O IOAN NANET,A DEscrFnun TATNELE EREDrrAlrr

LUCIAN GAVRILA
VOL.

,:l

CoPErtA dE EPAI}TINONDA TIOTIU

Blank page intentionally inserted

PREFATA

Nu eristd un alt domeniu al biologiei atit d.e dinamic co. cel lor sncinn de a scrte a &r,te dp Genetied, este' fmrt'e d,ificild, cdci, m,enfinerea tn acfumlitatn docurnentdrii reprezintd, o adeudnatd cursd. conhw-crwtnmetru, dabele stiingifice, unele de rutin,, iar altele foarte noi, sau chinn nebdnuite pnd deunzi, apdrnd Tnintr-ttm adeadmt fenonterL de aualangd
ala

gemeticii.

inf o,rmnpictrtald.

'Iotodatd, fenvmenul ereditar este ertrem de compler, iar .;tiina ereditd{ii reprezin,td, un dameniu n care trecerea de la tezd la antitezd. ;i sintezd,, ntr-o desfdgurare profund dialectic, es'te un loc cornun. Ultimul deceniu o nsemnat W$i errcrmi n aprofunzdo"r'ea stttdiu,lui fenomenului ereditur. Datele mai u,echi despre replicarrea semiconseruotiud a ADN au fost cornpletate cu rnod,ele noi, dem.anstrnd,u-se realitabm unei replicdri segmenfune, discanySinuu. A fast demonstrat, transmitureo, inf ormnfiei ,erediture de la,^tRN la ADN, aducndu-se astfel u"n s.erios 'omendoment la dogmn centtwld a biologiei rntoleculare. Saau ob$inut rezulfute rem.arcsbite n stadiul structurii ,rn^oleculotre a .cromozomului de tip eucario't, bsndarea crarnozomnld reprezentnd o ue'ritv'bild ,,Ao'r-nbd cu origenK penh'u citogeneticd. S-o dooedit cd, genele prezintd, secuen{e codificatoore. trsnscrise ;i traduse ;i secuenfe intercalate printre secuen{ele codificatmre ;i care snt transcnse dar nu snt traduse, genele ansnd d,eci o structurd m,ozaimtd,. De asemenea, Ia baci;eriofagi, s-a demnnstrnt fenam,enul acoperirii de Eene. S-au descifmt proprietfile gemelor sdritosre pi s-a elobstwt ipoem ootcoEenrei. Rezultute dc el:cepie ou f ost obfinute mtr-un domnniu nou al g,enetcii mn'lecu.Inre, cel ol mnnipuldrii de Eene cunoscut ;i sub d,enumirm de dhginerie g'eneticd. Cu oicasta Genetica capdtd nebnuite implimiii de ordin ;tiinlific, econotnic, social, poltic Ei chinr m,aml, im wuele reslizdri epoele din dorneniul ingineriei genetice pot fi comptnte ca gwndmte ;i insolit cu

mdrelia pa1i,lor tui Armstrong pe lund,. $tiinfd, cll Wofunde ezonan,te umnniste, Genetica demonstreazd unicifu.eo fincrui ittdir;i.d umnn, irepetabilitatea .so spafio-temporard. Totodn., genetr,ca aduce n discu[ie, de dnta aceasta pe temeiuri materialist-cLialecti,ce, eristenfa unui desbin. $i acest destin se nLb mc;te destin genetic. EL se mpline;te cu rgo'we matema;ticd", fdrd a euea nsd implacabilitatea destinului ulnfln dl;in mitologa greacd.

Conceputd. dup rrn plan original, cortea de fatd reprezhrtd. o ncercare, t lintele uttui spaf,iu redus, de a da cititorului o imngine integrald asupra fanom,enului ereditar. n intenlia auborilor a sta't pe d:e ,o fxtrte pre'zentorca ct mai catn, pletd a datelor clqsice si a datelor m.oderne priuittd fenornenul eredit'ar ca ;i o ncqcare de interpreffire a datalor dc gvneticd, clasicd, formnld, prin dntele geneticii mo'leculare. Euide,nt, e&rtea de fald este urn din tariantele posbile. Pentru docum,enture ne-ant folosit de posibilttdfile pe care ni le-.au oferit biblioteca Facultd,tii de biologie a Uniuersitd'fii din Bucunegti, bibliotem d,epartarnentului de Biolngxe gi Bochimie al Uniuersitdfii Haruo,rd (S.U.A.) precum ;i scltimbul initerrwlional de lucrdri ;tiinfifiee, ostet nct auborii au auut posibilitwtea de a consulta ntulte tuqdri originale de geneti,cd, cla= sicd sau m.odernd. Autorii erpmd gratitudine tuturor ,acestor institufii ;i tuturor celor care le-au oferit, pe o cale sau alta pasibititatea documentdrii. Bibliografia este sel.ectiud, gi totodatd. cugnind,e luqdrile principale deuqrite clnsice sle genetici,i f,orunnle ;i rrualeculnre. Din ntotiue de spf;iu nu s4 realizat o pennanent eorelare o citdrii n tert a autorilor cu Ubliografin firnld. Lucrarea se adreseazd. speeiali;tilor n geneticd, stud'enfilor facultd.,tilor de biologie, medicind ;i agronomiie precurn 9i prof esorilor de biologie ;i etexilor de liceu. De osemsnea, ea pmte fi consultatd de oricine este interesat n descifrarea miw,u;Iosului fenomen ereditor, cuno;tinfele despre eredifute fdcnd Wrte in' tegrant din ceeo ce se poate numi formnlia intelectuald a omului modern.

AUTORII

CUPRINS

CAP. f. Suhstratul rnaterial al ereditlii l. Delinirea ered.itdlii. 2. Delinrea substratului chimic aI ereditdlii

3.

Sl.tuctura acizilor nuclcici.

I I ll
18
1B

3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

3.6. Cantitatea de ADN gi informalia ered.itar 3.7. Sinteza replicativ a ADN CAP. II. Struetura ARN qi transcrierea genetle

3.5. Exceplii de la structura bicatenar a ADN

Structuri tautomere

Scurt istoric Structura primar a ,{.DN Structura secuudar a ADN

l8
.

22 30 32 33 35 50 50 52 57

l. Generalildli 2. Transcrierea geneti,c 3. ARN nnseger 4. ARN ribozomal 5. lnN d,e tronsfer 6. I RJV nuclear eterogen. . 7. A RN crontozontal 8. IRN ttiral 9. Reuerstranscrieyea
CAP. III. Organizarea materialului ereditar l. Organizarea uiral -

6l

66 73
74 74

76 79 79 82 82
85

2. Organizarea

cclul,ar d

2.1. Organizarea procariot. 2.2. Organizarea eucariot

2.2.1. Organizarea genelor eucariote 2.2-2. Structura electronomicroscopic acromatinei gi a cromozomului eucariot 2.2.3. Complexul sinaptinemal

88
104 106 109 109

4,

3.

Caracleri,stici,le

Procariote-Eucariote, o comparalie 5. Genomul extranuclear

organizdrii eucariote

lll

CAP. IV. Codificarca biochimie'gi expresia genie

116 116

l. Generalitli . 2. Cod,ul genetic 3. Catacteristicile codului genelic

ll7

123

4.

Biosinteza proteinicd 4.1. DesfAgurarea proc'esului de biosintez

proteinic. 129 4.1.1. Inifierea catenei polipeptidice l3l 4.1.2. Alungirea catenei polipeptidice 137 4.1.3. Terminarea catenei polipeptidice 140
organizarii qi funcgionril factorllor oreditnri
145
146 117 148 stud,iutr

f28

cAP.

V. Caraeteristleile (genelor)

l. Ciclul de tiald la organismele superoare . 2. Caraateristicile genetice ale meiozdi

mald)

3. Localizarea genelor pe cromozomi 4. Descifrareo naturii genomul.ui (gcnotipului) prin

fenotil>ului (analiza geneticd) (Genetica factoriald. sau for4.1. Ivlonohibridarea . 4.2. Dihibridarea 4.3. Bxceplii de la raporturile mendeliene de segregare 4.3.1. Dominanla incomplet sau semidorninanla 4.3.2. Supradominanla 4.3.3. Codominanfa 4.3.4. Alele multiple (polialelia) 5. Factorul Rh 6. Variantele electroforetice ;i semnificalia lor 7. Interacliunea genelor
.

r49
152

r5B
167 167 168 168 169

t74
177

t79
181

B. Complementaritate genicd 9. Gene inhibitoare .

10. Gene epistatice.

ll. Gene duplicate cu e.fect cumulatu 12. Penetran!. gi exprsiuitate genic 13. Determinismul genetic aI ciracterelor cantitatfue
11. Gene

182 183
185

15. Pleiotropia

letale . .'

186 189 193

195

t
1

Capitolul I

SUBSIRATUI, MATERIAL AL EREDITATII

Motto:'
Spirala este esenfa vie{iir
Goethe

1. DEFINIREA ERBDITATII

rnc din anul 1863 Spenoer defineEte ereditatea ca fiind procsul care detenmin asemnara dintre prinli Ei descenden{i. IJlterior, la 1885, A. Weis,mann n{elege prin eredita't'e ,,'ttransferu de Ia o genera,,lie la al'ta a unei substanfe cu o constitu{ie molecular definit36. Prin ac+easta Weisrnann devan:seaz cu aproape trei sferturi de veac, conceptia modern despre, o baz molecular a eredittii, iar ooncptul su de pl asrnrt gerrnirwt't u d, cu ierarhia strl.c t ur al -f unclio nral determi nanfi-biofsri-idnrte-ide, este comparabi cu cnncephll actual asupra ierarhiei sistremului eredi'tanr care pornegte de la perechea de nucleotide qi ajunge Ia genarTr. Astzi prin ereditate se nfelege conservarea specificitlii unui sistrem ibi'olqgic dat, n ta:npu reproducerii s,al, conservare care asirgur oon,tiuruul n evolufie, legtuna organic dintne generafii, adic asemnairea dintre acesea. Totodat, pe Ing coarlinutul 'evolutiv, apare ca fenomen biologic fundarnentaln st,r,& de neas,ernnane, de discontinuitate evolutiv, adic vEriabilitatea, eea mai generat lege a naturii. Cele dou procese, conservatismul ereditar qi vari'abiitatea ereditar snt dou aturi inseparalbile ,car,e definesc unitatea dialeetic a organismu-

* Acest panseu al celebrului autor al lui Faust po'ate fi luat, n lipsa uneia exacte, drept definifie a vie{ii. Geniul marelui poet a pn.mod cert Viata se ,afl ntr-o g,alaxie de form spiral, iar macromoleculele din interactiune'a crora irumpe triumftorare Viata au li ele n esen! o fitrucfur spir.'al. (L. Gravril - Simpozionul, Prognese gi Perspective n biologie: Progrese n Genetica molecul.ar Bucuregti, g
truns esenfa viefi,i, de vreme ce Tem,a, singur,a planet pe care stguiegte

aprilie

1981.

r
lui viu. Fieoare organism are propria sa eredi,tate nscris codificat n s,tructuri moleculare specifice sub form de irrformatie ereditar. Cu studiul ereditafii Ei variabilittii se oeup $tiinfa Eredittri numit nc Gsslgriss. Ea studiaz meoanismele nregisrrii, reduplicrii qi modificarii imforrnafiei ereditar,e precum $i aie fun,cfi,onrrii m,a,eria,lnrlui enedirtar n conr,r.u*luL proceseil.or rbiosintetice din organi:srrt car,e conduc I'a ,contur,ara

cliferitelor caracteristici a,ie arcestuia. Cuvntul eredita,t,e este de origin:re 'latin (lueredibas =- a rno$teni) qi sem'nific trransmiterea din gen,era{ie n g'Enerafi'e, ou a unor caractere cai ata,re, ci a, capacit{ii. de a dezvoita aceste caractere la d,escend'enfi. Cuvn'tul Genetic, dat acestei gtiin{e de ctr,e W. Batesor, n 1905, provime de la ,,grecscul genrtao care nseamn a d,a naEtere, a gen'era. Principiile de 'baz ale Geneticii au fost formulate n anul 1865 de ctre Gregor N{endet n {ucrarea ,,tJtber die Pflan,zer:r hyb'riden6t Ei au la' baz, conceptul de factcri ereclitari (gene) de natur material. Etre au fos,t elaborate' n urma unor exprienfe de hilbridare efectuate rn,tre diferite soiuri d'e mazre. Fr a cunoaqte care este natura chirnic ,r factorilor ereditari, Mendel a starbilit, prin in'terpretarea corect a nezultatelor ,experi,errfelor de hibridare, prin analiza fe,notipi,c, indirect a factoril,or ereditari, dubtl art cle analiza statistic. comportamentu[ acestor factori ereditari n conrrdifionare,a qi transmiterea ca,racterelor eredi,tare. lli,tate pentru m,ai 'bine de trei deceurii, principiile elaborate, de Mendel au fost con'firrnat,e ia nceputu'l secolului nostru, dovedindu-,s,8 a fi universal valal:ile n lumea vie. Mendel trebuie astfel consldena,t fondatorul celei rnai moderure qtiinfe biologice Geneticai. Legnd factorii er,edi,tari ,mend.elieni de c'roln,o zomi qi dezvol,tn'd principiile memcleliene de ereditah, qcoala iui Morgan a e'lucidat clesfqurarea f enomenului eredit'ar la nivel celular, ,constatnd,u-se ,exis'tenla unui comportam,ent identi,c al factorilor ereditari rnn;delieni qi al cromozomil'or 'n tirnpui diviziunii celulare. Rmin,ea nc n,edescifrat natura chinnic a faatorior eredi,tari. Deqi n arnul 7924, Feulgen Ei Ross'enbeck ,eviden liaz,, printr-o metod selectiv de colorare cu leucofux,in prezenfa la nivelul nucleulrui cel'ular qi ,al croln,ozormilor a acid,ului dezoxi,ritbourucl'eic (ADN) nu s-ai putut s'tabiili urici,o ,relaf;ie dintre acas,t surb stan! Ei fac'torii ereditari, a cror 'localizare pe cromozorni fusese clar dernornstrat de Scoal,a lui Morgan"
10

2. DEFINIT3EA SUBSTRATULUI CHIMIC AL BIBEDITATII

n pr,ocesul de transrni'tere a carac,terel'or ereditare de la o genera{ie la, alta nu are loc o transmitere ,ca atar,e a unui caraoer. Bste de neimagiurat ,bunoar transmiterea la nivel'ul zigotului uman a ,,ochilor albaEtri(. Dar la nivelul acestui zigot ,roeva" a'fost trans'rris qi acest ,,cevar(( va face ,cE 'n dezvoltanea ulterioai a embriou:ului uman s apar nnaurifest caracterui ,,ochi a',libaEtri((.' Ce este acest ,,oeva66 Ei ca,re snt proprietlile sale? Fcnd o paralel ntre legil,e fizicii Ei le,gi'tfi'le feno'menului eredita'r, E. Schrdingep, n 1943, devansnd conceplia moderm molecular despre ereditak, a ajuns la concluzi:a c gen'el,e 'E pstr'e ,2 struotura lor de-a lungul generaliilor, deoarece cr'omozomu'l n cane e'le se afl, repre zint un fel de cristal sta,bil aperiodic, compus dintr-o succesiune de elemente izomerice, carace'rizate de peruuneur{ gi a cror natur exact eete de fapt.,legat de codul genetic. Trei trepte ,experimentale au dus la descoperirea a,celui f,cevars adic a subs,tratului material al eredittii care s-a dovdit a,fi s'ubstanta chimic macrcrmolecular ADN. Primp, treaptd, este repr,tentat de experienfele medicului englez Griffitllr, efectua,e n 1928 cu agpntul pneumoniei Diplocoecry . pneur:rnrnipp sau pneumococ. Aceast tbacerie se prezin,t, su,b forma a dou tipuri diferite: qnul virule'nt qi ncapslllat, altul nevirulent Ei nencapsulat. Caracterele de virulent, qi nevirtr'lent s'n't ereditare adic se transurrit constan't d,e la o gengrat-le celuar la aLta fi,pqt virulent a fiost oro,tat cu ,,Slt deoar, crescut pe agar formeaz, colonii netede (n englez sm,ooth-- neted). Celu,lele sale snt, nconjurate de o capsul formafta din polizaharide specifice nct exist pneumococi, de diferite tipuri serologice
i

Tiputr nevirulent nu pr,ezi,nt capsul Ei for,rne az pe aar col'onii rugoase. El a fost notat cu ,,Rtt (rough - ,aspru). m mod spourrtan form,a S se poa,te trans;forima prin mutalie n form,a R cu o frecvent foart'e mic dar niciodat nu are loc mutalia spontan n sensul .R->S. Rezul,t deci c prin mutalie natural tipul R provenit din diferitele tipuri serologice aile,lui S poate fi Rr, Rrr, Rrrr. Injectnd la Eoareci pneumo,coci cu diferite variante experimentale, Griffi'th a constatat c: 1. Tipul viruleurt ,,S* produce rboala Ei animalele mor;
11

Sr,

S11,, Srrr.

r
lente de pnreumococ. Experienla a t'ost riguru,s efectuan excluzindu-,se posirbili'tatea nvierii celule'lor de tip S omorlte prin

3. Tipul ,nevinulent ,,R( 'n-u produce boala; 4. Dac la aeelaqi $oarece se injectEaz simultan tipuriie dirn variantele 2 Ei 3 animalul pr.eznl,i,boala Ei 'moar,e. Din ssremenea animale s-au putut izola celule vii capsulate qi deci 'viru-

boala;

2. Tipul virul,ent ,,Sn ornorit

prin fierbene nu produce

fierbere, nct s-8 impus o singur concluzie: celulele vii 'ale tipului R nevirulent n amestec cu celulele moarte ale ti:pului S se transfo'rm n celule viru,lente. Fenom,enul a fost numit T RAIVSFOR MARE GEN ETIC 4.. Transformarea genetic se desfEoar cu pne'cizie, pstrndu-se tipul serologic inifial: dac n amstecul iniectat ,au intrat celule de tip Sr omorte prin fierbere qi celule Rrr vii, din animale !-or putea fi izolate celule de tip 51 vii qi cetrule Rn. Dintr-uo asemerlea arnestec ,nu vor putea fi izolate celule de ti,p S ttt sau Sr rr. Acest lucru ar fi posibil numai n urma unui fenomen de mutafie spontan, dar un assrnnea eveninrent ese pe de o parte foarte rar qi necesit P, de al't parte un timp cu mult rnai ndelungat dect dureaz experienfa de 'mai s:tls. Celulele virulente de tip Sr renrtate prin tnansformarea cIulelor nievir"ulnte de ti,p Frr aflate n prezen{a celulelor S omorte prin fierbere 'trsnsmi,t cu fidelitsb, n'generafiile celu-r
lar.e ulteiioane, caracenrl de virul,en!. Transformar,sa are astfel carac,ter permanerr,t, virulenta fifuld nscris n 'baza eteditar a
c,e1,,u,1e1or

s determine tra'nsform'area geneti,c prfur cr-ll'tivarea cel'ulelor de tip ,,R" n mediu lichid la care au fost adugate extracte filtrate obtinrute din Liza, celulelor de tip ,,S".

