MD 3654 F1 2008.07.

31
REPUBLICA MOLDOVA

Date Bi bliogr af ice

(19) Agenia de Stat

pentru Proprietatea Intelectual

(11) 3654 (13) F1

(51) Int. Cl.: C07F 1/08 (2006.01)

C07C 281/16 (2006.01)

C07C 59/19 (2006.01)
C12N 1/14 (2006.01)
C12R 1/685 (2006.01)

(12)

BREVET DE INVENIE

Hotrrea de acordare a brevetului de invenie poate fi

revocat n termen de 6 luni de la data publicrii
(21) Nr. depozit: a 2008 0089
(22) Data depozit: 2008.03.27

(45) Data publicrii hotrrii de

acordare a brevetului:
2008.07.31, BOPI nr. 7/2008

(71) Solicitani: INSTITUTUL DE CHIMIE AL ACADEMIEI DE TIINE A MOLDOVEI, MD;

INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE I BIOTEHNOLOGIE AL ACADEMIEI DE TIINE A
MOLDOVEI, MD; INSTITUTUL DE FIZIC APLICAT AL ACADEMIEI DE TIINE A
MOLDOVEI, MD

(72) Inventatori: DONICA Ioana, MD; DESEATNIC Alexandra, MD; CIAPURINA Ludmila, MD; STRATAN
Maria, MD; TURT Constantin, MD; KRAVOV Victor, MD

(73) Titulari: INSTITUTUL DE CHIMIE AL ACADEMIEI DE TIINE A MOLDOVEI, MD; INSTITUTUL

DE MICROBIOLOGIE I BIOTEHNOLOGIE AL ACADEMIEI DE TIINE A MOLDOVEI,
MD; INSTITUTUL DE FIZIC APLICAT AL ACADEMIEI DE TIINE A MOLDOVEI,
MD

(54) Complexul cuprului cu aminoguanizona acidului piruvic, care posed

proprieti de stimulator al capacitii biosintetice la microorganisme

Rezum at

(57) Rezumat:

1
Invenia se refer la un compus nou din clasa de
compui coordinativi pe baz de cupru i aminoguanizon, care poate fi aplicat n calitate de
stimulator de cretere n diferite procese biotehnologice.
Esena inveniei const n obinerea compusului
bioactiv Cu2 ?-SO4- (Hagpa)2(H2 O)3, unde Hagpa
este aminoguanizona acidului piruvic monodeprotonat, care favorizeaz acumularea n mediul de
cultur a unor cantiti considerabile de amilaze

2
5

10

15

ordinare i stabile la acizi de ctre tulpina de fungi

Aspergillus niger 33-19 CNMN FD 02A in termeni
mai precoce. Compusul poate fi aplicat in
industriile farmaceutic, microbiologic, alimentar, n medicina veterinar n calitate de ingredient
la obinerea mediilor nutritive selective n cultivarea dirijat cu un coninut maxim prognozat de
enzime exocelulare.
Revendicri: 1
Figuri: 2

