PREVENIREA SI LIMITAREA RASPANDIRII CANCERULUI BACTERIAN LA VITA-DE-VIE IN VEDEREA OBTINERII SI MENTINERII PLANTATIILOR VITICOLE SANATOASE

REZUMATUL TEZEI Cuvinte cheie: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis,

viticultura, sol, izolare, identificare

Cancerul bacterian al vitei-de-vie se manifesta pe toate organele multianuale ale viteide- vie (tulpini, coarde, cordoane, radacini), in special pe tulpini in zona de contact cu solul la plantele nealtoite, sub forma de tumori (gale), respectiv proliferari si aglomerari de tesuturi determinate de toxinele secretate de bacterie. Plantele de vita-de-vie atacate de bacteriile patogene Agrobacterium sp. prezinta intarzieri de crestere, nanism, reducerea habitusului, scaderea cantitativa si calitativa a producttiei, necrozarea organelor atacate. Cancerul bacterian al vitei-de-vie se manifesta si apare indeosebi in urma efectului temperaturilor scazute, sub limita de rezistenta la ger a soiurilor, dar este la fel de bine favorizat si de temperaturile ridicate. Principalul mijloc de raspandire al cancerului bacterian al vitei-de-vie il reprezinta utilizarea la plantare a materialului saditor viticol infectat, iar principala poarta de intrare a bacteriei in organismul viitoarei plante obtinute prin altoire o reprezinta sectiunile (leziunile) ocazionate de operatiunea de altoit. In plantatiile viticole mama si pe rod infectarea se realizeaza prin leziunile provocate de ger sau cele mecanice pentru care responsabile sunt ustensilele, uneltele, echipamentele cu care se intretin pepinierele si plantatiile viticole. Prezentul studiu a avut drept scop analiza agentului patogen care produce cancerul bacterian la vita-de-vie si prevenirea raspandirii speciilor virulente de Agrobacterium in plantatiile viticole. Avand in vedere preocuparile existente pe plan mondial privind prevenirea si raspandirea cancerului bacterian in plantatiile viticole, teza de doctorat a urmarit realizarea urmatoarelor obiective: izolarea si identificarea de specii virulente de Agrobacterium din zona viticola 1

Stefanesti; evaluarea calitatii coardelor altoi provenite de la plante mama afectate de cancer bacterian; testarea unor substante chimice in plantatiile viticole in vederea prevenirii raspandirii cancerului bacterian; studiul tolerantei unor soiuri de vita-de-vie la atacul de cancer bacterian; realizarea unei scheme de tratament pentru prevenirea raspandirii cancerului bacterian in plantatiile viticole. Lucrarea de fata este structurata in urmatoarele capitole: 1. Stadiul actual al cercetarilor privind cancerul bacterian la vita-de-vie (Agrobacterium sp.). 2. Cadrul natural de experimentare. 3. Material si metode de cercetare. 4. Rezultate si discutii. 5. Concluzii si recomandari. 6. Bibliografie. 7. Anexe. S-au identificat plantele bolnave de cancer bacterian dintr-o plantatie viticola parasita a I.N.C.D.B.H. Stefanesti si s-au marcat in vederea realizarii cercetarilor stiintifice. Pana in primavara anului 2011 s-au realizat observatii si determinari in camp, iar pentru a le supraveghea mai bine acestea au fost scoase din plantatie si transplantate in ghivece dupa care au fost transportate intr-o sera special amenajata experimentelor cu bolile plantelor. Soiurile utilizate in experiment pentru depistarea bacteriei A. tumefaciens au fost: Precoce, Down, Alphonse Lavalle, Somesan, Azur, Muscat de Adda, Argessis, Augusta. Pentru evaluarea calitatii coardelor altoi s-au utilizat soiurile Cetatuia, Chasselas, Coarna neagra selectionata, Somesan; iar pentru testarea virulentei in vitro s-au utilizat soiurile Azur, Neuburger, Busuioaca de Bohotin. Conditiile climatice din perioada de cercetare 2009-2011 s-au caracterizat prin: - resurse mai bune ale insolatiei anuale si pe perioada de vegetatie: suma anuala a orelor de insolatie a crescut cu 17,3 % fata de media multianuala de 2.120 ore/an, inregistrand in medie 2.487 ore/an; - resurse termice mai ridicate: temperatura medie anuala a inregistrat 11,3C, o crestere de 4,63% fata de temperatura medie multianuala de 10,8C din perioada ultimilor 30 de ani 1979-2008). Singura luna in care s-au inregistrat valori mai mici cu 13-15% fata de media multianuala a fost luna octombrie a anilor 2010 si 2011, urmare a revenirii precipitatiilor 2

