Analiza furosemidului

din comprimate

Poterai Ioana-Roxana, grupa 21;

Pucau Alexandra, grupa 21;
Rdoi Nicoleta-Alina, grupa 21.

Cuprins:
I)
II)
III)
IV)

Monografie F.Eur. pentru form farmaceutic (Comprimate);

Monografie F.Eur. i FR X pentru substana activ (Furosemid);
Monografie BP (British Pharmacopoea) pentru produs (Comprimate cu Furosemid);
Cromatografie lichid de nalt performan cu faz invers pentru cuantificarea

V)

furosemidului din comprimate i nanoparticule;

Rezultate i discuii.

I)

Monografie F.Eur. pentru forma farmaceutic

2

Comprimate
Definiie
Comprimatele sunt preparate solide fiecare coninnd o doz unic din una sau mai multe
substane active i de obicei se obin prin comprimarea unui volum uniform de particule.
Comprimatele sunt destinate pentru administrarea orala. Unele sunt nghiite ntregi, altele dup
ce au fost mestecate, unele sunt dizolvate sau dispersate in ap, nainte s fie administrate i
unele sunt meninute n gur, unde substana activ este eliberat.
Particulele conin una sau mai multe substane active cu sau fr excipieni, cum ar fi diluani,
liani, ageni de dezintegrare, ageni de alunecare, lubrifiani, substane capabile sa modifice
comportamentul preparatului n tractul digestiv, colorani autorizai de ctre autoritatea
competent i substane aromatizante.
Comprimatele sunt de obicei cilindrii solizi circulari, drepi, suprafeele de capt sunt plane sau
convexe si marginile pot fi rotunjite. Acestea pot avea linii sau pot fi nsemnate i pot purta un
simbol sau alte marcaje. Comprimatele pot fi acoperite. Unde este cazul, recipientele pentru
comprimate respect cerinele privind Materialele utilizate pentru fabricarea recipientului (3.1 i
subseciuni) si Recipiente (3.2 si subseciuni).
Cteva tipuri de comprimate cu administrare orala se pot clasifica n:
-comprimate neacoperite,
-comprimate acoperite,
-comprimate efervescente,
-comprimate solubile,
-comprimate dispersabile,
-comprimate orodispersabile,
-comprimate gastro-rezistente,

-comprimate cu eliberare modificat.

Producere
Comprimatele de obicei sunt preparate prin comprimarea unui volum uniform de particule sau de
agregate de particule produse prin metode de granulare. n fabricarea comprimatelor se iau
msuri pentru a se asigura ca acestea posed o rezisten mecanic adecvat pentru a preveni
surparea sau ruperea privind manipularea sau prelucrarea ulterioar. Acest lucru poate fi
demonstrat prin examinarea Friabilitatii comprimatelor neacoperite (2.9.7.) i Rezistena
comprimatelor la strivire (2.9.8.). Comprimatele masticabile sunt preparate pentru a asigura
faptul ca ele pot fi uor strivite prin mestecare.
Pentru comprimatele pentru care sunt autorizate subdiviziunile se demonstreaz, spre satisfacia
autoritilor competente, ca parile subdivizate respect fie testul A pentru Uniformitatea
continutului preparatelor cu doz unic (2.9.6.) fie cu testul pentru Uniformitatea masei a
preparatelor cu doza unic (2.9.5.) ca fiind apropiate.
n fabricarea, ambalarea, depozitarea i distribuirea comprimatelor, se iau mijloacele adecvate
pentru a asigura calitatea lor microbiologic; recomandarile n acest aspect sunt prevazute n
textul Calitatea microbiologica a preparatelor farmaceutice(5.1.4.).
Teste
Uniformitatea coninutului (2.9.6.) - Cu excepia cazurilor de prescriere, justificate sau
autorizate, comprimatele cu un coninut de substan activ mai mic de 2 mg sau mai
mic de 2 procente din masa totala se conform cu testul A pentru uniformitatea
coninutului a preparatelor cu doz unic.Cu exceptia cazurilor justificate si autorizate,
comprimatele acoperite, altele decat comprimatele filmate, se conformeaz cu testul A
pentru uniformitatea coninutului a preparatelor cu doza unic indiferent de coninutul
de substan activ.

Uniformitatea masei (2.9.5) - Comprimatele neacoperite, cu excepia celor justificate i

autorizate i comprimatele filmate se conform cu testul pentru uniformitatea masei a
4

preparatelor cu doz unic. Daca testul pentru uniformitatea coninutului este prescris,
justificat i autorizat pentru toate substanele active, atunci testul pentru uniformitatea
masei nu este necesar.

Dizolvare - Un test corespunator poate fi efectuat pentru a demonstra eliberarea

adecvata a substanelor active, de exemplu unul dintre aceste teste este descris in Teste de
dizolvare pentru forme de dozare solide (2.9.3).
Cand un test de dizolvare este prescris, testul de dezintegrare nu mai este necesar.

Comprimate neacoperite
Definiie
Comprimatele neacoperite includ tablete cu un singur strat rezultate dintr-o singur comprimare
a particulelor si comprimate cu mai multe straturi constnd din straturi concentric sau paralele
obinute prin compresii successive a particulelor cu diferite compoziii. Excipienii folosii nu
sunt destinai n special s modifice eliberarea substanei active n fluidele digestive.
Comprimatele neacoperite sunt conforme cu definiia generala a comprimatelor. O seciune
rupt, atunci cnd este examinat sub un obiectiv, arat fie o textur relativ uniform
(comprimatele cu un singur strat) sau o textur stratificat (comprimatele cu mai multe straturi),
dar nu arat niciun semn de acoperire.

Teste

Dezintegrarea - Comprimatele neacoperite se conform cu testul pentru dezintegrarea

comprimatelor si capsulelor (2.9.1). Se folosete apa R ca lichid. Se ataseaz cate un test
la fiecare tub. Se lucreaz la aparat 15 minute, cu excepia cazurilor justificate sau
autorizate, i se examineaz starea comprimatelor. Daca comprimatele nu sunt conforme
din cauza aderenei discurilor, se repet testul mai departe cu 6 comprimate omind
discurile. Comprimatele sunt conforme cu testul dac toate cele 6 s-au dezintegrat.
Comprimatele masticabile nu e necesar s fie conforme cu testul.
5

Comprimate acoperite
Definiie
Comprimatele acoperite sunt comprimate acoperite cu unul sau mai multe straturi formate dintrun amestec de diferite substane cum ar fi din raini naturale sau sintetice, gume, gelatine,
umpluturi inactive i insolubile, zaharuri, plastifiani, polioli, cear, colorani autorizai de
autoritai competente si cteodat substane aromate si substane active. Substanele folosite
pentru acoperiri sunt de obicei aplicate ca soluie sau suspensie n condiiile n care are loc
evaporarea vehicului. Cnd acoperirea este format dintr-un strat subire de polimer,
comprimatele sunt cunoscute ca fiind comprimate filmate.
Comprimatele acoperite au o suprafa neted care adesea este colorat i poate fi lustruit; o
seciune spart, cnd este examinat sub un obiectiv, se observ un miez nconjurat de unul sau
de mai multe straturi continue cu texturi diferite.
Producere
n cazul n care se justific, uniformitatea masei sau uniformitatea coninutului comprimatelor
acoperite, altele dect comprimatele filmate, poate fi asigurat de controlul miezurilor.
Teste

