FAMILIA HERPESVIRIDAE.

MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR CAUZATE DE HERPESVIRUSURI FAMILIA HERPESVIRIDAE Virusurile herpetice - ageni patogeni ai omului, primatelor i altor mamifere (porci, cai, vite), a psrilor (gini, curcani, etc), petilor i broatelor, reunind peste 100 de virusuri. Clasificarea virusurilor herpetice de interes medical: Subfamilia Alphaherpesvirinae genul Simplexvirus (HSV-1, HSV-2) genul Varicellovirus (VZV) Subfamilia Betaherpesvirinae genul Cytomegalovirus (CMV ) genul Roseolovirus (HHV-6/7) Subfamilia Gammaherpesvirinae genul Lymphocryptovirus (EBV) genul Rhadinovirus (HHV-8) CARACTERE GENERALE ALE HERPESVIRUSURILOR Structura virionului Virion sferic, 150-200 nm diametru, constituit din: centru dens, de forma unui mosor (bobin), de natur proteic, pe care este nfurat acidul nucleic; genomul viral ADNd.c., constituit din 80-100 gene capsida de simetrie icosaedric, format din 162 capsomere; tegument structur proteic fibrilar, situat ntre capsid i supercapsid; peplos (supercapsida), dublu strat lipidic, pe suprafaa creia proiemin spiculi scuri, constitui din 5-8 glicoproteine, responsabile de adeziune i fuziune Enzime (ADN-polimeraza ADN-dependent, timidin-kinaza, ribonucleotid-reductaza, serinproteaza) Caractere biologice virusuri dermo, limfo i neurotrope determin infecii latente, recurente majoritatea prezint potenial oncogen posed numeroase enzime ce intervin n reproducerea viral prezint un spectru foarte larg de gazde i o gam divers de forme clinice sunt virusuri fragile i se transmit numai prin contact direct Rezistena la ageni fizici i chimici n stare liofilizat, la 4 grade, virusurile herpetice se menin ani de zile. Relativ instabile la temperaturi ambientale (+ 22 grade C), inactivate de solveni lipidici, detergeni, dezinfectani uzuali, pH extreme. Prezint sensibilitate la aciunea inhibitorilor sintezei ADN (acyclovir, etc). Multiplicarea viral Adsorbia virionului la suprafaa celulei-int Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei virale cu membrana celular Degradarea partiala a capsidei de enzime celulare i ptrunderea ADN viral n nucleul celulei. Sinteza proteinelor celulare se oprete. Biosinteza: n 3 runde consecutive are loc transcrierea ARNm viral cu sinteza ulterioar a 3 tipuri de proteine: foarte precoce (alpha, immediate early), precoce (beta, early), care sunt n majoritate enzime i proteine tardive (gamma, late), care sunt proteine de structur. Replicarea ADN Asamblarea NC are loc n nucleu. Prsindu-l prin inmugurire, NC se nvelesc cu membrana nuclear intern, n care sunt nserate GP virale imature, pe care o dezbrac n procesul de nmugurire prin membrana nuclear extern. n citoplasm NC capt proteinele tegumentului i sunt ulterior re-nvelite n supercapsid ntr-o vezicul de exocitoz, n membrana creia se conin GP virale mature. 1

 Virionii sunt eliberai prin exocitoz . Celula infectat este alterat ireversibil prin: Inhibarea rapid a metabolismului celular Fragmentarea cromozomului i apariia incluziilor intranucleare corpusculii Cowdry Apariia de sinciii i celule gigante SUBFAMILIA ALPHAHERPESVIRINAE GENUL Simplexvirus Specii: Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1) Herpes simplex virus tip 2 (HSV-2) Cultivare: 1. Culturi celulare primare umane sau din rinichi de iepure, fibroblaste de embrion de gin, linii celulare HeLa 2. Ou embrionate de gin (pe membrana chorioalantoic produc pustule pocks-uri) 3. Animale de laborator - oarece nou-nscut (letal) - Iepure (keratoconjunctivit dup scarificarea corneei) - Cobai infectat