Rrt. Griffift nu a puhrt da o expLicatle csrespunztoare acestui pruces de transforrnare genetic, dar el are un merit de,osebit deoarec l-a sernrnralat penru prirnar dat, iimputsionnd lumea qtiintific la elucid,area mecanismul'ui su. A doua treapt n elucidara mecanismului transformrii est,e reprezentat de experientele lui Al'loway efectuate n 1932 Ei de experienfel,e lui Dawson qi Sia din 1937. AceEtia au r.euEit

Deqi nu au precizat natur,a agentului transformant aceEti autori au putut astfel excliude implicarea materialului capsular n pnoces,ul transformrii. Tnebuia cutat ait substa,rrf cu pr'opri etti transfortn an'te . A trein trmptd qi ca d'ecisiv n ,elucidarea naturii agentului transformalrt ,este repnezentat de experienlele americanilor O. T. Avery, C. M. Macleod qi M. MacCarty al'e cror rg2u,ltate
L2

culare, Etiin! prin care biologia secolului XX qi a celor ct U vor unna se va nscrie ca un domeniu rerrolu-tionar al qtiintelor naturii. Descoperirea lui Avery qi colaboratorilor si declanqeaz o febril aetivitate n toate labora,toarele lumii, Se demonstreaz ro,lul transfor,matrr't aL ADN qi la alte baceri.i apoi Ia plante qi anima'le, fenomenul ,tmnsformrii dewnind n cele din urm e cale prin care este transforrnat dirijat ereditatea in cadrul ingineriei g'ene,tice. O alt dovad a rolului geuretic al ADN ra lprezentat-o descoperir,ea conjugrii fucteriene de ctre Irederberg gi Tatum n 1946. Acesta este un proces na,tural prin care ADN al unei bacterii este direct transferat unei atte rbact'erii. Bacteriile se deos,e'besc dup tipul sexua't. Astfel sint bacterii de tip sexuat mascul clesemnate F+ qi d,e tip sexuat fernel, desemnate F- ntre el,e fiind un tra,nsfer unidir,ecfional de material gearetic de la F+ l,a F-. Capacitat'ea d,e a transfera gene o au numai acele bacterii care posed un factor ereditar numit frctor de fertilitute (F). Aceasta repnezint tot o molecul ADN, localizat ln citoplasffi, adifional cromozomuiui bacteria,n principal. El se poate integra n cromozomul, principa,l devenind ceea ce se numegte u,n episom. n stare integrat faetorul F confer bacteriei capacitate,a de a transfera cu o frecvent nal't gene la tipul femel
13

dezoxiri,bonucleaz (errzim ce hidroLze,an rnolecula polimeric de ADN) arat c extrashrl qi pierde proprieatea transfonmu.t. Era dovada peremptorie c agentul transformant este ADN, Prin aaeas'ta s-a pus piatra de ,tqmelie Ia zidirea g,enetici'i rnole-

sint publ.icate n 1944 ntr-s lucrare devenit clasic. n aceast lucrare se arat ,c n urma cultivrii eelulelon de tip R ftl pnercrtta ADN nat purificat, extras de la celulele de tip S se poate obline o transforro,are efectiv a cehrlelor rrevirulenrte R n celule virulente, S. Descoperirea era suprinzAtoare (Wabon a numit-o ,,bomba( lui Avery) pe fondul tmei' gndiri dogmatice dominat de acceptar'ea general a ideii c sulbstantele pnoteinice au rol de rnateri'al ereditar, f,apt ce a fcut ca '1a' nceput chiar lui Avery s-i viar ,greu s cread n propri,a sa descoperire epocal ! Di,n aceast eauz, reznrltatele unei asemenea experienfe trebuiau verificate riguros prin efeetuarea diferielor teste. Astfel, testele senoLogice au ,el"iminat posi'bilitatea contaminrii 'extracfului de ADN cu polizaharide. Testele proteolitice, n Llrma crora extraetul Ei pstra activiatea transformant au eliminat posibilitatea ca proteilrele s fie irnplicat,e nr, fenomenul transf,or,mrii. n sfrEit, ;tes'tul de drrgestie cu

$i asrnrra tulpini au fost desemnate Hfr cci tra,nsfernd genele cu o mare frecven! determim totodat o inal't frecvenfa de reeorn,bi,nare a gemelor n popul'afia [bacterian considera't. Tnansferul de gene se face ntr-o manier ,unic, s'ecvenfial qi orientat, pe ,baza sa stabilindu-se ordinea genelor pe crmozomul bacterian (cartare,a geuric) qi totodat s-a conchis c ,acesa are forrn circular. Conjugarea baot'erian explie rolul pe care 1 are ADN n ereditate, statutul su d,e substant eredi'tar. ,n annrl L952, N. Zinder qi J. Ledenber,g descoper transferul de gene ntre diferite tulpini baceriene mediat prin transduc{ie fagicd. Bocteriofagii snt virusuri ale bacteriilor descoperit'e nc din 1917 de c'tre d'Here1le gi cane se ,mai nurnesc simplu fo,gr.Fagii se multiplic n celulele bacteriene lizndu-le (ciclul liic) sau Ei integre az ADN lor n cromozomul c,elulei 'bacteri'ene (-ciclul lizogen). Ciclul litic Ei ciclul lizogp6l srnt rever-si-

biLe. Integrat n cromozomul bacterian La iegiree din acesta ADN fagic poate smulge gene baeeriene pe care s le trans(Ftg. 1). n aceln+i an, A. H,erfene la, o al't tulpiur
'bcteriaura
+--+ SUfftune
5t

presiune alt'ernariL

lA Z( phe + lrp, qet- nis- I

22

(Ohe- f r P- mef r 'lis+,

atI dpdr prototrofr

Ftllru
de

protof rof i ( phe+ trF+ nef+ hts+ )

plasate fiecare ntr-un bral separat al tubului Davis de forma literei It. Brafele snt separate printr-un filtru d.e sticl care nu permite schimbul de celule dar permit trecerea mediului lichid dintrun-un braf n cellalt, astfel' c cele d.ou tulpini snt de fapt crescute pe un acelagi med.iu. Formele prototrofe apar numai n bralul care confine tulpina LA22 nu ns gi n acela care confne tulpina LAz. Cu alte cuvinte un ,,agent filtrabI" (FA) activ genetic apare legat de tulpina LAZ care poate produce prothtrofi La22. S-a d.ovedit c ageutul filtrabil este de fapt un fag temperat care a trecut odat cu mediul de cultur prin filtnr de stid de tulpina LAz la tulpina LA22 pe care o lizogenizeaz,, transfedndu-i genele de tip slbatic (poe+, trp+) d,e la tulpina nelizogen LAZ gi transformnd-o astfel ntr-o tulpina prototrof. Acest fenomen d.e trecere a unor gene de la o tulpin bacterianA la alta imediat d.e fagi s-& numit transducfie fagic. F*gul transductant a fost desemnat Prr.
T4

Dou tulpini auxotrofice de Salmonella typhimuri%ffi, LA22 qi LAZ au fost

Fig. . Experienfa de transducfie efectuat de Zinder gi Lederberg n

1952.

i.

o'p-

.. 32
fonto.r,o f.tgic

p ce rntr n ADtl
S ce intr n
ProtetnEls
copsrdeu

rta
[t.

'

35

$i
ZO-

;ta pe
g_

/-- , -bGCterie"

tuate de Hershey qi Chase (1952). a.b. - radioactivitatea nsofegte numai ADN qi se deceleaz" n interiorul celulei; c, d. - radioactivitatea nsofegte numai proteinele gi nu apare n interiorul celulei bacteriene gazd.

Fig. 2. Demonstrarea rolului genetic al ADN prin studii

autorad.iografice efec-

shey Ei Martha Chas'e, demo,ns'tre az. rolutr n ereditate a,l ADN fagic, excluznd totoda;t orice implicalie dir,ect a proteinelor in fenome,nul 'ereditar (Fig. 2). Fagii ptrund n celula bacteri,an unde s,e mu:ltiplic pe sea,ma componentelor celul,ei gazd qi apoi, n urrna lizei celulei baceriene se elibereaz noiil.e particule fagice. Bacteri'ofagii au a1ctuire foarte simpl. Ei prezin't o capsid, proteinic cane ncon'jur u,n miez de ADN. Au'orii au f'olosit bacteriofagi de 'tip T2 ca're conlin coa 400/o ADN $i 6A0/a proteine. Capsida proteinic, ,n interiorul creia s, afl ADN form,e az, capul rbacteriofagul'ui care se continu cu ,o ,,coad33. Cu ajutorul eozii, 'bacteriof,a,gul se ataEeaz la peretele celu,lar aI celulei bacteri,n, coada avnd la partea sa distal o plac h,exagonia[ cu gas spini scurfi qi nurnenoase fibrile Ei posd activita,te li'zozimic prin care peretele celulei baeteriene este dizoivat local. Pe a,ceas,t cale ADN fagic este injectat n rnt'eriorul celul,ei bacteriene, nveliqul proteinic a,l fagului rmnnd la exterior sub for,m de ,,fantom fagic. Prin experienfe
15

I
de marcare cu izotopi radioactivi, Hershey Ei Chase au demurstrat carre este funcfia ADN (Fig. 2). Comptrlen,ele bacteriofag{ilui au fost marcate ,f rnd, proteinele capsidei cu 3qS qi 32P. 35S Ei 32P difer n intens;tntea energiei ra4DN fagie cu diafiilor B pe care le emit fiind u$or de distins. Cu asmenea bacteriofagi marcali au fost infectate culturile ,bacterien,e. Prin urentrifugare au fost ,ndeprtafi bacteriofagii urea'taqatt iar prin agitare puernic s-au putut separa ,,fantomre,le6s fagice. Cnd s-au marcat pruteinele cu 35S s-a eonstatat c rtre AO qi g7o/o din 3qS este asociat cu fracfiun,ea proeinic a ,,faurtomelors fa-

ct Ei penrtru sinteza prote,inelor virale. Aceste dou cate,gorii de experienfe d,e ,transformare Ei de infecfie fagic au demonstrat faptul, c ADN-'utr reprczint, mnfurinlul gtenetzc, substratul chimic al ereditdfii, ott ls, uirusuri cit fL la sistemele Aiobgice celulare. Dat fiind faptul c uurel,e virusuri rbouiru,suril"e pr,ezint ca rniez de acid nucLeic acidul ri,bonucleic (ARN) s-a pus n mod firesc problema cin'e ndeplfureqe, n acest caz rolul de material ereditar. Experienlele lui Fraenke,l-Co,nrat, Singer Ei Williams pe d'e. o par,te Ei ale lui Gi,erer qi Schrarnm pe de alta, desfqurate, ntre 1955-1956 au adus dovezi sigure, dup care la ri,bovirusuri ARN viral. ndepliureEte rol de material er.editar (Fig. 3). Aceqti autori au lucr,at'ctl virusu rnozaicului tutunului (VMT) oare are form cilindric n interior aflndu-se ARN (60/a) ce ,este nconjurat de protein (94o7o| av,nd o lungime de 300 pm gi o 'lfime de 15 pm. Pe cale chirnic proeina viral poa'te fi separat de ARN. Cele dou compon,ente pot fi astfeL in,ocul,a,te separat la plante de tutun. S-a constatat c proteiura viral nu estre capabil d,' a determina infecfia vira,l pe cn,d ARN viral are'
caracer infec{i,os.

ADN, dup 30 minue rezult panticule vira,le ntregi care conlin att acid nucleie ct qi pnoteire. Rezult c ADN conline toat furforrrnafia eredi,tar, att pentru propria sa sintez

gice. Cnd s-a marcat ADN cu 3ZP s-a consta,ta c cea mai mare parte a radioactivittii apare n interiorul celulei bacteriene. S-a tras concl,uza c ilr. timpul ilrfecfiei fagice r celula gazd nu ptrunde ntreg lbacteriofagul ci numai ADN-uI su. Acsta st Ia tle;za rnultiplicrii fagului cu aparifia de noi partieutre f'agice. identice cu eea inifial. Deqi n celula gazd ptrunde doar

Cnd Gi'erer gi Sc,hramm au fol,osit ARN pur izolat de la VIW| spre a infeota pla,nte de tutun, BU constatat c se produce
16

3. STRUCTURA ACIZ,ILOR }IUCLBICI

3.1. SCURT ISTOR,IC

Acizii nucleici snt acizi ,orga'nie car'e aonfin f,osfor, r'sprezerr-tnd substante macromoleculare din grupa,biopolimerilor.
Descifrarea structurii ADN a fost ndelung pregtita. n anul 1868, studentul elvelian de numai 24 d,e ani, F. Miescher descoper n nucleii celulelor prele,vate din plrroi uman, ,c8 dealtfel qi n lapfii d,e somon qi sperma altor animale o substan! cu un nalt confinut d,e fosfor pe care a nu'mit-o nucleinrt Ei pe care, n 1872, 'c consider a fi materialul genetic activ at spermatozoizilor. Mult timp aceast idee nu a fost mtbrliqat de iurnea biologilor. Abia rn 1939, Astbury Ei Caspersson, n cadrul celui de-al VII-le,a Congnes de Genetic, vor avansa ideea c acizii inucleici ar servi ca matrif pentru siurteza proteinelor, asigurnd reproducerea materiei vii. n 1899, R. Altmann identific n mucleina d'e d'rojdie o substan! macromo,lecular pe care a numit-o acid nucleic. n anul 1909, P. Leven,e arat c acidul nucleic de drojdie oonfine patru baze aza,tate: odenina, gunnina, citozinn qi unacilul precum Ei acid fosforic qi o pentoz riboza. n 1930, ac'elagi autor anaIiz.eaz cornpozifi,a chimic a acidului nucleic din 'timus Ei constat c acesta cornline adnnind,, guanind., citozind qi timind, ca baze azotatn precum Ei acid fosforic Ei d'ezstirbozd. La acea vreme, ,acidut care es,te nucleic de la drojdie a prinit denumirea de acid riborw"cleic (ARN) i,ar c.el din timus de vigel a fost numit acid timonucleic, de fapt acid dezoriribonucleic (ADN).
3.2. STRUCTURA PRIMARA

A ADN

cleotid;e. D'e aceea acizii nucleici se numesc polinucleotide, adic polim,eri de nucleoticle. n anul 7952, Todd a s'talbilit ;treg-

Unitlile structurale al,e ADN, rnonomeri, se numesc nr,t lbaz,

lei ADN. U,n nucleotid este alc'tuit dintr-o

mrolecul de dezoriribozd, Ei

turile chimice dirr-tre co,rnponentel'e de

ale nlacromolecu-

un rest fosforic. Bazele a:zofra,te snt de tip organic, relativ hidrofobe. Ele snt de dou feluri : purinice adenina (A) Ei guanina (G) Ei ptrimidinice citoziura (C) Ei timina fI). Nucleul purinic este ,un dublu heterociclu al1B

baz, anotat, o

H C

N,/c/r\
HCs.#-Fig.

[ ;lr /
Nil
g

..

N r'Hr ,,r49\c/\ ''l il cH

HC

f.. ,-C--. ,/ NN
H

HzN

ril /'c\^-

E di|/ \cz \
nJ

n \.,

NH

4,

Nucleu purinic.

Fig. 5. ddsnina.

Fig. 6.

Guanna.

ctuit din 4 a'tomi de ar'ot (N) Ei 5 atomi de, carbour (C) (Fig. 4). Adenina este o 6.aminopurin- (Fig. b), pe cnd guani"-este 2-amino, 6-oxipuri,na (Flg. 6). Nucleul pirimidinic este un heterociclu aroma,tic alctuit din 2 atomi de azot qi 4 atomi de carbon (Fig. 7). Timina este o ?,6-dioxi, 5-*gtilpirimidina (Fig. B) iar citozina este o 2-oxi, 6-armiuropirimidfut (Fig. 9). Bazele azota,t'e A, G, T, C, pred.omin n ADN de Ia marea majoritate a speciilor. n unele cazuri ns, 'bazele azotate obignuite pot fi ilrlocuite de unii derivatt ai lor (Frg. 10-13). AstfI, la gru circa tlq din resturile citozin apar ca 5-metilcitozin, care are pnoprietli de rnperechere asernntoare citozinei. Acest derivat al' citozinei apare qi la alte gramin@, 6ealtfe'1 Ei la mamif'ere. "* [,ar fagii de tip T ai ,bracteriei Escherichia co:|,i, (8. coli,) citozima este ntrocuit comple ou 5-hidroximetilcitozina care de regul este conrjugat cu gil.ucoza. De asemenea, la unele virusuri se afl 5-hidroxirneti'1uraci,lu1, iar la unrele lbacterii se afl O-metilpurin. Purinele qi piri,midinele oomfin dutble legturi sau legaturi conjugate, din care cauz ele se po't pnez'enta sub forme chimice.
o

x/
htc

tl \

cH :il 3-'C H

**[' -f -cHl
1,.-*'cH
H

ll r

NHr
lL y1

iil

2 \..cH,

or-*-ci-i'
Fig. 9. Citozina.-

Fig. 7. Nucleu
pirimidinic.

Fig. 8. Timina.

19r

6- netrlaninopurna
[-t N

anrnopurina
htpoxanfina

-c Hl

NA*zri

\r

{
A nalcai

HzN-L-*
ai
edentfr

Jt-*A_)
H

rr
\
N
n tralog

al guaninet
al

Fit.

10. Analogi

nopurina gi 2-emlnopurine.

si

adeninei

&metilami-

Fig.

guanine; hiporentina.

. Amlog

ura c ilul

5-bronouracil r \.

''o

5-

fl uorouract

\o

**r\Br'
*
A na

o^d "'
logi ai uret'ilulu

Al
;
S-fluorouracil"

HN

)ly,

Fig.

'12. Analogi

ai uracilului. Uracilul ;

S-bromouracil

-nettlcrfoztn

hid

r ox t n e ! t i c : !' o z n

5 - b ro moc

tloz;n

NHr
IL

NJ

H2

L)
NH

N*

cHr

LcH2oH

oLJ
Analog a citozinei

,,4.'/ vN

N,ry* lil

NHr l'

.Fig.

13.

Analogi al citozinei. S-metilcitozin; S-hidroximetilcitozinll; S-bromocitozinl,.