Dezintegrare - Comprimatele acoperite, altele decat comprimatele filmate, sunt conforme

cu testul pentru dezintegrare a comprimatelor si capsulelor (2.9.1). Se folosete apa R ca
lichid. Se adaug un disc fiecarui tub. Se opereaz aparatul pentru 60 de minute, cu
excepia cazului n care se justific i se autorizeaz i se examineaza starea
comprimatelor. Daca niciuna dintre comprimate nu s-a dezintegrat se repet testul mai
departe cu 6 comprimate, nlocuindu-se apa R cu acid clorhidric 0.1 M. Comprimatele
corespund cu testul daca toate 6 s-au dezintegrat in mediul acid.
Comprimatele filmate corespund cu testul de dezintegrare prescris mai sus, ns aparatul
opereaz 30 de minute, cu excepia cazului n care se justific sau se autorizeaz.
Dac comprimatele acoperite sau comprimatele filmate nu corespund din cauza aderenei
dintre discuri, se repeat testul pentru nc 6 comprimate neglijnd discurile.
Comprimatele corespund cu testul dac toate cele 6 s-au dezintegrat.
Comprimatele acoperite masticabile nu trebuie sa corespunda cu testul.
6

II) Monografie F.Eur. i F.R. X pentru substana activ

A) Farmacopeea European
Definiie
Furosemid conine nu mai puin de 98,5 % i nu mai mult decat echivalentul a 101,0 % din
acidul 4-cloro-2-[( furan-2-metil)amino]-5-sulfamoilbenzoic,calculate cu referire la substana
uscat.
Caracteristici
Pulbere alb sau aproape alb, cristalin, practic insolubil in ap, solubil n aceton, greu
solubil n alcool, practic insolubil n clorur de metil. Se dizolv n soluie diluat de hidroxizi
alcalini.
Se topete la aproximativ 210C, cu descompunere.
Identificare
Prima metod de identificare: B
A doua metod de identificare: A,C
A. Se dizolv 50 mg in 4 g/l soluie de hidroxid de sodiu R i se dilueaz la 100 ml cu aceeai
soluie alcalin. Se dilueaz 1 ml soluie la 100 ml cu 4 g/l soluie hidroxid de sodiu R. Examinat
ntre 220 nm i 350 nm (2.2.25), soluia prezint 3 maxime de absorbie. Raportul dintre
absorbana msurat la maximul de 270 nm i cea masurat la maximul de 228 nm este cuprins
ntre 0,52 i 0,57.
B. Absorbia examinat la spectrofotometria cu IR, comparat cu spectrul obinut cu furosemid
CRS.

C. Se dizolv aproximativ 25 mg n 10 ml alcool R. La 5 ml se adaug 10 ml apa R. La 0,2 ml

din aceast soluie se adaug 10 ml de acid clorhidric diluat R i se inclzete la un condensator
cu reflux timp de 15 minute. Se las s se raceasc i se adaug 18 ml de hidroxid de sodiu 1M
i 1 ml de nitrit de sodiu R,soluie 5 g/l. Se las n repaus timp de 3 minute i se adauga acid
sulfamic R, soluie 25 g/l, apoi se agit. Se adaug 1 ml diclorhidrat de naftiletilendiamina R,
soluie 5 g/l. Apare o coloraie rou-violet.
Teste

Substante nrudite

Examinare prin cromatografia de lichide (2.2.29). Prepararea soluiilor imediat nainte de

utilizare i ferit de lumin.
Soluia test. Se dizolv 50.0 mg de substan pentru a fi examinat n faza mobil i se dilueaz
la 50.0 ml cu faza mobil.
Soluia de referin (a). Se dizolv 20.0 mg impuritate furosemid A CRS n faza mobil i se
dilueaz la 20.0 ml cu faza mobil.
Soluia de referin (b). Se dilueaz un amestec format din 1.0 ml soluie test i 1.0 ml soluie de
referin (a) la 20.0 ml cu faza mobil. 1 ml din aceast soluie se dilueaz la 20.0 ml cu faza
mobil.
Procedura cromatografic poate fi realizat utiliznd :
-o coloan din oel inoxidabil cu lungimea de 0.25 m i diametru intern de 4.6 mm impachetat
cu octylsilyl silica gel pentru cromatografie R (5 m),
-ca faza mobil cu un debit de 1 ml pe minut, un amestec preparat n urmtoarele condiii: se
dizolv 0.2 g dihidrogenofosfat de potasiu R i 0.25 g cetrimid R n 70 ml ap R; se ajusteaz la
pH 7.0 cu amoniac R i se adaug 30.0 ml propanol R,
- ca detector un spectrofotometru setat la 238 nm.
Injectai 20 l din soluia de referin (b).Reglai sensibilitatea sistemului astfel ncat nlimile a
dou vrfuri de pe cromatograma obinut s nu fie mai puin de 20 % din scala complet a
8

nregistrrii. Testul nu este valabil dect dac rezoluia ntre primul vrf ( furosemid impuritate
A) i al 2 lea vrf (furosemid) este de cel puin 4.
Se injecteaz 20 l din soluia test. Se continu cromatografia de trei ori timpul de retenie al
maximului principal. n cromatograma obinut a soluiei test: aria oricrui maxim,excepie
maximul principal, nu este mai mare dect aria primului maxim al cromatogramei obinute cu
soluia de referin (b) (0.25 %); Suma ariilor tuturor maximelor,cu excepia ariei maximului
principal, nu este mai mare dect dublul ariei primului maxim obinut la cromatograma soluiei
de referin (b) (0.5%).
Nu se iau n considerare vrfurile cu aria mai mica de 0.1 ori aria primului vrf obinut n
cromatograma soluiei de referin (b).

Cloruri(2.4.4). La 0.5 g se adaug un amestec format din 0.2 ml acid nitric R i 30 ml

ap distilat R i se agit timp de 5 minute. Se las n repaus timp de 15 minute, apoi se

filtreaz. 15 ml filtrat conform cu testul limit pentru cloruri (200 ppm).

Sulfai(2.4.13). La 1.0 g se adaug un amestec format din 0.2 ml acid acetic R i 30 ml
ap distilat R i se agit timp de 5 minute. Se las n repaus timp de 15 minute, apoi se

filtreaz. 15 ml filtrat conform cu testul limit pentru sulfai (300 ppm).

Metale grele(2.4.8). 1.0 g conform cu testul limit C pentru metale grele (20 ppm). Se

prepar standardul folosind 2 ml soluie standard de plumb (10 ppm Pb) R.

Pierdere prin uscare (2.2.32). Nu mai mult de 0.5% , determinat pe 1.000 g prin uscare

ntr-un cuptor la o temperatur cuprins ntre 100-105C.

Cenu sulfatat(2.4.14). Nu mai mult de 0.1%, determinat pe 1.0 g.