intraplantar (erupie vezicular local) Patogeneza infeciilor cu HSV Sursa de virus omul (90% au Ac anti-HSV1 i 20% anti-HSV2) Transmiterea virusului: - Contact direct prin saliv sau lichidul vezicular, mai rar prin obiecte contaminate recent cu saliv (HSV 1) - Contact sexual (HSV 2) - n timpul naterii (herpes neonatal) - Transplacentar (herpes congenital) - Prin intermediul transplantelor de organe infectate - Autoinocularea Infecia cu HSV -1 Primo-infecia este precoce, la 1-3 ani, n 90% cazuri asimptomatic. Manifestri clinice: - herpesul labial - gingivostomatit (erupie vezicular i ulceroas, adenopatie cervical, febr) - kerato-conjunctivit (prezint riscul ulceraiei corneei i orbirii) - eczema herpeticum (survine la pacieni cu eczeme cronice, se manifest ca o dermatit vezicular generalizat) - panariiu herpetic (la personalul medical, la copii autoinoculare) - meningite, menindo-encefalite, consecutiv infeciei pe calea nervilor trigemeni sau olfactivi (letalitate 70%). Dup infecie (clinic sau asimptomatic) virusul se localizeaz n ganglionii trigemeni, determinnd o infecie latent. Genomul viral persist sub form de episom. Replicarea ADN nu are loc, exprimndu-se doar cteva gene de laten. Reactivarea infeciei (herpesul recurent) are loc consecutiv scderii rezistenei organismului: stress, radiaii, frig, infecii, perturbri hormonale, etc. Virusul se propag centrifug pe cale nervoas, determinnd o infecie local (frecvent la jonciunea cutaneo-mucoas): herpes labial, nazal, keratita herpetic (buchet de vezicule, se acoper cu cruste n cteva zile, vindecarea survine n 10 zile). Infecia cu HSV -2 Determin preponderent infecii genitale. Primo-infecia are loc la persoane de 15-25 ani (primele contacte sexuale) sau la nou-nscui (herpes congenital, neonatal). 75% cazuri primo-infecia este inaparent. Manifestri clinice: 2

 herpesul genital (leziuni veziculo-ulcerative ale penisului, vulvei, vaginului, colului uterin, perineului, feselor. Proctita herpetic contact sexual anal). Dup infecia primar virusul rmne latent n ganglionii lombari i sacrali, determinnd recurene, cu aceeai localizare, care sunt mai puin severe. herpesul neonatal. Contractat de nou-nscut la natere sau de la personalul medical cu herpes oral sau panariiu herpetic. Se manifest prin septicemie sau conjunctivit. Netratat progreseaz cu diseminare visceral i deces (65%). Infecia poate fi asimptomatic. infecie congenital. Transmiterea transplacentar determin malformaii congenitale, vicii. cancer de col uterin i vulvar La gazde imunocompromise infecia cu HSV evolueaz grav, cu diseminare masiv i afectarea organelor interne. Recurenele sunt mai frecvente, cu ulcerare, necroz, extindere. Rspuns imun: umoral i celular, apare dup 1-3 sptmni dup infecie. Ig M apar i n reactivri i sunt martor de multiplicare viral. Ig nu sunt protectoare, reactivrile au loc n prezena Ac. Imunitatea celular joac rolul principal n controlul infectiei. Diagnosticul de laborator al infeciei cu HSV Prelevate: lichid din vezicule, ulceraii, cruste, fragmente bioptice sau necroptice. A. Diagnosticul direct 1. Examenul microscopic ME Microscopia optic pe frotiuri colorate cu hem-eozin se observ celule mari, cu incluzii intranucleare eozinofile (Cowdry) 2. Detectarea Ag virale: RIF cu Ac monoclonali 3. Examenul virusologic Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat de gin sau culturi celulare Indicarea virusului: manifestri clinice la animal, apariia veziculelor pe membrana chorioalantoica a oului embrionat, ECP specific pe culturile de celule (celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare) Identificarea virusului cu ajutorul serurilor imune specifice (RN, RIF, ELISA) 4. Detectarea genomului viral prin tehnici de biologie molecular (hibridare in situ, PCR) B. Diagnosticul indirect Serodiagnostic. Examinarea serurilor perechi (precoce i tardiv) cu evidenierea creterii titrului de Ac de cel puin 4 ori i prezena Ig M n caz de primo-infecie. Reacii utilizate: RFC, RN, RIFI, ELISA. Tratamentul specific al infeciei cu HSV Vidarabin (adenin-arabinosid). Analog nucleozidic al guaninei. Inhibitor competitiv al ADN polimerazei virale Acyclovir, Valacyclovir, Zovirax (acycloguanosid), Penciclovir, famciclovir. Analogi nucleozidici al guaninei. Inhibitori al ADN polimerazei virale, manifest activitate numai asupra virusului n curs de replicare. Foscarnet (phosphonoformat). Dezechilibreaz reacia de polimerizare a ADN. GENUL Varicellovirus Specia virusul Varicella-Zoster (VZV), agentul etiologic al varicelei n primo-infecie i al zonei-zoster prin reactivare. Cultivarea numai pe culturi celulare (celule primare de origine uman, simian, din rinichi de iepure, linii celulare) Patogeneza infeciei cu VZV Infecia pimar varicela Sursa de virus omul Transmiterea aerogen, prin secreii rinofaringiene sau prin contact cu lichidul vezicular sau obiecte recent contaminate cu lichid vezicular. Varicela se manifest n special la copii de 2-6 ani, evolund epidemic iarna i primvara. Contagiozitate maxim cu 1-2 zile naintea erupiei i o sptmn dup ultimul puseu eruptiv. Perioada de incubaie 14 zile 3

 Dup ptrundere virusul se multiplic local n cile respiratorii (mai rar conjunctiv) i ganglionii limfatici locali. Urmeaz faza de viremie primar, cu durata de 10-11 zile i cu afectarea sistemului reticulo-endotelial. Peste 5 zile urmeaz viremia secundar cu rspndirea i multiplicarea virusului n tegument, conjunctiv, tractul respirator (esuturilor de origine ectodermic). Apare febra i succesiunea unor valuri de erupie pruriginoas care evolueaz independent (macul papul vezicule cu lichid clar, apoi cruste) i ating tot corpul. Dispar fr cicatrice. Odat cu apariia Ac (2-3 sptmni) simptomele dispar. Evoluia este benign. La persoane cu deficiene imunitare leziuni hemoragice, suprainfecie bacterian, encefalite, pneumonii, varicela diseminat, letal. La gravide n primele 20 sptmni de sarcin varicela poate determina o embriofetopatie Reactivarea (Zona-Zoster) n cursul primoinfeciei, prin nervii senzitivi sau hematogen, VZV disemineaz spre ganglionii spinali sau ai nervilor cranieni, unde persist latent. n caz de reactivare virusul se multiplic i se deplaseaz pe cale nervoas centrifug spre sectorul cutanat corespunztor, determinnd Zona-Zoster. Infecia debuteaz cu neuralgie sever, hiperestezie i erupie vezicular localizat unilateral n dermatomul nervului afectat. Poate fi asociat cu meningit sau paralizii. Forme clinice: zoster oftalmic, zoster motor, encefalomielita. Erupiile persist pn la apariia rspunsului imun (umoral, celular). Tratament acyclovir, valacyclovir, famciclovir. Tratament simptomatic (analgezice, antipruriginoase) Profilaxie vaccin viu atenuat, tulpina Oka (n special la imunodeprimai). Pentru prevenirea evoluiei grave la contaci (nou-nscui, copii pn la 15 ani, gravide neimunizate, persoane cu imunodeficiene) se administreaz Ig uman hiperimun specific sau gammaglobuline de convalesceni de zona. SUBFAMILIA GAMMAHERPESVIRINAE GENUL Lymphocryptovirus Specia virusul Epstein-Barr (EBV) EBV este agentul cauzal al mononucleozei infecioase, implicat n etiologia unor tumori: limfomul