Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Curs.14.Ingineria Genetica Si Biotehnologiile Moderne
Curs.14.Ingineria Genetica Si Biotehnologiile Moderne
Tabelul 2.I
Enzimele folosite in tehnologia ADN recombinat
Enzima
Endonucleaze de
restrictie de tip II
ADN ligaze
ADN polimeraza I
(E.coli)
Reverstranscriptaza
Polinucleotid kinaza
Transferaza terminala
Exonucleaza III
Bacteriofag
exonucleaza
Fosfataza alcalina
Functia (Activitatea)
scindeaza ADN in secvente ce contin baze specifice
leaga doua molecule de ADN sau doua fragmente de ADN
foloseste in procesul de replicare semiconservativa a ADN
sintetizeaza o copie ADN pe matrita de ARN
fosforileaza unele lanturi polinucleotidice
transfera un homopolimer la gruparea 3-OH finala din
structura duplexului linear
scindeaza nucleotide reziduale din pozitia 3 finala a uneia
din catenele de ADN
scindeaza nucleotide din pozitia 5 terminala din ADN
bicatenar eliberand catena la pozitia 3 finala
scindeaza fosfatul terminal din fiecare capat 5 sau 3
terminal din amandoua catenele
In primul rand, endonucleazele de restrictie scindeaza (taie) molecula de ADN cand recunosc
anumite secvente specifice pentru a genera un set de fragmente de ADN mai mici.
In al doilea rand, fragmentul de ADN de clonat este izolat si legat de alt fragment de ADN care
este vectorul de clonare folosindu-se ADN ligaze.
Vectorul recombinat este apoi introdus intr-o celula gazda care il cloneaza pe masura ce celula
trece prin numeroase generatii de diviziune celulara.
3. VECTORII DE CLONARE IN TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT
3.1.CARACTERISTICI GENERALE ALE VECTORULUI DE CLONARE
Vectorul de clonare (vehiculul) reprezinta un element extracromozomial capabil sa se multiplice
si sa exprime o gena straina atasata de el in vitro, independent de cromozomul celulei gazda.
Operatia prin care o plasmida este convertita intr-un vector de clonare genica se numeste
constructia vectorului. Vectorul trebuie sa posede o serie de proprietati esentiale de care se tine
seama in alegerea si constructia lui:
Capacitatea de a se replica rapid si intr-un numar cat mai mare de copii in celula gazda
(30-50 copii/celula);
Dimensiune cat mai redusa (pentru a facilita patrunderea in celula gazda);
Capacitate cat mai ridicata de acceptare (vehiculare) a unei gene straine;
Sa nu contina in structura sa gene generatoare de efecte nedorite ( de exemplu, gene
inductoare de tumori);
Sa posede cel putin un marker genetic (de exemplu, gena rezistentei la anumite
antibiotice) care sa permita selectia celulelor ce contin ADN recombinat;
In tehnologia ADN recombinat se folosesc mai multe tipuri de vectori de clonare: plasmide,
bacteriofagi, cosmide si chiar cromozomi .
2
Multe metode sunt insa bazate pe utilizarea sondelor moleculare, ca de exemplu ARNm codat
de gena de interes, marcat radioactiv. Coloniile continand segmente de ADN neidentificate sunt
transferate pe filtre speciale (nitroceluloza) care au proprietatea de a fixa ADN. Celulele sunt lizate
in situ, ADN denaturat si filtrele sunt plasate in contact cu o solutie continand ARNm. Daca o
colonie contine plasmide asociate genei corespunzatoare, ARNm se ataseaza de ADN genei si
colonia astfel marcata este vizualizata prin autoradiografie (tehnica hibridizarii acizilor nucleici).
3.3. PRODUSELE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT
In mod normal, clonarea unei gene reprezinta numai primul pas intr-un proiect mai complex de
obtinere de proteine biotech. O gena clonata poate fi folosita pentru a genera proteine codificate
de ea, in cantitati mari. Secventa de aminoacizi a proteinei poate fi modificata operand schimbari de
baze in gena; aceasta strategie permite verificarea anumitor ipoteze privind structura si functia
proteinei. Metode din ce in ce mai sofisticate de transport de ADN in interiorul si in afara celulelor
de toate tipurile au deschis drumuri noi pentru studierea functiei si reglarii genelor si permit
introducerea de noi trasaturi la animale si plante [16,51].
Intelegerea metabolismului acizilor nucleici, a metabolismului proteic si a reglarii lor in
Escherichia coli a facut posibila exprimarea genelor clonate pentru a studia proteinele produse de
ele. Deoarece multe gene eucariote nu au promotorii necesari pentru exprimarea lor in E.coli,
trebuie inserate secvente de reglare de origine bacteriana pentru transcriere si traducere, in anumite
pozitii specifice in vectorul ADN fata de gena eucariota insasi. In unele cazuri, genele clonate sunt
exprimate atat de bine incat apare o supraproductie a proteinei respective, uneori reprezentand 10%
sau mai mult din productia totala de proteine celulare. O concentratie atat de mare de proteine poate
distruge o celula de E.coli, in aceste cazuri exprimarea genelor trebuie limitata la numai cateva ore
inainte de recoltarea celulelor. Vectorii de clonare care au semnalele de transcriptie si de traducere
necesare pentru exprimarea reglata a unei gene clonate sunt numiti vectori de expresie.