B) F.R. X
FUROSEMID - C12H11ClN2O5S
Furosemida este acid 4-cloro-N-furfuril-5-sulfamoilantranilic. Conine cel puin 99,0% i cel
mult 101,0% C12H11ClN2O5S raportat la substana uscat.
Descriere. Pulbere cristalin alba sau aproape alba,fr miros, cu gust slab acru (IX. B). La
lumin se coloreaz n galben.
9

Solubilitate. Solubil n aceton, dimetilformamid i metanol, puin solubil n alcool, greu

solubil n eter, foarte greu solubil n cloroform, practic insolubil n ap (IX.C.1). Se dizolv n
soluii de hiroxizi alcalini.
Identificare

Spectrul n infrarou trebuie sa corespund celui obinut cu furosemid (s.r.) prin

dispersie n bromur de potasiu (R) (IX.C.24.2).

Spectrul n ultraviolet al soluiei 0,0005% m/V n hidroxid de sodiu 0,1 mol/l
prezint dou maxime: la 228 nm i la 271 nm (IX.C.24.1).

La 10 mg furosemid se adaug 10 ml acid clorhidric 100 g/l (R) i se nclzete pe baia de

ap timp de 15 min. Dupa racire se adaug 5 ml nitrit de sodiu ( R ) 1 g/l i se las n repaus
timp de 3 min. Se adaug 5 ml acid sulfamic-soluie (R) , se agit energic i dup 2 min se
adaug 5 ml diclorhidrat de N-(1-naftil)-etilendiamin (R) 1g/l; apare o coloraie roie pn
la rou-violet.
Aspectul soluiei. 0,10 g furosemid se dizolv ntr-un amestec format din 0,5 ml hidroxid de
sodiu 1 mol/l i 9,5 ml ap; soluia trebuie s fie limpede i incolor. O eventual coloraie nu
trebuie s fie mai intens dect coloraia unei soluii-etalon preparate din 0,02 ml cupru-E.c.,
0,10 ml fer-E.c. i ap la 10 ml. (IX.C.2).
Cloruri. Cel mult 0,02%.
0,10 g furosemid se agit timp de 5 min cu 10 ml ap i 0,5 ml acid nitric 250 g/l (R). Se
filtreaz, se completeaz cu ap la 10 ml i se compar cu 2 ml soluie-etalon completat cu
ap la 10 ml (0,02 mg ion clorur) (IX.C.13).
Metale grele. Cel mult 0,001%.
Reziduul de la calcinare, prelucrat conform prevederilor de la Controlul limitelor pentru
impuriti anorganice (IX.C.13) i completat cu ap la 10 ml , se compar cu 10 ml soluieetalon (0,01 mg ion plumb).
Acid 4-cloro-5-sulfamoilantranilic. 40 mg furosemid se aduc ntr-un balon cotat de 100 ml ,
se adaug 10 ml dimetilformamid (R) i se agit timp de 5 ( soluia 1).
10

Se introduce balonul cotat ntr-un vas cu ghea i se adaug, sub agitare, 24 ml ap, 2 ml
nitrit de sodiu (R) 5 g/l, 4 ml acid clorhidric 1 mol/l i se las n repaus timp de 3 min. Se
adaug 2 ml sulfamat de amoniu (R) 25 g/l i se agit energic timp de 3 min. Se scoate
balonul din vasul cu ghea, se adaug 2 ml diclorhidrat de N-(1-naftil)-etilendiamin (R) 5
g/l soluie proaspt preparat, se agit i se completeaz cu dimetilformamid (R) la 100 ml.
Soluia se centrifugheaz (soluia-prob).
n paralel, se efectueaz determinarea cu o soluie-etalon preparat astfel: 50 mg acid 4cloro-5-sulfamoilantranilic (s.r.) se dizolv ntr-un amestec format din un volum
dimetilformamid (R) i dou volume ap i se completeaz cu acelai amestec la 25 ml ,
ntr-un balon cotat. 2,5 ml din aceast soluie se dilueaz cu acelai amestec de solvent la 50
ml ntr-un balon cotat. 2 ml din aceast soluie se aduc ntr-un balon cotat de 100 ml i se
prelucreaz n aceleai condiii cu soluia 1.
Se determin absorbanele soluiei-prob i soluiei-etalon la 530 nm, folosind ca lichid de
compensare o soluie obinut n aceleai condiii i din aceiai reactivi cu soluia-prob
(IX.C.24.1).
Pierdere prin uscare. Cel mult 0,5%.
0,5 g furosemide se usuc la 105C pn la mas constant (IX.C.15).
Reziduu prin calcinare. Cel mult 0,1 %.
1 g furosemid se calcineaz cu acid sulfuric (R) (IX.C.17).
Dozare. 0,5 g furosemid se dizolv n 40 ml dimetilformamid (R), n prealabil neutralizat
la albastru de bromtimol-soluie (I) i se titreaz cu hidroxid de sodiu 0,1 mol/l pn la
coloraie albastr. 1 ml hidroxid de sodiu 0,1 mol/l corespunde la 0,03307 g C12H11ClN2O5S.
Conservare. n recipient bine nchise, ferit de lumin. Separandum.
Aciune farmacologic i ntrebuinri. Diuretic.

III) Monografie BP pentru produs

11

Aciune si utilizri: diuretic de ans.

Definiie. Furosemid comprimate ce conin furosemid.
Comprimatele se supun cerinelor stabilite in monografia de comprimate care conine
urmatoarele cerine:
Coninut de furosemid: 95.0 pn la 105.0 % din cantitatea declarat.
Identificare:
A) Absorbia luminii, anexa II B, n intervalul 220 - 320 nm al soluiei finale obinut n
test, ce prezint 2 maxime, unul la 228nm si cel de-al doilea la 271nm.
B) n testul pentru substane nrudite, principalul vrf n cromatogram, obinut cu soluia (2)
arat un pic cu acelai timp de retenie ca i cel principal obinut cu soluia (3) n
cromatogram.
Teste

Dizolvare

Comprimatele ce conin mai puin de 100 mg de furosemid, conform cerinelor din monografia
coninuta de Farmacopeea Britanic pentru testul de dizolvare pentru capsule i comprimate,
anexa XII B1, folosind Aparatul 2. Se folosete ca mediu: 900 ml tampon fosfat la ph=5,8 i
paleta este setat la 50 rpm. Se prelev o prob de 10 ml din mediu, se filtreaz i se dilueaz
filtratul cu o cantitate suficient din mediul de dizolvare pentru a obine o soluie care s conina
aproximativ 0,001% m/v de furosemid. Se msoar absorbana acestei soluii, anexa IIB, la 227
nm utiliznd ca mediu de dizolvare n celula de referin. Se calculeaz coninutul total n
furosemid,C12H11CLN2O5S, n mediul n care s-a obinut absorbana de la o soluie 0,001%
m/v de furosemid BPCRS n mediul de dizolvare i folosind coninutul declarant pentru
C12H11ClN2O5S n furosemid BPCRS.

