Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Proteine
Proteine
O clasificare structural posibil vizeaz poziia relativ a celor dou grupe funcionale. Nomenclatura precizeaz poziia grupei amino pe catena acidului carboxilic.
CH3 CH2
CH2 CH NH2
COOH
1
CH3 CH2
CH NH2
CH2 COOH
- Aminoacizii sunt monomeri importani, care prin condensare conduc la poliamide (polipeptide). Polipeptidele naturale denumite proteine sunt elemente constitutive de baz ale lumii vii. Formarea lor implic participarea regio- i stereoselectiv a moleculelor de ADN. Funcionalitatea proteinelor n organisme este complex i variat. Amintim: material constitutiv al organismului uman cu rol fundamental sau auxiliar (suport mecanic pentru piele i oase); rol de transportor - de exemplu hemoglobina din snge ca purttor de oxigen de la plmni la nivelul celulelor, i de fier care este transportat i stocat n ficat; fotoreceptor (rodopsina), participnd i la transmiterea impulsurilor nervoase spre celulele retinei; biocatalizatori (enzime) ce catalizeaz procese vitale majore de la simpla hidratare a bioxidului de carbon pn la replicarea cromozomilor datorit structurii spiralate a ADN-material genetic important n viaa celulelor; elemente responsabile de apariia imunitii i a controlului creterii n corelare cu individualitatea i specificitatea organismului umanprelund la un moment dat o parte a informaiei stocate n ADN.
65
n structura proteinelor intervin aproximativ 20 de - aminoacizi. Gradul de policondensare este de ordinul miilor, responsabile de biosinteza lor fiind moleculele de ADN i ARN. 3. 1. 1 Aminoacizi naturali Precum s-a artat n structura aminoacizilor sunt incluse att grupri amino ct i carboxil. Cea mai mare parte a aminoacizilor naturali sunt aminoacizi, structura lor putnd fi corelat cu cea a monozaharidelor din seria L. COOH H2N C COOH H2N C H R 2 ( ) R H
HO R C CHO
2 ( )
CHO HO C H
66
Tabelul 3-1 Formula Acizi monoamino monocarboxilici H2N CH2 COOH Glicocol (glicina)
H2N CH COOH CH3
Gly Ala
G A
2.3 2.3
9.6 9.7
Alanina
H3C CH CH3 H2N CH COOH
CH3 CH2 H2N CH CH CH3 COOH
Val
2.3
9.6
Leucina *
H3C CH CH2 H2N CH CH3
Ile
2.4
9.6
COOH
Izoleucina *
CH2 C6H5 H2N CH COOH
Phe
1.8
9.1
Asp
1.9
9.6
Acid asparagic
CH2 CH2 COOH H2N CH COOH
Glu
2.2
9.7
Acid glutamic
67
CH2 NH2
Orn
2.2
9.0
COOH
Ornitin
CH 2 COOH CH 2 CH 2 NH 2
Lys
2.2
9.0
Asn
2.0
8.8
Asparagina
CH2 H2N CH CH2 CONH2 COOH
Gln
2.2
9.1
Arg
2.2
9.0
Arginin * Hidroxiaminoacizi
CH2OH H2N CH COOH
Ser
2.2
9.2
Serina
H3C CH OH H2N CH COOH
Thr
2.1
9.1
Treonina *
CH2 H2N CH COOH OH
Tyr
2.2
9.1
Tirosina
68
Cys
2.0
10.3
Cistein
CH2 CH2 S H2N CH COOH
Met
2.3
9.2
His
1.8
9.2
COOH
Triptofan (Indolil alanina) * * aminoacizi eseniali 3. 1. 2 Structura i caracterul amfoter al aminoacizilor n molecula aminoacizilor este prezent att un centru donor de protoni (acid) ct i unul acceptor de protoni (bazic). Din acest motiv aminoacizii monoamino-monocarboxilici pot exista n soluii apoase sub trei forme: R R R + OH OH H2N C COO H3N C COOH2N C COOH + + H H H H H
predominant la predominant la predominant la pH>13 punctul izoelectric pH<1 Pentru majoritatea aminoacizilor punctul izoelectric pI pK COOH + pK NH 3 (pI = ) este situat ntre 5.4 i 6. Excepii de la acest regul 2
69
fac produii la care radicalul R include resturi amino (9.7 lisina, 10.8 arginina) i acizii dicarboxilici (acidul aspartic 2.8, acidul glutamic 3.2). Datorit structurii lor amfionice soluiile de aminoacizi sunt soluii tampon, pH-ul lor rmne constant la adaosul unor mici cantiti de acizi sau baze, acestea fiind neutralizate de aminoacid. R R R + + + H O + 3 + OH H3N C COOH H3N C COOH2N C COO-H2O -H2O H H H 3. 1. 3 Alternative de preparare ale aminoacizilor n figura 3-1 sunt prezentate variante de sintez a unor -aminoacizi. Principala surs de -aminoacizi sunt proteinele. Alternativa Gabriel de grefare a resturilor aminice prin substituia nucleofil a halogenilor se regsete n variantele (2) i (4) de sintez. Se constat de asemenea c o serie de sinteze utilizeaz ca materii prime esterul malonic. n cazul variantei (3) compusul 9 se obine prin nitrozarea esterului malonic cu acid azotos urmat de reducerea esterului izonitrozo-malonic tautomer cu hidrogen gazos n prezena paladiului i a anhidridei acetice. Sodarea compusului rezultat genereaz sarea 11. Acidul hipuric 22 se prepar prin acilarea cu clorur de benzoil n prezena hidroxidului de sodiu a glicinei. Obinerea aminoacizilor aromatici prin metoda Strecker prin tratarea aldehidelor cu acid cianhidric i amoniac poate fi conceput fie conform variantei (5) fie cu formarea intermediar a unei cianhidrine urmat de aminarea acesteia la aminoacid. Sinteza aminoacizilor aromatici prin reducerea nitroacizilor corespunztori este o metod cu aplicaii generale. Proveniena nitroacidului poate fi fie nitrarea direct (8) fie oxidarea energic a unui alchil-nitroderivat aromatic. Astfel prin oxidarea p-nitrotoluenului se obine acid p-nitrobenzoic, care prin reducere conduce la acid p-anminobenzoic (vitamina H). Aminoacizii sintetizai conform variantelor din fig. 3-1 se obin sub form de racemic.
70
(1) CH3
CH3
CH COOH 4 Br CH COOR 7 Br + O
+ NH3/aq 250
CH3 5
CH COOH NH2
(2) CH3
CH3
O
NK + OH -
COOH COOH
CH3
CH
COORO (3) C6H5 CH2 Cl + Na+ : C (COOR)2 11 NHCOCH 10 O COOR (4) H C Br COOR 14 (5) CH3 NH3 CHO -H2O 17 + (6) Ar CHO 21 O (7) 25 O O COOH NH3 CH3 CH 18 CO O C C6H5 + 8
NK +
H3O H2O
CH CN
H3O H2O
CH3
CH COOH NH2 20
19 NH2
COOH CONH2 26
NaOCl 27 COOH
COOH NH2
COOH (8)
NO2 28 29 30
NH2
71
n figura 3-2 se prezint cteva alternative de obinere a enantiomerilor puri de aminoacizi prin metoda diastereoizomerilor.
R H2N C COOH H (R,S) aminoacid 31 R R' CONH C COOH H (R,S) aminoacid N-amidat 32 + + (S) B /CH3OH,
33a
35b
Fig. 3-2 Alternative de obinere a enantiomerilor puri ai aminoacizilor Datorit bifuncionalitii acestora se impune blocarea gruprii amino prin amidare (tratare cu cloruri acide, anhidride sau acizi). Amida 32 rezultat manifest un net caracter acid. La tratarea sa cu o baz enantiomeric pur (S-brucin 37 de exemplu) rezult diastereoizomerii 33a
72
i 33b care prin separare urmat de hidroliz, dup ndeprtarea S-brucinei, conduc la aminoacizii enantiomeric puri 35a, respectiv 35b.