20

diferi.te, cun,oscute sub d'enumirea cle structuri fut^ttompre. Astrnucleel,e, structurale ale macrornoleculei ADN se caragerizeaz, ,att printr-o mare stabilitate structural, ct Ei prin posibilitti de a se prezenta sub variante structurale. Asemene specle c'o,ntra'dictorii stau l'a baza dialecticii fenomenului ere-

fel,

di tal'.

i,ntre acidul fosforic qi gruprile hidroxi'lice (oxidrilice) al'e glucidului din pozifiile 3' gi 5', avind loc esteri,ficarea a dou grupri hidroxilice al'e restului f'osforic:
R1
I

Purin'eLe Ei pirimidi'nele pot r'ealiza legturi chimice cu pentozele. Atomii de carrbon ai pentozel'or snt num'rotafi l' , 2' , 3', 4' gi 5'. Cat'bonul I' a,l pentoz,ei ,s,e leag cu a'tom'ul dre azot din pozifia 1 al pirimidinei sau cu ato'mul de arnt dfur pozifia I al purinei. Prin intermediul restului fosforic s rsalizeaz 'lqgturi ntre caflbonul 5' al dezoxiriibozei unui nucleotid qi carbonul 3' al dezoxiritbozei nucl,eotidului urmtor, forrnnd{"r-se serii lungi de asemen,ea legturi 5'-3' sau 3'-5' n cadru,l polimerului care stau la baza structurii primare a'maeromol,eculei ADN nepresent'at de ro caten polinucleotidic de 'lungime variabil, specific fiecrei specii. fueg'turile 5'-3' sau 3'-5' r,eprezint legturi internucleotidice fosfo-diesterice poval,en'te, realizate

o
C)

_-P-OH
I

o
I

R2

pe s'eailt& lor realizndu-se o structur f,iniar, neprzen,tnd o adevrat coloan vertebral a monocatenei ADN. n structura macr,omoleculei ADN iur,tr patru tipuri principale de nucleotide: dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxitimidimtrifosfat (dTTP), dezoxigu'anozintrifosfat (dGTP) qi dezoxicitidintrifosfat (dCTP). Cnd se asamibLeaz, n monocatena po,linucleotidic acreste nucleotide rmn sub form de dezoxinucleotid-5'-monof'osfat.

Legturile, fosfodiesterice snt foarte puternice' Ei deci stabile,

Nucleotidul prezint o regiune specific, ,rpnezentata de baza arntat Ei o regiuure nespcific reprezentat de dezoxiri-

2l

r
r

boz Ei res,tul fosforic. n cadrul macr,omol'eculei, pun{ile fosfodiesteric,e s stabilesc ,ntotdea,una ntre aceleaEi grupri care snt grupri nespeci,fice, ceea ce confer acestei prti a rn,a,cromolec'ulei o mare regu,laritate, respectiv uniformitate, ce caracterizreaz, ,toate ,moleculele de ADN, d,e, oriee provenien! ar fi. Nu acelaEi lucru s poate spune despre bazele azotat, care repreziult r,egiunea specific a nucle,otid,elor, a cror nqiruire de-a lurrgul catemei pol,inucleotidice variaz de la o m'olecul de ADN ,La alta, adic de la o specie la alta qi aceast ornduire, secverrf de 'baze, az,otate, specific fiecrei specii, rprezint modul n care ,este nscris, (surb form codificat ibiochimic) r .^ macromoleflila ADN infonnatia genetic ce dirijeaz r,ealiza-i rea diferitelor caractere ereditare.

3 STRUCTURA SFCUNDAR A ADN

:

Pen,tru d'escifrarea struchrrii secun dare a, ADN au fost f olosite metode precum spectrofotometria, rezonanta m,agnetic nuclear, albsortbfia n ultraviolet, crofrnatografia ,n raz,e X etc. Difrac{ia m raze X a dat cel,e mai bune rezultate n d'escifrarea structurii secundare a ADN. Primele cer,cetri privind descifrarea structurii ADN prin analza imaginilor difracfiei n raze X au fost ntr,eprinse de ctre Astbury n anul 1938. n acelaEi an Astbury qi Bel,l ,arr arta,t c macromolecula de ADN ane ro structur fibrilar, iar pe axa sa Lun,g bazEle azotae stau perpendicular, ntre d,ou baze azobte vecine fiind o distanr! de 3,4 A. Cele mai bune imagini ale difracliei n rare X snt ns otbfinute n periroada 1950-1952 de ctre M. H.F. Wilkins Ei Rosatlind Franklin. Principiul difracliei n raze X este urmtorul: un fascicul, de raze X trece priurtr-o substan't Ei cade apoi pe o plac fotografi,c. Dac substanta prezimt un aralrja,m,ent ner,egulat a'l unitfil'or sale structurale r,azele X votr produce pe pJ.aca fotografic o pat centra'l repnezentnd pozilia fascicului principal. Dac subr-rnitfile substanlei prezint u,n aranja,ment ordonat, razel,e X vor fi d.eviate m anumite direclii rnai mult dect n alele. Dac aranjamentul subuni'tlitor preziurt un mode,l ce se repet regulat, pB placa fo,tografic vor apare benzi foarte distincte ntre care 'exist spalii fo'arte clane. S-a constatat c ADN care provine de la sun$e f'oarte difurite produce prin difraclie n taze X un model de benzi foarte clar qi aproape dentic
22

ceea ce deno,t aranj,amentul ordonat al rnonomerilor n cadnul, macrornoleculei ADN. Ma,i m,ul, modelul de difracfie n raze X a sugerat c macromolecula ADN ar,e o struchrr helicoldai (Frg. 14). De o deosebit importa'n! n elucidarea structurii secundare a ADN s-au dovedit a fi cercetrile lui Chargaff dful 1950, prin care ,s-a stahilit, contnar preril,or oomune dominate de con-

rq

f O fi

----

.Fig. 14. Structura secunsari a ADN Stlonstantele fizice ale mactomoleculei.

23

ceplia ,tetranucleotidului lui Levene (macr'omolecul ADN/1a toate speciile rezult printr-o repetare uniform a celor pa,tru nucleotide), c cele patru baze azotate principale care, 'intr n stntctura ADN nu snt prezente n propor{ii e,gale la diferiele specii. Mai mult, el a staibilit rgula echivalenfei dup care ,t,otdeauna cantit'atea de adenin (A) este ega't cu acea a timinei fI) iar canti,tatea de guanin (G)-este "Suta cu acea a citozirrei (C) de unde rezult un raport T/A-C/G foa'rte diferirte precurn Mgcofu:ctqium tubercrrtosis ansium" Soccharomryces cereuisine, Bos tantrus sau Homn sopnens. Aces:te constatri cunoscute qi surb denumirea de legile lui Charga,ff au reprezentat un punct de sprijin de mane important pentru ,elaborar,ea ideii mperecherilor de baze, piatr de temelie a modelului propus de Watson Ei Crick n 1953 pentru structur,a secundar a ADN. Pe de alt parte studiile de hidroliz, urmat de s,epararea cromatografic a bazelor azotate Ei estimarea lor cantitativ n spectrofotometrie n u'ltraviolet, efectuate de ctre Chargaff gi colaboratrorii n 1949, au artat c ADN d,e la cele patru specii menfionate anterior are o compontie n baze azotate foarte diferi,t, raportul A + T/G + C fiind foarte variabil la aceste organisme, independent de lesutul sau de individul de la care este ex,tras ADN Tabelul Compozlfin tn baze a AIIN Specia
Om (sperm)

alrlclc
31,0
29,7

Proporfia n

u/o

31,5

19,1

18,4

Arici de mare
Drojdie Mycobacterium tuberculosis Escherichia coli Virusul Vaccinia Bacteriofagul Ta d.e E. coli

Somn (lapfi)

29,l
32,t
32,6
14,6

20,8
t7 ,7 18,8

24,4
17,7 17,4

32,8
31,7 26,1

l5,l

29,5 32,6

23,9 29,9 32,6

34,9 24,9 20,6

18,2

35,4
25,1

20,3 16,6*

* S-hidroxmetilcitozin
nis,me (ta',belul

Apar varia{ii mari n raportul A+T/G+C la di-ferite orga-

un exces de A + T fa! de G + C. Varia{iile acestui raport nu snt ntmpltoare. Raportul A + T/G + C este specific fiecrei
24

nr. L). L'a plante,le Ei ani,malele

superi,oare apare

fiind ,mult mai apropiat la rorgInismele nmdite filogenetic. Sintetiznd n mod magistral date,le ecumulate n literatura de specialitate, bazafi Ei pe ,experienlel'e proprii incluznd tnod,elarea molecutrar, n anul 1953, Watson qi Crick au propus modelul de structur bicateurar a ADN (Fig. 14). unanim BCceptat, reprezentnd una dintre cele mai mari descoperiri din istori,a Etiinfei, pentru care autorii au primit pr.emiul Nobel. Mod,eluL propus de Watson gi Crick se deostbea radical de modelul ,tricatrr,r propus de Linus Pauling qi Corey n care baz'ele erau dispuse la exteriror Ei n care nu existau forte care s asigure stabilitatea structurii tripiu catenare, iar unele distanfe uan der Waals ,erau prea mici (Wabon $i Crick, 1953). I)e asemenea Watson qi Crick au adus argumente qi m,potriva mod'eiului tot tricatenar propus de Fraser, naintat spre pu,blicare chiar n perioada n care apnea lucrarea 1or. Ei au propus modelul de structur ibicatenar, n cane fiecare caten helical s,e rsucneqte n jururl aceleia$i axe virhrale Ei 'const dilr grupe fosfodiesterice care unesc nesf,urile B-D-dezoxiribofuraltozice cu legturi 3', 5'. Am,bete catene snt orientae dertral, dar scvnfele a'tomilor in cele dou catene snt ori,en,tate n dir'ecfii opuse. Bazele se afl spre interiorul helixului iar grupele fosfat n afar. Zahrul este perpen'dicular pe baz. Structura, prezin't repetifii (pasul eicei) dup fiecare 10 resturi pe fiecare caten, adic dup 34 A, existnd cte un rest (baza) pe fiecare caten la fi'ecare 3,4 A. Distanta aomuLui d'e fosfor fat cl,e axa fiibrei este de 10 A. Fiind dispuse la exterior, gnrprile fosf,at snt uEor accesibile' cationilor. Aceasta ,este o structur deschis Ei con{inutul su de ap ,este mare. Planurile lbazelor snt perpendiculare pe axa fibrei. Ele 'snt r.rni'er prin pun{i de hidroger, formnd perechi specifice de b,az'e cci to'tdeau,na are lroc uirea unei baie purinice cu una pirimidinic Ei viceversa. Astfel, ADN se prezint ca ,o suibstan! ma'cro,molecular rbicat,enar, adic alctuit din d,ou lan{uri polimerice (catene) rsucite ;plectonemicul unul n 'jurul celuilalt dup un ax vir'tual, rezul'turd structur 'bic,aten,ar he[i'coidal numit dublu
speci.i,

dubtutui helix,este de 204 avnd un pas (spir) spir a dublului helix ADN cuprinde cte 10 nucleotid'e, ceea ce nseamn c dimensiu,nea fiecrei baz.e este de 34 4..
Fiec,ar,e,

nttK*-^t*t

de 3,4 A. C,e[e d'ou lanfuri polinucleotidice snt antiparalele, adic la unu,i legturil'e f,osfodiest'erice, s,e r,ealizeaz ntre C 3' al dezoxi25

7
rirbozei unui nudleotid $i C 5'

dezoxtriboz

---v 1 a sugerat realizarea G/C:

legturile fosfodiesterice se rearlizeaz, n seos, inver-s C 5' Q 3' . Rapor,tu.l A/T -

al dezoxiri;bozei nucleotidului vecin, pe c,n'd la niveflul celuilalt lan! polinucleotidic

ciosin

guanin

''

delr.ri ri boz6

dczoxiriboz

Fig.

gi G : Q eare stau la baza structurii bicatenare a ADN.

Ei funcfionarea rnaterialului ereditar. Astfel, A se dovedeEte a fi complementar lui T iar G lui C, adic hazele purinrice prezint complementaritate chi'mico-spafiat pentnu cele primidinice, iar bazele pri,midiuricre' prezimt compleme'ntaritate pentru cel'e purinice (Fig. 15). Asemin,,a perechi d,e baze prezin't dirnensiuni egal'e conferind ma,cromolecvulei. ADN un diametru uniform pe toat lungim,ea sa. O mperecher,e purin-purin sau pirimidin-pirimi'din ar depqi sau ar fi mai, mica faF de diametrul de 20/^ ct are n mocl nor"m,al dub,l'url he[ix ADN lipsimdu-l de reg'ulari'tate. m'perecherile cle barn se realizeaz prin intermediut u:rror punli de hicirogen, dou ntre A qi T qi trei ntre G qi C. ,mperecherile sint, re-

15. Perechile specifice de

baz

A:T

unor mp'erecheri, d'or,'eclite a fi real'e Si prin modelare molecular, ntre A $i T r'espectiv G gi C. mperecherea de baze azotate are la baz principiul complmentarit{ii, cel mai de seam n organizarea

ciproce:

A-T, T-A

respe,ctiv

G-C, C-G.

Dar legturile de hidrogen joac un rol foarte important n reacfiile biomoleculelor, formndu-se Ei dezorganizndu-se cu uqurint fr a necesita surse energetic'e speciale, avnd totodat rol esen{ial n reacliile car,e imp,lic recunoaqterea de, structuri compleurrentare cum ar fi replicarea, tra,nscrierea Ei repararea ADN ca Ei n traducerea me,sajului genetic. Structura bica'tenar a ADN prezint de regul o mare stabilitate' rizic, asi.gurat pe vertical d,e' punlile fosfodiesterice intraca,tenar,e, iar pe orizontal de punfile de hidrogen intercatenare qi de stivuirea (stacking) perechil,or de baze ,a'zatate n cadrul dub'lului helix, 't,oa,t,e acestea fcnd ca ADN duhlu-catenar s apar ca o structur CIarecum rigid, para26

cristalin. Caracteristicile structurale finale ale ADN dublu-catena'r snt dictate ns de moieculel'e de dezoxiriboz care se aEaz cu ,oxirgenul inelului orientat n sus ,n cadrul unei catene qi ,orienta't n jos n' cadrul catenei complemen,tare. Din eauza acestui aranjament opus al moleculelor de dezoxiri'boz n cele dou catene Ei d'eoarece zahrul 6e leag la o pozitie excntric a b,azei az'otate, ntreaga mrolecul de ADN este obligat s se rsuceasc, s se spiraliz'eze, rezultnd nu o s'tructura dreapt bicatenar ci una spiraiat dublul h,eli,t, n care fiecarre p,ereche succesiv de baze azotate se ntoarce cu 36 " n direcfia acelor',de ceas,onnic, dublul helix fcnd u,n ur complet (360o) 1" fiecare X0 perechi cie ,baze. Structura polimeric a macromoleculei ADN permite nscrier',ea n aceasta, sub form codificat, a unei cantitfi de informaiie genetic teonetic nelimitat. Nu,mrul, permutrilor posi{bile este de 4n, n ,car,e n reprezin't numnrtr nucleotidelor de-a iungul u:n,ei catene ADN. Cunoscnd c cele mai rnici virr.'suri au n ADN cel pu{in 1500-3000 nucl'eotide, aceasta fiind limita inferioar dirnensional a genom,ului pentru sistemele biologice, pute'm a:vea im,aginea enormei diversi'tti informa{iornaie a siste,melor 'ereditare din lumea vie, Ei ne ptrtem explica, de c este ,posiibll ca fieca,re specie s ailb pnopria sa infonmafi,e ereditar, rdiferit de a altor specii. Rece,nt dou eohipe de cercetori, una american condus de A. Rich de la Massachusetts Institute of Technology, gi alta ol,and ez (J. H. van Boom qi Gijs van der Marel) de ,la Uni\rersitatea din Leyda au descris la nivelul unor polinucleotide sintetice de tip p,oli d (G-C) duplexuri ADN cu spirala orientat se,nestrLt (ADN de stn*ga) avnd conformalie dife,rita de ADN ,normal cuno,scu't ca ADN de dreapta. ADN de st,r\ga prezint aceeaEi regularitate intern, 'aceleaqi asocieri de baze az,otate ca Ei ADN de dreapta, dar Ei unele difer,ente stnrrchrrale consid'erabile. Astfel, n ADNT de stnga grupele fosfat se dispu,n, nu dup uin traiiect rectiliniu, ci dup 'un tra'iec*t m zLg-zag, ADN de stnga, numindu-,se Ei ADIV-Z. n ADN de stng,a perechile rd'e ibaze snt expuse mai spre exteriorul dutbl,ului helix Ei pasu[ elicei c,uprinde, nu 10, ci doar 6 perechi de b,aze, din care cauz, forfe'le de stivuire snt mai mici iar molecula cle ADN-Z apar,e mai fragil, avnd un dia'metru ceva ma,i mic. Plasarea perechilor de bazre' ,azo'tate mai spre ,exteriorul rnacromol,eculei ADI.{-Z face ca su,bstanlele reactante s interacfion,eze rnai usor cu ibazele azotate. Dac a'ceste su'bstante snt can27

r
I

cerigre, ADN-Z poate s condilioneze transformarea rnal,ign a celulei. StructurA de fip ADIV-Z poate s apar n anurnite condifii chiar n cadrul structurii normale de ADN nativ l'a nivelul unor anlunite segrnente ale acestuia. Conformafii sen,estreau fost descrise la nurn,eroase polinucleo* tide sintetioe de 'tip pali-d (GC), poli-d (GC) sau poti-d (AC). poli-d (GT). Se arat c structura sen,estr este accesiibil oricrui segment de ADN cu o s'ecven{ de 'baze alter'native purin-pirimidiur (Arnott Ei colab., 1980). I)escoperirea, confcrma{iei senestre a ADN extinde eno'rm limitele structurilor $ecundar,e cunosc,ute pentru duplexurile ADN. El,e pot fi implicate n multe aspecte referitoare la schi,rnibrile conform,afiona'le ale duplexu'lui ADN n replicare, dena,turare, transcrier,e. Regiunile dextre Ei s,enestre dintr-o molecul de ADN pot fi separate dcar de 2 nucl.eotide. P'e baza datelor de structur a ADN se poate deduce funclia sa de rnolecul informafional Ei se poate defini unitatea funcfional de transrnitere a caracter,el'or ,ereditare care a fost numit gnd,. Genq, reprezntd lLn se'gmeflt, o por[iune din lnfrerom,alecula de ADN la tost'e sisternele biologice sau de ARN (l,a ribo'uirusuri) de lungime uarinbild care define sub farmd codificatd informn{ia ereditard ce dirije'azd, sinteza unei ca'tene po,lipeptidice. Gena c,on{ine n m'edie ntre 900 Ei 1500 perechi de nu'cleotide. Peste arrrumite limite de temperatur (ntr'e 63aC .9i 100'C) stabilitatea legturilor de hidrogen cedeaz avnd ioc desfacerea dublului heiix. n c'eLe dou catene complem,entare, fenomen ,numit clenaturare termic. Cea mai sczut ,temperatur de denaturare cunoscut este' 65"C qi se nregistreaz n cazul den,aturrii polinucleotidului sintetic poli d (A-T). Dac amest,ecul monoc&t,nlor r,ezultate din denaturarea dublului helix de ADN se rceqte brusc ele r'mnd permanen,t separate' gi un asemenea ADN se llumeq.te ADN denntLdtr'at. Dac amestecul de rnonocatene se rceEte lemt, treptat, are loc o reasocier,e a catene'tror cu refacerea legturilor de hidrogen di,ntre el,e, r,estaibilindu-se structura bicat'enar a ADN. Acest fenom,en s-a numit rennturareq ADN (Fig. 16). Temperatur de denaturare p,oate constitui un indiciu indirect privind prooentul d,e baze azotate din struct,ura ADN. thir ADN n care predomin perechile A-T, ntre care exist 2 punfi de hidrogen, v8 prezent,a o temperatur de denaturare mai mic deet un ADN n' care predo,min perechite G-C care, prezentnd trei punfi de hidrogD, snt mai rezistente la dena2B

Af,
a H

il

ce'cturare

AD I{

r &4: j:
AR N ir,rlerenicn

z,"qJ qnr

gj:

ADN

Fig. 16. Denaturar_ea.gi renaturarea aDry (A). Denaturarea gi hibridarea molecularA (B).
"toC*C
100

BO

Hycoba cterrun phlei

60

40

Fit.

aefurare a ADN de la diferite surse, avnd un confiuut variabil G+C (dupA J. Marsrur $i P. Doty, 1959).

