1 Mecanismul de cataliza tipul 1 Acesta se refera la reactii care decurg in mai multe etape cu formare de intermediari care reactioneaza.

Cel mai simplu sistem este: R+C X X+R` P+C (1-6)

k1 k2

k3

De obicei intermediarul sau intermediarii X nu sunt stabili astfel ca sunt implicati imediat in procese mai rapide. Cand k1>k3 se realizeaza repede o concentratie in X foarte aproape de concentratia de echilibru a perechii reactante astfel incat formarea lenta a produsilor are un efect neinsemnat. Un astfel de intermediar este denumit de tip Arrheinus intrucat este asemanator intermediarului activat sugerat de Arrhenius ce se formeaza din reactanti in toate reactiile chimice. Evident pana la formarea lui X trebuie sa treaca prin starea de tranzactie deci X nu este complexulac-tivat ci un intermediar de reactie. Cand k2,k3>> k1 interme-diarul se numeste de tip Van`t Hoff. In fapt cineticile adecvate pentru fiecare din aceste situatii se dovedesc a fi cazuri particulare ale unei ecuatii generale de viteza rezultata din secventele (1-6). Astfel daca se presupune ca X isi atinge rapid concentratia starii stationare, se obtine: dCx si CR`=C 0 R ` -Cx (1-7) dt =k1*CR*CC-k2*CX-k3*Cx*CR`=0 0 0 Unde: CR`=C R -Cx; Cc=C C -Cx pe care inlocuindu-le in ecuatia (1-7) rezulta: dCx 0 0 0 (1-8) dt =k1[(C R -Cx)( C C -Cx)]-k2*Cx-k3*Cx(C C -Cx)=0 Adica: 0 0 0 0 2 2 k1[C 0 R * C C -C R -Cx- C C *Cx+C x]-k2*Cx-k3*Cx* C R +k3*C x=0 Neglijand termenii in C2x comparativ cu ceilalti se obtine concentratia stationara Cx: 0 0 0 0 Cx= (k1*C 0 (1-9) R * C C )/( k1*C R + k1*C C+ k3*C R +k2) Scriind viteza de reactie in raport cu produsul care se formeaza pentru momentul initial rezulta: 0 0 0 o o (dCp/dt)t=0=(k1*k2* C 0 (1R * C C *C R)/(k2+k1* C R +k1* C C +k3*CR )=vo 10)

Cum concentratia initiala a catalizatorului este mult mai mica decat 0 0 concentratiile initiale ale reacantilor deci C C <<C 0 R *C R , putem neglija 0 termenul la numitor in C C Astfel ca (1-10) devine: 0 0 o o Vo=(k1*k3* C R * C C *C R)/(k2+k1* C 0 (1-11) R +k3*CR ) 0 0 Valorile relative ale lui k3*C R ` si k2,k1*C R determina daca intermediarul X este de tip Arrhenius sau van`t Hoff si daca poate altera in mod sensibil cinetica reactiei. k1*C 0 Asftel daca k3*C 0 R ` <<k2 R ` intermediarul X este de tip Arrhenius si viteza initiala de reactie devine: 0 0 o Vo=(k1*k3* C 0 (1-12)Din care rezulta ca R * C C *C R)/(k2+k1*C R ) 0 0 V0 este proportionala cu C R ` si C C la puterea intaia, dar prezinta un ordin de reactie variabil in raport cu C 0 R .Deoarece in relatia de mai sus factorul 0 0 k1*C R (k1*C R ) este subunitar, viteza V0 trebuie sa fie mai mica decat viteza reactiei V1. k1*C 0 Daca k3*C 0 R ` >>k2 R , atunci x este un intermediar de timp Van`t Hoff si viteza reactiei V0 devine: 0 V0=k1*C 0 (1-13) R *C C Ceea ce ne arata ca viteza initiala a procesului este in acest caz egala chiar cu viteza v1 a primei reactii (de formare a intermediarului) din secventa (16). Etapa limitativa in acest caz o reprezinta formarea intermediarului X. Este de mentionat ca ecuatia (1-11) are aceasi forma cu cea dedusa pentru reactiile catalizate de enzime, iar ecuatia (1-12) este forma mai simpla dedusa de Michaelis-Menten. In expresia generala (1-11) daca una din concentraatii este marita sistematic intr-un setnde experimente spre de exemplu C 0 R si se masoara v0 se obtine o crestere a acesteia din urma pana se atinge o valoare maxima ceea ce inseamna ca ordinul in raport cu C 0 R va varia monoton de la valoarea unu la zero. O comportare similara se poate obtine si in raport cu C 0 R ` dar nu in 0 raport cu C C care avand o valoare foarte mica in raport cu reactantii ordinul fata de catalizator ramane unitar. Daca in setul de experiente 0 0 0 amintit se creste C 0 R viteza (V0)max=k3C R ` *C C , iar daca C R ` este variat , 0 (V0)max=k1*C 0 R *C C . Din aceste doua ecuatii cu doua necunoscute, k 1si k3 pot fi evaluate. Sa revenim la expresia vitezei initiale V0 data de ecuatia (110)scrisa sub forma sa reciproca: 0 0 0 0 0 0 1/vo=(k2+k1* C C +k3*C 0 (1-14) R ` )/(k1*k3*C R ` *C C *C R )+ 1/k3*C R ` * C C

