre 150 i 250 nm i poate s reprezinte o pondere de 515% din biomasa uscat a drojdiei. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar i este alctuit din 23 straturi. Difereniat dup stadiul de dezvoltare al celulelor, peretele celular se prezint subire i flexibil la celulele tinere, mai gros i rigid la celulele btrne. Stratul extern prezint o suprafa rugoas n care se observ cicatricile mugurale, rmase dup desprinderea mugurilor de celula mam. O celul normal de Saccharomyces cerevisiae poate nmuguri de circa 20 de ori, aa nct nainte de a-i pierde viabilitatea aproape ntreaga suprafa celular este acoperit cu cicatrici mugurale. Din punct de vedere chimic, n componena stratului extern s-au descoperit manani, glucani i chitina, care mpreun reprezint peste 90% din substana uscat a peretelui celular, alturi de prezena unor cantiti mici i variabile de lipide, enzime, cationi i ap. Stratul intern are o suprafa ornamentat cu riduri proeminente formate din fibrile constituite din molecule liniare de -glucan ce formeaz complexe cu proteinele asigurnd rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular. La nivelul peretelui celular sunt localizate i enzime (invertaza, fosfataza, endoglucanaze, permeaze) implicate n biosinteza compuilor peretelui celular i n procese de transfer a substanelor. Rolul esenial al peretelui celular este cel de a asigura forma celulei i de protecie fa de factorii mediului ambiant. n cooperare cu plasmalema, particip la creterea i reproducerea celular, n biosintez i catabolism. De asemenea, peretele celular este implicat n reaciile de floculare i aglutinare ale drojdiilor, proprieti tehnologice importante pentru drojdiile fermentative. Prin ndeprtarea peretelui celular prin metode enzimatice, se obin protoplatii folosii n ingineria genetic pentru obinerea prin fuziune a hibrizilor cu importan practic. Prin amplasarea protoplatilor pe mediu nutritiv n timp de 812 ore are loc regenerarea peretelui celular. Plasmalema (membrana citoplasmatic), reprezint cel de-al doilea nveli al celulei de drojdii ce ader strns pe toat suprafaa sa cu peretele celular, cu care coopereaz funcional. La microscopul electronic apare ca un strat lamelar cu o grosime de circa 89 nm, care delimiteaz protoplastul la exterior. La celulele tinere apare ca un strat omogen, neted, fr nici o nvaginare, n timp ce la celulele mature n membran se evideniaz nvaginri - similare unor anuri care i mresc mult suprafaa. Din punct de vedere chimic plasmalema este constituit din lipoproteine, n care lipidele reprezint 2330%, iar proteinele 3033% din masa membranei, raportul proteine/lipide variaz n funcie de specie, fenofaz i procedeul de izolare utilizat, ntre 1,1 i 1,4. Dintre lipidele prezente n plasmalem predomin fosfolipidele care mpreun cu sterolii i acizii grai nesaturai au un rol esenial n procese de permeabilitate. Lipidele, cu rol de solvent hidrofobic, permit accesul n celul al unor substane utile (aminoacizi nepolari, vitamine). Proteinele plasmatice sunt glicoproteine ce au o mare mobilitate n plasmalem i sub form de molecule sau complexe moleculare ndeplinesc funcii de recepie i transport. Conform modelului stabilit de Robertson, plasmalema prezint dou straturi lipidice n care

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE moleculele de lipide sunt orientate cu partea hidrofob spre interior i cu cea hidrofil polar spre periferie i sunt delimitate n ambele pri de macromolecule proteice; particule globulare proteice se pot evidenia i ntre straturile lipidice, modificndu-i poziia n funcie de starea fiziologic a celulei. Plasmalema este o structur dinamic, nsuirile sale morfologice i biochimice ca i potenialul su funcional modificndu-se pregnant n funcie de stadiul ciclului celular i de influena unor factori ai mediului ambiant. n primul rnd este o barier osmotic cu permeabilitate selectiv ce regleaz transferul de substane nutritive necesare n celul pentru a fi metabolizate, precum i eliminarea de catabolii, iar prin sistemele enzimatice active la acest nivel, intervine n reglarea procesului de cretere i nmulire. Plasmalema interfereaz cu principalele ci metabolice ale celulei vii. Citoplasma este constituit din citosol i din organite citoplasmatice care sunt dispersate n el. Este componenta celular cu cel mai nalt dinamism, structura sa fizico-chimic i potenialul su fiziologic modificndu-se foarte rapid, corelndu-se permanent cu condiiile mediului ambiant i cu necesitile metabolice ale diferitelor etape de dezvoltare. Citoplasma reprezint mai mult de jumtate din volumul total al celulei. Hialoplasma sau matricea citoplasmatic este substana fundamental a citoplasmei prezent n toate celulele vii, localizat n spaiul celular n afara compartimentelor delimitate de membranele intracelulare. Ea este format dintr-o fracie solubil (citosol), citoschelet i o reea de filamente care interconecteaz elemente de citoschelet i organitele celulare n citoplasm (Dan, V., 1997). Citosolul este un sistem coloidal cu un coninut de 7085% ap, n care substanele componente se afl sub form de sol sau gel, formnd micele coloidale. Dintre substanele organice predomin proteinele cu rol structural sau catalitic, lipide cu rol plastic i glucide cu rol energetic. n compoziia chimic a citosolului intr i acizii nuceici (ARN I ADN), nucleosidele i nucleotidele cu implicaii majore n metabolismul energetic al celulei ca i unii alcooli, fenoli, acizi organici, etc. n citosol, n anumite faze ale creterii celulare, se pot acumula substane n exces sub forma unor incluziuni de rezerv i anume: Granule de glicogen, se prezint sub forma unor corpusculi sferici, cu diametrul de circa 40 nm i reprezint principala substan de rezerv a celulei care este metabolizat cnd aceasta este n stare de nfometare. Se pot evidenia prin suspendarea celulelor de drojdie n soluie de Lugol, cnd glicogenul n prezena iodului se coloreaz n brun-rocat. Sferozomii (oleiozomii) reprezint incluziuni lipidice acumulate n faza staionar de cretere celular delimitate de o membran simpl, ce conin fosfolipide i acizi grai nesaturai ce pot fi metabolizai n condiii de malnutriie, dup ce se produce liza enzimatic a membranei. Citoplasma joac un rol important n biochimia celulei i se gsete n strns interdependen cu organitele pe care le nconjoar. n acest sens, primul stadiu al respiraiei glicoliza i fermentaia alcoolic decurg n citoplasm, n timp ce urmtorul stadiu, ciclul ATC se realizeaz mitocondric. Organitele celulare. Dintre organitele celulare cu care citosolul interacioneaz n mod permanent formnd o unitate morfofuncional, fac parte urmtoarele: nucleul, mitocondrii, aparatul Golgi, sistemul vacuolar. Nucleul reprezint spaiul genetic n care are loc stocarea, replicarea i transmiterea informaiei celulare i poate fi secvenializat n urmtoarele pri: nveli,

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE nucleoplasm, cromonemat, nucleol i fus intranuclear. Are o form sferic sau oval, de obicei cu o poziie excentric n citosol i prezint o anvelop nuclear n care s-au evideniat pori care asigur legtura ntre nucleu i citosol. nveliul nuclear confer individualitate nucleului prin controlul riguros i medierea schimbrilor nucleocitoplasmatice. Nucleoplasma reprezint mediul n care sunt nglobate cromonemata, nucleolul i fusul intranuclear. Nucleolul const dintr-un miez denumit core, alctuit din histone n form de disc pe care sunt nfurate segmente de ADN, formnd aranjamente helicoidale sau solenoide. n nucleol sunt sintetizate proteine ribozomale i ARN ribozomal care apoi trec prin porii nucleari, n citosol. n funcie de caracterele genetice ale speciei de drojdie, numrul de cromozomi nu depete valori de 818, Saccharomyces cerevisiae are 17 cromozomi (Konovalov, 1980). Mitocondriile sunt organitele de baz sau structurile subcelulare n care se sintetizeaz substanele care nmagazineaz energia chimic a celulei, de aceea, nu ntmpltor sunt supranumite i uzine energetice celulare. Pot ocupa pn la 25% din volumul citosolului, n numr variabil, de 1050/celul, ntr-o continu metamorfoz, nct n unele faze fiziologice pot forma o mitocondrie unic, ramificat denumit condriom. Sunt organite puternic hidratate, apa reprezentnd pn la 70% din masa mitocondriei, ceea ce reflect un potenial fiziologic particular. Substana uscat este constituit n principal din proteine i lipide (peste 90%), acizi nucleici, nucleotide, ioni minerali. Proporia diferitelor componente variaz considerabil n funcie de starea fiziologic a celulei i de influena unor factori de mediu. Conform ultimelor date tiinifice, proteinele se afl repartizate n proporie de 5% n membrana extern, 20% n membrana intern i 75% n condriopasm. Mitocondriile posed sisteme de transport specifice, diversificate, care realizeaz transportul unor metabolii eseniali prin membranele mitocondriale ce separ condrioplasma de citosol. n mitocondrii exist enzime ce realizeaz procese de oxidare ale compuilor organici, enzimele lanului respirator i numeroase enzime oxidative, enzime ce asigur fosforilarea. Reticulul endoplasmatic face legtura ntre nucleu i vacuom i reprezint o reea de vezicule, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologic. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NAD+, enzime ale lanului transportor de electroni) i are rol n transportul substanelor nutritive, n declanarea procesului de nmugurire, n biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; particip, de asemenea, la expansiunea nveliului nuclear i a plasmalemei n diferite etape de dezvoltare ale celulei. Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alctuit din uniti funcionale corpi Golgi sau dictiozomi, care face legtura ntre reticulul endoplasmatic i plasmalem, ntre reticulul endoplasmatic i alte organite celulare. Aparatul Golgi este aparatul de sortare i dirijare a proteinelor i componentelor membranare spre locul de destinaie; au rol n expansiunea peretelui celular (Dan, V., 1999). Ribozomii denumii i granule Palade dup numele cercettorului de origine romn care i-a pus n eviden n anul 1953, sunt particule nucleoproteice implicate n sinteza proteinelor celulare rspndii n citosol citoribozomi, liberi sau n asociaii de 56 polizomi. Au n structur ARN ribozomal i proteine (n cazul ribozomilor de Sachharomyces cerevisiae valoarea raportului ARN/proteine variaz

10

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ntre 1,04 i 1,12. ARN ribozomal este implicat n procese de transcripie a informaiei genetice pentru biosinteza proteinelor/enzimelor, necesare celulei. Lizozomii sunt structuri veziculare bogate n enzime: proteaze, fosfataze, lipaze (peste 40 de tipuri de enzime), active la pH = 5 cu rol n digestia unor compui ai celulei vii, care nu mai funcioneaz eficient; n exteriorul lizozomului, n citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Enzimele lizozomale sunt n mod normal inactive, latena lor este dependent de integritatea membranei lizozomale, care acioneaz ca o barier ce se interpune ntre enzim i substrat. Cnd sub aciunea unor factori, de exemplu n starea de nfometare, n absena apei care s asigure transportul n exteriorul celulei a cataboliilor formai, pH-ul n citosol scade, enzimele din lizozomi sunt activate i celula moare prin autoliz. Peroxizomii sunt structuri sferice sau ovale nconjurate de o membran simpl i cu o matrice fin granulat pe care sunt localizate oxidaze, cu rol n adaptarea celulei de drojdie la condiii aerobe i intervin n degradarea acizilor grai, a aminoacizilor, a apei oxigenate i a altor substane (de ex. a metanolului). 2.1.6. Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate important a unor drojdii cu utilizri n industria alimentar este aceea de a fermenta n condiii de anaerobioz glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon i produse secundare care dau aroma caracteristic produselor fermentate: C6H12O6 ----- 2CH3-CH2-OH + 2CO2 + 117kj n condiii de aerobioz, drojdiile asimileaz glucidele transformndu-le prin respiraie la CO2 i H2O, iar energia eliberat favorizeaz creterea i nmulirea celulelor: C6H12O6 6CO2 + 6H2O + 2840 kj Celulele de drojdie reacioneaz activ la presiunea osmotic dat de concentraia substanelor dizolvate n mediul n care se afl suspendate. Dac mediul este hipotonic, cu o concentraie a substanelor dizolvate mai mic dect concentraia intracelular, apa va ptrunde n celula care i mrete volumul i dac se prelungete aceast stare de turgescen, celula sufer deteriorri fizice ireversibile. n mediu hipertonic, cnd concentraia mediului este superioar concentraiei intracelulare, apa din celul difuzeaz n exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece n starea de plasmoliz (Dan, V., 1999). Celulele de drojdie, n funcie de condiiile de cultivare si vrst pot prezenta activitate metabolic difereniat concretizat prin trei stri n care se pot afla celulele si anume: starea de metabioz (activ), n care celulele au activitate metabolic maxim. n condiii favorabile de cultur, celulele cresc, se reproduc i acumuleaz intracelular substane de rezerv glicogen i trehaloz; starea de anabioz (latent), celulele i menin caracteristicile vitale, dar nu se pot nmuli. Aceast stare apare cnd substanele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consum din substanele de rezerv intracelulare; starea de autoliz (moartea fiziologic). Se produce o solubilizare a compuilor intracelulari sub aciunea enzimelor proprii celulei.

11

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 2.1.7. Reproducerea drojdiilor Forma general de reproducere a drojdiilor este nmugurirea vegetativ (calea asexuat) care are la baz un proces simplificat de mitoz, cnd din celula mam se formeaz noua celul, identic din punct de vedere genetic. Unele drojdii au capacitatea de a se nmuli prin sporulare, ce poate avea loc pe cale asexuat (prin procesul de meioz) i pe cale sexuat (prin procese de copulare). Sporularea este condiionat genetic are loc n anumite condiii de mediu. Reproducerea prin nmugurire. nmugurirea are loc cnd drojdiile se afl n condiii optime de mediu (nutrieni, pH, temperatur). O condiie necesar pentru nmugurire este aerarea corespunztoare a mediului, deoarece n prezena oxigenului din aer are loc asimilarea eficient a nutrienilor cu recuperarea energiei poteniale a acestora, energie folosit de celul n cretere pentru procese de biosintez, consumatoare de energie. n aceste condiii, n prima etap celula de drojdie crete n dimensiuni n urma creterii coordonate a compuilor intracelulari; creterea n volum fiind mai rapid dect a suprafeei nveliurilor celulare, are loc o nmuiere enzimatic a peretelui i apare o protuberan - mugurele. ntre celula parental i mugure se perfecteaz un canal - diverticulum prin care se transfer n celula nou format material nuclear i citoplasmatic (cariokinez i citokinez). Cnd celula fiic va conine toate componentele i organitele necesare unei viei independente, la nivelul canalului se formeaz un perete inelar cu o concentraie ridicat n chitin, ce se dezvolt centripet pn are loc obturarea i separarea (Dan, V., 1999).

Fig. 2. nmugurirea la drojdii: 1- mugure; 2- canal de legtur; 3- nucleu; 4- vacuol adiacent nucleului; 5nucleol. Celula fiic, cu activitate metabolic independent, poate rmne ataat de celula mam formnd asociaii sau pseudomicelii, sau se separ de celula parental, iar la locul de desprindere rmne vizibil cicatricea mugural. n condiii optime de via, o celul de drojdie poate forma 942 noi celule apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. Reproducerea prin sporulare. Sporularea are la baz procesul de meioz, prin care numrul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumtate, iar celulele formate primind un singur rnd de cromozomi sunt haploide. Sporularea este iniiat dup circa 10 ore de expunere pe mediul de sporulare i este mai intens dup 2448 ore. n timp, celula generatoare de spori denumit i asc se poate rupe sau s se solubilizeze prin autoliz i ascosporii liberi, n condiii favorabile germineaz i formeaz prin reproducere vegetativ clone haploide. Ascosporii haploizi pot fi de tip a sau n funcie de natura feronomilor specifici; n condiii favorabile, celulele ajunse la maturitate fiziologic denumite i gamei pot s fuzioneze printr-un proces de conjugare pentru a forma din nou celule diploide. Dac

12

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE are loc conjugarea ntre celule de acelai tip a sau celulele diploide sunt viabile, dar ascosporii formai i pierd aceast calitate. Sub form de ascospori drojdiile rezist timp ndelungat n sol, n condiii de uscciune, n schimb termorezistena lor este apropiat cu cea a celulelor vegetative (inactivare la 75850C). Meioza este important din punct de vedere practic pentru c se pot realiza copulri dirijate cu obinerea unor hibrizi ce prezint proprieti superioare prelund de la celulele parentale caractere deosebite (Dan, V., 1999). 2.1.8. Clasificarea general a drojdiilor Potrivit Codului Internaional de Nomenclatur Botanic tulpinile de drojdii sunt grupate n specii, speciile n genuri, iar genurile n subfamilii i familii. O clasificare de referin este cea propus de Lodder i Kreger van Rij (1952) care clasific drojdiile n 38 genuri i 349 de specii de drojdii, iar clasificarea cea mai recent i cuprinztoare aparine lui Kreger van Rij (1984) (60 genuri cu aproximativ 500 de specii). Din aceast clasificare se vor meniona genuri i specii cu implicaii n industria alimentar, n calitatea lor de ageni ai fermentaiei alcoolice sau de alterare a produselor alimentare. Genul Saccharomyces cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fermentativ. Se nmulesc prin nmugurire i sporulare, producnd 1-4 ascospori. Dintre speciile reprezentative ale genului: Saccharomyces cerevisiae este o drojdie de fermentaie superioar folosit la fabricarea alcoolului i la obinerea drojdiei de panificaie. Din biomasa de celule obinut n mediul nutritiv i n condiii de aerare, prin procedee biotehnologice se pot obine enzime (invertaz), vitamine din grupul B, interferon .a. Saccharomyces carlsbergensis este o drojdie de fermentaie inferioar, se utilizeaz industrial la fabricarea berii, iar din drojdia rezidual rezultat dup fermentare se pot obine extracte, substane de arom. Genul Brettanomyces cuprinde drojdii de form oval cilindric, n aerobioz pot s produc prin fermentarea lent a glucozei, alcool etilic 11-12% alcool, acid acetic, citric, lactic, succinic. Dau alterri ale berii, vinului (tulburare, iz de oarece) cu formare de esteri i substane cu gust amar, a buturilor nealcoolice, a murturilor. Genul Candida este un gen bogat n specii (81), eterogen din punct de vedere morfologic i fiziologic i care a suferit n timp multe modificri taxonomice. Candida mycoderma denumit i floarea vinului se dezvolt n prezena aerului la suprafaa lichidelor slab alcoolice formnd un voal caracteristic; prin oxidarea alcoolului la dioxid de carbon i ap are loc deprecierea vinului, berii. Alte specii Candida utilis, Candida robusta, Candida tropicalis, Candida lypolitica etc. se pot cultiva pe medii obinute prin prelucrarea unor deeuri ale industriei alimentare, a lemnului i celulozei, obinndu-se o biomas, cu un coninut de 45-55% protein, folosit n furajarea animalelor. Candida kefyri este util la fabricarea chefirului, Candida albicans, drojdie facultativ patogen nu se nmulete n alimente. Genul Debaryomyces cuprinde drojdii de form oval cilindric, poate produce mucus la suprafaa batoanelor de salam, se dezvolt la suprafaa brnzeturilor, iaurtului i dau alterri ale sucurilor concentrate de portocale. Genul Hanseniaspora include drojdii cu proprieti fermentative reduse (50 alcool), cu form apiculat i sunt rspndite n microbiota fructelor citrice, a

13

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE smochinelor; intervin n fermentarea natural a boabelor de cacao. Hanseniaspora apiculata poate reprezenta pn la 90% din microbiota mustului i i reduce viteza de fermentare la acumularea de 5-7% alcool. Se poate dezvolta n vin fiind responsabil pentru formarea de acizi volatili, esteri care dau un gust amar, strin vinului. Prin contaminarea vinului folosit la obinerea ampaniei la sticle, Hanseniaspora apiculata poate forma un sediment aderent la sticl i care se ndeprteaz greu la degorjare. Genul Pichia conine 35 de specii. Au o slab activitate fermentativ, sunt drojdii peliculare; prin dezvoltare i formare de voal produc deprecierea vinului, a berii. Se pot izola de pe suprafaa petilor i a creveilor, din saramura mslinelor conservate i pot produce alterri ale produselor vegetale murate. Genul Rhodotorula include celule cu form oval-cilindric, sunt drojdii oxidative i pot sintetiza pigmeni carotenoizi care imprim coloniei culoarea roucrmiziu. Rhodotorula glutinis i Rhodotorula mucilaginosa, predominante pe alimente: pui, pete, crevei, pe suprafaa untului, sunt specii psihrotrofe. Genul Saccharomycodes cu specia Saccharomycodes ludwigii prezint forme apiculate sau oval alungite, poate fi agent de alterare a musturilor i sucurilor de fructe i dau tulburarea cidrului, a vinurilor semidulci. Genul Saccharomycopsis cu specia important Saccharomycopsis fibuligera prezint celule ovale, fermenteaz lent glucoza, zaharoza, maltoza, asimileaz amidon, alcool etilic, acid lactic etc.; unele tulpini sunt folosite pentru producerea de glucoamilaz sau pentru obinerea de drojdii furajere. Genul Schizosaccharomyces cuprinde drojdii de form cilindric, oval. Schizosaccharomyces pomb este agent al fermentrii sucului de trestie de zahr i folosit pentru obinerea romului i a buturii arak. Genul Torulopsis prezint celule sferice, ovale sau cilindrice. Specii ale genului ntlnite n mustul de struguri, au putere alcooligen redus. Sunt osmotolerante, psihrofile, sulfitorezistente. Pot produce alterri ale laptelui concentrat, a siropurilor, a sucurilor. Genul Zygosaccharomyces cuprinde drojdii cu celule ovale, cu proprieti fermentative, osmotolerante. Pot produce fermentarea mierii, a siropurilor concentrate de zahr cu formare de alcool etilic, acid acetic, dioxid de carbon. 2.2. MUCEGAIURI (FUNGI FILAMENTOI, MICROMICETE) Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori formai numai pe cale asexuat sau pe cale mixt (asexuat i sexuat). 2.2.1.Rspndire i rol Mucegaiurile sunt foarte rspndite n natur, habitatul preferat i cel mai populat este solul, n special n stratul superficial al solului care le asigur condiii de cretere i supravieuire. Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile particip la transformarea unor compui organici (celuloza, hemiceluloze, substane pectice, amidon, lipide) la compui mai simpli i sunt considerai ageni de putrezire. Mucegaiurile particip astfel la circuitul carbonului n natur i mbogesc solul n substane cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de ctre plante. Din sol, prin intermediul factorilor naturali, sporii

14

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE de mucegai sunt antrenai pe calea aerului la distane foarte mari, ceea ce asigur rspndirea nelimitat de granie geografice. n aer, mucegaiurile sub form de spori sau hife vegetative pot supravieui un timp ndelungat, iar n absena curenilor de aer se depun cu o vitez ce atinge valori de 3 cm/sec. n ap prezena mucegaiurilor este ocazional, apa fiind un mediu prin care se poate face rspndirea sporilor. Creterea mucegaiurilor n ap este dependent de coninutul acestora n compui organici i poate avea loc numai n condiii de aerare. Sporii de mucegai se ntlnesc frecvent la suprafaa plantelor, n tractul digestiv, n special la ierbivore. n industria alimentar activitatea de biodeteriorare este nedorit deoarece fungii cauzeaz pierderi prin mucegirea seminelor alimentelor. Ca efect secundar este formarea de micotoxine, de ctre unele mucegaiuri, nct alimentele devin inutilizabile. n afara mucegaiurilor saprofite ageni ai putrezirii, se ntlnesc mucegaiuri patogene care pot parazita: plante, animale, peti i insecte. Mucegaiurile sunt frecvent ntlnite n microbiota plantelor, pe suprafaa fructelor i legumelor. Dac produc mbolnviri la plante poart denumirea de mucegaiuri fitopatogene i sunt responsabile pentru aproximativ 70% din totalul mbolnvirilor ntlnite la cereale i legume. Dintre mucegaiurile fitopatogene se pot enumera cele care produc boli ca mlura, rugina, tciunele etc. ale plantelor industriale. La om i animale mucegaiurile patogene produc un numr mai redus de mbolnviri, se dezvolt pe piele, unghii, pr. Un numr mic de mucegaiuri pot produce mbolnviri interne atunci cnd sporii sunt inhalai (pe cale respiratorie) dnd micoze (de exemplu, Aspergillus fumigatus produce aspergillom pulmonar). 2.2.2. Rolul mucegaiurilor n industrie n afar de rolul important al mucegaiurilor n natur, n industria alimentar, culturi fungice selecionate se pot folosi la fabricarea brnzeturilor tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. Cu ajutorul mucegaiurilor pe cale biotehnologic se pot obine compui deosebit de valoroi: - antibiotice: peniciline cu Penicillium chrysogenum, cephalosporine (Cephalosporium), griseofulvine (Penicillium griseofulvum) acidul fusidic cu Fusidium coccinenum i antibiotice active fa de bacterii Gram pozitive cu Mucor ramannianus; - acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); - vitamine (B2, ergosterol provitamina D2); - enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). Mucegaiurile se mai pot folosi pentru mbogirea n proteine a finurilor vegetale i ca ageni de depoluare a apelor reziduale. n tehnologiile moderne se obin SCP cu fungi din care: Fusarium graminearum n Marea Britanie i specii de Paecilomyces n procesul Pekilo n Finlanda unde sunt cultivate pe leii sulfitice i deeuri din industria hrtiei. 2.2.3. Caractere morfologice Mucegaiurile se rspndesc n natur sub form de spori rezisteni la uscciune, form n care se menin n stare viabil ani de zile. Dac un astfel de spor ajunge pe suprafaa unui mediu favorabil pentru cretere, cu o cantitate suficient de ap liber care s-i permit absorbia substanelor nutritive, n primul stadiu care

15

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE poate s dureze 3-4 ore, are loc absorbia apei i activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale i formarea tuburilor vegetative numite hife sau thal. Hifele cresc numai prin vrf i deci au o cretere apical, dup care se ramific. Hifele se extind pe suprafaa mediului, se diversific i ndeplinesc anumite funcii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta i n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol n susinere; hifele de rspndire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formeaz hifele reproductoare, generatoare de spori, difereniate n funcie de gen i specie. Totalitatea hifelor vegetative i reproductoare alctuiete miceliul. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile, astfel n interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile difereniate. n cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu aseptat, coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, au aspect pslos i culori alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formeaz colonii cu o cretere radial limitat i culoare ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuane specifice n funcie de gen i specie. Cnd sporii de mucegai ajung la suprafaa unui mediu nutritiv lichid, prin ntreptrunderea hifelor vegetative se formeaz o pelicul denumit derm, la nceput neted, n timp, prin creterea suprafeei derma se cuteaz i la suprafa se dezvolt hifele reproductoare, se produce sporularea i colorarea specific. Prin introducerea sporilor de mucegai n mediu lichid i cultivarea pe agitator rotativ, ca rezultat al agitrii, mucegaiurile formeaz prin cretere vegetativ, sfere vizibile, ntotdeauna de culoare alb. 2.2.4. Structura mucegaiurilor Mucegaiurile au la baz celula de tip eucariot ce include toate organitele descrise la celula de drojdie. Spre deosebire de drojdii, peretele celular este mai gros i n afar de i -glucani se gsete n cantitate mare celuloza. Celula poate conine 1-2 nuclei cu cte 2-4 cromozomi fiecare. n funcie de caracterele genetice pot fi: - mucegaiuri inferioare sunt monocelulare i se dezvolt sub forma unei celule gigantice ce prezint mai multe ramuri. n aceste celule migreaz liber nucleii citoplasmatici i organitele intracelulare. n cazul n care un spor ajunge pe un mediu nutritiv, atunci prin cretere are loc germinarea sporului care const ntr-o cretere n volum a acestuia producndu-se hife vegetative. Prima dat se formeaz hife de extindere care se dezvolt n paralel de-a lungul mediului nutritiv. Se formeaz apoi hife submerse ce se dezvolt n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol de susinere. Totalitatea acestor hife de extindere i submerse formeaz miceliul vegetativ. Odat cu creterea i dezvoltarea miceliului vegetativ ncep s apar hife aeriene care sunt i reproductoare; - mucegaiuri superioare sunt pluricelulare i au miceliu septat, aceasta pentru c la anumite distane apar perei despritori (septum) prevzut cu un por central prin care se poate face transfer citoplasmatic.

16

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 2.2.5. Caractere fiziologice generale Mucegaiurile sunt microorganisme uor adaptabile, deoarece au capacitatea de a forma enzime induse n funcie de natura substratului pe care se afl, nct produc degradarea att a produselor alimentare ct i a fibrelor textile, a cauciucului, betonului etc. Mucegaiurile sub form de hife sau spori sunt foarte rezistente la uscciune i se menin n stare latent de via un timp ndelungat. Mucegaiurile sunt puin pretenioase la cantitatea de ap liber prezent n produs, de aceea ele pot produce mucegirea produselor care se conserv prin uscare numai cnd acestea ncep s absoarb ap din mediul ambiant. n raport cu oxigenul, mucegaiurile sunt microorganisme aerobe deci necesit pentru cretere prezena oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat n mediul lichid. Mucegaiurile se pot dezvolta n limite largi de pH (1,59) cu o valoare optim n domeniul acid (pH = 5,56). Mucegaiurile sunt microorganisme mezofile cu temperaturi optime de cretere la 25C, un numr restrns sunt termofile cele patogene au temperatura optim la 37C, iar altele sunt adaptate la temperaturi sczute (03C). Rezistena termic a mucegaiurilor sub form de hife sau spori este mic, majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80C, cei mai rezisteni spori sunt distrui la 88C n 10 minute. 2.2.6. Reproducerea mucegaiurilor Mucegaiurile se nmulesc pe cale vegetativ i prin sporulare. Reproducerea vegetativ se realizeaz prin intermediul fragmentelor de hife rupte sub aciunea unor factori mecanici atunci cnd acestea conin cel puin o celul. Fragmentele hifale chiar cnd, de exemplu n cazul mucegaiurilor superioare conin mai multe celule, vor forma o singur colonie. Din acest motiv la determinarea numrului de mucegaiuri din diferite produse exprimarea se face n uniti formatoare de colonii (UFC). Fungii filamentoi pot s creasc n dimensiuni fr s modifice raportul ntre volumul de citoplasm i suprafaa hifelor, astfel nct schimbul de substane ntre miceliu i mediu implic transport numai pe distane scurte. Se cunosc 3 mecanisme prin care are loc reglarea creterii miceliului i anume: prin reglarea extinderii hifelor, prin iniierea de ramificaii i prin distribuirea spaial a hifelor. Timpul de dublare a miceliului ca i intervalul ntre cicluri succesive de formare a septumului depind de specie i condiii de cultur i poate dura aproximativ 2 ore (Aspergillus nidulans). Se apreciaz c, pentru mitoza complet a nucleilor la mucegaiuri sunt suficiente 10 minute, iar intervalul ntre mitoz i apariia septumurilor este de 2040 minute. Reproducerea prin sporulare. Este forma cea mai rspndit la mucegaiuri i poate avea loc pe cale asexuat sau pe cale mixt. 2.2.7. Clasificarea general a mucegaiurilor Mucegaiurile reprezint un grup taxonomic complex, motiv pentru care clasificarea acestora este n continu transformarea. Numrul posibil de specii ce ar putea exista n natur este apreciat la aproximativ 250000. Mucegaiurile de interes alimentar sunt grupate n 20 de genuri i aproximativ 1000 de specii. Clasificarea are la baz anumite criterii morfologice, structur, caractere coloniale, pigmentogenez, integrate cu date fiziologice i genetice.

17

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Mucegaiurile fac parte din diviziunea EUMYCOTA cu urmtoarele subdiviziuni: 1. MASTIGOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin oospori, pe cale sexuat, cu urmtoarele genuri: Genul Peronospora cu specii fitopatogene, produc mana viei de vie. Genul Phytium include ageni ce produc putrezirea plantelor de gru tinere. Genul Phytophtora cu specia Phytophtora infestans, agentul productor al manei la cartofi. 2. ZYGOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin zigospori pe cale sexuat i prin sporangiospori i chlamidospori pe cale asexuat. Genul Mucor (88 specii) se caracterizeaz prin formarea de sporangiospori n stilosporange, la maturitate prin ruperea membranei i eliberarea sporilor rmne la baza columelei, un collar. n funcie de specie, columela poate avea dimensiuni i forme diferite. Dintre speciile mai importante ale genului: Mucor mucedo, denumit i mucegaiul alb al pinii, Mucor racemosus, agent de putrezire a fructelor i legumelor, Mucor pussillus i Mucor miehei, specii selecionate pentru obinerea de proteaze cu aciune similar cu cea a cheagului animal. Genul Rhizopus (11 specii) se caracterizeaz prin stilosporange de dimensiuni mari, cu columel semisferic, fr collar dup ruperea membranei sporangelui. Sporangiosporii se dezvolt n mnunchi dintr-un punct n care se dezvolt rhizoizi - hife de susinere cu rol absorbant. Extinderea coloniei are loc rapid ca urmare a formrii unor lstari micelieni denumii stoloni. Specia cea mai rspndit pe toate produsele alimentare este Rhizopus stolonifer, agent de mucegire a fructelor i legumelor. Tulpini selecionate pot fi folosite pentru obinerea pe cale fermentativ a acidului fumaric. Genul Thamnidium se caracterizeaz prin formarea de sporangiofori terminai cu un stilosporange mare sub care se dezvolt sporangiofori scuri purttori de sporangioli cu un numr mic de sporangiospori. Thamnidium elegans produce mucegirea produselor conservate prin refrigerare. Genul Absidia prezint sporangi mici cu columel de form conic. Unele specii sunt termofile i produc mbolnviri la animale i om. Poate produce mucegirea porumbului i elaboreaz toxine. 3. ASCOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se reproduc pe cale asexuat i sexuat prin ascospori. Genul Byssochlamys produce asci cu 8 ascospori termorezisteni i produc alterarea alimentelor conservate cu acizi. Byssochlamys fulva i Byssochlamys nivea produc alterarea conservelor de fructe. Genul Monascus cu specia Monascus ruber este folosit pentru obinerea de colorani roii de uz alimentar. 4. BASIDIOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu ciclu de via mai evoluat i care se reproduc pe cale sexuat prin bazidiospori. Genul Puccinia cuprinde specii fitopatogene ageni ai ruginii cerealelor. Genul Ustilago produc la gru i porumb boala denumit popular tciune. 5. DEUTEROMYCOTINA cuprinde numeroase genuri i specii de mucegaiuri superioare care se reproduc prin conidiospori i la care nu exist cale sexuat de sporulare sau aceasta nu a fost nc evideniat. Genul Aspergillus (132 specii) cuprinde numeroase specii cu importan biotehnologic. Se caracterizeaz prin formarea de conidiofori drepi, neramificai care poart capul conidial alctuit dintr-un suport anatomic denumit vezicul pe care

18

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE se dezvolt celulele conidiogene respectiv fialide, generatoare de lanuri lungi de fialospori. Specia Aspergillus niger formeaz colonii radiale de culoare brun-negru, prezint dou rnduri de fialide pe toat suprafaa veziculei, capul conidial este sferic. Numeroase tulpini selecionate sunt folosite pentru obinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucozoxidaze, invertaze, enzime pectolitice sau pentru obinerea acizilor organici: acid citric, acid lactic, gluconic. Specia Aspergillus oryzae formeaz colonii de culoare bej-oranj cu conidiofori drepi i cap conidial sferic cu un singur rnd de fialide. Este numit pe drept cuvnt arsenalul enzimelor deoarece se cunosc peste 200 de enzime elaborate de mucegai i obinute n stare purificat. Pentru obinerea de amilaze mai pot fi folosite speciile Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspegillus usamii, Aspergillus cinnamommeus. Aspergillus flavus formeaz colonii de culoare alb-glbui la maturitate galben-verzui spre brun cu revers colorat n galben brun. Este rspndit n sol, pe produse vegetale i are capacitatea de a produce aflatoxine, micotoxine cu efect cancerigen. Genul Penicillium (453 specii) se caracterizeaz prin formarea unui aparat reproductor ramificat alctuit din ram, metule, fialide i fialospori cu diferenieri morfologice n funcie de specie. n cadrul genului, specii selecionate sunt folosite la obinerea brnzeturilor cu past albastr Penicillium roqueforti, a brnzeturilor cu past moale Penicillium camemberti, la maturarea salamurilor crude uscate Penicillium nalgiovense. Pentru obinerea de antibiotice din grupa penicilinelor se fosesc tulpini de Penicillium notatum i Penicillium chrysogenum. Numeroase specii sunt ageni de putrezire i pot produce micotoxine: Penicillium expansum, Penicillium islandicum, Penicillium citrinum etc. Genul Botrytis formeaz colonii extinse, psloase, de culoare cenuie. Botrytis cinerea este denumit mucegaiul cenuiu i poate produce putrezirea vulgar sau nobil a strugurilor. Specii fitopatogene dau boli la floarea soarelui i alterri n depozit ale fructelor i legumelor. Genul Fusarium include specii saprofite rspndite n sol i specii patogene parazite ale plantelor superioare. Dau putrezirea brun a fructelor citrice, putrezirea umed a smochinelor, mucegirea cerealelor (orz, gru) cu producerea de micotoxine trichothecene: Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium nivali etc. Genul Cladosporium formeaz colonii cu aspect catifelat de culoare brun-oliv cu revers colorat n bleumarin-negru. Se reproduc prin blastospori n form de lmie. Este prezent n microbiota cerealelor proaspt recoltate. Este agent al putrezirii negre a strugurilor i pepenilor galbeni. Genul Alternaria formeaz colonii pufoase cu miceliu septat i conidii mari cu septumuri longitudinale i transversale. Dau putrezirea brun a fructelor. Este considerat mucegai de cmp i este prezent pe suprafaa seminelor proaspt recoltate fiind folosit ca indice de prospeime a cerealelor. Genul Geotrichum formeaz colonii extinse, catifelate de culoare alb. Produce miceliu septat din care se separ arthrospori ce au tendina de aranjare n zig-zag. Geotrichum candidum este ntlnit n industria laptelui i la fabricarea pastei de tomate, drept contaminant al utilajelor. Genul Trichoderma formeaz colonii extinse pufoase sau pulverulente de culoare glbui spre verde. Trichoderma reesei produce activ celulaze i un antibiotic gliotoxina cu efect fungistatic fa de mucegaiuri care produc putrezirea lemnului. Genul Trichothecium formeaz colonii cu aspect pufos de culoare rozportocaliu. Dintre cele 4 specii ale genului Trichothecium roseum este cel mai ntlnit

19

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE pe reziduuri vegetale, ca agent al putrezirii fructelor. Este ntlnit pe suprafaa boabelor de cereale: gru, orz, porumb i poate produce mucegirea pinii. 2.3. BACTERII Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5-0,8 m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomoforf. Bacteriile sunt microorganisme cu o larg rspndire n natur, ca rezultat al adaptrii lor n cursul procesului de evoluie. Rezervorul natural al bacteriilor este solul unde concentraia de celule poate ajunge la valori de 10 7-109 g-1 att n straturile superficiale (bacterii aerobe), ct i n straturile de profunzime (bacterii anaerobe). Din sol, bacteriile s-au adaptat s triasc n ape, unde concentraia de celule poate fi ntre 10/cm3 n apa de izvor, pn la valori de 1012/cm3, de exemplu, n ape fecalomenajere. Bacteriile se pot ntlni la adncimi mari n apa mrilor i oceanelor, n ape termale. Existena n aer a bacteriilor este temporar i prin intermediul curenilor de aer sunt rspndite la distane foarte mari. Din aer, sunt antrenate din nou n sol prin intermediul precipitaiilor atmosferice. Bacteriile pot avea forme extrem de diferite. Astfel pot avea form sferic (coci), de virgul (vibrioni), de bastonai (bacili), sau de spiral (spirili). Rolul bacteriilor n natur i industrie. Bacteriile au un rol imens n transformarea compuilor macromoleculari n compui simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea natural a circuitului unor elemente de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor, fier .a. Fr activitatea bacteriilor ageni ai putrefaciei pmntul s-ar transforma treptat ntr-un uria cimitir. n industria alimentar bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate, a brnzeturilor, n industria panificaiei, la conservarea legumelor, mslinelor, furajelor verzi etc., bacteriile propionice sunt utilizate la fabricarea brnzeturilor tip schwaitzer, iar bacteriile acetice la fermentaia alcoolului etilic obinerea industrial a oetului. Pe ci biotehnologice s-au obinut cu ajutorul bacteriilor: - enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solveni (aceton, alcool izopropilic, alcool butilic); - hormoni insulina produs de un mutant de Escherichia coli; - ngrminte biologice Azotobacter; - insecticide biologice Bacillus thuringiensis; - antibiotice Streptomyces sp. - vitamine de ex. vitamina B12 Propionibacterium shermani Ca aspecte negative putem aminti: - n industria alimentar bacterii ageni de alterare a produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefacia crnii .a.); - bacterii patogene ingerare alimente contaminate toxiinfecii alimentare; - bacterii patogene pot s paraziteze organismele vii dnd mbolnviri grave (tuberculoza, febra tifoid, dizenteria, sifilis, bruceloza, antrax, .a.), bacterioze la plante.