Au fost construiti multi vectori de expresie cu situsuri de restrictie specifice oentru clonare
plasate langa un promotor bine cunoscut ( cum este de exemplu promotrolul lac din E.Coli) si
elementele de reglare.
Structura unei proteine poate fi schimbata prin modificarea secventei de ADN a genei clonate
pentru acea proteina. Unul sau mai multi aminoacizi specifici pot fi inlocuiti prin mutageneza
directionata, ceea ce reprezinta una din metodele de varf pentru studierea structurii si functiei
proteinei [105].
4. PROCEDEE DE OBTINERE A INSULINEI PRIN INGINERIE GENETICA
Tinand cont de complexitatea sintezei insulinei in pancreas, obtinerea insulinei umane cu ajutorul
bacteriilor reprezinta intr-adevar o realizare deosebita. Trebuie precizat ca insulina produsa de
bacteriile modificate este absolut identica cu insulina umana pancreatica.
Exista in momentul de fata doua procedee de obtinere a insulinei umane cu ajutorul bacteriilor
modificate prin tehnologia clonarii genelor.
Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei, sintetizate
chimic, iar al doilea pe clonarea ADNc corespunzator proinsulinei.
In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E.coli.
A. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic
Din structura insulinei mature s-a dedus structura genelor corespunzatoare in baza echivalentelor
dictate de codul genetic.
In acest fel s-a stabilit ca pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide inlantuite in
mod specific, iar pentru catena B 90 de nucleotide cuplate. Proiectul sintezei celor doua gene a mai
4
prevazut atasarea la capetele lor a unor nucleotide care sa asigure, pe de o parte, cuplarea corecta a
genelor de vector si, pe de alta parte, prezenta semnalelor necesare pentru pornirea si oprirea exacta
a transcrierii genelor [50, 73, 74].
Pentru cuplarea corecta s-a prevazut adaugarea a 12 nucleotide, dintre care 6 asigura jumatate din
situsul enzimei de restrictie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide jumatate din situsul enzimei de
restrictie BamHI (figura nr.3.6).
La randul ei, pornirea este realizata de codonul ATG plasat la inceputul genei intre situsul
enzimei EcoRI si gena structurala; oprirea transcrierii este asigurata de doi codoni (TAA si TAG)
plasati intre capatul genei structurale si situsul enzimei de restrictie BamHI.
Gena A a fost obtinuta din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin metoda
fosfotriesterilor, iar gena B a fost obtinuta din 18 oligodeoxinucleotide diferite sintetizate prin
aceasi metoda chimica. Cele doua gene corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei mature au fost
apoi inserate independent de cate un vector de clonare genetica prevazut cu elementele de control
ale operonului lac.
Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea celulelor de
E.coli.
In celulele transformate ADN recombinat se replica. Sub controlul elementelor de reglaj ale
operonului lac se sintetizeaza complexul -galactozidaza-catena A a insulinei in celulele
transformate cu ADN recombinat continand gena A si complexul -galactozidaza-catena B in
celulele transformate cu ADN recombinat continand gena B a ainsulinei.
In final, cele doua catene ale insulinei sunt detasate de -galactozidaza cu ajutorul unui reactiv
chimic (BrCN) care actioneaza asupra metioninei situata exact la locul de jonctiune dintre cele doua
componente [73.96].
Dupa purificare, cele doua catene se amesteca si, prin simpla oxidare cu aer, ele se cupleaza prin
legaturi disulfurice, dand nastere insulinei, care este identica atat structural cat si functional cu
insulina umana.
In figura nr.3.6 sunt prezentate schematic etapele principale privind obtinerea insulinei umane cu
ajutorul tehnologiei ADN recombinat folosind genele catenelor A si B sintetizate chimic.
B. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat continand gena pentru proinsulina
Acest procedeu are la baza construirea unor plasmide care sa contina secventele (genele) care
codifica proinsulina sub forma de ADNc. Acest ADNc se poate sintetiza in vitro din ARNm pentru
proinsulina izolat din celulele beta din insulele Langerhans ale pancreasului. ARNm se izoleaza din
aceste celule, se purifica prin cromatografie pe oligo-dT-celuloza si este apoi utilizat la sinteza de
ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La inceputul lantului de ADNc se ataseaza codonul ATG
(sintetizat chimic) corespunzator metioninei. In acest fel are loc marcarea pentru ADNc si se asigura
si delimitarea galactozidazei de proinsulina, ceea ce usureaza procesul de purificare a proinsulinei
prin tratarea cu BrCN.