17. Temperafura de

de-

?0
0

29

Fturare, nec,esitnd pentru aceasta o temperatur mai ridicat (Fig. 17). Prinr denaturare-rrrsturare se pot rea,liza hibrizi ,moleculari ntre ADN ,ce provine de la diferite specii, putndu-se aprecia gradul de nrudir,e dintre specii pe criterii rnoleculare. Astfel, dac renaturarea ADN homolog e,ste teonetic de 1000 , renaturarea ADN heterol'og (ce provine de la specii diferite) ese n fr-rrrcfie de apropierea filogenetic a speciilor (7So7o ntre ,om Ei maimuta Ei 250/o n,tre om Ei goar,ece, bu'noar) Hilbrizi moleculari pot fi realizali Ei ntre ADN Ei ARN, iar cnd aceast hibridare se realiz eaz,, in si;tu, se pot loca,liza pe cr'omozomi genele care dirijeaz sinteza diferitelor categorii d,e ARN celular.
3.4. STRUCTURI TAUTOMERE

Prin deplasarea unor atomi de hidrogen de la un atom de azot sau ,oxigen d'e la o ,grupare l,a alta a nucleului purinic sau pirimidinic, fenomen numit migcare tautomer apar formele tautomere ale inelului purinic sau pirimidinic care 'trec de la
l-l
I

NJ-H
I

NH

1;':-/'-\C/\ rll
F

illr'H C'.-1 rr/C\

r,l
roe

\
/
NH

**r'

C \C

ti

-N

HC\ ,/\-,t'
NNH

tl \.u

Adentna :f orna antnOJ

ra

Adentna ( forp; tmno,

c-cH" %,'cx t'

O:C
t

?''/

,e''atA

OH
I

-T

il

--'>

\ ./cH
NH

i lL,, o=i\ ,/cH

NH
tautomere.

y/ \ c-c H.J

l^ \r,

Itnt. ) {rornA: cetonrca)

Ttorn ( forn.: enoliciI

Fig. 18 Structuri
30

forma amino (NHz) la forma imino (NH). AceIaEi lucru se ntmpl ctr atornii de oxigen legali de atomii C6 ai guaninei qi timinei cane au n mod normal forma aeto (C:O) qi care n urma miqcrii tauto,mere trec n forma enolicd (C-OH) (Fig. 18,
MiEcarea tautorner creeaz posibilitatea mperecherii gresite de baze azotate de tip A-C qi G-T, fenomen care poart n sine ca'uzele apariliei de mutafii spontane (vezi procesul mutagen).
19).

/(
N

A ( oornal

4/

,W, -

antno

w
o

')n,n,

-- .
NHz

.-

-''

rv

Hz.

6 (nornal ceto)

G4 (f orna rar enattr )

NH

1/\
t,---r/

,0
C r4ornal anino) Cf

,N

\r
inino;

r f orna rar

Fig. I 9. Tranziliile tautomerice d.e la formele comuue, stabile ale bazelor azotate (A, T, G, C) la formele rare, tautometice (A*, T*, G*, C*).
31

3.5. EXCEPTIE

DE LA STRUCTURA BICATENARA A ADN

eficace pe structurile bicatenare de ADN. S-a tras aoncluzia c ADN de q X174 este monocatenar, adic sr prezint n mod n,ormal ca structur primar, aprnd ca o mol'ecul ci,rcu'lar de ADN mornocat'enar (Fig. 2q. O situa{ie asemntoare s-a evidenliat gi la atli bacteriofagi precum q^R Ei StB. Asomenea cazur n care ADNT se prezint m s,tare natural ca strucfur monocatenar ne sqgerc azi c de fapt la toae sistemel'e tbiologice ar fi po'sibii nscrierea informaliei ereditare n structuri monocatenare. Starea dublucatenar nativ a ADN Ia covrgitoarea m,ajoritate a 'sist,em,1,or biologice este o stare redutant, r'eiterat. Dar cum nseEi s,tructurile monocatenare devin n timpul replicrii structuri dutblu-catenaffi', nsea,mn c natura a avut o anumit ,,rafiune( de a-gi baza realizarea fenomenului ,ereditar pe structuri dublu-catenare. Dealtfel natura face un foar,te interesant joc de duplicitate, ncepnd d,e la pereehea de'baze azot'ate specifice, structurile du'blu-catenare, structurile cromozomale bicroma,tidice, existena structuril,or sernicnomati-

Cercetrile lui Sinsheimer (1959) efectuate la bacteriofagut g XL74 a:u artat c ADN la acest virus prezin,t o structur care nu se ncadreaz n modelul de structur bicatenar. ,El nu prezint o structur complementar, fiind atacat de ctre losf odiester'ozo, extras din E. col;i, acliunea acnestei enzime fi,iurd in-

Fig. 20. Bacteriofagul OX 174. a. particule fagice intacte colorate cu ecetat d,e uranil ; b. cromozomal circular (ADI{) molocatenar de OX 17 4 (dup Finch, Dressler gi Wolfson, din Goodenough gi Levine, 1971).
32

dice qi contiqrund cu existenta a d,ou seturi de cromozomi n garni'ttrra diploid (numrul, d,e cr,omozomi variaz 'd,e la 1 la precariote tra cel pufin 2 (Ascorris megaloceplwla uniuq,tm,s) sau 4 (HWlopappus gracilis compozit) qi ajurgfnd la ordinul a B, 10, 20,100 qi mai mu,lfi la al,e eucariote (Lima-de-Fari.a ns, consicler c oric,e celul 'eucariot are de fapt nevoie doar de 3 crornozomi: un autoz'o,m pe care s fie plasat'e majoritatea gn'elor, un cromo zom de sex care s intervin n determinarea s,exului qi un cromozom organizator nuel'ear eare s posede, genele nucleolare) apoi dou sex,e separa,te, implicnd dou tipuri Ce gameli diametral ,opuse qi terminnd cu larg raspnditele cazuri d,e simetrii ale naturii (s lum doar fiin@ timan, doi ,ochi, dou urechi, dou nri, dou mini, dou pcioar, . . , e,te . . .). Complernentaritatea apare ca o condi{ie esenlial n desfgLlrarea multor fenomene ale naturii. n cazuL ADN, complementaritatea catenelor din structura dublu-catenab est'e esenfiai n procesele de replicare Ei transcriene, iar 'existenta a clou caten,e apare ca o ,,grij( a naturii de r asigura ,transmiterea fidel a informaliei ereditare n condiliile n carre fenomenul mutagen ar afecta urr- dintre cele dou catene. Dac muta{ia afecteaz o structur monocatenar gansa d'e a transmite fidel irnformafia ereditar este practic nml, p cnd n cazul structurii dublu-catenare aceast qans este de 500/* Dealtfe}, vom vedea c n cazul reparrii 'leziunilor din ADN induse de mutageni, integritatea uneia dintre cele dou catene ale dublului helix ADN devine esential, condifie sine qua non a reuqitei repaieirii. Este d,e la' sine nleles c aceas't ,,gii;" a ADN, spre a-$i asigura nd'eplinirea funcfiei sale, ru are nimic d'e-a faoe ' ''' :l cuaspet"d,etelologie.
3.6.

c.$urarEA

DE aDN gr TNFoRMATTa EREDTTARA

da Feulgen-Ross'enbeck). Cantitatea dp ADN este specific fiecrei specii, a menfinndu-se consta,rft de Ia o generafie celular ia alta. n ciclul celular (perioada dintre dou diviziuni succesive alctuit din in,terfaz Ei mitoz) se r,emarc o.trecere a cantittii de ADN de la ,o valoare considera't diploid .tipic pentru fiecare specie (2 C) gi care se nregistreaz ,1a' sfrEitul diviziunii nuclear,' cnd nucleii fii trec n interf az; la dubla3 - Descifrnd tainele ereditiii, vol. I

Canr' fuuu relativ de ADN poate fi apreciat citofoto,metric prin anatifa nucleilor interfazici colonafi cu leueofuxin (meto-

33

rea ac,6tei cantitti de ADhT (4 C) n timpul interfazei. La urmtoarea diviziune nuclear prin intervenlia aparatului mitotic cantitatea dubt (4 C) de ADN va fi distrirbui't echilibra,t n c,elulele fiice, acestea primind o aceeaEi canti'tate diploid (2 C) de ADN. Mitozn apare astfel ca un mecarrism ,bi'ologic fundarnental car s asigur constanta cantitativ a ADN-ului n succesiunea g'enerafiilor celulare. Nlitoza apare astfel ca e permanen:t legtur ntre trecut Ei prezent, asigurnd transmi,t,erea unei aceleiaEi' cantit{i de informalie genetic de la celula ma,m la celulele fi.ice (Gawil Ei Dbal, 1975). S-a mai constatat c n gamefi (celule sexuale) cantita'tea .le ADN este r'edus la jumtate fa! de can,titateia dipl,oid car,acteristic speciei considera,te (2 C). Din aceast cauz, gaffielii snt haploizi (cantitatea de ADN:lC). Totodat s-a constatat c n gameti numrul de cromozomi,est,e redu's Ia jumtate fa! de celulele somatice (toate celelalte celule a1e organismului. Prin unirea gamefil,or de sex opus, n pr,ocesul fecundrii, s,e restabileEte cantitatea, n,ormal de ADN caracteristic speci'ei date (1C + 1C=:2C). Ga,melii apar n urma unei diviziuni celulane de tip specia'l numit meiozd,, aceasta fiind de fapt o diviziune de reducere (nium'ttire) a numrului de cromozoml Ei t,otodat a cantitalii de ADI.I. Meioza apare ca u,n mecanism compensatoriu al fecundrii, obligatoriu la oranismele cu reproducere s'exuat care previne mrir,ea exponenfial a cantittii de ADN, ce ar avea loc n condiliile unei fecundri a gamelilor a crror cantitate de, ADN nu ar fi redus la jumatate comparativ cu celule,le somatise. ADN-uI se caracterzeaz printr-o nemarcabil c'onstan! cantitativ riguroas dea lun,gul generaliilor c.elulare, ceea ce n,u 'este eazul altor com,ponente macromoleculare atre' celulei (proteine, acizi ribonucleici etc.) care prezint varialii canti"tative evidene nu numai de-a lungul generaliilor celulare dar ehiar n cadrul diferi'elor ce'lule ale aceluiaEi organ'ism ia un m,ome,nt dat. Recent, s-au adus multe date n sprijinui unor exc,epfii de ]E rqgula cronstenlei valorii canrtitaive a ADN, n ciclul celular, rearliznd'u-se vari,alii ae cantitlii de, ADN prin mecanisme de replicare diferenfiat a ADN (Nagl, 1978, 1979). Prin experirenle de marcar,e cu izotopi radioactivi (1tr3, CI4, P31 s-a constatat, c radioactivitatea odata ncorporat n macromoleeula de ADN (de exemplu timidina tritia't timidina H3 este ncrcrporat n' ADN n locul timinei fiind un precursor al acesteia) nu o mai prseEte atta timp ct celula tr34

ieSte, cea ce nseamn c, odat sintetizat, rnacromolecul,a de ADN nu ma'i este dezagregat spr a fi resinrtetizat. Aceasta nseamn c spre deosebire de alte oomponente macromoleculare

prfu:tr-o,rnare stabilitate. Urmrind cin,etica' renaturrii ADN-ului denaturat car aparline la specii diferite se coxLstat c cu ct specii'le sint rnai apropiate filogenetic cu att proeenul de refacere de strtreturi dublu-catenare este rnai mare, ac;asta deoarrece speciile a'propiate din punct de vedere fiL,ogenetic prezint ntr-o proporfie mai mare succesiuni similare de baze azotatn n macromolecula lor de ADN, adic pr,ezint u,n anumit fond de informafie ereditar co,nnun. Acest fapt ne face s gn'dim c ,evolufia speciilor s-a desfqurat n principal la nivel molecular.
3.7. STNTEZA REPLICATIVA

care sqrfer turnover rapid (degradare Ei resintez ,cu sctrirnib continuu de ,atomi) macromolecula de ADN se caracterizeaz,

A ADN

Deoarece ADN confine informatia genetic a celulei, sinteza sa este unul dintre cele mai importante evenimente din via,fa

Realiza,t prin intervenfia unui cornplex aparat errzimatic, sinteza ADN este o reaclie de tip repficativ, fiind ,rrnicul caz din lumea biomoleculelor n care o substant qi dirijeaz prcpria 'sa sintez. Complexul de replicare care include aparatul enzimatic Ei molecula, de ADN n replicar'e se num'e$te repli-

acestei,a.

to%ouotura

tbic,anrtenar se dov'edeqte avea implicafii ,biologice dintre ,cel,e mai profunde, dar prezint Ei un foar,'te iqLteresant punet de dezbatere filozofic ea expl,icnd, cel pulin n parte, unele dintre misterele vielii. In uirso, sintez,a ae,zilor nucleici (ADN gi ARN) s,e d.esfqoar n trei etape: a) stnteza precursorilor nucleotid'elor purinice qi pirimidinice adic a acidului uridilic Ei a acidului inozinic (Frg. 2I); b) sirnteza nucl,e,otidelor propriu-zise care intr direct n alctuirea macromoleculelor acizilor nucleici (dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxiguanozintrifosfat (dGTP), dezoxicitidintrifosfat (dCTP) qi dezoxiti'midintrifosfat (dTTP) pentru ADN; ad'enozintrifosfat (ATP), guanizintrifosfat (GTP), citidintrifosfat (CTP) qi uridinrifosfat (UTP) pentm ARN;
35

Acid uridilh ( UMP,

f u'io;n

lrilosfot ( Uf P) tritosfot (CTP)

Citidin

lnterconrersb pirimidinnudeotldic

Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

I

2 .

Dezoxicitidin trifosf ot (d CTP

)l=
I

!cr
Guonosin

trifosot

Dezoxguonosin

lo
I

(GTP)

lnFrcqrversie
prrh-rruc.leo-

trifosfot (dGTP).
Dezoxiodenozin

Adencn trrfosfot (ATP)

trifosfot

(dATP)

i
l
t

Acid inosinic ( IMP)

Fig.
t

2l

. Cile bioslntezei nucleotidelor.

c) polirn,erizarea ordona,t a nucleotidelor ntr-o secvent camplementar unei matrife (dup modelul semiconserl'ativ) sub cataliza unor enzime polimerazice celulare. Sinteza in uitro a ADN a fost realizat de ctre A. K,ornberg, I. Lehma'n,n, M. J. Bessman Si E. S. Simms n 1'J56, n sisterne acelulare folosind un echipamern't enzimatic polim,erazic extras de la E. coli (ADN potimeraza I sau enzirna lui Karrlberg) n prezenfa ionilor Mg++ $i a unei matrile ADI{ naitpoiimerizat. Sinteza in uitro a ARN a fost realizat pentru prima Cat de ctre Marianne Grunberg-Manago Ei Severo Ochoa de La Universitatrea din New York, n anul 1955. Pentru aceasta au folosit un sistem ,enzimatic ARN polimerazic, ionii metalici ,bivalenli (Mg++) Si un segment ADN ca matri!. Mecanismul de replicare ssmiconseruatiud, a ADN pr:supune separarea ca,tenelor complementar,e prin desfacer,ea punlilor de
36

unui noi

hidro'gpn, fiecare caten servind drept matri! pentru sinteza catene, complementare, refcndu-se a,stfel structura bicatenar a noilor macromol,ecule ADN care vor avea astfel cte o cat,en veche Ei alta nou sintetizat,. Acesta este modelul sernicanseruatiu de replicare a ADN. Prima dovad experimentat n spriiinul m,odelului semiconservativ de replicar a ADN este aclus ia nivel cromozoma de ctre H. Taylor (1957, 1958) n sistemele eucariote qi n acelagi timp, la nivel molecular', de ctre meselson qi Stahl (1958) n sistemel'e procariote (8. coli). +vr Inc din anul 1950 Srvift artase c replica'rea ADhl n celulele eucariote este restrns doar la inteif az, la un stacliu pe care Flowarcl qi Pelc l-au numit stadiu ,,So', separat cle ctiviziunea pr,ecedent printr-un stacliu G1 (de gol sintetic) qi urmat de trn stadiu G2 n care, de asemera nu se mai sintetize'az ADN. G1 este f'oarte varia,bil durnd de La 3-4 ore, la zile, sptmni qi luni, depinznd de tipul de celul gi starea fizioiogic (Gavril gi Dbal, 1975) . G2 este mult, mai constant, clurnd 2-5 or,e iar S clureaz 7 ore. Pregtirea nucleului pentru re-B plicarea A.DN se face . n Gt, fapt demonstrat de expuner,e,a, prin transplant a nucleilor, Ia citoplasma celulelor aflate n Gr (nu qi n atte f.aze) care arat c ace;ti nuclei i,ntr de ndat :n stadiul,S, de sintez a ADN. n 1957 Taylor, W.oods $i }lughes au efectuat experienfe ,autoradiografice la cromozomii cle Vicia faba, folosind timidina tritiat (3H) precursor al timinei. Radicelele crescute pe mediu cu timidin au pr,ezen,tat crorrt:o-3g zomii uniform rnarcali pe toat lungimea 1or. Ele au fost apoi transferate pe rnediu fr timidin tritiat (mediu ,,rece'(). I,adicele au frost tra,tate cu colchicin pentru a fi prevenit formarea fusului de diviziune astfel c produgii replicrii fiecrui crom,ozom rmn unili la nivelul centromerului. S-au efectuat preparate citologice pentru cromozomi dup un ciclu cle diviziune, dup dou cicluri etc. Cnd au fost analizat'e autoi'acliografic aceste preparate, autoradiogramele cromozomiior" clin radicele cultivate pe m,ecliu cu timidina tritiat prezentatr ambele crornatide marcate radioactiv (FiS. 22). Cnd s-au efectuat preparate din raciicele cultivate pe rnediu radioactiv qi apoi transfera.te pe mediu neraclioactiv (fr timidin pentru -lH), un singur ciclu celular (o si;ngur diviziune). cromozomii din aeeast a doua rnetaf az, statrn'ochinetic cl'e clup mal'care prezentau o cromatid rnarcat qi alta nemarcat. Aceasta a fost prima dovad experim'ental cert n sprijinui modelului serniconservativ de replicare a ADN. El a fost dovedit gi la alte organisrne vegtale pi:ecurn Crepis gi Belleuolia. Dar ela
37