MD 3654 F1 2008.07.31
3
Descrie re

Descriere:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Invenia se refer la un compus nou din clasa de compui coordinativi pe baz de cupru i
aminoguanizon, care poate fi aplicat n calitate de stimulator de cretere n diferite procese biotehnologice.
Tulpinile de fungi din genul Aspergillus, Rhizopus, Penicillium reprezint surse valoroase de
diverse substane bioactive, inclusiv celulaze, pectinaze, amilaze, lipaze cu largi aplicri n industria
microbiologic, alimentar, etero-oleaginoas, vinicol, farmaceutic sau n producia de nutreuri.
Pentru creterea tulpinilor se utilizeaz medii standard, fr stimulatori speciali [1]. Mediile standard nu
asigur realizarea maxim a potenialului biosintetic al tulpinilor i obinerea randamentelor sporite de
biomas i enzime. Pentru a mri randamentul s-a propus de inclus n compoziia mediilor a
biostimulatorilor pe baz de compui coordinativi ai metalelor de tranziie cu diveri liganzi chelai. De
exemplu, sporirea biosintezei -glucozidazelor i xilanazelor de ctre tulpina de fungi Aspergillus
flavius BKM F 3292 D se poate realiza utiliznd compleci ai zincului cu aminoacizi optic activi [2].
Dezavantajul acestor biostimulatori const n faptul c pentru obinerea lor sunt necesari liganzi relativ
scumpi i mai greu accesibili. Au mai fost propui n calitate de biostimulatori compleci pe baz de
trans-dioximai de cobalt (III) cu diveri anioni n sfera exterioar. De exemplu, pentru tulpina Rhizopus
arrhizus productor de pectinaze fluorur-hexafluorosilicat-trans-dioximat de cobalt(III) [3], iar
pentru tulpina Aspergillus niger 33 CNMN FD 6 A productor de amilaze complexul analog cu
tetrafluoroborat [4]. Pentru unele tulpini din genurile Aspergillus, Rhizopus, Penicillium productori
de hidrolaze exocelulare, ca stimulator s-a manifestat fluorura-hexafluorofosfat-trans-dioximat de
cobalt(III) [5]. Ultimul compus coordinativ a fost selectat ca cea mai apropiat soluie. Dup cum se
vede din componena dioximailor, pentru sinteza acestor stimulatori se folosesc att srurile fluorului,
care atac vasele de sticl, ct i hexafluorsilicaii sau hexafluorfosfaii, care sunt mai puin accesibili i
sunt supui ntr-o oarecare msur hidrolizei.
Problema pe care o rezolv invenia propus este extinderea gamei de biostimulatori pentru specia
Aspergillus niger reprezentai de compuii coordinativi ai cuprului (II) cu aminoguanizona acidului
piruvic.
Problema se soluioneaz cu ajutorul noului compus cu formula Cu2 SO 4(Hagpa)23H2O, unde
Hagpa este aminoguanizona acidului piruvic monodeprotonat, i n care doi monocationi
Cu(Hagpa)(H2O)+ sunt legai n dimer prin puntea anionului de SO 42-.
Esena inveniei const n sinteza compusului bioactiv Cu2 SO4(Hagpa) 23H 2O, cu proprieti de
stimulator al capacitii biosintetice ale fungului Aspergillus niger, producent de amilaze, unde Hagpa
prezint aminoguanizona acidului piruvic. Utilizarea biostimulatorului revendicat n mediile de cretere
permite micorarea duratei de cultivare a producentului Aspergillus niger 33-19 CNMN FD 02A.
Rezultatul inveniei const n sporirea biosintezei amilazelor (ordinare cu 55,3% i acidstabile cu
42,3%); posibilitatea de a micora durata cultivrii producentului Aspergillus niger 33-19 CNMN FD
02A. Utilizarea compusului coordinativ Cu2SO4(Hagpa)23H 2O n concentraii mici (1 mg/1) asigur
accelerarea biosintezei amilazelor, ceea ce duce la acumularea n mediul de cultur n cantiti
considerabile a ambelor tipuri de amilaze in termene mai precoce (in ziua a 4-a, a 5-a) comparativ cu
variantele martor (in ziua a 6-a). Efectul biostimulator este cauzat de capacitatea elementelor chimice
indispensabile de a regla metabolismul microorganismelor.
Invenia se explic prin desenele din fig. 1 i 2, care reprezint:
- fig. 1, structura ? 2-(sulfato)-bis(aqua-(tiosemicarbazonei acidului piruvic)) -cupru(II);
- fig. 2, structura complexului [Cu2SO4 (Hagpa)2(H2O)2]DMSO ? 2(sulfato)-bis(aqua-(aminoguanizonei acidului piruvic))-cupru(II) dimetilsulfoxid.
Aminoguanizona acidului piruvic (H2agpa) face parte din clasa hidrazonelor R 2C=HHR2, derivaii
aldehidelor i cetonelor. Hidrazonele, inclusiv i aminoguanizonele, sunt bine cunoscute i studiate pe
larg ca ageni de chelatare a metalelor tranziionale, iar pentru o parte din complecii respectivi a fost
depistat un spectru larg de activitate biologic: antituberculoas, antiviral, anticancer, antifungic etc.
Studii mai depline au fost efectuate, n special, n seria combinaiilor complexe pe baza
tiosemicarbazonelor cu diferite metale 3d. ns pn n prezent nu au fost depistate proprieti de
biostimulatori pentru fungi. De exemplu, pentru compusul coordinativ cel mai apropiat dup structur
de compusul revendicat, [{Cu(Hpt)(OH2 )}2SO4] sau (?-sulfato)-bis(aqua-(tiosemicarbazona acidului
piruvic))-cupru(II) [M.B.Ferrari, G.G.Fava, C.Pelizzi, G.Pelosi, P.Tarasconi, Inorg. Chim. Acta, 269,
297 (1998)], cu structura prezentat n figura 1, n-au fost depistate proprieti de stimulator pentru
fungi, in special pentru genurile menionate mai sus, inclusiv Aspergillus.
n aceast structur a tiosemicarbazonei acidului piruvic s-a observat, de asemenea: un complex
dimer legat prin ionul de sulfat ca punte, dar SO 42- coordineaz n planul bazal cu doi atomi de
cupru(II), iar molecula de ap ocup poziia apical fa de ionul de cupru.