0 0 Daca ne referim la varianta C C variabil si C C si C 0 R mentinute constante 0 0 atunci produsul k3*C R *C C este asa numita valoare initiala maima Vmax astfel ca ecuatia (1-14) poate fi scrisa: 0 0 1/vo=(k2+k1* C C +k3*C 0 R ` )/(k1*Vmax *C R )+ 1/Vmax (1-15) Cunoscuta sub denumirea de ecuatia lui Linewear-Burk mult aplicata in cinetica enzimatica din care se observa ca o reprezentare grafica 1/V0=f(C 0 R ) conduce la o dreapta a carei ordonata la origine este 1/V max iar panta 0 este (k2+k2*C C +k3*C 0 R ` )/k1*Vmax. Cum k1 si k3 au fost in prealabil 0 determinate asa cum s-a aratat anterior, iar C C si C 0 R sunt concentratiile cunoscute mentinute constante rezulta imediat posibilitatea evaluarii lui k2. Multe reactii sunt descrise satisfacator de ecuatiile (1-9) si (1-10) sa formele lor simplificate pintre care cele de cataliza eterogena si cele de cataliza enzimatica. Pentru mecanismul de tip 1 prezentat este caracteristic faptul ca viteza reactiei catalizate care decurge in cateva trepte nu poate depasi viteza procesului initial dintre reactant si catalizator. Aceasta inseamna ca pentru a avea loc cataliza, catalizatorul trebuie neaparat sa reactioneze mai rapid cu unul din reactanti decat aceasta ar reactiona cu celalalt reactant sau decat s-ar descompune. Acest fapt sta la baza unor legi de cataliza ca cea a lui Bronsted pentru cataliza omogena si se reflecta si in cele de cataliza eterogena, bunaoara in faptul ca viteza reactiei catalizate nu poate fi mai rapida decat viteza de chemosorbtie a reactantului.

2. Energia de activare in procesele catalizate rin mecanism 1 si 2 Pentru a stabili energia de activare in cazut proceselor catalitice care decurg prin cele doua mecanisme generale 1 si 2 se porneste de la concentratii mici. In aceste conditii in cadrul mecanismului 1 viteza reactiei in care este implicat un intermediar Arrhenius (1-12) devine: k1 k 3 0 0 V0= k 2 * C 0 (1-19) R *C R ` *C C Iar pentru intermediarul Van`t Hoff ramane ecuatia (1-13). Presupunand ca fiecare constanta de viteza a etapelor individuale asculta de legea exponentiala a lui Arrhenius, energia de activare totala E a reactiilor catalizate va fi: Ia(intermediar Arrhenius) E=E1+E3-E2 (1-20) Ib(intermediar Van`t hoff) E=E1 (1-21) Aceasta inseamna ca energia de activare determinata experimental pentru reactia catalizata este numai in cazul (Ib) egala cu intermediarul Arrhenius, la energia de activare a etapei determinate de viteza E3 se adauga diferenta E=E1-E2, adica tocmai caldura absorbita in reactia directa.In general reactiile de cataliza eterogena gaz-solid se incadreaza in cazul Ia. In cazul Ib energia de activare cea mai mare E1 este cea care se ia in considerare In cazul mecansmului II vom distinge de asemenea doua cazuri IIa si IIb.Pentru cazul IIa cu intermediar Arrhenius energia de activare E va fi: E=Ep+Ei-Et (1-22) Iar pentru IIb E=Ep+2=1/2(Ei-Em) (1-23) Obisnuit energia Ei este destul de mare desi mai mica decat cea corespunzatoare reactiei necatalizate; Ep este mica iar Et si Em sunt foarte mici. Pentru cazul IIa energia aparenta de activare va fi mai mare de cat a etapei ce-l implica direct pe catalizator, in timp ce in cazul IIb ea va fi donsiderabil mai mica.In cele mai multe reactii catalizate energia de activare este asa cum s-a mai afirmat mai mica decat a celor necatalizate si

