LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2

INFLAMAŢIA ACUTA
Inflamaţia este un proces biochimic şi celular care apare în ţesuturile vascularizate, ca reacţie de
apărare , declanşată de pătrunderea unor agenţi patogeni în ţesuturile organismului.
Când celulele sau ţesuturile sunt afectate, apare un răspuns rapid al ţesuturilor înconjurătoare,
acest răspuns fiind definit ca PROCES INFLAMATOR.
Inflamaţia presupune trecerea plasmei şi a substanţelor dizolvate în ea din patul vascular în
ţesutul interstiţial din jurul ariei afectate, realizând EXUDATUL INFLAMATOR.
Cauzele inflamaţiei sunt numeroase şi variate. Este esenţial de înţeles că inflamaţia şi infecţia
nu sunt sinonime. Infecţia presupune întotdeauna prezenţa inflamaţiei, dar inflamaţia apare şi în alte
situaţii în care nu este infecţie.
Clinic, inflamaţia este caracterizată de 5 semne şi simptome (manifestări locale) descrise încă
din primul secol al erei noastre de către Celsius.
Acestea sunt: -RUBOR(roşeaţă)
-TUMOR(tumefiere)
-CALOR(căldură)
-DOLOR(durere)
-FUNCTIO LAEZA (modificarea funcţiei).
Cu ocazia investigării celulare a inflamaţiei s-au observat 3 modificări caracteristice la nivelul
microcirculaţiei (arteriale, capilare, venule) în zona afectată:
- vasele sanguine sunt obliterate crescând fluxul sanguin în zona afectată;
- permeabilitatea vasculară creşte, rezultând exudatul inflamator;
- leucocitele aderă de peretele intern al vaselor , apoi migrează prin peretele acestora spre locul
afectat.
În contrast cu procesele imune care sunt antigen-specifice şi care au “memorie” procesul
inflamator este nespecific deoarece se desfăşoară aproximativ identic indiferent de stimuli şi se
desfăşoară în acelaşi fel chiar şi la a doua expunere la acelaşi stimul.
Se vorbeşte despre un proces inflamator acut şi unul cronic. Procesul inflamator acut , spre
deosebire de cel cronic, este autolimitat durând până când agresiunea ce a avut loc dispare; aceasta
durează de obicei 8-10 zile de la debut până la vindecare. Inflamaţia este considerată cronică dacă
durează peste 4 săptămâni de la debut.
Reacţia inflamatorie acută începe după afectarea celulară, care poate fi cauzată de:
- traumatisme
- privarea de oxigen;
- defecte immune sau genetice;
- agenţi chimici;
- microorganisme;
- temperaturi extreme;
- radiaţii ionizante.
Spre deosebire de raspunsul imun care necesită zile pentru a se declanşa, efectele vasculare ale
inflamaţiei apar în câteva secunde.

Manifestări sistemice ale procesului inflamator acut

 FEBRA - are pe de o parte efect benefic în procesul de apărare, deoarece unele

microorganisme ce produc inflamaţia sunt foarte sensibile la variaţiile termice (Treponema

-1-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
palidum, Gonococul). Pe de altă parte este şi un inconvenient prin creşterea susceptibilităţii
celulelor gazdă la acţiunea unor endotoxine eliberate de bacteriile gram negative.
 LEUCOCITOZA - în timpul inflamaţiei numărul leucocitelor şi în special al neutrofilelor
creşte. Această creştere este însoţită, de obicei, de o deviere spre stânga a formulei lui
Arneth, predominând formele tinere faţă de cele mature.
 DISPROTEINEMIA - majoritatea proteinelor produse de către ficat, cresc în timpul
inflamaţiei. Ele sunt cunoscute ca reactanţi ai fazei acute. Unele sunt proteine inflamatorii a
căror sinteză se realizează în ficat. Astfel sunt crescuţi:
-factori ai coagularii: fibrinogenul, protrombina, factorul VIII, plasminogenul;
-proteaze inhibitoare: α-1-antitripsina;
-proteine transportatoare: haptoglobinele, ceruloplasmina, feritina;
-componenţi ai sistemului complement:C1, C2, C3, C4, C5, C6;
-proteina C reactivă.
Alte proteine scad în timpul procesului inflamator: proteine inhibitoare, proteine transportatoare
(transferina), albumina, prealbumina, alfa-1-lipoproteinele, beta-lipoproteinele.
Creşterea reactanţilor de fază acută în plasmă şi în special al fibrinogenului se asociază cu
creşterea VSH.
Modificarea raportului proteinelor plasmatice duce la creşterea agregabilităţii eritrocitare şi
implicit creşterea VSH. Raportul albumine/globuline scade (valoare normală a raportului este de 1,2-
1,4).
Deşi e o reacţie nespecifică, creşterea VSH este un indicator fidel al răspunsului inflamator
acut.
Dinamica procesului inflamator este influenţată în afara proprietăţilor agentului cauzal şi de
terenul pe care se desfăşoară :
-vârsta;
-starea nutriţtională a organismului;