:/
a
doua

duprcare ctt :[:#,!;:::;3 lintdin frtraf dup marceie

(anbele cranalide narcaf e )

c,tpticare rri linrdin frifat

nefafa
re

drp;

sf afncchinetic
mdi'ca

'

( o c 'ona f ,,C rna rcaf si a rf a na narrat I

Fig. 22. lVIodelul replicrii semiconservative a cromozomuiui eucariot

(Taylor, Woods gi Hughes, 1957)

(duplt

d,ovad inclirect a replicr:ii ADN, prin care de 'fapt s,e dovedea replicare,a semicons,ervativ a cromozomi'lor. Dovad direct, la ni.vel m,olecular, a replicrii semiconservative a ADN a fost adus n 1958 de ctne Mese,lson Ei Stahl, prin experienfe de transfer izotopic (FiS. 23). Autorii au crescut pentru multe genera{ii ceLular.e E. col,i pe mediu n car'e n

Mode(e de obsorbfre UV dup

centrilugort
-

lnbrptltqre
in tcrm6 deruptrcore

totogrcfterit tn
UV

Aspcctut.

ccmiatserntiv

:ffi
Crenerofic
ADN
f
1

J
^ /\,r!
(1958)

!,octerii trons-

extros din

r:rote

cu lltN

pe mecu

Fig.23. Reqrezentarea grafic a experieufet lui Meselson Si Stahl

: u$or'i"S;tilr J" ;^:Tffi*i:t(til

ffi ilHPir#r.-

.L - light heavv

3B

sursa, de anlt (NHrrCl) iurra nu azotul normal' 11'N ci iz t,opul su greu 15N, astfel c n macromolecula ADN atomii cle N erau rprezentanli de 15N. n prealabil s-au fcut cercetri de ultracentrifugare qi s-a constatat c ADN cu 1r'N bande az diferit (mai sus n tubul de centrifug) fata de ADN cu 15N care hande az la un nivel inferior, spre fundul tubului de centrifug. Dup cre$terea bacteriei pe mediu cu 15N pentru rnult,e generafii, celulele snt transferate pe mediu cu t4N pentru a desfgura un singur ciclu de diviziune (a crui durat era precis deterrninat 90 minute). S-a extras ADN Ei s-a ul'tra'centrifugat. S-a c,onstatat c a,cest ADN ,bandeaz la un nirtel intermediar n,tre 14N qi 15N. Cu alte cuvinte acesta era un ADN hibrid, n care o caten prezenta ca atomi de N, azotul normal 14N iar catiena complementar prezenta izotopul greu al, acestuia l5N. Dup dou generafii celulare d 'la transfei pe mediu cu 14N se constata c propor{ia de ADN hibrid 14N 15N scade la jumtat,, cea,lalt jumtate fiind reprzntat de ADN cu 14N, dup trei generalii raportul dintre' cantitatea de ADN hibricl qi ADN c,u 14N este de 1 : 3 q.a.m.d. (Mode1 semiconservativ de replicar s ADN propus de ctne, Wafuon gi' Crick n 1953)" Mod'elul semiconservativ de replicare a ADN asigur o continuitate a fenomenului ereditar, cci cele dou noi' molecule bicatenar'e de' ADN sn,t identice pe de o parte ntre ele, iar pe de alt parte snt identice cu uurcromolecula inilial (parental) de ADN ca,re $i-a ,,topit(( iidentitatea n sinteza rnoleculelor fiice. Primul eveniment a} replicrii ADN ,este desfac,erea, separ,area catenelor complementare aLe dublului helix din care cauz molecula de ADN }'a punctul de replicare are form de U, aceast structur fiind,,, numit bifurcagie de replicere. ADN este replicat cu ajutonil unui complex multienzimatic nurnit' ,,aporat de rep1icare66. Ansamb,lul de evenirneur,te care realizeaz, replicar,@ ADN a fost conve,nfi,onal rnprlit n inifierea, continuarea Ei terminairea replicrii, etape care se pot ntlni Ei n sinteza altor 'rnacrornolecule informafionale' (ARN Ei pro'teine). ADN natural se afl sub form de structur ter{iar, structur n car, el este superspiralizat. La eucari,ot,e tururile superspiralizate din ADN liniar rezult n urrna asocierii sale cu proteinel,e bazice, hist;one; pe cnd la procariotele, Ia care macromolecula ADN ,este circular, tururile superspiralizate sn't formate prin intervenlia unei enzime speciale care s-a nu,mit ADN Eirazn, aceasta aclionnd chiar din, m,omentul replicrii. Tururile superhelicale pot s apar Ei'ca rezultat aI desfacerii (desfaqurrii) dublului helix n
39

r
tirnpul replicrii. Din cauza vitezel mari cu care ar loc. desrsuci{ea dublului helix n fata bifurca{iei d'e replicane, rnai ales ia moleculele :ci,rcular, .nchise rse forrae az o supe,rspiralizare, astfel c o ,etap' necesan, n replicarea ADN ,ste ,ftd,o.'. prtarea structurilor terfiare superspiializate, n scast, ,proces intervin enzime care, ralaxeaz, tensiunea de ,,:rsucire, ,prin crestat"ea unei catene naintea 'bifurcafiei gi astupapea ;acestei crestturi dup ce s:-a reaLizat relaxarea. Aceste erZime, s:ru numit enzim,e de crestore-,ast'ttpw, descrise att la procariote ct qi ia eucariote. S-a mai descris Ei ,enzirna Al)N=topozorneTazQ, o enzim care introcluce ,o cresttur morl,ocatenar tranzitorie n duplexul ADN, oferind astfei LtR pivot pentru clespi=
raliz.area

Pentru desfacerea, ,punfilor" de hidrogen dintre ca'tenele corn,plementare n veder,ea replicrii inlervine o enzinrr destabilizatoal"e a dublului helix care a fost numit unusindszd., Catenele compl,ementare separate funcfiori.eaz ca rnatrif pentru sinteza de noi cate'ne complementare. Nucleotideie 5'* trifosf at libere din mediu se aliniaz pe matri{, mperechnclu-se cu bazele complementare d,e pe aceasta cu italbilirea unor Punli cle hiCrogen. Enzima ADN polimerozq dependen,t de ADiV catalizeaz formaiea legturilor covalente : fosfodies, terice dintre nucleotidele nvecin",ate. Inilial a fost descris rrr zima polim,erazic. ADN polimnraza I sau enzi'ma tui Kot*rtberg ca avnd rol esen{ial n replicsr'e, dar cercet,ri ulterioarq au stalbilit c ea intervine ,nu*ui ntr-,o etap ulterioar a pr.ocesului ar'nd rol esenfial n sinteza rep.ara,torie. As tzi estg urnanim acceptat, interve'ntia n etapele inifiale a;le,. neplicr:ii ca Er n alungirea catenei nou sintet z,a'te a enzim,ei polim,erazice dese,m;nat ADN pol,imeroaa III. Toate enzimele polimerazice eu capacitatea de a alungi numai catene polinucleotidice deja existent,e,,rlu ns'Ei de a initia sinteza ,,de no'vott ,a unei cate,ne. Pentru aceasta ele rlce-r sit un elem'ent ajuttor prin car,e se: primeaz (i,nifiazl o as,ernrr,ea sintez. n calitate de primer poate fi folosi,t ,un mic segment de ARN lung de cteva nucl,eotid'e. De aceea primul e'v"eniment n replicare dup destabilizarea (,,topirea{t) dubtrului heiix este si'nteza prin in,tervenfia enzimei ARN pattmerazd, 'a unu$ ARN primer. Acesta ofer ADN polimerwzei un cap't 3'-OFI liber al crui nuclmtid,este mperecheat cu,o baz oornplementar din matrif. Acurn, ADN pcttimero,za, catalizeaz,& reacfia de cond,ensare a acestei grupe 3'-OH a prim,erului ,$i a gr.upei 5'-f,osfat a', primului nucleotid 5:-trifosfa.t a,l.iniat pe
,

superhelicelor.

40

i
I I
I

rnatritr,'',cui realizarea primei ,le,g'turi covalente f,osfodiesterice. Replicarea ,ADN este ,astfef ini{iat. Are loc alungirea noii catene, ;captul ,3f-OlI al fiecrui, nucle,otid aliniat servind de fiecare dat ca prim,er, din care eauz catena de ADIV nou sJntetizat' se mai numeqte Ei ADN primer. Proeesul continu pn 'ce es.te f,olosit ntreaga matri! avnd loc sinteza cte unei caterr-e complementare matri$el'or cu forrnra, . t dou rnolecule fiice identice de ADN. ' Toate' ,ADN plimerazele dependente de ADN pot cataliza adugarea de nucleotide Ia o cten primer numai ca rspuns (n virtutea eomplementarittii bazelor azotte) Ia secvenla d,e baze pe'care or gsesc pe o a doua caten, batena matri!. Astfel dae un grup 3'---OH lib,er de pe o caten primer st 'opus un'ei tirnine pe catena matri{ (ternplate) polim eraza va, permite atagdrea numa,i a unui dezoxiadenozintrifosfat (dATP) la ca,tena ,pfimr chiar dac dCTP, dTTP qi dGTP se afl fur :mediu. Cttd n mediul de reactje' s afl un 'nnestec confnnd ADN ,polimeraze gi nucleo ztd-trifosfafi mpreun cu fragrnente dE ADN; ''aceste 'fragrnente pot servi att ca primer ct qi ca rn6itfit,. . , Polaritatea opus a catenelor-matri{, 3'-+5' a uneia Ei 5'+3' a celeil,alte a, ridica problema existentei ,a dou polimeraze cane s dirijeze potierizara, rtna n- direclia 5':r3' , alta n 'directia' 3'+5i, Aici s-a nregistrat dilema central a replicrii ADN dat fiind faptul c nu au fost descoperite dou enzime' p-olimeraziee care s polimeriz'eze n direcfii opuse. Cercetri' recente au stabilit ns c n repliea,re intenvine o singur enzim esen{ial , ADN polimereza III, car,e are specificitate de direc{ie, nu de se,cven! de nucleotide. Astfel, ,aceast enzim se deplaseaz numai n direcfia 3'-+5' pe anlbele catene-rna,tri!, determinnd polimerizarea noilor catene (replicilor) numai n direc{ia 5'--+3'. Comportamentul polimera'zei III nu este n acord cu m'odelul ini{ial d'e replicare propus de Kornbefg, n qare s,e acorda rol ,esenfial enzimei ADN polimeraza, I, enzim care ar fi determinat o sintez continu a noiIor catene.' Experienle1e de fftfrrcare pulsatorie (pentru scurt !imp) cu timidi'na tritiat ef'ectuate de ctre Okaiaki Ei colab. fntr-e ,19:59-1970 au adus dovezi ,pentru existenta unui model discontinuu de r,eplicare n care, noile catene snt sintetizate pe segmente mici cleotide, cpre'apoi sn! urrile prin punli fosodiesterice eovaLente ,Frip 'aetivitata enzimei, ,ADN-ligwo n segmente mai mari qi n ultim instan{:,reZUlt,'o'caten continu nou sintetizat,
; r. -.' a. '
'

I I I
I

4t

replie a matri{ei (complem:enta'r ,ac'esteia). n aces.t caz, sinteza fiecrui fragment Okazaki este prim,at d,e urr segm,ent d.e ARN primer sintetiza't prin intervenfia ARN polimerazei. Dup sin,teza fragmentului O,kazaki, ARN primer este excizat. Golul rmas n urma exciziei este umplut prin activiatea polim'erazei f. La 'nivelul ,bifurcafiei de replicare sinteza fr,agmentului Okazatki se continu de pe o caten pe cealalt, ADN polflmeraza III srind de, pe .o ca'ten pe cealalt Ei det'ermi,nnd plimeriza,rea pn ce ntIneqte originea ,replicrii n cazul primului s,egment replicat sau bariera segmentului ADN deja r,epJicat n cazul urmoarelor segrnente replicate. n ,acest caz intervine o ,enzim grtdonuclewicd, care deterrnin o incizi.e ,rnon,ocatenar n segmentul ADN nou sintetlz.at ce s'e continu de pe ,o caten pe cealalt n urma creia apare un capt reactant S'-OH fcnd ca procesul de replicare s s,e continu, iar bifurca{ia de replicare s se deplas,eze secvenfial de-a lungul ntregii matrife avnd loq o progresiv desfEurare a dubluluihelix (Fig. 24A). Acesta este modelul ,,cufitului qi furcul,itei" propus de R. Barzilai qi C. Thomas ca o variant a modelului pr'opus d'e Okazaki qi colafboratorii n ca,re n cadrul sintezei
A
?

3'

,"/

5'

3',

t'/ y,,/
r
ctt I

tit 5'
3;

1'j 3'l
3'f

'lt

"5{

Fg. 24A. Replicarea ADN dup mod.elul Okazaki-Kornberg. Se prezint o secvenf de evenirnente (a-d) de despiratizae 9i de replicare segmentat5- la nivelul bifurcafiei uuui dublu-helixADN.ADN-polimeraza cataliz;sinteza ADN numai n direcfia 5'-+-3', d,eplasndu-se pe ambele catene-matrif d.oar n direcfia 3'-;-5', srind., 1a nivelul hifrrcafiei de pe o caten pe celatt, a) Despralizarea dublei-elice (blocurile negre reprezint puncte de inifiere a segmentelot Okazaki putnd fi scurte fragmente de ARN-prmer). A gi B reprezint catenele-matflla. b) Pe m,sura despiralizri, o po$iune din catena B rmne tenporar sub form nonocatenar pn ce o nou molecul de ADN polimeraz ptnrnde la nivelul bifurca$iei spre a umple golul. c) ADN polimeraza determin pe catena A (catena hdding B (tagging

: "**;,:1!fi#;fl:r ;nHffiJf

,:**,*,:ffi:'

42

discon'tinue se sintetizeaz segmente scurte de ADN ataEate la matri{ numta,i prim intermediul punfilor de hidrogen. Dup o scurt perioad de sintcz, pe una din matrife, un segment monocatenar al, celei de-a doua catene parental,e (matri!) st expus. Intenrine o & doua molec,ul de, ADN pol'im,eraz. la nivelul bifurcafiei qi copiaz. acest sqgment expus al celei de-a dou ''maf'rite''n direcfie invens fata de prirna matri! (data fiind plari'tatea lor opus) dar n aceeagi direefie ehimic permis, adic 5'+3' ca pe prima matri!. Mode.lul de replicare discontinu propus de Okazaki a fost unanirn acaptat qi s-a dovedit a fi aplicabil la toatq siste,mele biologice. Este posi'bil ca repficarea pe o caen s fie naintat (sau unires segrnentelor Okaraki s fie mai rapid) iar pe caterur comple,mentan s fie rnai ntrziat (Fig. 248). Replicarea este' reac{fa' cea mai importunt din lumea vie Ei desfqurarea ei cade, dupa cum este Ei firesc, sub incidenla unui strict control celular. Controlu,l este efectuat la mai rnulte nivele. L.a, nivel molecular exist mecanisme care asigur oorecfia repli,crii cci o baz azntat, greEit ,mperechea,t cu b,aza complementar din ma,tri! face ca desfqurarea polimerizrii s nu fie continuat pd c nu este ndeprta't baza aaotat gregit mperechsat. La beza unei asemenea activitti de corecfie st re pare activitatsa ADN polimerazei f. Greqetile de ncorporare datorate acfir.rnrii unor agenfi mutageni sau iarefieaciii n corecfie a ADN polimerazei I stau l,a baza unuia dintre ,mecanisme,le de apari{ie a m'utafiilor. Dac la ,:ptrocariote (bacteriii , astilLomicete) replica,rear nu sste restrns la o f.az, anume a, 'ciclului' celular, B fiind potenlial continu n condilii optime de'mediu pe parcursul ntregutui ciclu :celular, la eucgriote replicarea este restrns la o f.az, b,in delimitata a ciclului celular plasat n interf az. Ei care a fost numit fazo de sinezd ,S. Durata fazei S este variarbit nu nurnai 1,& diferitele specii dar Ei n cadrul aceluia$I individ la nivelul celulelor afliate n difeite stadii de dezvoltar,e, fiind mai scurt n stadiile timpurii ale em,briogene zei fat de celulele somatice diferenfiate. I),e asrrnea faza S prernergtoare meiozei este foarte lung comparativ cu aceea din ciclul mitotic. Cnornozornii euca,riotelor reprezint totodat structuri complexe n care ADN este permanent complexat cu proeine bazice de tip histon. Replic,ar,a, cromozornului eucariot se realiznaz, asincron nu num,ai ntre diferiti cromozomi n@mologi ai comple'm,entu'lui cromozomal al unei oelule dar chia,r la urivelul
43

Ftla.xarea

AI)N-

J finN
T
tte

loooitomerat grret)
toroftint rtP' 3''5')

lirer

SrpiiJft3

cafenelo,c

aheiiwlui A0N {fr0P)

Probrn

desbi lita foars

Frt,nld (frlutd rin':t

'n

, ''(nrornlhr molr/ - n"o"'na dna 8J fi

ARt

Pnmen A tl N

longerea,t2/erter

,toliate,'du

('P

* fltt; l{ ilt tt H ; e x tt:;utfea ,t Slalh'P'smrtt t'

l'8 tl

pilnenta

,0*tderra tovalcnti I

ttle nei

-l. i.b

t Dtt

liyn

Sryerspinali

taret

0/1/

Fig. 24. B. SCHEX,IA COM?LEXULUT ENZTMATTC CARE pAnrrcipt. /N REPLICAREA ADN.' pentru simplificare se arat" n detaliu doar sinteza catenei. succesoare (,,lagging") eare, spre ,deosebire de catena directoare (,,lea-

3' -fr-,1,/;i,:r":,::
5*

J $,'(,ii,,.7).,,J;\

l't-^).ol"r-r-,

9irg")
coli.

In dreapta schernei se red d,enumif,ea proteinei sau enzimei particlpante n ,replicare, iar n stnga se trece funclia pe care aceasta o ind.eplinette. n parantezI- este trecnt denumirea enzimelor sau proteinelor detectate la bacteria'F..
Relaxarea ADN este neeesar spre a permite naintarea bfurcafiei tlo repli-' 9a1e, ngreunat de torsionarea duplexului circutar ADN. Aceast torsionare este ndeprtat prin ac!unea unor enzime care au capacitatea cle a introduce crestturi monocatenare tranziente n duplexul ADN eeea ce perrnite rotatia liber n

are o direcfie de sintez opus direcfiei de migcare a bifurcaliei de replicare-

schimbri n conformalia macromoleculei ADN. Topoizoyneya,za, are d.ou subunitti ce constituie un tetramer. Una din aeeste subunitfi funclioneazi ca topoizirneraz- propriu-zis adic ca enzm de relaxare, fiind sensibil la acid nalidixicun foarte eficient inhibitor al replicrii ADN, pe cnd cea d.e a d.oua subunitate

jurul celeilalte catene. Aceste enzime s-au nurnit inifial swivelaz (pivota za,l , enzirn de crestare-nchiclere, enzim de relaxare a ADN sau unwind,azd, dar acum poart numele de topoizomerazd, ADN, nsemnnd enzim ce deterninl

a topoizonerazei acfioneaz ca ADN girazd, sau protein, omega, introd.ucnd tururi superhelicale n ADN nou sintetizat. Hel'icaza ADN realizeaz separarea catenelor prin ruperea punfilor d.e hidrogen folosind energia provenit prin defosforilarea ATP dependent d.e ADN.