MD 3654 F1 2008.07.31
4

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Structura complexului revendicat s-a stabilit cu ajutorul spectroscopiei n infrarou (IR). n spectrul
IR al compusului revendicat deplasarea cu 110 cm-1 a vibraiilor v(N-H) in domeniul cu frecvena joas
se observ pentru grupa secundar NH la C=NH, ce confirm formarea legturii coordinative Cu
NH=C. Dovad a formrii acestei legturi la coordinarea ligandului (H 2agpa) cu cupru(II), precum i
formarea legturii coordinative ntre cupru i atomul de azot al grupei azometinice C=N este deplasarea
benzii azometinice v(C=N) n aria cu frecven joas cu 50...60 cm-1 pentru spectrele complecilor CuX
(Hagpa), (1542...1550 cm-1). Apariia benzii Cu-N la 420 cm-1 n spectrele complecilor i lipsa
acestei benzi n ligandul liber este un argument adugtor al formrii legturii coordinative Cu-N.
Banda grupei vas(C=O) la 1720 cm-1 n spectrele n IR ale ligandului liber lipsete la compleci. Banda
vs a grupei carboxilice (1385 cm-1) a ligandului H2agpa liber la coordonarea cu cupru se deplaseaz n
domeniul cu frecven joas cu 56...60 cm-1, ceea ce indic la faptul c ligandul coordineaz la cupru
prin atomul de oxigen al grupei carboxilice deprotonate.
Deoarece complexul Cu2SO4(Hagpa)2 3H 2O nu formeaz monocristale bune pentru elucidarea
structurii sale absolute cu ajutorul difraciei cu raze X, s-a recurs la sinteza unui derivat structural foarte
apropiat [Cu2SO 4(Hagpa)2(H2O)]DMSO, care formeaz cristale calitative pentru studiul cu raze X.
Ultimul se obine n aceleai condiii ca i compusul revendicat, unica deosebire const n aceea c
sinteza are loc n prezena metanolului i a dimetilsulfoxidului. n favoarea structurii propuse, pe lng
rezultatele spectroscopice pot fi aduse i datele privind descifrarea structurii complexului foarte
apropiat dup compoziie [Cu2 SO 4(Hagpa)2(H2O)2 ]DMSO.
Ca rezultat al studiului structural s-a stabilit c n cristalul complexului, rmi a aminoguanizonei
acidului piruvic (CH3-C[=N-NH-C(=NH)-NH2]-COO-) are o structur plat este un ligand
monodeprotonat tridentat (ONN), i la coordinare la Cu(II) formeaz dou pentametalocicluri. Ionul de
cupru(II) are nconjurare bipiramidal-ptratic (4+1+1). La baza bipiramidei mpreun cu atomii
donori ai ligandului (ONN) se situeaz i o molecul de ap coordinat. Anionul de sulfat execut
funcia de punte ca ligand exo-bidentat i coordineaz prin atomii de oxigen n direcia apical la dou
centre coordinative (ionii de Cu(II)). Ca rezultat se formeaz un dimer binuclear neutru. In cristal
numrul de coordinare al cuprului(II) se completeaz pn la 6 graie interaciunii slabe cu atomul de
oxigen al grupei carboxilice a ligandului de la dimerul invecinat. In complexul