Principalele teste nespecifice ale inflamaţiei acute sunt:

- VSH;
- LEUCOGRAMA;
- FIBRINOGEN;
- TESTE DE LABILITATE SERICA;
- ELECTROFOREZA PROTEINELOR;
- REACTIA RIVALTA;
- HAPTOBLOBINA SERICA;
- PROTEINA C REACTIVA.

-2-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
1. REACŢIA RIVALTA

Reacţia Rivalta este o reacţie biochimică calitativă ce completează examenul citobacteriologic

al lichidului din seroase: pleură, peritoneu, pericard, articulaţii.
PRINCIPIUL METODEI – proteinele din lichidele biologice precipită în mediu slab acid (acid acetic 2%)
dacă depăşesc concentraţia de 3g%.
MATERIALE NECESARE
- lichidul biologic de analizat (pleural, pericardic, peritoneal);
- cilindru gradat;
- acid acetic 2%;
- apă distilată;
TEHNICA DE LUCRU
Într-un cilindru gradat se pun 100ml apă şi câteva picături de acid acetic 2%. În această apa
acidulată se lasă să cadă o picătură din lichidul biologic de analizat cât mai aproape de suprafaţa apei.
Dacă reacţia este pozitivă se formează pe traiectul picăturii un nor fin de proteine precipitate, ca “un
fum de ţigară”.
Reacţia Rivalta este o metodă rapidă, necesară pentru diferenţierea unui exudat de un transudat.
Exudatul este consecinţa procesului inflamator, are un conţinut în proteine de peste 3g%, un
pH acid şi coagulează (exemple: ascita din TBC peritoneal, cancere abdominale etc.).
Transudatul este un lichid neinflamator, ce apare în condiţii de stază circulatorie cronică
(insuficienţă cardiacă congestivă, stază portală etc.), cu conţinut în proteine sub 3g%, reacţie uşor
alcalină, necoagulabil.

2. LEUCOGRAMA

2.1 Numărătoare de leucocite

PRINCIPIUL METODEI – Sângele recoltat în pipete speciale, diluat cu un lichid hemolizant ce păstrează
intacte leucocitele, este introdus într-un hemocitometru, unde acestea se numără într-un volum
determinat.
MATERIALE NECESARE
- pipetă Potain pentru leucocite, formată dintr-un tub capilar cu zece gradaţii, cu notaţiile
0,5 şi 1 prelungit cu o bula de diluţie. Deasupra bulei de diluţie notaţia este de 11;
- lichid de diluţie Tűrck (amestec de acid acetic glacial-2ml, albastru de metilen-2 picături,
apa distilată-100ml);
- cameră de numărat Bűrker-Tűrck;
- lamelă de sticlă;
- microscop cu obiectiv 10 sau 20;
- materiale necesare pentru recoltarea sângelui.
TEHNICA DE LUCRU
1. Se pregăteşte camera de numărat Bűrker-Tűrck. Este necesară o bună aderenţa între lama şi lamelă,
care este asigurata când se formează inelele lui Newton (inele colorate de refracţie).
2. Se recoltează sânge capilar – după înţeparea pulpei degetului, prima picătură se şterge, iar a doua se
aspiră în pipetă.
3. Se încarcă pipeta cu sânge până la diviziunea 0,5 sau 1 şi apoi cu lichid de diluţie până la diviziunea
11 (se realizează astfel o diluţie de 1/20 sau 1/10; capacitatea reală a pipetei este de 11 volume, dar
diluţia este de 1/10 sau 1/20 deoarece un volum de diluent rămâne în tubul capilar şi nu diluează
sângele).