Substane nrudite

12

Se folosete metoda de la lichid cromatografie, anexa III D, folosind urmtoarele soluii, care se
prepar imediat nainte de utilizare i se feresc de lumin. Pentru soluia (1) se dizolv o cantitate
din comprimatele triturate (pudr) ce conin 20 mg furosemid n suficient faz mobil pentru a
obine 50 ml i se amestec cu ajutorul ultrasunetelor timp de 15 minute. Pentru soluia (2) se
dilueaz 1 volum de soluie (1) la 500 de volume, cu faza mobil. Soluia (3) conine 0,00008%
m/v de furosemid BPCRS n faza mobil. Soluia (4) conine 0,00008%

m/v din fiecare

furosemid BPCRS i furosemid impuriti A EPCRS n faza mobil. Soluia (5) care conine
0,00032 % m/v de acid 4-cloro-5-sulfamoil antranilic BPCRS n faza mobil.
Metoda cromatografic poate fi efectuat folosind:
a) O coloan din oel inoxidabil (25cm x 4,6mm) umplut cu octailsilil silicagel pentru
cromatografie (5 micrometri) (ChromSpher C8 este potrivit);
b) Ca faz mobil cu o rat de curgere de 1ml/min se prepar un amestec n modul urmtor:
se dizolv 0,2 g orto-fosfat dihidrogenat de potasiu i 0,25 g de cetrimid n 70 ml de ap
i se ajusteaz la ph = 7 cu amoniac 6M i se adaug 30 ml de propan 1-ol i
c) Se face detecia la o lungime de und de 238 nm.
Apoi se injecteaz 100 microlitrii de soluie (4) , se regleaz sensibilitatea sistemului astfel
nct nlimea celor 2 picuri obinute n urma cromatografiei nu sunt cu mai puin de 20%
fa de ntreaga scal a aparatului de nregistrare. Testul nu este valabil dect dac factorul
rezoluiei dintre primul pic (furosemid impuritate A) i cel de-al doilea pic (furosemid) este
cel puin 4.
Se injecteaz 100 microlitrii de soluie (1) i se permite cromatografului s desfoare de 3
ori timpul de retenie al primului pic. n cromatograma obinut prin folosirea soluiei (1)
zona oricrui pic ce corespunde pentru acid 4-clor-5-sulfamoil antranilic nu e mai mare dect
zona picului obinut prin cromatografie cu soluia (5) (0,8%), iar suma zonelor oricror picuri
secundare nu este mai mare de 2,5 ori dect zona primului pic obinut cu soluia (4) (0,5%).
Nu se ia n calcul niciun pic cu o zon mai mica de 0,1 ori fa de zona primului pic obinut
cu soluia (4) (0,02%).

Analiza
13

Se cntresc i se tritureaz 20 de comprimate pn se obine o pudr. Se amestec o cantitate de

pudr ce conine 0,2 g furosemid cu 300 ml de soluie NaOH 0,1M pentru 10 minute. Se adaug
apoi NaOH 0,1M suficient pentru a obine 500 ml i se filtreaz, apoi se dilueaz 5 ml la 250 ml
cu o soluie de NaOH 0,1M i se msoar absorbana soluiei ce rezult la un maxim de 271nm,
anexa IIB. Se calculeaz coninutul de C12H11ClN2O5S considernd 580 valoarea lui A (1%, 1cm)
pentru un maxim de 271 nm.

IV) Cromatografie lichid de nalt performan cu faz invers pentru cuantificarea

furosemidului din comprimate i nanoparticule
1)INTRODUCERE
Furosemid (FUR) , diuretic de ans ce a fost folosit n tratamentul insuficienei cardiace
congestive i edem. FUR acioneaz la nivelul ansei Henle, respectiv a poriunii terminale a
acesteia determinnd pierderi de sodiu, potasiu i cloruri care sunt eliminate n urin. Aceste
aciuni au ca rezultat o scdere a reabsorbiei de sodiu i cloruri, crescnd n acelai timp excreia
de potaiu n poriunea distal a tubului renal. Efectul diuretic al FUR administrat oral apare n 30
de minute pn la o or i este maxim n prima sau a doua or . Pentru tratamentul bolilor de
inim doza uzual este de 20-80 mg pentru adult. Pentru uz pediatric dozele variaz de la 1
mg/kg pn la maxim 40 mg/zi pentru nou-nscui.
FUR a fost raportat ca fiind agentul etiologic responsabil pentru pierderea permanent
neurosenzorial a auzului. Studii recente au demonstrat c FUR scade mecanismul activ cohlear
prin reducerea i modificarea pragului n urma unui zgomot continuu n band larga. Prin urmare
scade att mobilitatea membranei bazilare cohleare ct i a transduciei care n mod normal
rezult din unirea stereociliei (grmezi de cili) cu celulele de pr. n urma acestor constatri,
FUR poate fi considerat un model de medicament care atac urechea intern. Poate fi de
asemenea o potenial modalitate de a nelege mecanismul molecular al substanelor
medicamentoase ototoxice. Toate observaiile anterioare indic faptul c o utilizare ndelungat a
FUR poate duce la ototoxicitate n rndul oamenilor.
La oareci volumul mediu al urechii interne este de 9.7 0.2 L, la purceluii de Guineea
volumul perilimfei este: 15.94 L, iar volumul mediu al lichidului urechii interne este 80.2 L.
14

Pe lng volumul mic de lichid cohlear, o mic modificare a volumului poate avea un impact
major asuprea sensibilitii auzului.
Dezvoltarea i validarea unei metode analitice pentru determinarea FUR n lichidele biologice
folosind o prob mic de volum sunt foarte importante i urgent de realizat pentru cercetarea
tiinific. Mai multe metode incluznd titrimetria, detecii optice i electrochimice li
electroforez capilar au fost folosite pentru cuantificarea FUR. Extracia lichid-lichid, urmat de
evaporarea solventului, a fost folosit pentru pregtirea probelor n analiza cromatografic a
diureticelor i a probenecidului n probe biologice. Unele rapoarte au relevat probleme
nesoluionate n ceea ce privete precizia, timpul consumat i pierderea unor compui de interes.
Alte studii au propus folosirea cromatografiei lichide micelare pentru determinarea diureticelor
ca FUR n prepararea farmaceutic cu un timp de eluie mai mic de 18 minute si cu o rat de
curgere de 1ml/min. Literatura de specialitate a artat faptul c metoda HPLC a fost indicat
pentru detectarea FUR n snge, urin sau perilimf. Recent, FUR a fost determinat simultan cu
spironolactona prin HPLC. Pn acum HPLC e metoda aleas pentru determinarea cantitativ a
diureticelor datorit costurilor i timpului necesar pentru analiz.
n aceast lucrare, dezvoltarea i validarea unei metode reproductibile RP-HPLC cu intenia de a
cuantifica FUR prin folosirea acesteia ca metod

de rutin n laborator, sunt descrise n

conformitate cu ndrumrile Conferinei Internaionale a Armonizrii (ICH).

2)MATERIALE I METODE
2.1. Substane chimice i reactivi.
Furosemid, fosfat monobazic de potasiu, clorur de calciu deshidratat, clorur de sodiu, clorur
de potasiu, bicarbonat de sodiu i bicarbonat de potasiu au fost achiziionate de la Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO). Furosemid (USP comprimate 20 mg) a fost asigurat de Mzlan Inc. (Canonsburg,
PA). Diclormetanul a fost obinut de la ACROS Organics (Morris Plains,NJ). Acetonitrilul (de
calitate HPLC) i acidul formic obinut de la Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Poli-caprolacton polietilen glicol (PCL-PEG, 2k-3k) dibloc a fost asigurat de materiale de polimeri

15

avansai Inc. (Montreal, Canada). Poli (D,L lactic-co-glicolic acid) 50:50 (vscozitate inerent
0.4, 0.58 i 0.8 dl/g) au fost obinute de la Birmingham Polzmers (Pelham, AL).