cu cat mai mica cu cat catalizatorul este mai activ.Totusi nu intodeauna vitezele relative de reactie catalizate si necatalizata sunt date de raportul simplu
Vcat Vnecat

kcat knecat

=e

e Ecat / RT
Enecat / RT

(1-24)

Deoarece exista reactii catalizate la care energia deactivare nu variaza sensibil de la un catalizator la altul iar schimbarea vitezei se coreleaza mai bine cu variatia factorului preexponential A din ecuatia lui Arrhenius.

3. Constituentii enzimelor Enzimele sunt macromolecule proteice formate dintr-un lant poli aminoacidic pe care sunt grefate resturile de circa 20 aminoacizi intr-o anumita secventa. Fiecare centru chiral este de aceasi configuratie de obicei in S. In timp ce secventele resturilor de aminoacizi constituie structura primara activitatea catalitica a enzimei este in mare parte datorata numeroaselor legaturi intramoleculare ce rezulta din configuratia locala a asocierii polimerului prin interactii slabe(in special legaturi de hidrogen) cu formarea unor sturcturi elicoidale sau de alte forme infasurate( -helixstructura secundara). Oraganizarea de ordin si mai inalt (structura tertiara si cuaternara) rezulta din infasurarea si plierea -heliului secundar intr-o structura conformationala tridimensionala esentiala si specifica fiecarei enzime, prin combinarea multo interactiuni slabe, impreuna cu cateva legaturi covalente, datorata in special puntilor-S-S-. Acestea din urma se formeaza prin oxidarea a doua grupa tiolice de cisteina care pot face parte din doua lanturi diferite de polimer dar care au fost aduse intr-o proximitate

spatiala prin pliere. Sunt cunoscute cateva enzime formate prin asocierea a doua, patru sau mai multe unitati(lanturi polimerice). Cele mai multe dintre enzime au greutati moleculare de ordinul 105 si chiar >106 u.a.m, iar structura lor prezinta o complexitate enorma, motiv pentru care determinarea structurii a pus si pune probleme deosebit de dificile. Printr-o hidroliza foarte ingrijita( in parte folosind metode enzimatice) un lant poolipeptidic poate fi clivat in fragmente mai mici ce pot fi identificate prin tehnici cromatografice. Aceste informatii pot fi utilizate pentru deducerea secventei amino-acizilor. Structura tridimensio-nala poate fi obtinuta numai din crstalografie de raze x , ceea ce impune izolarea enzimei si obtinerea sa in forma cristalina pura. S-au stabilit pana in prezent structurile a peste 100 de enzime dar mai multe sunt prea instabile pentru a fi izolate. Mai mult structura moleculara in sine nu evidentiaza neaparat modul sau de actiune. Uneori norocul si sansa au adus la obtinerea unei structuri cristaline a unor enzime legate de substratul lor, sau de o molecula foarte asemanatoare cu acesta, dar numai putine astfel de exemple au fost pana acum gasite. In consecinta numai foarte putine mecanisme enzimatice au fost stabilite pana in prezent avand un grad acceptabil de incredere. Revenind la consti-tutia enzimelor se cunoaste ca multe dintre ele sunt formate dintr-o componenta proteica denumita si apoenzima si una sau mai multe componente neproteice denumite cofactori. Compleul apoenzima-cofactor, componenta proteica ramasa devine inactiva catalitic.Dintre cei doi constituenti ai holoenzimei, cofactorul determina tipul si viteza reactiei catalizate, adica imprima specificitatea de substrat. Apoen-zima avand natura proteica manifesta toate proprietatiile generale ale proteinelor:este capabila in anumite limite, de modificari conformationale stabileste legatura enzimei cu substratul manifesta afinitate de diferite grade pentru cofactor. Cofactorii enzimatici sunt reprezentati asa cum s-a aratat de componentele neproteice din enzima care pot avea o natura chimica foarte diferita si sunt absolut necesar pentru manifestarea activitatii catalitice a numeroase enzime. In functie de natura chimica si modul de legare la apoenzima, cofactorii se clasifica in: coenzime, grupari prostetice, ioni metalici. Coenzimele sunt compusi organici derivati in special de la vitamine care se ataseaza temporar de apoenzima fiind usor disociabili de aceasta. Ele pot trece usor de la o