H CH3O H CH3O O NH H 37 H O N
Dac se dispune de un aminoacid enantiomeric pur structura acestuia poate fi modificat prin tratare cu -cetoacizi n prezena transaminazei (3536). Aa cum s-a mai artat sintezele biochimice sunt nalt stereoselective. Astfel pornind de la acidul 2-ceto-pentan-1,5-dioic, prin tratare cu amoniac n mediu acid n prezena NADH(vezi nucleotide) i a glutamat-dehidrogenazei rezult acidul S-glutamic printr-o aminare reductiv. 3. 1. 4 Proprieti fizice ale aminoacizilor n tabelul 3-1 au fost prezentate o serie de date legate de implicarea -aminoacizilor n echilibre protolitice. Aminoacizii naturali sunt substane cristalizate. Cu excepia glicocolului ei sunt optic activi posednd un stereocentru de tip S (fac parte din seria L). O parte din proprietile fizice ale acestora sunt prezentate n tabelul 3-2. Comportarea spectral n IR a aminoacizilor poate fi corelat cu prezena unor specii ionice (mutiple) generate de structurile acestora. Vibraiile grupei NH3+ -Aminoacizii amfioni nu prezint benzi de absorbie n regiunea vibraiei de valen NH a grupei amino de la 3200 cm-1. Ei prezint o band lat ntre 3030 i 3130 cm-1 atribuit vibraiei de valen asimetric a grupei NH3+. Vibraia simetric se situeaz ntre 2080 2140 cm-1 sau 2530-2760 cm-1, fiind dependent de structura aminoacidului. Clorhidraii aminoacizilor absorb ntre 3049 i 3145 cm-1. Vibraiile de deformaie ale grupei - NH3+ se situeaz la 1500-1600 cm-1, alturi de cele caracteristice ionului carboxilat. Banda de deformaie asimetric apare ntre 1610-1660 cm-1 ca umr de band larg proprie anionului carboxilat care o acoper uneori. Vibraia grupei COO- n anioni i amfioni se situeaz frecvent ntre 1560-1600 cm-1, aa cum s-a artat, acoperind uneori banda vibraiei NH3+. Cea de a doua band apare n jurul valorii de 1410 cm-1. n soluie absorbia anionului carboxilat din amfion se situeaz la 1618 cm-1, iar n soluii alcaline frecvent la 1570 cm-1.
73
Vibraia grupei COOH. poate fi evideniat n clorhidraii aminoacizilor monocarboxilici. n aminoacizii dicarboxilici intervine alturi de benzile amfionilor. n -aminoacizii naturali CO se plaseaz ntre 17241754 cm-1. Creterea fecvenei grupei COOH n -aminoacizii naturali se datoreaz efectului -I puternic al restului cuaternar de amin. Tabelul nr. 3-2 Proprieti fizice ale aminoacizilor Denumirea aminoacidului Punct de topire Rotaia specific 0 C []D20 Glicocol 292 L(+) Alanina 297 +2.7(ap), +9.5(HCl dil.) L(+) Valina 315 +6.42(ap), +32.77(HCl dil.) L(-) Leucina 337 -15.6(HCl dil.) L(+) Izoleucina 280 +10.7(ap), +40.8 (HCl conc.) L(-) Fenilalanina 278 -35.03(ap) L(-) Prolina 220 -80.9(ap) L(+) Acid asparagic 251 +4.36(ap) L(+) Acid glutamic 248 +34.9(ap) L(+) Lisina 224 +14.6(ap) L(+) Ornitina +11.5(ap) L(-) Asparagina 227 -5.42(ap) L(+) Glutamina +34.9(HCl dil.) L(+) Arginina 227 +11.37(ap) L(-) Serina 257 -6.83(ap) L(-) Treonina 257 L(-) Tirosina 343 -8.07(HCl dil.) -9.01(KOH conc.) L(-) Cistina -20.6(HCl dil.) L(-) Metionina 280 -6.87(ap) L(-) Histidina 277 -39.74(ap) L(-) Triptofan 280 -33.4(etanol)
74
Vibraia grupei NH2 se situeaz ntre 3300 i 3500 cm-1. n cazul diaminoacizilor banda se scindeaz frecvent n dou componente cu frecvene de 1546 i 1477 cm-1. Izomerii optici -n stare solid comportarea spectral a enantiomerilor este diferit de cea a racemicilor permitnd uneori identificarea lor. Astfel pentru serin OH(-) = 3484 cm-1, OH() = 3630-3125 cm-1, NH3+(-) = 3077 cm-1, COO- i NH3+(-) = 1600 cm-1, respectiv COO- i NH3+() = 1670, 1642, 1499 cm-1. Faptul se datoreaz modului diferit de asociere n stare solid. Valorile ale protonului din poziia n spectrele 1H-RMN ale aminoacizilor depind de pH-ul soluiei i de natura radicalului, plasndu-se ntre 4.30 - 4.90 ppm. n amfioni valorile pentru cei trei atomi de hidorgen legai de azot se situeaz ntre 7.40 - 7.54 ppm, depinznd de natura radicalului. 3. 1. 5 Proprieti chimice ale aminoacizilor n esen proprietile chimice alec aminoacizilor se pot mpri n trei categorii respectiv n reacii datorate prezenei (coexistenei) celor dou funciuni, amino i carboxil, n molecul i reacii datorate fiecrei funciuni n parte (reacii specifice aminelor respectiv acizilor carboxilici). Reacii datorate coexistenei grupelor NH2 i COOH Comportarea termic -aminoacizi
O COOH R CH NH2 HOOC H2N CH R H R N O N H R 38
H2N
NH3 + CH2
CH COOH 39
COOH NH2
N H 40
Caracterul amfoter
75
Reacii specifice grupei amino Acilarea cu acizi, cloruri acide, anhidride R R' COX + H2N CH COOH R' CONH cu cloroformiat de benzil (Cbz)
R C6H5 CH2 O COCl + H2N CH COO
-
R CH COOH
R
C6H5 CH2
CO
HN 41
CH
COOH
R (CH3)3C O CO HN CH 42 COOH
R AcHN CH C O C R' O 44 O
Formarea de amide
R AcHN CH COOH + H2N R' + C6H11 N C N C6H11 R AcHN CH CONH R' + C6H11 NHCONH 45 46 C6H11
Amidele acilate 45 se obin n prezena diciclohexil diimidei care capteaz apa rezultat din reacie genernd N, N - dicilohexil ureea 46. Formarea dicetopiperazinelor 38 i a lactamelor 40 poate avea loc att la nclzirea acizilor liberi ( respectiv sau ) ct i a esterilor acestora (de ex 43). Deosebit de imortante sunt reaciile de acilare a gruprii amino.
76
Astfel acilarea cu cloroformiat de benzil (Cbz) sau ter-butoxi-carbonil azid (Boc) sunt aplicate ca etape intermediare n sinteze de peptide. -Aminoacizii formeaz compleci la tratarea cu metale tranziionale:
R 2 H2N CH COOH + CuO O R NH2 O Cu O NH2 albastru R O
Alchilarea aminoacizilor cu derivai halogenai sau cu dimetilsulfat conduce la sruri cuaternare de amoniu (sare intern) denumite betaine: R 2 H2N CH COOH + 3CH3I - 3HI (CH3)3N
+
R CH COO
-
Cea mai simpl betain provenit din glicin (R= H) se gsete alturi de ali compui n zahrul de sfecl roie (Betterava). n cazul aminoacizilor gruparea NH2 poate fi nlocuit cu o serie de ali substitueni conform figurii 3-3.
R + HNO2 R 2 H2N CH COOH H3O
+
HO CH R Cl CH R CH2
+ NaOCl + 2 HI
Fig. 3-3 Modaliti de nlocuire a grupei NH2 Dintre reaciile biochimice amintim: transaminarea (transaminaza i cotransaminaza):
77
O COOH + R1 C COOH
+ NH3 (din dezaminarea aminoacizilor) + + NADH, + H + - NAD
H2N desaminare i decarboxilare (enzime din drojdia de bere) + H2O R CH COOH R CH2 OH + CO2 + NH3 H2N Reacia constituie una din sursele alcoolilor superiori toxici rezultai la fermentaia alcoolic a zaharidelor, datorit prezenei n sistem a proteinelor (leucin alcool izoamilic, izoleucin alcool amilic, valin alcool izobutilic, etc.). 3. 2 Peptide i proteine (oligomeri i polimeri ai -aminoacizilor) 3. 2. 1 Clasificare. Nomenclatur Denumirea poliamidelor generate prin policondensarea aminoacizilor difer dup gradul de policondensare al acestora. Convenional se consider peptide produii cu maxim 10 resturi de monomer, polipeptide cei cu maxim 50 resturi de monomer i proteine dac gradul de policondensare depete 50, putnd fi i de ordinul zecilor de mii. Legtura amidic format cu participarea unor -aminoacizi se numnete polipeptidic. Peptidele pot fi simple dac la formarea lor particip un singur aminoacid sau mixte atunci cnd n structura lor exist resturi ale unor aminoacizi diferii.
78
Proteinele se pot clasifica constitutiv n proteine simple care dau la hidroliz numai aminoacizi (ex. albumina din serul sanguin) i proteine conjugate sau proteide care dau la hidroliz i ali compui pe lng aminoacizi : hidrai de carbon (glicoproteide), grsimi (lipoproteine), acizi nucleici (nucleoproteine), esteri fosfonici (fosfoproteine), metale (metaloproteine-hemoglobina). Molecula proteidelor include n structur o parte proteic i una prostatic (resturi fr structur de aminoacizi). Nomenclatura peptidelor este cea general a amidelor. Dipeptidele de exemplu se denumesc prin precizarea restului acil legat de gruparea amino a unui -aminoacid.