20

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Structura celulei bacteriene. Peretele celular. Fiecare bacterie este acoperit de un rigid perete celular, care este alctuit din peptidoglucan. Peretele celular bacterian este considerat de muli un adevrat biopolimer. Acest perete i d celulei o form i nconjoar membrana citoplasmic, protejnd-o de mediul nconjurtor. Peretele celular bacterian de asemenea menine integritatea celular. Acesta este att de puternic, nct mpiedic celula bacterian s explodeze, atunci cnd presiunea osmotic dintre citoplasm i mediu este prea mare. Compoziia peretelui celular difer de la o celul la alta, astfel alctuind un factor important n analiza i diferenierea celulelor bacteriene. Astfel, n 1884, Hans Christian Gram, un fizician danez, a realizat o metod de a diferenia structurile peretelui celular. Peretele celular gram pozitiv se coloreaz in violet prin tehnica Gram. Este gros, dar simplu structurat, unitatea de baz fiind peptidoglicanul, format din uniti repetitive. Mureina este structura rezultat din unitile de peptidoglicani cu ajutorul unei enzime: transpeptida. Are rolul de a menine forma bacteriei (la presiuni de 2-2,5 atmosfere) in cazul in care bacteria ii pierde peretele sub aciunea penicilinei. Sferoplastul (cu urme de perete celular) si protoplastul (fara perete celular) sunt fragili, usor de atacat de fagocite sau sub aciunea variaiei presiunii osmotice. Membrana citoplasmic. Membrana citoplasmic procariot const dintr-un strat dublu de fosfolipide i proteine, i se aseamn foarte mult cu membrana eucariot. Aceasta este o barier, ce le permite s interacioneze selectiv cu mediul nconjurtor. Membranele sunt asimetrice, constnd fiecare din 2 pri, fiecare parte constnd din suprafee i funcii diferite. Citoplasma. Nucleoidul, plasmidele i cromozomii. Nucleoidul reprezint regiunea citoplasmei, unde este concentrat ADN-ul cromozomal. Nu este un nucleu propriu-zis, ca la eucariote. Plasmide. Plasmidele pot pstra informaia genetic adiional. Ele se afl n special n nucleoid. Informaia pstrat de acestea nu este vital, ns poate oferi avantaje selective n anumite circumstane. De ex: unele plasmide pot codifica anumite toxine, iar alte plasmide pot pstra informaie genetic mpotriva antibioticelor. Cromozomi. Cromozomii bacterieni sunt n form circular i pstreaz informaia genetic a bacteriilor. Ribozomii i alte structuri multiproteinice. Ribozomii sunt structuri prezente n orice celul. Ribozomii bacterieni sunt similari celulelor eucariote, ns sunt mult mai mici i au o alt structur. Unele antibiotice ar inhiba funcionarea ribozomilor celulelor procariote, astfel cauznd moartea bacteriei. Caractere morfologice coloniale Mediul de baz pentru cultivarea bacteriilor bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar-agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia natere o colonie alctuit din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unic: - colonii de tip S (smooth neted lucios) - colonii de tip R (rough rugos, aspru, zbrcit) - colonii de tip M la bacterii productoare de capsule, cu consisten gelatinoas, mucoid Coloniile bacteriene pot prezenta n seciune un profil lenticular, crateriform, triunghiular i perimetru circular, dantelat sau cu ramificaii rizoidale. Pe BCA coloniile devin vizibile dup 24-48 ore i pot avea culori de alb, albcrem, galben-auriu, oranj-rou, albastru, fluorescen, caractere microscopice

21

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE importante n identificare. Pe medii nutritive lichide bacteriile pot da tulburare i sediment bacteriile anaerobe sau formeaz la suprafaa lichidelor voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos bacteriile aerobe. Bacteriile prezint forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de baz, monocelulare, precum i forme derivate ale acestora ce rezult n urma asocierii celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de baz fac parte urmtoarele: - forma sferic denumit coccus, n care sfera este perfect, de exemplu la micrococi sau ovalar, de exemplu la enterococi, lanceolat la pneumococi i reniform la gonococi; - forma bacilar cilindric, este cel mai frecvent ntlnit, este denumit i bacterium. Formele pot fi drepte cu capete rotunjite genul Enterobacter, cu capete retezate genul Bacillus, fusiforme, mciucate genul Corynebacterium, cu diametruvariabil genul Mycobacterium; - dintre formele spiralate-elicoidale, specifice bacteriilor patogene, fac parte: forma vibrio, forma spirillum sub forma unor filamente rigide cu spire largi, forma spirocheta sub forma unor filamente flexibile cu mai multe spire; - formele filamentoase sunt caracteristice bacteriilor miceliene cu habitatul n sol i ape (actinomicete, chlamydobacterii etc.). Caractere fiziologice generale ale bacteriilor Bacteriile se caracterizeaz prin complexitate metabolic, cu o mare capacitate de adaptare, rspndire pe cele mai diverse medii, ca urmare a producerii de enzime care le permite utilizarea n nutriie a compuilor organici macromoleculari (protide, poliglucide, lipide). n raport cu temperatura, bacteriile se dezvolt ntr-un domeniu larg, ntre 10C i 90C; majoritatea bacteriilor ageni de alterare a alimentelor sunt bacterii mezofile i dau alterri la temperatura camerei (bacterii de putrefacie). Bacteriile n form vegetativ sunt inactivate pe cale termic la temperaturi de pasteurizare, iar sub form de endospori, la temperaturi de sterilizare. n raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), care cresc n semiaerobioz (ex. bacterii lactice), dar un grup restrns de bacterii sunt adaptate s creasc n strict anaerobioz (ex. genul Clostridium). Bacteriile se pot dezvolta n domeniul de pH1-11 cu zone optime la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacie. Clasificarea general a bacteriilor Pentru identificarea unei specii sunt uneori necesare 40 pn la 100 de teste. Criteriul de baz afinitatea tinctorial; familia ca unitate taxonomic conine acelai tip de bacterii: Gram pozitive sau Gram negative. Criterii fiziologice: teste de asimilare sau fermentare a glucidelor, relaia fa de oxigen, temperatur, pH, rezisten la inhibitori .a. Clasificarea de baz Bergey (1952) bacteriile sunt grupate n 10 ordine i 47 familii clasificare reluat n 1984 dup criterii morfologice n 33 seciuni. Regnul PROCARIOTAE dou diviziuni: - SCOTOBACTERIA bacterii care folosesc pentru cretere i multiplicare energia rezultat din reacii chimice: o clasa BACTERIA

22

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE o clasa ACTINOMYCES o clasa MOLICUTES - PHOTOBACTERIA bacterii ce conin pigmeni celulari similari clorofilei i care pot folosi energia luminoas n procese de biosintez celular Clasa BACTERIA Ordinul PSEUDOMONADALES bacterii Gram negative cu habitat n sol i ape, aerobe, nesporulate. Familia Pseudomonadaceae genuri: - Pseudomonas bastonae tipice, rspndite pe produse vegetale, carne, pui; dau alterarea produselor refrigerate - Acetobacter bacterii acetice, produc oxidarea alcoolului etilic la fabricarea acidului acetic de fermentaie - Xanthomonas dau alterri ale legumelor, produc un polimer xanthanul - Zymomonas bacterii care pot produce fermentarea glucidelor cu formarea de alcool; sunt folosite la obinerea alcoolului carburant din materii celulozice. Familia Nitrobacteriaceae, cu genurile Nitrobacter i Nitrosomonas care produc oxidarea compuilor cu azot rezultai din putrefacie, cu transformarea azotului amoniacal n azotii i azotai, form asimilabil de ctre plante. Familia Thiobacteriaceae produc oxidarea compuilor cu sulf. Bacterii din genul Thiobacillus ageni ai coroziunii biologice. Familia Spirillaceae produc degradarea celulozei n condiii aerobe. Bacterii ale genului Cellulomonas prelucrarea deeurilor de hrtie pentru obinerea de protein bacterian folosit n scop furajer. Ordinul EUBACTERIALES bacterii propriu-zise, foarte rspndite ce cuprind bacterii n form de coccus, bacterium i forme derivate prin sciziune Familia Achromobacteriaceae bacterii nesporulate Gram negative, produc putrefacia: - g. Achromobacter produc prin degradarea proteinelor amine biogene toxice, sunt bacterii aerobe, produc alterarea produselor refrigerate - g. Alcaligenes sunt ntlnite n lapte, carne, pui, pete i materii fecale - g. Flavobacterium se prezint sub form de bastonae, produc un pigment galben-rou i alterarea produselor la refrigerare. Familia Azotobacteriaceae bacterii care folosesc azotul atmosferic n nutriie, au rol n circuitul natural al azotului i pentru obinerea de ngrminte biologice Azotobacter chroococcum Familia Bacillaceae bacterii sub form de bastonae, Gram pozitive, productoare de endospori: - g. Bacillus 25 specii bacterii de putrefacie aerobe,anaerobe; unele specii selecionate se folosesc pentru obinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucanaze - g. Clostridium 93 specii bacterii de putrefacie anaerobe, productoare de toxine, bacterii butirice, bacterii productoare de solveni - familia Enterobacteriaceae bacterii Gram negative, nesporulate, aerobe/facultativ anaerobe, patogene/facultativ, cu habitatul n tractul digestiv - g. Escherichia bacterii de putrefacie, facultativ patogene (ageni ai gastroenteritelor) se pot nmuli n produse alimentare, pot produce toxine

23

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE E.coli indicator sanitar pentru verificarea condiiilor de igien la fabricarea produselor alimentare - g. Enterobacter face parte din microflora intestinal - g. Proteus bacterii de putrefacie, mobile, aerobe, produc alterarea crnii, a oulor pstrate la temperatura camerei - g. Shigella bacterii enteropatogene ( agentul dizenteriei) - familia Lactobacillaceae bacterii lactice Gram pozitive, nesporulate, facultativ anaerobe, sub form de bacili (bastonae subiri sau sub forme derivate de la coccus. - g. Streptococcus cuprinde bacterii sub form de streptococi. O parte din speciile genului au trecut n g. Lactococcus, folosite drept culturi starter n industria laptelui - g. Lactobacillus bacterii lactice acidotolerante, folosite n industria laptelui i pentru conservarea prin murare a produselor vegetale - g. Pediococcus bacterii lactice sub form de tetrade. Pot produce acrirea berii - g. Leuconostoc bacterii lactice heterofermentative, ageni de alterare a sucurilor, siropurilor de zahr .a. Pot produce biosinteza dextranului Familia Micrococcaceae bacterii Gram pozitive cu forma coccus sau forme derivate prin sciziune - g. Micrococcus bacterii aerobe/anaerobe,de putrefacie - g. Sarcina bacterii aerobe de putrefacie - g. Staphylococcus bacterii facultativ patogene; produc enterotoxine i sunt ageni ai intoxicaiilor alimentare Familia Propionibacteriaceae bacterii nesporulate Gram pozitive, produc fermentaia propionic. - g. Propionibacterium bacterii folosite la fabricarea brnzeturilor cu past tare i desen pentru obinerea vitaminei B12. CLASA ACTINOMYCES Ordinul ACTINOMYCETALES bacterii filamentoase, Gram pozitive, saprofite sau facultativ patogene, folosite industrial pentru obinerea de substane biologic active Familia Mycobacteriaceae bacterii patogene Mycobacterium tuberculosis (agentul tuberculozei) i Mycobacterium leprae Familia Actinomycetaceae bacterii patogene pentru animale i plante. Au rol n formarea humusului i la nchiderea la culoarea solului. Familia Streptomycetaceae bacterii filamentoase: - g. Streptomyces numeroase specii sunt folosite pentru obinerea de antibiotice (tetracicline,streptomicina, cloramfenicol etc.) sau pentru enzime (glucozizomeraze). Ordinul RICKETSIALES cuprinde bacterii obligat parazite ale insectelor, transmisibile prin nepturi la animale i om. - g. Ricketsia cu sp. R. prowazecki agent al tifosului eczantematic - g. Coxiella bacterii patogene, produc febra Q hemoragic. C. bruneti se poate transmite prin lapte

24

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

3. NUTRIIA MICROORGANISMELOR
Nutriia este un proces fiziologic complex prin care microorganismele i procur elementele necesare i energia pentru biosinteza compuilor celulari, pentru cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Procesul de nutriie se desfoar n cadrul metabolismului celular prin reacii de degradare a compuilor macromoleculari n compui cu mas molecular redus ce pot fi transportai n interiorul celulei, reacii exergonice ce au loc n cadrul catabolismului celular. Concomitent cu reaciile de catabolism, folosind compui simpli i energie, celula vie sintetizeaz compui celulari eseniali pentru cretere, n cadrul anabolismului. Viaa celulei microbiene este posibil att timp ct cele dou procese se desfoar concomitent. Celula bacterian poate utiliza ntre 300-600 tipuri de molecule diferite din care aproximativ 50% sunt reprezentate de molecula de ap i ioni. Se apreciaz c fr a lua n calcul moleculele de ap celula de drojdie poate utiliza pn la 500 molecule mici i peste 4000 de macromolecule. Microorganismele ntlnite n industria alimentar sunt microorganisme chimiosintetizante i i obin energia prin degradarea compuilor organici cu eliberarea energiei poteniale a substratului nutritiv pe care aceasta se dezvolt dnd de cele mai multe ori alterarea specific a acestuia. Prin substrat nutritiv se nelege acel mediu care conine ap, surse de energie (de natur glucidic), surse asimilabile de azot, sruri minerale i facultativ factori de cretere. 3.1. TIPURI NUTRIIONALE I SURSE NUTRITIVE Microorganismele care pot folosi CO2 ca surs unic sau principal de carbon sun numite autotrofe spre deosebire de cele heterotrofe care folosesc ca surs de carbon moleculele organice preformate de la alte organisme. Ca rezultat al adaptrii microorganismelor la diferite condiii de mediu ambiant , n funcie de sursele accesibile, acestea pot aparine la 4 tipuri nutriionale: - chemoorganotrofe heterotrofe i obin energia pe cale chimic, prin procese de oxidare a compuilor organici i procur oxigenul i hidrogenul din compui organici i anorganici (fungi i bacterii); - fotolitotrofe autrotrofe (alge, bacterii din ape) folosesc energia luminoase n procese de biosintez i folosesc sursa de carbon, hidrogen i oxigen din compui anorganici; - fotolitotrofe heterotrofe folosesc energia luminoas iar ca surs major de carbon, CO2 din aer (bacterii sulfuroase); - chimiolitotrofe autotrofe (sulfobacterii, ferobacterii) i obin energia pe cale chimic, iar ca surs de carbon i hidrogen servesc compuii anorganici. Microorganismele cu rol n industria alimentar (drojdii, mucegaiuri, i bacterii aparin primului tip nutriional. Fiind adaptate s se dezvolte prin asimilarea carbonului din materie organic sunt cunoscute ca ageni selecionai pentru dirijarea proceselor fermentative industriale, ca ageni de alterare sau patogeni . n primul tip nutriional al microorganismelor organotrofe se disting urmtoarele subgrupe: - microorganisme saproorganotrofe (saprofite) se dezvolt folosind ca surs de carbon i energie, materia organic nevie. n aceast categorie intr

25

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE majoritatea microorganismelor cu aplicaii industriale, dar i bacteriile de putrefacie, microorganismele care se dezvolt pe alimente; - microorganisme comensale se dezvolt la suprafaa sau interiorul organismelor vii (plante sau animale) beneficiind de aceast asociere i hrnindu-se cu substane ce rezult n mod natural din activitatea metabolic a acestora. Se pot exemplifica microorganisme din microbiota epifit a plantelor, a pielii, din microbiota intestinal; - microorganismele patogene sau parazite pot fi strict patogene fiind specializate s se hrneasc i s triasc parazitnd celula vie; - microorganismele potenial patogene pot s creasc pe produse alimentare bogate n nutrieni i pot n anumite condiii s elaboreze toxine, ns prin ngerarea alimentului contaminat se produc stri de toxiinfecii alimentare sau toxicoze. Surse de nutriie preferate de microorganismele organotrofe Surse de carbon Nu exist nici o surs de carbon care s nu fie utilizat pe cale microbian. Exist microorganisme care pot utiliza foarte mult sursa de carbon, exemplu Pseudomonas cepacia care pot utiliza peste 100 surse diferite de carbon, alte bacterii, de exemplu din genul Letospira folosesc ca surs principal de C i energie numai acizii grai cu numr mare de C n molecul. Dintre sursele de C naturale ntlnite n materii prime alimentare sau utilizate n compoziia mediilor de cultur sunt preferate urmtoarele: - poliglucide: amidon, celuloz, substane pectice, care pot fi folosite n special de ctre bacterii i microorganisme productoare de enzime specifice extracelulare; - monoglucide (hexoze, pentoze), diglucide, reprezint att sursa de carbon ct i de energie pentru toate microorganismele i sursa de baz n nutriia drojdiilor; - acizi organici (acid lactic, malic, acetic) pot fi o surs de C pentru microorganisme i unele drojdii; - alcoolii sunt utilizai de ctre drojdii oxidative (g. Candida, g. Pichia) i de bacterii (g. Acetobacter). Deoarece carbonul reprezint max. 50% din substana uscat a celulei la alctuirea mediilor de cultur se calculeaz cantitatea de nutrient ce trebuie adugat (n funcie de masa molecular i de coninutul n carbon) pentru obinerea unei cantiti corespunztoare de biomas. Nutrieni cu N,P,S Pentru cretere, microorganismele necesit cantiti mari de azot, fosfor i sulf, iar organotrofele le pot procura fie din sursele organice cu carbon, fie din compuii anorganici. Se tie c azotul (10-14% din substana uscat a celulei) este necesar pentru sinteza de aminoacizi, purine, puridine, unele lipide, coenzime. Multe microorganisme pot folosi azotul din aminoacizi i amoniac prin ncorporarea direct, cu ajutorul unor enzime. Unele bacterii pot reduce i asimila azotul atmosferic folosind un sistem de nitrogenaze i au un rol vital n asigurarea circuitului natural al azotului. Proteinele pot fi folosite n nutriie numai de ctre microorganismele ce produc proteaze extracelulare, respectiv bacterii - ageni cu putrefacie i mucegaiuri - ageni de putrezire. Se mai pot folosi n mediile de cultur a drojdiilor - sulfatul de amoniu i

26

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ureea. Ali compui cum ar fi nitraii sunt asimilai de ctre mucegaiuri i bacterii, nitriii numai de ctre bacterii (g. Nitrosomonas) i cu efect toxic pentru drojdii (nmulirea este oprit la concentraii de 200 mg nitrai /dm3). Nutriia mineral Pentru procurarea elementelor minore, sunt preferate de ctre microorganisme srurile acestora n urmtoarea succesiune: fosfai, sulfai, azotai, carbonai. Efectul pe care l are adugarea diferitelor substane minerale asupra creterii poate fi diferit prin indicele de utilitate specific, ce reprezint raportul dintre biomasa format pe un mediu de cultur complet i cea rezultat n mediul carenat n substana /elementul respectiv. Factorii de cretere Factorii de cretere sunt substanele organice ce sunt eseniale pentru creterea microbian i nu pot fi sintetizate de microorganismul respectiv. Conform exigenelor nutritive ale microorganismelor ncadrate n primul tip de nutriie se poate stabili o anumit succesiune; cele mai pretenioase din punct de vedere nutritiv sunt bacteriile gram pozitive urmate de bacterii Gram-negative i respectiv drojdii i mucegaiuri. Factorii de cretere ca structur si funcie metabolic intr in urmtoarele 3 categorii: - aminoacizii sunt necesari pentru sinteza de proteine / enzime; - purine si pirimidine , pentru sinteza acizilor nucleici; - vitamine, care functioneaz ca grupari prostetice ale unor enzime sau cu funcie de coenzime. n funcie de natura microorganismelor necesarul de aminoacizi variaz ntre 0 si 18 aminoacizi. Dintre microorganismele din industria alimentar drojdiile din genul Saccharomyces necesit biotin si acid paraaminobenzoic bacteriile lactice ale genului genului Lactobacillus necesita acid folic, acid nicotinic, biotin, vitamina B, piridoxina, bacteriile acetice necesit acid p-aminobenzoic, iar Enteracoccus faecales are nevoie de 8 vitamine diferite pentru cretere. Exist i un grup restrns de substane denumite factori stimulatori de cretere care fr s fie indispensabile, prezena lor accelereaz ritmul de cretere celular. Cunoaterea condiiilor de cultur i a exigenelor de nutriie a fiecrui microorganism are o importan deosebit att n practica de laborator ct i la cultivarea industrial, deoarece permite reglarea activitii fiziologice fie n direcia obinerii de biomas, fie a unor produse de metabolism cu importan economic. 3.2. MODALITI DE TRANSPORT A NUTRIENILOR N CELULA MICROBIAN Pentru realizarea procesului de nutriie este obligatoriu ca nutrienii s ptrund n interiorul celulei pentru a fi metabolizai. Nutrienii solubili cu molecule mici pot ptrunde n celula microbian pe diferite ci. Una din cile cele mai frecvente este ptrunderea prin difuzie i anume prin: - difuzie pasiv este difuzia ce se realizeaz ca urmare a unui gradient de concentraie posibil cnd n exteriorul celulei concentraia nutrientului este superioar celui din interiorul celulei. Prin anumii pori ai membranei plasmatice nutrientul ptrunde n interior si este metabolizat.

27

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE difuzie facilitat se realizeaz ca urmare a prezenei n biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau n spaiul periplasmic. Permeaza recunoate i leag molecula solubil a apei schimbndu-i conformaia i o elibereaz in interiorul celulei. Apoi aceasta i reia poziia orientat spre exteriorul membranei plasmatice si este pregtit pentru a prelua o nou molecul. Acest proces poate avea loc atta timp ct concentraia moleculelor nutrient este mai mare n exteriorul celulei fa de cea intern. Difuzia facilitat este mai important la celulele de tip eucariot pentru transportul aminoacizilor si al glucidelor, n timp ce la procariote servete pentru transportul glicerolului. Microorganismele adesea se ntlnesc in habitate n care coninutul n nutrieni este foarte redus nct pentru cretere este important transportul i concentrarea lor in celul. n aceasta situaie, transportul se face contra gradientului normal de concentraie, cu consum de energie, prin transport activ i translocaie de grup. Transportul activ transportul n celul este asigurat chiar n absena gradientului de concentraie i se realizeaz cu consum de energie. Transportul se activeaz ca urmare a energiei eliberate prin transformare ATP n ADP. Translocaia de grup este un transport activ ntlnit la drojdii i mucegaiuri n care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze, care permit ptrunderea glucidelor prin membrane sub forma esterilor fosforici. Celulele pot face schimb cu mediul exterior nu numai cu ioni i glucide ci i cu glucide compui macromoleculari. Astfel, bacteriile de exemplu pot secreta proteine printr-un proces de exocitoz. Este posibil si ptrunderea unor astfel de macromolecule in interiorul celulei prin procese de endocitoz. 3.3. MEDII DE CULTUR Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, cu rol de aliment, care trebuie s asigure microorganismului ce urmeaz a fi cultivat, cantitatea necesara de ap, surse de carbon, azot, substane minerale, factori de cretere, substane care s i furnizeze cantitatea de energie ct i toate elementele folosite de celul n procese de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - s corespund din punct de vedere nutritiv; - s aib o concentraie a substanei dizolvate n mediu care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei; - s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n urma creterii culturii microbiene; - s aib un anumit pH sau rH; - s fie steril astfel nct s nu dezvolte numai celule introduse prin inocul. n practica de laborator mediile de cultur se folosesc pentru izolarea din medii naturale a diferitelor microorganisme pentru obinerea de culturi pure, pentru cultivarea acestora n scopul obinerii de biomas sau pentru ntreinerea culturilor pure selecionate. n scop industrial mediile de cultur se folosesc pentru obinerea de celule sau a compuilor rezultai prin activitatea microorganismelor selecionate. n funcie de destinaia lor, mediile de cultur se difereniaz astfel:

28

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE a. medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui numr mare de specii i genuri deoarece includ n compoziia lor substane nutritive diversificate. Dintre mediile de cultur generale folosite n practica laboratorului de microbiologie menionm: - bulionul de carne lichid sau gelozat (BCA); - mediul tripton - extract de drojdii - glucoz agar; - mustul de mal agar (MMA) pentru cultivarea drojdiilor i mucegaiurilor; b. medii de cultur selective sunt medii cu o compoziie chimic definit care permit dezvoltarea unui grup restrns de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii conin pe lng substane nutritive i substane cu efect inhibitor asupra altor microorganisme nsoitoare ntlnite n microbiota din care se face izolarea culturii ce dorim s o selecionm. Un mediu selectiv folosit la determinarea bacteriilor coliforme este BLBV (bulion bil lactoz verde briliant) n care srurile biliare inhib alte bacterii, n timp ce coliformii sunt adaptai. Numrul mediilor selective este foarte mare i permit izolarea unor specii de interes industrial sau se folosesc pentru identificarea, determinarea microorganismelor contaminante n produse alimentare. c. medii de cultur de difereniere aceste medii permit separarea speciilor n funcie de anumite caractere biochimice, atunci cnd acestea au fost selectate dintr-o microbiot eterogen. d. medii de mbogire (fortifiate) sunt destinate separrii i cultivrii unor microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv i care se afl n numr redus n produsul analizat din punct de vedre microbiologic. n funcie de compoziie i provenien, mediile de cultur pot fi medii naturale i medii sintetice. a)mediile naturale sunt cele mai utilizate deoarece reproduc condiiile n care se dezvolt microorganismele. Mediile naturale de origine vegetal sunt sucuri de fructe, de legume, mustul de mal, legume fierte/ terciute, fructe, infuzii de plante. Ca medii de origine animal se folosesc dup sterilizare, laptele, snge (pentru bacterii facultativ patogene), zerul, carnea, bulionul de carne, ficat, ou. n condiii de laborator se folosesc att medii lichide, n special pentru cultivarea microorganismelor facultativ anaerobe, pentru studiul proceselor fermentative, medii solide pine, cartofi felii, .a. i frecvent medii solidificate obinute prin adugarea n mediile lichide a unor ageni de solidificare. Pentru solidificarea mediilor de cultur se folosete: - agar agarul (geloza) un diglucid obinut din alge ale genului Gelidium avnd n structur molecule de galactoz i acid D galacturonic legate prin legturi 1,2,1,3 glicozidice. n stare purificat se prezint sub form de pulbere sau fibre si se adaug in cantitate de 0,5 2 % mediu lichid. - gelatina agent de solidificare de natura proteic, extras din esuturi organice. Se folosete in cantitate de 12 15 g% . n afara mediilor descrise i care se pot prepara in condiii de laborator, numeroase firme sunt specializate n fabricarea de medii de cultur ce pot fi livrate sub diverse forme. Astfel sunt medii gata preparate sau sub form de pulberi ce pot fi reconstituite conform reetei i au un termen mare de valabilitate. Medii fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau pentru obinerea de produi de metabolism cu valoare economic.

29

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Diversitatea mediilor de cultur este datorat si capacitaii de adaptare a numeroase microorganisme ntlnite n habitaturile naturale ct i de faptul c prin modificarea compoziiei mediilor de cultur se pot obine randamente superioare n produi de metabolism microbian cu valoare economic. Mediile de cultur sunt utilizate frecvent n tehnici microbiologice de laborator, pentru izolarea, cultivarea i ntreinerea culturilor pure i pentru controlul microbiologic al produselor alimentare.

4. METODE DE IZOLARE I OBINERE A CULTURILOR PURE

Cultura pur reprezint o biomas de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat. Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti formatoare de colonii, atunci cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid. Puritatea unei culturi se poate obine i prin repicare, deci prin transfer de celule din eprubeta ce conine cultura pur, n alt vas cu mediu de cultur steril. n practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza separarea unei singure celule din microbiota eterogen a mediilor naturale. Metodele cunoscute i practicate n laborator n scopul izolrii culturilor pure pot fi clasificate n metode fizico-mecanice i metode biologice. 4.1.METODE FIZICE DE IZOLARE I OBINERE A CULTURILOR PURE Metode prin rspndire se folosesc pe scar larg, fiind uor de executat, avnd ca principiu rspndirea celulelor din medii naturale unde acestea se afl n numr mare, prin diluare n medii lichide sau prin diseminare mecanic pe suprafaa mediilor sterile. Metode scarificate. n placa Petri se repartizeaz un mediu de cultur adecvat, de exemplu MMA/BCA i dup solidificarea mediului, cu firul metalic se recolteaz celule din mediul natural i se execut trasri pe suprafaa mediului, astfel nct diversele celule rmn distanate ntre ele. Prin termostatare 48-72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se face repicare ntr-o eprubet cu mediu solid nclinat i astfel se obine o cultur pur. Metoda n strii este similar, n schimb drept suprafa de rspndire se folosete mediul nclinat din 2-3 eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, n mod succesiv. Aceste metode se folosesc i n cazul n care o cultur pur este contaminat cu microorganisme strine n perioada de pstrare a culturii i aceasta trebuie s fie salvat. Metoda cultural Koch este folosit n special pentru izolarea de drojdii. Ca mediu de rspndire se folosete MMA repartizat n 3 eprubete, fluidificat i meninut la 40C. Din mediul natural, de exemplu un must n fermentaie, se recolteaz o ans care se introduce succesiv n cele 3 eprubete, cu agitare, care s asigure desprinderea celulelor. Dup inoculare i uniformizare, coninutul fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri prin solidificare celulele rmn fixate n gel i prin multiplicare vor forma colonii izolate. n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial n placa a 2-a sau a 3-a coloniile sunt suficient de distanate (se prefer o distan de circa 2 cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvat a culturii pure, prin repicare n eprubet cu MMA.

30

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Metode prin diluare. n prima etap, din mediul natural se execut diluii decimale n ser fiziologic steril, astfel nct numrul de celule ntr-o micropictur din ultima diluie s fie redus. Metoda Lindner se folosete pentru izolarea de drojdii fermentative. Din diluia convenabil, cu ajutorul unei penie topografice se plaseaz aprox. 9 picturi pe suprafaa unei lamele sterile. Lamela se amplaseaz cu picturile n jos pe o lam cu excavaie i se studiaz la microscop fiecare pictur. Se noteaz cu un marker conturul picturii n care se afl o singur celul. Se desprinde lamela i cu ajutorul unei benzi sterile de hrtie se absoarbe pictura notat. Odat cu lichidul se adsoarbe i celula de izolat, apoi banda se introduce ntr-o eprubet cu mult lichid. Celula va da prin reproducere o cultur pur. Dei este meticuloas, metoda propus de Lindner este o metod precis, deoarece se face sub control microscopic. Metoda Naumov este folosit pentru izolarea culturilor pure de mucegaiuri. Dintr-o diluie convenabil se aplic distanat micropicturi peste care se adaug picturi de mediu MMA fluidificat (42C) i dup 3-8 zile se selecteaz din pictura cu o singur colonie cultura pur dorit. O metod simplificat pentru separarea sporilor fungici const n inundarea unei plci cu MMA cu 1-2 cm3 din diluia convenabil. Sporii care au rmas ataai de mediu vor da colonii izolate. n general mucegaiurile nu ridic probleme la izolare deoarece cresc sub form de colonii mari pe diverse alimente i pentru obinerea n cultur pur se face repicarea de spori situai n centrul coloniei. Metode de izolare cu ajutorul micromanipulatorului. Este o metod precis i se realizeaz cu ajutorul unui aparat prevzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecia celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene i este folosit n dirijarea proceselor de fuziunea protoplatilor, pentru conjugare etc. 4.2. METODE BIOLOGICE DE OBINERE A CULTURILOR PURE Metodele biologice sunt foarte diverse i se bazeaz pe proprieti fiziologice ale microorganismelor de izolat care s se diferenieze clar de cele ale microorganismelor nsoitoare din acelai biotop. Uneori prin aceste metode se face izolarea unui grup cu caractere taxonomice apropiate i apoi se face izolarea de culturi pure prin tehnici de rspndire sau prin folosirea mediilor selective. O metod biologic clasic este metoda Burri prin care se face separarea microorganismelor n funcie de necesarul de oxigen pentru cretere. Dintr-un mediu natural se face inocularea n BCA termostatat la 42C i dup uniformizare acesta se introduce ntr-un tub de sticl prevzut la un capt cu dop de cauciuc. Prin rcire celulele sunt imobilizate n gel i prin termostatare n funcie de accesul oxigenului din aer, n zona tubului prevzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta bacterii anaerobe, intermediar bacterii microaerofile, iar n stratul de mediu la care aerul a ptruns prin dopul de vat al tubului, bacterii aerobe. Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale pe baza termorezistenei deosebite a endosporilor. De exemplu, Bacillus subtilis se poate izola din infuzie de fn, deoarece endosporii rezist la fierbere, n timp ce alte bacterii sunt distruse i prin germinare trec n forme vegetative i care prin nmulire prin sciziune rmn asociate formnd n 24 ore un voal cutat. Numeroase metode de izolare se bazeaz pe introducerea n medii de cultur a unor substane chimice cu efect inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separat cultura dorit. De exemplu, prin introducerea de 0,02% actidion are loc

31

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE inhibarea dezvoltrii drojdiilor aflate n amestec cu bacterii. Metoda este folosit pentru izolarea unor bacterii ce pot produce contaminarea drojdiilor folosite sub form de culturi pure n industriile fermentative.

5. IMPORTANA PRACTIC A CULTURILOR PURE

Izolarea i obinerea culturilor pure, cunoaterea cineticii de cretere prezint o importan practic deosebit n urmtoarele domenii: 1. Identificarea, selecionarea i mbuntirea proprietilor de biosintez Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietilor morfologie i fiziologice, n scopul identificrii, caracterizrii i stabilirii domeniului de utilizare a culturii. Sub form de culturi pure microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce modificri genetice la nivelul acizilor nucleici, cu obinerea de culturi mutante, din rndul crora se face din nou selecia tulpinilor performante. 2. Obinerea culturilor starter n procese fermentative industriale Pornind de la cultura pur, n biotehnologii alimentare prin cultivarea n medii adecvate se obine cantitatea necesar de inocul/maia folosit drept cultur starter a procesului fermentativ. Inoculul reprezint un mediu nutritiv steril n care s-au nmulit celule aparinnd unei culturi pure, aflat n etapa final a creterii exponeniale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculat nct prin introducerea sa n mediul fermentativ steril, concentraia n celule s asigure declanarea rapid a procesului. n funcie de specificul biotehnologic este obligatorie asigurarea continuitii n transfer pentru aprovizionarea cu inocul activ, la perioada solicitat de producie. Utilizarea culturilor pure n biotehnologii alimentare (la fabricarea berii, alcoolului, vinului, produse lactate acide, panificaie etc.) permite obinerea unor produse cu calitate constant.

6. CURBA DE CRETERE A CULTURII MICROBIENE

Prin inocularea de celule, aparinnd unei culturi pure, ntr-un mediu nutritiv steril se poate stabili dinamica de cretere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau prin creterea numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului. n condiiile experimentale, dinamica multiplicrii microorganismelor este bine cunoscut. Procesul evolueaz ntr-o serie de faze succesive. Fig.3. Curba de multiplicare a microorganismelor 12-faza de repaos (faza lag); 1a-perioada de adaptare; a2-perioada de refacere; 23-faza exponenial; 34-faza staionar; 3b- perioada de spor de cretere negativ; b4-perioada de staionare propriu-zis; 5-faza final de declin.