dupa seceta prelungita din lunile august si septembrie ale acestor ani. - un regim anual al precipitatiilor de 548,1 mm, mai redus cu 20,1% fata de media multianuala a ultimilor 30 de ani (1979-2008) de 686 mm. Izolarea si identificarea bacteriei patogene A. tumefaciens s-a realizat din material biologic si din sol. Materialul biologic a fost prelevat de la soiurile Precoce, Down, Alphonse Lavelle, Somesan, Azur, Muscat de Adda, Argessis si Augusta, in conditii aseptice. Pentru izolarea bacteriilor din tumori si coarde de vita-de-vie s-au utilizat mediile Lieske si 1D, iar pentru izolarea din sol s-au utilizat mediile PGA, PGA 2, PGA 3, PGA 4 si Lieske. Izolarea bacteriilor din tumori s-a realizat prin sectionarea tumorilor; acestea au prezentat celulele bacteriene dezvoltate haotic si fara a fi organizate in tesuturi. Pentru identificarea bacteriilor dezvoltate pe mediile de izolare s-au utilizat mediile 1A si R&S. Pe mediile de cultura specifice, bacteriile au format colonii rotunde cu margini regulate, bombate, cu suprafata neteda, translucide, lucioase, usor detasabile. Comparativ cu mediul 1D, mediul Lieske a favorizat dezvoltarea mai rapida a bacteriilor si epuizarea completa a mediului. Izolarea bacteriilor din coardele de vita-de-vie, a avut ca rezultat obtinerea de colonii bacteriene care nu au condus la semnalarea de diferente in ceea ce priveste evolutia lor si rezultatele obtinute comparativ cu cele izolate din tumori. Evolutia bacteriilor din tumori si coarde de vita-de-vie pe mediul 1A a fost asemanatoare si au avut ca rezultat punerea in evidenta (identificarea) a patogenului A. tumefaciens. Testarea virulentei bacteriei cu inocul preparat din culturi pure de bacterii, obtinute din tumori si coarde, s-a realizat in vivo pe rondele de Daucus carota si in vitro pe plantule (multiplicate pe mediul de cultura Murashige-Skoog) din soiurile Azur, Neuburger si Busuioaca de Bohotin. Pe morcov bacteria a determinat formarea unor concresteri tumorale de culoare galben-verzui in jurul cilindrului central. Pe materialul biologic multiplicat in cultura in vitro nu s-au format tumori dar bacteria a produs moartea plantulelor. Pentru identificarea din sol a bacteriilor patogene A. tumefaciens si A. vitis s-au prelevat probe din trei locatii diferite. Din solul prelevat din vasele de vegetatie aflate in sera sa identificat bacteria patogena A. tumefaciens iar din solul prelevat in urma defrisarii unei plantatii viticole, s-au identificat ambele specii de bacterii patogene. Insa, bacteria A. tumefaciens se afla intr-un numar mai redus in acest sol comparativ cu cel prelevat de la baza plantelor bolnave. Din solul necultivat s-a izolat doar patogenul A. tumefaciens care se afla in cantitatea cea mai mica comparativ cu celelalte doua locatii mentionate mai sus. Pentru controlul bacteriei patogene A. tumefaciens, izolate de la plantele de vita -de-vie s- au formulat doua retete care au avut la baza tinctura de usturoi si sulfatul de cupru in 3