CH3 H2N CH CONH CH COOH Serinil-alanina (Ser-Ala) S-A
Analog se procedeaz n cazul peptidelor superioare. Pentru tripeptide de exemplu denumirea raional este :
CH3 H2N CH CONH CH CONH CH(CH3)2 CH COOH Serinil-alanil-valina (Ser-Ala-Val) S-A-V
CH2OH serinil Aminoacid N-terminal alanil 47a rest de valina Aminoacid C-terminal
Prin convenie grupa amino liber se scrie n stnga (aminoacid Nterminal) iar restul carboxilic n dreapta (aminoacid C-terminal). Se consider drept lan principal catena ce include puntea peptidic i centrii chirali. Prin opoziie lan lateral este cel format de substituenii alchilici grefai la stereocentru. La formarea peptidelor de cele mai multe ori aminoacizii componeni intervin cu configuraia steric S. O imagine mai sugestiv a structurii poliamidelor -aminoacizilor poate fi redat folosind formulele Newman, cnd conformaia centrilor chirali este mai evident ilustrat.
79
H HO H
H H N N H
(S)
H2N H
(S)
H H H H
47b
Numrul mare i varietatea poliamidelor generat cu participarea aminoacizilor se datoreaz multiplelor posibiliti de legare a acestora. Un numr mare de peptide prezint o importan deosebit. Dintre acestea amintim asparagil-fenil alanina 48 i gramicidina S 49.
H
-
OOC H3N
+
H N
COOCH3 C6H5
H
Esterul metilic al asparagil-fenilalaninei -cunoscut sub numele de Aspartam este un ndulcitor hipocaloric iar Gramicidina S un antibiotic.
CH3
Leu
H3C CH H2C
N
Val Orn
H H N
Phe (R)
H H H N H H
Pro
H3C
N
CH3
H H
C6H5 O N
H
O (H2C)2
H
N O
H N H
NH2 H
H N H
NH2
H
(H2C)2 O
N
H N
C6H5
H H
H H
H3C
H
CH3
H2C CH
H
Pro
Orn
H3C
Phe (R)
Val Gramicidina S 49
Leu
CH3
80
Structura ciclic a acesteia din urm este format din dou tripeptide cu conformaie absolut S a aminoacizilor constitueni legate ciclic de dou molecule de R-fenil alanin la cele dou capete. Gramicidina S este astfel o decapeptid ciclic, stabilizat prin legturi de hidrogen intramoleculare realizate cu participarea gruprilor amidice. O alt polipeptid important este insulina secretat de pancreas, care regleaz concentraia constant a glucozei n snge. Molecula insulinei este tridimensional, la formarea ei participnd 51 de -aminoacizi care dau dou secvene polipeptidice liniare A (21 aminoacizi) i B (30 aminoacizi), legate ntre ele prin trei puni - S - S - generate de prezena celor 4 resturi de cistein, analog echilibrului cistein-cistin, una intracatenar i dou intercatenare, asigurnd astfel rigiditatea acesteia.
H2N CH COOH oxidare reducere H2N CH COOH H2N CH S Cistina CH2 COOH CH2 S CH2 SH Cisteina
3. 2. 2 Structura proteinelor Complexitatea i diversitatea peptidelor i proteinelor se daotreaz numrului mare de alternative de legare chiar a unui numr mic de aminoacizi n vederea formrii lor ct i unor particulariti de conformaie i configuraie a moleculelor acestora. Ele sunt generate de alternana elementelor rigid plane (legtura poliamidic conjugat) din structur cu elemente de mobilitate (atomi de carbon hibridizai sp3) capabile s genereze chiralitate de ax (n final de spiral-vezi stereochimia atomului de carbon hibridizat sp3). n plus posibilitatea stabilirii unor legturi (van der Waals, de hidrogen, dipol-dipol, inducie, dispersie inter i intramoleculare) conduc la stabilizarea unor conformaii ca entiti bine individualizate. Sub denumirea de structur primar este inclus cunoaterea felului aminoacizilor componeni ai unei peptide sau proteine i a modului lor de legare. Atomii de carbon sunt hibridizai sp3. Orientarea legturilor n spaiu este sugerat cu ajutorul formulelor conformaionale Newman n structura 50.
81
H H
O 1230 1170 H H
H N
1200
H H
N 0 H O 121
1100
50 Se constat orientarea alternativ (de o parte i de alta a planului catenei principale) a hidrogenului i eventualilor substitueni grefai la atomul chiral. Determinarea structurii primare a proteinelor prezint pe lng un interes tiinifc i un interes medical direct. De exemplu absena unui singur aminoacid (histidina) n hemoglobin poate fi responsabil de apariia unei anemii puternice. Cunoaterea structurii primare a acestei hemoglobine deficitare permite remedierea -vindecarea prin aport de histidin. Stabilirea structurii primare a unei proteine implic parcurgerea etapelor prezentate n figura 3-4.
PURIFICAREA POLIPEPTIDELOR
DIALIZA CROMATOGRAFIA GEL FILTRANTA CROMATOGRAFIA CU SCHIMB DE IONI ELECTROFOREZA CROMATOGRAFIA DE ACTIVITATE
DETERMINAREA AMINOACIDULUI
N-TERMINAL DETERMINAREA AMINOACIDULUI C-TERMINAL
Fig. 3-4 Stabilirea structurii primare a unei proteine (etape) Aminoacidul N-terminal poate fi stabilit prin mai multe metode. Dintre acestea menionm: degradarea Edman (figura 3-5). Procesul const n tratarea cu fenil izotiocianat 52 a proteinei 51 cnd rezult un compus tioureeic 53 care
82
prin degradare acid conduce la restul de protein 54 i un derivat de N-fenil hidantoin 55, uor identificabil. Procesul poate fi reluat pn la hidroliza (identificarea) total a secvenelor de aminoacid; marcarea aminoacidului N-terminal cu clorur de dansil 56 (figura 3-6). Hidroliza acid a proteinei marcate 57 conduce la sulfonamida aminoacidului N-marginal 58 puternic fluorescent uor de identificat i al restului secvenelor de aminaoacizi ce compun proteina. Dezavantajul metodei const n faptul c identificarea aminoacidului N-terminal este posibil doar n cazul hidrolizei complete a catenei. Aminoacidul C-terminal poate fi determinat prin hidrazinoliza total a proteinei cnd toi aminoacizii componeni se regsesc sub form de hidrazide cu excepia aminoacidului C-terminal care se regsete ca atare, putnd fi uor separat i identificat (metoda Acabori). Dezavantajele constau n instabilitatea hidrazidelor n procesul de separare a acidului liber. Din aceste motive se prefer o metod enzimatic. De exemplu, grupa de enzime pancreatice numite carboxipeptidaze elimin selectiv prin hidroliz doar aminoacizi C-terminali.
R1 Rest proteina NHCO CH NHCO R2 CH NH2 S S 51 52 NH S
N NH CH
C6H5 N C O R2
CH NHC R1
H3O
+
CH NH C
..
C6H5 53
55
R2
NH C6H5 S
..
H3O
+ C6H5
NH CH
R1
83
Fig. 3-5 Stabilirea succesiunii aminoacizilor ntr-un rest de protein prin stabilirea aminoacidului N-terminal Procesul poate fi continuat pn la hidroliza succesiv a tuturor aminoacizilor. Analiznd concentraia aminoacizilor n hidrolizat, cromatografic, funcie de timp, poate fi estimat succesiunea aminoacizilor n preparatul primar. Se pot realiza i hidrolize enzimatice selective ale unei proteine n peptide mai simple , mai uor identificabile. Astfel tripsina desprinde din protein fragmente de Lys, Arg(C-terminal), clotripsina de Arg (Cterminal), chimotripsina de Phe, Trp, Tyr (C-terminal), pepsina de Asp, Glu, Leu, Phe, Trip, Tyr(C-terminal), termolisina de Leu, Ile, Val (C-terminal), etc.
SO2Cl
R1 CH COOH + H2N
R1 CH COOH + ............ 59
Fig. 3-6 Stabilirea succesiunii aminoacizilor ntr-un rest de protein prin marcarea aminoacidului N-terminal Structura secundar a proteinei este determinat de apariia legturilor de hidrogen inter- i intra-moleculare cu participarea legturilor amidice din peptide. Conformaiile cu numr maxim de legturi de hidrogen sunt cele mai stabile. Din acest motiv dup cum s-a stabilit prin spectre de raze X, catena peptidic adopt o conformaie rsucit sub form de elice sau una ncreit (plisat). n cazul keratinei (protein din firul de pr ) sunt posibile alternativele: -keratina -spiral ncolcit cu chiralitate de spiral dreapta (urub dreapta) datorit configuraiei S a aminoacizilor. Integritatea elicei este pstrat datorit legturilor de hidrogen intramoleculare stabilite de moleculele de peptide ntre dou spirale ale elicei succesive.