32

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

1) Faza de laten, de cretere zero sau de lag reprezint etapa de timp cnd dup inoculare numrul celulelor rmne neschimbat, sau chiar scade, noile condiii de mediu implic latena induciei acelor enzime necesare pentru adaptarea la mediul nutritiv. Faza de laten apare deci ca o perioad de adaptare la condiiile noi de cultur, n care microorganismele viabile din inocul i acumuleaz n celul metabolii i sistemele necesare creterii, n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit condiiilor de mediu anterioare inoculrii. n cazul drojdiilor aceast faz poate dura 1-2 ore,durat ce depinde de compoziia mediului i capacitatea de reglare a metabolismului propriu. Faza lag se poate prelungi mult dac inoculul este obinut din culturi vechi sau care s-au pstrat n condiii de refrigerare. n schimb dac la inoculare s-a folosit o cultur viguroas, aflat n faza activ de cretere, n mediul cu o compoziie similar, faza lag este scurt sau poate s fie absent. 2) Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este caracterizat prin aceea c, dup o scurt perioad (cca. 2 ore) de accelerare a ritmului de cretere, n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit, acest ritm devine constant i caracteristic n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind minim. Perioada de echilibru poate fi meninut numai att ct nu intervin alterri importante, pe care creterea le poate provoca n compoziia mediului. De exemplu, numrul de celule de drojdie sau de bacterii i cantitatea de materie vie format crete temporar dup o progresie geometric cu raia 2. Celulele aflate n faza exponenial de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie. 3) Faza staionar (de maturare) n care numrul celulelor viabile este maxim i rmne constant o perioad de timp. De exemplu, celulele de drojdie nu mai nmuguresc, i mresc volumul i tind spre forma sferic, se rotunjesc. Celulele de microorganisme au n aceast faz caracteristicile morfologice cele mai tipice genului i speciei. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd urmrim pstrarea culturii pure, prin modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular. 4) Faza de declin se caracterizeaz printr-o scdere n progresie geometric n raport cu timpul a numrului de celule vii. Pe msur ce mediul devine mai puin favorabil, celulele vii nu se mai multiplic, dei activitatea lor mai continu un timp dup care mor i intr n autoliz. La sfritul acestei ultime faze se nregistreaz maximum absolut al numrului total de celule formate pe parcursul ntregii evoluii a culturii.

7. PROCEDEE DE CONSERVARE A CULTURILOR PURE

Sub form de culturi pure sunt pstrate microorganismele aflate n studiu i care prezint proprieti de biosintez remarcabile, culturi ntreinute i nregistrate n colecii autorizate de microorganisme, denumite micoteci. Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe prelungirea fazei staionare de cretere i evitarea etapei de declin, se cunosc urmtoarele: repicarea periodic prin transfer de celule din eprubeta cu cultura pur n care mediul nutritiv este epuizat, n eprubeta cu mediu nutritiv steril cu compoziie

33

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE similar. Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, compoziia mediului i temperatura de pstrare. n timp ce bacteriile lactice necesit repicri la intervale de 1-3 sptmni, drojdiile se pot pstra pe MMA 3-6 luni,iar bacteriile sporulate 612 luni. Mucegaiurile sunt rezistente la pstrare i chiar dup uscarea mediului, sporii se menin viabili ani de zile. Procedeul de repicare periodic necesit un mare volum de munc, prezint risc de contaminare i este greu de realizat atunci cnd numrul de culturi de ntreinut este mare; prelungirea intervalului ntre dou repicri prin scderea vitezei de metabolism a celulelor i deci evitarea strii de declin ce poate duce la pierderea culturii se poate realiza prin: o Meninerea culturilor la temperaturi sczute, n condiii de refrigerare sau congelare. Culturile de fungi pstrate la 5C se transfer anual, iar dac pstrarea se face la 16C la interval de 6 luni. o Privarea de oxigen. n absena oxigenului din aer,microorganismele aerobe trec n stare latent de via. Pentru drojdii i mucegaiuri, cultura dezvoltat n mediu solidificat (drept) se acoper cu un strat de ulei de parafin steril. Cnd celulele vii se acoper cu ulei de parafin (sterilizat n prealabil la 170C, 2 ore) procesele metabolice ale fungilor decurg de10 ori mai lent. o Reducerea umiditii mediului conduce la trecerea celulelor n stare de anabioz care poate fi meninut timp ndelungat fr a se produce modificri intracelulare, ireversibile. Bacteriile sporogene ale genului Bacillus se pot menine sub form de endospori prin antrenarea culturii n eprubete cu nisip steril i dup evaporarea apei sporii se menin viabili, adsorbii pe nisip, zeci de ani. Pstrarea culturilor n stare liofilizat. Este tehnica cea mai utilizat i avantajoas, deoarece prelungete cel mai mult intervalul de conservare a culturilor, fr s produc modificri ale proprietilor lor fiziologice. n cazul mucegaiurilor, o suspensie de spori n lapte degresat se congeleaz rapid la - 25C, apoi are loc uscarea n vacuum timp de trei ore n recipiente de sticl care se nchid ermetic i culturile se pot menine 10 ani. Spori aparinnd genului Aspergillus liofilizai i pstrai astfel la 7C i-au meninut viabilitatea timp de 23 ani. Bacteriile lactice sunt mai sensibile la pstrare comparativ cu fungii.

8. COLECII DE CULTURI
n lume se cunosc colecii de culturi care n marea lor majoritate cuprind culturi protejate prin brevete; dintre acestea colecia NRRL SUA cunoscut din 1975 cu acronym ARS cuprinde peste 1000 de tulpini n majoritatea lor de actinomicete i mucegaiuri, CBS Fungus Collection Olanda conine 19300 fungi etc. n cadrul Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos din Galai exist o micotec cu acronym MIUG ce include tulpini de drojdii, mucegaiuri, bacterii.

9. FACTORI DE CONTROL AI CRETERII MICROORGANISMELOR

34

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Celula microbian avnd o mas redus este puternic influenat de condiiile mediului ambiant i reacioneaz foarte diferit la diferii factori, fie prin adaptare sau n caz contrar, prin dispariie. Astfel creterea microbian este dependent de numeroi factori fizico-chimici i biologici ceea ce a condus n cursul evoluiei la adaptri specifice prin stabilirea de interrelaii ntre microorganisme i mediu. Pentru a nelege modul n care celula microbian reacioneaz la condiiile mediului ambiant, diferii factori au fost mprii n mod arbitrar n trei mari grupe, cu precizarea c, n condiii naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic: 1. Factori extrinseci sunt factori exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatur, umezeal relativ a aerului, concentraia de oxigen, radiaii, factori mecanici, factori chimici etc. 2. Factori intrinseci sunt factori dependeni de natura alimentului care influeneaz creterea i activitatea culturilor starter dar i natura alterrii specifice a produselor alimentare (compoziia chimic i concentraia n nutrieni, aw, pH, rH, structura anatomic, substane chimice etc.). 3. Factori implicii sunt factori biologici determinai de relaiile ce se pot stabili ntre diferitele grupe de microorganisme care alctuiesc microbiota alimentului respectiv. 9.1. INFLUENA FACTORILOR EXTRINSECI ASUPRA MICROORGANISMELOR 9.1.1. Temperatura Temperatura are o mare influen asupra proceselor fiziologice ale celulei microbiene deoarece stimuleaz sau inhib activitatea echipamentului lor enzimatic. n funcie de temperaturile posibile ale mediului natural i ca rezultat al adaptrii, diferitele specii de microorganisme prezint urmtoarele temperaturi: temperatura minim temperatura la care mai poate avea loc creterea, n schimb dac temperatura scade sub valoarea minim, creterea este oprit; temperatura optim temperatura la care rata specific de cretere este maxim; temperatura maxim - temperatura la care creterea este nc posibil dar prin depirea acesteia efectul devine letal. n funcie de domeniul specific de cretere, microorganismele se mpart n patru categorii: microorganisme psihrofile cuprinde specii care cresc bine la 0C, au o temperatur optim la 10-15Ci maxim la aproximativ 20C. Se consider c aproximativ 90% din microbiota apelor prezint temperaturi optime la aproximativ 5C. Din grupa bacteriilor psihrofile de putrefacie fac parte genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes. Microorganismele psihrofile prezint sisteme enzimatice active la temperaturi sczute, conin n membrana plasmatic o concentraie mai mare de acizi grai nesaturai (acid linoleic), ceea ce explic meninerea sa n stare semifluid la rece i degradarea la temperaturi mai mari de 30C; microorganisme psihrotrofe sunt facultativ psihrofile, au temperatura minim de cretere la 0C, cresc bine la 7C i produc prin pstrare la aceast temperatur, colonii vizibile sau turbiditate n medii lichide dup 7-10 zile de pstrare. Au temperatura optim ntre 20-30C i maxim la 35-40C. n acest grup sunt incluse bacterii din genurile Enterobacter, Vibrio, Listeria etc., drojdii din genul

35

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Candida, genul Rhodotorula i mucegaiuri, microorganisme ce pot da alterri ale alimentelor pstrate prin refrigerare; microorganisme mezofile reprezint grupul majoritar, cu temperaturi minime la 15-20C, temperaturi optime n intervalul 30-40C i maximum la temperaturi peste 45C. Cuprinde bacterii, drojdii, mucegaiuri, inclusiv microorganismele patogene pentru om/animale; microorganisme termofile sunt microorganisme adaptate s creasc la temperaturi mai mari de 45C; majoritatea au temperaturi optime la 55-65C i temperaturi maxime 90C. n cadrul grupului, se difereniaz microorganisme: o preferenial termofile (Tm = 25-28C; To = 45-55C; TM = 60-65C) din care fac parte bacterii lactice ale genului Lactobacillus , unii fungi; o obligat termofile (Tm = 37C; To = 50-60C; TM = 65-70C) din care fac parte specii ale genurilor Bacillus i Clostridium, actinomicete. Microorganismele termofile sunt folosite industrial pentru obinerea de produse lactate acide, a enzimelor termostabile, pentru purificarea apelor reziduale, ca bioindicatori pentru anumite tratamente termice. 9.1.2. Umiditatea Viaa microbian este posibil numai cnd n mediul nutritiv exist ap liber care particip ca solvent, ca mediu de reacie pentru enzimele celulare i pentru transportul bidirecional al produselor de metabolism. Dac coninutul de ap liber intracelular se reduce, celulele trec n stare de preanabioz, continuat cu anabioz, n care enzimele trec n stare inactivat iar metabolismul este mult redus. n atmosfer exist o umezeal relativ de 70-90% i prin pstrarea alimentelor, n timp, n funcie de temperatur i compoziia produsului are loc o absorbie a vaporilor de ap din aer, instalndu-se o stare de echilibru, cu creterea cantitii de ap liber i a indicelui de activitate al apei, aw. Acesta se poate calcula cu relaia: aw = P/P0 n care: P presiunea de vapori a apei din produs; P0 presiunea de vapori a apei pure. Microorganismele se pot dezvolta ntr-un domeniu larg de a w situat ntre valori de 0,62-0,99 i n funcie de adaptare n raport cu limitele de aw care le permit creterea se pot mpri n trei categorii: microorganisme xerofite aw = 0,62-0,75; din care fac parte mucegaiuri ale g. Xeromyces, g. Aspergillus, drojdii osmotolerante, bacterii halotolerante; microorganisme mezofite - aw = 0,75-0,85; cuprind majoritatea fungilor, bacterii; microorganisme hidrofite - aw = 0,85-0,99 sunt predominant bacteriile. Cunoaterea comportrii celulelor n raport cu umiditatea ca factor extrinsec ce condiioneaz cantitatea de ap liber accesibil pentru desfurarea proceselor vitale, se aplic la conservarea prin uscare a produselor alimentare. Dac acestea se pstreaz n condiii n care crete treptat umiditatea, primele microorganisme care se dezvolt aparin grupului xerofitelor. 10.1.3. Concentraia n oxigen

36

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Aerul atmosferic conine aproximativ 20% oxigen. Microorganismele necesit oxigen pentru biosinteza compuilor organici i pentru desfurarea proceselor de oxidoreducere biologice. n funcie de necesarul n oxigen procurat din aer se disting 5 tipuri de comportare difereniat a microorganismelor i anume: aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor, a mediilor solide. Oxigenul servete ca acceptor final de electroni transportai prin catena respiratorie. Celulele eucariote folosesc oxigenul n sinteza sterolilor i a acizilor grai nesaturai (drojdii, mucegaiuri); facultativ anaerobe, nu necesit oxigen pentru cretere dar cresc mai bine n prezena sa. Se dezvolt bine n medii lichide n care solubilitatea oxigenului din aer este mai redus (bacterii lactice etc.); anaerobe aerotolerante nu necesit oxigen pentru cretere i cresc la fel de bine n prezena sau absena sa (Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum); strict (obligat) anaerobe, nu tolereaz oxigenul i mor n prezena acestuia. Nu pot obine energie prin respiraie propriu-zis i folosesc fermentaia sau respiraia anaerob n acest scop (bacterii butirice, metanobaceterii etc.); microaerofile aparin microorganismele aerobe care necesit concentraii reduse de oxigen pentru cretere, respectiv 2-10%. 9.1.4. Energia radiant Lumea vie este bombardat de radiaii electromagnetice cu lungimi de und ntre 10-4la 106 nm; n acest domeniu microorganismele sunt influenate de urmtoarele radiaii: Radiaii ionizante (, , ) Au lungimi de und mai mici de 12 nm, o energie radiant intens ce acioneaz prin ionizare cu eliberarea de ioni,radicali liberi ce acioneaz prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea i formarea dublelor legturi, modificri n structur, polimerizri. n prezena oxigenului, aciunea radiaiilor ionizante este amplificat prin generarea de radicali OH- sunt intensificate procese de oxidare, denaturarea ADN-ului, ceea ce conduce la moartea celulei. Eficiena acestor radiaii depinde de forma i starea celulei; celulele cu forma coccus sunt mai rezistente dect formele bacilare, iar formele vegetative sunt mai sensibile dect n stare sporulat. Succesiunea n sensul creterii rezistenei la efectul distructiv al radiaiilor este urmtoarea: Bacterii Gram-negative > bacterii Gram pozitive > fungi > virusuri Dei efectul radiaiilor ionizante se manifest asupra tuturor microorganismelor, acestea au o radiosensibilitate diferit care se poate aprecia prin determinarea valorii D10 (adic doza absorbit care produce distrugerea a 90% din populaia iniial). Radiaii ultraviolete (10-400 nm) n condiii normale pe Terra nu ajung radiaii cu lungimi mai mici de 287 nm deoarece acestea sunt reinute de stratul de ozon protector cu o grosime de aproximativ 40 km. Acest lucru are o semnificaie deosebit deoarece radiaiile ultraviolete cu ntre 254-260 nm au efect letal sau mutagen asupra celulelor vii. Radiaiile ultraviolete n funcie de doz i starea microorganismelor au efect letal maxim la =254 nm i produc degradarea triptofanului cu formarea de compui

37

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE toxici ce conduc la moartea fiziologic a celulei expuse. Microorganismele pot s-i refac structura iniial prin fotoreactivare cnd n prezena luminii sunt activate enzimele care desfac dimerii timinei, sau la ntuneric cnd celula are capacitatea de a elimina poriunea denaturat. n practic, radiaiile se pot folosi pentru sterilizarea aerului i pentru obinerea de mutani valoroi performani prin produii lor de biosintez. Radiaiile luminoase (1-103 nm) Sunt utile bacteriilor din diviziunea Photobacteria. Microorganismele chimiosintetizante prefer s se dezvolte n ntuneric. Dintre acestea unele microorganisme pot produce pigmeni cu rol protector ceea ce le permite dezvoltarea n prezena luminii. Radiaii infraroii (>103nm) Acioneaz prin energie caloric i induc transformri ireversibile ale protidelor. Energia sonic Bioefectul ultrasunetelor asupra celulei microbiene este specific i complex depinznd de frecven, intensitate, durat, densitate de celule etc. Ultrasunetele cu frecven mare ( >>1000 KHz ) pot s acioneze producnd distrugerea fizic a celulei datorat fenomenului de cavitate ultrasonor i efectelor electrice/termice asociate. Datorit frecvenei mari pot apare rupturi la nivelul structurilor, apar germeni de cavitaie sub forma unor bule mici de gaz care n stadiu de comprimare rezist la presiuni mari, n faza de expansiune produc implozie determinnd distrugeri locale. La frecvene mici se observ efectul de stimulare al ultrasunetelor ca urmare a unor deplasri sau deformri ale unor organite intracelulare (lizozomi, mitocondrii) i modificri ale proprietilor plasmalemei cu influen asupra permeabilitii i vitezei de transport a nutrienilor. Ultrasunetele de joas frecven i intensitate stimuleaz procesul de nmugurire al drojdiei Saccharomyces cerevisiae ca rezultat al activizrii echipamentului enzimatic i a unui contact mai bun al suprafeelor celulelor cu nutrienii mediului. Ultrasunetele se pot folosi la sterilizarea apei, a saramurilor n industria preparatelor de carne sau pentru distrugerea pereilor celulari n scopul extragerii unor compui valoroi localizai intracelular. 9.1.5. Factori mecanici Dintre operaiile utilizate n tehnici de analiz microbiologic se aplic frecvent centrifugarea i filtrarea, n scopul separrii de celule din medii lichide. Centrifugarea Este folosit pentru separarea biomasei de drojdii din medii de cultur cnd se folosesc viteze de centrifugare de 4000- 6000 rot/min., iar pentru separarea celulelor bacteriene, viteze de 6000-12000 rot/min. Se mai aplic lichidelor ce conin un numr redus de celule, n vederea concentrrii lor n centrifugat i controlul microbiologic. Filtrarea Realizeaz reinerea mecanic a celulelor microbiene atunci cnd diametrele porilor materialului filtrant sunt mai mici dect dimensiunea acestora. Separarea prin filtrare se mai poate realiza prin adsorbie electrostatic atunci cnd materialul filtrant cu sarcin pozitiv reine bacteriile cu sarcin negativ. n practica de laborator se

38

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE folosete sterilizarea prin filtrarea mediilor de cultur lichide ce conin n compoziie compui termolabili (de exemplu vitamine). Filtrarea se poate aplica pentru determinarea numrului de bacterii din ap sau alte medii lichide cnd se face filtrarea unui volum determinat din proba de analizat prin membrane filtrante din acetat de celuloz, care rein celulele. Dup filtrare, membrana poate servi pentru numrarea direct a celulelor sau poate fi transferat pe suprafaa unui mediu nutritiv solidificat repartizat n plac i dup termostatare se numr coloniile dezvoltate. Agitarea. Se aplic la cultivarea microorganismelor n condiii de laborator pentru obinerea culturilor pe agitator sau la cultivarea submers n condiii industriale, deoarece asigur un mai bun contact ntre celule i mediul de nutriie i avantajeaz concomitent aerarea culturii. Rata de agitare la cultivarea submers n bioreactoare variaz cu volumul de mediu i natura microorganismului cultivat. Astfel pentru 1-20 m3 viteza de rotaie este de 120-180 rpm, iar la volume de 450 m3 poate fi de 60-120 rpm. 9.1.6. Factorii chimici Substanele chimice cunoscute prezint o mare diversitate de compoziie i se difereniaz n funcie de efectul pe care l prezint asupra celulelor microbiene i anume: efect stimulator, benefic n concentraii mici deoarece numeroase substane conin elemente majore sau minore ce intr n componena compuilor celulari; efect de stagnare a creterii (microbiostatic) ca rezultat al aciunii unor substane asupra enzimelor microbiene cu rol n metabolismul celulei vii; efect letal (microbicid) atunci cnd substana, n funcie de doz, conduce la modificri ireversibile i dau distrugerea fizic a celulei sau inactivarea enzimelor, asociat cu moartea fiziologic. Toxicitatea este caracteristica rezultat din manifestarea biologic a organismului n care a ptruns o substan toxic i este consecina a dou reacii i anume aciunea toxicului asupra celulei vii i aciunea celulei asupra toxicului. Din punct de vedere a toxicitii i a efectului produs de substanele chimice cu efect antimicrobian acestea pot fi mprite n patru grupe: substane chimioterapice substane care au efect negativ asupra microorganismelor patogene i nu sunt toxice pentru organismul uman la dozele la care sunt aplicate n terapeutic. Substane ca antibiotice, sulfamide etc. acioneaz prin activarea enzimelor litice din lizozomi, inhib sinteza peretelui celular, distrugerea permeabilitii membranei plasmatice sau interfereaz dereglnd biosinteza polimerazelor cu rol n sinteza acizilor nucleici; substane antiseptice cuprinde un grup mare de substane cu rol n combaterea infeciei. n medicin, prin antiseptici se neleg substanele toxice pe cale oral pentru organismul uman i care sunt folosite pentru uz extern mpotriva patogenilor de infecie (stafilococi, streptococi patogeni etc.); substane conservante sunt substane netoxice pentru organismul uman i n concentraii mici au efect microbiostatic, folosii n industria alimentar pentru conservarea prelungit a calitii produselor alimentare. Numrul conservanilor utilizai n industria alimentar este limitat de OMS i FAO n funcie de condiiile pe care acestea trebuie s le ndeplineasc i anume: s prezinte un spectru larg de aciune, s aib putere microbiostatic la concentraii mici, s fie stabil, solubil, netoxic, economic. Conservanii determin o ncetinire a creterii microbiene

39

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE acionnd prin inactivarea unor enzime specifice, blocarea unor ci metabolice, prelungind astfel intervalul de timp pn se produce alterarea microbian a produsului; substane dezinfectante sunt substane cu efect microbicid, toxice pentru organismul animal i sunt folosite n industria alimentar pentru dezinfecia utilajelor, a spaiilor de producie, ambalajelor, pentru unele materii prime. Operaia de dezinfecie are loc n mai multe etape: curirea cu ndeprtarea materiei organice de pe suprafaa ce trebuie dezinfectat; aplicarea soluiei dezinfectante ce realizeaz decontaminarea i sanitizarea. Prin decontaminare are loc distrugerea microorganismelor patogene, iar prin sanitizare, reducerea microorganismelor organotrofe la limite la care activitatea lor nu prezint risc; cltirea cu ap potabil pentru ndeprtarea substanei toxice. Modul de aciune a substanelor chimice folosite n industria alimentar n funcie de natura substanei i a microorganismelor, efectul substanelor chimice poate fi: efect microbiostatic ce se manifest prin reducerea vitezei de desfurare a metabolismului i oprirea nmulirii celulelor; efect microbicid (germicid) ce este produs de ctre dezinfectani ce pot aciona, n general, prin: o denaturarea ireversibil a proteinelor i enzimelor produse de acizi anorganici, baze, sruri; o blocarea gruprilor amino din structura protidelor, aminoacizilor cu formarea de puni metilenice i inactivarea de enzime aldehida formic; o permeabilizarea nveliurilor celulare, cu pierderea compuilor intracelulari i ptrunderea substanei toxice n cazul folosirii de spunuri, detergeni, sruri cuaternare de amoniu etc. Factori care influeneaz efectul antimicrobian al substanelor chimice Efectul unei substane chimice este condiionat de numeroi factori, biologici, dependeni de substana chimic i de mediul n care aceasta acioneaz. Factori biologici. Efectul unei substane chimice este dependent de natura microorganismelor, starea n care se afl i numrul de microorganisme prezente n mediul ce urmeaz a fi conservat. Microorganismele sunt mai sensibile la aciunea substanei chimice atunci cnd se afl n stare vegetativ i mai rezistente n starea lor sporulat. Celulele tinere, cu un coninut mai mare de ap liber sunt mai sensibile dect celulele mature. Eficiena este dependent de numrul de microorganisme n momentul utilizrii, deoarece fiecare celul absoarbe i reine o cantitate din doza existent. Astfel prin adugarea unei doze constante, eficiena acesteia se reduce cnd ncrcarea microbian este mare. Un factor biologic cu implicaii practice este fenomenul de adaptare al microorganismelor la adaosul de substane chimice. n practic se utilizeaz culturi starter adaptate la doze crescute din substana la care alte microorganisme sunt sensibile. Un exemplu ar fi folosirea de dioxid de sulf n fermentarea mustului de struguri cu drojdii de cultur sulfitorezistente. Pentru a evita adaptarea microorganismelor n practic se recomand alternarea substanelor dezinfectante atunci cnd se constat o reducere a eficienei.

40

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Factori fizico-chimici. Fiecare substan chimic acceptat n industria alimentar se caracterizeaz prin: spectrul de aciune reflect efectul specific sau generalizat. Astfel pentru conservani acesta poate fi general (fungistatic) sau specific: levuristatic, bacteriostatic, n timp ce pentru dezinfectani efectul poate fi: microbicid (general), bactericid, virulicid, fungicid; puterea antiseptic apreciaz efectul substanei chimice n raport cu o substan etalon stabilindu-se astfel o scar de apreciere. Ca substan etalon se folosete fenolul, cu stabilirea coeficientului fenolic. Puterea antiseptic este dependent de aciunea temperaturii i anume cu creterea temperaturii cu 10 grade a soluiei dezinfectante puterea crete de 20 ori; de aceea n industria alimentar dezinfecia se face cu soluii la temperaturi de 60-70C cnd eficiena este maxim. Factori dependeni de mediu. Eficiena substanei chimice depinde de solubilitate i de factorii care o influeneaz. Substanele chimice nu trebuie s reacioneze cu componentele mediului. Multe substane cu efect antimicrobian nu pot fi folosite ca urmare a faptului c reacioneaz cu protidele. De exemplu, clorul i hipocloriii i reduc efectul antiseptic dac se introduc n ape cu grad ridicat de impurificare. Eficiena substanelor conservante poate crete ca urmare a unui efect de sinergism, efect cooperant ce permite utilizarea n amestec a mai multor substane n concentraii mai mici dect cele necesare pentru a avea aceeai eficien, la folosirea lor separat. 9.2. INFLUENA FACTORILOR INTRINSECI ASUPRA MICROORGANISMELOR Factorii intrinseci se refer la diferite componente i structur a produselor alimentare care influeneaz activitatea microorganismelor prezente pe/n produs. n funcie de prezena concomitent a mai multor factori, din totalul microorganismelor ce pot contamina produsul este favorizat activitatea unui numr restrns, de obicei 1-4 specii care vor produce i alterarea sa specific. Produsele alimentare au o compoziie chimic foarte diversificat i un grad de ncrcare cu microorganisme foarte diferit, ce depinde de acela al materiilor prime i auxiliare, de factorii extrinseci ce intervin la prelucrare i pstrare. Dintre factorii intrinseci, dependeni de alimentul care va reprezenta substratul pentru activitatea microorganismelor (adugate prin culturile starter sau ocazional contaminante), mai importani sunt: 9.2.1.Compoziia chimic a alimentelor Reprezint un factor important deoarece microorganismele necesit pentru cretere surse de carbon, azot, substane minerale, factori de cretere i ap disponibil. Cu ct alimentul este mai complex cu att asigur condiii favorabile pentru creterea mai rapid, a unui numr mare de microorganisme i este mai alterabil. Produsele alimentare lichide se altereaz mai rapid dect cele solide pentru c celulele microbiene vin n contact direct cu nutrienii solubili. Produsele vegetale (fructe, legume) cu un pH acid i lipsite de vitamine din grupul B sunt alterate preferenial de ctre mucegaiuri care nu necesit factori de cretere i care produc enzime ce pot hidroliza poliglucidele din nveliul lor protector. Produsele bogate n glucide simple sunt de obicei fermentate cu formare de alcooli, acizi, nct prin scderea de pH este inhibat activitatea bacteriilor de putrefacie care necesit pentru dezvoltare pH neutru. Carnea ce conine cantiti importante de substane azotate avnd un pH apropiat de neutru va favoriza dezvoltarea bacteriilor de

41

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE putrefacie ce pot folosi protide ca surs de azot. Alimentele ce conin lipide vor fi alterate preferenial de microorganisme productoare de lipaze: Pseudomonas, Bacillus, Candida, Geotrichum, Aspergillus, Rhizopus etc. 9.2.2.Structura anatomic Influeneaz activitatea microbian ca urmare a meninerii la distan a microorganismelor de nutrieni accesibili. Astfel oul se altereaz greu, deoarece coaja poroas i membrana mpiedic ptrunderea unor microorganisme. Seminele oleaginoase sau ale cerealelor prezint un nveli celulozic protector ce nu poate fi degradat dect de microorganisme celulozolitice. Prin absorbia de ap, acestea sufer mucegirea deoarece mucegaiurile au condiii favorizante. La fructele cu nveli ceros, greu penetrabil, alterarea intervine n zone unde se produc leziuni mecanice, nepturi de insecte etc. 10.2.3. Valoarea de pH Este o proprietate inerent a unor produse naturale ce conin cantiti ridicate de acizi organici sau dobndesc aciditate prin procese fermentative dirijate (produse conservate prin murare). Microorganismele se dezvolt n limite largi de pH (ntre 1,5-11). n acest interval microorganismele acidotolerante drojdii, mucegaiuri, bacterii lactice i acetice prefer pH 2,5-5,5 i se vor dezvolta n produse acide care pot suferi fermentaia i mucegirea. Bacteriile de putrefacie care prefer un pH = 7 nu se pot dezvolta n medii acide care sunt astfel protejate. Aciunea pH-ului asupra creterii se poate observa n mediu, deoarece disponibilitatea unor nutrieni este modificat de echilibrul ionic. Astfel la pH acid ionii de magneziu formeaz complexe insolubile, n timp ce la pH bazic sunt complexai ionii de calciu, zinc i ionii ferici, elemente cu rol de cofactori ai enzimelor microbiene. Valori extreme de pH influeneaz permeabilitatea membranelor celulare. n mediu acid permeazele cationice sunt saturate de ioni de H + care limiteaz sau anuleaz transportul cationilor indispensabili pentru celule; n mediu alcalin membrana este saturat cu OH- i este mpiedicat transferul de anioni necesari. La modificri de pH se modific i cinetica reaciilor enzimatice care se desfoar optim la anumite valori specifice. Microorganismele patogene, de exemplu Clostridium sunt mai sensibile dect cele din genul Escherichia, Salmonella, Staphylococcus. Clostridium botulinum are pH-ul minim pentru producerea de neurotoxine egal cu 4,8, iar la Staphylococcus aureus pH minim pentru cretere este de 4,2. 9.2.4.Valoarea de rH Este dependent de prezena n aliment a substanelor cu caracter oxidant sau reductor. Alimentele cu potenial de oxidoreducere sczut (rH = 0-12),de exemplu laptele, favorizeaz dezvoltarea substanelor anaerobe, n timp ce fructele cu rH ridicat (18,5 -28) favorizeaz dezvoltarea microorganismelor aerobe. Diverse lichide cu valori medii de rH (12-18,5) permit activitatea fermentativ a drojdiilor, bacteriilor lactice. 9.2.5.Indicele de activitate al apei (aw) Reflect coninutul de ap liber din produsele alimentare pus la dispoziia microorganismelor pentru reacii chimice, biochimice, transfer de metabolii prin nveliurile celulare.

42

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Domeniul general de aw pentru dezvoltarea microorganismelor este 0,62-0,99; cele mai pretenioase sunt bacteriile care necesit cantiti mari de ap liber, n timp ce drojdiile osmotolerante i mucegaiurile xerofite se dezvolt la valorile minime ale domeniului. ntre coninutul de umiditate al produselor alimentare determinat prin uscare la etuv la temperaturi de 105C pn la mas constant i indicele de a w nu se pot stabili relaii de dependen. Este important de precizat c: indiferent de temperatur, capacitatea microorganismelor de a crete este redus, cnd aw este sczut; domeniul de aw la care creterea are loc este cel mai extins la temperatura optim de cretere; prezena nutrienilor necesari n aliment crete domeniul de aw n care microorganismele pot supravieui. Substane naturale cu efect antimicrobian. Unele produse vegetale folosite n alimentaie conin substane denumite fitoncide. Astfel ceapa conine alicina, usturoiul alil sulfonatul, de asemenea conin fitoncide: hreanul, mutarul, cuioarele, scorioara etc. Unele fructe pot conine benzoat, salicilat (este cazul fructelor de pdure). n produse de origine animal, n ou este prezent lizozimul, n lapte proaspt este prezent pe lng lizozim, lactenine, lactoperoxidaz. Desigur c aceste substane au un spectru specific i pot influena numai activitatea microorganismelor sensibile. 9.3. INFLUENA FACTORILOR IMPLICII Inter-relaiile ce pot aprea n condiii naturale ntre microorganisme care triesc n acelai mediu, sau pe acelai aliment sunt foarte complexe. Din cauza proprietilor variate ale diferitelor specii i a intensitii cu care decurg procesele lor metabolice, aceste relaii au un rol important asupra vieii microorganismelor i indirect asupra modificrilor pe care le sufer alimentele. n biotehnologii alimentare n care se folosesc culturi mixte de microorganisme aflate ntr-un anumit raport cantitativ, procesul tehnologic este astfel dirijat nct s fie favorizat multiplicarea sau formarea anumitor produse de metabolism. Calitatea produselor finite i conservabilitatea lor este dependent de corelaii care se stabilesc ntre microorganismele existente la un moment dat pe alimentul care le asigur necesitile nutritive. Dintre relaiile ce se pot stabili ntre diferite grupe de microorganisme mai importante sunt urmtoarele: Neutralismul Corespunde unor relaii de indiferen ntre dou sau mai multe specii de microorganisme atunci cnd acestea se deosebesc mult prin exigenele nutritive. Foarte puine specii sunt strict neutrale, de obicei se formeaz asocieri care au caracter temporar sau accidental, reacionnd unele fa de altele n mod favorabil i sinergic sau dimpotriv, antagonic. Mutualismul (simbioza) Reprezint un tip de relaie care permite dezvoltarea simultan pe un substrat comun a unor specii diferite care exercit una asupra alteia o influen bilateral favorabil. Un exemplu l ofer bacteriile lactice i drojdiile folosite n culturi mixte la fabricarea produselor lactate acide, la prepararea maielelor n panificaie. Drojdiile produc vitamine ale grupului B care sunt factori de cretere pentru bacteriile lactice iar acestea produc acid lactic care le asigur un pH optim pentru activitatea lor. Comensalismul (metabioza)

43

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Este caracterizat prin creterea mpreun a dou sau mai multor specii de microorganisme aflate ntr-o relaie n care una profit de asociere iar cealalt n aparen nici nu profit nici nu este influenat negativ. Comensalismul se realizeaz fie prin elaborarea de ctre unul din parteneri a unor substane care favorizeaz dezvoltarea celorlali, fie prin modificarea mediului care devine mai favorabil pentru speciile asociate. Se ntlnesc frecvent la pstrarea laptelui, la fermentarea lactic a produselor vegetale, la fabricarea vinului, a brnzeturilor etc. Sinergismul Este o relaie de tip cooperant n care dou sau mai multe specii produc mpreun un efect pe care n mod izolat nu l pot realiza. De exemplu, putrezirea lemnului este posibil numai prin asocierea cooperant a mucegaiurilor i a bacteriilor celulozolitice. Antagonismul Se manifest sub forma unor corelaii complexe ntre grupe de microorganisme n care una din specii se comport ca agresor i profit de pe urma asociaiei cu celelalte specii care sunt prejudiciate. Se consider c nu exist microbi fr antagoniti. Fenomenul de antagonism microbian poate fi datorat mai multor cauze: vitez diferit de cretere i multiplicare a speciilor antagonice. Atunci cnd mediul conine substane accesibile tuturor microorganismelor de obicei predomin bacteriile care au un timp de generaie mai mic dect cel al fungilor; insuficiena n mediu a substanelor nutritive. n medii cu un coninut redus ntr-o substan util aceasta este consumat de specia cea mai adaptat la mediu; aciunea unor substane de metabolism ce pot produce un antagonism nespecific atunci cnd efectul se exercit asupra tuturor asociaiilor, de exemplu acidul lactic format prin fermentaie inhib prin reducerea de pH activitatea tuturor bacteriilor de putrefacie, sau un antagonism specific cnd substana produs (de exemplu, antibiotice) au efect selectiv asupra unui grup restrns. n tabelul de mai jos se dau grupe de microorganisme aflate n relaii de antagonism: Tabelul nr.1.Relaii antagonice ntre microorganisme Microorganisme patogene Microorganisme antagonice Clostridium botulinum Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. Clostridium perfringens Clostridium sporogenes, Lactobacillus sp. Staphylococcus Streptococcus, Pseudomonas, Enterobacter Salmonella Escherichia coli Parazitismul reprezint un tip de relaie antagonic n care un microorganism se dezvolt pe seama celuilalt. Se manifest prin liza celulelor microbiene ca rezultat al aciunii fagilor (bacteriofagi, micofagi). Cunoaterea factorilor implicii care determin creterea i multiplicarea microorganismelor aflate n produse alimentare permite alegerea condiiilor optime la utilizarea culturilor mixte i dirijarea relaiilor microbiene n scopul asigurrii calitii alimentelor.