Burkitt, carcinomul nasofaringean, leucoplakia proas a limbii. Este limfo i epiteliotrop. Structura antigenic a EBV: - antigen precoce (early antigen) EA enzime implicate n replicare - antigen de membran MA - antigen nuclear EBNA - antigen al capsidei virale VCA Cultivare: Culturi din limfocite B, provenite din snge din cordonul ombilical. Infectate cu EBV sufer transformare prin proliferare continu - imortalizarea limfocitelor. Inocularea de celule limfoblastoide la obolani nou-nscui, hamsteri, oareci induce tumori secretoare de IgM sau IgG. Celulele-int pentru EBV exprim pe suprafaa membranei celulare moleculele CR2 (CD21) receptor pentru fracia C3b a complementului, de care se ataeaz virusul limfocitele B i celulele epiteliale ale oro- i rinofaringelui. Infecia celulelor epiteliale este litic, cu moartea celulei i producere de virus. Celulele infectate astfel exprim pe membran Ag EA i VCA. n contrast, EBV induce infecie latent a limfocitelor B in vivo i transform limfocitele B normale in vitro cu proliferarea lor continua - linii limfoblastoide imortalizate. Limfocitele infectate latent exprim Ag EBNA i MA. Patogeneza mononucleozei infeciose Afecteaz n special copiii i adolescenii. Sursa de infecie omul. 4

 Transmiterea se efectueaz prin intermediul salivei (boala srutului), obiecte contaminate recent, rareori transfuzii. Poarta de intrare orofaringele. EBV afecteaz limf B direct sau dup traversarea esutului epitelial amigdalian prin transcitoz. Aceste limfocite B prolifereaz i produc virus, care infecteaz alte celule, astfel afectnd toate esuturile limfoide din organism. Incubaia 30-50 zile Semne clinice angin, astenie, febr, adenopatie generalizat, splenomegalie i hepatit Complicaii: anemie hemolitic, purpur trombocitopenic, meningit. n snge limfocite B atipice, care prezint Ag EBNA i MA. Vindecarea survine peste cteva zile sau sptmni (rspunsul imun). Reactivarea endogen a EBV conduce la sindromul de mononucleoz cronic, cu febr, astenie i producere anormal de Ig. Imunitate: umoral prin prezena Ac (IgM antiVCA sunt markeri de infecie recent, IgG antiVCA si antiEBNA semnal de infecie persistent) imunitatea celular este supresat, numrul de Ts fiind majorat pentru o perioad de 8 sptmni. Pe suprafaa limfocitelor B apar neoantigene (antigene Paul-Bunnell), ce induc Ac heterofili (Ac fa de hematii de oaie). Diagnosticul de laborator Prelevate: spltur faringian, snge (limfocite), bioptate (ganglioni limfatici, splin) Examenul microscopic: pe frotiuri din snge limfocite B mari, anormale, cu citoplasma bazofil i nucleu fragmentat Detectarea Ag EBNA n RIF anti-complement cu Ac monoclonali Examenul virusologic: izolarea virusului pe cultur de limfocite B i observarea transformrii maligne cu apariia unei linii continui Diagnosticul de laborator Prelevate: spltur faringian, snge (limfocite), bioptate (ganglioni limfatici, splin) Examenul microscopic: pe frotiuri din snge limfocite B mari, anormale, cu citoplasma bazofil i nucleu fragmentat Detectarea Ag EBNA n RIF anti-complement cu Ac monoclonali Examenul virusologic: izolarea virusului pe cultur de limfocite B i observarea transformrii maligne cu apariia unei linii continui Diagnosticul serologic: In infecia primar se evideniaz Ac heterofili (testul Paul-Bunnell) Teste pentru detectarea Ac specifici fa de Ag virale pe probe duble de ser: n infecii primare IgM i Ig G (peste 2 spt) anti VCA (persist n titru mic toat viaa), n convalescen anti EBNA n infecia reactivat i n neoplazii reapar Ig G anti EA n titru mare i sunt prezeni Ac antiEBNA SUBFAMILIA BETAHERPESVIRINAE GENUL Cytomegalovirus Specia Virusul cytomegalic (CMV) Cultivarea numai pe culturi de celule primare din fibroblaste umane sau culturi de miometru. Celulele int: macrofagele, celulele endoteliale, limfocitele T i B, celulele-su din mduva osoas, celulele epiteliale ale canalelor glandulare. Patogeneza infeciei cu CMV Sursa de infecie omul Transmiterea: Prin contact direct cu secrete i excrete ale bolnavilor (saliv, lacrimi, lapte, urin, secreii ale colului uterin, vaginale, sperm, mase fecale, snge) 5