-3-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2

Camera de numarat Bürker-Türk

4. Se omogenizează sângele diluat prin agitarea pipetei câteva minute. Se aruncă primele 2-3 picături.
5. Se umple camera de numărat prin apropierea vârfului pipetei de marginea camerei acoperite cu
lamela. Camera are o suprafaţă de 9 mm2, împărţită prin linii triple în 9 pătrate cu suprafaţa de 1
mm2 (fig. 5). Pătratul din mijloc (de 1 mm2) este este de tip Thoma, fiind utilizat pentru
numărătoarea de eritrocite. Pătatele din colţuri sunt împărţite prin linii duble în 16 pătrate cu
suprafaţa de 1/25 mm2. Aceste suprafeţe se folosesc pentru numărarea leucocitelor.
6. Se realizeaza numărarea leucocitelor - se numară leucocitele din 4 sau 8 câmpuri cu suprafaţa de 1
mm2. Din elementele figurate aşezate pe liniile ce delimitează suprafaţa de numărat, se numără
numai cele de pe 2 linii de granită (de exemplu, stâga şi sus).

CALCUL
leucocite numarate
Leucocite / mm3   dilutie  inaltimea camerei
4
Exemplu de calcul: pe suprafaţa de 4 mm2 s-au numărat 240 leucocite. Deci, pe 1 mm2 sunt 60 de
leucocite.
- dacă recoltarea s-a efectuat până la notaţia 0,5, numărul de leucocite/mm3 este: 60 x 20 x
10 = 12000 leucocite/mm3
- dacă recoltarea s-a efectuat până la notaţia 1, numărul de leucocite/mm3 este: 60 x 10 x 10
= 6000 leucocite/mm3

VALORI NORMALE: L/mm3 = 4000-10000/mm3

VARIAŢII ALE NUMĂRULUI DE LEUCOCITE

 Fiziologice
a. La nou-născut se constată o leucocitoză de 20000-30000/mm3. După 4-5 zile, numărul scade, însă
în primul an de viaţă valoarea fiziologică se menţine la 1000-12000/mm3.
b. În ultimile 2 luni de sarcină, la gravide se observă o creştere a numărului de leucocite, chiar din
ziua naşterii şi încă o săptămână, numărul leucocitelor mamei ajungând la 20000-30000/mm3.
c. În timpul menstruaţiei, variaţiile numărului de leucocite sunt uşoare, fie în plus, fie în minus.
d. Numărul de leucocite creşte în emoţii, efort fizic, putând ajunge la 15000-20000/mm3, dar la o oră
dupa efort numărul leucocitelor revine la normal.
e. La 3-4 ore după ingestia de alimente, există de asemenea o creştere a numărului de leucocite, care
poate sa ajungă la 10000 – 20000/mm3. La unele persoane sensibilizate faţă de diferite alimente,

-4-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
mai ales pentru lapte şi care prezinta o intoleranţă pentru alimentul respectiv, se constată o
leucopenie, sub 3000/mm3.
f. Unele persoane pot prezenta o leucopenie permanentă de 2000 – 3000 elemente/mm3, fără să aibă
nici o manifestare a patologică. Unele leucopenii sunt congenitale şi rămân neschimabate toată
viată, altele sunt trecătoare, dureaza câteva luni sau ani, apoi dispar secundar.

 Patologice
a. Leucocitoze – reprezintă creşteri ale numărului de leucocite peste 10000/mm3. Pot fi: creşteri
adaptative, reversibile cauzate mai ales de infecţii cu coci (pneumpococ, streptococ, meningococ
etc.) sau provocate de distrugerea ţesuturilor proprii (traumatisme, infarct miocardic) şi creşteri
neadaptative, apărute în leucemii,numărul leucocitelor putând depăşi 100000/mm3, iar în circulaţie
sunt aruncate elemente tinere ce nu-şi pot îndeplini rolul fagocitar.
Creşteri ale numărului de leucococite peste 30000/mm3 sunt cunoscute ca şi reacţii leucemoide,
deosebindu-se de leucemie prin absenţa celulelor imature în sângele periferic şi revenirea numărului la
normal după încetarea acţiunii factorului declanşator.
b. Leucopenii – reprezintă scăderea numărului de leucocite sub 4000/mm3. Pot să apară în: unele
infecţii microbiene (febra tifoidă, febre paratifoide, tularemia, bruceloza), infecţii virale (gripa,
rujeola, rubeola, hepatita), parazitoze (malarie), infecţii grave de orice natură (septicemii), după
iradieri masive cu raze X etc.