10. PROCESE METABOLICE ALE MICROORGANISMELOR I APLICAII N INDUSTRIA ALIMENTAR

44

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 10.1. METABOLISMUL MICROBIAN FUNCII DE BAZ Viaa celulei microbiene n condiii compatibile cu aceasta este determinat de caracterele genetice care i imprim un anumit metabolism, determinat de totalitatea reaciilor biochimice catalizate secvenial de enzimele celulei vii, prin care se asigur transferul de mas i energie ntre celul i mediul ambiant. Viaa microorganismelor, continuitatea lor genetic este asigurat de desfurarea concomitent a celor dou laturi independente ale metabolismului i anume catabolismul i anabolismul. Catabolismul Denumit i metabolism degradativ este rezultatul reaciilor biochimice catalizate enzimatic prin care compuii macromoleculari sunt transformai n produi uor asimilabili cu eliberarea concomitent a energiei poteniale a compuilor cu rol de nutrient (reacii exergonice). Anabolismul Denumit i metabolism constructiv, de biosintez, reprezint totalitatea reaciilor biochimice endergonice catalizate de enzime, prin care se realizeaz biosinteza compuilor celulari, creterea i reproducerea microbian. Microorganismele au potenialul genetic de a codifica i de a sintetiza peste 1000 de tipuri de enzime care catalizeaz specific, ci metabolice proprii. Echipamentul enzimatic complex al celulei microbiene este alctuit din enzime constitutive sintetizate n mod necondiionat i obligatoriu n toate celulele microbiene i enzime adaptive (inductive) sintetizate n mod condiionat, cnd mediul ambiant prin nutrienii oferii impune adaptarea. 10.2. FERMENTAIA ALCOOLIC Fermentaia alcoolic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacii de oxidoreducere sub aciunea echipamentului enzimatic al drojdiei n produii principali (alcool etilic i CO2) iar ca produi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide etc. Agenii tipici ai fermentaiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot s produc prin fermentarea glucidelor mai mult de 8 alcool etilic. Fermentaia alcoolic este un proces ntlnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantiti mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, Zymomonas, dar ele nu sunt considerate ageni tipici. Proprieti biotehnologice ale drojdiilor fermentative. Pentru a putea fi folosite n practic drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate i selecionate n funcie de unele proprieti care le recomand pentru utilizare industrial, cum ar fi: Puterea alcooligen care se refer la concentraia maxim de alcool ce se poate acumula cnd n mediu exist un exces de zahr. Drojdiile sunt sensibile la creterea concentraiei n alcool i n timp ce drojdiile cu putere alcooligen slab (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentraie n alcool de 4-6 drojdiile de vin i alcool (Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae) au o putere alcooligen mare i continu fermentaia alcoolic pn se acumuleaz 16-18 alcool. Alcoolorezistena se refer la capacitatea drojdiei de a continua fermentaia la creterea concentraiei de alcool. Sulfitorezistena este capacitatea drojdiilor de vin de a produce fermentaia alcoolic n prezena unor concentraii de 200-500 mg SO2/dm3 care pot influena

45

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scderii potenialului de oxidoreducere. Capacitatea de floculare i pulverulena proprieti datorate structurii peretelui celular i a modificrii de pH i rH din timpul fermentaiei. Drojdiile floculante pot forma asociaii ce se depun mai uor, n timp ce drojdiile pulverulente se menin mai mult timp n suspensie i produc o fermentaie mai avansat. Osmotolerana se refer la capacitatea drojdiilor de a produce fermentaia n mediu cu o concentraie crescut de zahr. Aceste proprieti sunt recomandate drojdiilor folosite la obinerea alcoolului din melas cu un randament superior n alcool etilic. Caracterul killer este ntlnit la unele drojdii capabile de a sintetiza intracelular o toxin cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. n selecionarea drojdiilor de vin culturile care au caracter killer dau randamente superioare, n cursul fermentaiei are loc o autoselecie natural. Factorii care influeneaz dinamica fermentaiei alcoolice Fermentaia alcoolic n condiii industriale folosete substraturi naturale bogate n zahr fermentescibil, iar viteza de fermentare i transformare a glucidelor n produi primari i secundari este dependent de numeroi factori care pot fi mprii n dou mari categorii: factori biologici, dependeni de microagenii fermentrii i factori fizico-chimici, dependeni de compoziia mediului supus fermentrii i condiiile mediului ambiant. 1)Factorii biologici nc din 1885-1887 a fost stabilit de ctre Ed. Bchner c fermentaia alcoolic este cauzat de enzimele elaborate de celula de drojdie, stabilindu-se natura enzimatic a fermentaiei. Complexul zimazic acelular obinut prin mojararea celulelor de drojdie este format din 15 enzime care catalizeaz n diferite etape procesele de oxidoreducere ale glucidelor fermentescibile i n final formarea de alcool etilic. Fermentaia decurge activ cnd celulele de drojdie sunt n faza exponenial sau la nceputul fazei staionare de cretere, n timp ce drojdiile autolizate, ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare i inactivarea enzimelor, i pierd proprietile fermentative. Viteza de fermentare depinde i de numrul de celule/cm3 mediu; viteza crete cu numrul de celule, prin vitez nelegnd coninutul de alcool format la 100 cm3 lichid n unitatea de timp. n practic, din raiuni economice, prin folosirea culturilor starter n industriile fermentative, concentraia de celule pentru declanarea rapid a fermentaiei este 106-109/cm3. Un alt factor l constituie spectrul de fermentare al glucidelor. Din studiul caracterelor fiziologice se cunoate c drojdiile produc fermentarea unui numr limitat de glucide ce pot fi transformate n alcool etilic i CO2 n condiii anaerobe, ntre specii existnd diferene. Datorit importanei pe care o prezint alcoolul etilic de fermentare n practica industrial, n afara glucidelor fermentescibile se pot folosi substraturi naturale ce conin poliglucide (amidon, celuloz) care sunt hidrolizate n prealabil pe cale chimic sau enzimatic pn la formarea de glucide fermentescibile. Aceast zaharificare este obligatorie deoarece drojdiile de fermentare nu produc amilaze/celulaze i nu pot produce hidroliza enzimatic a poliglucidelor. Dac mediul de fermentare este puternic aerat, atunci are loc efectul Pasteur, prin care se observ conversia fermentaiei n respiraie deoarece n prezena

46

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE oxigenului, oxidarea se face pn la produi finali (CO2 i H2O), iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru acelai echivalent energetic consumndu-se o cantitate mic de zahr. 1 mol glucoz 2 ATP (fermentaie) 1 mol glucoz 36 ATP (respiraie) Procesul de aerare este folosit la cultivare atunci cnd intereseaz obinerea unei cantiti mai mari de drojdie, de exemplu la obinerea industrial a drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere. 2) Influena factorilor fizico-chimici asupra fermentaiei alcoolice Compoziia mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate n mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, n funcie de calitatea mustului, care este influenat de soiul i gradul de coacere a strugurilor, apar diferene de arom. Concentraia n zahr influeneaz direct proporional viteza de fermentare atunci cnd se situeaz n limitele 5-12% (50-120 g zahr/dm3). Cu creterea concentraiei de zahr anumite drojdii mai sensibile sufer o inhibare n activitate prin procese de represie catabolic sau prin modificri la nivel de membran datorate plasmolizei. Drojdiile de fermentare au n general osmotoleran i de aceea produc fermentarea n bune condiii a mustului de struguri cu o concentraie de 170-250 g zahr/dm3. Concentraia n alcool. n mediile fermentative cu microbiot natural, dac se ajunge la o concentraie alcoolic de 4-6, se produce o ncetinire a fermentaiei la drojdii care nu au rezisten la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuat de drojdii alcoolorezistente, acumulndu-se 18-20 alcool (1 grad alcoolic = 1 ml alcool absolut/100 ml mediu fermentat). PH-ul are un rol important n formarea compuilor de fermentare, n funcie de pH cunoscndu-se dou forme ale fermentrii: fermentarea alcoolic propriu-zis, ce se desfoar la pH 3,5-5 cnd produsul principal este alcoolul etilic i dioxidul de carbon, cu produi secundari n cantiti mici, echilibrate i fermentarea la pH alcalin, cnd n afar de alcool etilic i dioxid de carbon se formeaz n cantitate mai mare glicerol (pn la 30% din zahrul fermentat). Temperatura. Enzimele componente ale sistemului zimazic prezint fiecare un optim de activitate, iar proprietile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Fermentarea alcoolic poate avea loc ntre 0-35C. n funcie de specia de drojdie predominant sau folosit n cultur pur temperaturile optime sunt la: 28-30C, pentru drojdia de alcool i de panificaie (Saccharomyces cerevisiae); 6-12C, pentru drojdia de bere (Saccharomyces carlsbergensis); 15-20C, pentru drojdiile de vin (Saccharomyces ellipsoideus i Saccharomyces oviformis), care produc o fermentare mai lent la aceste temperaturi, dar conduc la obinerea unui vin de calitate deoarece la temperaturi mai sczute se evit pierderile de substane volatile. Biochimismul formrii produilor principali i secundari n fermentaia alcoolic propriu-zis Conversia prin fermentare n mediu acid a glucidelor, catalizat de enzime din drojdii se desfoar n cinci etape principale: transformarea diferitelor tipuri de glucide n esteri ai glucozei i formarea esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa n care se consum energie prin transformarea ATP-ului n ADP;

47

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE formarea triozelor-aldehid fosfogliceric i fosfodioxiaceton; transformarea triozelor pn la formarea de acid piruvic. Energia eliberat prin procesul de oxidoreducere este nmagazinat prin fosforilare de substrat; decarboxilarea acidului piruvic i formarea de aldehid acetic; aldehida acetic se reduce devenind acceptor de hidrogen i se formeaz alcoolul etilic. Reacia global a fermentaiei alcoolice n mediu acid: C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP (117kJ/mol)

Formarea produilor secundari n fermentaia alcoolic rezult o diversitate de produse secundare. n vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substane diferite. Majoritatea lor rezult prin fermentare, iar celelalte sunt dependente de compoziia mediului. Glicerolul se acumuleaz n mod normal n cantiti de 3,3 g/100 g glucoz fermentat i are un rol benefic asupra calitii vinului, conferindu-i catifelaj-ul. Aldehidele se acumuleaz n mediul de fermentare. Cea mai important, aldehida acetic, la concentraii ce depesc 2,5 mg/dm3 influeneaz indirect gustul, deoarece prin oxidri duce la formarea de acid acetic. Acizii provin att din must ct i din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatil vinului (acid acetic, formic, propionic, butiric) precum i o aciditate fix (acid lactic, succinic) care se regsete n aciditatea total a vinului. Dintre alcoolii superiori, care se acumuleaz mai ales la fabricarea alcoolului, fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot s contribuie la formarea unor substane de arom. La fabricarea vinului alcoolii superiori sunt precursori de arom deoarece se pot combina cu diferii acizi rezultnd esteri cu arom caracteristic. De exemplu, n vinuri, din fenilalanin se formeaz alcoolul feniletilic care d arom de trandafir. n afar de aspectele pozitive ale fermentaiei alcoolice la fabricarea alcoolului, vinului, distilatelor, berii, pinii, poate prezenta i aspecte negative atunci cnd se produce fermentarea spontan a unor produse bogate n zahr (siropuri, dulceuri, compot, miere). n acest caz fermentarea este dat de drojdii osmotolerante care produc prin fermentare alcool etilic, CO2 i o cantitate apreciabil de acid acetic, ceea ce duce la deprecierea lor. Fermentaii alcoolice neconvenionale, produse de bacterii Exist bacterii care pot produce cantiti apreciabile de alcool: Bacillus macerans, Leuconostoc, Clostridium acetono-etillicus, iar Zymomonas mobilis i Zymomonas anaerobica, produc prin fermentare 10-16 alcool. Cu aceste bacterii pot fi fermentate derivatele celulozice, pentru obinerea de alcool carburant. Cu ajutorul bacteriilor se obine alcool cu ntrebuinri industriale, care nu este folosit n alimentaie deoarece bacteriile nu produc i substane secundare de arom, iar randamentul de conversie este mai mic dect al drojdiilor. 10.3. FERMENTAIA LACTIC Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor n acid lactic ca produs principal i ca produse secundare: diacetil, acetoin, acid acetic, alcool etilic i CO2.

48

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Calea metabolic de producere a acidului lactic este frecvent ntlnit n lumea microbian, n schimb randamente superioare de conversie a glucidelor n acid lactic sunt ntlnite la bacterii i mucegaiuri. Dintre acestea, bacteriile lactice, considerate ageni tipici ai fermentaiei sunt folosite industrial n biotehnologii alimentare, la industrializarea laptelui i a crnii, n panificaie, la conservarea produselor vegetale i la obinerea acidului lactic. Mucegaiuri selecionate ale genurilor: Aspergillus, Penicilium i Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijat, pentru obinerea industrial a acidului lactic. Caractere morfo-fiziologice generale ale bacteriilor lactice Bacteriile lactice sunt foarte rspndite n natur n diferite biotopuri: aparatul foliar al plantelor, n microbiota intestinal, n cavitatea bucal, n microbiota pielii. Caractere morfologice Bacteriile lactice prezint eterogenitate morfologic: principalele forme sunt derivate de la coccus, i se pot prezenta sub form de streptococi (g. Lactococcus i g. Streptococcus), de diplococi (g. Leuconostoc), de tetrade (g. Pediococcus); numeroase alte bacterii lactice se prezint sub form cilindric, de bastonae cu dimensiuni variabile, izolate sau n lanuri lungi, incluse n genul Lactobacillus. Caractere fiziologice Bacteriile lactice sunt pretenioase din punct de vedere nutritiv i nmulirea lor are loc n medii cu compoziie chimic complex. 10.4. FERMENTAIA PROPIONIC Fermentaia propionic este un proces anaerob prin care substratul fermentescibil, acidul lactic, sub aciunea complexului de enzime ale bacteriilor propionice agenii tipici este transformat n acid propionic, acid acetic, CO2 i energie. n afara bacteriilor propionice (g. Propionibacterium), formarea prin catabolism a acidului propionic este ntlnit la bacterii anaerobe ale g. Clostridium (Clostridium propionicum) i g. Veillonella. Bacteriile propionice sunt rspndite n natur n tractul digestiv al animalelor, n lapte i brnzeturi din care pot fi izolate. Biochimismul fermentaiei propionice n fermentaia propionic, substratul fermentescibil (acidul lactic) este metabolizat anaerob, conform reaciei generale: 3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O (+ 3 ATP) Aspecte practice ale fermentaiei propionice Fermentaia propionic dirijat este folosit la fabricarea brnzeturilor (Schweitzer, Ementhal), cu rol pozitiv n formarea ochiurilor (alveole rezultate prin difuzia lent a CO2, rezultat din fermentaie sau prin decarboxilarea aminoacizilor), n formarea gustului specific i creterea valorii alimentare, ca urmare a formrii de ctre bacteriile propionice a vitaminei B12. n industria panificaiei, fermentaia propionic produs de bacterii propionice adaptate la mediul aluat, conduce la formarea suplimentar a CO2 cu rol n creterea volumului i a acidului propionic cu efect fungistatic ce previne mucegirea pinii la pstrare. 10.5. FERMENTAIA BUTIRIC

49

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Fermentaia butiric reprezint un proces anaerob prin care diversele surse de carbon sunt metabolizate sub aciunea bacteriilor butirice n produi principali ai fermentaiei: acid butiric i gaze: CO2; H2. n funcie de specie i condiii de fermentare se mai pot forma pe ci deviate de la fermentaia butiric propriu-zis solvenii: butanol, propanol, etanol, aceton. Biochimismul fermentaiei butirice Are loc dup ecuaia general: C6H12O6 CH3-CH2-CH2-COOH + 2CO2 + 2H2 Fermentaia butiric se poate folosi industrial la fabricarea acidului butiric. n acest scop se folosesc plmezi amidonoase zaharificate cu enzime din mal, se face inocularea cu Clostridium butyricum i fermentarea are loc anaerob, la 35-40C timp de 8-10 zile, n prezen de carbonat de calciu. Pentru obinerea acidului butiric, n plmada fermentat se adaug sulfat de sodiu. Butiratul de sodiu se separ de sulfatul de calciu prin filtrare i dup concentrare, n prezen de acid sulfuric se elibereaz acidul butiric. Acidul butiric sub form esterificat este folosit la fabricarea unor esene, deoarece butiratul de metil are arom de mr, iar butiratul de etil, arom de par sau ananas, esene folosite la obinerea produselor zaharoase. Fermentaia butiric, atunci cnd are loc la fabricarea sau conservarea produselor alimentare, influeneaz negativ calitatea acestora. Fermentaia butiric poate fi ocazional detectat la fabricarea alcoolului din materii amidonoase, cnd acidul butiric rezultat are un efect inhibitor asupra drojdiilor, ageni ai fermentaiei alcoolice. Dac fermentaia butiric spontan are loc n spaii nchise, gazele generate prin fermentaie pot deveni explozive. Bacterii ale genului Clostridium pot fi ageni de alterare a conservelor, alterare caracterizat prin bombaj i pierderea valorii alimentare. 10.6.PROCESE METABOLICE AEROBE (FERMENTAII OXIDATIVE) Spre deosebire de fermentaiile propriu-zise anaerobe, fermentaiile acetic, gluconic, citric etc. sunt procese oxidative simple, care se desfoar n condiii aerobe i se difereniaz de metabolismul oxidativ (respiraie), prin aceea c oxidarea este limitat, rezultnd n condiii industriale acizi organici cu mare valoare economic. 10.6.1.Fermentaia acetic Fermentaia acetic este un proces metabolic aerob prin care substratul (alcoolul etilic) este oxidat n prezena oxigenului din aer, sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor acetice, n acid acetic ca produs principal al fermentaiei. Biochimismul fermentaiei acetice Fermentaia acetic se desfoar dup reacia global: CH3-CH2-OH + O2 CH3 COOH + H2O Alcoolul etilic este oxidat n aldehid acetic n prezena alcooldehidrogenazei. Are loc legarea chimic a unui mol de ap i se formeaz acetaldehida-hidratat care n prezena aldehid dehidrogenazei cedeaz 2H + care

50

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE este transferat de ctre enzime ale catenei respiratorii celulare pe oxigenul molecular i se acumuleaz acid acetic produs principal al fermentaiei. Importana practic a fermentaiei acetice Deoarece obinerea vinului se cunoate de peste 10000 de ani, se presupune c i obinerea oetului are aceeai vechime. Obinerea industrial este descris din 1670 i n prezent producia anual depete 106 t acid acetic pur, obinut prin fermentarea diferitelor materii prime: soluii alcoolice, vin, cidru, mal, bere, orez. n cazul materiilor amidonoase, se face n prima etap zaharificarea, apoi fermentaia alcoolic cu drojdii i n final are loc acidificarea cu bacterii acetice selecionate. Consumul pe cap de locuitor i an poate varia ntre 0,2-38 l. Fermentaia acetic spontan, ntlnit la fermentarea boabelor de cacao are un rol pozitiv n formarea compuilor de arom i obinerea unor boabe de calitate superioar. Bacteriile acetice Acetobacter xylinum pot fi folosite pentru obinerea de glucani folosii la fabricarea de membrane filtrante pe baz de acetat de celuloz. Gluconobacter suboxidans poate fi folosit pentru oxidarea manitolului n fructoz i a glicerolului n dehidroxi-aceton folosit n cosmetic. Importana practic o are i oxidarea sorbitolului i formarea de L-sorboz, materia prim n sinteza acidului L-ascorbic (Vitamina C). Fermentaia acetic nedorit a vinului, berii, pstrate cu gol de aer conduce la deprecierea calitii lor. n cazul vinurilor, procesul este considerat o boal, deoarece acrirea are loc n ntregul volum, dei bacteriile acetice aerobe se dezvolt la suprafa. Acidul acetic format sub voal are o densitate mai mare dect a alcoolului nct se produce o circulaie a compuilor reactani care conduce la acrirea total a produsului. 10.6.2. Fermentaia gluconic Fermentaia gluconic este un proces oxidativ simplu prin care glucoza, n prezena oxigenului din aer i a sistemului enzimatic al microorganismelor selecionate este transformat n acid gluconic ca produs principal. Agenii tipici ai fermentaiei gluconice sunt bacteriile din genul Gluconobacter (Acetomonas), genul Moraxella i mucegaiuri din genul Aspergillus: A.niger, A. phoenicis, A.wenti i ale genului Penicillium: P.chrysogenum, P.luteum. Importana practic a fermentaiei gluconice Acidul gluconic se obine pe cale fermentativ cu culturi fungice folosind ca substrat melas diluat (10-20 % zaharoz), repartizat n tvi cu suprafa mare. Dup inoculare cu spori ai mucegaiului selecionat acesta se dezvolt la suprafa formnd o derm groas se produce lent oxidarea glucozei rezultat prin inversia zaharozei. Procedeul este lent i n ultimii ani a fost nlocuit cu metode submerse de aerare, n bioreactoare n care procesul este accelerat i randamentul de conversie al glucozei n acid gluconic este de 80-90% n timp de 18 ore la 25-30C i pH=3. Prin adugare de carbonat de calciu se formeaz gluconatul de calciu, din care prin procedee chimice se purific acidul gluconic. Biomasa rezultat n perioada fermentrii poate fi valorificat pentru recuperarea glucoxidazei intracelulare. Dintre multiplele aplicaii ale acidului gluconic, mai importante sunt urmtoarele: folosirea gluconailor de Ca, Fe, n terapeutic; la obinerea prafului de copt;

51

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE gluconolactona, produs intermediar al fermentaiei este folosit n industria preparatelor de carne, deoarece le confer un gust acrior, mpiedic activitatea bacteriilor de putrefacie i menine culoarea roie natural a compoziiei salamurilor; acidul gluconic n amestec cu soda caustic este folosit pentru ndeprtarea rapid a srurilor insolubile de magneziu; acidul 2 ceto-gluconic este folosit la obinerea acidului D-araboascorbic substan cu efect antioxidant folosit la prevenirea rncezirii alimentelor cu coninut ridicat n lipide. 10.6.3. Fermentaia citric Fermentaia citric este un proces oxidativ complex prin care substratul glucidic (zaharoza) este metabolizat la compui intermediari de oxidare cu acumulare n mediu a acidului citric ca produs principal. Agenii tipici ai fermentaiei citrice sunt tulpini selecionate ale speciei Aspergillus niger care produc activ citrat sintetaz. Acidul citric se poate obine cu un bun randament (52 g/dm3) i prin cultivarea drojdiilor cu specia Candida oleophilla, pe medii cu parafine. Pentru creterea randamentului n acid citric, cnd pentru fermentaie se folosete ca materie prim melasa, aceasta se trateaz cu ferocianur de potasiu pentru ndeprtarea prin precipitare a Mg, Fe, Mn, Zn, CU, metale care influeneaz acumularea de acid. Ca rezultat al eliminrii acestora, crete activitatea enzimei de condensare, n schimb enzime ale ciclului Krebs: aconitat hidrataza care necesit fier i izocitrat dehidrogenaza care necesit mangan, n absena cofactorilor trec n stare inactiv i deci este oprit secvena biochimic de transformare a acidului citric prin ciclul Krebs i astfel acesta se acumuleaz n mediul de cultur. Producerea industrial a acidului citric Prin culturi de suprafa pe medii cu melas diluat tratat cu ferocianur de potasiu, dup sterilizare i rcire n tav, se inoculeaz cu spori de A.niger (3-4 g spori/100 m2 suprafa mediu) i fermentarea are loc la 30-35 C. La suprafa se dezvolt o derm cu suprafa cutat prin creterea aerob a miceliului vegetativ i reproductor. Fermentaia dureaz 6-8 zile cu un randament de conversie a zaharozei n acid citric de 70-72% (1 m2 suprafa miceliu poate s produc 500-800 g acid citric n 24 ore). Dup separarea biomasei, aceasta poate fi valorificat ca surs de enzime/proteine, iar din mediul fermentat prin metode fizico-chimice se separ acidul citric cristalizat. Acidul citric se poate obine i prin metode submerse n bioreactoare cu aerare dirijat, prin procedee discontinue sau continue, cu reducerea duratei de fermentaie i creterea randamentului la valori de 80-85% n acid citric. Importana fermentaiei citrice Acidul citric este principalul acid folosit n industria alimentar, pentru fabricarea buturilor rcoritoare, a produselor zaharoase. Este folosit n calitate de conservant al culorii produselor pstrate n stare congelat, are proprieti antioxidante i rol de anticoagulant al sngelui. n industria farmaceutic intr n componena pulberilor efervescente. Citratul de sodiu este recomandat n compoziia detergenilor, nlocuind fosfaii, care prin deversare n ape favorizeaz proliferarea excesiv a algelor. Acidul citric sub form cristalizat prin nclzire la 170C se transform n acid itaconic utilizat la fabricarea rinilor schimbtoare de ioni.

52

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 10.6.4. Fermentaii oxidative diverse Prin fermentaii oxidative (aerobe) se mai pot obine i ali acizi, de exemplu: acidul fumaric cu culturi din g. Aspergillus, Penicillium, important pentru obinerea aldehidei maleice, materie prim pentru obinerea rinilor sintetice. Acidul kojic obinut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae este folosit ca reactiv n chimia analitic i intr n compoziia unor insecticide. Acidul ustilagic obinut cu culturi de micromicete ale genului Ustilago este folosit n industria parfumurilor. Este important de subliniat c fermentaiile pot avea loc n mod spontan n condiii naturale, favoriznd transformarea compuilor organici din materia nevie n compui mai simpli, accesibili pentru alte grupe de microorganisme, transformri ce permit un circuit natural al carbonului. Majoritatea fermentaiilor descrise stau la baza biotehnologiilor alimentare cnd prin utilizarea culturilor starter se obin produse cu mare valoare economic.

11. MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR I INCIDENA MICROORGANISMELOR CONTAMINANTE

Valoarea alimentar a unui produs este dat de valoarea nutritiv, senzorial i de gradul de inocuitate, respectiv absena din alimente a microorganismelor patogene, a substanelor toxice microbiene i a organismelor care produc infestarea (ou, larve, insecte). Coninutul n microorganisme patogene a unui aliment variaz n limite largi i acestea provin din materia prim supus prelucrrii la care se adaug microorganisme provenite de la contactul cu utilajele, ambalajele, astfel nct produsul finit formeaz o anumit microflor specific produsului, dar n condiiile pstrrii normale i respectrii tehnologiei nu influeneaz calitile produsului pn n momentul consumrii sale. Distrugerea culturilor de microorganisme selecionate care se introduc pentru a asigura calitile produsului, duce la apariia unei microflore de contaminare care determin o poluare a produsului finit. Studiul microbiotei alimentelor a condus la stabilirea n diferite ri a unei legislaii privind gradul de contaminare cu microorganisme a alimentelor, formarea microbiotei n condiiile proceselor tehnologice de prelucrare a alimentelor, rolul microorganismelor la creterea valorii biologice i alimentare, rolul etiologic al unor alimente n transmiterea microorganismelor patogene. 11.1. CONSIDERAII GENERALE ASUPRA MICROBIOTEI ALIMENTELOR Microbiota alimentelor n funcie de natura microorganismelor componente, poate fi difereniat n microbiot specific i nespecific. 11.1.1. Microbiota specific Este alctuit din microorganisme cultivate denumite i culturi starter introduse dirijat n produs, n scopul obinerii unor transformri dorite. n aceeai categorie intr i microbiota care se formeaz n etape tehnologice determinante i care realizeaz nsuiri senzoriale i de compoziii obligatorii, cu o influen pozitiv asupra calitii alimentelor. Microorganismele benefice introduse n mod dirijat sub form de culturi pure pentru creterea calitii produselor alimentare nu sunt

53

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE considerate contaminani dei, n funcie de condiiile de activitate i durata n care ele sunt active, acestea pot s produc uneori defecte senzoriale. Microorganismele necesare n fermentaia alimentelor pot fi adugate sub form de monoculturi/culturi mixte, sau n anumite cazuri nu se adaug culturi, dac microorganismele dorite, se cunoate c sunt prezente n numr mare n materia prim. De exemplu, la murarea verzii, a murturilor, a mslinelor, la fermentarea boabelor de cafea, cacao, materia prim conine o cantitate suficient de microorganisme dorite, care vor aciona ntr-o succesiune proprie, dac vor fi pstrate condiiile adecvate pentru fermentare. n aceste condiii nu este necesar sau avantajoas adugarea de culturi pure. n schimb folosirea culturilor starter pentru desfurarea unei fermentaii controlate se practic n multe biotehnologii alimentare la fabricarea produselor lactate acide, a brnzeturilor, untului, pinii, berii, spirtului i buturilor alcoolice, oetului .a. (Larpent, J., 2000). 11.1.2. Microbiota nespecific Particulariti ale microorganismelor contaminante Microbiota nespecific poate fi reprezentat de microorganisme organotrofe (saprofite) i microorganisme patogene. Microorganisme organotrofe (saprofite) Sunt foarte rspndite n natur i produc alterri ale alimentelor cnd se afl n numr mare, ca rezultat al aciunii lor asupra compuilor organici din aliment. Microorganismele care produc alterarea produselor alimentare au mai ales activitate proteolitic i lipolitic. Contaminarea produselor alimentare i nmulirea microorganismelor n produse este nedorit deoarece ele scad valoarea nutritiv i biologic nct n unele cazuri fac imposibil folosirea produsului n nutriie. Alturi de modificarea nsuirilor senzoriale, aceste microorganisme pot produce compui toxici. Microorganismele saprofite prezente n produse pot condiiona ntr-o serie de cazuri dezvoltarea unor procese biochimice obligatorii i deci s condiioneze calitatea alimentelor. n acest caz, ele devin specifice pentru microbiota dat a produsului, de exemplu bacteriile lactice. Avnd nsuiri antagoniste n raport cu alte microorganisme, acestea, adesea, asigur conservarea produselor alimentare i consumul este lipsit de pericol epidemiologic. Alterarea microbian Microorganismele de alterare sunt ntotdeauna prezente pe alimente neprocesate i includ bacterii, drojdii i mucegaiuri care dau modificri nedorite ale calitilor senzoriale i nutritive ale alimentului (modificri de arom, miros, gust, culoare, textur, consisten). Alimentele perisabile sunt n primul rnd cele cu compoziie chimic complex i un coninut ridicat de ap, ca de exemplu: carnea, petele, produsele lactate, vegetale, fructe. Dintre acestea produsele de origine animal au un pH apropiat de neutru, conin cantiti mari de proteine i lipide i sunt conservate la temperaturi sczute. Aceste condiii favorizeaz creterea bacteriilor Gram negative cu specii ale genului Pseudomonas, Acinetobacter (Moraxella) care prin activitatea lor proteolitic i lipolitic dau produi de alterare cu miros i gust putrid. Din grupul alimentelor stabile n condiii normale de pstrare fac parte alimentele conservate i ambalate aseptic. n urma tratamentului termic se obine o sterilizare comercial termen care semnific distrugerea tuturor microorganismelor capabile de cretere n aliment. n cazul n care rmn supravieuitori acetia n

54

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE general nu prezint un pericol. n alimentele cu aciditate redus se aplic o formul de sterilizare care s asigure reducerea numrului de spori de Clostridium botulinum cu un factor de 10-12. Pentru alte alimente: cereale, orez, nuci/alune, aw, compoziia i structura anatomic sunt importante pentru conservabilitatea produselor. n general creterea microbian nu poate avea loc la a w mai mic sau egal cu 0,6, cu o stabilitate de 1 an la valori de 0,7 i egal cu 6 luni la valori mai mari de 0,75, nct la valori peste 0,78 este probabil alterarea rapid. Alterarea microbian a alimentelor este un proces competitiv ntre bacterii, drojdii i mucegaiuri printre care, drojdiile joac un rol nensemnat deoarece ele constituie un procent redus din populaia iniial Microorganismele ageni ai intoxicaiilor alimentare mbolnvirea este cauzat prin consum de alimente n/pe care s-au dezvoltat microorganisme care elaboreaz metabolii cu efect toxic. Perioada de incubaie i simptomele evideniate prin investigaii pot fi corelate cu alimentul ingerat (n special pentru bacterii). Mucegaiurile toxicogene. Produc intoxicaii denumite micotoxicoze cu o perioad de incubare prelungit nct este dificil asocierea mbolnvirii, cu alimentul incriminat. Mucegaiurile pot forma colonii la suprafaa produsului i n etapa de cretere colonial, o dat cu apariia sporilor, pot s sintetizeze produi secundari de metabolism de natur hidrocarbonat cu o toxicitate deosebit de ridicat. Omul i animalele pot s sufere intoxicaii prin consum de alimente mucegite, intoxicaii care se manifest prin mbolnviri ale diferitelor organe (ficat, rinichi etc.). Dintre bolile produse prin consum involuntar de micotoxine fac parte: ergotismul, aleucie toxic alimentar (ATA), hepatocarcinogeneza, nefrotoxicoze, sindromul hemoragic, poliurie .a. Produc micotoxine specii aparinnd urmtoarelor genuri: Genul Aspergillus reprezentanii genului produc aflatoxine denumite astfel de la specia Aspergillus flavus. Se cunosc 12 aflatoxine dintre care cele mai toxice sunt: B1, B2, G1, G2. Iniialele provin de la fluorescena pe care o dau aceste toxine prin expunerea plcii cromatografice la radiaii UV cu = 360 nm (blue = albastru, green = verde), n timp ce numerele se refer la ordinea de migrare pe cromatogram. Aflatoxinele M1, M2 cu toxicitate mai redus, pot fi detectate n laptele provenit de la animalele hrnite cu furaje (mucegite cu specii toxicogene). Mai produc aflatoxine unele tulpini ale speciilor Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus wenti. Aflatoxinele au efect toxicogen asupra animalelor i produc ciroze n 3 sptmni de la ingerarea acestora cu 1 mg/kg corp. nclzirea la 120C, timp de 4 h, nu distruge n totalitate aceste micotoxine. Aflatoxinele nu sunt solubile n ap, ci n solveni organici, dar acetia nu pot fi folosii pentru ndeprtarea micotoxinelor deoarece prin extracie se pierde valoarea alimentar a produsului. Genul Penicillium specii ale genului pot produce peste 60 de toxine mai ales cnd se dezvolt pe cereale i furaje. Dintre speciile productoare fac parte: P.islandicum care se dezvolt pe orez i produce 2 micotoxine: islanditoxina i luteoskirina. Pe fructe, se dezvolt P.expansum care produce putrezirea albastr i sticloas a merelor i sintetizeaz patulina. Se poate dezvolta pe cereale i produse de panificaie. Patulina este rezistent la temperaturi ridicate, la pH acid i are efect cancerigen. Dac sucul de fructe este supus fermentaiei, o parte din toxin se elimin din lichidul fermentat. Alte specii: P.citrinum produce citrinina pe orez decorticat, cauznd afeciuni renale; P. citreoviridae citreoviridina, toxin ce

55

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE produce la om dereglri nervoase, simptome cardiace similare cu cele ntlnite n boala beri-beri etc. Genul Fusarium produce trichothecene care pot fi sintetizate i la temperaturi sczute, deosebit de rezistente n timp (mucegaiurile pot s moar dar toxina rezist ani de zile). Specii toxicogene: F. sporotrichoides produce sporofusariogenina productoare de ATA ce se manifest prin apariia pe piele a unor pete specifice, anghin pectoral, diateze hemoragice, afeciuni ale mduvii, dnd simptome similare cu cele produse prin iradiere cu radiaii ionizante sau otrvirea cu benzen. F.nivali se dezvolt n special pe cereale i produce trei tipuri de toxine: fusarenona, fusarenona X i nivalenolul, toxine care determin n organismul animal o proliferare anarhic a celulelor, hematopoez i simptome similare ATA (aleukie toxic alimentar). Genul Rhizopus specii ale genului produc micotoxine ce dau stri de oboseal i poliurie. Genul Cladosporium poate produce la temperaturi sczute toxine de tipul acizilor tricarboxilici nesaturai care dau simptome caracteristice ATA. Pe nutreuri, cereale, porumb i furaje se mai pot ntlni mucegaiuri toxicogene ca Ustilago, Stachybotris, Walemia, Dendrodochium toxicum .a. Consumul de furaje contaminate cu mucegaiuri toxicogene poate cauza moartea animalelor (cazuri mai frecvent ntlnite la oi i cai), iar dac animalul nu a ingerat doza letal, micotoxinele se acumuleaz n diverse esuturi/organe, sau se pot elimina prin lapte, iar n cazul psrilor, prin ou. Bacterii toxicogene Dintre agenii bacterieni ai intoxicaiilor prin alimente contaminate fac parte urmtoarele specii: Clostridium botulinum este un saprofit care crete rar n organisme vii, capabil de a produce toxine prin creterea n alimente. Produce 8 toxine de natur proteic difereniate din punct de vedere imunologic. Tulpinile productoare de neurotoxine A, B, E, dau botulismul la om i produc sindrom neuroparalitic cu efect letal. Manifestarea strii de boal are loc dup 1-10 zile i cazurile letale ajung pn la 68%. Dup ingerarea toxinei botulinice dup 8-36 ore apar stri de vom, dureri abdominale i diaree, apoi starea de uscciune n gur, dilatarea pupilelor, viziune dublat, dificulti respiratorii, cderea muchilor faciali, iar moartea este datorat asfixierii, stopului cardiac, infeciilor pulmonare. Toxinele botulinice au o toxicitate ridicat (o doz de 0,2 g poate omor un om de 100 kg). Prin dezvoltarea lui Clostridium botulinum, carnea i alte alimente bogate n proteine, vegetalele cu aciditate sczut, capt un miros alterat sau se formeaz gaze prin procese de fermentaie, aspect care ns nu poate fi sesizat n alimente cu aciditate mai ridicat sau cu un coninut redus n proteine. Producerea toxinelor este oprit n alimente cu pH<4,5, iar n condiii optime de cultur este inhibat la concentraii de 8-10% NaCl. Staphylococcus aureus este agentul specific responsabil pentru enterointoxicaii. Produce intoxicaii alimentare prin elaborarea de enterotoxine foarte termostabile, cu rat redus de letalitate i cu o perioad scurt de incubare chiar dup 30 minute de la ngerare, n general dup 3-6 ore. Se transmite de la indivizii purttori de tulpini enterotoxice la care rezid ca saprofit n fosa nazal i se elimin prin secreii nazale i expectoraie, fiind ejectat n picturi, prin tuse i strnut. Se mai transmite n timpul fumatului cnd degetele ating buzele sau nasul, n timpul