apoenzima la alta, participand la transformarea altor molecule de substrat dupa terminarea unei reactii anumite. Astfel NAD+,NADP+,FMN,FAD,ATP,CTP,acidul lipoic, etc. Gruparile prostetice sunt molecule organice fixate pe apoenzima, care fiind legate de aceasta prin lega-turi covalente disociaza greu.Dintre gruparile prosteice se mentioneaza:TPP,hemul,piridoxalfosfatul. Gruparea prostetica imprima mecanismul unor procese enzimatice de tipul: transfer de electroni, de grupari NH2, de grupari acetil etc. Spre exemplu hemul continand ioni Fe2+ este o componenta a citocromilor(enzime ce transporta electroni) legata puternic de apoenzima prin legatpuri chimice cova-lente.Ionii metalici sunt absolut necesari pentru exercitarea funciei catalitice a unor enzime, participand in calitate de cofactori sau facand parte din structura acestora. Astfel de enzime continand unul sau doi ioni metalici sunt denumite si metal-enzime. Dintre ionii metalici participanti la activitatea enzimatica se amintesc: Ca2+,Mg2+,Mn2+, Cu2+,Zn2+,Fe2+(3+),Mo2+ ect.

4. Centrul activ al enzimei La formarea complexului enzima-substrat, in cursul unei reactii enzimatice, enzima nu participa decat cu o portiune limitata din structura sa numita centru activ sau centru catalitic. Aceasta regiune responsabila de activitatea catalitica contine grupari reactive capabile sa recunoasca substratul, sa-l atraga si sa-l fixeze molecular intr-o pozitie privilegiata si intr-un loc strict determinat. S-a emis ideea ca geometria centrului activ trebuie sa fie complementara cu aceea a substratului a carui transformare o

catalizeaza fiind necesara o potrivire a acestora asemanatorcheii de broasca (cheie-lacat). Aceasta complementaritate geome-trica permite substratului patrunderea in cavitatea centru-lui catalitic al enzimei si stabilirea legaturilor slabe in vede-rea formarii complexului intermediar enzima-substrat. In cazul enzimelor simple(formate numai din aminoacizi) centrul catalitic sau centrul activ este format dintr-o secven-ta de aminoacizi cu o anumita structura spatiala. Eficacita-tea centrului catalitic depinde de o parte de natura grupari-lor chimice functionale continute in centrul activ iar pe de alta parte de integritatea configuratiei spatiale a moleculei proteice care determina pozitiile relative ale acestor grupe funcionale. Daca enzima este denaturata, are loc modifi-carea conformatiei spatiale ceea ce conduce la sschimbarea pozitiei relative a resturilor de aminoacizi ce constituie centrul activ si ca urmare enzima isi pierde activitatea catalitica. Rezulta deci importanta structurii tertiare a prote-inei pentru activitatea sa enzimatica. Pentru enzimele simple centrul activ coincide si cu zona denumita situs catalitic, adica zona unde se gaseste secventa de aminoacizi implicati in activitatea catalitica. In cazul enzimelor com-plexe care contin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic si regiunea din molecula la care este atasat cofactorul deci: centrul activ=situs catalitic+cofactor. Organizarea structurala a enzimei Din punct de vedere al organizarii structural moleculare, enzimele se clasifica in urmatoarele grupe: enzime monomere, enzime oligomere si izoenzime.Enzimele monomere sunt cele constituite dintr-un singur lant polipeptidic in care este continut si situsul catalitic; au mase moleculare relativ scazute (13.000-35.000) si nu pot fi disociate in subunitati. Izoenzimele reprezinta forme moleculare multiple ale unor enzime ce catalizeaza aceeasi reactie, au originea in aceeasi celula, tesut sau lichid biologic, dar difera ca structura spatiala si proprietati fizicochimice(mobilitatea electro-foretica, pH optim de actiune, cinetica de reactie). Izoenzimele se datoresc diferentelor ce apar la nivelul structurilor polipeptidice cuaternare respectiv combinarilor diferite ale unor subunitati structurale de natura polipeptidica. Specificitatea enzimelor