Congenital (vertical) Neonatal (n timpul naterii, prin lapte) Transfuzii sau transplante de organe Primoinfecia este n general asimptomatic (80-90%). n caz de viremie este urmat de persistena latent a virusului n glandele salivare i limfocite B. Manifestri clinice: Infecia congenital - moarte in utero cu avort - natere prematur, cu dezvoltarea bolii cu incluzii citomegalice (microcefalie, hepatosplenomegalie, purpur trombocitopenic, pneumonie interstiial, defecte neurologice). Patomorfologic - celulele infectate devin gigante (citomegalie), cu incluzii intranucleare specifice n ochi de bufni. Infecia postnatal (infectarea n timpul naterii sau cu laptele matern). Copiii elimin virusul prin urin i saliv. Decurge inaparent n majoritatea cazurilor. La prematuri pneumonie interstiial, sechele neurologice i retardare psihomotorie. Infecia primar a copilului sau a adolescentului. Dup o incubaie de 30 de zile diseminarea viral se manifest prin febr, hepatosplenomegalie, adenopatii asociate cu sindrom mononucleozic (neutropenie, limfocitoz, bazofilie). Evoluie benign. Infecia adultului (doar la imunodeprimai, persoane cu transfuzii sau transplante). Se aseamn cu mononucleoza infecioas (cu febr i splenomegalie, dar fr angin, fr adenit i fr Ac heterofili ) Dup primoinfecie virusul persist latent n limfocite. Reactivrile se traduc prin apariia unei viremii tranzitorii i excreia virusului. La imunodeprimai pneumonie, hepatit, infecie generalizat. Imunitate umoral (Ac neutralizani, fixatori de complement) i celular prin intermediul limfocitelor Tc i celulelor NK. CMV are efect imunosupresor, ducnd la creterea nr limfocitelor Ts i diminuarea limfocitelor Th. Diagnosticul de laborator al infeciilor citomegalice Prelevate: fracia leucocitar a sngelui, urin, spltur rinofaringean, secreii cervicale, probe bioptice sau necroptice. Diagnosticul microscopic. Prezena celulelor mari, cu incluzii intranucleare n ochi de bufni pe frotiuri din leucocite, plasm, sediment urinar sau seciuni tisulare Detectarea Ag virale cu Ac monoclonali (RIF, ELISA) Examenul virusologic dificil. Cultivarea pe culturi de celule este lent (2-8 sptmni). ECP- celule balonate, incluziuni eozinofile intranucleare i bazofile intracitoplasmatice Detectarea genomului viral (PCR) Serodiagnostic. Cercetarea serurilor perechi n RFC, RHAI, RIFI, ELISA Infecie congenital izolarea virusului n primele 2 sptmni de via, depistarea Ig M. Infecie recurent: reapariia excreiei virale la pacieni seropozitivi. Tratament: gancyclovir, valgancyclovir, foscarnet, cidofovir Profilaxie: vaccin viu atenuat sau/i plasm sau globulin hiperimun se administreaz gravidelor seronegative, recipienilor de transplant HHV 6 ntlnit la aduli n 90%. Agent implicat n etiologia unei afeciuni cutanate exanthum subitum. La persoane cu imunosupresie pneumonii, encefalite, retinite, etc. HHV 7 izolat de la aduli sntoi (aprox. 75%), care excret virusul prin saliv. Sediul latenei epiteliul glandelor salivare, limfocite T CD4. Omologie de 50% cu CMV. HHV 8 asociat cu sarcomul Kaposi.