Replicarea ADN

Reprezint procesul de copiere fidel a succesiunii de nucleotide din

moleculele de ADN, deci a informaiei genetice, n scopul transmiterii
acesteia de-a lungul generaiilor celulare.
Procesul se desfoar n faza S a ciclului celular.
Este o reacie de polimerizare, are loc cu o rat de 500 nucleotide/secund
la bacterii i de 50 nucleotide/secund la celulele de mamifere.
Durata fazei S este de aproximativ 8 ore rezultatul fiind 2 cromozomi
perfect identici cu cel de origine, unii prin intermediul centromerului pn
n metafaza mitozei.
Duplicarea cromozomilor implic att replicarea moleculei lungi de ADN a
fiecruia, ct i asamblarea la ADN-ul nou format a noi proteine
cromozomiale, ceea ce duce la formarea cromatinei.
Viteza i acurateea sunt asigurate de o "main replicativ" complex,
reprezentat de un complex multienzimatic.

Fidelitatea replicaiei ADN

Secvena de nucleotide a ADN-ului (sau a unei secvene de ADN) este

duplicat prin mperecherea complementar de baze (A cu T i G cu C),
ntr-o secven nucleotidic complementar.
Procesul presupune recunoaterea fiecrui nucleotid i implic n mod
obligatoriu separarea tranzitorie a celor dou lanuri complementare ale
dublului helix de ADN, astfel ca gruprile acceptoare i donoare ale
fiecrei legturi de hidrogen ale bazelor azotate s apar expuse pentru
mperechere.
Procesul este catalizat de o enzim de polimerizare a nucleotidelor
denumit ADN-polimeraza.

ADN-polimeraza catalizeaz adiia "treapt cu treapt" a

dezoxiribonucleotidelor, la captul 3'-OH al unui lan polinucleotidic
preexistent (lanul primer) care se afl mperecheat la lanul matri.

n timpul replicaiei, fiecare caten veche de

ADN servete ca matri pentru sinteza unei
catene noi.
Astfel, secvena ADN de o lungime enorm
este replicat "semiconservativ" de ctre
ADN-polimeraz.

"Furca replicativ"

Denumit astfel deoarece regiunea aflat n replicare ce se mic de-a

lungul helixului de ADN parental are o form de Y.
La nivelul furcii replicative, helixul ambelor molecule noi de ADN este
sintetizat de un complex enzimatic extrem de sofisticat care conine i
ADN-polimeraza.

Iniierea replicrii

Shortcut to replication.lnk

Furca replicativ este iniiat la nivelul unor secvene speciale de ADN

numite origini de replicare;
replicare
Viteza de deplasare a furcii replicative este de 50 nucleotide/secund;
Pe cromozomii eucarioi exist mai multe origini de replicare care se mic
simultan;
Furcile replicative funcioneaz grupat fiind activate simultan cte 20-80 de
origini ce constituie uniti replicative;
replicative
n interiorul unei uniti replicative, fiecare origine de replicare este
separat de cealalt printr-un spaiu de 30.000-300.000 de nucleotide;
La fiecare origine de replicare se formeaz cte dou furci de replicare care
se mic n direcii opuse, pn ce se ntlnesc cu furca de replicare a originii
de replicare nvecinate care vine din direcie opus;

Replicarea pe lanul "tardiv"

ADN-polimeraza are nevoie pe lanul tardiv, din timp n timp, pe msur ce

furca se desface, de cte un capt 3'-OH nou;

Sinteza se face n salturi, la fiecare salt fiind necesar un nou primer ARN
sintetizat de o ARN-primaz;
Primerii ARN sunt secvene lungi de 10 ribonucleotide sintetizate la
intervale regulate pe lanul tardiv;
n momentul n care ADN-polimeraza ntlnete captul 5' al primerului
ARN din fragmentul anterior intervine o RN-az ce rupe fragmentele de
ARN primer iar spaiile rmase goale sunt ocupate de nucleotidele
corespunztoare;
Ultima etap este realizat de o ADN-ligaz ce sudeaz capetele
fragmentelor Okazaki;

Proteinele de la nivelul furcii replicative

Proteinele helix-destabilizatoare, numite i proteine SSB ("single-strand

DNA-binding proteins"), se leag la catenele de ADN desfcute din helix,
fr a acoperi bazele. Ele stabilizeaz forma desfurat a monocatenelor.