44

unuia qi aceluiaqi cr:orn,o z,o,m. Crom'ozomul eucariot este deci o structur multirepliconic, prezentnd la nivelul su mai multe puncte C,e ini{iere ,a replicrii. tlu,bermann qi Riggs (1968), extragnnd ADN din celulele ,,Hela(i marcat pulsatoriu, au msurat lungimile varia'te ale seqmentelor marca'te pulsatoriu reuEind s calculeze c viteza de repii,care este de L pm/minut (la E. eoli aseasta este de 30 1rm/minut). IJn cromoz,om 'uman de lungime mede ane circa 30 000 um ADN iar cromozomul eucari,ot are a singur molecul de ADN. Dac neplicarea ar fi iniliat la un capat al er,omozomului qi s-,Br desfEura secventral spre cellalt capt ar fi necesare 500 ,ore pentru replicar,ea ADN al unui crorn,ozom. Dar se gtie c replicarea are loc n 6-8 ore. Aceasta a adus nc c clovad c la eucari,ote cromozomul ,are un numr mars de unitli de replicare de lungimi diferite cu un aornportament retrativ independent n replicar,e (Fig. 25). Distribufia produEilor cle replica,r,e (cr,ornozomii fii) se realizeaz, La eucariote prin intervenlia unui complex mecanism mit,otic care este strict controlat ereditar. Replicarea ADN este supus unui control riguros, la nivel molecular, dar a cade
<Helicaza de E. coli se numegte protcina

ADN n direcfia 3'* -5' ndeprtnd catena complementar, p cnd helca.zc III
se deplaseaz[ n direcfia 5'+-3' avnd. aeeeagi acflune. Acfiunea este facilitat de prezenfa proteiuelor neenzimatice unafindoze

re/, qi ea se deplaseaz pe monocatena

lor complementerll

topire a duplexului ,.tDN. Aceste proteine asigut stabilizatea monocaterer lor spre a putea servi ca matrife. Sinteza fragmentelor Okazaki este iniliat prin sinteza unui ARN prirner catalizat de enzima ADN primaza (ARN polimeraza) prod,us al genei dna G care acfioneaz sinergie cu produsul proteinic al genei dna B. Proteina dna B este o AP- azd depend,ent de ADN care se deplaseaz pe matrife folosind energia eliberat priu defosfotilarea ATP. Ea marche az6, la anumite distanfe pozifiile
ne
d.e

FIDP)

sau protei-

pentru sinteza primerului de ctre ADN primaz,, din care

Dup primare se realizeaz, elongarea catenei (polimeizarea uucleotidelor) sub catalza ADN polimerazei lff. Elimiuarea primenrlui ARN se face sub acfiunea RNceai I{ sau a activitfi exonucleazice 5' a ADN polimerazni f.Golul rAmas dup excizia primerului este umplut prh acfiunea polmerizatoare a ADN polivnerazei f . Intervine apoi ADN ligaza care tealizeaz, nchiderea covalent a catenei (unirea prin punti fosfodiesterice a fragmentului Okazaki recent sintetizat cu cel preced.ent, realizind.u-se astfel treptat sinteza unei catene urtice catena nou sintetizat sau replica). Dup teahzarea replicrii intervine ADN giraza sau proteina omega spre a conferi moleculei fiice d.e ADN starea supespiralizati, stare care este normal, stabil, fiiud. cerut se pare d.e funcfiorarea sa n replicare, transcriere gi recombinare (Dup WACKERNAGEL, 'W'. 1980 Replication (in :) Progress in Botany, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork, 154- 170). 45

tor mobil".

caaz, s-a

numit ,,prono-

F
. ount r [ -" " lernrnll
puncf
ca
-

terninal
nui.,

gn cl t ^rninal

unilaf ea de I untlatea dP t FreplicarelT'-repticare Z -1 calena nou stnlelizat

l#.r

;ffilF

,-Sffit*'

25. Modelul lui Huberman gi Riggs (1968) d,e replicare a, ADN eucaiot. Snt reprezentate douA unitAfi de replicare adiacente care apar ad.esea $ n imagi nile autoradiografice ale fibrei de cromatfut. Cele dou unitfi de replicare desemnate I gi 2 au fieeare cte un pnnct de inifiere a sintezei ADN 11, respectiv fr, la nivelul croa se corctituie n timpul replicrii buclele de replicare {ochi de replicare) corespunzAtoare. Fiecare unitate de replicare are un punct terminus indicat prin baie transversale. a) Inainte de reptcare. b) Replicarea a nceput n unitatea 1 dar nu nc. n uuitatea 2. c) Replicarea este complet r untatea 1 ti a nceput n unitate a. 2. d) Replicarea este complet n ambele unitfi. e) Dublu-helixurile fiice separate n punctul terminal comun dar snt nc unite cu segmentele ad.iacente. n d.reapta se eprezint, schematic , ,grainuritre" obser-

Fig.

vate n autoradiografie.

Si sub incidenfa un,or semnale venite din citoplasm. n urrna ul,or fuziuni cel,ulare dintr,e celule a'flate n S Si GL are loc o sintez prernatur de ADN n nucleul aflat n GL urmat de oondensar,ea prematur a cr,omozomilor. Condensarea crornatinei crom,ozomale poate duce la aooperirea $i deci la reducera numrului unor punct,e de inifiere a replicrii. Cr'omatina cond,ensa,t numit heter'ocr,omatin prrezint o replicare tardiv n faza S comparativ cu cromatina difuz eucnomatina.
:

i I i

46

I
F

de ini{iere la ,eucariote. Replicarea ADN este nsofit gi de sinteza d,e proteine histonice. Cei mai important este ns reglajul genetic al replicrii. La eucariote exist un control i"ntracromazornnl aI rephcarii. Tofi repliconii dintr-un cromozom eucariot, avnd dimensiuni diferite, trebuie s funcfioneze n cadrul aceleiagi perioade S din inberfaz, repliconii de la nivelul heterocromatinei (bogat n AT) funclionnd spre sfrgitul acestei perioade S, ,pe cind cei d,e la nivelul eucromatinei (bogata n GC) funcfioneaza la nceputul acesteia. Cromozomul Y de drosofil, care este n cea rrrai mare parte heterocromatic, se replic mai trziu fa! de ceilalfi cromozomi gi acest lucru este valabil Ei atunci cind are loc trarrslocarea unor prfi ale sale n cromozomi ,eucrotnatici. Acreasta nseamn c prlile cromoz,omului Y confin informafia care regleaz timpul replicrii 1or. La eucariote replicarea ADN nuclear Ei extranuclear este reglat gi Ia nitselul celular. Pentru replicarea ADN este necesar enzima tirnidinkinnzd. care este sintetizat nainte de mitoz qi este hidrolizat sau inactivat dup realizarea repiicrii. Sinteza ADN inceteaz cnd s-a atins nivelul 4 C, ceea c presupu,ne un mecanism fin de control celular al replicarii ADN. n dezvoltarea timpurie a ovulelor are loc replicarea nuclear fr a avea loc replicarea celular. Toate cazurile de endoreduplicare, poliploidie Ei polinemie arat absenfa unei diviziune nuclear sau celulara. coordonri replicare ADN Faptul c replicarea ADN este dependenta de factori citoplasnatici este demonstrat de constatarea c nucleii dfun neuronii adulli nu sintetizsaz ADN ln mod nor,mal. Daca ns
17

ADN are capacitatea de a exercita un anumit autocsrrtrol ai replicrii sale, prin care este prevenit reactivarea secvenlelor de inifiere imediat dup ce acestea au funclionat n r-.eplicare. n acest proces de autoc.ontrol un rol esenfial se pare c l au diferitele fracliuni de ADN saelit (secrien!,e simple de ADN, dar nalt repetate localiza'te de regul la nivelul regiunilor centromerice) dar mai ales ADN cu secvenfe mijlociu repelate, incluznd secvenf,ele repetate cu simetrie rotatorie invers numite palindroarne de tip ABC XY C'B'A', precum gi (AT) de vreme ce ADN satelit nu se afla Ia secrrente poli toate speciile. -Un rol esenfial n replicarea ADN l joac sinteza ARN sub cata"liza ARN polirnerazei, acest ARN condifionind inifierea repl.icrii ADN, fiind se pare vorba de un ARNm

acesti'nuclei snt transplantafi n ovule activate partenogenetic ale.aceleiaqi specii, in aceEti nuclei are loc replicarea ADN la numai o or de la transplantare. De asemenea, cnd nuclei din blastula medie care sintetiz,eaz ADN sint transplant'ali n ovocite in creqtere care nu mai sintetizeaz ADN, nucleii transplantali nceteaz sinteza ADN. Cnd 1 celulele ,,HeLa" se asociaz experimental nuelei qi citoplasm din stadii diferite ale ciclului celular sinteza ADN este iniliat numai dac nucleii din G1 snt piasali n citopiasma aflat n faza S. S-a tras conluzia c citoplasma S trebuie s oonlin unul sau mai mu1!i factori care promoveaz sinteza ADN nuclear. Este posibil ca aceqti factori citoplasmatici s aib origine nuclear. Replicarea ADN este reglat de asemenea la niuelul ,tesuturilor gi organelor. Snt date. dup care evenimentele desf$urate la nivelul rnembranei nucleare pot influenla sinteza ADN nuelear. Desfqurarea mitozei, frecvenla diviziunii, orientarea fusului mitotic, incapacitatea anumitor cromozomi sau prti din cnomozomi de a se distribui n timpul miozei, frecvenla reoqmbinrii mitotice ca qi distribufia cromozomilor n meioz n urma sinapsei cromozomale snt controlate genetic. Antplif icarea gencd. sau extrareplicarea anumitor segmente din ,$rrori, in special a genelor riibozomale, se desfgoar att n celulele diploide ct qi n celulele endopoliploide ducnd la sinteza unui ADNr amplificat, labii metabolic, fiind degradat dup ce Ei-a ndeplinit funcfia de transcriere (sinteza AIINr). Reoent, Mihescu Ei Gavrit (1980) au evidenfiat fenomenul de amplifioare a genelor ribozomale n celulele de rnamifer n cultur infectate cu adenovirus, tratate n prealahil cu tioacetamid. Uneori ADN amplificat nu este transcris aga cum este cazul cu ADN de la nivelul pufelor insectelor Scinride sau dac este transcris, ARN sintetizat nu este transportat n citoplasm, aoest ADN arnplificat, r,epetitiv, l.,ocalizat de regul la nivelul regiunilor heterocromatice ale genomului putnd juca n principal rol reglator. Hormonii animali gi fitohormonii pot juca un rol important n determinarea unei replicri diferenliate a ADN. Cromomerele cromozomului eucariot al cror ADN sufer o replicare amplifioa de ADN s-au numit arnpliconi. Amplificarea ,si sub48

n celulele suspensorului embrionar de la Phoseolzs se afl cromozomii politeni, la nivelul crora apar,e un fenomen de amplificare genic a ADN satelit. n acelaEi timp apare un

replicarea nu s:rt fenomene alternative, ci coexistente. Astfel,

fenomen de subreplicare a segmentelor ADN car,e cuprind genele ribozomale. Conlinutul total de ADN nuclear apare ns ca un multiplu al valorii diploide.

{ - Desclfrlnd taiuele ereditlii, vol. I

Capitolul
STBUCTURA ARN

II

$I

TBANSCBIEREA GENSIICA

1. GENENALTTATI

zat n proeesul replicrii

ADN are dou funclii pri,mare: funclia autocatalitica, realisae gi

n procesul de sinteza de molecule specifioe, n spet proteine. Dac ADN reprezint substanfa macromolecular cu fiurclie primar ereditar, ARN este implicat n realizarea decodificrii informafiei ereditare care are loc n procesul de biosintez proteinic, cnd secvenla de nucleotide din ADN este mai nti transcris n ARN mesager gi apoi tradus n secvenla de aminoacizi a catenelor polipeptidice. Inc din anul 1952, A. Dounce a artat pentru prima da,t c ADN qi ndeplineqte funcfia heterocatalitic n dou etape: transcrierea qi traduCa qi ADN, ARN este o substan! rnacromolecular, polimer al unor ribonucleotide, avnd de regul structurA monocatenar. Axui principal ai monoca'tenei este reprezentat de o ooloan glucidofosforic ia care snt ataEate hazele azotate (Fig. 26). Ca pentoz, n ARN intr D-ribozo care spre deosebire de 2-deoxi-D-riboza din structura ADN, are patru grupri hidroxil. Bazele azotate din ARN snt dou Tsurinice Adeninn q Guanirn qi d.ou pirimidinice Citozina qi Uronil. Deci locul timinei este luat n ARN de uracil (U) care prezint complementarita,te pentru adenin. Legaturiie fosfodiesterice creeaz o anumit polaritate a monocatenei ARN care va prezenta un capt 3' Ei altul 5'. ln structura ARN, n afa,ra rbazelor tipice ma'i pot intra Ei alte baze, unele modificate dintre car oomun este nucleotidul pseudouridina qi dihidrouracilul mai frecvente n u,nele tipuri de ARN. n cazuri foar,te rane, n structura ARN indr Ei timina.
50

fu,nclia heterocatalitic realizat

cerea mesajului genetic.

ccdtut

Jt 'N- -l.l)^ O-P-O-Cl+

s' *.\ ,--*-ill

I

Adenin

J' t'..1

oGP-o-cH,

\-i4 I I Hc-coN ? ot ,. -A- citozin 'NNHr

d' ir...l I\-,4

II

rN',/\Nu

Gucni;r.

''r-lrJt'A*o-*" ,

(l!
O

r tf"-*

Urocil

o'- o - Ct*j*-N'c-'o

ri
00H
I

-p-

O-CHe

j*,,u'r'

Fig. 26. Formula chimic a uaui poliribonucleotid,

Spre deosebire de ADN, ARN prezint o mare heterogenitate structural-f uncf ional. Degi n general structura ARN este m,onocatenar, acesta poate prezenta prin pliere n urma potrivirii de secvenfe complementar,e, regiuni bicatenare l,a nivelul crora apar perechi de baze azstate unite prin punli de hidrogen. Unele riibovirusuri prezin,t n mod normal ca miez de acid nucleic ARN bicatenar cum este cazul reovirusului. De asemenea diferitetle tipuri de ARN celular nspecial celribozonwl qi
51

l.

de transfer pot prezenta regiuni bicatenare, separate de regiuni

Dat fiind structura principial monocatenar a A.RN proporfia de baze complementare A-U Ei G-C nu realizeaz de regul raportul unitar. Monocatenele ARN au form liniar, nefiind nc decelate molecule circulare de ARN. Numrul de nucleotide ce intr n structura diferitelor tipuri de ARN variaz ntre 75 qi 10.000. Se pot distinge dou categorii esenlial diferite de ARN: AIIN uiroZ materialul ereditar al ribovirusurilor Si ARN celukr molecule care intervin in decodificarea informa{iei ereditare qi traducerea sa in secvenle aminoacidice n procesul de biosintez proteinic celular. ARN uiral. Este ARN care ca Si A"DN este inzestrat cu funclie genetic primar qi anume funcfie de depozitare a informatiei ereditare Ei transmiterea sa n generafiiile virale succesive prin replicare. Se ntlneEte la unele virusuri vegetale, (\IMT), la unii bacteriofagi (Qf3, R 17, MS,;), unele virusuri animale (polio, virusuri poliedrale citoplasmatice de la insecte etc.). Cantitatea de ARN viral reprezint I0/o din greutatea particulei virale cum este cazul virusului influenza sau 6olo ,n cazul VMT. De regul ARN viral este monocatenar (VMT, virusul gripal, polio, fagi Qp, R17 ; F2) sau bicatenar cu catene corr*p.ementare (reovirus). ARN celular. Acest tip de ARN nu codific informalie genetic qi este sintetizat pe matri! ADN, adic transcrie informatia genetic. Niciodat ,ns ARN celular nu ndeplinegte funcfie de matri! pentru pr"opria sa sin'tez, deosebinclu-se principal de ADN sau de ARN viral. El ndeplineqte ns func{ia de primnr n replicarea ADN. 2. TIANSCRIEBEA GENETICA
Transcrierea genetic reprezint un prooes complex desfqurat n mai multe etape, n care pe matri! de ADN se sintetizeaz. mon,oca'tene ARN, asigurindu-se transferul informaliei genetice de la ADN la ARN. n cadrul procesului enzima numit AP"N polimerczd, dependent de ADN recunoaqte secvenle specifice de pe- matrila ADN gi catalizeaz polimerizarea unor ribonucleotide trifosfat libere, aliniate pe matrila
52

monocatenare.

in virtutea complementaritlii de baze azotate de tip A-U, T-A, G-C, C-G, primul partener a1 perechilor fiind lrerze azotate di,n ADN, al doilea fiind baz,e 'azotate ce .snt incluse in catena polirilbonucleotidic. Matrifa Ei catena poliriADN

bonucleotidic nou sintetizat formeaz un hibrid molecular ADN-ARN temporar, prin intermediul pun!ilor de hidrogen din'tre bazele compl.ementare. Ca substrat pentru ARN polimerazi servesc cei patru ri,bonucleotidtrifosfati ATP, GTP, CTP Ei UTP. ARN polimeraza, spre deosebire de ADN-polimerazA are capacitatea de a inilia sinteza ,,de novos a unei catene polinucleotidice fr a neoesita prhTter. Cel mai bine studia,t este ARN polimeroza bacterian. ARN polimeraza bacterian este o enzim compl'ex alctui,tii din 2 su'bunitti a, o su,bunitate B, o subunitate $' Ei factorui alosteric o. Ba are o greutate molecular de 495.000 daltoni. Holoenzima se poate separa n miezul enzimatic gi factorul o. Factorul o este factor de inifier,e, ,el fiind acela care recunoaEte ,o secvenfa specific din ADN (promot'ord), condi{ion'nd form,area comptrexul,ui ADN-ARN polimwaz,. Dup inilierea sintezei ARN factorul o se desprinde de pe holoenzim Ei se poate asocia cu un alt miez'enzimatic cruia i oonfer specifitate pentru matrita ADN. Procesul de transcriere cuprinde ca qi n cazul replicrii. ADN o faz de ini{iere a catenei ARN, o faz, de elongane Ei o faz de terminare a transcrierii. Fiecare faz se desfqoar prin inlervenlia anumitor factori de inifiere, de elongare qi de terminare. ARN polimeraza ese dependenta de ADN, ceea ce nseamn c ea func{ioneaz numai n prezenla matritei ADN. Caiena din duplexul ADN care funclioneaz ca matrif n sinfeza ARN, care 'este deci transcris, se numeEte catend sena. Procesul de inifiere a ,transcrierii pnesupwre mai nti preinifierea n care are loc formar,ea unui complex molecular ADN.ARN polimeraz, enzima recunoscnd prin facorul 6 o sec.ient specific din matrifa ADN cu care se asociaz intim. Urmeaz apoi formarea complexului de iniliere propriu-zis a transcrierii Ei n care este iniliat polimerizarea secvenlial a ribonr-rcleotidelor cu desfSurara alungirii catenei polirlbonucleotidice (ARN), prin formarea de punli fosfodiesterice succesive. Transcrierea poate fi prezentat astfel: ATP -i- GTP

CTP

+ UTP :

matri! ON - ARN ARN polimeraz

+ PPt (pirofosfat)
53

Creqterea catenei ARN are loc prin formarea punfilor fosfodieterice succesive n direc{ia 5'-> 3', adic prin* adilia unui ribonucleotid-5'-fosfat la captul 3'-OH al ri,bonucleotidului precedent.