56

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE mncatului, prin intermediul tacmurilor. Este rezident de tranzit al pielii i prului i permanent n tractul intestinal, nct contaminarea este categoric datorat unei manipulri i procesri neigienice a alimentelor. Intoxicaiile stafilococice sunt asociate cu consumul unor alimente gata preparate pstrate la temperatura camerei: creme, fric, produse de patiserie, plcint de carne, ou, unc, lapte de la animale bolnave. Cu excepia laptelui i a brnzeturilor care pot fi contaminate de la animale bolnave de mastit, celelalte sunt contaminate prin intermediul omului. Riscul de intoxicaie crete deoarece prin dezvoltarea acestor bacterii, nu apar n mod obligatoriu modificri de gust i miros ale alimentului, chiar cnd numrul lor este de sute de milioane per gram. Microorganisme patogene transmisibile prin alimente Dintre agenii toxiinfeciilor alimentare, fac parte bacterii aparinnd urmtoarelor genuri/specii: Salmonella cuprinde specii ce sunt ageni importani ai toxiinfeciilor alimentare: Salmonella enteridis, S.dublin, S.typhymurium .a. Aproape toate alimentele pot fi contaminate n condiii neigienice de manipulare. Aceste bacterii se pot nmuli pe alimente, dar nu produc modificri senzoriale; sunt frecvent ntlnite n ou proaspete, congelate sau sub form de pulbere, n lapte praf, pe carnea de pui, crnai, homari, scoici etc. Peste 40% din puii tiai i comercializai pot fi contaminai cu bacterii. De la acetia, indirect se pot contamina alte alimente n timpul pstrrii sau preparrii, nct este o cale major pentru Salmonella de a ptrunde n hran. Toxinele sunt intracelulare, deci se formeaz i rmn n celula bacteriei. n cazul fierberii oulelor dac glbenuul a rmas fluid salmonelele pot supravieui. Controlul infeciilor cu salmonele este dificil deoarece ele pot crete la temperaturi sczute de 6C, mor lent n timpul pstrrii alimentelor prin congelare, dar rezist n produse uscate i pot fi eliminate din alimente numai prin tratament termic adecvat. Shigella (Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei) sunt bacterii patogene de origine intestinal transmisibile prin ap, care nu cresc n alimente. Contaminarea accidental a alimentelor (cu excreii ale indivizilor bolnavi de dezinterie) i ingestia unui numr de minimum 108 celule aparinnd lui Sh.dysenteriae, dup o incubare de 4-7 zile, ca urmare a producerii de exotoxine proteice cu activiti citotoxice, neurotoxice i enterotoxice, au loc inflamaii i ulceraii ale intestinului. Persoanele bolnave pot fi purttori ai bacteriilor patogene, timp de cteva sptmni. Listeria monocytogenes produce rar listerioze (letalitate n 20-50% din cazuri) cu o perioad de incubaie de cteva sptmni. Recent s-a stabilit c aceste bacterii foarte rspndite n ap, sol, plante, pot fi vehiculate prin alimente. Detectarea bacteriilor n alimente este dificil i cele mai rapide metode dureaz minimum 4 zile. Bacterii din genul Listeria au fost gsite n lapte nepasteurizat, pete afumat la rece, n unele brnzeturi, n particular n Brie i Camembert. Pe vegetale pot crete dup ce acestea au fost tiate, n contact cu sucul celular. Se apreciaz c 25% din cele aproximativ 1600 de cazuri depistate anual, pot avea efect letal. Escherichia coli poate prezenta tulpini patogene, ageni ai enteritei infantile, enteropatogene, care se pot dezvolta pe epiteliul intestinal, verocytoxice, produc colite hemoragice. Enterotoxinele produse de E.coli sunt endotoxine legate ferm de peretele celular, pot fi proteine termolabile care se inactiveaz la 60C n 30 de minute i se distrug complet la pH = 3,5-5, rezistente la aciunea tripsinei. Majoritatea tulpinilor normal ntlnite n microbiota intestinal aparinnd lui E.coli sunt lipsite de

57

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE risc i pot fi folosite ca indicatori igienico-sanitari n controlul microbiologic al alimentelor. Pot contamina alimentele prin intermediul apei poluate cu materii fecale i supravieuiesc, indiferent dac alimentul e conservat prin frig. Vibrio cholerae poate produce holera i o diaree exploziv, cu efect letal n peste 40% cazuri dac nu se aplic un tratament adecvat. Poate crete pe diferite alimente i se consider c holera demareaz ca o toxiinfecie alimentar. Streptococcus (Enterococcus): S.faecalis, S.bovis, S.durans, provoac posibile stri de toxiinfecie cnd concentraia bacteriilor n produs este de 106-107/g. Bacillus cereus i n ultimii ani, Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis pot fi implicate n producerea de mbolnviri cu etiologie mixt (intoxicaie i infecie). Aceste bacterii pot produce sindrom emetic (greuri, stri de vom) observat dup 15 ore dup consum, frecvent prin consum de orez fiert/prjit sau sindrom manifestat prin stri diareice dup 8-16 ore, ca urmare a consumului de alimente renclzite, preparate cu boia de ardei sau alte condimente ce pot conine un numr mare de spori. B.cereus poate crete la temperaturi sczute de 10C, dar se consider c toxinele pot fi elaborate la temperaturi peste 15C. Clostridium perfringens se elimin prin materiile de dejecie ale omului i animalelor i prin nerespectarea condiiilor de igien pot contamina alimentele, dar se poate transmite i prin sol, praf, ape, condimente etc. Creterea lui pe produse (alimente cu carne gata preparate, insuficient tratate termic) este asociat cu formare de acid butiric i gaze. Din cele 8 tipuri de toxine tipul A i C sunt implicate n intoxicaii alimentare i infecie. Este cunoscut prin capacitatea sa de a supravieui n mncruri gtite care nu au fost pstrate la rece n mod corespunztor, deoarece majoritatea tulpinilor nu cresc sub 15C i un numr redus de izolate au crescut la 6C. Dup ingestia alimentului contaminat are loc multiplicarea bacteriilor n intestinul subire, producerea de enterotoxine i eliberarea de toxine prin liza celulelor. n calitate de ageni ai toxiinfeciilor alimentare sunt vizate i genuri mai puin studiate ca: Enterobacter, Citrobacter, Hafnia, Klebsiela, i altele, crora n ultimii ani li se acord o mare importan. Mai sunt denumite i bacterii nonfecale fiind prezente pe produse vegetale, n ape, fiind constitueni normali ai microbiotei aerului, pe suprafee, ambalaje, mini, de pe care pot fi transferate la manipularea alimentelor. Microorganismele patogene transmisibile prin alimente dau anual zeci de milioane de cazuri de mbolnviri intestinale. Pentru oamenii sntoi disconfortul produs de diversele simptome (starea de vom, crampe abdominale i diaree) poate fi de scurt durat, n schimb la oamenii cu imunitate slab (cum ar fi cei bolnavi de SIDA) simptomele sunt mai severe, infecia este greu de tratat i poate avea efect letal. Trebuie subliniat c, termenul general pentru mbolnviri ale omului, cauzate prin ingerarea de alimente contaminate, ntlnit n literatura de specialitate prin traducere din limba englez (Food poisoning) este cel de toxiinfecie alimentar sau intoxicaie alimentar. Pentru acurateea exprimrii se recomand folosirea termenului de contaminare atunci cnd microorganismele ajung din diferite surse, de exemplu: pe produse alimentare procesate. Termenul de infestare exprim n mod corect contaminarea cu: insecte, larve, ou, nematozi etc.

12. MICROBIOLOGIA LAPTELUI I A PRODUSELOR DERIVATE

58

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 12.1. MICROBIOTA LAPTELUI Laptele este un produs foarte valoros din punct de vedere nutritiv deoarece conine n cantiti corespunztoare surse de C, N, substane minerale i factori de cretere. Laptele are un pH de 6,5 (laptele de vac) i rH = 12-18, (domeniu favorabil activitii microorganismelor facultativ anaerobe). Dac laptele se pstreaz, la suprafaa lui se acumuleaz un strat de grsime astfel nct accesul aerului este oprit, are loc reducerea potenialului redox i se pot dezvolta astfel bacteriile anaerobe. Datorit compoziiei sale, laptele este un mediu excelent pentru dezvoltarea numeroaselor microorganisme, dar bacteriile lactice au condiii favorizante. 12.1.1. Contaminarea intern a laptelui Are loc n timpul colectrii laptelui, ca urmare a ptrunderii n lapte a unor microorganisme patogene, sau a unor substane transmisibile de la animalul bolnav. Microorganisme patogene Genul Mycobacterium conine 50 de specii dintre care obligat patogene: M. tuberculosis tip uman, agentul tuberculozei, M.bovis (Mycobacterium tuberculosis tip bovis), M.leprae .a. De la animalele bolnave de tuberculoz se poate transmite prin lapte Mycobacterium bovis, bacterie descoperit n 1882 de ctre Robert Koch. Nu se nmulete n lapte, dar poate supravieui chiar zile i sptmni. Dei se pare c tipul bovis nu ar provoca mbolnviri ale omului, au existat situaii n care indivizii cu imunitate sczut s-au mbolnvit prin consum de lapte contaminat. mbolnvirea const n apariia de leziuni ale faringelui i mrirea nodulilor limfatici. Deci Mycobacterium tuberculosis tip uman se rspndete de la om la om i d tuberculoza pulmonar, n timp ce tipul bovis se transmite frecvent prin lapte nepasteurizat i produce tuberculoze nepulmonare. Pentru evitarea oricrui risc, laptele contaminat este preluat de ntreprindere pe linii separate i n mod obligatoriu se face o pasteurizare corespunztoare pentru a distruge aceste bacterii patogene, care au o termorezisten superioar altor patogeni transmisibili prin lapte. Genul Brucella cu speciile B.abortus, B.melitens, se pot transmite prin lapte de vac, ovine, caprine sau prin inhalarea aerosolilor cu bacterii i pot produce mbolnviri prin infecie, manifestat prin avort spontan i septicemie. Bacteriile din genul Brucella sunt inactivate rapid la temperaturi de peste 60-65C, n schimb n laptele crud pot rezista mult timp. Brucella abortus transmisibil prin lapte de la animale bolnave supravieuiete n lapte pstrat la 0C timp de 40 zile. Streptococii patogeni: Streptococcus pyogenes produce inflamaii ale esuturilor, este distrus la pasteurizare, dar poate ptrunde n laptele pasteurizat de la indivizii bolnavi. Streptococii responsabili pentru mastita la vaci (inflamarea ugerului) sunt: Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberus. Staphylococcus aureus se nmulete n lapte dac nu se produce o rcire corespunztoare a acestuia i poate produce enterotoxine. Genul Salmonella prin lapte contaminat se pot transmite S.typhi, S.dublin, S.heidelberg i S.newport care au fost izolate din lapte colectat de la vite cu febr i enterit, fr mastit. Se pot nmuli n lapte proaspt, dar odat cu acumularea de acid lactic i scderea pH-ului la 5-4,3 nmulirea este oprit, n schimb acestea pot supravieui 2-9 sptmni.

59

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Dintre bacteriile patogene pentru om prin lapte se mai pot transmite Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Campylobacter, Yersinia, Pasteurella. Prin lapte se mai pot transmite i virusuri, ageni ai bolilor virale: poliomelita, hepatit .a., iar virusul agent al febrei aftoase la vite rezist n lapte pstrat la 5C timp de 12 zile. Microorganisme nepatogene Bacteriile lactice: genul Lactococcus prezena lor este constant normal n lapte; bacterii ale genului Lactobacillus sunt mai rar ntlnite. Numrul microorganismelor ce ajung n lapte din surse interne poate varia ntre 1000-1500 celule/cm3, microorganisme prezente, indiferent de condiiile igienico-sanitare aplicate. Alte substane transmisibile prin lapte Prin contaminarea intern mai pot ajunge accidental n lapte antibiotice atunci cnd animalele au fost sub tratament, care influeneaz negativ activitatea bacteriilor lactice, sensibile la antibiotice. Cnd animalele au fost furajate cu produse mucegite i au ingerat eventual micotoxine, acestea pot fi transformate n organismul animal i eliminate n lapte, de exemplu sub form de aflatoxine: M1, M2 cu efect toxic mai sczut dect al celor de tip B1, B2. 12.1.2. Contaminarea extern a laptelui Este datorat microorganismelor din surse contaminante ale mediului ambiant i are loc n timpul mulgerii, la transport/pstrare de la punctul de colectare la fabric pn n momentul prelucrrii laptelui, prin contact cu vasele, aparatele de colectare i transport, aer. Principalele surse de contaminare cu microorganisme (inofensive, periculoase pentru sntate sau care dau alterarea calitii) sunt: fecale i tegumente, surse de coliformi, bacterii patogene de origine intestinal. Prin intermediul materiilor fecale de la om la animale bolnave se pot transmite urmtoarele microorganisme patogene: Bacillus anthracis (produce antraxul), Bacillus cereus agent al gastroenteritelor; Salmonella sp. ageni ai toxiinfeciilor alimentare; Shigella ageni ai dezinteriei; specii patogene ale genurilor: Proteus, Psudomonas, Klebsiella. O surs important o prezint prul i pielea (108 - 4109 celule/g pr). Contaminarea poate avea loc frecvent prin intermediul apei, a blegarului (8106 - 18109 celule/g). Ugerul splat i zvntat reduce contaminarea extern a laptelui; sol poate fi o surs de contaminare cu bacterii Streptomyces, Clostridium, Bacillus, spori de mucegai; aer i ap, cu microorganisme diverse. Contaminarea prin intermediul aerului din grajd (106/dm3) e mai abundent dac s-a fcut furajarea, datorat prafului, motiv pentru care mulgerea se face nainte de hrnirea animalelor; echipamentele de la colectare i pstrare pot fi o surs important de contaminare a laptelui cu bacterii lactice, micrococi, Clostridium, Psudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Acinetobacter, drojdii. Contaminarea poate avea loc i prin intermediul vaselor de colectare, deoarece laptele formeaz pe suprafaa vaselor o pelicul, iar dac n recipient se face nclzirea, pe suprafaa pereilor se formeaz piatra de lapte, un amestec de fosfai i sruri minerale deosebit de rezistent, care face dificil ndeprtarea microorganismelor aderente; personal, purttor de stafilococi eliminai prin expectoraie i prin materii fecale, n condiii neigienice;

60

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE vectori diveri, de ex., insecte (o musc poate introduce n lapte aprox. 106 microorganisme). Contaminarea extern este ocazional dat de numeroase alte grupe de microorganisme care prin activitatea lor poate fi n marea lor majoritate, ageni de alterare. 12.1.3. Calitatea microbiologic a laptelui Este dependent de contaminarea iniial, de cea care continu la transport i n vasele de colectare, de temperatur i durata de pstrare. Pentru a preveni nmulirea n exces a microorganismelor se recomand rcirea rapid a laptelui de la 37C la 5C. Dac laptele este pstrat la temperaturi sczute, n lapte se vor dezvolta predominant bacteriile psihrotrofe care pot produce enzime termostabile ce pot rmne active dup pasteurizare i pot da defecte n produsele finite. Dac laptele nu este rcit n cteva ore de la colectare, numrul de microorganisme ajunge la valori de ordinul 106 cnd rcirea va avea o eficien redus. 12.1.4. Microbiologia laptelui pasteurizat Prin pasteurizarea laptelui se urmrete distrugerea eventualelor bacterii patogene transmisibile prin lapte, ca i reducerea numrului de bacterii care dau alterri ale laptelui. Pentru a asigura calitatea sanitar a laptelui n industria laptelui se folosesc urmtoarele regimuri de tratare termic: pasteurizare joas la 63C timp de 30 minute (low temperature, long time); pasteurizare la 75C timp de 15-20 secunde n sistem HTST (high temperature, short time). Acest regim este stabilit innd cont ca Mycobacterium tuberculosis tip bovis este distrus la 61,6C/28,5 minute i la 71,6C n 14 secunde, la care este prevzut n plus, o limit de siguran. Laptele pasteurizat nu conine microorganisme patogene deoarece prin respectarea regimurilor de T/t sunt inactivate toate bacteriile patogene ocazional transmisibile prin lapte, sterilizare la 132-138C timp de 1-2 secunde, n sistem UHT (ultra high temperature). 12.1.5. Defecte de natur microbian ale laptelui crud i pasteurizat n timpul pstrrii laptelui crud sau laptelui pasteurizat apar anumite defecte datorate activitii microorganismelor care au ajuns n lapte i nu au fost inactivate prin pasteurizare. Dintre defecte ocazional pot fi ntlnite: acidifierea i coagularea prin acumularea de acid lactic, proteinele din lapte pot s precipite i are loc coagularea acid a laptelui la pH = 4,6 i separarea de zer. Laptele este acru cnd numrul de bacterii lactice aparinnd genului Lactococcus cu specia Lactococcus lactis este de 10106-40106/cm3. Alterarea laptelui pasteurizat este cauzat de streptococii rezisteni la tratamentul termic aplicat care produc acid lactic pn pH-ul scade la 4,6 i are loc coagularea acid. Dac sunt prezeni i lactobacili, pH-ul scade la 4. Laptele pasteurizat, prin pstrare la temperaturi de refrigerare poate suferi o coagulare neacid datorat activitii lui Pseudomonas fragi;

61

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE coagularea acid asociat cu formarea de gaze cu formarea unui coagul buretos poate fi datorat fermentaiei lactozei de ctre Enterobacter aerogenes i Clostridium perfrigens; coagularea neacid este datorat proteazelor produse de Bacillus subtilis, Bacillus cereus i uneori prin dezvoltarea micrococilor i a lui Enterococcus faecalis; proteoliz i lipoliz sunt procese enzimatice ce au loc prin meninerea laptelui la temperaturi sczute i sunt produse de bacterii coliforme, bacterii ale genului Pseudomonas i de ctre alte bacterii lipolitice din genurile: Bacillus, Acinetobacter i Achromobacter; colorarea apare la laptele crud n timpul verii n urma dezvoltrii unor microorganisme productoare de pigmeni astfel: Chromobacterium cianogenum i Pseudomonas syncyanca produc pigmeni albatri; Brevibacterium prodigiosus i Brevibacterium erytropeus dau pigmeni roii; gustul amar poate fi ntlnit n laptele proaspt atunci cnd ncrctura microbian este foarte mare nainte de pasteurizare i este dat de bacterii peptonizante din genurile: Microbacterium, Enterobacter, Enterococcus. Produc peptide amare prin hidroliza proteinelor laptelui. Gustul amar poate proveni i prin activitatea de oxidare ya lactozei la acid lactobionic (genul Pseudomonas); alcalinizarea laptelui datorat eliberrii de amoniac prin activitatea lui Psudomonas flurescens, Alcaligenes faecalis; gustul de caramel la dezvoltarea n lapte a lui Lactococcus maltigenes; defecte de consisten coagularea cazeinei sub aciunea bacteriilor lactice sau mrirea vscozitii laptelui datorat dezvoltrii unor microorganisme ce produc substane de natur poliglucidic dnd lapte filant, ca de exmplu: Alcaligenes viscolactis, g. Micrococcus, g.Enterobacter. 12.1.6. Microbiologia laptelui praf La obinerea laptelui praf se folosete un lapte degresat de calitate microbiologic foarte bun. Prin operaia de centrifugare, n smntn, se elimin aproximativ 60% din microbiota bacterian a laptelui. Urmeaz apoi pasteurizarea pentru inactivarea enzimelor i reducerea numrului de bacterii, concentrarea i uscarea prin pulverizare. Temperatura de uscare este astfel dirijat nct s ating 72C pentru a inactiva eventualele bacterii patogene. Laptele praf are o umiditate de 3-3,5% care nu permite nmulirea microorganismelor. Bacteriile se afl n stare de xeroanabioz i nu influeneaz calitatea dac umiditatea este mai mic de 3,5%. Ocazional n microbiota laptelui praf pot fi ntlnite bacterii sporogene Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, micrococi, Enterococcus faecalis, Enterococcus bovis i alte bacterii termorezistente. Laptele praf este un produs higroscopic nct dac dup deschiderea ambalajului umiditatea crete >11% se produce mucegirea, rncezirea i modificarea gustului. Din punct de vedere microbiologic se admit 510 47104/g (pn la 2000 de microorganisme per cm3 lapte reconstituit 1/10), iar Escherichia coli s fie absent la 1 g. 12.2. MICROBIOLOGIA PRODUSELOR LACTATE ACIDE Produsele lactate acide se obin ntr-o gam variat ca urmare a inoculrii cu culturi specifice, dei folosesc aceeai materie prim (laptele pasteurizat). Produsele lactate acide au valoare nutritiv i valoare biologic ridicat, deoarece prin consumul de bacterii lactice (ocazional drojdii), omul beneficiaz de prezena unor

62

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE vitamine produse de aceste microorganisme. Bacteriile lactice pot produce substane cu efect antibiotic ca: bulgaricina, acidofilina, care pot grbi vindecarea bolilor gastrointestinale. Unele bacterii lactice se pot adapta n organismul uman, deoarece au temperatura optim de 37C cum ar fi cele izolate din microbiota intestinal a sugarilor (Lactobacillus acidophillus i Lactobacillus bifidus). Tehnologiile de preparare a acestor produse au la baz utilizarea de culturi de bacterii lactice selecionate ce se folosesc sub form de monoculturi sau culturi mixte cu proprieti biotehnologice corespunztoare pentru obinerea unor produse de calitate constant. La obinerea produselor lactate acide, n prima etap se realizeaz n laboratorul uzinal activarea culturilor pure pentru obinerea cantitii de inocul necesar n declanarea fermentaiei lactice. Inoculul de producie (maia) trebuie preparat n cantiti suficiente, nct prin inocularea laptelui pasteurizat s existe un numr de celule de bacterii lactice care s depeasc de cel puin 1000 de ori pe cel al microorganismelor existente n microbiota rezidual a laptelui pasteurizat. Pentru activarea culturii pure de bacterii lactice, n fabric se execut 2-4 pasaje sau inoculri succesive, inoculri care se fac la intervale n care se asigur timpul i temperatura optim pentru creterea i activitatea celulelor inoculate Pasajul de la volume mici la volume mari pentru obinerea inocului de producie se realizeaz dup ce a avut loc coagularea laptelui, care corespunde cu sfritul fazei exponeniale de cretere bacterian. ntre etape se face controlul microbiologic al culturii i se determin aciditatea, iar prin examen microscopic se determin puritatea i concentraia de celule, prin metoda Breed. 12.2.1. Microbiologia iaurtului Iaurtul (yogurt) denumete corect, produsul obinut prin fermentarea laptelui cu o cultur mixt din 2 specii de bacterii lactice termofile, Streptococcus thermophillus (SST) i Lactobacillus bulgaricus (LDB), care trebuie s existe n stare vie n produsul final (aprox. 106 ufc/g iaurt). Rolul culturii starter la fabricarea iaurtului. n culturile starter pentru iaurt raportul ntre Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophillus este de 1:1. n cultura mixt ntre bacteriile lactice se stabilesc relaii de cooperare, fiecare monocultur produce substane care nu sunt iniial prezente n lapte i care influeneaz pozitiv creterea celeilalte. Producerea de acid lactic de ctre LDB este stimulat la concentraii sczute ale acidului formic produs de SST n absena oxigenului ct i de CO2 eliberat prin fermentaie. Streptococii cresc mai repede i sunt responsabili pentru aciditate n timp ce lactobacilii adaug arom n special datorit formrii aldehidei acetice. Prin activitatea lor, lactobacilii care au activitate peptidazic produc compui cu azot, asimilabili pentru streptococi ceea ce explic relaia de sinergism ntre streptococi i lactobacili la fabricarea iaurtului. Rolul streptococilor i lactobacililor la obinerea iaurtului const n acidifierea laptelui, sinteza de arom, dezvoltarea texturii i a vscozitii. Interaciunile ntre bacterii lactice din iaurt sunt deosebit de complexe i benefice pentru stimularea creterii activitilor fermentative. S. thermophillus nu posed activitate proteolitic extracelular suficient, iar cantitatea de aminoacizi i peptide libere n lapte nu sunt suficiente pentru creterea sa optim. Lactobacilii produc proteaze care degradeaz cazeinele laptelui i asigur streptococilor sursele necesare de azot pentru cretere. Activitatea endopeptidazic a lactobacililor este

63

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE intracelular i este optim la 45-50C i pH = 5,25,8 i sunt inactivate la 70C timp de 1 minut. Proteinazele din Lb. bulgaricus sunt active fa de cazein. Prin activitatea proteazic lactobacilii termofili contribuie la ameliorarea proprietilor reologice, a digestibilitii i aromei. n timpul fabricrii iaurtului numrul maxim de bacterii lactice ajunge la valori de 109/g, apoi numrul se reduce progresiv la pstrare la 107/g. n iaurtul congelat bacteriile lactice au supravieuit i dup 60 sptmni. 12.2.2. Produse fermentate cu bifidobacterii Produsele fabricate din lapte cu culturi de bifidobacterii pot fi lichide, de tip iaurt sau sub form de pulberi i conin n mod obligatoriu concentraii de 108-109 celule vii/cm3. Bio-iaurtul, produs recent introdus n consum, conine pe lng bacteriile specifice iaurtului, bacteriile Lactobacillus acidophillus i Bifidobacterium bifidum. Produsul are efect benefic suplimentar deoarece amelioreaz creterea bacteriilor care n mod normal fac parte din microbiota intestinal. Echilibrul acestor bacterii este considerat a fi foarte important n meninerea sntii intestinale i ar putea ajuta la protecie fa de unele boli majore cum ar fi cancerul i bolile coronariene. Bifidobacteriile au temperatura optim de 36-38C, nu sunt acidotolerante i nu se nmulesc la temperaturi mai mici de 5,5C. Folosirea de bifidobacterii poate conduce la obinerea de produse aromate dac se adaug proteine din zer bogate n treonin, ca precursor pentru acumularea de aldehid acetic. 12.2.3. Microbiologia chefirului Acest produs se obine utiliznd un amestec de streptobacterii mezofile asociate cu drojdii din genul Torulopsis, microorganisme care sunt fixate pe cazeina coagulat sub forma granulelor de chefir. ntre aceste culturi apar relaii de simbioz deoarece bacteriile lactice beneficiaz de vitaminele din grupa B produse de drojdii, iar drojdiile au activitate fermentativ optim la valori acide de pH. Pentru inocularea laptelui se folosesc granulele de chefir cu dimensiuni de 0,5-3,5 cm constituite din protide i poliglucide rezultate prin activitatea biomasei microbiene. 12.2.4. Microbiologia cumsului Cumsul se obine din lapte de iap mai bogat n lactoz (6,2%) i conine 2% alcool etilic rezultat prin fermentaia lactozei. Drept culturi starter se folosesc Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactis, Acetobacter aceti i drojdii din genul Torulopsis i Kluyveromyces marxianus care produc fermentaia alcoolic i mici cantiti de aldehid acetic. n cums i chefir activitatea lipazic a bacteriilor lactice este limitat, n schimb drojdiile dau cantiti mari de acizi grai liberi: caproic, caprilic i lauric, ce contribuie la gustul specific. 12.2.5. Defecte de natur microbian a produselor lactate acide n cazul produselor lactate acide pstrate mai mult timp sau ca urmare a procesului tehnologic defectuos, acestea pot suferi diferite tipuri de alterri microbiene: Brnza proaspt de vaci poate suferi defectul de acrire, cnd se pstreaz la temperaturi ridicate i gustul amar atunci cnd predomin bacteriile sporulate. Se

64

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE presupune c gustul amar rezult din formarea peptidelor amare, care conin acid pirolidon carboxilic ce poate rezulta din transformarea acidului glutamic. Smntna poate suferi defectul de mucegire de Geotrichum. n condiiile n care n grsime rmn bacterii lipolitice la pstrare se produce rncezirea hidrolitic cu eliberarea de acizi grai care prin oxidare genereaz aldehide, cetone. n smntn trebuie s fie absente bacteriile patogene i se admit 20 bacterii coliforme/g smntn. 12.3. MICROBIOLOGIA UNTULUI La fabricarea untului se poate folosi smntna dulce i mai frecvent smntna fermentat. n acest scop smntna dulce este pasteurizat i dup rcire este inoculat cu culturi mixte de bacterii lactice aromatizante productoare de acid lactic, diacetil i acetil metil carbinol. Dintre acestea fac parte Lactococcus cremoris, Lactococcus diacetylactis i Leuconostoc mesenteroides. Aceste bacterii pot produce substane de arom din acidul piruvic format prin fermentaia lactozei, sau din acidul citric prezent n lapte. n general dup fermentare la 22C, timp de 24 ore, smntna maturat cu aproximativ 55Thrner (pH 4,7), sufer operaia de batere cu separarea n zar a unui numr mare de microorganisme. Urmeaz splarea masei de unt cu ap pur din punct de vedere microbiologic, malaxarea i caluparea. Se recomand ca apa potabil se sufere n prealabil o clorinare cu 5-10 mg Cl2/dm3, timp de 15 minute pentru o decontaminare suplimentar. Prin malaxare are loc dispersarea fin a apei, astfel nct untul poate conine aproximativ 1010 micropicturi per gram, majoritatea cu diametrul < 5 m reinnd aproximativ 2% din microbiota apei. Numrul de microorganisme n untul proaspt din smntna fermentat este de aproximativ 107-109/g. n absena oxigenului i a nutrienilor are loc treptat o reducere a numrului de lactococi, nct dup o lun de pstrare n microbiota untului predomin micrococi i drojdii, microorganisme ce pot proveni din apa de splare sau antrenate de pe suprafaa utilajelor. n untul din smntna dulce predomin microbiota remanent ataat de globulele de grsime separate la centrifugare la care se adaug microorganisme de contaminare astfel nct numrul de celule poate fi de ordinul 105-106/g. n funcie de temperatura de pstrare, evoluia creterii microorganismelor este difereniat. Prin pstrare la temperaturi de 15C are loc o cretere a numrului de bacterii lactice, care ajung la concentraii de 107/g, n schimb la pstrarea la 5C se dezvolt mai intens bacteriile psihrofile, cu activitate lipolitic i proteolitic. Defecte de natur microbiologic la pstrarea untului La pstrarea untului, n funcie de natura microorganismelor de contaminare i numrul lor, se pot produce urmtoarele defecte: Rncezirea microorganismele care sintetizeaz lipaze exogene pot produce hidroliza lipidelor din unt cu formare de acizi grai i care iniiaz rncezirea hidrolitic. Dintre bacteriile productoare de lipaze: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putrefaciens, g. Flavobacterium, g. Alcaligenes, care pot contamina untul dup pasteurizare, de pe echipamente sau din apa de splare. Gustul putrid rezult prin activitatea bacteriilor cu activitate proteazic i lipolitic ale genului Pseudomonas cu speciile Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas nigrifaciens. Este sesizat un miros specific datorat formrii de acid izovalerianic i poate avea loc colorarea n negru la suprafaa untului.

65

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Mucegirea untului se poate produce superficial de ctre mucegaiuri productoare de lipaze din g. Aspergillus, g. Penicillium, iar mucegirea intern de ctre Cladosporium herbarum, mucegai microaerofil ce se dezvolt n micropicturi de lichid din masa de unt, formnd puncte negre, inestetice. Din grupul fungilor mai pot fi ntlnite pe suprafaa untului reprezentani ai genurilor Alternaria, Mucor, Rhizopus, Geotrichum, Torulopsis. Pentru aprecierea calitii untului, standardele prevd absena bacteriilor coliforme pe gram produs i admit, n funcie de calitatea untului, ntre 1000-2000 celule de drojdii i mucegaiuri/g. 12.4. MICROBIOLOGIA BRNZETURILOR Brnzeturile se obin ntr-o gam variat de sortimente, peste 600, variante posibile prin modificarea componentelor principale din lapte sub aciunea culturilor selecionate de microorganisme folosite drept culturi starter la prelucrarea laptelui. Pentru obinerea brnzeturilor se poate utiliza laptele ca atare n care bacteriile lactice trebuie s reprezinte peste 50% din totalul microbiotei, cu restricii privind prezena bacteriilor butirice (absente la 1 cm3), a bacteriilor coliforme, a bacteriilor de putrefacie din genul Pseudomonas. Pentru evitarea unor defecte i a riscului de transmitere a unor bacterii patogene de la animale bolnave, dup colectarea laptelui i verificarea lui din punct de vedere calitativ i cantitativ se efectueaz pasteurizarea n regim t/T care s nu produc denaturarea proteinelor laptelui i s asigure distrugerea microorganismelor patogene transmisibile prin lapte. Dup rcire se realizeaz inocularea laptelui cu monoculturi sau culturi mixte specifice, are loc nmulirea bacteriilor concomitent cu fermentaia lactic, iar etapele tehnologice urmresc s dirijeze activitatea util a culturilor starter. Brnzeturile nu reprezint un substrat ideal pentru dezvoltarea tuturor microorganismelor, dar unele microorganisme, din care fac parte i microorganismele selecionate, utilizate drept culturi starter n industria brnzeturilor, sunt adaptate acestui tip de biotop. Dup inocularea n laptele pasteurizat i rcit la temperatura optim pentru culturi, bacteriile produc fermentarea lactozei cu formare de acid lactic i substane de arom. La sortimentele de brnzeturi cu past moale, fermentaia lactic dureaz 4-6 ore pn cnd, prin formarea de acid lactic pH-ul scade sub 4,5, cnd se produce coagularea acid a cazeinei din lapte. La sortimentele de brnzeturi cu past tare, de exemplu, cnd pH-ul ajunge la valoarea de 5, n laptele fermentat se adaug enzime proteolitice din cheag, active la acest pH i are loc coagularea enzimatic. n lapte are loc multiplicarea bacteriilor lactice favorizat de prezena lactozei, a surselor asimilabile de azot (aminoacizi i peptide), a potenialului de oxidoreducere favorabil. Rolul principal al bacteriilor lactice la fabricarea brnzeturilor este producerea intens i sigur de acid lactic. Fermentaia are loc rapid la concentraie iniial de celule de 1109 /cm3, care reprezint masic aproximativ 500 g substan uscat per cm3 i necesit pentru sinteza acesteia 260 g proteine. Coagularea laptelui const n transformarea cazeinei solubile n paracazeinat insolubil i se poate realiza pe dou ci:

66

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE coagularea acid poate avea loc ca urmare a acumulrii de acid lactic rezultat prin fermentaie atunci cnd prin scderea de pH se ajunge la punctul izoelectric al cazeinei din lapte; se formeaz paracazeinat insolubil i lactat de calciu; coagularea enzimatic se realizeaz cu enzime proteolitice coagulante, cnd se obine, prin formarea de paracazeinat insolubil, un coagul compact, mai bogat n calciu. Dintre enzimele coagulante sunt folosite: cheagul, obinut prin extragere din stomac de miel (viel), conine un complex de enzime proteolitice din care fac parte: chimotripsina, tripsina, plasmina i renina; enzime de origine vegetal: papaina, bromelaina, ficina, folosite n ri cu climat cald; enzime de natur microbian, se obin cu ajutorul unor microorganisme selecionate cu speciile: Mucor pussilus, Mucor miehei, Endothia parasitica. Prelucrarea coagului. n funcie de sortimentul de brnz, coagulul este supus operaiei de tiere (mrunire), care favorizeaz separarea zerului. n timpul operaiei are loc n continuare multiplicarea bacteriilor, iar prin separarea zerului se apreciaz c aproximativ 2/3 din microbiota laptelui rmne n coagul i restul se elimin o dat cu zerul. Maturarea brnzeturilor. Este o etap foarte important pentru calitatea produsului finit i este rezultatul activitii complexe a celulelor microbiene vii, a enzimelor microbiene exogene ale acestora sau a enzimelor eliberate n urma procesului de autoliz a celulelor nevii, precum i a enzimelor native ale laptelui sau adugate cu cheagul, asupra principalelor componente din coagul i anume: lactoz nefermentat, lactai, acid lactic, protide i lipide. Ca rezultat al formrii de lactat de calciu se reduce aciditatea n past i devine posibil activitatea bacteriilor care necesit pentru dezvoltare valori neutre de pH. La maturare se produce o hidroliz limitat a proteinelor din lapte, n special a cazeinei, cu formarea de compui cu masa molecular redus, uor digerabili i a aminoacizilor. Prin maturare are loc creterea gradului de digestibilitate i a valorii nutritive. Aminoacizii rezultai la maturare pot suferi reacii de transaminare, decarboxilare, dezaminare, iar produsele rezultate pot fi aldehide, alcooli .a., ceea ce explic diversitatea gustului i aromei. Lipidele sub aciunea lipazelor produse de culturi sau provenite din cheag sau lapte sunt transformate n glicerol, surs de carbon pentru microorganisme, iar acizii grai sunt transformai parial n aldehide, cetone, compui ce dau un gust picant, specific. Particulariti microbiologice la fabricarea unor brnzeturi Brnza Camemberti. Microorganismele utile sunt reprezentate de Lactococcus cremoris i Lactococcus diacetylactis, iar dintre lactobacili Lactobacillus plantarum i Lactobacillus casei. Dup 2 zile de la formare se pulverizeaz cu spori de Peniclillium camemberti i maturarea are loc la 12C i umezeala relativ de 95%. Dup 10 zile se mpacheteaz n folie i se las 20 zile la temperatura camerei. Enzimele fungice difuzeaz din exteriorul formei de brnz spre interior i se produce maturarea, nmuierea pastei. Brnza Roquefort. n acest tip de brnz fabricat din lapte pasteurizat domin genul Lactococcus, genul Leuconostoc, speciile Lactobacillus plantarum i Penicillium roqueforti. Brnzeturi cu past presat i desen (Emmental, Gruyere, vaier). Se caracterizeaz prin asociaia a dou fermentaii respectiv lactic, prin inoculare cu

67

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Streptococcus thermophillus, Lactobacillus helveticus i Lactobacillus bulgaricus i propionic prin inoculare cu Propionibacterium shermani care se succed n timp. Fermentaia lactic se deruleaz n primele 24 ore pn se atinge un pH de 5,2-5,3 iar fermentaia propionic are loc la maturare i dureaz cteva sptmni/luni. Microbiologia brnzeturilor topite. Se obin prin topirea brnzeturilor maturate cu defecte fizice, la 70-95C timp de 5-30 minute. Microbiota este alctuit din microorganisme termotolerante, rezistente la temperatura de topire: streptococi termofili, enterococi, lactobacili i bacterii butirice. Dup topire numrul de microorganisme vii este de aproximativ 103/g, dar prin pstrare se poate obine o cretere pn la valori de 106/g. Pstrarea brnzeturilor topite se impune s se realizeze la temperatura de 8C. Alterri microbiene ale brnzeturilor n condiii de nerespectare a procesului tehnologic i a condiiilor igienicosanitare la prelucrarea laptelui, n urma activitii microorganismelor de contaminare pot avea loc alterri ale brnzeturilor cu modificarea calitii senzoriale i pierderea valorii alimentare. Dintre defectele ocazionale ntlnite n brnzeturi cele mai frecvent ntlnite sunt: Balonarea timpurie apare dup 1-2 zile de la formare i este datorat prezenei n numr mare a bacteriilor coliforme Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis etc. Aceste bacterii se pot nmuli concomitent cu bacteriile lactice i produc fermentaia lactozei cu formarea de acid lactic, acid acetic, CO2 i H2. Ca urmare a degajrii intense de gaze, n condiiile n care coaja nu este penetrabil apare balonarea formei de brnz, iar n seciune pasta este buretoas cu alveole mici, neuniforme. Prezena n concentraie ridicat a celulelor de Escherichia coli, facultativ patogen, productor de enterotoxine, poate conduce prin consumul brnzei alterate la starea de toxiinfecie. Defectul poate fi ntlnit la brnzeturi cu past moale tip Camembert, ca urmare a multiplicrii n perioada de maturare a bacteriilor coliforme n lapte. Balonarea trzie poate apare dup 20-60 zile (n timpul maturrii branzeturilor) i este datorat bacteriilor butirice din speciile Clostridium butiricum i Clostridium tyrobutiricum. Aceste bacterii pot proveni din sol, ap furaje, cheag etc., rezist la pasteurizarea laptelui i rmn n stare de endospori pn cnd pH-ul crete prin neutralizarea acidului lactic de fermentaie la valori mai mari de 6. n urma activitii lor prin formare de gaze (CO2 i H2) are loc balonarea, deformarea cu rupturi inestetice, neordonate n past i sesizarea gustului iute, slciu, prin acumularea acidului butiric. Balonarea brnzeturilor poate fi dat i de ctre Bacillus polymixa care utilizeaz ca surs de carbon lactaii cu eliberare de CO2. Defectul de gust amar este ntlnit n brnzeturi de tip Cheddar i Gouda i poate fi datorat activitii proteolitice a culturilor starter sau a celor adugate cu cheagul. Prin aciune lipolitic se elibereaz acizi grai cu formare de mono i digliceride responsabile pentru gustul amar. n brnza Camembert, Roquefort, pot da gustul amar i culturile fungice. Pentru eliminarea acestui defect prin metode tehnologice este favorizat dezvoltarea bacteriilor productoare de peptidaze care produc hidroliza enzimatic a peptidazelor amare la aminoacizi. Ptarea brnzeturilor este datorat bacteriilor din genul Pseudomonas. n condiii de pstrare a brnzei n mediul umed, ca rezultat al proteolizei, se formeaz tirozina care prin oxidare formeaz melanine de culoare cenuiu-brun.