[Cu2SO4(Hagpa)2(H 2O)2]DMSO ionul de cupru se afl practic n planul ecuatorial. Este cunoscut, c
bioactivitatea complecilor poate depinde de prezena ionilor metalelor de tranziie, de nuclearitatea lor
i crete semnificativ la utilizarea liganzilor chelai, iar capacitatea atomului de cupru de a completa
numrul su de coordonare pn la ase se presupune ca una din cauzele de majorare a bioactivitii.
Alt cauz poate fi structura dimeric a compusului revendicat datorit exercitrii de ctre anionul de
sulfat a funciei de punte. O alt particularitate a complecilor, ce poate influena asupra gradului de
bioactivitate, este sarcina unitii monomerice. n complexul [Cu2SO4(Hagpa)2(H2O)2]DMSO
monomerul este n form monocationic. Datele experimentale obinute mai sus confirm structura
dimeric a complexului revendicat conform formulei propuse.
Activitatea amilazelor ordinare s-a determinat n condiiile de hidroliz obinuit: pH 4,7, temperatura 30oC, timpul hidrolizei 10 min. Pentru determinarea activitii amilazelor acidstabile s-au utilizat
condiiile acido-extremale de hidroliz: pH 2,5, temperatura 30oC, durata hidrolizei 30 min.
Nivelul activitii s-a determinat dup degradarea amidonului solubil n molecule mici dextrine cu
mas molecular diferit. Activitatea maxim a amilazelor a fost nregistrat la utilizarea concentraiei
biostimulatorului de 1 mg/1.
Nivelarea activitii enzimatice ntre variante n ziua a 6-a de cultivare (termenul optim de
manifestare a maximului de biosintez enzimatic de ctre tulpina n studiu pe mediul de control)
permite de a presupune c metalocomplexul accelereaz fazele de dezvoltare ale microorganismului.
Un aspect pozitiv este micorarea duratei de cultivare a producentului Aspergillus niger 33-19
CNMN FD 02A, ceea ce este convenabil din punct de vedere economic in producerea preparatelor
enzimatice active cu aciune amilolitic.
Exemplu de realizare a inveniei
Sinteza complexului Cu2SO4(Hagpa)2(H2O)3.
Complexul Cu2SO4(Hagpa)2 3H 2O a fost obinut din metanol. Amestecul de 0,50 g (0,002 moli) de
CuSO4 5H2O i 0,29 g (0,001 moli) de H 2agpa25H2O ml metanol a fost nclzit cu reflux pe baie
marin timp de 30 min, pn la formarea unui praf cristalin de culoare albastr-deschis. Substana
format a fost filtrat i splat cu etanol, eter i uscat la aer. Randamentul 76%. Produsul este solubil
n ap.
Pentru Cu2SO4(Hagpa)2(H2O)3 : Gsit: C 16,9; H 4,1; N 20,1%; Calculat: C 17,05; H 3,58; N
19,88%.
Sinteza derivatului structural apropiat [Cu2SO4(Hagpa)2(H 2O) 2]DMSO, care formeaz cristale
calitative pentru studiul cu raze X, s-a efectuat pornind de la acelai raport sulfat de cupru/ligand, dar