S-a amintit anterior ca cea mai importanta deosebire dintre cataliza chimica si cea enzimatica se bazeaza pe inalta specificitate de actiune a enzimelor adica proprietatea de a actiona preferential asupra unui substrat sau grup de substraturi cu caractere chimice comune. Specificitatea de reactie se manifesta prin capacitatea unei enzime de a cataliza o reactie strict definita a unui substrat din mai multe posibile termodinamic.Aminoacidul este dezaminat oxidativ sub influenta aminoacid-oxidazei care catalizeaza specific aceasta reactie. O alta transformare posibila, decarboxilarea nu poate fi realizata cu ajutorul aceleiasi enzime si necesita un alt ferment ( decarboxilaza) iar o a treia enzima transaminaza mijloceste reactia cu acidul oxalilacetic ducand la schimbul de grupe funcionale (ceto-cu amino-).Se poate constata deci ca cele trei enzime mentionate prezinta o pronuntata specificitate de actiune ceea ce este valabil pentru toti biocatalizatorii.Ultimele doua enzime amintite au in plus si o coenzima comuna, piridoxalfosfatul ceea ce ne arata ca specificitatea de actiune nu se datoreaza gruparii prostetice, ci actiunii gruparii proteicei a moleculei.Specificitatea de substrat se refera la activitatea pe care o manifesta enzimele fata de anumite substraturi. Gradul specificitatii de substrat variaza in functie de enzima respectiva. Se deosebesc astfel:Specificitate absoluta- cand enzima actioneaza doar asupra unui singur substrat: invertaza (zaharaza) hidrolizeaza numai zaharoza, dar este inactiva asupra maltozei iar ureaza hidrolizeaza doar ureea fiind inactiva asupra derivatului sau melitat: H2N-C-NH2 ureazaCO2+2NH3
|| O

Arginaza catalizeaza doar hidroliza argininei la ornitina si uree

NH2 |

H | |

NH2

HN=C-NH-(CH2)3-C-COOH arginazaH2N-C-NH2+(CH2)3 | || | NH2 O CH-NH2 Uree | COOH .. ornitina -specificitatea de grup este caraceristica enzimelor care actioneaza asupra unei sserii de substante apropiate ca structura chimica. De exemplu pepsina catalizeaza scindarea tuturor tipurilor de proteine, dar este inactiva asupra substraturilor care nu sunt proteine.Amlaza catalizeaz amidonul; glicogenul si dextrinele, hexokinaza nactiva in alte manoze.-stereospecificitatea enzimelor se refera la activitatea enzimelor fata de anumite substraturi care sunt izomeri geometrici sau stereoizomeri optici. Drept eemplu se prezinta enzima fumaraza ce actioneaza numai asupra acidului fumaric (izomerul trans) si este inactiva asupra izomerului cis, acidului maleic. H COOH H COOH | | | | fumaraza C=C HOOC-C-C-H | | | | HOOC H HO H Acid acid Majoritatea bimoleculelor poseda atomi chirali putand exista sub forma de antipozi. Stereospecificitatea absoluta de substrat si de reactie se manifesta la acele enzime care ataca exclusiv unul din antipozii optici, lasandu-l pe celalalt neschimbat. De exemplu (lactatdehidrogenaza din muschi) catalizeaza doar oxidarea acidului L-lactic la acid piruvic. In cazul cand molecula substratului este simetrica iar produsul reactiei enzimatice contine un atom de carbon asimetric atunci enzima catalizeaza reactia in care se formeaza doar un singur izomer optic realizandu-se astfel o sinteza asimetrica absoluta ceea ce in cazul catalizatorilor chimici nu este posibil.