2.2 Formula leucocitară

METODĂ DE DETERMINARE

Executarea frotiului
a. Principiul metodei – Se întinde o picătură de sânge proaspăt recoltat pe o lamă, în strat subţire, în
aşa fel încât elementele să nu fie suprapuse.
b. Materiale necesare:
- lame curate, degresate
- microscop optic, ulei de cedru
- sânge capilar.
c. Tehnica executării frotiului de sânge
- Se recoltează o picătură de sânge proaspăt pe marginea unei lame şlefuite şi cu un colţ rupt
pentru ca latura sa să fie mai mică decât lama pe care se va executa frotiul ();
- Se aplică apoi pe o lamă de sticlă, aşezată pe masa de lucru, într-un unghi de aproximativ
30o, astfel încât picătura de sânge să se întindă prin capilaritate la marginea de contact dintre cele două
lame;
- Se imprimă lamei şlefuite o mişcare de translaţie uşoară, ceea ce va permite sângelui să se
întindă într-un strat subţire;
- Imediat după întinderea frotiului, lama se agită pentru uscarea rapidă a acestuia.

Colorarea panoptică a frotiului de sânge

 Reactivi şi materiale necesare

- Soluţia May-Grűnwald cu următoarea formulă: eozinat de albastru de metilen – 1g,
glicerină neutră – 50ml., alcool metilic – 100ml.
- Soluţie Giemsa conţinând: eozinat de azur de metilen – 3g, azur de metilen – 0,8g,
glicerină neutră – 250ml, alcool metilic 200ml.

-5-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
- Apa distilată neutră sau apă tamponată.
- Lame de sticlă.
- Pipete Pasteur, pipete gradate.
- Ceas.
 Etapele colorării
- Fixarea – frotiul se acoperă cu un număr cunoscut de picături din soluţia May-Grűnwald şi
se lasă 2-3 minute;
- Colorarea – se face în doi timpi: timpul 1 – se adaugă peste soluţia May-Grűnwald un
număr egal de picături de apă distilată neutră sau apă tamponată, se omogenizează şi se lasă astfel 2
minute; timpul 2 – se îndepărtează soluţia de pe lamă fără să se spele, se acoperă lama cu soluţie
Giemsa diluată în proporţie de 1-2 picături soluţie Giemsa concentrată la 1ml apă distilată neutră sau
apă tamponată, după care se lasă în repaus 20 de minute , iar ulterior lama se spală sub jet puternic de
apă şi se lasă pe stativ pentru uscare.
 Calcularea formulei leucocitare
Formula leucocitară reprezintă exprimarea procentuală a diferitelor categorii de leucocite şi se
calculează după numărarea a cel puţin 200 de elemente pe frotiul de sânge.
Tehnica de lucru – Pe frotiu se pune o picătura de ulei de cedru şi se fixează poziţia
microscopului, folosind obiectivul cu imersie, diafragmul deschis şi condensatorul sus.

Tabel nr. I – Tabel pentru calcularea formulei leucocitare

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N
S
E
B
L
M
P

Se parcurge frotiul deplasând preparatul într-un singur sens şi în zig-zag pentru a surprinde atât
elementele marginale cât şi pe cele din mijlocul lamei (limfocitele au tendinţa de a se grupa spre centru,
iar neutrofilele şi monocitele se dispersează spre margine şi în franjuri). Pe măsura ce se întâlnesc
leucocitele, ele se notează pe categorii într-un tabel (tab. Nr.I), în grupuri de câte 5 elemente, pentru
diversele tipuri celulare folosindu-se notaţia:
- N = neutrofile nesegmentate
- S = neutrofile segmentate
- E = eozinofile
- B = bazofile
- L = limfocite
- M = monocite
- P = plasmocite
După numărarea a 200 de elemente se face procentajul fiecărei clase de elemente.
Numărul absolut a diferitelor tipuri de leucocite – exprimă numărul de tip de leucocit conţinut
într-un mm3 de sânge. Se calculează printr-o regulă de trei simplă, cunoscând distribuţia procentuală şi
numărul absolut total de leucocite/mm3.
Exemplu:
-
numărul de leucocite este de 6600/mm3

-6-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
- limfocite 22%
- deci, numărul absolut de limfocite este: (6600 x 22)/100 = 1452 limfocite/mm3

VALORI NORMALE ALE FORMULEI LEUCOCITARE

Neutrofile nesegmentate 1 - 4%
Neutrofile segmentate 50 - 70%
Eozinofile 1 - 4%
Bazofile 0 - 1%
Limfocite 20 - 40%
Monocite 4 - 8%

Variaţiile cantitative ale numărului de leucocite se însoţesc de modificări în formula leucocitară.