ADNc astfel pregatit este apoi cuplat cu vectorul plasmidic prevazut cu elementele de control ale
operonului lac continand o mica parte din gena structurala a galactozidazei.
ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E.coli. Celulele
transformate produc o proteina compusa prin -galactozidaza si proinsulina. Aceasta, tratata cu
BrCN, elibereaza proinsulina, care apoi este convertita in insulina matura pe cale enzimatica (figura
nr.3.7) [51,96].
Avantajele insulinei umane obtinuta prin ADN recombinat fata de insulina izolata din pancreasul
animal sunt: nu induce afectiuni oculare (retinopatie) si renale (nefropatie), nu provoaca alergii (fata
de 5% alergii la insulina animala), are un grad inalt de puritate, se poate obtine prin orice cantitate,
productia nu este dependenta de abatoare, care sunt aprovizionate discontinuu, iar testele clinice au
stabilit ca insulina umana obtinuta prin inginerie genetica este mai activa decat insulina umana.
Initialele NPH se refere la Neutral Protamine Hagedorn, nume care vine de la inventatorul
acestui preparat de insulina H.C.Hagedorn si este o suspensie cristalina neutra care este preparata
prin co-cristalizarea insulinei cu protamina.
Ambele formulari permit obtinerea unor profile prelungite privind relatia timp-actiune prin faptul
ca necesita dizolvarea unei forme precipitate si/ sau cristaline a insulinei. Aceasta dizolvare este
considerata a fi faza sau treapta care limiteaza viteza de biodiponibilitate a insulinelor cu actiune
intermediara si lunga.
In consecinta, profilul timp-actiune al formularilor este prelungit prin intarzierea ulterioara a
disocierii hexamerului in dimeri si monomeri. Protamina reprezinta un grup de proteine cu caracter
bazic puternic, grup de substante strans inrudite care sunt obtinute din sperma de peste.
In general, protamina este caracterizata printr-un numar de aproximativ 30 aminoacizi, dintre
care arginina este in proportie de 65-70% [16,20].
Folosind metodologiile de cristalizare propuse de Krayenbhl si Rosenberg se pot prepara in mod
corespunzator, din protamina si cristale de insulina, cristale de INSULINA NPH de forma
tetragonala cu volume curpinse intre 1 si 20 mm. Astfel aceste formulari au concentratii foarte mici
de insulina solubila si protamina.
Conditia la care in solutie nu mai exista protamina sau insulina masurabila, dupa cristalizare, este
denumita ca fiind punctul de isophane. De aceea INSULINA NPH se mai numeste INSULINA
ISOPHANE.
INSULINA NPH are o declansare a actiunii cuprinsa intre1-2 ore, o activitate maxima cuprinsa
intre 6-12 ore si o durata a activitatii de 18-24 ore.
Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate la relatia timp-actiune sunt datorate unor factori
cum ar fi : doza, locul injectarii, temperetura si activitatea fizica a pacientului.
INSULINA NPH poate fi amestecata usor cu INSULINA REGULAR fie ex tempore, de catre
pacient, fie in forma in care se obtine de la fabricant, respectiv sub forma unei formulari
preamestecate.
Insulina preamestecata, de exemplu NPH/REGULAR in raportul 70/30 sau 50/50, ofera
pacientului o ameliorare a exactitatii la dozare si, in consecinta, o ameliorare a controlului
glicemiei.
Au fost solutionate si controversele privind imunogenitatea la protamina. Astfel, pacientii care au
prezentat sensibilitate la protamina in cazul formularilor NPH au fost trecuti pe tratament cu
preparate de INSULINA LENTE sau INSULINA ULTRALENTE pentru a se putea controla
concentratiile bazale ale glucozei.
INSULINA LENTE este o suspensie de zinc-insulina care a fost conceputa pentru o singura
injectie zilnica. Ea este un amestec constituit din doua forme insolubile de insulina, 70% cristale
romboedrice de zinc-insulina (componenta ultralente) si 30% particule de insulina amorfa
(componenta semilente).
Formularea aceasta este un preparat neutru care contine tampon pe baza de acetat si un exces de
zinc. Surplusul de zinc se leaga la suprafata hexamerului insulinei, reducand astfel solubilitatea
insulinei si, in felul acesta, se produce o incetinire a profilului timp-actiune.
Volumul componentei cristaline ultralente este cuprins in mod obisnuit intre 200 si 1 000 mm.
INSULINA LENTE are o declansare a actiunii dupa 1-3 ore, activitatea maxima este intre 6-12
ore si durata actiunii revine la 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate in ceea
ce priveste profilul timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii,
temperatura si activitatea fizica a pacientului.
Capacitate de amestecare a INSULINA LENTE cu INSULINA REGULAR este limitata la
amestecurile ex tempore care sunt utilizate imediat dupa preparare.
5.3.FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI CU ACTIUNE PRELUNGITA