84
-keratina (fir de pr etirat 1000) (fig. 3-7) n care catenele polipeptidice sunt orientate paralel. n acest caz sunt posibile dou conformaii :straturi paralele 60 i straturi plisate 61. n al doilea caz, aa cum rezult foarte sugestiv din prezentarea cu formule Newman, gruprile amidice alternante se afl n planuri paralele (A cu C cu E respectiv alt set de plane paralele B, D, etc.). Planurile a dou legturi amidice fac un unghi ntre ele (A cu B, B cu C, etc.). Distana dintre dou plane paralele este de aproximativ 6.7 . Structura teriar a proteinelor aflate sub form de elice se datoreaz stabilirii unor fore de legtur ntre lanurile laterale ale catenei polimere (ntre resturile R ale moleculelor de aminoacizi componeni ai proteinei). Acestea pot fi fore van der Waals de inducie i dispersie, legturi de hidrogen, electrovalente i chiar legturi covalente (puni -S-Sgenerate prin oxidarea resturilor de cistein.
H N N H N N
H N
O
N H
H N
O
N
60
6.7
H H
H N N
O
N
C O 61
85
Toate aceste fore stabilizeaz molecula, conducnd i la apariia unui efect micelar. Polimerul adopt structura n care poate expune un numr maxim de grupri polare mediului exterior apos, minimaliznd expunerea resturilor hidrofobe (alchil, aril). Acest efect este pregnant n cazul proteinelor globulare (mioglobin, hemoglobin), multe dintre acestea fiind transportori chimici sau catalizatori n medii protice. Pentru proteinele fibroase (miosina din muchi, fibrina din snge, -keratina din unghii i pr) care posed o elice , existena acestor fore conduce la apariia unor supraelici prin rsucire n ghemuri a dou sau mai multe molecule spiralate. Structura teriar a enzimelor i a proteinelor care transport diverse molecule dintr-un loc ntr-altul n cadrul organismului, frecvent, sugereaz pachete tridimensionale denumite forme active. Ele conduc la o mare specificitate, activitatea lor fiind posibil doar atunci cnd exist o compatibilitate geometric total ntre molecula proteinei i substrat. Denaturarea sau distrugerea structurii teriare a proteinelor conduce la precipitarea acestora sau la dispariia activitii catalitice. Denaturarea poate fi realizat termic (denaturare permanent) sau prin modificarea pH-ului (frecvent denaturare temporar). La formarea structurii teriare pot participa i ioni metalici, grupe prostatice de proteide, etc. Structura cuaternar a proteinelor reprezint un mod superior de organizare i agregare cu participarea mai multor tipuri de elici . Ele se realizeaz cu intervenia acelorai fore care determin structura teriar, dar de aceast dat stabilite ntre catene (elici) diferite. Astfel structura cuaternar a hemoglobinei -protein transportoare de oxigen din snge-, const din patru catene polipeptidice i patru grupe prostatice (hem) asociate ntre ele. 3. 2. 3 Realizarea structurii secveniale a proteinelor cu participarea ADN recombinat n capitolul 2.4.2 a fost prezentat mecanismul de copiere a secvenei de nucleotide n cazul reproducerii ADN. Acest fapt este folosit n natur (i n ultimul timp chiar experimental) n vederea obinerii unor copii pariale a codului genetic. n natur, cea mai important aplicaie o reprezint construirea unei molecule ARN ce transcrie (copiaz) prile componente ale ADN care de fapt conine informaia (genele) necesare pentru a sintetiza proteine n celule. Procesul prin care aceast informaie este transcris (decodat) i utilizat pentru sinteza proteinelor n celule este denumit translaie. Sinteza proteinelor implic trei elemente: ARNm (ARN manager) copiaz secvene din ADN;
86
ARNt (ARN de transport) realizeaz transportul aminoacizilor n corelare secvenial cu ARNm; ribozomul -catalizatorul ce permite formarea legturilor amidice ntre -aminoacizii transportai de ARNts(specfic-cte unul pentru fiecare aminoacid). Sinteza proteinei pornete de la ARNm care constituie o copie a unei secvene ADN (fig. 3-9 i 2-24). Odat realizat, molecula de ARNm prsete secvena ADN constituind ablonul/modelul responsabil pentru succesiunea corect a unitilor de aminoacid n protein. Procesul se realizeaz astfel: fiecare secven de trei baze (denumit codon) specific un anumit aminoacid (tabelul nr. 3-3). Simpla permutare a acestui cod de trei baze (dintr-un total de 4) conduce la 43=64 secvene distincte. Acest numr este mai mult dect suficient deoarece la formarea proteinelor particip doar 20 de -aminoacizi diferii.
87
ADN
C dupa formare ARN m se desprinde de ADN G C A T A O O C O H2N CH CH2 TRANSLATIE CH2 C NH2 codon anticodon O COD GENETIC PENTRU PEPTIDA G G C A G G A C C A C G C G G C O H2N CH CH3 CH2 T A C G C G O O H2N CH2 T A G G G C O T A
ARNm ARNt
..
..
..
NH CH
ARNt1
Gln
ARNt2
Ala
ARNt3
Gly
ARNt4
Pro
CATALIZA RIBOZOMI Gln Ala Gly Pro CH2 C O CH2 Peptida N COOH CH
Fig. 3-9 Reprezentarea schematic a biosintezei unei tetrapeptide Este interesant de precizat c, dac natura ar fi adoptat un cod de dou baze (16 combinaii) acestea ar fi fost insuficiente n raport cu cei 20 de -aminoacizi gsii n proteinele naturale. Totui natura face uz de toi cei 64 de codoni. Uneori un aminoacid este descris de mai muli codoni (tabelul nr. 3-3). Unii codoni acioneaz ca semnale pentru a iniia sau a ntrerupe creterea unui lan polipeptidic. Se constat c codonul iniiator (AUG) este i codonul pentru metionin. Astfel dac codonul AUG apare dup ce un lan a fost iniiat el va semnifica introducerea n secvena proteinei a unui rest de metionin. Tabelul nr. 3-3
88
Corelarea codului de trei baze (codoni) cu aminoacizii ce pot intra n constituia proteinelor Aminoacid Codoni Ala GCA, GCC, GCG, GCU Arg AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU Gln CAA, CAG Gly GGA, GGC, GGG, GGU Pro CCA, CCC, CCG, CCU Val GUA, GUG, GUC, CUU Met AUG Iniiere lan AUG Terminare lan UGA, UAA, UAG Secvena complet a ADN ntr-o celul definete codul su genetic. Mutaii n secvena de baze ADN pot fi provocate de factori fizici (radiaii), chimici (substane cancerigene), etc. Ele pot fi prentmpinate de organism datorit existenei codurilor multiple (secvene multiple de baze pentru acelai aminoacid). De exemplu codul genetic transmis de ADN-ul din figura 3-9 poate fi transmis celor 4 ARNts(1...4) i de alte secvene de baze incluse n constituia altor molecule ADN. Faptul constituie o alternativ eficient de protecie pentru organismul uman n vederea realizrii unor perturbri minime n transmiterea codului genetic. Sinteza proteinelor conform modelului/ablonului pe care l reprezint ARNm implic participarea unui alt set de acizi nucleici denumii ARNt - acizii ribonucleici de transport. Moleculele acestora conin 70-90 de nucleotide. Fiecare ARNt este astfel conceput nct s poat purta/transporta pe unul din cei 20 de -aminoacizi naturali ctre ARNm n decursul construirii proteinei. Secvena de aminoacizi cifrat (codat) n ARNm este citit codon cu codon printr-o secven complementar de trei baze ale ARNt numit anticodon. Altfel spus ARNts poart fiecare aminoacidul su specific, aliniindu-se de a lungul ARNm. n ordinea corect. n acest stadiu ribozomii catalitici (enzime foarte mari) coninnd propriul ARN faciliteaz formarea legturilor peptidice, prin atacul nucleofil al restului aminic liber din aminoacizi la restul carboxilic. Pe msur ce crete, lanul peptidic dezvolt propria sa structur secundar i teriar caracteristic cu ajutorul enzimelor care formeaz puni -S-S-. Se estimeaz c alctuirea unei proteine de 150 resturi de aminoacizi poate fi realizat ntr-un timp mai mic de 1 minut de ctre organism.