1. Leucocitoză cu neutrofilie
- infecţii localizate sau generalizate;
- acutizări ale bolilor cronice;
- intoxicaţii endogene sau exogene;
- LGC (leucemia granulocitară cronică) etc.
2. Leucopenie cu neutropenie
- în unele infecţii bacteriene (febra tifoidă, febre paratifoide);
- colagenoza;
- afecţiuni hematopoetice cu hipoplazie medulară;
- agranulocitoză;
- boli autoimune citotoxice-citolitice etc.
3. Leucopenie cu limfocitoză
- infecţii virale (gripă, rujeolă, rubeolă, HIV);
4. Leucopenie cu limfopenie
- infecţii supraacute;
- boala Hodgkin;
- după tratament cu cortizon sau citostatice imunosupresive etc.
5. Leucocitoză cu limfocitoză
- debutul TBC;
- alte boli infecţioase;
- LLC (leucemie limfatică cronică) etc.
6. Leucocitoză cu eozinofilie
- stări imunoalergice;
- parazitoze;
- sindrom Löfler; boală Hodgkin;
- LGC cu eozinofilie etc.
7. Leucocitoză cu bazofilie
- Malarie;
- intoxicaţie cu plumb;
- tumori maligne;
- LGC etc.
8. Monocitoză
- boli infecţioase (mononucleoza infecţioasă, febra tifoidă);
- parazitoze (malaria, trepanozomiaza);
- leucemie mielomonocitară;
- boala Hodgkin etc.

-7-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2

3. DETERMINAREA PROTEINE C REACTIVĂ

Proteina C reactivă (PCR) este o roteină serică prezentă la persoanele sănătoase în cantitate
minimă, ce nu poate fi decelată prin tehnici uzuale. Numele de PCR derivă de la proprietatea sa de a
precipita fracţiunea c polizaharidica a pneumococului.
PCR este un marker precoce al inflamaţiei acute deoarece creşte la 2-4 ore de la debutul
procesului inflamator.
Informaţii asupra PCR se obţin prin metode calitative (dubla difuziune Qucherony, precipitare
în caplar sa reaţia latex-PCR) sau metode cantitative (imunodfuziunea radială Mancini).
PRINCIPIUL METODEI – Testul PCR este un test de aglutinare rapidă pentru detectarea directă şi
semicantitativă pe cartonaşul PCR. Reactivul este o suspensie de particule latex reacoperite de anticorpi
antiproteină C reactivă umană, care se aglutinează în prezenţa PCR din serul analizat.
MATERIALE NECESARE
1. PCR latex – suspensie de particule latex reacoperite de anticorpi antiproteină C umană, hidroxid de
sodiu 0,95g/l. preparatul este calibrat în maniera de a detecta între 6mg/l şi 250mg/l PCR.
2. Control pozitiv – ser uman, hidroxid de sodiu 0,95g/l.
3. Control negativ – ser animal, hidroxid de sodiu 0,95g/l.
4. Eşantion – ser stabilizat 48 de ore la 2-8oC (serul hemolizat şi lipidic nu este adecvat pentru test,
riscând să furnizeze rezultate eronate).
5. Agitator reglabil la 100 rpm.
6. Agitator de unică folosinţă.
MOD DE LUCRU
1. În prealabil reactivii se aduc la temperatura camerei.
2. Se pun 50µl din eşantion şi câte o picătură din fiecare control în cercurile individuale de pe cartela
test.
3. Se agită uşor flaconul latex înainte de a se utiliza. Se pune câte o picătură de PCR latex în fiecare
cerc, lângă eşantionul de testat.
4. Se amestecă cu un agitator de unică folosinţă astfel încât să fie acoperită în totalitate aria fiecărui
cerc. Pentru fiecare eşantion se foloseşte un nou agitator.
5. Se introduce în agitatorul reglabil, la 100 rpm, timp de 2 minute.

INTERPRETARE
După ce se scoate din agitator, se examinează şi se indică prezenţa sau absenţa aglutinării. O
aglutinare vizibilă indică prezenţa PCR peste 6mg/l

LIMITELE METODEI
Factorul reumatoid din eşantion interferă cu dozarea de PCR. Interferenţa este eliminată
folosindu-se un absorbant. Se adaugă o picătură de absorbant pe fiecare eşantion înainte de a se adâuga
PCR latex.