2.2. Echipament i condiii ale cromatografiei.

Sistemul pentru cromatografie lichid conine o pomp HPLC binar Waters- 1525, autosampler
Waters 717 Plus i un detector dual de absorbane (Water Corporation, Milford, MA). Analiza
cromatografic a FUR a fost semifabricat sub eluare izocratic, folosind o coloan Spherisob
ODS2, C 18, 80 ,5 m,4.6mm x 150 mm (Spherisorb, Queensferry, UK), o faz mobile
compus din acetonitrile i tampon fosfat de potasiu (ph= 3.85) cu o raie 70:30 (v/v).
Msurtorile au fost reslizate la 233 nm cu o rat de curgere de 1ml/min i cu un volum de
injecie de 10 microlitri. Picul analitic a fost confirmat prin caracteristica sa: timpul de retentive
de 7.2 minute. Faza mobil a fost degazat prin sonicare (Model 150 D , VWR, Minneapolis,
MN) i a fost filtrate printr-un filtru cu membrane 0.22 m. Toi parametrii cromatografici de
mai susau fost controlai de versiunea 3.3 a softului Water Breeze (Waters Corporation, MA).

2.3. Prepararea soluiilor stoc i soluiilor standard.

Prima soluie standard a Fur a fost preparat cu faza mobile la concentraia de 25,000 ng/ml.
Soluia a fost n continuare diluat cu faz mobile folosind o metod de diluie n serie pentru a
obine soluii standard mixte care au ntre 5.2 pn la 25,000 ng/ml.

2.4. Validarea metodei.

Validarea metodei a fost efectuat conform ndrumrilor ICH. Studiul ce urmeaz presupune
validarea caracteristicilor urmtoare: limita de detective (LOD) i limita de cuantificare (LOQ),
specificitate, linearitate, precizie, acuratee, regenerare i robustee.
2.4.1. Specificitate.

16

Obiectivul acestui studiu a fost s msoare cantitatea de FUR prin apariia interferenelor UV n
prezena excipienilor care se ateapt s fie prezeni n nanocarrierul (NC) extractului din
matrice. Procedura a fost utilizat pentru a demonstra faptul c specificitatea depinde de
obiectivul metodei analitice. Pentru acest scop,discriminarea analitului a fost efectuat n
prezena excipienilor (PCL-PEG i PLGA) folosii pentru prepararea nanocarrierului (NC). O
mic parte de FUR tratat cu o cantitate adecvat de excipieni. Trei probe placebo au fost
preparate dizolvnd 1, 2, i 3 mg de pudr de NC n 1.5ml amestec de acetonitrile/diclormetan
(14:1 v/v) pentru 20 de minute la temperature camerei. Trei probe au fost centrifugate la 15,000
rpm pentru 15 minute (Micro 18R, VWR, Minneapolis, MN). n final, un volum de 40 L de
supernatant a fost diluat (de 7 ori). Probele au fost analizate la HPLC lund n considerare limita
cea mai mica de cuantificare.

2.4.2. Limita de detective i limita de cuantificare.

Obiectivul determinrilor limitei de detective (LOD) este acela de a stabili nivelul minim de la
care o anumit cantitate de FUR poate fi cu certitudine identificat. Determinarea limitei de
cuantificare (LOQ) este acela de a detecta cantitatea minima injectat de substan activ care
produce msurtori cantitative cu o precizie acceptabil. LOD i LOQ au fost determinate
folosind deviaia standard a rspunsului i panta curbei de calibrare. Probele au fost diluate n
faza mobil prin metoda diluiei n serie i analizate n triplicate. Curba de calibrare a fost
construit folosind concentraii diferite de substan activ (5.2, 62.5, 250, 700, 3 500, 14 000 i
25 000 ng/ml). LOD i LOQ au fost obinute folosind urmtoarele relaii i apoi aplicnd legea
Lambert-Beer:
LOD

Unde

3.3
S

LOQ

10
S

este deviaia standard a zonei picului cromatografic ce conine analitul n intervalul

LOD sau LOQ i S este panta curbei de calibrare.

17

2.4.3.Acuratee i precizie.
Scopul acestor teste este de a identifica dac metoda va da acelai rspuns pentru 3 concentraii
diferite prin 3 metode diferite.
Precizia a fost determinat prin repetabilitate (pe parcursul zilei) i prin precizie intermediar (n
zile diferite) cu probe standard de control a calitii. Exactitatea a fost evaluat prin replicarea
(n=5) analizei probelor pentru 3 concentraii diferite ale FUR: 5, 7.5 i 10 g/ml (50, 75 i
100%). Abaterea de la medie fa de valoarea real servete pentru msurarea exactitii i ar
trebui s fie mai mic de 15%.
Procentul de Fur recuperat dintr-o cantitate cunoscut a fost efectuat pe baza datelor a 5
rspunsuri corespunztoare pe zi n 3 zile consecutive asupra celor 3 concentraii menionate mai
sus. Cantitatea de FUR a fost estimat pe baza msurtorilor zonelor picurilor i prin
introducerea acestora n linia dreapt a ecuaiei curbei de calibrare. La fiecare nivel de
concentraie, precizia nu ar trebui s fie mai mare de 15%. Att acurateea ct i precizia au fost
raportate ca %RSD pentru semnificaie statistic.

2.4.4. Linearitatea curbei de calibrare.

Studiul dorete s monitorizeze relaia dintre rspuns(aria de sub curb) i concentraia de FUR.
Linearitatea a fost evaluat utiliznd 7 concentraii standard ale FUR : 5.2, 62.5, 250, 700, 3500,
14000, 25000 ng/ml i analizate n triplicat. Curba de calibrare a fost obinut prin tratarea zonei
de vrf a curbei n funcie de concentraia teoretic de FUR din soluiile standard i ecuaiile de
regresie au fost calculate. apte probe au fost cuantificate folosind relaia dintre concentraia
picului i arie. Linearitatea curbei de calibrare a fost evaluat de analiza regresiei lineare. Pentru
2
aprobare este necesar coeficientul de corelaie ( r ) care trebuie s fie 0.99 sau mai bun.

2.4.5.Recuperare.

18

Eficiena extraciei FUR a fost cuantificat la 3 concentraii diferite : 5,000 , 7,000 i 9,000 ng/ml
catagalogate ca fiind probe de joas, medie i nalt calitate pentru control (50, 70, 90 % m/v,
n=3). Pentru a prepara proba care este o soluie, 10 tablete de 20 mg furodemid au fost cntrite
individual pentru a obine mai apoi masa medie. Se tritureaz apoi comprimatele cu pistilul ntrun mojar i se cntrete o cantitate echivalent cu 20 mg FUR.