combinatie cu hipoclorit de sodiu (R1) pe de o parte si cu alcool etilic de 90 (R2) pe de alta parte. In urma aplicarii repetate a tratamentelor cu retetele R1 si R2, cate 5 tratamente/an, doi ani consecutiv, atat in conditii de camp cat si de sera, gradul de atac al bacteriei A. tumefaciens (aparitia de tumori) a fost mai mare la soiurile Azur si Augusta comparativ cu soiurile Muscat de Adda, Somesan, Alphonse Lavall e, Cetatuia, Coarna neagra selectionata, Argessis dar mai mic decat la plantele de vita-de-vie bolnave dar netratate. Soiurile Alphonse Lavelle, Cetatuia si Coarna neagra selectionata au format tumori la nivelul solului care s-au stopat in urma aplicarii a 5 tratamente anuale. Insa irigarea cu apa rece a favorizat reluarea activitatii bacteriilor si dezvoltarea tumorilor de la baza tulpinii aflate in contact cu solul. Prin indepartarea solului din jurul tumorilor si aplicarea tratamentelor s-a produs uscarea tumorilor. La soiurile Somesan, Chasselas si Muscat de Adda aparitia tumorilor a fost inhibata 100% in urma aplicarii celor 5 tratamente anual. Pentru a limita raspandirea patogenilor A. tumefaciens si A. vitis in sol s-au testat aceleasi retete mentionate mai sus. Prin urmare s-au analizat toate probele de sol tratate, dar si lichidul rezultat in urma dezinfectarii solului pentru a afla daca solutiile aplicate spala bacteria din sol sau o omoara. Astfel, tratarea solului cu cele doua retete, a condus la distrugerea partiala a bacteriilor patogene A. tumefaciens si in totalitate a bacteriilor A. vitis. In urma dezinfectarii solului s-a constatat ca o mica parte din bacterii patogene A. tumefaciens sunt spalate sau percoleaza pe profilul de sol odata cu lichidul detinfectant. Dupa cum este cunoscut, gradul de maturare al lemnului coardelor de vita-de-vie influenteaza, in mare masura, rezistenta plantelor de vita-de-vie la temperaturile negative din perioada repausului de iarna. Materialul vegetal provenit de la plantele bolnave este de calitate inferioara, comparativ cu cel al plantelor sanatoase, fapt dovedit prin analizele chimice realizate in aceasta lucrare. Dupa aplicarea tratamentelor cu R1 si R2 pe plantele de vita-devie bolnave calitatea materialului biologic a crescut comparativ cu plantele bolnave netratate. Calitatea materialului lemnos si vegetativ al plantelor de vita-de-vie infectate cu A. tumefaciens este influentata de soi dar si de prezenta bacteriei. Acest lucru a fost evidentiat prin analizele chimice realizate pe materialul biologic viticol luat in studiu: - la plantele infectate cu A. tumefaciens, continutul in apa totala si apa libera este mai ridicat comparativ cu plantele martor (sanatoase). Astfel, atat continutul procentual de apa libera, cat si cel de apa totala inregistreaza valori mai mari de 50% in coardele provenite de la butucii cu tumori provocate de bacterie, in timp ce, la martor, acesti indicatori au oscilat in jurul valorii de 45%; 4

- la sfarsitul perioadei de repaus, continutul in glucide solubile din materialul lemnos a inregistrat la plantele infectate valori cuprinse intre 3,89% (soiul Chasselas) si 5,49% (soiul Coarna neagra selectionata); fiind mai reduse, comparativ cu valorile obtinute de la plantele sanatoase care s-au incadrat intre 5,84% (soiul Chasselas) si 9,68% (soiul Coarna neagra selectionata) ; - continutul in amidon din tesutul lemnos in cadrul soiurilor experimentate a inregistrat valori semnificativ mai scazute in grupa plantelor infectate cu A. tumefaciens comparativ cu plantele martor sanatoase; - in urma analizarii materialului vegetal al plantelor infectate cu A. tumefaciens raportul clorofila a/clorofila b este favorabil clorofilei a, continutul in glucide este mai ridicat, continutul in polifenoli totali este mai mic, cantitatea de substanta uscata este mai redusa cu 3%, iar continutul in apa este usor mai ridicat comparativ cu plantele martor sanatoase. Datele obtinute privind aplicarea retetelor R 1 si R2 pe plantele de vita-de-vie infectate cu patogenul A. tumefaciens si pe sol infectat cu bactereiile patogene A. tumefaciens si A. vitis conduc la recomandarea utilizarii acestora pentru limitarea raspandirii acestor patogeni in plantatiile viticole. Totodata se recomanda aplicarea a 5 tratamente/an pentru cresterea rezistentei plantelor de vita-de-vie la temperaturile negative din perioada repausului de iarna. Se recomanda de asemenea utilizarea mediului de cultura PGA 4 pentru izolarea bacteriilor patogene A. tumefaciens si A. vitis din sol.