Formanea punfilor fosfodiesteriae (alungirea catenei ARN) este catalzat de miezul enzimatic al ARN polimerazei. Ribonucleotidul inifiat 5' al unei catene ARN este de obicei un ribonucleotid trifosfat purinic (ATP sau GTP) care gi pstrsz toate grupele fosfat. Aceasta nseamn c n rnatri!, l,a situl de iniliere a transcrierii diferitelor catme ARN se afl fie dezoxitimidinmonofosfatul, fie dezoxicitidinmonofosfatul, ceea ce nseamn c o glupare de pirimidine n ma,trita ADN a,r putea c,onstitui situl de ini{iere a transcrierii ARN, recunoscut de ctre transcriptaz prin facorul o. Situl dn ADN la care se atageaz ARN polimeraza qi a crui secvent este recunoscut n rnod specific de factorul o s-a numit pro,motor. El reprezint o regiune mic dfur matrita ADN de plr la 50 nucleotide lungime, localizat imediat naintca genei sau grupului de gene a crei informa{ie genetic hrelbuie transcris n ARN. De refinut c secvenfa promotorului nu este transeris n ARN. Studiimd inifierea transcrierii ARNm specific pentru enzirna p-galactmid,azd., Gilbrt qi Maxarn au staibil,it n 1973 secvenfa de baze din punctul de inifiere a sin* tnz,ei ARNnz care este urmtoarea:

5',..... TGGAATTGTGAGCCGATAACAATTTCA
3',

3'

Inifierea sinezei ARNnz pentru F-golnftozidnzd este indicat prin sgeat. Se poate cons'ta.a c s;ec'venfa de baz"e, corespunztoar,e sitului de iniliene a transcrierii este boga n perechi A-T. Inilierea transcrierii poate fi ur-hirbat n mod specific de anti,bioticul rifampicin la procariote sau a-amanitin Ia euoariote. $i alti factori snt impl,icafi n controlul inifierii transcri'erii, cel mai important pentru bacterii fiind factorul proteinic CRP (proteina rreceptoa,ne a cata,bolitului) numit nc factor CAP care reprezint protena receptoare a AIVIP ciclic, acest nucLeotid monofosfat ciclic avnd rol important qi multiplu n, reacfiile biochimice lega,te de deoodificarea informaliei genetice. Aibsenfa CRP sau chiar a AMP ciclic duce Ia descreEterea vitezei de initiere a transcrierii qi ca urmare a sintezei ARN.
54

bioticul streptolidigina, care ar'e afinitate pentru ARN polimeraz, inactivnd-o. Aaelaqi efect are acliuniea acinomicitzi D. Terminarea si;ntezei ARN ese drect, condiliona de ntlnirea de ctre compl,exul tripartit de ,transcriere ADN miezul enzimatic al ARN polim,erazei ARN nscnd, a unui sit de tgrminare din cadrul secvenlei -ADN ce este transcrisa cu eliberarea catenei ARN adic a transcriptului qi dezorganizarea complexului de transcriere. Transcriptul ARN ncepe la captul su 5' cu o aga-numit sectsenl ghid sau cozducdtmre (leader) care poate avea pn la 150 de ibaze $i include qi complementul operatorului (vezi reglajul genetic) sau al unei prli a
aeestuia.

Desfqurarea ,transcrierii (elongarea catenei ARN) se realizeazi cu o vitez, de 60 ntrcleotide pe secund, dar viteza de transcriere poate fi influentat de lnsqi secvenfa car,e tnebuie transcris, acesta fiind chilar un rnecanism de reglare a franscrierii. Elongaea catenei ARN este inhibat specific de catre anti-

nar q (rho) care este alctuit dn 6 subunitli identice aranjate n cerc gi care are capacitatea de a se lega Ia ARN pli.maroz. spne a nceta transcrierea la nivelul unor bariere naturale al.e transcrierii care apar n ADN reprezentate de secvenfe specifice de nucleotide localizate fie n cadrul secvenfei unei gene, fie intre gene adiacente. Sinteza ARN se desfqoar polarizat. Transcrierea ncepe la captul 3'-OH al matrifei ADN qi sin3'. Rezult deci, c teza ARN se d,esfEoar n direcfra, 5' -+ atrila gi transcriptul snt antiparalele. n vederea transcrierii are loc ,o desfacere local a dublului helix ADN :r zona ce urmeaz a fi transcris qi apare astfel a$a-numtul ochi, de fiqrnsqie:re. Pe msur ce transcrierea se desfgoar, n urma se reface structura dublu-catenar a ADN Ia parametri si inifiali. Desfaoerea local n transcriere poate fi folosit Si n rreplicarea ADN. In uiuo transcrierea este ,asimetric adic doar una din cele dou caene ale dublului helix ADN serveqe ca matri! pentru sinteza ARN. Dar acest lucru nu nsea,mn c n toate cazurile una gi aceeaqi caten ,a ADN este activ ,n transcriere ian cealalt este inactiv. Pentru o gen dat sau un grup de gene (vezi operonul) o caten ADN este activ n transcriere iar caterra complementar inlactiv, pe cnd, pentru alt gen sau alt gnup de gene aceeaqi ca0en ADN poate fi inactiv iar catena complementar poate fi activ n transcrier,e. Dar dac un
55

T,erminanea transcrierii ns poate avea l,oc prin intervenfia unui factor proteinic care a fost desem,nat factorul de termi-

sqgrnent al unei catene ADN este activ n,transcriere segmenfirl corepunztor de pe catena oomplementar este n mod ,determinat inactiv :r transcriere. Altfel s-ar sintetiza dou ,transcripte care prezentnd oompl'ementaritate ar duce la formare de structuri bicatenare ARN, de regut inaetive n dirijarea sintezei pro0einice. Faetorul o joac rol esenlial n selocfia catenei active; cci n absenfa sa miezul enzimatic al ARN polimerazei nu prezint specificitate de secventa Ei caten, putndu-se l,ega la orice secven! a oricreia dintre cele dou catene ale ADN. n prezenla factorului o ns, ARN polimeraza capt capacitatea de a recunoagte secvenfa specifie de p mtena sel ce trehuie transcris. n naitocondrii s-a stabilit existenfa r,rnei transcrieri gen,etice sirnetrice, am'bele ca,tene ale ADN mitocondrial fiind ac"tive n transcrie're, dar int'ervine Ei aici un mecanism specific car',e degrad.ea,z rapid unul din cele dou transcripte. rnesaEer policistronic, adic care conline transcrisa informafia g_enetiqS pentru mai multe proteine, sistemele dc transcrierg $i de traducre fiind intirn cuplate (FiS. 27), f.apt care Du se. evi-

I"a procariote produsul imediat al' transcrierii s-.ecvenfelor din ADN ce specific sinteza diferitelor proteine este un ARN

E
8-,..
6f;"':r::r
Fig. 27. Transcrierea gi traduceea mesajului genetic la procatiote snt
rt'l ,'. .,:'

freev'efiLt

56

ientiaz la eucariote unde transcrierea are loc n nucleu iar t:aducerea mesajului genetic are loc n cioplasm, la nive-u. ribozomil.or. La eucariote pr,oduEii imediali ai transcrierii sint mult mai mari dect produEii maturi astfel c ei snt supugi unor prelucrri posttranscripli,onale prin care snt pe de ..' prrte modificate unele baze azotate (metiiare, acetilare etc.) -'r sint ,excizate anumite secvenle de baze azotate iar uneori a:iugaie unele secvenle specifice de ,baze (adenilare). n urma ai-s[oi prelucrri posttranscrip{ionale, ARN rrlesagter frrea.ffsor e:::ariotic clevine un ARN masager mnnocistronic ma,tur care jeline informalia ce specific o singur caten polipeptidic. !: :'eglarea transcrierii intervin factori inductori Ei repnesori :ine evidenfia{i mai ales la procariote. La eucariote transcrierea -lDli din cromozomi este dependent de starea decond'ensat i:::erfazic a cromatinei, starea condensat a cromozomilor mi:c:i,-'i sau a heterocromatinei nepermi!nd transcrierea ADN. n ',-elelea transcrierii la nivelul cromozomilor condensali ar,e loe r.l:r proces d'e deslnare local, cu aparilia de ptle sau inele fuJbiani n cazul cromozomilor politeni de diptere. Sinteza -lRN ale loc pe parcursul ntregii interfaze qi continu gi n piofaz cind inceteaz, rencepnd n telofaz. Din 'aceast cauz s-. tras concluzia c ea este condilionat de integritatea mem'branei nucleare Si a nucleolului. Aceasta poae fi justificai pentru sinteza ARN riboz'ornal, nu Si pentru ale categorii de ARN. Mai sigur este c sinteza ARN este condili,onat de
s:area difuz, deconderr.sat a cr,omatinei. Prcpor{ia din ADN la bacterii care este transcris 'este de o:'C:.nul a B0-1000/o pe cnd la eucariote aceasta este mult mai mi-' \2-2007r) Ei este dependenta de tipul celular qi de organismul considerat. Transcrierea la eucariote nu este cuplat ri--i :emporar qi nici spalial cu traducerea mesajuli genetic. Transcrierea a fost vizualizat electr,onomicroscopic att la p:ccariote ct qi la eucariote (FiS. 28 A, B, C) d,e ctre Miller 1; coia'b. (1970). Difelitele categ,orii de ARN celular intervin n etape speci!:ce aie decodificrii informaliei ereclitare. S: pot distinge mai multe tipuri de ARN celular: ARN rnescger', ARN ribozomal, ARN de transfer, ARN heterqen qi -{iN cromozontal. Primele trei tipuri de ARN celular intervin diret-c n procesul decodificrii. 3. ARN mesager (ARl{m) a mai fost numit ARN d,e inforn:.aiie. If.oleculele cle ARNm snl componente centrale n expresir genelor structurale. ARNrn reprezint 20/s din ARN ce37

(,

co

/ /'\

/
,/

ARN

tolrmcrozo

AON

fj
o geno

g$)q"*--:aDN .'/ strrl .Jc rnrtrere Gl tr3f,scrlpt'cr f '. ,' an -

$
vrz rbrte

ARN m

( Nu

sirrt

polrpeptrdele sr ARI'it)

Fig, 28. l. Transcrierea genetic. la procariote. Interptetate dp electronografie.

Fig. 28. B.

(a) - ulr fragruerrt de ADN de ,8. col,i avnd atagate molecue ale enziurci ARN-polinrerazei qi ribozonri; (b--c) - diagranazouei de initiere a trartscrierii cu red.area deplasrii secventiale a ARNpolimerazei spre stnga determinnd sinteza de ARNzra pe mattifa enx. La aceste molecule de ARNm. se atageaz tibozomii, la cape-

tele lor 5', traducnd secvenla sa polinucleotidic ntr-o secvent de

aminoacizi a polipepticlelor pe msur ce aceasta se tleplaseaz spre captul ,,n ciegtr" 3' al mesagcrului; (d) Degradatea ARNm ncepe cu- captul 5' gi astfel ru ruai *:rl"r?."r"qarea de ribozomi care se disa'

.
srl

lo)

trnlnot s'l
de

nroleculo deARN

(br

ot l

tnitlere-ARN '

,d

;1 .

Fig. 25. C. Trauscrierea la eucariote. (a). Electronogtafia unei secvenf ADN n-procesul de trauscriere n ovocita de Triturus airidescens. Moleculele de A'RN transcrise pofnesc radiar din axa ADN. La intersecfia unei catene ARN 9i axei ARN polimeri,z b-f. Secvenfa de evenimente redat diagramatic care duc segment ADN. (b).O molecul de ARN polmeraz ($l) se ataqeaz [a un sit de iniliere pe o secven! d.e ADN ce trebuie transcris la un moment dat. (c). Molecula de eRN polimeraz se deplaseaz,pe catena ADN
d.e

ADN se ail un grauul proteinic dens care cel mai probabil teprezint molecule

la transcierea unui

ttanscriind-o ntt-o secvenf ARN. Dup ce polimeraza + I s-a d.eplasat pe un anumit interval, se atageaz polimeraza * 2 la situl de inifiere gi lucepe_ 9i ea transcrierea, g.a.m.d.. asifel ca pe cnd molecula de ARN asociat cu ARN poJirneraza, nr. I reptezint o secvnf complementa" la aproape ntreaga lungime a unei catene ADN, celelalte asociate cu ARN polimerazele 2, 3, 4 etc. snt proeste eliberat mpre' gresiv mai mici. La termina*i$'ffT'i'ii

irlilJ;J:-eraza

luL,ar, avnd durat scurt de via!. El tra,nscrie informafia genetic de pe un segment al unei catene a dublului helix ADN aonespunztnr unei gene care trebuie s funcfioneze la un moment 'dat Ei funcfioneaz. ca m,atri! pentru sinteza sa- &gmentul din ADN care serveEte ca matri! pentru sinteze ARNnt poate cor,espunde la o gen sau la mai multe gene care delin informa,fia genetic pentru sinteza unor proteille sau enzime
59

nrudite ce controleaz un acelaEi caracter sau rnrervln

aceeaEi cale metatboiic.

Dimensiune'a diferiteior: molecule de ARNrn este n functie de mrirnea mesajului pe care t poart, adic corespuncle secvenlei de baze a diferitelor gene pe care le transcrie, gene care au la rndul lor dimensiuni foarte diferite Ei care specific n consecin! catene polipeptidice de lungime varia'bii. As'tfe1, cons'ta,nta de sedimentare a diferitelor moleculre cle ARNrn cle ia acelaEi organism variaz ntre B S qi 45 S. ARNrn pentru ovalbumi'n cuprinde cca 1890 nucle,oticle. llnul dintre cele mai mari tipuri de ARNnz est,e cel pentru fibroina firului' de mtase din glanda posterioar de Bambyr

lor, 1979).

mori. Acest ARNnz are constanta cle sedimentare de 32 S (Tay-

Durata de r,ta! a ARNrn la procariote este de 2_.1 rninute" De ndat ce au f,ost traduse, moleculele de ARNnr snt distrtrse, evitndu-se astfei aterriie posibile clin structura sa cere ar cluce Ia modificarea mesajului genetic gi la sinteza ce proteine modificate, sau la traducel'ea unui ARNnr care n-r este n eonformitate cu cerinfele de mecliu celnlar care se -.chlrnb rapid de la o perioad de ti'rnp la alta. Cele rnai multe tipuri de ARNm prezint la captul 3' al monoca,tenei o secven! poi[ (A) care este adugat posttranscr'lpfional gi este implicat n conturarea duratei de via! a AF!.N'r. . Complexul enzima'tic care clegradeaz ARNm procariot, are capacitatea de a distinge diferitele tipuri de ARNnx pe cir,re ie degradeaz n mod specific, degradarea fiincl cupiat cu tr"a'clu* cerea mesagerului. La eucariote, la care ciurata de via! a celulei este mai mare +i durata de via! a ARNnz este mai mare, de cca 1-4 ,ore. Att la procariote ct Ei la eucariote exist situalii n care ARNrn are o durat de via'! mai mare. Este cazul celul,eior" cle Bacillus cereus irnduse s devin spori n care ARNnr clureaz cca 6 ore Ei reticuiocitelor mamiferelor n care 900/o diri sinteza proteinic este reprezentat de sinteza hemoglobinel i:rr cnd .se maturiz'eaz, pierd spontan nucleul, nemaifiind der.:i \ireo matri! pentru sinteza ARI{nz pentru hemoglo;bin. Cu toate aceslea, sinteza hemoglobinei este continuat pe seama ARNrz sintetizat' nc din s,tadiul nucleat Ei care persist Ei funclion ettz rnulf timp (cteva zile) dup ace,ea. n cazul dormanlei adoptat de mul.te ou 1a anirnale qi seminlele de plante, ARNrn este menlinut ntr-o for:m stabil pentru luni qi chiar a,ni.
60

gura traducerea mesajului genetic. De regul, la eucariote ARNm este monocistronic Ei transcrie gene care dirijeaz sinteza de polipeptide. Aceste gene snt de regul reprezentate de secvenfe unice, nerepetate din ADN. ARNnz eucariotic se sintetizeaz sutb forma unui precursor heterogen numit qi ARN nuclear he,terogeru care are o ,greutate moiecular de 5 X 105 107 daltoni. S-a mai numit pre-ARNnz. Precursorui ARNm este supus prelucrriior posttranscripfional'e n cadrul crora vor fi eliminate nueleotide, de la captul 5'aI moleculei Ei totodat vor fi adugate la captul 3', 50-200 resturi adenilat formnd un segment de acid poliadenilic care cond.i{ioneaz durata de via! a ARNm La procariote ARNm reprezint copia exact a secvenlei genice,, fr a-i lipsi anumite segmente. La eucariote n cazul unor gene apar por{iuni (secven{e interpuse sar-r spa{iatoare n cadrul secvenfei genice codificatoare) care snt ,transcrise n ARNrz dar nu stnt traduse. O situalie sirmilar apare n cazul unor virusuri anirnale. Asertenea secvenle spaliatoare apar n genele pentru catena f3 a hemoglobinei, h genele pentru imunoglobulin, ovalbumin qi n genele ARN Ei ARNr. Secvenlele spaliatoare snt implicate se pare n reglarea activitfii genice. Ele pot fi transcrisp n ARNrn, dar ulterior snt excizate. Este admis Ei posibilita,tea ca la eucariote ARNrn s fi,e sintetizat segmentar, segmentele fiind ulterior unite ntr-o monocaten unic de ARNnz n care nu snt incluse qi secven{ele spafiatoare. 4. ARN ribozomnl (ARNr). ARNr r'eprezint cca 800/o din ARN celular total qi intr n structura ri'bozomilor care ;snt
61