Tabel 1- Matrix design experimental pentru studiul de robustee i valorile rspunsului (n=5)
Model

+--+
++--++++++
-+-+
-----++
+-+Nivel jos
Nivel nalt

% acetonitril n

Lungime

ap (v/v)

und (nm)

X1
32
32
28
32
28
28
28
32
28
32

X2
228
232
232
232
232
228
228
228
228
232

de

pH

Debit

X3
3.7
3.7
3.9
3.9
3.7
3.7
3.9
3.9
3.7
3.9

X4
1.1
0.9
0.9
1.1
1.1
0.9
1.1
0.9
0.9
1.1

Pe de alt parte, o cantitate echivalent de FUR ncrcat cu NC (20 mg) a fost folosit n paralel.
Ambele pudre au fost dizolvate ntr-un recipient volumetric de 20 ml ce coninea 10 ml etanol ,
apoi a fost 10 minute sonicat pentru a accelera procesul de dizolvare. Probele au fost transferate
n tuburi de microcentrifug de 2ml i centrifugate la 15, 000 rpm pentru 15 minute. Apoi, 75 L
din fiecare soluie au fost divizai n tuburi de microcentrifug de 2ml i diluate n 1.425 ml faz
mobil pentru obinerea unui volum de 1.5 ml. Extracia pentru FUR recuperat a fost determinat
19

prin campararea picurilor cromatogramei obinute

cu standarde neextrase ce reprezint p

recuperare de 100% (n=3).

2.4.6.Robustee.
Scopul testului e de a demonstra c performana metodei nu va fi impactat n mod significant de
variaii mici ale parametrilor metodei. Cu ajutorul software-ului JMP, versiunea 8, un design
factorial fracionat a fost construit pentru a calcula efectele principalilor parametrii
cromatografici incluznd raia acetonitrilului i tamponului fosfat (X1), lungimea de und(X2),
ph(X3) i debitul (X4) n zona picului cromatografic. Un design factorial fracionat cu dou
nivele ( 2

41

) a fost folosit pentru a evalua influena parametrilor aa cum arat tabelul 1.

Fiecare experiment s+a realizat de 5 ori i media a fost folosit pentru analiz.

2.5.Determinarea Plate Number.

Pentru a evalua eficiena coloanei, acest numr (N) a fost calculat:
N=

3000 xL
dp

Unde L este lungimea coloanei i dp este diametrul particulei din micrometru.

2.6. Metoda de aplicare
Aceast

metod a fost aplicat pentru determinarea ncorporat n comprimate polimerice,

biodegradabile NCs,respectiv USP. n lucrrile noastre anterioare, furosemidul ncorporat n

nanotransportori au fost sintetizai cu succes i caracterizai fizico-chimic [24]. n aceast
lucrare, aceeai metod este utilizat pentru a estima eficiena
ncapsulat n nanotransportori.

20

procentului de furosemid

2.6.1. Determinarea Absorbtivitii Molare a furosemidului prin metoda spectrometriei- UV

Valoarea a furosemidului

a fost calculat pregtind curba de calibrare n intervalul de

concentraie 1000-25,000 ngmL-1 utiliznd un spectrofotometru UV-Vis la 233 nm. Pentru

fiecare concentraie, absorbana a fost calculat i un grafic a fost construit prin punerea
absorbanei pe axa-y i a concentraiei pe axa-x. Analiza datelor a fost realizat de regresie
liniar prin punctele experimentale. Setnd intercepta curbei de calibrare la zero, ne-a permis s
obinem valoarea lui din panta curbei utiliznd legea Lambert-Beer clasic:
A= cl ,

(4)

unde absorbana (A sau Abs) unei substane depinde de lungimea cii (l), care reprezint
lungimea soluiei prin care lumina trece. Pentru celulele noastre, l= 1 cm i concentraia (c) a fost
exprimat n molil-1 de substan.
2.6.2. Determinarea absorbtivitii molare a furosemidului prin metoda HPLC
Metoda HPLC dezvoltat, a fost aplicat pentru estimarea valorii a furosemidului . Pentru
calculul lui prin HPLC ecuaia (4) a fost rearanjat pentru a obine[25]:
Ar

0,06 l ng
,
Mf

(5)

unde A este aria cromatogramei medicamentului (mAUs) nregistrat de detectorul UV la 233

nm, l este lungimea cii (cm), M este masa molecular a medicamentului (Dalton), f este debitul
fazei mobile (mlmin-1), i ng ( n nanograme) este cantitatea medicamentului injectat, pentru
fiecare injecie cu volumul de 10 microlitri. Formula elaborat (5), ar putea fi folosit ca un
instrument alternativ pentru a estima mai bine valoarea a oricrei molecule folosind date
HPLC. n aceast ecuaie, toi parametrii, cu excepia Ar si au fost constani pentru un
medicament dat. Astfel , ele pot fi menionate ca o constant k, care duce la :
Ar= k.

(6)

21

n aceast metod, a fost estimat utiliznd panta curbei de regresie generat de cantitile
injectate i alte constante din ecuaia (5), conducnd la (nmolMinmL-1L-1) i la zonele
corespunztoare (Ar).
2.6.3. Stabilitate pe termen scurt
Acest experiment a fost realizat prin simularea compoziiei fluidului cohlear, aa cum este
ilustrat n Tabelul 2 [23]. O cantitate cntrit cu precizie de furosemid nativ (50g) a fost
transferat n 50 ml de perilimf sau endolimf, lichid simulat,( n conformitate cu condiiile
sink) i incubat n triplicat la 32 0.2C, cu agitare constant timp de 6 ore. n acest moment
probele au fost luate la fiecare moment de prelevare stabilit (n fiecare or). Alicotele retrase au
fost diluate cu ap pur(40l) n scopul de a obine o concentraie final (7-fold) n intervalul
curbei de calibrare. Apoi probele prelevate au fost analizate utiliznd metoda HPLC de mai sus.
Tabel 2: Compoziia chimic a fluidului cohlear sintetic,deproteinizat (rezumat al datelor
adaptate din Wangemann i Schacht) [23].
Ion

Na
K
Cl
Ca2
CO3Ph

Perilimf sintetic (Scala

Endolimf sintetic

vestibuli)
141 mM
6 mM
121 mM
0.6 mM
18 mM
7.3

1.3 mM
157 Mm
132 mM
0.023 mM
31 mM
7.4

2.7. Analiza statistic

Un test-t student a fost aplicat pentru a compara mijloacele a dou probe individuale. O valoare P
mai mic de 0.05 a fost considerat semnificativ statistic. O ecuaie polinomial a valorilor
zonei de rspuns din cromatogram a fost derivat din rezultatele a opt puncte din proiectarea
factorial fracionat.