89
3. 2. 4 Metode de sintez ale polipeptidelor Datorit bifuncionalitii aminoacizilor sinteza univoc a peptidelor implic blocarea succesiv a unor centri de reacie. Astfel pentru obinerea unei dipeptide (figura 3-10) trebuiesc parcurse urmtoarele etape:
O A= C6H5 CH2 O (1) O A= (CH3)3CO C (2) R1 A HN CH C R1 H2N CH R1 H2N CH COOH + (CH3)3CO C O 63 Boc 64 COOH R1 + DCC A HN CH (1) 66 COOB + CF3COOH + CH2Cl2 R1 R2 H2N CH COOH + B Cl 65 unde B este Polistiren CH2 sau C6H5 CH2 R3 H2N CH CONH R1 CH CONH 71 R2 CH COOB R1 H2N CH CONH R3 + A HN CH HOOC HN CH R2 CH COOB 69 + HF anhidru COOH R1 H2N CH CONH R2 CH COOH 70 CONH - CO2 R2 CH 68 COOB CONH 67 R2 CH COOB (2) + H2 ; Pd/C - C6H5CH3 O C OC(CH3)3 O COOH + C6H5 CH2 O 62 Cbz C O Cl
R2 H2N CH
Polipeptide
Fig. 3-10 Alternative de sintez a peptidelor blocarea gruprii amino din aminoacidul N-terminal, cnd rezult compusul 64. Aceasta se poate realiza prin tratare cu cloroformiat de benzil Cbz 62, fie cu ter-butoxi-carbonil (Boc) 63;
90
blocarea gruprii carboxil din aminoacidul C-terminal prin reacie cu cu un derivat monoclorometilat 64. Acesta poate fi fie clorura de benzil, fie un polistiren parial cloro metilat, cnd acidul rmne fixat pe polimer; formarea amidei 67 poate avea loc fie cu transformare intermediar a acidului carboxilic n clorur acid, fie direct cu participarea acidului carboxilic i a aminei n prezen de diciclohexil-carbodiimid; obinerea dipeptidei 70 prin deprotejarea succesiv a gruprii aminice (rezult intermediar 69) i a gruprii carboxil. Modul de deprotejare a gruprii amino depinde de agentul de protejare folosit. Dac acesta a fost Boc, deprotejarea impune o tratare cu acid fluorhidric anhidru (nu atac gruparea amidic). n cazul utilizrii Cbz, procesul are loc prin reducerea catalitic cu hidrogen, n prezena paladiului depus pe crbune. Aa cum se constat din figura 3-10 procesul poate fi continuat n vederea obinerii unor peptide superioare. Trebuie subliniat faptul c la utilizarea polistirenului parial clorometilat ca agent de blocare a gruprii carboxilice din aminoacidul Cterminal exist avantajul ca produsele intermediare 69 respectiv 71 fac parte din molecula noului polimer solid, fiind aadar uor purificabile. 3. 3 Metaloproteine Hemina 73, complexul cu fier al porfirinei 72 substituite n toate poziiile pe inelele pirolice este materia colorat a hemoglobinei din sngele vertebratelor.
CH CH2 A NH B H3 C A N Fe N D HN C H3C D N
+3
CH2CH2COOH CH2CH2COOH 72 73
Hemina mai este prezent i n unele nevertebrate, n muchi, n drojdie, n leguminoase, etc. Deoarece totdeauna ea se gsete legat ntotdeauna de proteine este mai corect denumit hematoprfirin sau gruparea hem din mioglobin i hemoglobin.
91
Dac legtura 3,4 -C=C- din inelul pirolic D al porfirinei este hidrogenat se obine clorina 74. Ea formeaz baza clorofilei a 75 i b 76 care sub form de complex cu Mg2+ confer culoarea verde frunzelor. Dac legturile -C=C- din inelele B i D sunt hidrogenate rezult structura de baz a bacterioclorofilei a i b.
CH A NH B H3C A N M N D HN C N H3C D H H C20 H39 OOC H 74 unde C20 H39 = (rest fitol) 75 N C CH3 H3C D N H H H C20 H39 OOC 76 N CH2 CH3 B C2H5 H3C CH A N M N C CH3 N CH2 CHO B
O COOCH 3
O COOCH 3
Toi aceti colorani naturali cu rol important pentru existena omului, animalelor i plantelor fac parte din clasa [18]-aza-anulenelor. Ei sunt compleci metalici, ionul metalic aflndu-se n centrul sistemului macrociclic, substituind atomii de hidrogen legai de atomii de azot n compuii nemetalici. Marea majoritate a porfirinelor sunt recomandate n calitate de aditivi alimentari i cosmetici. Un compus n care mai multe duble legturi sunt hidrogenate este aa numitul factor F430 din bacteriile metanogenice. Uor diferite dar biogenetic nrudite cu porfirinele sunt carinele. Cel mai important reprezentant al acestui grup este vitamina B12 78, un complex cu cobalt. La fel ca i factorul F430, vitamina B12 nu include n structur un rest porfirinic, ambii compui nefiind aza-anulene aromatice. 3.3.1 Biogeneza pigmenilor porfirinoizi Calea primar de biosintez a tuturor pigmenilor porfirinogeni (figura 3-11) pornete de la acidul 5-amino levulinic (ALA) 79 care, n cazul clorofilelor din eucariote i anumite bacterii se formeaz prin reducerea unui ester al acidului glutamic la semialdehida corespunztoare i rearanjarea acesteia. Dou molecule de ALA se ciclizeaz la porfobilinogen 80 sub influena dehidratazei. Aceast reacie este analoag sintezei Knorr a pirolului.
92
A N N Co N CH3 N
N D
N C
CH3 CH3
CONH2
N H O H H CH2OH
78
P O
Uroporfirinogenul 87 se formeaz din 4 molecule de porfobilinogen prin aciunea a dou enzime: porfobilinogen deaminaza (cunoscut i ca hidroximetilbilan 81) i a cosintetazei. Procesul nu este totui o adiie capcoad a patru molecule de porfobilinogen la o grup de cistein a deaminazei, fiind implicate ase molecule de porfobilinogen. Primele dou molecule i deaminaza sunt apoi separate prin hidroliz acid, iar hidroximetilbilanul rezultat 85 sufer o reacie de ciclizare la uroporfirinogen 87. Resturile de acid acetic i acid propionic apar n aceleai secvene grefate pe inele A, B, C dar nu i n inelul D. Din acest motiv se impune o rearanjare a inelului D. Aceasta este catalizat de cosintaz. Aceeai enzim este responsabil i de nchiderea ciclului. Experimentele efectuate in vitro cu derivai spiro 86 au demonstrat c acetia se rearanjeaz n uroporfirinogen n acelai mod. Nici un ion metalic nu este implicat n generarea tetrapirolului. Unitile de porfobilinogen sunt legate ionic prin lanurile laterale acide. Coloranii porfirinoizi sunt catalizatori importani n diferite sfere ale vieii. Ei sunt denumii pigmeni ai vieii datorit importanei lor. Culoarea hemoglobinei i a mioglobinei nu are nici un rol n sensul absorbiei luminii. Reaciile redox ale acestor compui sunt ns favorizate de stri de joas energie ce apar la absorbia radiaiilor electromagnetice din domeniul vizibil. Pigmenii porfirinoizi colorai din bacterii i plante catalizeaz reacii fotochimice, n particular fixarea CO2 i formarea oxigenului molecular. Bacterioclorofilele prezente n bacteriile roii transform energia luminoas n energie chimic prin formarea adenozintrifosfatului (ATP). n
93
2
O
+ NH3
Cys242 S 80
79
Cys242 SH 81
P A P NH NH A PA NH
+ 80
P P A NH NH PA NH
P A NH
+ 80
Cys 242 S 83
Cys242 S
82 + 80
P A P NH NH NH A A P P A P A P A HO NH NH NH NH A P A P
P A NH NH
PA
Cys242 S
NH P
85
84
H2O P A A
+ Cosintetaza A
NH NH A
B
NH NH
P P A
A
NH NH
B
NH + NH
A
NH A
B
NH
.. D
NH +
D
P
C
P
D
P
C
P
NH
C
P
87
86
Fig. 3-11 Biogeneza porfirinelor (A-acid acetic, P-acid propionic) Multe profirine din plante i animale sunt transformate n natur n tetrapiroli cu lan deschis prin oxidarea unei grupe metinice. Exemple sunt bilirubina care se gsete n bil i biliverdina, un pigment ce apare la fluturi. Pigmenii din bil sunt fluoresceni. Procesele chimice pe care ei le suport n organism sunt izomerizri EZ ale dublelor legturi exociclice i ciclizrile dintre inelele A i B formnd un inel cicloheptadienic (heminrubin). Tetrapirolii liniari au fost extrem de importani pentru evoluie, n istoria pmntului. Microorganismele existente n atmosfera reductoare iniial a pmntului au evoluat ulterior la cianobacterii, primele
94