Creşteri ale PCR poate să apară în:

1. Toate cazurile de inflamaţie, precedând creşterea haptoglobinei (cu 2-3 zile) şi a fibrinogenului (cu
3 zile)
2. Afecţiuni reumatismale (reumatism articular acut, poliartrită reumatoidă).
3. Boli autoimune, tip colagenoze.

-8-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
4. După intervenţii chirurgicale; normal concentraţia PCR trebuie să scadă după 2-3 zile de la
intervenţie. Dacă titrul se menţine crescut şi după 4 zile de la intervenţie este posibilă o complicaţie
infecţioasă.

4. TESTELE DE LABILITATE COLOIDALĂ A SERULUI (TESTE DE FLOCULARE SAU

TESTE DE DISPROTEINEMIE)

Disproteinemia se însoţeşte de un dezechilibru coloidal al serului, ce poate fi pus în evidenţă

prin reacţii de floculare nespecifice. În reacţiile de floculare sau de labilitate coloidală substanţa
străină introdusă în ser (săruri ale metalelor grele, precipitanţi organici, substanţe coloidale) joacă rol
de agent declanşator al labilităţii serice.
Testele de disproteinemie sunt metode de rutină, uşoare, executate cu reactivi şi aparatură
simplă. Lipsa de specificitate le limitează valoarea în diagnostic, fiind importante în urmărirea în
dinamică a evoluţiei bolii şi stabilirea prognosticului, fiind ultimele care se negativează.
Dintre numeroasele teste de disproteinemie cunoscute şi utilizate în activitatea practică vom
prezenta următoarele:

4.1 Reacţia TIMOL (metoda MAC LAGAN)

PRINCIPIUL METODEI – soluţia tampon cu pH = 7,8 saturată cu timol produce precipitarea

serurilor disproteinemice. Reacţia se bazează pe formarea unui complex de globuline, fofolipide,
colesterol şi timol.
MATERIALE NECESARE
- ser proaspăt (sângele se recoltează dimineaţa pe nemâncate)
- reactiv tampon veronal cu pH de 7,8
- soluţie timol 1% în alcool etilic 96o
- eprubete
TEHNICA DE LUCRU
La 0,1 ml ser proaspăt se adaugă 6 ml reactiv tampon veronal-timol, se agită şi după 30 min se
evaluează turbiditatea, prin comparare cu o gama de etalonare.
REZULTATE - Rezultatul se exprimă în unităţi Mac Lagan.

VALORI NORMALE: 0-4 unităţi Mac Lagan

VALORI PATOLOGICE
Valori crescute pot să apară în procese inflamatorii (valori mai mari de 6 UML), în afecţiuni
hepatice (hepatită acută, hepatită cronică activă), în alte boli însoţite de disproteinemie (tumori,
nefropatii, colagenoze).
Reacţia este importantă pentru diagnosticul diferenţial dintre icterele hepatice (valori crescute)
şi icterele mecanice (valori normale).

4.2 Reacţia cu sulfat de zinc (Testul KUNKEL)

PRINCIPIUL METODEI – este o reacţie de precipitare a serului cu sulfat de zinc, indicând o creştere
a gamma-globulinelor şi a beta-globulinelor.
MATERIALE NECESARE
- 0,1 ml ser proaspăt
- 6 ml reactiv sulfat de zinc tamponat cu pH = 7,5
- eprubete
TEHNICA DE LUCRU
-9-
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
La 0,1 ml ser proaspăt se adaugă 6 ml reactiv sulfat de zinc tamponat. Reacţia este pozitivă dacă
după 30 min se produce o turbiditate mai mult sau mai puţin intensă care se poate aprecia fie la scara de
timol, fie la fotocolorimetru (cu lungimea de undă de 470 nm).

VALORI NORMALE - 2-8 unităţi Mac Lagan (la copii se obţinalori mai scăzute, iar la vârstnici
vloareamaximă poate ajunge la 12 uML)
VALORI PATOLOGICE - Valorile crescute indică o creştere a gamagloulineor, putând să apară în
hepatite acute şi cronice.

5. VITEZA DE SEDIMENTARE A HEMATIILOR (VSH)

Reprezintă unul din cele mai simple teste de disproteinemie, uşor de realizat şi cu un cost redus.