3. REZULTATE I DISCUII

22

3.1. Metoda de dezvoltare.

Scopul acestei lucrri a fost de a obine o nou metod analitic adecvat i reproductibil i de
a determina n mod obinuit valoarea furosemidului. Alegerea condiiilor de cromatografie a fost
bazat pe minimizarea factorul de decantare , mbuntind simetria picului i reducnd timpul
analizei totale. Prin urmare , o lungime de und de scanare a fost prima dat realizat n
intervalul 200-400 nm folosind spectrofotometrul UV-VIS. Absorbana maxim de Furosemid cu
sensibilitatea adecvat s-a dovedit a fi la lungimea de und de 233 nm.
Pentru a obine cel mai bun raport de tampon acetonitril / fosfat( A / F ) , experimentele au fost
efectuate cu un raport A / F variind de la 10 la 90% v / v. Cel mai bun raport A / F s-a dovedit a
fi 30 : 70 ( v / v ) . Pentru a optimiza compoziia fazei mobile,acetonitrilul i tamponul fosfat de
potasiu 0,01 M au fost preparate la pH-uri diferite ( 3,0 , 3,5 , 4,0 , 5,0 i 6,0 ) folosind
acid formic ca modificator de pH. La pH 3,0 , rezoluia picului s-a dovedit a fi sczuta . De la pH
4.0 i pana la pH 6.0 factorul de sedimentare a picului de Furosemid a fost slab ( 1.6-1.88 ) .
Cea mai bun separarea a analitului cu randament ridicat, cu simetrie a picului i cu
reproductibilitate a fost realizat cu o compoziie a fazei mobile de A / F ; 30 : 70 , v / v la pH
3.85. Furosemid este un medicament cu o solubilitate destul de slab n ap ( acid pKa = 3.22 ) i
conine gruparea acidului carboxilic, care este ionizat la un grad mare ( pH > pKa ) [ 26 , 27 ] .
Relaia dintre pKa i pH-ul i importana lor n cursul de preparare a tamponului este cunoscut
sub numele clasic de ecuaia Henderson - Hasselbalch [ 28 , 29 ] .
Aa cum este indicat , timpul de retenie ( 7.2 min ) a fost reproductibil ( valoare egal cu 0,31
RSD % ) i n concordan cu datele publicate [30] .

Tabel 3: Interday (analiza pe parcursul mai multor zile) i analiza pe parcursul zilei a
reproductibilitii n soluii apoase de FUR

Concentraia

Intraday

Vrfurilor F

Concentraie medie

(ng/ml)

(=5)

Parcursul zilei
DS*

RSD%

calculat(g/ml)

Concentraie medie
calculat(g/ml)

23

DS*

RSD%

5,000

5.300

0.080 1.509

5.325

0.091 1.709

7,500

7.464

0.092 1.233

7.429

0.120 1.615

10,000

10.820

0.156 1.442

10.852

0.213 1.963

DS* deviatia standard

n plus , factorul de simetrie 1.29 a fost mai mic dect limita superioar ( 1.5 ) conform
ghidurilor ICH i n conformitate cu rezultatele anterioare [ 31 ]. Din literatur nu exist date
disponibile cu privire la numrul de plac a coloanei n FUR prin cuantificarea de
HPLC.Numrul de plci calculate (folosind valoarea N) s-a dovedit a fi 9000 i trebuie s
ndeplineasc cerin teoretic a valorii N( 1000 ,[32]).

Figura 2 : Cromatograma de extrase din nanotransportoare goale (a) i amestec de 25 g

/ ml de furosemid ( w / vol ) cu nanotransportoare goale .

24

3.2. Metoda de validare. Prezenta metod a fost validat n conformitate cu liniile directoare
ICH [ 33 ] . Metoda de validare a fost efectuat

n ceea ce prive te specificitatea ,

exactitatea,precizia , LOD ,LOQ , restabilirea , liniaritatea i robusteea .

3.2.1. Specificitate
Capacitatea metodei de a discrimina analitul n prezena excipienilor folosii pentru prepararea
CN fost rezolvat. Excipienii inclui sunt poli- - caprolactona - polietilenglicol ( PEG PCL - )
i poli (acid l-lactic co glicolic, PLGA ). Necompletarea NC variaz de la 106 la 400 nm n
diametru si au fost utilizate pentru a verifica specificitatea metodei optimizate. Nu se interfer
picurile compuilor endogeni n jurul timpului de retenie din Furosemid la lungimea de und de
233 nm ( Figura 2 ( a) ) . Rezultatul a artat , de asemenea, o absen de interferen a
comprimatelor comerciale de gradul de Furosemid. Un pic bine definit la timpul de reten ie al
Furosemid fost demonstrat atunci cnd o cantitate cunoscut din Furosemid a fost inta n
precedent n suspensia coloidal absolut de NCS ( Figura 2 ( b ) ) . Prin urmare,metoda
optimizat este adecvat pentru detectarea i cuantificarea Furosemidului[ 22 ] .
3.2.2. Limite de detectare i cuantificare .
Sensibilitatea metodei a fost examinat prin determinarea LOD i LOQ folosind abordarea
semnal- zgomot . LOD a fost gsit la 5.2 ngmL-1 corespunznd unei concentraii de
0.019 % din soluia de lucru ( 25000 ngmL-1 , ( 1 ) ) . LOD obinut a fost mai mic dect cel gsit
anterior n literatur [ 17 , 34 , 35] . Limita cantitativ a fost gasit la 15.8 ngmL-1 ( 2 ) care
corespunde 0.056 % ,ce este mult mai mic dect 1 % concentraie reprezentat de picul de
furosemid ( 25000 ngmL-1 ) . Ambele LOD i LOQ ndeplinesc criteriile acceptate ( < 10%)
3.2.3. Acuratee i precizie.
Acurateea metodei analitice a

fost evaluat prin compararea concentraiei cunoscute de

furosemid la valoarea experimental .Deviaia standard relativ (DSR %) a preciziei pe parcursul

zilei variaz de la 1.233 la 1.509% (Tabel 3), care este n conformitate cu criteriul de acceptare
propus de orientarea ICH ( RSD < 2,0 % ) . Cu toate acestea , precizia a fost evaluat la

25

concentraia de mai sus pentru 3 zile cu RSD % ntre 1.615 i 1.963 % . La acest domeniu de
concentraie limita superioar a fost n limita criteriilor de acceptare ale ghidului CIA [ 22 ] .
3.2.4. Linearitate si interval.
A fost investigat liniaritatea relaiei dintre concentraiile de medicament msurate i teoretice.
Concentraia msurat de furosemid obinut n urma analizei regresiei lineare a curbei de
calibrare. O curb de calibrare tipic a ariei de pic de furosemid are domeniul de concentra ie de
5,2 la 25.000ng mL-1 i a fost obinut cu urmatoarele linii de regresie: = 54,061 1,769.2 (2
= 0.9997). Aceasta din urm ecuaie confirm , de asemenea, c interceptarea y la concentra ia
zero din furosemid nu a fost neglijabil.
3.2.5.Restabilire.
Furosemidul din nanotransportoare si comprimate a fost
cuantificat la concentraii de 5 , 7 , 9 g / ml respectiv( 50 , 70 i 90 % g / g ). Aceste date
ndeplinesc criteriile de accepate de ctre ICH (Tabel 4, DSR<2%) i sunt compatibile cu
studiul anterior [ 36 ] .
3.2.6. Robustee.
Robusteea unei metode este o indicaie a fiabilitii sale n cadrul procedurii de analiz. Un
design factorial fracionat (2k-1) a fost construit cu scopul de a calcula efectele unei schimbri
deliberate a principalilor parametrii cromatografici (Xi) pe zona cromatografic a picului (Y). X1
reprezint procentul de acetonitril ( v / v ) n faza mobil ,X 2 este lungimea de und UV , X 3 a
fost pH-ul fazei mobile i 4 a fost luat ca debitul din faza mobil. Cum era de ateptat , zona
picului cromatografic a sczut n cazul n care coninutul de acetonitril a fost crescut de la 28 la
32 % ( v / v ) .
Diagrama Pareto a efectelor parametrilor cromatografici pe aria picului a fost prezentat n
Figura 3. Semnul negativ al ratie indic un efect negativ al parametrul cromatografic pe
valoarea , n timp ce un semn pozitiv de - ratie indic un efect pozitiv al parametrului
cromatografic pe valoarea . S-a aratat n mod clar c 1 i interaciunea acestuia cu X 3 a avut
din punct de vedere statistic un impact negativ semnificativ asupra valorii (P=0.0257,respectiv
0.0168). Acestea par s indice c o cretere din volumul de acetonitril n faza mobil poate duce
26