68

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Mucegirea brnzeturilor defect frecvent ce duce la deprecierea unor cantiti mari de produse se caracterizeaz prin apariia de pete colorate specific, miros caracteristic, degradarea cojii i a zonelor adiacente, risc de formare a micotoxinelor i difuzia lor n past. Dintre mucegaiurile izolate din microbiota brnzeturilor alterate fac parte: Geotrichum candidum cu activitate proteazic i lipazic, lipsit de potenial toxicogen, Geotrichum auranticum, Monascus purpurens, Aspergillus sp., Penicillium sp., care produc pete diferit colorate (portocaliu, rou, brun, verzui). Concomitent cu mucegaiurile, pe suprafaa brnzeturilor se pot dezvolta drojdii ce dau modificri de culoare i aparin genurilor Rhodotorula, Candida, Debaryomyces.

13. MICROBIOLOGIA CRNII I A PREPARATELOR DE CARNE

Carnea este un produs alimentar valoros i reprezint un mediu foarte bun pentru microorganisme, care beneficiaz de un pH = 6,4-6,5, substane uor asimilabile (glicogen i acid lactic) i substane asimilabile cu azot. 13.1. SURSE DE CONTAMINARE MICROBIAN A CRNII 13.1.1. Contaminarea intern Contaminarea intern a crnii ca i a organelor este produs de microorganisme patogene care dau mbolnvirea animalului i se localizeaz n esutul muscular i organic. Dintre microorganismele patogene, care se pot transmite pe cale digestiv prin consum de carne contaminat fac parte: Mycobacterium tuberculosis de tip bovis agent al tuberculozei este inactivat prin tratamentul termic al crnii la 80-85C timp de 10 minute. Bacillus anthracis, agent al antraxului, se poate transmite prin carnea de ovine. Alte specii pot aparine genurilor Leptospira, Brucella, Coxiella .a. care se transmit pe cale cutanat. Contaminarea crnii se poate produce i n momentul sacrificrii; prin contactul cuitului cu plaga jugular pot fi antrenate microorganisme de pe suprafaa pielii i prului care sunt transmise prin circulaia sngelui n organism. Dac dup sacrificare nu se realizeaz rapid rcirea i eviscerarea se poate produce un transfer al microorganismelor din viscere i se produce contaminarea crnii cu microorganisme de origine intestinal, enterobacterii, dintre care sunt facultativ patogene/patogene: Salmonella typhi, Klebsiela, Listeria monocytogenes, Proteus, Escherichia coli. 13.1.2. Contaminarea extern n funcie de condiiile mediului ambiant i condiiile igienice la procesarea crnii (jupuire, eviscerare, despicare, toaletare) are loc contaminarea extern, cnd numrul de celule poate ajunge la 102-103/cm2 suprafa carne/carcas. Prin contaminarea extern pot ajunge pe carne bacterii din genurile: Pseudomonas, Flavobacterium alcaligenes, Bacillus, Clostridium, Micrococcus etc., bacterii de putrefacie, care se pot dezvolta pe carne chiar n condiii de refrigerare. De la indivizii bolnavi, pe cale aerian sau prin contact cu minile celor care manipuleaz carnea se pot transmite microorganisme patogene.

69

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE n cazul bovinelor, contaminarea extern se poate face la jupuire atunci cnd accidental, prul cu o ncrctur microbian de 107-108/g vine n contact cu carnea, din surse umane, prin mini murdare i mai ales cnd eviscerarea este defectuoas. Pielea i prul sunt surse importante pentru rspndirea lui Listeria monocytogenes cu diseminarea acesteia pe carcase de carne prin contact direct/indirect la tiere, sngerare, jupuire. Prin respectarea regulilor de igien se reduce numrul i numai 1,2% din carcase de bovine i 8,7% de porcine au coninut Listeria. Deoarece ndeprtarea acestora este imposibil aceste bacterii ar putea fi folosite ca indicator sanitar al condiiilor globale de igien n abatoare. Carnea obinut n condiii igienice de la animale sntoase este lipsit de microorganisme sau poate conine la suprafa un numr redus de cel mult 100 celule per gram ce pot aparine genurilor: Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Lactobacillus i numai n cazuri rare pot fi prezente salmonele. n cazul porcinelor contaminarea microbian se poate realiza mai intens dac oprirea se efectueaz pe orizontal prin imersare n bazine cu ap la 64-65C. Prin oprire repetat, apa se ncarc cu microorganisme de pe pr i piele i exist pericolul ca pulmonii s se ncarce cu un numr mare de microorganisme, mrind riscul de contaminare. O contaminare secundar a crnii cu mucegaiuri se poate transmite pe calea aerului existent n abatoare. 13.2. ALTERRI MICROBIENE ALE CRNII Alterrile microbiene ale crnii sunt dependente de natura i concentraia de microorganisme, de tipul de carne, de umezeala relativ din depozit i de temperatura de pstrare. Se pot ntlni urmtoarele tipuri de alterri: alterarea superficial prin pstrarea crnii la temperatura de 0-10C se produce lent deoarece temperaturile sczute scad viteza de metabolism a microorganismelor, iar modul de alterare este dependent de umezeala relativ a aerului din depozit. Dac aceasta este mai mare de 80-90% i suprafaa crnii este umed, este favorizat multiplicarea bacteriilor psihrofile i psihrotrofe ale genului Pseudomonas, Psihrobacter. La suprafaa crnii se formeaz un mucus format prin unirea coloniilor i modificarea structurii coloniilor din zona superficial a crnii, este sesizat mirosul de putrefacie. Dintre bacteriile productoare de mucus fac parte cele ce aparin genului Pseudomonas, bacterii Gram negative, aerobe, cu activitate lipolitic i proteolitic. Dac se pstreaz carnea la 20C (temperatura camerei) alterarea are loc mai rapid, ea este mai profund i poate fi produs de bacterii mezofile din g. Achromobacter, Escherichia, Moraxella, Proteus, Bacillus. Alterarea ncepe de la suprafa spre interior i dup consumarea oxigenului de bacterii aerobe, se produce alterarea profund. Are loc nmuierea esuturilor, modificarea culorii (rou cenuiu), hidroliza i fluidificarea grsimilor cu formarea produilor finali de putrefacie (amine i substane toxice). n carnea de vit ambalat n vacuum, modificarea culorii roii i apariia culorii verzi a fost produs de specii de Clostridium, dup 10-12 sptmni de pstrare. Mucegirea la pstrarea crnii n depozit cu umezeal relativ a aerului mai mic de 75% cnd suprafaa crnii este zvntat, alterarea poate fi produs de ctre drojdii i mucegaiuri. Drojdiile produc rar alterri ale crnii, ele se nmulesc mai bine n carnea tocat. Mucegirea este vizibil dup 1-2 sptmni de pstrare. n domeniul temperaturilor de refrigerare se dezvolt multe mucegaiuri. Mucegirea pornete de la suprafa spre interior i apar pete colorate i miceliul vegetativ poate

70

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE s ptrund n esut. Dac mucegirea s-a instalat, prin splarea crnii rmn pete mate colorate difereniat. Dintre mucegaiurile care se pot dezvolta pe carne n condiii de refrigerare fac parte: Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, Sporotrichum. Alterarea total, superficial i de profunzime, poate avea loc prin pstrarea crnii la temperaturi de 10-25C. Aceast alterare are loc i atunci cnd rcirea se face lent dup sacrificare i are loc pstrarea la temperatura mediului ambiant. Alterarea global a crnii poate s fie evideniat dup 2-3 zile de la sacrificare i este datorat dezvoltrii bacteriilor aerobe de putrefacie psihotrofe i mezofile, aparinnd genurilor: Pseudomonas, Lactobacillus formatoare de mucus. Carnea alterat prezint o culoare cenuie-verzuie, ca urmare a formrii de ctre microorganisme a apei oxigenate care reacioneaz cu pigmenii crnii. Alterarea profund poate avea loc n carne cu contaminare intern, pstrat la temperaturi de 20-45C. Aceast alterare se produce cnd nu se realizeaz rcirea dup sacrificare i climatizarea spaiilor de depozitare a crnii este necorespunztoare. Alterarea poate s fie sesizat dup 4-8 ore mai ales dac eviscerarea nu este realizat imediat dup moartea animalului i este datorat bacteriilor anaerobe ale genului Clostridium. Pe lng analizele microbiologice, pentru detectarea alterrii se pot folosi markerii chimici care pot reflecta modificrile n compoziie pn la limita de acceptabilitate, mai rapid dect metodele microbiologice. Astfel, ca un indice de alterare se poate folosi detectarea cadaverinei, histaminei, a acidului D-lactic i gluconic tec. 13.3. MICROBIOLOGIA CRNII DE PASRE Carnea de pasre are valoare nutritiv ridicat i un coninut variabil de ap de la 58% la carnea de curcan la 71% n carnea de pui, nct este un produs uor alterabil. 13.3.1. Contaminarea intern Carnea psrilor vii poate suferi o contaminare intern cu bacterii ale genurilor Salmonella, Corynebacterium i Moraxella. 13.3.2. Contaminarea extern n timp ce contaminarea intern este ocazional i limitat, contaminarea extern este dificil de evitat i are loc n cursul diferitelor etape tehnologice. Sacrificarea n abatoarele de psri este un proces foarte important, de aceea respectarea regulilor de igien este obligatorie innd cont c nivelul de contaminare al crnii depinde de acest proces, iar contaminarea ridicat a crnii are efect negativ asupra proceselor ulterioare i asupra duratei de pstrare a calitii crnii. La oprire cu ap cu temperatura de 50-65C i deplumare (ndeprtarea penelor) se produce concomitent cu reducerea numeric a celulelor microbiene, o diseminare a microorganismelor (provenite din sol, ap, materii de dejecie), aflate pe suprafaa penelor i transferul acestora pe carne. La deplumarea mecanic datorit deplasrilor brute se pot elimina materii fecale, caz n care are loc contaminarea masiv cu enterobacterii. Eviscerarea n abatorul de psri se face prin vacuumare i dac au loc accidental rupturi ale intestinelor are loc contaminarea cu bacterii din microbiota

71

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE intestinal, respectiv cu enterococi i enterobacterii: Escherichia, Salmonella .a. La eviscerare este posibil de asemenea transfer direct de microorganisme pe carne, prin intermediul ustensilelor, a minilor. Splarea cu ap sub presiune prin duare conduce la o reducere cu 50-90% a bacteriilor colifome mai ales dac apa conine 40-60 ppm clor. Rcirea crnii de pui se face n czi cu ap cu ghea. Dar apa poate fi contaminat cu microorganisme nedorite, ca de exemplu salmonele, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens .a., care pot ajunge n carne. La cntrire i ambalare poate avea loc o cretere a numrului de microorganisme pe suprafaa carcaselor, prin contact direct/indirect, n funcie de gradul de igien. n condiii igienice adecvate, microbiota crnii de pui cuprinde specii de microorganisme din genurile Moraxella, Acinetobacter, Pseudomonas, Micrococcus i n numr redus, lactobacterii. Alterarea crnii de pui se realizeaz mai rapid dect a crnii de vit i este datorat bacteriilor din genul Pseudomonas i genul Moraxella. Cnd concentraia de bacterii ale genului Pseudomonas ajunge la valori de 108/cm2 se observ formarea de mucus. Viteza de formare a mucusului este dependent de temperatur i durata de pstrare. Astfel prezena de mucus i a mirosului de alterat devine evident dup 6 zile prin pstrare la 5C i se reduce la 3 zile cnd temperatura crete la 10C. n cazul n care prin activitatea bacteriilor de putrefacie au rezultat amine toxice, consumul crnii este riscant deoarece aminele sunt termostabile i rezistente la tratamente termice lejere. n carnea de pasre ambalat prin vacuumare se poate produce acrirea crnii datorat activitii bacteriilor facultativ anaerobe din genul Lactobacillus i ale genului Brochothrix. Prin carnea de pui se pot transmite bacterii patogene din genul Salmonella, a crei contaminare este greu de evitat innd cont c peste 40% din psri pot elimina aceste bacterii prin materii de dejecie. Mai pot fi ntlnite Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus. Controlul microbiologic al crnii de pui impune absena bacteriilor din genul Salmonella n 50 g, iar bacteriile din genul Clostridium ntr-un gram. 13.4. MICROBIOLOGIA CRNII DE PETE Petii n stare vie prezint la suprafa un mucus cu proprieti bactericide i care previne mbolnvirea sa n timpul creterii. Acest mucus reine microorganismele din apa n care petii triesc, astfel nct microflora petelui este asemntoare cu a apei. n microflora petelui de ap srat se ntlnesc bacterii din g. Flavobacterium, Achromobacter, n microflora petelui de ap dulce se ntlnesc bacterii din g. Alcaligenes, Pseudomonas. Dup scoaterea petelui din mediul natural mucusul i pierde proprietile bactericide i reprezint un mediu pentru dezvoltarea microorganismelor reinute de mucus. Dac petele este pstrat neeviscerat sub aciunea permeazelor este posibil ptrunderea microflorei din intestin n esut. Alterarea petelui se produce mai nti n zona capului pentru c bronhiile filtrnd apa rein o cantitate mare de molecule ce devin active dup moartea petelui. Dup scoaterea din ap apare faza de rigiditate, carnea este rigid, cu pH acid, ce nu permite multiplicarea bacteriilor i rigiditatea se pstreaz la 0C. Dac petele este neeviscerat apare defectul de umflare datorat dezvoltrii bacteriilor anaerobe din genul Clostridium. Dac petele este eviscerat i pstrat la temperatura de

72

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE refrigerare sau la 20C defectele sunt produse de Escherchia coli, Pseudomonas, Achromobacter. Prin activitatea bacteriilor de putrefacie se acumuleaz amine toxice, astfel nct prin consum de pete alterat se produc intoxicaii grave. Petele se poate pstra doar n stare congelat sau uscat, srat, afumat. 13.5. MICROBIOLOGIA PREPARATELOR DIN CARNE Preparatele din carne se obin ntr-o gam larg de sortimente difereniate prin compoziie, coninutul de ap liber/valoare aw, tehnologie i din punct de vedere microbiologic. 13.5.1. Microbiota materiilor prime i auxiliare n funcie de tehnologia de fabricaie, pe lng carne, organe, grsimi, ca materii prime, aditivii, ingredientele i alte materii auxiliare introduc un numr variat, cantitativ i calitativ de microorganisme, care sufer modificri importante n etapele tehnologice de preparare. Carnea tocat. La fabricarea preparatelor din carne se folosete carnea tocat, care poate prezenta o contaminare bacterian de 104-106 ufc/g. Pe suprafaa crnii tocate la refrigerare, se dezvolt bacterii ale genurilor Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas, care dau modificri ale culorii (cenuiu-brun), cu formare de amoniac i amine, n timp ce n interiorul crnii tocate, ca urmare a consumului de oxigen de ctre bacteriile aerobe, se dezvolt bacterii facultativ anaerobe i se produce acrirea. Dintre microorganismele patogene ntlnite cu o frecven mai mare n carnea tocat, fac parte bacterii din g. Salmonella, Staphylococcus i Clostridium perfringens. O carne tocat cu peste 107/g celule bacteriene, nu este admis la fabricarea preparatelor din carne, iar la creterea concentraiei de celule la valori de 108/g apar evidente modificri senzoriale, specifice putrefaciei. Sarea i amestecurile de srare. O surs important de microorganisme (102-106/g), o prezint sarea, care aduce n compoziie bacterii sporulate, bacterii tolerante la sare, inclusiv drojdii halotolerante. Sarea influeneaz legarea apei n preparatele din carne tratate termic i ca urmare a reducerii valorii de aw este considerat factorul cel mai stabilizator din punct de vedere microbiologic. La fabricarea salamurilor crude se mai pot folosi n calitate de aditivi sruri nitrii sau nitrai glucide, glucono--lactona (GDL), acid ascorbic sau ascorbai, care adaug n compoziie un numr de microorganisme i influeneaz microbiota produsului. Prin adugarea de nitrii i nitrai se menine culoarea roie a crnii. Nitriii pe lng efectul de meninere a culorii roie caracteristic au rol n dezvoltarea aromei, n protejarea lipidelor de oxidare i cel de inhibare a unor microorganisme. Se cunoate c nitritul inhib creterea multor specii de microorganisme chiar la concentraii relativ reduse. Condimentele, dei se adaug n proporii mici, au o ncrctur microbian foarte mare mai ales n cazul plantelor aromatice care se ncarc cu microorganisme n timpul perioadei de vegetaie. Piperul, ienibaharul pot conine 105-106 ufc/g. Din microbiota condimentelor au fost izolate bacterii sporulate i mucegaiuri ce produc micotoxine, de aceea exist orientarea de a fi sterilizate nainte de folosire, pe cale chimic. Membranele, cele naturale (conservate prin srare) au o ncrctur microbian ridicat deoarece au venit n contact cu microbiota intestinului (bacterii coliforme i alte bacterii de putrefacie). Din punct de vedere microbiologic

73

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE membranele artificiale au o ncrctur foarte redus i deci nu contribuie la ncrcarea produsului cu microorganisme de alterare. 13.5.2. Culturi starter utilizate n industria preparatelor din carne n tehnologia preparatelor din carne se pot folosi microorganisme sub form de culturi starter, care se pot aduga n past nainte de umplere sau sunt folosite la pulverizarea superficial a salamurilor uscate. Culturi bacteriene Bacteriile lactice - n monoculturi sau culturi mixte, capabile s suprime creterea microorganismelor nedorite pot fi folosite drept culturi de protecie n diferite preparate de carne: Lactobacillus, Micrococcus. Culturile mixte de lactobacili i micrococi dau rezultate bune n reducerea timpului de maturare, o mai bun dezvoltare a calitilor senzoriale, inhibarea bacteriilor de putrefacie i astfel prelungesc durata de pstrare a acestor produse. Culturile se adaug ntr-un mediu nesteril, de aceea cantitatea culturii de producie adugat trebuie calculat astfel nct numrul de celule introduse n pasta de carne s fie de cel puin 1000 de ori mai mare dect cel existent n microbiota crnii/compoziiei. Aceste culturi produc o fermentaie lactic determinnd astfel o scdere a pH-ului care inhib activitatea bacteriilor de putrefacie, iar acidul lactic contribuie la obinerea gustului plcut. Pentru obinerea salamurilor fermentate se pot folosi culturi mixte alctuite din lactobacili, micrococi i drojdii. Culturi fungice Dintre culturile fungice folosite drept culturi starter cele mai importante sunt cele din genul Penicillium, folosite la obinerea salamurilor crude, care influeneaz pozitiv uscarea natural i maturarea. Aceste microorganisme se dezvolt ca un fetru de culoare alb la suprafaa batoanelor i prin intermediul hifelor penetrante asigur o difuzie a umiditii i o uscare uniform, iar prin intermediul enzimelor (lipaze, proteaze) contribuie la formarea compuilor de gust i arom specifice acestor produse. Sporii de Thamnidium elegans inoculai prin pulverizare la suprafaa carcaselor de carne de bovine, inhib dezvoltarea bacteriilor de alterare ceea ce face posibil creterea temperaturii i a umezelii aerului din depozit, pentru a reduce timpul necesar pentru maturarea crnii de la 2 sptmni la 2-3 zile. 14.3.3. Defecte i alterri microbiene ale preparatelor din carne Preparatele din carne au o durat de conservare i condiii recomandate de depozitare diferite, n funcie de coninutul de ap liber pe care l conin. Astfel, prospturile (parizer, crenwurti, lebr) cu umiditate mai mare de 65% au o durat de conservare de 48-72 ore la temperaturi de refrigerare, n schimb ce salamurile semiafumate cu umiditate mai mic de 45% au durate de conservare 12-14 zile, iar salamurile afumate semiuscate (salamul de var) timp de 30 zile la temperatura camerei. Alterarea salamurilor bine maturate i uscate este rar ntlnit. Dintre defectele mai frecvente se menioneaz: Formarea de mucus are loc la suprafaa batoanelor este datorat dezvoltrii bacteriilor sau drojdiilor, favorizat de umiditatea ridicat sau de apariia apei de condens. Se poate forma frecvent la suprafa sau sub membran, datorit bacteriilor aerobe i facultativ anaerobe din genurile/speciile: Pseudomonas, Aeromonas, Lactobacillus viridiscens, Brochothrix thermosphacta.

74

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Alterri produse de drojdii n cteva cazuri formarea de mucus i apariia petelor albe poate fi datorat dezvoltrii de drojdii halotolerante cu specia Debaryomyces hansenii. Mucegirea este un defect de suprafa i poate fi datorat mucegaiurilor ce se pot dezvolta n domeniul de refrigerare i care pot proveni din contaminare extern (aer, mini, utilaje). Dintre mucegaiurile ce dau pete inestetice i colorate fac parte genurile Penicillium, Thamnidium, Aspergillus, Cladosporium. Colorarea se caracterizeaz prin apariia de pete albastre, rar ntlnit, este determinat de unele bacterii din genul Chromobacterium cianogenum ce pot proveni din sare sau aer. Acrirea i nverzirea pastei este un defect ntlnit la prospturi (parizer, polonez) i este datorat dezvoltrii bacteriilor heterofermentative care se pot nmuli n anumite condiii, dnd acrirea ca rezultat al formrii de acid lactic. Deoarece aceste bacterii produc ap oxigenat, n absena catalazei inactivat prin pasteurizare, aceasta poate produce oxidarea pigmenilor roii ai crnii cu formare de porfirine de culoare verde. Acest defect se caracterizeaz i prin modificarea gustului i este dat de bacterii lactice din g. Leuconostoc i Lactobacillus, frecvent ntlnite la preparatele din carne cu adaos de ficat, splin. Umflarea apare la prospturi i este un defect rar ntlnit, atunci cnd n past sunt prezente bacterii ale speciei Clostridium perfringens. Dac concentraia n celule este mare, se produce o fermentaie cu producere de gaze (CO2 i H2), se produce umflarea, pasta devine buretoas i n caz de consum, exist riscul de toxiinfecie alimentar.

14. MICROBIOLOGIA OULOR

Oule sunt alimente valoroase din punct de vedere nutritiv. Sunt folosite ca atare pentru consum sau n industrie, la fabricarea pastelor finoase, a produselor de patiserie, n obinerea maionezelor, a prafului de ou etc. Oule conin o microflor facultativ patogen transmis de la psrile bolnave i o microflor de alterare care ajunge n ou prin contaminare extern. Din punct de vedere structural oul prezint la suprafa un strat de mucin, solubil n ap, cu efect bactericid. La 1-2 sptmni de la obinere, efectul bactericid se pierde. Sub stratul de mucin se gsete coaja poroas, cu pori suficient de mari, pentru a permite trecerea celulelor microbiene (110 pori/cm2). Sub coaj se gsete membrana cu coninut ridicat n cheratin, permeabil pentru vaporii de ap i pentru celulele de dimensiuni mici. Sporii de mucegai cu dimensiuni mari nu trec prin membrana intern. Albuul se prezint sub forma unui amestec coloidal cu pH =9,3 nefavorabil dezvoltrii bacteriilor. El nu este un mediu bun pentru multiplicarea bacteriilor deoarece conine lizozim, conalbumina, avidina, substane cu efect antimicrobian asupra bacteriilor pozitive pe care le lizeaz. n albu mai sunt prezeni inhibitori ai proteazelor vegetale/microbiene ca de exemplu ovostina, cistatina, ovomucoidul. Prin formarea unui strat vscos ntre coaj i glbenu, albuul mpiedic rspndirea microorganismelor. De asemenea n interiorul albuului exist o reea de fibre formate ca rezultat al interaciunii ntre lizozim i ovomucin. Glbenuul reprezint un mediu excelent pentru nmulirea microorganismelor, are un pH=6,9, este bogat n substane nutritive i nu conine substane cu efect inhibitor. Experienele de inoculare artificial n glbenu a bacteriilor din genul

75

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Salmonella au stabilit c acestea se nmulesc foarte bine i pot ajunge la valori de 108/g glbenu. 14.1. CONTAMINAREA INTERN Contaminarea intern se realizeaz prin contaminarea cu microorganisme de la psrile bolnave sau n timpul formrii oului n cazul raelor i gtelor prin intermediul apei poluate. Dintre microorganismele de contaminare intern amintim: genul Salmonella cu speciile: Salmonella enteridis, Salmonella galinarium se pot nmuli n glbenu, pot s provin de la psri care au suferit mbolnvirea, fie din contaminarea extern (dejecia altor psri). Bacteriile din genul Salmonella care se rspndesc prin ou pot produce endotoxine, de aceea prin ingerarea preparatelor din ou insuficient tratate termic, acestea ajung pe cale digestiv n organism, sub aciunea sucului gastric are loc liza pereilor celulari i eliberarea de toxine, producndu-se starea de toxiinfecie alimentar caracterizat prin diaree, dureri de cap i chiar moarte. n timp ce oule de gin au o contaminare redus (07%), oule de ra pot fi contaminate n proporie de 1-26%, de aceea la prelucrare i comercializare se impun condiii de fierbere de minimum 10 minute pentru a avea certitudinea distrugerii salmonelelor i inactivarea toxinelor pe care acestea le pot produce. Genul Proteus, cu specia Proteus mirabilis n concentraii mari produc boli infecioase i toxiinfecii alimentare (gastroenterite). Bacteriile se nmulesc n ou i produc hidrogen sulfurat prin degradarea proteinelor. Genul Clostridium, cu specia Clostridium perfringens poate proveni i din contaminarea extern. n prezena fosfolipidelor din glbenu pot produce toxine (6 tipuri de enterotoxine). Prin dezvoltarea acestor bacterii n creme, preparate cu ou contaminate, se produce eliberarea de toxine i mbolnvirea (dac aceste toxine nu sunt distruse prin tratament termic). Genul Mycobacterium tuberculosis (tip aviar) produce o contaminare a oulelor provenite de la psri bolnave. 14.2. CONTAMINAREA EXTERN Contaminarea extern. Are loc dup expulzarea oului, prin intermediul apei poluate, a aerului din cuibarul contaminat cu dejeciile psrilor, prin contacte directe cu mediul i are o pondere de aproximativ 90% din totalul microbiotei. Dup expulzare, oul are o temperatur de 35-37C, iar dac n cuibar este rece, prin contracia coninutului, aerul este aspirat i devine oportun penetrarea microorganismelor aflate pe coaj sau n stratul de aer nconjurtor. Numrul de microorganisme pe coaj este n medie de 100000 n funcie de gradul de igien, cu predominarea bacteriilor Gram pozitive ale genului Micrococcus care rezist bine pe coaja uscat a oului. Dac oul este n contact cu aerul umed, sporii de mucegai se dezvolt la suprafa hidroliznd cuticula, facilitnd eliberarea porilor i ptrunderea bacteriilor. Pe aceeai cale oul poate fi contaminat cu bacterii patogene transmisibile prin dejecii, aer, aparinnd genurilor Salmonella, Staphylococcus, Proteus, Escherichia. 14.3. ALTERRI MICROBIENE ALE OULOR n timpul pstrrii oulor, ca urmare a activitii microorganismelor de contaminare se pot produce diferite alterri:

76

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Putrefacia verde coninutul oului capt o culoare verzuie i prezint un miros de varz acr; este datorat microorganismelor din genul Pseudomonas producnd pioverdina pigment de culoare verzuie, cu proprieti fluorescente. Putrefacia neagr este profund, cu modificarea culorii i degajarea puternic de hidrogen sulfurat datorat bacteriilor din genul Proteus. Putrefacia portocalie atunci cnd oul se pstreaz la temperatura camerei i este dat de Bacillus megatherium ce produce pigmeni portocalii, gaze, amine toxice; Putrefacia roie dat de bacterii din genul Serratia care produc un pigment rou, denumit prodiogiosin. Mucegirea sub coaj, n camera de aer se formeaz prin pierderea apei; este dat de reprezentani ai genurilor Penicillum, Cladosporium. Pentru industrializare se folosesc numai oulele de gin ce sunt dezinfectate prin splare, iar spargerea se face separat sub control, pentru a nu permite introducerea de ou alterate n procesul tehnologic. 14.4. MICROBIOLOGIA PRODUSELOR DIN OU Melanjul. Dup spargere se pierd sistemele naturale de protecie i are loc o contaminare suplimentar, prin antrenarea microorganismelor de pe coaj (motiv pentru care se recomand splarea i dezinfecia prealabil a suprafeei oului), din aer, prin contact cu utilaje, ambalaje, ustensile pentru omogenizare, surs uman etc. Pentru reducerea numrului de microorganisme din melanj se poate realiza pasteurizarea la 55-60C timp de cteva minute pentru distrugerea bacteriilor din genul Salmonella. Se consider o pasteurizare suficient dac eficiena este de 99%, iar numrul maxim de microorganisme nu depesc valori de 103/cm3 melanj. n microbiota rezidual dup pasteurizare pot rmne n stare viabil bacterii ale genurilor: Alcaligenes, Bacillus, Proteus, Escherichia, Flavobacterium. Congelarea melanjului din ou prelungete conservabilitatea produsului. n produse congelate pot supravieui bacterii din genul Bacillus care pot s prezinte 80% din supravieuitori restul fiind format din bacterii din genul Alcaligenes, genul Proteus, care se reactiveaz atunci cnd decongelarea este lent, urmat de pstrarea n domeniul temperaturii eugenezice. Concentrarea este o alt metod industrial de conservare, se realizeaz sub vid, sau prin adugare de sare/zahr care conduc la o scdere a indicelui de activitate al apei de la valoarea iniial de 0,97 la valori ntre 0,8 i 0,85 defavorabile pentru activitatea bacteriilor patogene/toxicogene. Deshidratarea se poate realiza prin atomizare cnd are loc o reducere numeric a microorganismelor, n schimb specii de Salmonella i de Escherichia pot supravieui. Praful de ou este conservabil dac umiditatea nu crete peste 5%.

15. MICROBIOLOGIA ALCOOLULUI

Alcoolul de fermentaie se poate obine prin procese de fermentaie i prin procese chimice. Ca materii prime la noi n ar se folosesc: materii prime amidonoase cartofi, cereale, ce sufer procese hidrotermice, apoi enzimatice, cu obinerea de plmezi dulci ce sunt apoi supuse fermentaiei alcoolice; materii prime zaharoase melasa (din sfecl, trestie de zahr).

77

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Drojdii productoare de alcool Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces bayanus, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces polysporus, Kluyveromyces loderi, Hansenula anomala, Hansenula fabiani, Debaryomyces hansenii, Pichia. Unele drojdii mutante pot s fermenteze pentoze n condiii slab aerobe aparinnd speciilor: Candida shaetae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophillus. Bacterii productoare de alcool: Zymomonas mobilis, bacterie facultativ anaerob, Gram negativ, sub form de bastonae, poate s produc 10-16% vol.alcool; Clostridium thermocellum, Acetovibrio cellulolyticus, au activitate amilazic i celulozolitic, se pot folosi n culturi mixte cu drojdii fermentative; Clostridium thermosaccharolyticum, Termoanaerobacter ethanolicus, sunt termofile active la 66-69C, prezint dezavantajul de a produce cantiti mari de produse secundare de fermentaie. 15.1. OBINEREA ALCOOLULUI DIN MATERII PRIME AMIDONOASE Au loc procese de zdrobire (cartofi), mcinare (cereale), apoi are loc gelatinizarea granulelor de amidon pe cale hidrotermic pentru a favoriza la plmdire hidroliza enzimatic a amidonului. Plmada dulce este trecut n zaharificator, este rcit la temperatura optim de activitate a enzimelor amilolitice adugate n scopul zaharificrii amidonului. Drojdiile de alcool nu produc amilaze, de aceea se folosesc enzime vegetale sau microbiene pentru transformarea amidonului n glucide fermentescibile. n fermentaia clasic pentru zaharificare se folosesc enzime amilolitice din malul verde (slad), care conine n cantitate mare -amilaz, -amilaz cunoscute i sub denumirea de diastaze. Enzimele microbiene sunt mai avantajoase deoarece pot fi dozate cu precizie, pot avea o activitate de zaharificare mai avansat, deoarece pe lng i -amilaze produc i glucoamilaza. Astfel se pot obine avantaje prin reducerea spaiului necesar obinerii malului i a consumului de energie. Pentru obinerea de amilaze se folosesc microorganisme din genul Bacillus cu speciile B.subtilis, B.coagulans, B.sthearothermophillus, care produc -amilaze termorezistente, active chiar la 90100C, astfel fermentaia este protejat i sunt inactivate microorganismele contaminante. Mucegaiuri selecionate pot produce -amilaze i glucoamilaze folosite pentru zaharificarea plmezilor amidonoase sub form de preparate brute. n acest scop mucegaiurile se cultiv pe mediu ce conine tre, la pH acid i temperatura de 30C. Se folosesc mucegaiuri selecionate din genul Aspergillus, cu speciile A.oryzae, A.niger, A. awamori, A.usamii. Poate produce glucoamilaze i drojdia Saccharomyces fibuligera. Dup zaharificarea plmezilor amidonoase are loc inocularea cu celule active de drojdii. Drojdiile adaptate la fermentarea acestora au putere de atenuare i capacitatea de a fermenta i dextrinele cu molecule mici. Tulpinile de drojdii folosite la fermentarea plmezilor amidonoase zaharificate sunt adaptate de a fermenta maltoza. Pentru obinerea inoculului se pornete de la cultura pur care se multiplic mai nti n laborator, apoi n fabric n cadrul operaiei tehnologice de prefermentare. Urmeaz apoi fermentarea obinndu-se n final n plmezile fermentate 8-9% vol. alcool. Dup fermentare plmada este dirijat la distilare, unde se obine alcoolul brut care prin rectificare trece n alcool rafinat.

78

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 15.2. OBINEREA ALCOOLULUI DIN MELAS Melasa reprezint un mediu bun pentru fermentare deoarece conine aproximativ 55 % zaharoz, 2% rafinoz, substane minerale, factori de cretere (biotin). Se utilizeaz drojdii din specia Saccharomyces cerevisae, drojdii de fermentaie superioar, capabil s fermenteze complet rafinoza. Drojdia trebuie s aib toleran la presiune osmotic ridicat deoarece n acest caz se pot folosi plmezi mai concentrate n zahr. La obinerea industrial a alcoolului din melas randamentul n alcool depinde att de proprietile biotehnologice ale culturii de drojdie ct i de calitatea melaselor folosite pentru obinerea mediului de fermentare. Melasa are o ncrcare microbian ridicat i se consider o melas bun cea care conine pn la 210 3 celule/g; cea de calitate inferioar are peste 3104 celule/g. Microbiota melasei este format din: bacterii lactice: Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum tolerante la alcool (14), nu sufer plasmoliza la concentraii ridicate de zahr; bacterii butirice: Clostridium pasteurianus, Clostridium nigrificans influeneaz negativ calitatea melasei; bacterii de putrefacie: genul Bacillus cu rol n formarea de nitrii; bacterii acetice. n scopul folosirii la fabricarea alcoolului, melasa este diluat i se adaug i alte substane nutritive care favorizeaz fermentaia. Melasa pstrat n stare diluat poate suferi o degradare prin fermentare cu bacterii din genul Leuconostoc mesenteroides care produc polimerizarea glucozei cu formare de dextran care i mrete vscozitatea i scade coninutul n zahr fermentescibil. n tehnologia obinerii alcoolului din melas, mediul este sterilizat, are loc inocularea cu drojdii adaptate la melas, fermentaia alcoolic dureaz 24-36 h, apoi au loc operaiile de distilare i rectificare. Alcoolul de fermentaie conine n afar de alcool i alte produse secundare: aldehide, esteri .a. Este un produs conservabil avnd un efect bactericid maxim la 70 alcool, deoarece produce coagularea proteinelor din citozolul celular. Este folosit pentru obinerea buturilor alcoolice cu trie 40-60 alcool, n amestec cu sucuri i extracte din fructe etc. 15.3. OBINEREA PRIN FERMENTAIE A ROMULUI n ri cultivatoare de trestie de zahr (Jamaica, Cuba etc.) din melas de trestie de zahr se poate obine prin fermentare i distilare, romul. Pentru fermentare se folosesc culturi de drojdii: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, g. Hansenula care produc pe lng alcool etilic i produi secundari cu rol n formarea aromei. Aroma specific se obine i prin adaosul n plmezi al unor plante aromatizante. Prin distilarea plmezilor distilate se obin distilate cu 80-88%vol.alcool, care pentru mbuntirea calitilor senzoriale se pstreaz n vase de lemn de stejar timp de 3 ani. Pentru obinerea romului se adaug caramel (pentru caramel) i se aduce la concentraia de 40-45% vol.alcool (n produsul pentru comercializare).