5. Factori care influenteaza cinetica reactiilor enzimatice -concentratia substratului si concentratia enzimei. Cinetica reactiilor enzimatice este dependenta de concentratia substratului, de concentratia enzimei si de concentratia inhibitorului.In conditiile mentinerii constante a uneia dintre concentratii si varierea celeilalte se constata cresterea vitezei de reactie cu cresterea concentratiei variabile pana la o anumita limita dupa care viteza ramane constanta. -influenta temperaturii La fel ca si in cazul reactiilor chimice viteza de reactie enzimatica creste cu marirea temperaturii dar nu numai in anumite limite. Urmarindu-se variatia vitezei de reactie in funcite de temperatura si reprezentand grafic se obtine o curba din care se observa ca pentru inceput viteza reactiei creste pana la o anumita valoare denumita temperatura optima (t0). Temperatura optima pentru majoritatea enzimelor este cuprinsa intre 30-40 *C. Marind in continuare temperatura se inregistreaza o diminuare progresiva a vitezei de reactie pana l o anulare a sa care se produce la o anumita temperatura, proprie fiecarei enzime si care se numeste temperatura de inactivare (ti). Diminuarea activitatii enzimei pana la anularea ei se explica prin denaturarea termica a enzimei al carei edificiu molecular este afectat. Deci enzimele sunt termolabile; incalzite dincolo de o anumita temperatura isi pierd ireversibil activitatea. Majoritatea

enzimelor sunt inactivate printr-o incalzire la temperaturi in jur de 80o C multe dintre ele prin incalzire chiar peste 55*C insa sunt si enzime care rezista la temperatura de 100o C. Temperatura de inactivare ca si cea optima este influentata de mai multi factori. Astfel enzimele pure sunt mai sensibile la inactivarea termica decat preparatele impure care contin o serie de substante ce exercita o actiune de pprotectie a moleculei de enzima. De asemenea in stare uscata enzimele rezista mai bine la temperaturi ridicate. Astfel se explica de ce maltul folosit la fabricarea berii desi a suferit temperaturi ridicate in ultima faza a operatiei de uscare mai contine o cantitate apreciabila de enzime deosebit de active.La temperaturi scazute in general enzimele au o activitate foarte lenta sau chiar nula dar prin ridicarea temperaturii ele devin din nou active. Multe din ele rezista chiar la temperatura aerului lichid (-191*C). O dovada a faptului ca frigul nu inhiba complet activitatea enzimelor sunt transformarile calitative( gust, miros, culoare) pe care le sufera alimentele congelate in timpul pastrarii lor in aceasta stare. -influenta pH-ului Toate reacrtiile enzimatice sunt puternic influentate de pH-ul mediului. Reactia are o viteza maxima pentru o anumita valoare a pH-ului sau pentru un interval foarte strans de pH, denumit si pH optim. Abateri de la aceste valori produc o scadere brusca a vitezei de reactie. Reprezentand grafic variatiile vitezei in functie de pH se obtine o curba in forma de clopot ingust.Valoarea pH-ului optim al diverselor enzime coincide in general cu pH-ul lichidelor din organism unde ele isi exercita actiunea. De exemplu, pH-ul optim al pepsinei este 1,5-2,5 realizat in sucul gastric de acidul clorhidric; al tripsinei este 8-11, identic cu pH-ul sucului pancreatic. Majoritatea enzimelor vegetale actioneaza bine la un pH in jur de 6-7. De asemenea pH-ul optim de activitate al unei enzime are o vloare caracteristica numai in conditii bine precizate. Aceste valor pot suferii variatii sub influenta a numerosi factori cum sunt:temperatura: la 40*C amilaza din malt are pH-ul optim 4,4 iar la 60*C pH-ul optim este de 6,6;substratul: maltaza are pH-ul optim pentru maltoza 6,0 iar pentru metilglucoza 6,7;-originea enzimei: amilaza din malt are pH-ul optim de actiune 5,2; cea din pancreas 7,0 iar cea din ficat 6,0.La majoritatea enzimelor intervalul de pH in interiorul caruia isi manifesta actiunea se

intinde pe cateva unitati de pH, de obicei 6-8. Abaterile de la acest interval conduc la imposibilitatea enzimei de a-asi mai exercita actiunea.