la subestimarea cuantificarii de medicament. Acest rezultat poate fi atribuit unei slbiciuni a

puterii soluiei de tampon din faza mobila n care volumul acetonitrilului este crescut. ntr-adevr
la pH-uri deasupra pKa-ului a furosemidului , gruparea acid a analitului va fi incrcat negativ ,
crescnd astfel polaritatea acestuia. Prin urmare, o reinere adecvat ar fi fost realizat prin
adugarea unui mic volumul apos de faz mobil , tiind c timpul de meninere de astfel de
substane analizate hidrofobe poate fi extins [ 37 ,38 ] .
Cu toate acestea 2 , 3 i 4 nu au avut efecte semnificative asupra valorii (P=0.0711, 0.2162
respectiv 0.1518). Aceasta prea s indice c metoda a fost suficient de robust la aceste condi ii
de munc . Pentru o mai bun utilizare a metodei de validare , procentul de acetonitril i
interaciunea acestuia cu pH-ul fazei mobile ar trebui controlat n mod strict .

Figura 3 : Diagrama Pareto indicnd efectele parametrilor HPLC pe zona de pic cromatografic.

Tabel 4 Determinarea eficienei procentuale a ncapsulrii ( EE % , DS) n USP tablete i

nanotransportoare furosemid - ncrcate

27

3.3. Metoda de aplicare

3.3.1. Calculul Absorbtivitii Molare ()
Curbele de calibrare construite n intervalul de concentraii descrise n Tab.6 pentru determinarea
valorii lui utiliznd spectrofotometrul UV-Vis i HPLC s-au descoperit a fi liniare cu
coeficientul de corelaie ( r2= 0.999 i respectiv 0.996 n Tab. 5). nainte de aceast metod de
aplicare, o curb de calibrare a fost dezvoltat pentru analiza furosemidului. Prin aplicarea
procedurii spectrofotometrice n UV, o analiz de regresie a legii Lambert-Beer, a aratat o bun
corelaie n variaia concentraiei definite n Tab.6 cu o absorbtivitate molar de 3.66 10 4
141.27 LM-1cm-1 (n= 3). Aplicnd metoda HPLC, rezultatele au indicat c absorbtivitatea
molar calculat a fost de 3.74 104 398.74 LM-1 cm-1 (=3), Tab. 6.
Utiliznd testul T- Student, diferena dintre cele dou valori (cea obinut prin spectrofotometria
UV,respectiv cea obinut prin HPLC) nu a fost semnificativ statistic (P= 0.9975) i nici n
conformitate cu raportul anterior.[39]
3.3.2. Testul de stabilitate
Studiu preliminar n laboratorul autorului a indicat c solubilitatea furosemidului a crescut n
endolimfa si perilimfa (urechea medie) simulate la: 500,000 ngmL-1 i

41,000 ngmL-1,

respectiv fa de 6,000 ngmL-1 solubilitate n ap (date nepublicate). ntr-adevr,valoarea mare a

pH-ului mediului a crescut solubilitatea furosemidului.
De asemenea, gradul de ionizare poate fi responsabil pentru creterea solubilitii n cohleea
simulat. Rezultatele obinute ( din endolimf si perilimf simulate) au artat c furosemidul (50
g) a fost stabil pe parcursul experimentului (6 ore). Datele obinute au indicat o scdere minim
a concentraiei medicamentului, sub procentul minim ( 95% Fig.4). Avnd n vedere volumul mic
al compartimentului cohlear i sensibilitatea acesteia n schimbrile mici de volum, metoda
28

HPLC dezvoltat ar putea fi util prin umplerea acestui compartiment cu 40l perilimf simulat
(0.5 Lmin-1) dupa colectarea a 40l prob de perilimf.
Tabelul 5: Data from linear standard curves, obtained separately by plotting versus .
Nr de pct

Coeficient

de

Ecuaie

02 molL-1

corelaie
0.9989

Abs

00.05

0.9956

36,501C
Area

nmolminmL-1

37,357K

L-1
a

Absorbance (, AU) versus FUR concentration (, molL1).

Area of chromatogram (, mAUs) versus (, nmolminmL1L1).

Tabelul 6: Determinarea absorbtivitii molare prin spectrofotometria UV si prin metoda HPLC.

Metod

UV

Interval

de

Ecuaie

R2

Pant()

Medie

Deviaia

calibrare(ng

standard

/ml)

relativ(

1000-

Abs=36,7

0.996

36,745

25,000

45

0.992

36,506

Abs=36,5

0.998

36,495

36,582

%)
0.386

37,407

1.065

06
Abs=36,4
HPLC

1000-

95
Area=37,0

0.998

37,023

25,000

23

0.995

37,819

Area=37,8

0.993

37,379

19
Area=37,3
79

29

4. Concluzii
Aceast metod HPLC a fost expus acceptabil de a avea sensibilitate, liniaritate, precizie,
robustee, limit inferioar de detecie i cuantificare n conformitate cu orientarea ICH.
Rezultatele metodei dezvoltate au furnizat rezultate satisfctoare cu nivel sczut de detecie,
bun precizie, volum mic de prelevare al probelor i gradul sczut de interferen al
ingredientelor inactive din NCS i comprimate. Metoda aplicat a permis determinarea FUR EE
% din NCs cu rezultate exacte. O bun estimare a absorbtivitii molare i a stabilitii FUR n
fluidul cohlee simulat pot fi obinute utiliznd metoda validat. Drept urmare a utilizrii
furosemidului pe scar larga, n problemele de ototoxicitate, un interes tot mai mare n
cuantificarea furosemidului n fluidele urechii interne ar putea fi de ateptat n viitorul apropiat.

Mulumiri
Autorii sunt recunosctori Dr. Cydney E. Mc Queen, Clinical Associate Professor, Division of
Pharmacy Practice (School of Pharmacy, University of Missouri, Kansas City, MO, USA) pentru
amabila asisten la cumprarea comprimatelor de furosemid USP. De asemenea le mulumesc
Dr. Michael Anne Gratton, Research Assistant Professor (St. Louis University, Department of
Otolaryngology,St. Louis, MO, USA), pentru discuia de folos de la nceputul acestui proiect.
30

V) REZULTATE I DISCUII

Anexa I - Articol original

J AMC2013-207028.p
df

Bibliografie
1)
2)
3)
4)

Farmacopeea Britanic 2009, volumul III, Monografii specifice, Furosemid comprimate;

Farmacopeea European, ediia a V-a, volumul II, pag. 1644-1645
Farmacopeea Romn, ediia a X-a
Journal of Analytical Methods in Chemistry, volum 2013, Ibrahima Youm i Bi-Botti
Celestin Youan (http://www.hindawi.com/journals/jamc/2013/207028/)

31

32