16. ASPECTE MICROBIOLOGICE LA OBINEREA I PSTRAREA DROJDIEI DE PANIFICAIE

79

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Producerea industrial a drojdiei la nivel mondial depete 1,8 milioane tone/an din care drojdia de panificaie are cea mai mare pondere. n industria panificaiei se utilizeaz sub form de drojdie comprimat (presat) sau sub form de drojdie uscat activ (ADY). Drojdia comprimat este o biomas de celule aparinnd speciei Saccharomyces cerevisiae drojdie de fermentaie superioar, adaptat s produc fermentarea glucidelor din aluat, folosit ca afntor biologic la fabricarea pinii i a produselor de panificaie. Alegerea acestei specii este determinat de capacitatea sa de a fermenta rapid glucoza, fructoza i zaharoza i dup o faz de adaptare, maltoza, principalul diglucid format n aluat sub aciunea amilazelor din finuri. O alt calitate este aceea de a avea timpul de generaie cel mai scurt comparativ cu celelalte specii ale genului, egal cu 2-2,2 ore la temperatura de 30C, nct randamentul n biomas este ridicat. Astfel n condiii optime de cultivare prin parcurgerea stadiilor de multiplicare, din 0,2 kg de drojdie (substan uscat) utilizat ca inocul starter, n final se pot obine aproximativ 100000 kg de drojdie, proces n care sunt implicate 24 generaii de drojdii. Pentru obinerea drojdiei comprimate se folosete ca materie prim melasa ca surs de carbon, substane minerale, substane cu azot, factori de cretere, pentru a crea un mediu favorabil nmulirii. Pentru a crea condiii de multiplicare, dup inocularea mediului sterilizat, se asigur condiii de aerare, care stimuleaz activitatea de biosintez a drojdiei i reducerea timpului de generaie. Se cunoate faptul c n condiii anaerobe drojdia crete mai lent dect n condiii aerobe; raportat la 100 kg zahr utilizat, randamentul teoretic n biomas (substan uscat), n anaerobioz este de 7,5 kg pe cnd n aerobioz este de 54 kg drojdie. Calitatea drojdiei depinde de procesul tehnologic care trebuie s se desfoare n condiii stricte de igien pentru a evita contaminarea plmezilor, care ofer condiii optime i pentru dezvoltarea altor tipuri de microorganisme. n cursul procesului de fabricare a drojdiei, n paralel cu multiplicarea drojdiilor de cultur, n diferite stadii de multiplicare (plmezi) se pot dezvolta i alte microorganisme de contaminare ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae, care mresc gradul de contaminare a drojdiei finite i determin o scdere a calitilor biotehnologice i a conservabilitii drojdiei comprimate. n timpul proceselor tehnologice este posibil contaminarea cu drojdii atipice din genul Candida i genul Torulopsis. Aceste drojdii se nmulesc mai repede dect drojdiile de cultur. Au efect negativ asupra produsului finit, deoarece au activitate fermentativ mic, iar prezena lor n calupul de drojdie influeneaz durata de pstrare, prin aceea c intr n autoliz mai rapid i astfel ofer bacteriilor de contaminare un substrat favorabil dezvoltrii. Bacteriile se pot nmuli n toate stadiile de multiplicare ale drojdiei de panificaie. Multe specii ca Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Bacillus cereus pot proveni din melas n care pot s formeze nitrii. Mucegaiurile pot contamina plmezile, dar acestea au vitez de nmulire mai redus dect a drojdiilor i efectul lor nu este sesizabil n cursul procesului de fabricaie. Sporii care s-au separat odat cu drojdia pot germina n timpul pstrrii i produc mucegirea exterioar sau intern a drojdiei comprimate. 16.1. PROCESE CARE AU LOC N TIMPUL PSTRRII DROJDIEI COMPRIMATE

80

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE n calupul de drojdie celulele de drojdie sunt celule vii separate de mediul n care au fost cultivate. Fiind lipsite de ap i substane nutritive n calup ele continu o activitate lent de metabolizare. ntreinerea funciilor vitale se realizeaz prin consumarea unor substane de rezerv din citoplasm. Drojdiile conin o cantitate de 30-120 mg glicogen i 20 mg trehaloz drept glucide de rezerv. Se tie c drojdiile cultivate n diferite condiii (aerobe i anaerobe) se difereniaz dup coninutul de glucide de rezerv. Astfel drojdiile cultivate n aerobioz sunt mai bogate n trehaloz, iar n condiii anaerobe predomin glicogenul. De aceea gradul de aerare este important pentru acumularea de trehaloz i deci pentru creterea viabilitii. Temperatura are un rol foarte important n prelungirea strii de viabilitate a celulelor. Astfel drojdia supravieuiete perioade mai lungi dac temperatura de pstrare este apropiat de temperatura de ngheare a apei. Conservabilitatea drojdiei comprimate este dependent de intensitatea de desfurare a proceselor de proteoliz, care ncep s se produc dup trecerea celulelor n stare de anabioz. Drojdia ncepe s se autolizeze, dup ce sunt consumai compuii de rezerv ai celulei. Ca rezultat al autolizei, calupul de drojdie se nmoaie, devine fluid, activitatea fermentativ scade foarte mult n urma hidrolizei enzimelor (proteine); un astfel de calup este foarte uor alterabil, reprezentnd un mediu nutritiv excelent pentru bacteriile de putrefacie. n cazul pstrrii drojdiei presate de bun calitate (necontaminat) n condiii corespunztoare de depozitare, autoliza are loc foarte lent n decurs de 1-3 luni. n schimb dac pstrarea acesteia are loc la temperatura de 35C, durabilitatea este de numai 135 ore. Influena microorganismelor de contaminare asupra conservabilitii drojdiei de panificaie. Prezena n calupul de drojdie presat a microorganismelor de contaminare, determin ntotdeauna o accelerare a proceselor ce conduc la alterarea drojdiei. Dac pstrarea drojdiei presate se face la temperatura camerei, primele celule care intr n autoliz sunt celulele care aparin drojdiilor atipice, iar produsele rezultate, servesc ca mediu nutritiv pentru bacteriile proteolitice. Acestea, prin enzimele extracelulare elaborate, vor degrada ntreaga biomas de drojdie. Se apreciaz c o drojdie de calitate bun din punct de vedere microbiologic, poate conine pn la 2% microorganisme de contaminare. Deoarece un gram de drojdie presat conine aproximativ 5109 celule/g, microorganismele de contaminare pot fi acceptate pn la valori de 1106 celule/g, iar dac numrul lor crete la valori de aproximativ 5107 celule/g, se consider c drojdia este puternic contaminat. ntrun calup de drojdie care conine de exemplu, n prima zi de pstrare 10 6 microorganisme de contaminare/g, dup 10 zile de pstrare la 2024C, numrul microorganismelor de contaminare poate ajunge la valori de 10 8 celule/g drojdie presat (Dan, V., 1999). n fabricile de pine, dac depozitarea calupurilor de drojdie se face la temperaturi mai mari de 10C i n magazii cu o umezeal a aerului mai mare de 75%, pe suprafaa calupului se pot dezvolta colonii de mucegaiuri, care i depreciaz calitatea. Astfel,se poate dezvolta frecvent Geotrichum candidum (sinonim cu Oidium lactis sau Oospora lactis), care formeaz superficial colonii albe cu aspect finos; mucegaiuri din genul Aspergillus i Penicillium, care formeaz colonii colorate caracteristice i Mucor mucedo. Acest mucegai n condiiile pstrrii drojdiei la temperatura camerei, poate s elaboreze enzime proteolitice care s favorizeze liza celulelor de drojdie, nmuierea i degradarea calupului de drojdie.

81

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Experimente efectuate privind durabilitatea drojdiei de panificaie, au stabilit c bacteriile de putrefacie au un rol deosebit n intensificarea proteolizei n calup. Prin pstrarea drojdiei presate la temperaturi de 35C, 1820C i 24C, s-a urmrit periodic durabilitatea, numrul de bacterii de putrefacie i activitatea enzimelor proteolitice, n intervalul de 20 zile. Ca rezultat al proteolizei, enzimele care catalizeaz desfurarea procesului de fermentaie alcoolic i care confer calitile tehnologice ale drojdiei de panificaie sunt astfel degradate i i pierd specificitatea de aciune. De aceea, la obinerea industrial a drojdiei de panificaie se impune un control microbiologic riguros care s cuprind toate fazele de producie, prin studierea gradului de igien i depistarea surselor de contaminare. Pentru a preveni multiplicarea microorganismelor de contaminare se impune ntocmirea unui program riguros de igien, care s fie respectat cu strictee, pe fiecare din cele cinci stadii principale de fabricaie: pregtirea melasei; multiplicarea drojdiilor; separarea drojdiilor din mediul de cultur; filtrarea-presarea drojdiei; modelarea i ambalarea Pentru a controla procesul din punct de vedere al riscului de contaminare se poate aplica metoda HACCP, cu evidenierea punctelor din procesul tehnologic care sunt critice pentru realizarea inocuitii produsului. Aplicarea sistemului HACCP permite evidenierea i meninerea sub control a riscurilor identificate. Utilizarea HACCP la fabricarea drojdiei de panificaie nu garanteaz faptul c nu vor apare riscuri, ci c ele sunt controlabile. Atunci cnd apar deviaii n punctele critice de control sunt necesare msuri corective. Metoda are un caracter dinamic i de aceea se va revizui ori de cte ori va fi necesar, odat cu modificarea materiilor prime, perfecionarea utilajelor, a tehnologiei de fabricaie sau a tehnicilor de curire i dezinfecie. Drojdia de panificaie produs finit reprezint n final rezultatul eforturilor efectuate pentru a evita contaminarea cu microorganisme strine, calitatea acesteia fiind condiionat de gradul de puritate microbiologic pe care l prezint la livrare.

17. MICROBIOLOGIA VINULUI

Vinul, produsul finit al fermentaiei mustului de struguri, conine peste 500 de componente responsabile pentru arom i gust, din care majoritatea rezult n urma activitii drojdiilor fermentative. Diversitatea sortimentelor de vinuri este dependent de compoziia i caracteristica soiurilor de struguri, de calitatea i cantitatea microorganismelor care acioneaz n must i de factorii tehnologici, de dirijare a activitii microorganismelor de interes. n tehnologia fabricrii vinurilor pot interveni urmtoarele tipuri de microorganisme: a) Microorganisme permanent utile: drojdii de fermentaie denumite i drojdii de cultur sau drojdii tipice care aparin genului Saccharomyces, cu specia Saccharomyces ellipsoideus i specia Saccharomyces oviformis, folosit la obinerea ampaniei, a vinurilor speciale (Xeres), vinuri oxidate n care drojdiile se dezvolt ca o pelicul la suprafaa vinurilor favoriznd reacia de oxidare rezultnd un gust specific. b) Microorganisme condiionat utile: drojdii cu putere alcooligen redus din genul Kloeckera, genul Torulopsis, genul Schizosaccharomyces.

82

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE c) Microorganisme duntoare n care pot fi incluse drojdiile oxidative care dau defectul de floare a vinurilor, bacteriile acetice i unele specii de bacterii lactice care dau alterri ale vinului la pstrare, mucegaiuri care n mod direct indirect influeneaz calitatea vinurilor. 17.1. MICROBIOTA STRUGURILOR La suprafaa boabelor de struguri exist o microflor epifit alctuit din drojdii, bacterii i mucegaiuri. Cantitatea i calitatea drojdiilor prezente pe boabe de struguri variaz cu condiiile pedoclimatice. Se cunoate c habitatul natural al drojdiilor este solul, care conine n medie 2,5104/g, cu valori mai mari n soluri de vi veche. Din sol, prin intermediul aerului, a altor factori fizici i biologici, ajung pe tulpini, frunze, ciorchini/boabe. Boabele de struguri n faza de coacere au la suprafa un numr redus de celule de drojdii, care nu penetreaz pielia protectoare a bobului, n schimb dac boabele au leziuni i este favorizat eliberarea sucului, numrul lor crete foarte mult. Recoltarea strugurilor se realizeaz la maturitatea tehnologic a boabelor i strugurii recoltai sunt transportai la centre de prelucrare. Tehnologic se recomand ca prelucrarea s se efectueze la cel mult 4 ore dup recoltare. n timpul transportului, datorit greutii lor se pot zdrobi, cnd se elibereaz mustul i poate avea loc o multiplicare rapid a microorganismelor. 17.2. MICROBIOLOGIA MUSTULUI DE STRUGURI Mustul de struguri are o compoziie chimic i biologic deosebit de complex, dependent de soiul de struguri, gradul de maturitate, condiiile climatice, de recoltare, transport, zdrobire, presare etc. Prin aceste operaii cea mai mare parte din microbiota strugurilor: drojdii, bacterii, mucegaiuri ajung n must, dar condiii favorizante le au drojdiile ca urmare a compoziiei mustului: glucide 180-250 g/l, formate din glucoz i fructoz n raport de 1:1, cu cantiti mici de zaharoz, precum i surse de azot asimilabile, sub form de peptide, aminoacizi. 17.3. ROLUL DROJDIILOR LA FABRICAREA VINULUI Fermentaia alcoolic a mustului poate fi un proces spontan determinat de microflora levurian a mustului, ce are condiii bune de dezvoltare. Sub aciunea drojdiilor are loc n anaerobioz fermentaia alcoolic propriu-zis prin care glucidele fermentescibile ale mustului sunt metabolizate n alcool etilic, CO2 i produse secundare ce dau vinului aroma specific. Fermentaia alcoolic a mustului de struguri poate s dureze un timp variabil, ntre 2-4 sptmni, n funcie de compoziie, temperatur, natura i densitatea celulelor de drojdie. Pentru dirijarea fermentaiei alcoolice se folosesc drojdii selecionate. Folosirea culturilor selecionate este avantajoas n urmtoarelor concluzii: cnd fermentaia decurge lent, ca urmare a numrului sczut de drojdii pe strugurii splai de ploi sau cnd mustul obinut din struguri mucegii este tratat cu doze crescute de SO2; cnd fermentaia se desfoar la temperaturi sczute; pentru fabricarea vinurilor spumante; fermentarea la rece a vinurilor roii.

83

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Ca urmare a colaborrii ntre geneticieni, biochimiti i tehnologi, n ultimul timp au fost obinui mutani ai drojdiilor de vin, cu anumite performane: capacitatea de fermentare a mustului cu 300 g zahr/l; separarea rapid la sfritul fermentaiei, prin floculare; tolerana superioar la alcool; capacitatea de fermentare la 10-12C, calitate important pentru ri cu temperaturi mai sczute. Utilizarea de culturi pure de drojdii cu proprieti biotehnologice cunoscute este practicat pe scar restrns. Selecionarea se realizeaz n institute de cercetare, n laboratoare centrale de vinificaie i sunt livrate n funcie de necesiti. Prin utilizarea de culturi selecionate mustul fermenteaz rapid, are loc fermentaia complet a glucidelor, ca rezultat se formeaz cu 0,5-1% mai mult alcool dect n fermentaia spontan, vinul conine mai puini acizi i esteri volatili, are un gust i miros ce permite evidenierea soiului de struguri, este mai puin sensibil la alterri microbiene, se limpezete uor. 17.4. ALTERRI MICROBIENE ALE VINURILOR Vinul dup condiionare poate s fie lipsit de microorganisme vii i prin nvechire i poate mbunti caracteristicile senzoriale (armonizarea gustului, formarea buchetului specific). Un vin de calitate, stabil din punct de vedere microbiologic, poate s fie steril atunci cnd s-a produs prin filtrare ndeprtarea total a microorganismelor sau s conin un numr redus de drojdii 800-900 celule/dm3. Defecte produse de drojdii tulburarea vinului n producie sau n reeaua comercial adesea se poate observa c vinul limpede, repartizat la sticle i pierde rapid din strlucire, se tulbur i formeaz un sediment. Aceast tulburare este datorat unei fermentaii secundare produs de drojdii care au ajuns n vin de pe utilaje, diferite materiale. Prin examinarea la microscop a sedimentului pot fi evideniate celule vii de drojdie, avantajate n dezvoltare de prezena unor glucide nefermentate ct i a oxigenului cu care vinul se mbogete n diferite operaii tehnologice. Refermentarea poate avea loc i n vinuri albe sulfitate dulci i poate fi datorat drojdiilor sulfitorezistente ale genului Schizosaccharomyces ce produc fermentarea zahrului rezidual cu formarea pe lng alcool etilic i dioxid de carbon, a acidului acetic i a acetatului de etil. Prin refermentare vinul se tulbur, spumeaz energic la deschiderea recipientului i are un gust acru. Floarea vinului apare n special, n vinurile cu grad alcoolic sczut, neprotejate antiseptic i antioxidant i pstrate n condiii de aerare. Boala este produs de drojdii mycodermice care aparin mai multor genuri: Candida, Pichia, Hansenula. Specia care deine ponderea cea mai ridicat este Candida vini. Agenii patogeni activeaz intens la temperaturi de 24260C. ntr-un stadiu avansat al bolii vinul i schimb aspectul, aplatizndu-se, au loc degajri de CO2, apar mirosuri strine neplcute, iar gustul devine fad i neagreabil. Boli i defecte produse de bacterii Oetirea vinului este o boal care apare n vinurile slab alcoolice, dar poate fi ntlnit i la cele cu grad alcoolic mijlociu (1112,5% vol.). Agenii patogeni ai oetirii vinului sunt bacterii din genul Acetobacter. Condiiile care favorizeaz activitatea bacteriilor sunt: temperatura ridicat;

84

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE accesul aerului; lipsa SO2; aciditatea sczut; pH-ul ridicat; lipsa msurilor corespunztoare de igien vinicol. Nu exist mijloace eficiente de tratare a vinurilor bolnave de oetire. Manitarea vinului apare n special la vinurile roii, la care fermentarea s-a oprit din cauza unor temperaturi excesive, de peste 380C. Ea se manifest prin apariia n vin a unui gust acru-dulceag, deosebit de neagreabil. Agenii care produc aceast boal sunt bacteriile lactice care transform fructoza n manitol. Nu exist mijloace de tratare a bolii, ci numai de prevenire. ncrirea lactic sau borirea vinului apare n toamnele deosebit de clduroase sau cnd fermentaia alcoolic s-a oprit, nainte ca ntregul coninut n zahr s fi fost transformat. Agenii patogenii sunt bacteriile lactice. n vinul bolnav se mrete coninutul n acid lactic, n aciditate volatil i azot amoniacal, iar prin hidroliza polizaharidelor se formeaz unele hexoze i pentoze, care confer vinului aspectul vscos. Nu exist mijloace de tratare. Fermentaia propionic sau degradarea acidului tartric apare la vinurile tinere, cu coninut sczut n alcool i aciditate i care conin zahr rezidual. Bacteriile lactice degradeaz acidul tartric sau srurile lui, cu formare de acid acetic, lactic i propionic, acesta din urm imprimnd caracterul de baz al bolii. Vinul se prezint tulbure, cu nuane de oetire i gust neplcut, dezagreabil. Vinurile albe prezint o culoare cu nuan roie-brun, iar cele roii, cenuie-brun. Bloirea vinului apare frecvent n zonele cu climat mai rcoros, fiind afectate mai mult vinurile tinere, slab alcoolice, srace n tanin, cu aciditate moderat, bogate n substane azotate i cu zahr rezidual. Agenii patogeni ai bolii sunt specii de bacterii lactice, la care se pot asocia i bacteriile acetice. Vinul bolnav se tulbur i capt un aspect vscos, de consisten mucilaginoas. Amreala vinului se ntlnete numai la vinurile roii vechi mbuteliate. Agenii patogeni sunt bacteriile lactice care atac glicerolul transformndu-l n acrolein, care se combin cu polifenolii rezultnd compui insolubili, care imprim vinului gustul amar. Culoarea vinului capt nuane brune sau crmizii, uneori negre-albstrui. n vin se formeaz un sediment lipicios, mucilaginos, de culoare brun. Izul specific de oarece se manifest prin apariia n vin a unui gust specific, neplcut i a unui miros de urin de oarece (acetamid). Agenii specifici sunt bacteriile lactice, unele mucegaiuri, drojdii din genul Brettanomyces i alte bacterii. La nceput apare o slab tulburare, care se intensific rapid formndu-se un sediment voluminos, uor mobil i de culoare cafenie-deschis. Vinurile afectate prezint i un coninut ridicat de acizi volatili. Defecte produse de mucegaiuri Mucegaiurile pot avea o influen indirect asupra calitii vinului la pstrare. Botrytis cinerea, prin eliberarea de oxidaze n cazul vinului obinut din boabe mucegite, poate produce la transvazarea vinului, n contact cu oxigenul din aer, casa oxidazic cu modificarea culorii, apariia de precipitat i gust de oxidat sau de vin fiert. n mustul fermentat, au condiii s se dezvolte n anaerobioz, sporangiospori ai mucegaiurilor din genul Mucor cu formarea de celule similare drojdiilor, care pot produce 1% alcool etilic prin fermentaie. Mucegaiuri din genul Penicillium, n pivnie

85

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE cu umezeal relativ a aerului de peste 75%, pot produce mucegirea dopurilor de plut i a lemnului. Cladosporium cellare se dezvolt preferenial pe pereii pivnielor, lemn, dopuri. Este adaptat la condiiile existente, folosind n nutriie substanele volatile, azotul din aer sau obinut prin digerarea insectelor. Formeaz un fetru msliniunegru, caracteristic pivnielor vechi.

18. PROCESE MICROBIOLOGICE LA FABRICAREA BERII

Obinerea berii este unul din cele mai vechi procese biotehnologice care folosesc drojdiile pentru a transforma glucidele fermentescibile n alcool etilic i dioxid de carbon. Primele date privind microbiologia berii sunt descrise de Louis Pasteur n 1876, n cartea Etudes sur la biere. Drojdia de bere aparine grupei ascosporogene, familia Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces. Acest gen se distinge prin urmtoarele caractere: nmulirea celulelor se face prin nmugurire; formeaz uneori pseudomiceliu; sporii sunt de obicei rotunzi sau ovali; fermenteaz ntotdeauna alcoolic i nu asimileaz azotaii. Din punct de vedere al fermentrii exist: drojdii de fermentaie inferioar Saccharomyces carlsbergensis care fermenteaz la temperaturi sczute, mergnd pn la 01C i care se depun pe fundul vasului la sfritul fermentaiei; drojdii de fermentaie superioar Saccharomyces cerevisiae care fermenteaz la temperaturi ridicate, iar la sfritul fermentaiei se ridic la suprafaa lichidului. Primele drojdii de bere de fermentaie inferioar au fost izolate n cultur pur la Laboratorul din Carlsberg (Danemarca) de ctre E.C. Hansen (1908), cultur considerat o specie distinct, Saccharomyces carlsbergensis. Clarificarea aspectelor microbiologice ale fermentaiei au fost posibile i datorit dezvoltrii unor noi utilaje de fermentare. n ultimii 20 de ani, prin metode de fermentaie noi s-a redus substanial timpul necesar pentru fermentare, prin folosirea unor cantiti mai mari de drojdie, folosirea de temperaturi de fermentare mai ridicate i de meninerea celulelor de drojdie ntr-o stare activ. Pe lng acestea, tehnologia de imobilizare a celulelor de drojdie, asigur prelungirea perioadelor de fermentare, comparativ cu metodele tradiionale. Drojdia de bere, Saccharomyces carlsbergensis, utilizat ca starter al fermentaiei, poate proveni din culturi pure de laborator sau prin recuperarea celulelor dezvoltate la o arj precedent de fermentare. Alegerea unei anumite tulpini de drojdie pentru obinerea berii, n condiii specifice de aprovizionare cu materii prime, dotrii i tehnologiei folosite, se realizeaz lund n considerare principalele caractere specifice ale drojdiei de bere: gradul final de fermentare i viteza de fermentare; capacitatea de asimilare a substanelor ce particip n metabolism; randamentul de multiplicare; capacitatea de floculare i sedimentare;

86

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE spectrul i cantitatea de produse secundare ale fermentaiei cu implicaii n gustul i aroma berii; rezisten fa de degenerare, contaminare, .a. Realizarea acestei alegeri este mult mai dificil dect a celorlalte materii prime pentru bere. ncercrile de a caracteriza drojdiile care se comercializeaz au artat c cele mai multe dintre ele sunt alctuite din specii diferite care adeseori posed proprieti de floculare. n practica industrial apar mutaii nedorite ce mpiedic flocularea. Pregtirea culturii pure de drojdie se face n general n dou faze i anume: faza de laborator; faza dezvoltrii n instalaia de culturi pure. 18.1. ALTERRI MICROBIENE ALE BERII Berea, n funcie de sortiment, prezint o compoziie variat, cu valoare nutritiv, iar diferitele componente ale berii pot servi drept substrat pentru activitatea microorganismelor ce contamineaz berea. Alterarea poate fi dat de un numr redus de microorganisme, deoarece n bere exist anumii factori defavorizani, respectiv o cantitate mic de extract uor asimilabil, prezena de alcooli, pH-ul acid, anaerobioz, presiune dat de dioxidul de carbon, temperaturi reduse la pstrare (415C). Alterarea microbiologic a berii poate fi dat de drojdii i bacterii. Alterri produse de drojdii Dezvoltarea drojdiilor de cultur cnd filtrarea nu a fost eficient, drojdii din genul Saccharomyces carlsbergensis pot continua fermentaia, produc tulburare, formeaz rapid un sediment stabil, iar la deschiderea ambalajului spumarea este mai intens, berea are extractul mai redus i o cantitate mai mare de alcool. Dezvoltarea drojdiilor de contaminare unele drojdii atipice Saccharomyces pasteurianus, Saccharomyces turbidans, pot produce contaminarea drojdiei de cultur i dau un gust specific, berea este tulbure, tulburarea este mai stabil deoarece aceste drojdii au celule mai mici ce rmn mai mult timp n suspensie, iar sedimentul este pulverulent. Alte drojdii de alterare aparin genurilor Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora, Hansenula, Pichia etc. Prezena lor poate avea efect negativ asupra stabilitii spumei deoarece ele pot elibera proteaze prin autoliz. Unele specii pot ctiga n competiie datorit avantajului de a utiliza dextrine sau de a avea caracter killer. Alterri produse de bacterii Unele bacterii sunt adaptate la condiiile existente n bere i prin activitatea lor de metabolism, produc opalescen persistent i importante modificri ale gustului, iar berea nu este acceptat n consum. O cauz a alterrii berii este datorat contaminrii secundare; se consider c 60% din contaminarea secundar are loc la umplere i capsare, datorit existenei unor locuri greu accesibile pentru dezinfecie la maina de mbuteliat. Printre bacteriile de alterare a berii se numr lactobacili heterofermentativi, care sunt mai puin sensibili la aciunea microbiostatic a rinilor din hamei, pot produce diacetil, opalescen i creterea vscozitii. Alterarea berii cu lactobacili se caracterizeaz prin turbitate fin asociat de gust acid i arome nedorite de acetoin sau de unt (diacetil). Bacteriile aerobe din genul Acetobacter sunt active dac berea este pstrat cu gol de aer; produc acid acetic, pelicul i opalescen. Acrirea berii poate fi dat de Acetobacter pasteurianus i Acetobacter xylinum. Prin activitatea lor n bere se

87

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE produce turbiditate, creterea vscozitii asociat cu o pierdere n coninutul de alcool datorit formrii acidului acetic. Berea devine filant, acr i are o culoare modificat. Bacterii din genul Zymomonas au fost izolate din bere, de pe suprafaa echipamentelor din fabrici de bere i de pe periile folosite la mainile de splat sticle. Cnd berea este alterat cu Zymomonas se formeaz turbiditate i un miros neplcut de mere putrede, datorat urmelor de aldehid acetic, H 2S i ali compui cu sulf, acizi grai, compui fenolici, diacetil, creterea vscozitii. n timpul verii prin pstrarea la cald, alterarea poate avea loc n 2-3 zile ca urmare a creterii bacteriilor i a formrii de aldehid acetic. n berea obinut prin fermentare la temperaturi sczute (8-12C) nefavorabile pentru creterea lui Zymomonas incidena acestor bacterii este redus. Bacteriile anaerobe din genul Pectinatus produc n bere H2S, acid acetic, acid propionic i opalescen. Prezena dioxidului de carbon i nivelul redus de oxigen previne creterea multor microorganisme, dar faciliteaz supravieuirea i multiplicarea bacteriilor anaerobe din g. Pectinatus i Megashera ce pot fi cauza a 5-54% din alterri. Bacteriile sporulate nu au fost detectate n bere. Bacteriile patogene i facultativ patogene nu rezist n bere, prin inocularea berii cu Escherichia coli celulele i-au pierdut viabilitatea dup 48 ore. Berea este un produs stabil datorit pH-ului redus, prezenei constituenilor hameiului, nivel redus de oxigen i nutrieni, prezena alcoolului care limiteaz creterea patogenilor, n schimb riscul de cretere a acestora, exist la berea fr alcool.

19. MICROBIOLOGIA OETULUI

Fabricarea vinului se cunoate de aproape 10000 de ani i se poate imagina c i producerea de oet, care este de fapt un vin acru rezultat prin fermentaia vinului cu bacterii acetice, este la fel de veche. n prezent la nivel mondial se fabric diferite sortimente de oet i pe lng oetul din vin, n funcie de zona geografic, se pot obine oet de mere (din cidru), oet de orez, din sucuri de fructe citrice, din alcool, din mal sau bere, de tarhon, de petale de trandafir i alte surse. Se estimeaz c media pe cap de locuitor, consumul de oet din rile industrializate este echivalent cu 1l oet cu 10% aciditate pe an. Se mai poate obine din alcool purificat (spirt vinegar sau distiled vinegar) ce poate fi obinut cu aciditate mai mare de 18% g/v. Particulariti ale fermentaiei acetice n condiii industriale La fabricarea industrial a oetului n funcie de natura materiilor prime se folosesc tulpini adaptate care dau randamente superioare de producere a acidului acetic. Cu ani n urm cea mai mare cantitate de oet se obinea prin procedeul lent Orleans. ncepnd cu secolul al XIX-lea n Germania este introdus procedeul rapid, mai eficient i mai uor de controlat. Un acetator simplu este format dintr-un vas tronconic nalt, umplut cu rondele de stejar, prevzut cu sistem de aerare i recirculare a mediului de cultur, pn la atingerea concentraiei de 9-10 grade acetice. La pornirea fermentaiei se efectueaz sterilizarea rondelelor i pulverizarea suspensiei de bacterii acetice care rmn fixate n fibrele lemnoase i n prezena mediului rspndit uniform i a aerului are loc

88

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE acumularea oetului. n acest procedeu randamentul de conversie a alcoolului la acid acetic este de 75-80%. Performane superioare se obin cu generatorul de oet Frings i alte sisteme n care randamentul de conversie este de 95%. Frings a adus mbuntiri procedeului asigurnd o aerare puternic i controlul temperaturii nct n prezent se consider c 30% din instalaiile prezente funcioneaz dup acest procedeu. Bacteriile acetice fac parte din ordinul Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae, genul Acetobacter, larg rspndite n natur pe materiale vegetale care au suferit fermentaia alcoolic. Dup atingerea gradului de aciditate dorit, oetul se pasteurizeaz i /filtreaz pentru ndeprtarea impuritilor. Pentru mbuntirea calitilor senzoriale oetul de fermentare este supus nvechirii n butoaie pline (de stejar) n care au loc: oxidarea lent a aldehidelor, formarea de esteri i stabilizarea calitii. n ara noastr se obine industrial oet de 9 (grade acetice). Este un produs stabil din punct de vedere microbiologic deoarece la aceast concentraie n acid acetic, nu este posibil creterea microbian.

20. MICROBIOLOGIA CEREALELOR, FINURILOR I PRODUSELOR DERIVATE

21.1. MICROBIOLOGIA CEREALELOR La suprafaa cerealelor exist o microflor foarte bogat alctuit din microflora epifit (de suprafa) ce se ataeaz la suprafaa bobului n timpul formrii, creterii i maturizrii bobului i microflora ce provine din sol i ajunge pe bob prin intermediul factorilor naturali n timpul recoltrii, transportului i depozitrii. Exist i o microflor de contaminare prin contactul cu solul, praful a mijloacelor de transport. n funcie de sursa de provenien microflora poate fi: a) microflora de cmp, n care predomin microflora epifit n care exist n cantitate mare bacterii i actinomicete: bacterii Pseudomonas herbicola, bacterii din genul Micrococcus, Lactobacillus, mucegaiuri din genul Alternaria (40% din total), Cladosporium, Rhizopus, Fusarium; b) microflora de depozit, ntlnit n cerealele depozitate un timp mai ndelungat: bacterii Pseudomonas herbicola, bacterii din genul Bacillus, Micrococcus, mucegaiuri din genul Aspergillus, Penicillium. n timpul depozitrii dac umiditatea boabelor se afl sub 13-14% (deci apa liber este insuficient pentru a favoriza creterea microorganismelor) se constat o scdere numeric a microflorei i n special mor formele nesporulate. Dac apar condiii favorabile de absorbire a umiditii din aer i n bob ncepe s apar ap liber sunt favorizate mucegaiurile pentru c ele sunt xerofite (necesit cantiti mici de ap pentru a putea s germineze). Aceste mucegaiuri au i echipament enzimatic bogat astfel nct pot s degradeze proteinele din bob, ele se dezvolt la temperatura de depozitare a cerealelor. n timpul depozitrii pot apare condiii favorabile pentru creterea coninutului de ap datorit unui fenomen numit hidrodifuzie, proces fizic prin care umiditatea dintr-un material difuzeaz ntotdeauna spre stratul mai rece al masei, apa de condens favoriznd creterea mucegaiului. Apariia condensului este determinat de modificri brute ale temperaturii masei de boabe, comparativ cu mediul ambiant, de obicei iarna i primvara.