MD 3654 F1 2008.07.31
5

10

15

20

25

spre deosebire de complexul revendicat, reacia s-a desfurat ntr-un amestec de solveni, i anume
dimetilsulfoxid/metanol, luai n raportul volumic de 1:4.
Studiul cu raze X pentru complexul [Cu2 SO 4(Hagpa)2(H2O)2 ]DMSO.
Structura molecular i cristalin a complexului [Cu2SO4(Hagpa)2(H2O)2]DMSO a fost efectuat
prin metoda analizei cu raze X. Rezultatele experimentale au fost obinute utiliznd difractometrul
Bruker-AXS SMART APEX inzestrat cu detector CCD la temperatura de 153K. Sursa de iradiere a fost
MoK (=0,7107 ). Setul de date experimentale s-a obinut, utiliznd un monocristal, cu dimensiunile
0,2x0,15x0,1 mm. Ca rezultat s-au stabilit datele cristalografice respective: singonia monoclinic,
grupul spaial de simetrie este C2/c, volumul celulei elementare 2139.99(17), numrul de uniti
structurale independente Z=4, (calc.)=1,935 pentru compoziia C 10H 24Cu2N8O11S2. Structura a fost
determinat prin metode directe i precizat prin tehnica matricei ptratelor minime, coordonatele
atomilor de baz fr hidrogen au fost precizate n varianta anizotropic n cadrul complexelor de
programe SHELX-97. Factorul de divergen R rezultat, obinut n baza a 2335 reflexe independente
este 0,0287.
Activitatea biologic:
Cultivarea tulpinii de fungi Aspergillus niger 33-19 CNMN FD 02A s-a realizat pe mediul utilizat
n cea mai apropiat soluie i n care suplimentar s-a introdus compusul Cu2SO4(Hagpa)23H2O,
raportul cantitativ al ingredientelor fiind (g): amidon 3,0; fin de fasole 9,0; tr de gru 18,0;
MgSO4 0,5; KH2PO4 2,0; KCl 0,5; Cu2 SO4(Hagpa) 23H2O 0,01...0,001, ap distilat pn la 1 l.
Cultivarea producentului se realizeaz n baloanele Erlenmayer de 0,5 l cu 0,1 l mediu nutritiv pe
agitator rotativ (180...200 rot./min), temperatura 28...30oC, durata cultivrii de 4, 5, 6 zile. n calitate de
material de inoculare s-a folosit suspensia apoas a sporilor culturii de 14 zile, crescute pe mediu malagar, luat n cantitate de 10% de la volumul inoculat al mediului nutritiv.
Activitatea amilazelor (ordinare i acidstabile) n lichidul cultural obinut la cultivarea tulpinii
Aspergillus niger 33-19 CNMN FD 02A pe mediul conform celei mai apropiate soluii i n variantele
optimizate cu adaosul compusului coordinativ Cu2SO4(Hagpa)23H2O se prezint n tabel:
Variantele mediilor

Conform celei mai

apropiate soluii
Conform inveniei
Cu2SO 4(Hagpa)23H2O

30

35

Concentraia de
biostimulator,
mg/1

1
5
10

Activitatea amilazelor
ordinare la a 4-a zi de
cultivare
Un./ml
% fa de
control
149,7
232,6
202,3
137,7

100,0
155,3
135,1
91,9

Activitatea amilazelor
acidstabile la a 5-a zi de
cultivare
Un./ml
% fa de
control
230,4
328,7
243,5
257,6

100,0
142,7
105,7
111,8

Dup cum urmeaz din datele obinute, compusul revendicat Cu2SO4(Hagpa)23H2O posed o
activitate biologic pronunat de stimulator al capacitii biosintetice pentru tulpina de Aspergillus
niger i poate s-i gseasc aplicare n diferite procese biotehnologice.

MD 3654 F1 2008.07.31
6

Reve ndi cr i

(57) Revendicri:
5

Complexul cuprului cu aminoguanizona acidului piruvic cu structura Cu2 ?-SO4- (Hagpa)2(H2O)3,

unde Hagpa reprezint aminoguanizona monodeprotonat a acidului piruvic, cu proprieti de
stimulator al capacitii biosintetice a fungilor Aspergillus niger 33-19 CNMN FD 02A.

10
Referin ebi bliografice

(56) Referine bibliografice:

1. MD 356 G2 1995.12.31
2. MD 1987 G2 2002.08.31
3. MD 1748 G2 2001.09.30
4. MD 2836 G2 2005.08.31
5. MD 2833 G2 2005.08.31

Director Departament:

JOVMIR Tudor

Examinator:

COLESNIC Inesa

Redactor:

Figuri

CANER Svetlana

MD 3654 F1 2008.07.31
7

Fig. 1. ? 2 -(Sulfato)-bis(aqua-(tiosemicarbazona acidului piruvic))-cupru(II)

Fig. 2. Structura complexului [Cu2 SO 4 (Hagpa)2(H2O)2]DMSO ? 2-(sulfato)-bis(aqua(aminoguanizonei acidului piruvic))-cupru(II) dimetilsulfoxid, (DMSO nu este prezentat, pentru a
simplifica desenul)