organisme capabile s ntrein fotosinteza prin producere de oxigen molecular. Cianobacteriile nc nu conineau clorofil ca pigment fotosintetizator ci tetrapiroli ca fotoreceptori, aa numite ficobiliproteine. Ficobiliproteinele permit algelor roii s absoarb lumina la adncimi de peste 180 metri n apa mrii unde clorofila nu constituie un absorbant eficient. n organismele vii pigmenii oligopirolici sunt i ionofori pentru cationi prezentnd o foarte mare selectivitate. Influena acestor oligopiroli asupra transferului unui mare numr de ioni n organism a fost verificat in vitro printr-un sistem membran -bloc. Se remarc selectivitatea foarte mare pentru transportul ionului de Zn2+ (de 106 ori mai mare dect pentru ionul de Na+. Clorofila, utilizat drept colorant alimentar i cosmetic se extrage din frunzele verzi ale diverselor plante: spanac, fasole, Basella, morcovi, etc. i din alge. Procesul de extracie se poate realiza din frunzele verzi proaspete de spanac cu ap la 1000. O alt alternativ o constituie valorificarea sucului de plante zdrobite. Acesta se coaguleaz la 60-700, se separ proteinele, iar apoi se extrage clorofila cu un solvent nemiscibil cu apa (alcooli sau cetone superioare). Un agent de extracie deosebit de eficace l constituie amestecul ternar eter de petrol:aceton:alcool (20:3:4 n volum). Separarea clorofilelor a i b se poate realiza prin HPLC cu un solvent isocratic (etanol:ap=91.5:8.5) i o coloan cu faz invers de dodecilsilan. Clorofila foarte pur se poate obine industrial prin absorbia extractului primar pe poliolefine pudr (polietilen, polipropilen) urmat apoi de eluia xantofilei i n final a clorofilelor a i b. Drept eluent pentru xantofile se utilizeaz o soluie apoas de aceton 70 %, iar pentru clorofile o soluie apoas cu concentraie mai mare de aceton(85%). Purificarea n continuare se realizeaz pe o coloan umplut cu zaharoz folosind ca eluent izooctanul sau amestecuri metanol-aceton. Pulberile de proteine (caseine sau colagen) coninnd hemin drept principiu colorat se pot utiliza la fabricarea fardurilor i pudrelor. De cele mai multe ori precipitarea heminei se realizeaz pe substraturi anorganice (talc, caolin, mic, TiO2). Procesul const n hemoliza sngelui animal la 30-1000, i pH=11-14, ajustarea pH-ului dup hidroliz la 7.6 urmat apoi de absorbia heminei pe substratul anorganic sau de uscarea hidrolizatului brut prin atomizare.
95
3-1 nrudirea steric dintre monozaharide i -aminoacizi poate fi stabilit i pe cale chimic:
O C HO C H H OH OH HCN NH3 CN CH NH2 HO C H OH OH H2 O HO COOH CH NH2 C H OH OH + separare -LACTONA IV Na/Hg reducere D-GLUCOZAMINA (piranoza) V + C2H5SH CH3 CH3 H C NHAc Pb(OAc)4 H C NHAc HO C H OH OH SC2H5 CH SC H 2 5 CH NH2 H OH OH VI
3. 4 Aplicaii. Probleme
H C H C
H C H C
H C H C
CH2OH II 2 diastereoizomeri
COOH IX
H C H C
CH3 H C NH2
CH2OH VIII
CH2OH
Se cere: a) s se indice o metod de separare a epimerilor acidului glucozaminic III; b) s se scrie structurile IV, V, VII; c) s se justifice configuraia S(L) a aminoacidului X; d) s se justifice alegerea agentului bazic la transformare VIIVIII;
96
e) s se justifice formarea celor doi diastereoizomeri II la transformarea III. 3-2 Schema de mai jos red nrudirea configurativ a unor aminoacizi naturali. Se cere: a) s se scrie reaciile preciznd reactanii pentru transformrile: III, IIII, IV, IVI, VIV, VIVII; b) s se arate configuraia absolut a stereocentrului din structurile IV, I, V; c) Transformrile IIII i IV au loc cu inversie Walden? Argumentai rspunsul.
COOH H2N C H H2N COOH H2N C H CH2SH III L(-) cisteina COOH C H
CH2
COOH C H H2N
COOH C H
CH2Cl I
CH2NH2 V
3-3 S se imagineze o cale de sintez pornind de la metan pentru urmtorii aminoacizi: a) glicocol; b) alanin; c) fenilalanin; d) acid antranilic e) acid p-amino benzoic; f) acid m-amino benzoic. 3-4 Utiliznd drept reactani 1-bromo-3-cloro-propanul, ftalimida potasic i esterul malonic, se cere: a) s se scrie o succesiune de reacii n vederea obinerii ornitinei; b) s se menioneze o cale sintetic n vederea preparrii 1-bromo-3cloro-propanului pornind de la propen; c) ce reactant trebuie folosit n locul 1-bromo-3-cloro-propanului pentru ca din reaciile scrise la punctul a) s rezulte lisin?
97
3-5 S se arate o alternativ de sintez a lisinei utiliznd ca materie prim fenolul tiind c intermediarul n sintez este -caprolactama. 3-6 Pornind de la acid acrilic s se scrie o succesiune de reacii din care s rezulte serin. 3-7 Utiliznd ca materii prime acrolein i ester N-acetil malonic se prepar acid glutamic. S se imagineze o alternativ de sintez. S-ar putea realiza aceeai sintez pornind de la acrilonitril? S se justifice rspunsul. 3-8 O sintez a metioninei utilizeaz ca materii prime organice etilenoxidul i esterul N-acetil amino-malonic. S se gseasc o cale de sintez tiind c alchilarea mercaptoalcoolilor decurge preferenial la restul tiolic. 3-9 S se imagineze o metod de sintez a alaninei pornind de la acid piruvic. S se discute stereochimia reaciei. 3-10 Acidul asparagic se poate prepara pornind de la acid maleic parcurgnd urmtoarele etape mari: Acid maleic Acid fumaric Ester dimetilic al acidului fumaric Ester dimetilic al acidului asparagic Acid asparagic. Se cere: a) s se scrie reaciile care au loc; b) s se arate condiiile i s se justifice transformrile Acid maleic Acid fumaric i Ester dimetilic al acidului fumaric Ester dimetilic al acidului asparagic. 3-11 Folosind datele din tabelul nr. 4-1 pe baza efectelor electronice s se discute : a) aciditatea comparativ a alaninei i fenil alaninei; b) bazicitatea comparativ a asparaginei i glutaminei. 3-12 Cte peptide, admind c n molecula peptidei un anumit aminoacid se regsete o singur dat, se pot prepara cu participarea a: a) doi aminoacizi diferii; b) trei aminoacizi diferii; c) patru aminoacizi diferii. 3-13 Glutationul (Glu-Cys-Gly) este o tripeptid prezent n toate esuturile. Se cere: a) s se scrie formula glutationului; b) s se imagineze o alternativ de sintez a dipeptidei Cys-Gly pornind de la aminoacizii componeni. 3-14 S se precizeze tipul si ordinea secvenelor de aminoacizi ntr-o tetrapeptid tiind c: sub aciunea clotripsinei se pune n libertate prin hidroliz arginin; sub aciunea tripsinei rezult prin hidroliz o dipeptid Lys-Arg;
98
marcarea aminoacidului N-terminal cu clorur de dansil a permis identificarea spectrofluorimetric dup hidroliza total a unui rest de prolin; analiza hidrolizatului total al proteinei a pus n eviden cantiti echimoleculare de lisin, prolin, arginin i metionina. 3-15 S se imagineze 4 secvene de nucleotide fcnd parte dintr-o molecul ADN capabile s transmit codul genetic pentru peptida din figura 4-9. 3-16 Un ARNm n transmiterea codului genetic utilizeaz urmtoarea secven de codoni: GCA, AGA, GGA, CCA, AUG. Se cere: a) secvena de baze din ADN a crui mesaj ARN l poart; b) anticodonii din ARNt corespunztor; c) peptida a crui cod genetic a fost purtat de ADN. 3-17 Acidul p-aminometil benzoic este un medicament antifibrinolitic. S se imagineze o alternativ de sintez pornind de la toluen. 3-18 Faza staionar n coloana cromatografelor destinate separrii aminoacizilor poate fi polistiren reticulat parial sulfonat (cationit). Admind c hidrolizatul conine: Gly, Ala, Phe, Pro, Trip i Lys s se arate ordinea de eluie a aminoacizilor (folosind datele din tabelul 4-1), dac eluia se realizeaz cu o soluie tampon. 3-19 Aminoacizii rezultai prin hidroliza proteinelor se pot separa i identifica i cu ajutorul cromatogafiei pe hrtie sau coloan. Detecia se realizeaz fotometric prin reacia cu ninhidrina I cnd rezult un colorant albastru violet.