PRINCIPIUL METODEI –Dacă sângele este tratat cu un anticoagulant şi lăsat în repaus, eritrocitele
vor sedimenta după un interval de timp. Metoda utilizată este metoda Westergreen.
MATERIALE NECESARE
- materiale necesare pentru recoltarea sângelui
- sânge 1,6 ml (recoltat fără stază, prin suspendarea garoului)
- soluţie citrat de sodiu 3,8% (0,4ml)
- seringă de 2ml.
- pipete Westergreen de 300mm. (gradată în milimetri de la 0 la 200)
- stativ Westergreen (stativ)
TEHNICA DE LUCRU
1. Se recoltează 1,6ml sânge (fără stază) în seringă de 2ml ce conţine 0,4ml citrat de sodiu 3,8% sterilă,
urmată de agitarea prin inclinare succesivă orizontală-verticală la recoltarea cu seringa, sau rotirea
(agitarea) flaconului cu anticoagulant (EDTA) la recoltarea a 2ml sânge direct în flaconul cu
anticoagulant.
2. Se aspiră sânge în pipeta Westergreen până la marca superioară (fig.6b).
3. Se apasă vârful pipetei pe dopul de cauciuc al stativului Westergreen şi se fixează pipeta perfect
vertical (fig.6b).
4. Din acest moment se porneşte ceasul.
5. Se citeşte cu câţi milimetri a scăzut coloana de eritrocite la o oră, respectiv două ore.

- 10 -
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2

a. b. c.
Determinare VSH: a. Stativ Westerngreen; b. aspirarea sangelui in pipeta Westerngreen până la
marca superioară; c. Citirea coloanei de plasma la 1 oră

VALORI NORMALE
- după o oră 4-6mm (la bărbaţi 10mm, la femei 15mm)
- după două ore 7-16mm (la bărbaţi 8mm, la femei 16mm)

Surse de eroare:
Influenţa temperaturii: VSH creşte cu temperatura. Între 20 şi 27 oC variaţiile sunt de mica
importanţa şi şi determinarea se poate face la temperatura camerei. În cazul unor variaţii mari ale
temperaturii se recomanda ca tubul să se introduca în termostat la o temperatură constantă de 20 oC.
În cazul bolnavilor cu crioglobulinemie, VSH efectuat la temperatura camerei poate da erori
mari, datorită împiedicării sedimentării eritrocitelor prin gelificarea plasmei, simulând viteze normale
sau uşor crescute. În astfel de împrejurări stativul se menţine la termostat, la 37 oC.
Determinarea trebuie să se facă imediat după recoltarea sângelui, orice întârziere putând să scadă
VSH-ul.
Trebuie respectată proporţia dintre anticoagulant şi sânge.

VARIAŢII FIZIOLOGICE
Sedimentarea hematiilor este cauzată de faptul că densitatea eritrocitelor (1093) este superioară
densităţii plasmei (1029) şi este influenţată de numărul de hematii, raportul albumine/globuline,
proteinemie.
Stabilitatea suspensiei eritrocitare este conferită în primul rând de încărcătura electrică negativă a
membranei datorată în mare parte prezenţei acidului neuraminic. Astfel, cu cât o anemie este mai
pronunţată, cu atât forţa de respingere dintre eritrocite va fi mai mică, ca urmare hematiile vor
sedimenta mai repede, determinând creşterea VSH-ului. Într-o poliglobulie, prin creşterea forţei de
respingere dintre eritrocite, VSH-ul diminuă.
Plasma are în general o încărcătură electrică pozitivă, dependentă în mare măsură de raportul
dintre albumine/globuline. Albuminele, care se găsesc în concentraţie mai mare şi au sarcini negative,
măresc stabilitatea sistemului şi de aceea VSH diminuă. Globulinele au sarcini pozitive mai multe şi
măresc încărcătura pozitivă a plasmei cu diminuarea VSH.

- 11 -
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
Creşterea fibrinogenemiei este urmată de aderarea moleculelor de fibrinogen la membrana
hematiilor, cu scăderea consecutivă a sarcinilor pozitive şi creşterea VSH.
De asemenea, scăderea viscozităţii sângelui, consecinţa a scăderii numărului de eritrocite, a
proteinemiei sau a ambelor (hemodiluţie) măreste VSH.