89

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE n condiii favorabile de umiditate, ca urmare a germinrii sporilor de mucegai, acetia se nmulesc activ i prin respiraie degaj o cantitate mare de cldur, de sute de ori mai mare dect cea degajat de boabe. Pentru c masa are o termoconductibilitate sczut apar straturi sau focare de ncingere. n acest caz se intervine prin dispersarea i aerarea boabelor. Dac nu se intervine, ca urmare a cldurii degajate prin activitatea mucegaiurilor are loc treptat o cretere a temperaturii masei de boabe, care n cazul cerealelor ajunge la un maxim de 55C. Prin creterea treptat a temperaturii n diferite etape de ncingere au loc modificri n compoziia microflorei cerealelor. n prima etap de ncingere cnd temperatura ajunge la 30-35C are loc o nmulire a majoritii microorganismelor mezofile (bacterii, mucegaiuri). Dac temperatura crete la 30-55C are loc o inactivare a sporilor de mucegai, o reducere a bacteriilor nesporulate, rmn active i cresc numeric doar bacteriile termofile (n special cele din genul Bacillus). Dup ce s-a atins un maxim al incingerii, treptat ncepe faza de declin i are loc o rcire treptat explicat prin faptul c au fost inactivate mucegaiurile, iar umiditatea ncepe s migreze spre stratul mai rece i nu mai asigur condiii de nmulire i activitate microbiologic. n urma ncingerii i mucegirii cerealelor au loc importante modificri ale calitilor lor tehnologice: modificri ale calitilor senzoriale: culoarea boabelor devine mat, i pierd strlucirea, uneori n zona embrionului apare o pat colorat n brun spre negru i ntregul bob se coloreaz n maro spre negru (rezult boabe carbonizate). Explicarea colorrii este urmtoarea: sub aciunea microorganismelor se formeaz compui de tip aminoacid i zaharuri reductoare (glucoz, fructoz); prin creterea temperaturii la ncingere au loc reacii Maillard cu formare a melanoidinelor de culoare brunnegru. Mirosul este modificat. Apare un miros i gust de mucegai datorit unor mirosuri ce se fixeaz bine de componentele bobului i poate fi regsit n fin i pine. Boabele mucegite pierd din greutate, devin uoare, zbrcite, ca urmare a consumrii substanei utile a bobului; boabele mucegite i pierd capacitatea de germinare, deoarece mucegaiurile din genul Aspergillus, Penicillium localizate n germene sau embrion distrug structura acestuia (se mai numesc i mucegaiuri sterilizante). Cerealele mucegite i pierd valoarea alimentar i nu mai pot fi folosite n furajarea animalelor pentru c exist riscul de dezvoltare a unor mucegaiuri ce pot produce toxine: genul Aspergillus, Penicillium, Fusarium. 20.2. MICROBIOLOGIA FINURILOR Cercetrile microbiologice efectuate pentru diferite finuri i crupe au dovedit prezena diferitelor grupe de microorganisme n numr ce variaz de la 10-106 ufc/g. n finurile de calitate normal, microbiota este format predominant din bacterii i n cantitate mai mic se ntlnesc drojdiile i mucegaiurile. n loturile de fin proaspt mcinat, microbiota are o compoziie similar cu cea a cerealelor. Diferena ntre cantitatea de microorganisme coninute de cereale i cea care trece n fin, va depinde de caracterul curirii cerealelor nainte de mcinare i de gradul de extracie al finii. Cantitatea de microorganisme din finuri mai depinde de condiiile de transport i depozitare, de calitatea ambalajului i ali factori. n microbiota normal a finurilor trebuie s fie absente salmonelele, stafilococii coagulazo-pozitivi i alte

90

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE bacterii patogene pentru om. Prezena unor astfel de bacterii, dovedete un grad de igien necorespunztor i o contaminare a acestor produse prin intermediul roztoarelor. Comparativ cu cerealele, fina este un produs mai puin stabil din punct de vedere microbiologic. Deoarece n fin lipsesc sistemele de aprare existente n bobul integru, reprezentanii microbiotei cerealelor care ajung n fin vin n contact direct cu substanele nutritive pe care aceasta le conine i din acest motiv, odat cu apariia condiiilor favorabile de umiditate i temperatur, se nmulesc activ, dnd alterri ale finei. S-a stabilit c n fina care are o umiditate de 14% i care este pstrat n condiii normale n silozuri de fin, nu are loc o multiplicare a microorganismelor i treptat are loc o reducere a numrului lor. Dac n timpul pstrrii finii apar condiii care s favorizeze termohidrodifuzia i umiditatea crete cu 1-2% peste umiditatea de 14%, atunci fina devine un mediu favorabil dezvoltrii microorganismelor. Fenomenul de termohidrodifuzie se poate produce atunci cnd are loc nmagazinarea finii calde, pe podeaua rece din beton, piatr etc., sau cnd, dintr-un anumit motiv, are loc nclzirea unuia din straturile finii, condiii care determin transferul umiditii din fin spre straturile mai reci, care i vor mri astfel umiditatea. Termohidrodifuzia apare i la transportul finii n vagoane, cnd exist diferene mari ntre temperatura finii i cea a mediului ambiant. Ca rezultat al creterii umiditii, se produce n timp o alterare a calitii finii. Alterri ale finii Dintre toate tipurile de alterri microbiene ale finurilor, mai frecvent ntlnite sunt: mucegirea, ncingerea i acrirea. Mucegirea este tipul de alterare cu frecvena cea mai mare de rspndire. Odat cu creterea umiditii peste valoarea umiditii de conservare (maximum 15%), sporii de mucegaiuri germineaz i prin intermediul hifelor, se rspndesc cu uurin n interiorul loturilor de fin. Ca rezultat al dezvoltrii mucegaiurilor se produc modificri ale mirosului i gustului care, n cazul finurilor, se transmit i produselor de panificaie. n fina mucegit, au loc modificri ale calitilor tehnologice, concretizate prin creterea aciditii, ca rezultat al hidrolizei lipidelor de ctre enzimele fungice i formrii acizilor organici, prin metabolizarea glucidelor. Glutenul capt o culoare mai nchis, are o elasticitate mai redus i se reduce cantitativ. Speciile de mucegaiuri ce se dezvolt preferenial n fin fac parte din genurile: Penicillium, Aspergillus, Mucor i Rhizopus; unele dintre ele pot elabora n anumite condiii micotoxine. ncingerea. Rolul negativ al microorganismelor n incingere este mult mai evident n cazul finurilor dect la cereale. n fina proaspt mcinat i care a suferit procesul de ncingere, au loc importante modificri fizice i biochimice, cu o intensitate mai mare dect n cazul cerealelor. Ca rezultat al mucegirii i ncingerii se produce o pierdere a pulverulenei finii, capacitii de curgere i fina se poate transforma ntr-o mas compact. Acrirea este rar ntlnit la fin i mlai, atunci cnd umiditatea lor este mare i sunt abseni sporii de mucegai. Acrirea este caracterizat printr-o mrire accentuat a aciditii, datorat dezvoltrii bacteriilor acidifiante, care metabolizeaz glucidele cu formarea de acizi organici. Dezvoltarea bacteriilor acidifiante (genul Lactobacillus) are loc concomitent cu cea a bacteriilor care produc degradarea

91

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE amidonului pn la glucide simple, din genul Bacillus, ntre aceste grupe de bacterii se stabilesc astfel, relaii de metabioz. Pentru a evita alterarea microbiologic a finurilor care conduce ntotdeauna la o reducere a calitii lor, depozitarea trebuie s se fac la temperaturi sub 12C n ncperi cu o umezeal relativ de 60-70%. 20.3. MICROBIOLOGIA PINII I A PRODUSELOR FINOASE La fabricarea pinii se folosesc drept materii prime: fina, apa, sarea i drojdia comprimat, materii care introduc n procesul tehnologic o microbiot caracteristic, n componena creia intr: microorganisme utile, celule de drojdie (Saccharomyces cerevisiae), bacteriile lactice i propionice; microorganisme indiferente, care nu se multiplic n condiiile unui proces normal; microorganisme duntoare care dau defecte i boli ale pinii. Totalitatea microorganismelor introduse odat cu aceste materii prime sufer transformri cantitative i calitative i determin n cursul procesului tehnologic, modificri ce conduc la obinerea unui produs finit de bun calitate sau la alterare. Pentru declanarea proceselor fermentative principale ce au loc la fabricarea pinii se introduce n aluat drojdie comprimat sau maia de drojdie. n aluat, preparat din ap 60%, sare 1,5% i 2% drojdie comprimat, va conine aproximativ 12 x 10 7 celule la 1 gram aluat. Cunoaterea caracterelor fiziologice ale celulelor de drojdie a condus la folosirea n panificaie a drojdiilor lichide, folosite n proporie de 10% la fabricarea maielelor. n drojdiile lichide este favorizat multiplicarea i adaptarea celulelor de drojdie, nct acestea fermenteaz mai rapid maltoza i au o activitate fermentativ de 4 ori mai mare dect a drojdiei comprimate. Maiaua reprezint un sistem complex cu umiditate de 62-65% i care prin meninere la temperaturi de 2832C i pH acid favorizeaz multiplicarea drojdiilor i a bacteriilor lactice. Multiplicarea celulelor de drojdie depinde de temperatura i consistena maielei. Astfel, la temperaturi mai mari de 32C viteza de nmulire a drojdiei se reduce, iar dac consistena maielei este mare se poate produce o inhibare a multiplicrii. Aerarea maielelor activeaz nmulirea celulelor de drojdie i capacitatea de a forma CO2, gaz care se dezvolt n corelaie direct cu numrul de celule vii de drojdie. n maia i aluat ntre drojdii i diferitele specii de bacterii lactice pot s apar relaii de concuren, metabioz i anabioz. Drojdiile favorizeaz dezvoltarea bacteriilor lactice prin punerea la dispoziie a vitaminelor factori de cretere pentru bacterii. Prin folosirea oxigenului n aluat sunt create condiii de anaerobioz; la rndul lor bacteriile lactice produc acizi care menin n aluat un pH acid ce favorizeaz desfurarea normal a fermentaiei alcoolice a zaharurilor din fin sau formate prin activitatea enzimelor amilolitice ale finii. Fermentarea reprezint faza din procesul tehnologic cu ponderea cea mai mare din timpul destinat fabricrii pinii i se produce n aluat n timpul divizrii, modelrii, dospirii bucilor de aluat modelate i chiar n prima perioad a procesului de coacere. n aluat, celulele de drojdie i bacterii lactice au o vitez de multiplicare mult mai redus datorit coninutului redus n ap liber, a gradului redus de aerare, a coninutului n celule mai redus dect n maia, n schimb acestea desfoar o activitate metabolic normal i n funcie de echipamentul lor enzimatic propriu, produc fermentarea specific a surselor hidrocarbonate asimilabile.

92

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Celula de drojdie absoarbe uor hexozele care trec prin membrana citoplasmatic celular prin difuziune simpl n cazul n care exist un gradient de concentraie ntre concentraia lor n exteriorul celulei i cea din interior. Transportul activ se poate realiza i prin translocaie de grup a esterilor fosforici ai hexozelor prin intermediul hexokinazelor. Printre hidraii de carbon existeni n aluat sau formai n urma hidrolizei amidonului sub aciunea alpha i beta-amilazei prezente n fin (sau din surse exogene), exist o diferen n secvena de absorbie i fermentare. Astfel, cel mai rapid sunt absorbite hexozele (glucoza), apoi zaharoza i maltoza. Zaharoza este hidrolizat n exteriorul membranei citoplasmatice, n regiunea peretelui celular unde este localizat invertaza ( D-fructofuranozid-fructohidrolaza) i este absorbit cu o vitez echivalent cu cea a hexozelor din care este format, respectiv glucoza i fructoza, zaharuri direct fermentescibile. Fermentarea succesiv se explic prin adaptarea treptat a celulei prin inducerea enzimelor adaptive, pe msur ce n mediu se formeaz maltoz. D-maltoza principalul dizaharid prezent n aluat este fermentat numai dup o perioad de inducie necesar pentru formarea enzimei maltaza (alpha D glucozid glucohidrolaza). Maltoza i maltotrioza ptrund n celula de drojdie sub influena unor permeaze specifice induse n prezena lor, enzime care se comport ca sisteme active de transport. Dup ptrunderea n interiorul celulei sub aciunea glucozidazei induse este hidrolizat n glucoz (2 moli) i are loc fermentarea rapid. Ca rezultat al fermentaiei alcoolice, are loc o cretere n volum a aluatului, datorit dioxidului de carbon format i reinut de gluten, iar produsele secundare ale fermentaiei alcoolice particip la formarea gustului i aromei pinii. Defecte i boli ale pinii produse de microorganisme Mucegirea. Este unul dintre cele mai frecvente defecte de natur microbiologic, ntlnite n industria panificaiei. Se apreciaz c aproximativ 1-5 % din producia de pine, se altereaz datorit activitii fungilor. n cazul pinii contaminarea cu mucegaiuri determin nu numai modificri ale culorii, gustului, ci i pierderi ale calitii de aliment, ca rezultat al formrii posibile de micotoxine. Mucegirea este datorat contaminrii externe a pinii dup coacere, deoarece sporii existeni n fin, n timpul unui proces tehnologic normal nu au condiii de multiplicare, iar n timpul coacerii, acetia sunt distrui. Contaminarea cu mucegaiuri a pinii, se poate produce n urmtoarele etape: la transportul pinii; la rcire i depozitare; n timpul tierii i ambalrii (operaii facultative). Propagarea sporilor de mucegai i contaminarea pinii poate avea loc indirect, pe calea aerului din sala de depozitare (prin aer) sau direct, prin contact cu ldie, navete, mijloace de transport etc. Dintre mucegaiurile care contamineaz pinea n timpul pstrrii, se ntlnesc frecvent urmtoarele specii i genuri: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Geotrichum candidum, Mucor, Neuropspora sitophila, Penicillium, Rhizopus stolonifer, Thamnidium elegans. Prin dezvoltarea altor mucegaiuri se produc pigmentri superficiale, care nu afecteaz dect aspectul comercial al pinii. Astfel prin dezvoltarea lui Geotrichum auranticum i Thamnidium auranticum, are loc o colorare n rou-auriu a pinii n zona de dezvoltare a coloniilor.

93

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Defectul de pine cretoas. Este produs prin dezvoltarea pe suprafaa pinii a lui Monilia variabilis, care formeaz pete cu un aspect finos, pulverulent; acest defect este mai frecvent la pinea obinut cu fin de secar. Un alt aspect nedorit al mucegirii, l constituie posibilitatea dezvoltrii mucegaiurilor productoare de micotoxine ca: Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium expansum, Penicillium viridicatum. Defecte ale pinii produse de ctre drojdii. Drojdiile pot produce rar, defecte ale aspectului i gustului pinii, contaminate dup coacere, n condiiile n care umezeala relativ a aerului este mai mare de 90%. Drojdiile din genul Endomycopsis pot produce pete pe suprafaa i n interiorul pinii. Datorit enzimelor amilolitice pe care le conin, are loc o hidroliz parial a amidonului, cu formare de dextrine i glucoz. Pe pine se mai pot dezvolta i drojdii din genul Rhodotorula, care formeaz colonii colorate n rou, dnd defectul de culoare, fr ns a produce modificri n compoziia pinii. Defecte i boli ale pinii produse de bacterii. Bacteriile pot produce defecte i boli ale pinii, n condiiile unui proces tehnologic defectuos, dac nu sunt respectate condiiile igienico-sanitare. Ca i mucegaiurile, bacteriile pot proveni prin contaminare indirect i direct. Dezvoltarea i multiplicarea bacteriilor este favorizat de umiditatea mare a miezului i de temperaturi n intervalul 25-40C. Cele mai importante alterri ale pinii produse de bacterii sunt defectele de culoare i boala ntinderii. Defecte de culoare. n timpul verii, cnd pinea este pstrat la temperaturi de 20-30C, pot apare pete de culoare roie datorit multiplicrii lui Chromobacterium prodigiosum. Aceast bacterie secret un pigment de culoare roie, prodigiosina i se dezvolt optim la 25C. Pinea se poate pigmenta i prin dezvoltarea lui Chromobacterium cianogenum, care elaboreaz n pine un pigment de culoare albastr sau violet. Bacteriile care dau defecte de culoare nu sunt componente ale microbiotei normale a finii, acestea ajungnd prin contaminare, de pe utilaje i din aer. Boala ntinderii. Este apreciat a fi cea mai important boal a pinii, provocat de bacterii. Agenii microbieni productori ai bolii, sunt inclui n grupul Bacillus din care fac parte urmtoarele specii: B.mesentericus, B.subtilis i B.licheniformis. Aceste bacterii fac parte din microbiota cerealelor i trec n fin prin procesul de mcinare; n cazul loturilor de cereale care au suferit ncingerea, numrul bacteriilor sporulate care ajung n fin, este mrit. Bacteriile se caracterizeaz prin formarea endosporilor de tip bacillus, termorezisteni, care i pstreaz viabilitatea n procesul de coacere al pinii. Prin sterilizarea unui mediu care conine bacterii sporulate, la temperatura de 100C, este necesar un timp de 5,5-6 ore. Deoarece temperatura maxim care se obine n timpul coacerii n interiorul pinii este de ~98C pe o durat de cateva minute, sporii bacterieni nu sunt distrui i dup coacere pot trece n forma vegetativ, se multiplic, producnd alterarea pinii. Bacteriile pot forma un pigment roz-cenuiu; au un pigment roz-cenuiu; au un bogat echipament enzimatic i pot s produc o hidroliz avansat a proteinelor i amidonului. Boala ntinderii se ntlnete mai frecvent la pinea alb, n timpul verii. Dup pstrarea pinii proaspete 24-48 ore, prin ruperea pinii se simte un miros caracteristic de pepene galben, miere sau de valerian. Miezul pinii este lipicios i la rupere se ntinde n fire i din acest motiv aceast alterare a primit denumirea de

94

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE boal a ntinderii. Pe msura dezvoltrii bolii, mirosul se intensific, devine putrid, iar miezul este cleios, i pierde structura poroas i apar goluri i rupturi. Toate aceste modificri sunt datorate activitii metabolice a bacteriilor sporogene, care i procur astfel substanele nutritive i energia necesar creterii i multiplicrii lor. Degradarea structurii normale a miezului se produce ca rezultat al capacitii acestor bacterii de a hidroliza amidonul gelificat, pn la dextrine i glucide fermentescibile. Cantitatea de amidon, ntr-o pine cu boala ntinderii poate s scad de la 63% ct conine o pine normal, pn la valori de 16%. Bacillus subtilis posed enzime proteolitice de tipul papainei, dipeptidaze i polipetidaze, care pot s produc o hidroliz avansat a protidelor din miez, ceea ce determin formarea firelor la ruperea pinii. 20.4. PROCESE MICROBIOLOGICE LA FABRICAREA PASTELOR FINOASE Pastele finoase se prepar din fin, ap, sare i alte materii care se adaug n vederea mririi valorii nutritive a pastelor, deoarece produsele de mcini utilizate la fabricarea lor sunt lipsite de unii aminoacizi eseniali ca triptofanul, lizina, valina i treonina, aminoacizi care se gsesc n exces n protidele de origine animal. n procesul tehnologic, microorganismele aflate n fin i cele din ap, sare, ingrediente, pot gsi condiii de dezvoltare n timpul frmntrii, presrii i n primele etape ale procesului de uscare. La operaia de presare granulele de amidon ale finii i pierd parial integritatea i sunt mai uor hidrolizate sub aciunea enzimelor microbiene. Amidonul i substanele proteice ale finii, datorit proprietilor higroscopice, leag apa coloidal, nct aluatul de paste are o umiditate de 27-33%. La aceste valori ale umiditii, n cazul ntreruperii accidentale a fluxului tehnologic normal, exist condiii de multiplicare a microorganismelor. Uscarea pastelor finoase reprezint faza final a procesului. Ca urmare a temperaturilor de maximum 50C atinse la uscare, microorganismele existente nu sunt distruse, acestea trec ntr-o stare de anabioz. La sfritul uscrii pastele trebuie s aib umiditatea de 12% care le asigur conservarea un timp ndelungat. La depozitare, ntre umezeala relativ a aerului i pastele finoase se stabilete o umiditate de echilibru; n condiiile n care umiditatea n paste crete peste 14-15%, microorganismele existente pe produs, pot s se dezvolte activ, dnd alterri ale pastelor finoase. n afar de microorganismele componente ale microbiotei materiilor prime i auxiliare folosite n reeta de fabricaie a pastelor finoase i care reprezint ponderea cea mai ridicat, o surs suplimentar o poate constitui aerul, utilajele, personalul. Printre defectele de natur microbiologic care au loc la fabricarea pastelor finoase, cel mai frecvent este acrirea pastelor, ca rezultat al multiplicrii bacteriilor lactice care fermenteaz glucidele din fin cu formarea de acid lactic, produse secundare. n unele cazuri, acrirea pastelor este asociat cu apariia pe suprafaa lor a unor baicue de gaz, care difer ca repartizare, dimensiuni i densitate pe suprafa; prin spargerea lor, n masa de aluat rmn alveole. n urma controlului microbiologic al macaroanelor cu ou, n afar de bacterii organotrofe, au fost prezente bacterii productoare de toxine. Astfel s-au identificat specii de Staphylococcus aureus i din genul Salmonella, n cantiti de 102-106ufc/g. Mucegirea pastelor finoase poate avea loc n mod accidental la uscare, n cazul unor ntreruperi ale procesului tehnologic, favorizat de umezeala relativ ridicat de 85-90% existent n dulapurile de uscare, cnd temperatura nu depete

95

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE valori de 45C. mucegirea se mai pot produce i n timpul depozitrii, cnd umiditatea pastelor crete peste 14-15%. n paste au fost depistate peste 79 de specii de mucegaiuri, reprezentante ale genurilor: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cladosporium, Spicaria. Dintre speciile izolate, n urma testrii, lor, dou specii aparinnd lui Aspergillus flavus, au produs aflatoxine. 20.5. PROCESE MICROBIOLOGICE LA FABRICAREA BISCUIILOR La fabricarea biscuiilor, dei microbiota aluatului este deosebit de variat, datorit procesului de coacere la temperaturi ridicate i dimensiunile reduse ale biscuiilor are loc distrugerea tuturor microorganismelor prezente n aluat. Unul din principalele defecte de natur microbiologic care se poate ntlni la fabricarea biscuiilor, este apariia n produsul finit, imediat dup preparare, sau n timpul depozitrii, a unui gust neplcut de spun, dac grsimea animal sau vegetal utilizat la obinerea lor a suferit n prealabil o mucegire.

21. MICROBIOLOGIA FRUCTELOR

Microbiologia fructelor este eterogen i variaz cantitativ, n funcie de soi, dimensiuni, structura anatomic, grad de coacere i condiii de recoltare, transport i conservare. Fructele se consum n stare proaspt, de aceea ele pot fi vehiculante a unor microorganisme facultativ patogene, astfel nct din punct de vedere microbiologic este important ca nainte de consum s se fac splarea lor cu ap potabil. n cazul epidemiilor se recomand dezinfectarea fructelor pentru distrugerea patogenilor i apoi cltirea cu ap fiart i rcit. n microbiota fructelor apar accidental microorganisme patogene i facultativ patogene: Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, bacterii care produc mbolnviri/toxiinfecii alimentare. Prin intermediul fructelor se poate transmite Helicobacter pyloris bacterie mobil adaptat la aciditatea sucului gastric, care colonizeaz omul i animalele, fiind agent al gastritelor i enteritelor. Se pot dezvolta pe fructe mucegaiuri organotrofe comune sau care produc micotoxine (g. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichothecium). Rezistena fructelor la pstrare depinde de numeroi factori: structura anatomic a fructelor, substane de protecie cu efect antimicrobian (acizii organici), substanele fitoncide (prezente n fructe) acioneaz cu efect letal asupra unor microorganisme uleiuri eterice. Cea mai rspndit form de alterare a fructelor este putrezirea provocat de dezvoltarea i activitatea mucegaiurilor. Fructele i n special sucurile lor prezint un mediu favorabil pentru aciunea microorganismelor. Dintre microorganismele care produc alterri ale fructelor fac parte: bacteriile au un rol minor n alterarea fructelor deoarece nu pot aciona asupra fructului intact sau nu au condiii de dezvoltare la pH acid. Atunci cnd fructele sunt zdrobite se pot dezvolta ocazional bacterii acidotolerante (lactice) i bacterii acetice, care se dezvolt n asociaie cu drojdii, de la care se folosesc factorii de cretere sau produsele lor de catabolism, drojdiile sunt foarte rspndite n microbiota epifit a fructelor i produc alterri cnd vin n contact cu sucul dulce. Activitatea lor se manifest prin fermentaia alcoolic a glucidelor i prin nmuiere datorat enzimelor pectolitice. Se dezvolt uneori dup putrezirea dat de mucegaiuri sau n zone lezate ale fructelor. Drojdiile din genul Rhodotorula i Sporobolomyces se caracterizeaz prin formarea

96

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE unor pigmeni roii; specii ale genurilor Candida, Hansenula, Kloeckera i Torulopsis n asociaie cu specii de Saccharomyces i Schizosaccharomyces folosesc ca surs de carbon, acidul malic, care le permite dezvoltarea de fructe acide; mucegaiurile pot produce alterri att n perioada de cretere i maturizare a fructelor ct i n timpul pstrrii lor n stare proaspt. Dintre genurile des ntlnite fac parte g. Alternaria produce alterarea fructelor dulci i putrezirea brun; g. Aspergillus se dezvolt pe fructe foarte dulci sau cu umiditate sczut; specia Botrytis cinerea d putrezirea umed cenuie a fructelor dulci (struguri, cpuni, ciree) ca urmare a activitii pectolitice le transform ntr-o mas mucilaginoas terciuit; g. Cladosporium produce mucegirea pepenilor formnd pete de culoare brun-negru i putrezirea uscat a altor fructe dulci; g. Mucor i g. Rhizopus dau putrezirea acid i umed, se dezvolt pe fructe cu umiditatea mare chiar i la temperaturi de refrigerare (detectarea lui Mucor n alimente este un indiciu de nerespectare a igienii sau c materia prim este de calitate inferioar); g. Penicillium speciile acestui gen dau putrezirea verde (umed) sunt foarte rspndite i se dezvolt pe ciree, caise, viine, mere, pere, fructe citrice; g. Trichoderma formeaz colonii de culoare verzuie i d putrezirea umed i nmuierea fructelor ca urmare a elaborrii active de celulaze. Odat ci scderea calitilor senzoriale, n cazul alterrilor fungice fructele i pierd i valoarea alimentar datorit riscului potenial al unor mucegaiuri de a produce micotoxine extracelulare, nct ndeprtarea numai a prii alterate vizibil, nu este suficient de a elimina riscul de intoxicaie. n cazul fructelor citrice mucegite cu specii toxicogene de Aspergillus au fost identificate n suc, aflatoxinele B1 i G1 (la portocale) i sterigmatocistine (la grefe).

22. MICROBIOLOGIA SUCURILOR I A BUTURILOR RCORITOARE

De pe suprafaa fructelor n procesul tehnologic de extracie, microorganismele trec n suc. Sucurile de fructe i buturile rcoritoare au pH redus i conin cantiti apreciabile de glucide, nct devin medii selective favorabile pentru creterea drojdiilor. Stabilitatea biologic a sucurilor de fructe este influenat de: intensitatea contaminrii iniiale a sucurilor care se reflect n cantitatea i natura microorganismelor prezente n suc dup ambalare; compoziia chimic a sucului, respectiv de coninutul de glucide, combinaii asimilabile de azot, substane minerale, vitamine, valoare pH, rH; diferii factori de producie pot cauza distrugerea sau ndeprtarea microorganismelor, ca de exemplu: pasteurizarea, sterilizarea, blanarea, turnarea la cald, filtrarea sterilizant, adugarea de conservani; temperatura de pstrare; n domeniul temperaturilor de refrigerare se reduce viteza de cretere i nmulire a microorganismelor, prelungindu-se perioada de pstrare; rezistena microorganismelor prezente n suc la aciditatea natural, sensibilitatea la ali factori restrictivi. Alterri microbiene ale sucurilor de fructe Drojdii. Sunt produse alterri n proporie de 90% de ctre drojdii care se dezvolt pn la valori de pH = 2,5 cu o cretere ncetinit de la valori de pH<3. n sucuri concentrate de portocale se ntlnesc frecvent specii ale genului Torulopsis.

97

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Mucegaiuri. Mucegirea este posibil dac exist gol de aer i este produs de specii ale genurilor Penicillium, Aspergillus, Phyalophora etc. Mucegaiurile pot forma o pelicul la suprafaa sucurilor i pot elibera substane colorate sau s degradeze pigmenii naturali ai sucului. Bacterii. Ocazional se ntlnesc i alterri datorate bacteriilor lactice din genul Lactobacillus i Leuconostoc. n sucuri de citrice bacteriilor lactice ncep s fie inhibate la pH = 4. Alterarea microbian a buturilor rcoritoare Sucurile de fructe se folosesc i la obinerea buturilor rcoritoare (nealcoolice), care se conserv ca urmare a unui pH sczut i a concentraiei de dioxid de carbon. Alterrile sunt date de drojdii i bacterii care pot proveni din zahr sau din microbiota sucurilor. Pentru obinerea unor buturi de calitate este necesar respectarea procesului tehnologic i asigurarea condiiilor de igien cu efectuarea unui control microbiologic sistematic. Buturile rcoritoare pot fi un mediu nutritiv pentru microorganisme deoarece conin 0,5-15% zahr, acizi organici, cantiti infime de azot organic, sruri minerale. Microorganismele ageni de alterare a acestor buturi pot fi arbitrar mprite astfel: microorganisme care produc modificarea nsuirilor senzoriale n care intr: o drojdii din genurile Saccharomyces, Torulopsis, Hansenula, Pichia, Candida; o bacteriile lactice produc transformarea acidului malic n acid lactic i dioxid de carbon ceea ce duce la reducerea aciditii i stabilitii; microorganismele care produc modificri ale aspectului i a gustului, n buturi necarbonatate din care fac parte mucegaiuri din genul Aspergillus, genul Penicillium, iar dintre bacterii, bacterii acetice din genurile Acetobacter i Acetomonas. Aceste bacterii se pot dezvolta n buturi cu potenial de oxidoreducere ridicat i sunt inhibate de prezena dioxidului de carbon, dar pot fi rezistente la unii conservani, ca de exemplu la acidul sorbic i acidul benzoic. nmulirea bacteriilor acetice denot o splare insuficient, o umplere incomplet a sticlelor i capsule cu defecte de etaneitate; microorganisme care nu produc modificri senzoriale dar prezint risc pentru sntatea consumatorilor, n care sunt incluse bacterii ageni ai toxiinfeciilor i intoxicaiilor alimentare.

23. MICROBIOLOGIA LEGUMELOR

Microbiologia legumelor proaspete Legumele au o microbiot foarte bogat deoarece, n funcie de natura lor, vin n contact cu solul i pot avea ntre 102-107 ufc/g. Un grad ridicat de contaminare este ntlnit la legume verzi (salate, spanac, ceap, varz) contaminate prin microorganisme provenite din praf, ape de irigaie, ap de ploaie, n care frecvent se ntlnesc bacterii: Alcaligenes, Flavobacterium, lactobacillus, Micrococcus i spori de mucegaiuri. Pe foi de varz, n zona central, se pot gsi bacterii lactice n concentraii de aproximativ 103/cm2. n cazul irigrii solului cu ape poluate, prin legume consumate n stare proaspt se pot transmite microorganisme patogene i facultativ patogene: Escherichia, Salmonella (n 25-75% din probe de salat), Shigella, Klebsiela.

98

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Dintre bacteriile ageni ai toxiinfeciilor alimentare, pe legume se pot ntlni Bacillus cereus i Bacillus thurigiensis ce poate fi folosit n calitate de insecticid biologic, care rezist pe suprafaa plantelor, pot supravieui la prelucrrile tehnologice i prin nmulire la concentraii de 109/g, pot produce toxiinfecii alimentare. Microorganismele patogene pot s provin i din contaminarea secundar n timpul prelucrrii manuale sau prin intermediul aparaturii (la tiere, tocare, rzuire etc.) dac nu se respect condiiile igienice. Contaminarea este mai rapid cnd esutul protector este degradat la recoltare, transport sau prin intermediul insectelor. Legumele prezint o compoziie valoroas i sisteme de protecie fa de atacul microbian. Astfel prezint o cuticul de protecie de natur celulozic, unele legume conin substane fitoncide: ridichea sulforaphen, ceapa alicin, hreanul substane volatile care inhib creterea lui Bacillus subtilis i Escherichia coli. Unele legume, rdcinoase pot elabora fitoalexine, substane cu activitate antibiotic sintetizate ca o reacie la prezena agenilor de infecie. n timpul pstrrii, legumele comparativ cu fructele, sunt mai puin protejate, deoarece au un pH apropiat de neutru, convenabil dezvoltrii majoritii microorganismelor. Alterri microbiene ale legumelor Putrezirea legumelor poate fi cauzat de bacterii i mucegaiuri, n timp ce bacteriile au un rol minor. Bacterii din sol i ap Cartofii pot fi alterai de bacterii din genul Pseudomonas, care se pot dezvolta ptrunznd prin leziuni ale cojii. Bacteriile filamentoase din genul Actinomycetes hidrolizeaz celuloza i amidonul. Alterarea bacterian se produce atunci cnd bacteriile au acces direct la substanele nutritive i legumele au umiditate mare; n alte condiii alterarea microbian este de natur fungic. Mucegaiuri. Sunt agenii cei mai periculoi la pstrarea legumelor, avnd condiii bune de dezvoltare. Ei sunt ageni ai putrezirii albe, negre i cenuii n funcie de modificarea specific a culorii. Dintre mucegaiurile ntlnite frecvent fac parte: - Alternaria produce putrezirea neagr i umed; - Fusarium produce putrezirea umed la mazre, fasole, castravei, tomate, cartofi; se dezvolt formnd un miceliu pslos i are loc nmuierea legumelor; - Peronospora d putrezirea uscat la diferite legume; peronospora brassicae d pete la varz; - Rhizopus i Mucor dau mucegirea tomatelor coapte i putrezirea umed; - Rhizoctonia d putrezirea brun caraczerizat prin apariia unor pete de culoare brun-negru la morcovi, sparanghel, varz, elin. La nceput apare un miceliu violet, apoi degradarea are loc n profunzimea esutului. Procese microbiologice la murarea legumelor Numeroase legume (peste 20) sunt conservate prin murare, dar importan comercial o au varza, castraveii i mslinele. Fermentaia lactic prezint cteva avantaje majore, deoarece nu necesit consum de energie aducnd un aport nutriional valoros datorat bacteriilor lactice i prelungete perioada de conservare a legumelor. Murarea verzii are loc n mai multe etape difereniate din punct de vedere microbiologic. n primele zile sunt active numeroase microorganisme aerobe ce consum oxigenul dizolvat. Dintre acestea, specii de Pseudomonas i Flavobacterium rhenanum produc colorarea n glbui a zemii. Sub aciunea

99

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE microbiotei eterogene alctuit din microorganisme aerobe (drojdii, mucegaiuri, bacterii: Pseudomonas, Enterobacter se formeaz gaze (CO2, H2 i chiar urme de CH4) i acizi: mici cantiti de acid lactic, acid fumaric, acetic, succinic, care se combin cu alcoolii produi de drojdii, rezultnd compui care contribuie la formarea gustului i aromei. n a doua faz este inhibat microbiota aerob i se dezvolt bacterii din genul Leuconostoc, bacterii facultativ anaerobe, care produc fermentarea zahrului cu formare de acid lactic, n cantiti mici acid acetic, alcool etilic i dioxid de carbon, manitol, esteri, compui de arom ca alcool izoamilic, n-hexanol, esterul etil-lactic etc.; la acumularea de 1% acid lactic dezvoltarea lui Leuconostoc este inhibat. Primele dou stadii se termin n aproximativ 3-6 zile. Bacteriile din g. Pseudomonas i Escherichia dispar n 1-2 zile i sunt nlocuite de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis i Pediococcus rhamnosus. Faza a treia are rolul cel mai important deoarece se formeaz intens acidul lactic prin fermentaia homolactic produs de Lactobacillus plantarum rezistent la concentraii mari de sare, cu temperatura optim de fermentare la 18-20C. Uneori pot fi prezente i drojdii osmotolerante din g. Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Debaryomyces care produc alcool etilic, acid acetic, CO2. Ca rezultat al activitii microbiene zeama dobndete valoare terapeutic fiind o surs de vitamine produs de bacteriile lactice/drojdii. Faza poate dura 3 sptmni i se acumuleaz acid lactic n concentraii de 1,5-2% care inhib activitatea fermentativ a lui Lactobacillus plantarum. n stadiul IV, glucidele reziduale pot fi fermentate cu formare de acid lactic, acid acetic, alcool, manitol i CO2 de ctre bacterii heterolactice din genul Lactobacillus brevis, care fermenteaz pentoze ducnd la acumularea de produi de gust i arom. n condiii naturale la murare, nu se pot acumula cantiti mai mari de 2,5 g% acid lactic deoarece este inhibat activitatea fermentativ a bacteriilor lactice. Conservarea are loc datorit acidului lactic i epuizrii substanelor nutritive. n medie, n varza murat raportul ntre acid lactic i acidul acetic este de 1:4 la un pH de 3,4-3,8 cu formarea de pn la 0,25% a compuilor secundari de fermentaie. Defecte i alterri ale verzei murate Gustul amar se produce atunci cnd murarea se realizeaz la temperaturi mai sczute datorat activitii bacteriilor psihrofile. nmuierea verzii dup murare este datorat activitii enzimelor microbiene sau a enzimelor tisulare ale verzii, mai ales n prezena aerului, n saramuri cu concentraia sub 0,8% sare care a fost supus la variaii mari de temperatur. Zeama filant, este datorat formrii de dextran prin dezvoltarea n exces a lui Leuconostoc mesenteroides, dar i ca rezultat al dezvoltrii drojdiilor Hansenula anomala, Candida mycoderma i a mucegaiului Geotrycum candidum, consumatoare de acid lactic. n acest caz aciditatea scade treptat, este favorizat dezvoltarea bacteriilor de putrefacie i se produce alterarea zemii. Murarea castraveilor. Castraveii pentru murare trebuie prelucrai imediat dup recoltare sau cel mult dup 6-8 ore, deoarece alterarea lor se poate realiza rapid. Concentraia saramurii trebuie s fie de 1-15% deoarece castraveii au un coninut de aproximativ 90% ap, care prin difuzie va produce n timp diluarea saramurii iniiale. Concentraia de sare iniial poate s inhibe dezvoltarea bacteriilor lactice i de aceea poate fi mrit dup 5-6 sptmni. n cazul murrii castraveilor se pot diferenia trei etape: fermentaia iniial produs de Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Pediococcus cerevisiae, fiind faza cea mai important de murare. n aceast

100

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE perioad se multiplic rapid bacteriile lactice i drojdiile, n timp ce microorganismele nesemnificative se reduc sau chiar pot s dispar; fermentaia intermediar care dureaz 3-6 sptmni asigur condiii optime de fermentare pentru microbiota lactic i are loc o stabilizare a saramurii; n faza final, Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum i Lactobacillus brevis sunt responsabile pentru formarea n final de 1-1,5% acid lactic. Prezena n exces a lui Lactobacillus brevis nu este dorit, ca urmare a formrii de gaze prin fermentaie. Alterarea castraveilor murai. nmuierea este datorat activitii enzimelor pectolitice (pectinaze i poligalacturonaze) elaborate de mucegaiurile care se dezvolt n prezena aerului: Penicillium, Fusarium, Cladosporium etc. Formarea de gaze i umflarea este datorat bacteriilor heterolactice care produc prin fermentarea glucidelor cantiti mari de CO2 i H2 (g. Enterobacter) sau care degradeaz acidul malic cu formare de acid lactic i CO2 (g. Leuconostoc). Formarea de gaze n esut mai poate fi datorat activitii fermentative a drojdiilor. Din saramura de castraveti murai au fost izolate numeroase drojdii: Brettanomyces versatilis, Hansenula subpelliculosa, Torulopsis caroliniana. Aceste drojdii au fost izolate din saramuri cu 4-18% sare i pH-ul variind ntre 3,1-4,8. Murarea mslinelor Mslinele verzi sunt iniial imersate n soluie de NaOH 1-2 % timp de 6 ore pentru eliminarea gustului amar dat de glucozidul europein dup care se efectueaz o splare timp de 8 ore cu ap potabil, operaie prin care se detaeaz i se elimin o mare cantitate din microbiota epifit. Mslinele sunt apoi imersate n saramur de concentraie 4-10% timp de 6-7 luni n care glucidele, aminoacizii eliberai prin osmoz sunt fermentate n mod gradat. Din punct de vedere microbiologic se disting 3 faze: prima etap dureaz 7-14 zile perioad n care predomin bacterii din genurile Pseudomonas, Enterobacter, Clostridium, Bacillus, Leuconostoc mesenteroides. Dac fermentaia are un curs normal bacteriile poteniale de a produce alterarea sunt rapid eliminate ca urmare a dezvoltrii bacteriilor lactice ce aparin genurilor Streptococcus, Pediococcus i Leuconostoc. n anumite condiii microorganismele de alterare devin predominante; faza intermediar n care predomin bacteriile lactice are o durat de 2-3 luni. Cantitativ pe primul loc se situeaz Leuconostoc mesenteroides urmat de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis; faza final care dureaz cteva luni se caracterizeaz prin predominana bacteriilor lactice ale genului Lactobacillus care produc acid lactic i are loc o scdere a pH-ului sub 4. Pentru obinerea mslinelor negre se aplic tratarea succesiv cu NaOH 1-1, 5% n trei trepte intercalate cu perioade de pstrare n ap, cu barbotare de aer, pentru a favoriza prin procese de oxidare formarea culorii negre (dat de un polimer format din ortofenoli, hidroxitirizol i acidul cafeic). Defecte al mslinelor la murare degradarea pectinolitic n urma dezvoltrii de microorganisme productoare de endo i exopoligalaturonaze (Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Penicillium); formarea de pustule cu gaz la suprafaa mslinelor (ochi de pete) datorate dezvoltrii excesive a bacteriilor coliforme sau a bacteriilor butirice, posibil atunci cnd saramura aer sub 5% sare, iar pH-ul este mai mare de 4,8,

101

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE modificri de gust datorate formrii de acizi: propionic, butiric, valerianic, caproic, ca urmare a dezvoltrii de bacterii ale genului Propionibacterium i Clostridium.

102