O R O H2N CH COOH I O
+
R N CH COOH
O N O
O +I O
O H NH2 O
Se cere: a) s se justifice comportarea difereniat a celor 3 grupri carbonil n raport cu aminoacidul, innd seama de mecanismul reaciei(AN +E). b) culoarea diverselor spoturi pe cromatograma pe hrtie depinde de natura aminoacidului (comentariu) ?
99
3-20 O alternativ de identificare a aminoacidului N-terminal o constituie reacia peptidei (proteinei) cu 2, 4, dinitrofluor benzen. Dup hidroliza total secvena I poate fi identificat n amestec prin cromatografie utiliznd etaloane adecvate (cunoscnd valorile Rf). NO2 R O2N HN CH COOH
I De ce reactivul utilizat este 2, 4-dinitro-fluorbenzenul i nu compuii dinitroclorurai sau dinitrobromurai ? 3-21 innd seama de reaciile din fig. 4-10 s se descrie modul de lucru impus de sinteza peptidei Gly-Ala-Val utiliznd pentru blocarea gruprii carboxil polistiren parial clorometilat. 3-22 Anestezina(anestezic local liposolubil) este esterul etilic al acidului paminobenzoic. O alternativ de preparare a acestuia o consitutie esterificarea direct n cataliz acid. Admind Ke = 4.5 n condiii de reacie se cere: a) conversia acidului n ester dac raportul molar acid-alcool la nceputul reaciei a fost 1:10; b) compoziia n procente molare a amestecului de reacie la echilibru (neinnd seama de prezena catalizatorului acid). 3-23 Un ester analog anestezinei cu aceeai activitate biologic este procaina (novocaina) rezultat prin tratarea acidului p-amino benzoic cu N, N -dietil N-(-hidroxietil) amina n cataliz acid. Se cere: a) s se scrie reaciile ce au loc; b) s se aleag o cale de sintez a N, N -dietil N-(-hidroxietil) aminei utiliznd etilenoxidul sau etilenclorhidrina ca reactant. Ce produi secundari rezult la utilizarea unui exces mare de etilenoxid mai ales dac n sistem sunt urme de ap ? 3-24 O metod interesant de obinere a dipeptidelor n care glicina este acid N-terminal utilizeaz ca materii prime clorura acidului monocloracetic, bazndu-se pe reactivitatea difereniat a celor doi atomi de halogen n raport cu un aminoacid C-blocat. Se cere: a) s se scrie reaciile care au loc la prepararea dipeptidei; b) s se indice o metod de preparare a clorurii acidului cloracetic, pornind de la acid acetic. 3-25 Sinteza Rodionov a -aminoacizilor const n condensarea crotonic a unei aldehide cu acid malonic n prezena amoniacului cnd rezult succesiv un acid amino dicarboxilic, care prin decarboxilare termic genereaz aminoacidul. Se cere:
100
a) utiliznd aceast metod s se indice o alternativ de sintez a acidului -amino--fenil butiric; b) s se precizeze produsul secundar format la obinerea aminoacidului de mai sus. S se scrie stereoizomerii acestuia. 3-26 Hidroliza dicetopiperazinelor n prezena soluiilor bazice diluate conduce la dipeptide. Metoda prezint importan n sinteza peptidelor ce conin alturat secvene identice de aminoacizi. Folosind aceast metod s se sugereze o alternativ de sintez a pentapeptidei Gly-Gly-Val-Ala-Ala pornind de la cei trei aminoacizi componeni. 3-27 O sintez asimetric interesant cu un randament de pn la 98% a L-aminoacizilor o constituie metoda N. Belokoni. Aceasta implic urmtoarele etape, prezentate n schema de mai jos. Se cere: a) s se scrie cte o metod de sintez pentru compuii I (pornind de la acrilonitril i ester malonic) i II (pornind de la alchilbenzeni); b) s se precizeze intermediarul ce apare n transformarea I+IIIII; c) s se scrie ligandul ce genereaz (prin sintez Template) complexul IV; d) tiind c produsul VI este un derivat sodat la grupa metilenic a compusului IV, s se propun o alternativ pentru structura reactantului V. e) s se precizeze structura intermediarului VIII, preciznd care dintre cei doi atomi de hidrogen (1 sau 2) ai grupei metilenice vor fi preferenial nlocuii de radicalul R din produsul VII (discuie);
II H2N N CH2 I COOH C6H5 COCH3 SOCl2 N CH2 CONH C6H5 III
H2NCH2COOH CH3ONa, NiCl2
CH2C6H5 O
N Ni N
O N
COCH3
H1 H2 CH3
f) seminificaia radicalului R dac din reacie rezult L-leucin. Pentru acest caz s se aleag o variant de sintez a compusului VII ce trebuie utilizat n reacie (pornind de la n-alcani).
101
SOLUII 3-1 a) Cu ajutorul diastereoizomerilor, utiliznd brucina drept baz enantiomeric pur: Acid glucozaminic () R - COOH () Brucina (-) B (-), analog pentru brucina (+).
R COOH ( + ) + B(-) R
+ COO (-) B H(-) + R + COO (+) B H(-)
diasterizomeri izolabili prin recristalizare + NaOH R COONa ( + ) + B(-) + NaOH R COONa (- ) + B(-)
b)
O C H C NH2 HO C H OH O CH OH H C NH2 HO C H OH O AcO CH SC2H5 SC2H5 CH NHAc C H OAc OAc
H C H C VII
H H O
4
H C H C
H C H C
CH2OAc V
HOCH2 H (OH)
2
CH2OH IV
CH2OH O H H OH H O HO H NH2
CH2OH
HO
3
HO H
NH2 OH (H)
c)
102
CH3 C H
1
COOH
3
COOH (a) A
(a) C
A B, A C ( dou inversri succesive ale substituenilor). d) Dac s-ar fi utilizat o baz mai puternic (NaOH de exemplu), ar fi existat pericolul hidrolizei, cel puin pariale a gruprii amidice. Rolul metanolului este de solvatare. e) Gruparea carbonil din structura I reprezint un centru prochiral cu dou fee, putnd fi atacat cu egal probabilitate pe fiecare din ele de agentul nucleofil (CN-).
R + C H CN
-
CN
3-2 a)
I I II III R R X Cl + Mg RMgX + H2 O RH - HOMgX
IV
I V
I
R
CH2Cl
VI
VI
V
VII
R
R
NH2
R COOH
103
b)
COOH IV H2N C H HOCH2
2 3
COOH NH2
4
C H
1 3
CH2OH
COOH NH2
4
C H
1
3
CH2Cl
COOH V H2 N C H
2
COOH NH2
4
H2NCH2 C H
1
CH2NH2
c) Nu, deoarece atomul de halogen nu este legat de un centru chiral (carbon asimetric). 3-3 a)
0 CH4 800 CH CH + H2O Hg
+
CH2 CH OH
H3C
H2C
COOH
+ 2NH3 - NH4Cl
H2C Cl
NH2
b)
H3C CHO + H2 H C CH 3 2 OH HCl H C CH 3 2 - H2O Cl + HCN H3C CH2 CN + + 2 H2O/ H3O H3C CH2 COOH
H3C CH NH2
COOH
+ 2NH3 - NH4Cl
H3 C
CH Cl
COOH
+ Cl2 - HCl
104
CH3 - H2
CH
CH2
+ Br2 peroxizi H2N CN CH + NH3 - NH4CN COOH CH CH2 CHO oxid. CH2 CH2 OH CH2 CH2 Br
H2N
+ CH4 CH3Cl
CH3
CH3 + NO2
CH3 NO2
CH3 NH2
CH3
1. oxidare 2. red.
Ac2O
CONH2
+ H2O/H3O
3-4 a)
105
O
NK +
+ NaCH(COOR)2 - NaCl COOR N CH2 CH2 CH2 CH O O NH2 COOH NH2 COOR
COOH
b)
CH2 CH CH3 + Cl2 (S.R.) CH2 4000 CH CH2 Cl + HBr Br CH2 CH2 CH2 Cl peroxizi
Lisina
3-5
106
OH + 2H2
OH
O + H2NOH
OH Transp. Beckmann
NH CO
-caprolactama
+ Ac2O
H2N CH2 CH2 CH2 CH2 COOH NH2 H2N CH2 CH2 CH2 CH COOH
Br + NH3 hidrol.