Corectarea erorilor de
replicare

Fidelitatea copierii ADN n cursul replicrii

nalt(max. 1 eroare/10 );
Formele tautomerice se pot mperechea greit; Ex:
forma tautomeric a C se mperecheaz cu A n loc de
G, ceea ce poate cauza o mutaie;
ADN-polimeraza ncepe sinteza unui polinucleotid de
la captul 3'-OH al unui primer ce este mperecheat cu
o secven complementar de pe lanul matri ;
Un nucleotid adugat greit (nemperecheat) nu poate
reprezenta capt de continuare a sintezei fiind tiat
de o subunitate a ADN-polimerazei ce are astfel o
activitate 3'5' exonucleazic ;

Proteinele de la nivelul furcii replicative

ADN-helicaza,
helicaza hidrolizeaz ATP
pentru a se mica rapid de-a lungul
unei monocatene de ADN;
ADN-topoizomerazele funcioneaz
ca "nucleaze reversibile ce determin
iniial ruperea dublei catene de ADN
"n amonte" de furca replicativ,
slbind tensiunea care s-a creat n
molecul i apoi legarea la loc a
capetelor libere;

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Etapele de la apariia unei leziuni n secvena ADN: recunoatere, evaluare (CP), rspuns (R, A);
Cile mecanismelor celulare de reparare ADN: excizia bazelor (BER), excizia nucleotidelor (NER),
excizarea mononucleotidic a bazelor mperecheate greit (MMR);

Rspunsurile la apariia unei leziuni n secvena ADN.

A. Post-recunoatere i evaluare are loc sinteza translezional
a ADN.
B. Repararea implic excizia bazelor i sinteza n condiiile
prezenei ADN-ului dublucatenar. Bazele mperecheate greit
- rezultate n urma erorilor din timpul replicrii ADN, sunt
excizate ca mononucleotide. O baz degradat este excizat fie
individual (reparare prin excizia bazelor) sau n cadrul unei
secvene
oligonucleotidice
(reparare
prin
excizie
oligonucleotidic).
C. Celula dispune de o reea complex de semnalizare ce
blocheaz ciclul celular, avnd n permanen la dispoziie
opiunea morii celulare programate. Imagine preluat din
articolul cu titlul: Defying death after DNA damage (Rich et
al., 2000a).

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Proteinele implicate n mecanismul MMR de reparare a erorilor (partea I).

Proteine

Funcii

MSH2-MSH6 (MutS)

Repararea erorilor de mperechere:

mperechere: eroare singular
singular de tip baz
baz-baz
baz i IDL de 11-2
baze

MSH2-MSH3 (MutS)

Repararea unor IDL singulare i unor IDLIDL-uri 2 baze.

baze. Ac
Aciune par
parial suprapus
suprapus
heterodimerului Msh2Msh2-Msh6

MLH1-PMS2
(MutL)

Mediator al evenimentelor:
evenimentelor: de la ata
ataarea la locusul mperecherii gre
greite a
omologilor MutS pn
pn la sinteza de reparare a ADN.
Are func
funcii i n recombinarea n meioz
meioz;

MLH1-MLH3
(MutL)

Repar
Repar: erorile singulare de tip baz
baz-baz
baz i IDL de 11-2 baze fiind un sistem de
rezerv
rezerv pentru MutL
MutL.
Principala func
funcie este legat
legat de recombinarea n meioz
meioz.

MSH4-MSH5

Repararea rupturilor ADNADN-ului dubludublu-catenar n meioz

meioz i mitoz
mitoz

EXO1

Excizia ADN dubludublu-catenar

ANKRD17

Supraexprimarea ANKRD17 promoveaz

promoveaz intrarea n faza S;
Deple
Depleia sa prin siRNA:
siRNA:
- blocheaz
blocheaz progresia ciclului celular;
celular;
- conduce la suprasupra-expresia p53 i p21;
- diminueaz
diminueaz nivelul de nc
ncrcare al proteinelor Cdc6 i PCNA pe molecula ADN
sugernd implicarea sa direct
direct n mecanismul replic
replicrii.
rii.