VARIAŢII PATOLOGICE

 Creşterea VSH-ului:

- orice proces inflamator

- orice proces infecţios (dă indicii că boala se gaseşte în evoluţie, scăderea VSH, neînsoţită
de semne de vindecare, denotă epuizarea capacităţii de reacţie a organismului)
- disglobulinemii (macroglobulinemia monoclonală Waldenström, maladia Kahler). În
aceste boli se observa cele mai mari valori ale VSH,de oicei pest 100mm/h, cu o
sedimentare rapidă, chiar din primele 10 -15 minute.
- cancer evolutiv (un VSH normal nu exclude prezenţa unui neoplasm)
- puseuri acute de boli de colagen şi LED
- după distrugeri tisulare: infarct miocardic, intervenţii chirurgicale. VSH are o perioada
deltenţa de 20-30 ore, spre deosebire de leucogramă care se modifică mai repede.

 Scăderea VSH-ului

- hepatita epidemică
- stări alergice
- policitemie, poliglobulie
- insuficienţă cardiacă
- talasemie
De asemenea, efectuarea VSH-ului poate oferi informaţii ecundare privind examinarea
aspectului plasmei şi al stratului leucocitar în tubul de VSH:
- aspectul plasmei: - galben-auriu – icter;
- foarte deschis (incolor) – anemie;
- tulbure – lipidemie;
- strat leucocitar foarte gros – leucemie.

6. DETERMINAREA FIBRINOGENULUI

PRINCIPIUL METODEI – Fibrinogenul din plasmă se coagulează cu exces de calciu, iar cheagul de
fibrină se dizolvă în soluţie alcalină şi se dozează proteina cu reacţia biuretului.
MATERIALE NECESARE
- plasmă;
- reactivul biuretului;
- clorură de sodiu, soluţie 0,9%;
- clorură de calciu soluţie 0,25%;
- hidroxid de sodiu soluţie 3%.
METODĂ DE LUCRU
 Se recoltează prin puncţie venoasă 2 ml sânge într-o eprubetă de centrifugă cu anticoagulant
(oxalat de amoniu).
 Se separă apoi plasma prin centrifugare.

- 12 -
 LUCRARE PRACTICĂ 1 ŞI 2
 Într-o eprubetă se diluează 0,5 ml plasmă cu 2,5 ml clorură de sodiu 0,9% şi se adaugă 2,5 ml
clorură de calciu, se amestecă şi se ţine 30 de minute la 37oC.
 Cu o baghetă se scoate cheagul, se spală în 2 eprubete succesive (una cu clorură de sodiu
0,9% şi una cu apă distilată), apoi se zvântă.
 Cheagul se pune într-o eprubetă şi se adugă 0,5 ml hidroxid de sodiu 3%. Se ţine 15 secunde
într-o baie care fierbe, agitând eprubeta, apoi se lasă 30 de minute la 37oC.
 Se adaugă 3 ml reactiv de lucru, se amestecă şi se ţine 30 de minute la temperatura camerei.
Se încălzeşte 1 minut la 37oC şi se măsoară extincţia probei (EP) la λ= 546nm faţă de un blanc cu 0,5
ml hidroxid de sodiu 3% şi 3 ml reactiv de lucru.
CALCUL
Coeficientul de extincţie procentual al reacţiei biuretului la λ= 546nm este E=2,77.
EP  2,6  g fibrinogen / 100mlplasma

VALORI NORMALE: Fibrinogen/100ml plasmă = 200 – 400 mg%.

VARIAŢII PATOLOGICE: Scăderi ale valorii fibrinogenului poate să apară în: alcoolism, neoplasm
gastric sau după gastrectomii, boli infecţioase grave, stadiile tardive ale cirozei atrofice (prin deficit de
sinteză de către un factor hepatic prezent în ciroze).
Creşteri pot să apară în: afecţiuni cardiorenale cu edeme, afecţiuni coronariene, infarct
miocardic, hepatite acute, afecţiuni reumatismale, infecţii microbiene, creşterea fibrinogenului
determinând şi accelerarea VSH. Fibrinogenul creşte nespecific în inflamaţii.

7. HAPTOGLOBINA SERICĂ

Haptoglobina este o alfa2-globulină cu valoare normală de 30-180 mg%. Creşte nespecific în

inflamaţii de aproximativ 2-4 ori.
Poate să scadă în hemoliza intra şi extravasculară prin creşterea eliminării complexului
haptoglobină – hemoglobină şi în hepatopatii cronice severe.

8. DISPROTEINEMIA REACTIVĂ DIN INFLAMAŢIA ACUTĂ

Va fi studiată în cadrul explorării metabolismului proteic.

- 13 -