3-6
Br + ROH CH2 CH COOH CH2 CH COOR + HOBr HO CH2 CH COOR O
NK +
N CH COOH O
3-7
NHAc CH2 CH CHO NaC (COOR)2 CH2 CH2 CHO C COOR COOR AcNH KMnO4/H3O
+
H2N CH
- CO2 -AcOH
COOH
Sinteza se poate realiza i pornind de la acrilonitril. n acest caz generarea grupei carboxil nu se va mai realiza ca n exemplul anterior prin oxidarea restului aldehidic ci prin hidroliza guprii nitrilice.
CH2 CH CN CH2 CH2 CN + H2N CH CH2 CH2 COOH + H2O/H3O COOH C COOR - CO2, -AcOH. - ROH COOR AcNH
107
3-8
H2C O CH2 + H2S HS CH2 CH2 OH + (CH3)2SO4 CH S 3 NaOH CH2 CH2 OH SOCl2 sau HCl gazos AcNH CH3S CH2 CH2 hidroliza NH2 CH3S CH2 CH2 CH COOH
4 4
C COOR COOR
3-9
CH3 centru prochiral cu doua fete C COOH + NH2OH CH3 O NH2 C N COOH + Zn/CH3COOH CH3 C
2
NH2 C H
1 3
COOH + HOOC
3
CH3
2
OH
H
1
R (amestec racemic)
3-10 a)
HOOC C H C COOH + H3O+ HOOC + C H H (A) C COOH H H HOOC + C H C
+ H - H3O H COOH
- H3O
HOOC C H
HOOC
108
b) Cationul format conform transformrii (A) permite rotaia liber. Echilibrul este deplasat spre dreapta datorit insolubilitii n mediu acid a acidului fumaric. Adiia nucleofil (C) este posibil datorti efectului puternic -I, -E exercitat de cele dou grupe carboxil.
3-11 a) n fenil-alanin, datorit efectului -I al restului fenilic (dei relativ slab datorit distanei), - la oxigen este mai mic dect n alanin, ceea ce face ca protonul s fie mai puin atras, iar compusul s fie mai acid.
H CH2 CH COOH C6H5 CH2 CH NH2 pKa = 1.8 O C + O H
b) Efectul -I exercitat de restul amidic asupra celui aminic este mai redus n glutamin dect n asparagin datorit creterii distanei. Deci glutamina este baz mai slab dect asparagina.
Asparagina CH2 CONH 2 H2N CH COOH pKNH3+ = 8.8 Glutamina CH2 CH2 CONH 2
3-12 (ase).
109
110
CH2 H2N CH
Glu
Cys
Gly
b)
O Pst H N CH2 COOH CH2Cl + 2 Pst CH2 O C + DCC CH2 NH2 CH2SH + Boc NH CH COOH CH2SH HOOC CH2 NH CO CH NH2 Gly Cys Pst O CH2 O C CH2 NH CO CH2SH CH NH Boc
3-14
a) CGT, GCG, CCT, GGT, GCG b) Arg, Ala, Pro, Gly, Ala c) Arg-Ala-Pro-Gly-Ala
111
3-17
CH3 CH3 + NO2 COOH H2 CH2 NH2 CN CH3 NO2 separare NO2 COOH + CuCN - N2, -CuCl N N]Cl
+
-
CH3
COOH
COOH
NO2
NH2 COOH
3-18 Viteza eluiei va fi cu att mai mare cu ct legtura RNH3+ -O3SPolimer are un caracter ionic mai pronunat. Cu ct bazicitatea aminoacidului este mai mare cu att caracterul ionic al legturii este mai pregnant. n seria:
Phe KNH3+ = 9.1 Trip KNH3+ = 9.4 Gly KNH3+ = 9.6 creste aciditatea creste Kb pentru bazele conjugate +creste caracterul ionic al legaturii R-NH3 O3S-polimer creste viteza de elutie Ala KNH3+ = 9.7 Pro KNH3+ = 10.6
3-19 a) Atacul nucleofil al secvenei aminice din aminoacid va avea loc la cel mai pozitiv centru din molecula ninhidrinei. Acesta este plasat la atomul de carbon al legturii carbonil centrale datorit efectelor -I, -E ale celor dou grupe carbonil adiacente. O
O Ninhidrina b) Nu, colorantul rezultat este totdeauna acelai. Identificarea se realizeaz pe baz de Rf i nu de culoare. Dintr-un spectru de reflexie al cromatogramei se poate estima doar catitatea de aminoacid.
112
3-20 Faptul c reactivitatea n seria F Cl Br I crete de la dreapta la stnga este justificat deoarece grupa NO2 din poziia orto i poate manifesta efectul labilizant -E doar cnd halogenul are un volum mic (cazul fluorului), i molecula este plan. n restul cazurilor halogenul i gruparea NO2 din orto nu pot fi coplanare din motive sterice, grupele NO2 intervenind doar prin efect -I activnd mai puin halogenul.
3-21
H3C H2N CH2 CONH CH3 CH
Gly
H3C CH3 CH Pst
Ala
H3C CH3 O CH CH2 O C
Val
CH NH Boc
CH3 HOOC
NHCO CH NH Boc
H3C CH HOOC CH
Pst CH2 O C
CH
NHCO CH NHCO
CH2 NH2
3-22
a)
113
H2N
H3O
H2N
Echilibru a-x moli acid 10a - x moli alcool x moli ester x moli apa
V - volumul probei (l); [ ] - concentraia (moli/l). ester apa acid alcool x x V V Ke = a x 10 = 4.5 a x V V 0.7x2 - 9.9 ax + 9a2 = 0 de unde x1= 13.16a > 10a (soluie eronat, nu corespunde condiiilor problemei). x2 =0.98a b) Final: 0.02a moli acid; 9.02a moli alcool; 0.98a moli ester; 0.98a moli apa. Total: 11a moli (procesul decurge cu conservarea numrului de moli). 0. 98 a % moli _ ester = 100 = 8. 91 11 a 0. 02 a % moli _ acid = 100 = 0.18 11 a 9. 02 a % moli _ alcool = 100 = 82 11 a 0. 98 a % moli _ apa 100 = 8. 91 11 a c) Conform legii lui Le Chatelier: marirea excesului de alcool; eliminarea apei (produs de reacie) din sistem prin distilare azeotrop cu benzen sau toluen. Ke = 3-23 a)
114
H2N
C2H5 C2H5
H2N
COOCH2 CH2 N
C2H5 C2H5
b)
C2H5 H2C CH2 + HN C2H5 O HO CH2 CH2 N C2H5 C2H5 C2H5 + HCl C2H5 (captat de o baza)
HO CH2 CH2 N
CH COOH R
CH3
COOH
+ Cl2 P
Cl CH2
Cl CH2 COCl
3-25
a)
COOH + CH2 COOH COOH + NH3 C6H5 CH CH COOH COOH C6H5 CH CH COOH NH2 t0 - CO2 C6H5 CH CH2 COOH NH2
C6H5 CHO
115
3-26
O R CH C NH2 OH + H2N 0 CH R t HO C O R NH O O NH R NaOH dil. H2N CH CONH CH COOH R R
Pe aceast cale se pot prepara Gly-Gly i Ala-Ala. Formarea pentapeptidei se realizeaz n maniera cunoscut (vezi fig. 4-10).
CH3 CH NHCO Pst CH2Cl +HOOC DCC H3C CH HOOC CH NH Boc H3C O CH3 Pst CH2 O C CH NHCO CH3 CH NHCO CH CH NH Boc CH3 O CH3 CH NH Boc Pst CH 2 O C CH NHCO CH3 O CH3 Pst CH2 O C CH NHCO CH3 CH3 CH NH2 CH3 CH NH Boc
CH3
H3C
CH3 CH CH
CH3
CH NHCO
NHCO CH NH2
CH2 NH Boc
CH3
H3C
CH3 CH CH
CH NHCO
NHCO CH
116
3-27
CH2
a)
CH CN CH2(COOR)2 ROOC + H2 ROOC ROOC CH CH2 CH2 CN RONa ROOC CH CH2 CH2 CH2 NH2
Br COOR O N H
COOR O
scindarea racemicului prin metoda diastereoizomerilor Cl CH2 N H COOH S C6H5 N S CH 2 COOH C6H5
NO2 HNO3/H2SO4 CH2 CH3 + NO2 CH2 CH3 CH2 CH3 separare prin distilare
NO2
NO2
b)
O N CH2 C Cl
C6H5
c)
117
CH2C6H5
O CH2
N HO O NH N CH3
d) V poate fi un alcooxid CH3O-Na+, CH3CH2O-Na+, etc. e) n compusul IV protonul H1 este blocat steric de restul benzilic, motiv ce conduce la substituirea preferenial a hidrogenului H2.
CH2C6H5
O H R CH3
N O Ni N
O N
VIII
f)
CH3 CH3
118