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Proteinele implicate n mecanismul MMR de reparare a erorilor (partea II).

II).
Proteine

Funcii

MLH1-MLH2
(hPMS1) (MutL)
Complexul RFC

La om nu se cunoa
cunoate func
funcia heterodimerului.
heterodimerului.

PCNA

Interac
Interacioneaz
ioneaz cu omologii MutS and MutL;
MutL;
Recrutez
Recrutez proteinele MMR la MM;
Augumenteaz
Augumenteaz specificitatea de legare la MM a Msh2Msh2-Msh6;
Particip
Particip la excizie i probabil la semnalizare;
semnalizare;
Particip
Particip la sinteza de reparare a ADN.

3_ exo a Pol
3_ exo a Pol

Excizia ADN monomono-catenar

ADN pol

Sinteza de reparare exact

exact a ADN

RPA
ADN ligaz

Particip
Particip la excizie i la sinteza ADN

ncarc
ncarc PCNA;
Moduleaz
Moduleaz polaritatea exciziei

Mutator sinergic cu Exo1 mutant

Sigileaz
Sigileaz molecula ADN prin formarea postpost-sintetic
sintetic a leg
legturilor fosfofosfodiesterice

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Principalii heterodimeri implicai n mecanismul MMR. A. Compoziia

heterodimerilor MutS i MutS. B. Compoziia heterodimerilor
MutL i MutS.

CAP.2. GENETICA SOMATIC A PROCESELOR MALIGNE COLORECTALE

2.7 Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare
Sistemul MMR uman reconstruit - etapele procesului de reparare.
MutS (sau MutS) legat la locusul unde s-a produs eroarea de tip MM
(triunghiul rou) recruteaz MutL. Acest complex sufer o schimbare
conformaional indus de ATP, rezultatul fiind deplasarea de la locusul
MM.
(a) Complexul ce se deplaseaz n direcia 5' ntlnete RFC legat la captul 5'
al catenei ntrerupte. Ulterior desprinde RFC de pe ADN i ncarc EXO1.
Exonucleaza activat ncepe degradarea catenei n direcia 5'3', monocatena
rmas fiind stabilizat de RPA. Dup nlturarea MM, EXO1 nu mai este
stimulat de MutS i este inhibat intens de MutL. ADN polimeraza este
ncrcat la captul 5' al discontinuitii iniiale unde se afl PCNA. Acest
complex particip la sinteza de reparare, fisura rmas ntre fragmente fiind
reparat de ADN ligaz.
(b) Complexul ce se deplaseaz n direcia 3' ntlnete molecula PCNA legat
la captul 3' al catenei ntrerupte. Recrutarea EXO1 conduce la degradarea
catenei dintre discontinuitatea original i MM, posibil prin cteva ncrcri
repetate ale EXO1. RFC este legat la captul 5' al discontinuitii pervenind
degradarea catenei (la distan de MM). Dup nlturarea MM activitatea
EXO1 este inhibat prin legarea sa de RPA i MutL, secvena lips fiind
sintetizat de ADN polimeraza i sigilat de ADN ligaza care finalizeaz
procesul de reparare. Imagine preluat din: The multifaceted mismatch-repair
system. Jiricny J. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 May;7(5):335-46.

Asamblarea histonelor pe parcursul

procesului de replicare

La eucariote ADN-ul este replicat n starea sa structurat sub form de

cromatin, deci complexat cu proteinele histonice.
Majoritatea organismelor posed copii multiple ale fiecrei gene
histonice(histonele fiind sintetizate aproape exclusiv n faza S a
ciclului celular);
Ipotez: n momentul cnd furca replicativ ajunge la nivelul
nucleozomului, se presupune c acesta se desface n doi "seminucleozomi" permind astfel ADN-polimerazei s copieze lanul
desfcut;

Ipotez: replicarea pe ADN-ul eucariot

organizat n cromatina nuclear