Moleculeie de ARNrn cu durata lung de via!., cum snt Ei cele din ovulele de ,broasc care snt pstrate multe uni nainte de a fi traduse, snt protejate fa! de atacul enzimelor depolimerizatoare ribonucleaze prin asociere cu categorii speciale de proteine. Asemenea asocieri ARNrn proteine la eucariote care apar nainte de trece,rea ARNrn din rnucleu n citopiasm unde se asociaz cu ribozomii sedii a,le sintezei proteinice au fost numlte informozomi-sau informnfere. La bacterii, genele aflate n raport de contiguitate gi nruclite rnelabolic (legate de aceeagi cale metabolic) formeaz o unita'te reglatoare care s-a numit operon. Ele snt transcrise ntr-un ARNm policistronic ce poart mesajul genetic pentru mai multe proteine. La scurt timp de la inilierea sintezei ARNrn bacterian, ribozomii se ataqeaz la aceasta Ei se deptaseaz de-a iungul su n urma ARN polinterazei, spre a asi-

particule ribonucleoproteinic,e implicate n biosin teza proteinic. Ribozomii confin 40-600/o ARNr qi proteine tbazice ribozomale. Ri:bozomii apar n citoplasma tuturor celulelor procariote gi eucariote avnd un diametru variabil. de 140-230 . Proteinele ribozomale n numr total de 53 la procariote Ei 70-80 la eucariote se leag de ARNr prin legturi necovalente, migurnd stabilitatea structunal a ribozomului permi!nd totodat ataqarea altor tipuri de ARN la riibozom. Prin ataqa,r'ea de ribozomi pe monocatena ARNrn se pstreaz, conformafia monocatenar a acestuia propice decodificarii traducerii mesajul.ui ,genetic. Ri'bozomii se ataqeaz la, ARNrn formnd poliribeotrri sau polizarni, ntre ei fiind o distanf de 50-150 . Ribozomii procariotelor au constanfa de sedimentare 70 S (subunitali 30 S gi 50 S) pe cnd cei eucariotici citoplasuratici au constanta de sedimentare B0 S (subuniffifi 40 S Ei 60 S) fr ca ri'bozomii eucariotici s constituie un grup uniform ,,80 S6c cci greutatea lor moleculara variaz de la 3,9 X 106 daltoni la plante la 4,55 X 100 la mamifere, sohimrbarea masei rirbzomale bazndu-se n special pe variafia dimensiunii subunitafii mari ribozomale (60 S) de Ia 2,4 la 3,05 X 100 daltoni, variafle ca,re este cleterminat de varialia cantitativ att, a ARNr ct qi a proteinelor ri,bozomal,e asociate. Subunitatea rirbozomal mic (40 S) a ri'bozomul.ui eucariot nu s-a schimbat aprecia,bil n cursul evolufiei eucariotelor. Ri'bozornii organitelor celulei eucariote, cloroplastici qi mitocondrial,i snt de tip procariot avnd oonstanta de sedimentare 60-70 S. Prin scderea ooncwttrafiei ionilor Mg2+ sub 0,35 ffiM, riibozomii bacterieni disociaz n subunittil,e 50 S qi 30 S. Greutatea molecular a prroteinelor bazice structurale ribozomale este de 25.000-26.000 dattoni. Proteinele ribozomale snt heterogene fiind descrise dou categorii, urla S, corespunztoare su,bunitlii ribozomale mici qi alta L c\orespunztoare subunitlii ribozomale mari. Fiecare categorie de proteine ri;bozomale are rnai multe fracfiuni Sr-Szr gi L1-L32. Ia, eucar:iote fracfiunile celor dou categorii de proteine ribozomale s,nt mai numeroase. Ele snt esentiale n funcfionarea rirbozomilor. Proteinele riibozomale Lt Qi Lp au proprietali contractile qi se pare c snt implicate n translocarea aminoacizilor n timpul sintezei proteinice. Asamblarea ribozomului realizat l,a rrivelul nucleolului este, cel pulin r parte, ur proces autodire4ionat, deci nedireclionat de alte structuri celulane pneexistente. Snt date dup care unii ribozomi pot fi specific mesageri, cu funclie informalio62

@ "^6(=

p6fi
@>"'
are loc atagarea subunitlii 50 S.

^D9
dup care

Fig. 29. Ciclul ribozomului. Subunitatea 30S se asociaz cu ARNrz

nal. Se pesupune c ARNr posed in uiuo un mesaj tradus, specific pentru sineza proteinel'or ribozomale (Rieger qi colab., 1968, 1976). Interesant este c ritbozomii ca qi cromozomii eucariotici snt organite celulare, lipsi'te de memibrane deiimiante, care prezint totoda,t spre deosebire de alte organite a1e celulei _- irn ciclu caracteristic de organizare Ei desfacere n vederea funcfionrii. Exist astfel un ciclu ri'boz'omai (Fig. 29) (vezi Ei sinteza proteinic) Ei un ciclu cromozomal (vezi .organizarea genetic).* n celulele eucariote care sintetizeaz proteine pentru secrefie-export, majoritatea ribozomilor snt eta$ati la nembranele reticuiului endoplasmic prin intermediul subunittilor mari 60 ,S: Rirb62o*ii lirberi neatagafi la membranele reticulului endoplasmic sintetizeaz pruteine care rmn n citoplasma celulei. Se admite c n acest proaes de seleclie de c'tre ribozomii ataqafi sau neataqa'F la reticulul endoplasmic a unui ARNrn particular spre a fi tradus, un ro1 important 1 joac secvenla lider din ARNrn ce poate fi recunoscut n mocl diferenliat de ctre cele dou tipuri de ribozomi. De asemenea, proteinele destina,te nucleului snt sintetizate pe ribozomii citoplasmatici neataga{i la neticulul endoplasmic. Dup sintez, acest'e proteine snt pompate sau suctiornate n nucleu. Se admite c Ei la procariote ARNrn ce codific proteine speciale snt traduEi n locuri speciale qi prorbabil de ctre ribozomi speciali. As,tfel, la Bacillus sinteza proteazei neutrre, care este secretat n mediu, afie loc pe ribozomi localizali la periferia celulei. n subumitatea ribozoma'I mic intr ARNr de tip 16 S la procariote Ei 18 S la eucariote.
+ Reunirea stunitfi'lor ri,bozomale spre a constitui particuie ribofuncfionale este aleatorie, ceea ce nseamn c reciclarea subunitlilor ribozoma,le ntr-o nou rund de sintez nu presupune asocierea aceloraqi subunitfi care au constituit ribozomii func{ionali ai
zontatre

rundei precedente.

63

F
n subunitatea ribozomal mare intr ARNr de tip 23 S la procariote qi 28 S ta eucariote. Att la procarioe ct Ei la eucariote asociat subunttii ribozomale mari mai intr qi un tip aparte de ARNr, care are constanta de sedimentare 5 S. n plus, la eueariote, s-a descris gi un alt tip de ARNr care are constanta de sedimentare 7 S qi care intra n componenla subunittii mari a ribzomului, existnd la eucariote deci 4 tipuri de molecule de ARNr (Wool,
1e7e).

ARNr' (pre-ARNr) care, dup transcriere, srt supuse, prelucrrilor posttranscriplionale. Acestea includ pe de o parte metilar:ea resturilor rirboz la cca 5oA dintre nucleotide, deterrriinnd diferenlieri calitatve n func{ia catenelor poliribonucleotidice, iar pe de alt parte clivar,ea unor secvenle (eliminarea) ducnd la reducerea lungimii pre-ARNr gi delimitarea unei rnolecule mature de ARNr. Dup pr,elucrarea posttranscripfior,ra'l structura primar mronocatenrar a ARNr poart.e suferi cqrorsionri spaliale cu realizarea de regiuni bicatenare gi cu aparifia unor modele spaliale caracteristice. Genele (ADNr) pentru cele trei caegorii de ARNr snt dispuse n'tandern (policistroni) n ADN (genom) gi snt tnanscrise n ordinea 16 S 23 S la procariote. Aceste gene apar de asemenea strns lincate, Ia eucariote fiind dispuse n'ordinea 18 S pre-ARNr unic care are o:constant qi - 28 S transcrise ca un de sedimentare 45 S. Acesta va fi separat prin prelucrrile posttranscriptionale ulterioare n cele trei tipuri de ARNr matur. La eucariote, genele pentru sinteza ARN 18 S. qi 28 S s'e afi n regiunea orgwuizator nucleolard (NO) Iocalizata la nivelul constricliilor secundar,e implicate n formarea nucleolului. Rezu1t c aceste gene ri'bozomale sint gene nucleolare. EIe snt r,egiuni vital,e ale genomului de vreme ce mutantele de Xenopzs desemnate D-nr.r fur stare homozigot tripsite de nu'crleol nu snt capabile s sintetizeze ARNr gi mor. Genele pentru ARN 5 ,S, prezente qi ele n copii multiple la eucariote snt neLincate cu celela,lte gene ri'bozomale, fiind distrirbui.te pe diverEi cromozomi, n spet n regiunea teiorneric a lor. Deqi nelincate cu genele ri'bozomale LB S qi 28 S, genele ri'bozomale 5 S snt transcrise coordonat cu genele pentru ARNr 18 S Ei 28 S. S-a constatat c prezenla ARN 5 S n subunitatea mare a ribozomului este esential n funclior.ara normal a rhozomului n sinteza proteinic.
64

Toate m,o1,ecu1e1,e de ARNr att la procariote ct qi la eucariote s'e sintetizeaz sub form de molecule precursoare de

ARNr din cloroplaste gi mi,tocondrii prrezint greutfi molecuiare mai mici dect molecrrlele crespunzatoa,re din citoplasrn.

Nu se cunoaqte deocamdat cane este firncfia particul,an a ARNr. Se admite c bazele nemperechearte din ARNr ar participa, intr-un fel sau altul (posiibil tot pe principiul complementarittii qi for'rnrii de punfi labile de hidrogen) la interacliunea cu oelelale oategorii de ARN celular spr a deoodifica mesajul genetic purtat de ARNnz. Are loc o al,iniere corect a diferitelor tipuri de ARN c'elular cerut de o fidel traduoere a informaliei genetice ntr-o secvenf corect de amnoacizi pentru sinteza unui polipeptid norma'l. Un rol prfurcipal n realizarea acestei alinieri revine ionilor de magneziu (Mg2+1 care joac de asemenea un rol important n asamblarea unitfilor
ribozomale.

Exist diferenle semnifica,tive n structura ribozomilor la procarioe Ei eucariote, diferenle care formeaz ceea ce WooI (1979) a denumit dilema centrald, a rbozomalui. Astfel, ribozomii eucariotici snt apreciabil mai mari dect cei procariotici, conlinnd un numr mai mare de proteine ribozomale (cca 80, fa! de 53 l,a procariote) qi au o mol'ecul n plus de ARN. Totodat moleculel,e de proteine rilbozomal,e Ei de ARNr snt mai mari la eucariote fa! de procariote. Diferenla n dimensiune este un paradox deoarece ribozomii eucariotici ndeplicantonarea sinrtezei pr,oteinice nesc aceeagi funclie general oa +i ri'bozomii procaniotici. Se admite ca peurtru a ju.stifica aceste diferente dimensionale la ri,bozomii eucariotici trebuie desooperite funclii noi. Unele proteine ribozoma,le suplimentare pot fi specializate pentru ineracfiunea cu reeeptorii din reticulul end'oplasmic numili ribophorine I Ei II, altele pot fi implicate n reglar,ea mai complex a traducerii ARNm. Necesitatea suplimentar pentru anumi'te proteine ribozomale, neimplicate n biosinteza proteinic poate fi determinat de panticularitlile biogenezei organitului: proteinele ribozomale snt sintetizate n citopiasm qi tra,nsportate n urucleol uurde snt asamiblate n subunit!ile ri'bozomale prin atagarea lor la precursorii ARNr pe cind acegtia snt nc tr,anscriEi de pe ADN ribozom,al. Pre-ARNr va trebrui prelucrat qi ARNr 5 S'transcris din alte situri n nucleu trebuie s fie :rcorporat n subr:nitatea mane ribozomal. Cele dou subunitfi rirbozomale tnebuie transportate din nuctreu n citopl,asm. n acrest prooes extrem de complicat de transport bidirecfional nucleu citoplasm ar putea fi implicate proteinetre ribozomale suplimerrtar,e ale rirboS - Descifrind tainele ereditfii, vol.
I

65

subunitlilor ri,bozomale ca qi
plasm.

zomului eucariot. Ele de ase,menea pot participa la asamblarea n 'transportul lor spre cito-

Proteinele ribozomale ale organitelor celulei eucariote mitocondriale Ei cl,oroplastice snt codificate n ADN nuclear qi sintetizate pe ribozomi citoplasmatici. Din aceast cauz la eucariote cu mitooondri qi cloroplaste snt sintetizate n citoplasm circa 200 de proteine riibozomale care trebuie distribuite n nucleol, mltooondrii qi cloroplaste. Cum se reaizeaz aceasrt distritbufie nu se cunoaqte. S-ar puea ca toate aceste proeine s fie fil,trate prin cele trei organite, fiecare relinnd grupul corect de proteine ribozomale. S-ar putea ca proteinele suplimentare ale ri,bozomilor eucariotici s condilioneze ele nsele aoeast distriibuire. n sfrqit, nu poate fi exclus nici posibilitatea ca proteinele ri,bozomale suplimentare de la rihozomii eucariotici s nu a,ib ,o funcfie special sau s nu ndeplineasc nici ofuncfie. Exist mutanfi de Bocillus suilis qi B. megateum rezistente la ttriostrepton qi ca,re snt lipsi{i de proeina ribozomal L 1L Mutantul de Ia prima specie spre deoserbire de acelra de la a doua specie de BacilZzs nu prezint nici un fel de deficient. Concluzia care se desprinde este c proteina L L1 la B. wbtilis. mu ndeplineEte \no funcfi,e ribozomal sau n sinteza proteinic, dan nu poae fi orclus posi,bilitatea ca rolul su s fie preluat de al,te pr,oteine ri'bozomale prezente la acest mutant. 5. ARN de transfer (ARN). A mai fost numit qi ARN solubil (ARNs), ARN accegttor de aminoacizi sau AIN adn@r. Snt molecule adaptoare sau de racordare la care se ataqeaz diferiti aminoacizi care sn transferafi la ribozomi n timpul biosintezei proteinice. Ac'este moiecule de racordare se atageaza la rndul lor n mod specific la gruprile cetonice qi aminice libere de pe monocatena ARNrz pe principiul mperecherii complementare de hlazr azotatn cu formarea unor punfi temporare de hidrogen. ARN foac rol cheie n ,biosinteza pr'oteinic. Perntru fiecare aminoacid exist ce1 pufin cte o molecul specific, diferit de ARN. Greutaea mol.ecular a ARNf este de circa 25.000 daltoni avnd o oonstant de sedimentare de 4 S. Lungimea molecutrei ARN este de 73-90 nucleotide. Reprezint 7A-150/o din cantitatea total de ARN celular. Ca gi ARNr, ARN nefiind purt'tor de mesaj genetic are, spre deosebire de ARNnz o durat de via{a mare, prrezentnd o stabilitate metabolic mare, diferitele molecule ARN putnd fi reciclate de nenumra'te ori. Captul iiber 3' al monocatenei se
66

ermin la toate tipurile de ARN cu secvenfa CCA pe cnd la oaptul, li'b,er 5' se afl secvenla terminat n G. Moleculele ARNf prezint o mare stabilitae rneta,bolic cane deriv tocmai din prezenfa guaninei (pG) Ia captul 5' al monocate'nei sale. Aceasta faoe oa ARN s nu fie supus aga cum este supus ARNrn digestiei enzimartioe, ,gua,nfura stabilind punti de hidrogen cu ,Lraza opus din ttrlpina dublu-catenar a structurii trifoliare a ARNf. ARN conline qi unele nucleotide areo iqnuie pnecum acidul inosinic (I) care poart purfura hipoxamtilra gi care nu formeaz aceleaqi per,echi de baze azotate ca oele formate de A Si G. Alte nucleotide neobiqnuite aflate n ARN srt acidul l-metiliinosisric (I-) acidul l-metilguan,lic (G-) gi acidul NlN-dimetilguami,lic (G-) la care, prezenta gmprilor mgtil determin formanea de perechi cu oricarre ate tb,aze azotate. Tot ca baz, neobiEnuit intr n ARN gi aeidul pseudouridilic (f) la care inelul pirimidilic uracil este ata$at lra riboz nu prin azotul sAu N1 ca n acidul uridilic normadt ci prin carjbonul su 5. Acidul ,riiboti,midilic (T) ese de asemenea o riibonucleotid neorbiqnult ce intr n ARN qi care este Lega de convertirea uracilului n timfur n urma unei metilri a uracilului la C 5. Mai exist Ei o alt bazi'neorbi.qnuit n ARN qi anume acidul d[hidrouridilic (Ui) sau DHU) n care uracilul poart hidrogen suplimentar la C 5 qi C 6. ln realitate dihidrouracilul nu este o pirimidin deoanece legtura dintre C 5 gi C 6 nu este o punte durbl ci, uina simpl. Nucleotidele neobiqniuite nu pot fi introduse n pnecursorul ARN n timpul transcrierii, prin nici un mecanism de mper,echere de baz.e complementare. Ele apar n urma modificri,lor posttaranscriplionale a nucleoidelor norm,ale, deja prezente n pre-ARN. Prin plierea monocatenei rezult rqgiuni dublu-catenare n zonele r car,e ,bazele azatat'e se mpenecheaz compl,ementar cu formar,ea d,e punfi de hidrog'en. Din ara,nfamentul spatia,l al regiunilor bicatenare qi a1 r,egiunilor monocatenare rezult o structur secundar care este cunoscut ca m,odelul frunzei d'e trifoi (FiS. 30). Structura secundar ,bidimensional po.ate fi la rndul ei supus plierii sprc a da o str-uctur terliar tridimerr.sion,al caracteristic de forma li'terei T (Fig. 30c). n structura unor tipuri de ARN inr gi inosina (I) mai ales n secvenla antioodonului pen'tru codomii serinei (UCU), leucinei (CUU), pr,olinei (CCC), argtrinei (CGC), izoleucinei (AUA) ,etc., n care inozina (I) intr n pozifia 3 antiparalel (deci pozilia L n citire dir,ect). Neputfndu-se mpereehea, bazele metilate deiimiteaz regiuni'le bioatenare ale monocatenei.
67

I
lr'
6 .ogt'/ 3oH , daq:l9roa o ordmcrddu -brllul lu
G

(b,
hollt al f ia&:rt

@eG\

u c6o

9c

blo
U

i?!ota

mitrf:.ft!)

l,r'nr' irlCl

hrt

oHq.

'iG "l' {s ru

G2o

l9 ig'a g\ r, i, u i,rq,.!r ln lg' Ir'

hU

.m UA 6mA l
lc)

Fg. 30. Structura ARNI. (a). Secvenfa celor 76 nucleotide din macromolecula de ARNI pentru alauin de la drojdie prezentat n modelul birlirnensional al fnrnzei de trifoi. Se indic cele patu bucle majore incluznd gi bucla anticodonului ca.re are secve[ta A-A-A gi care se pottivette prin complementaritate cod,onului din ARNz fenilalanin U-U-U. Bazele ncercuite cu linii continui ocup
aceleagi prclzlii

snt: lU: DihU: dihid.rouridina, Y:pseudouridina, mx : nucleotide metilate ti - timina (un uracil metilat n pozifia 5 n inelul pirimidinic). (b). Diagrama schematic care indic maniera n care ARNtFtea poate fi rsucit spre a produce unele dintte relafiile fizice observate ntre diferitele prfi ale moleculei. Liniile subiri indic punfile de hid.rogen ce apar ntre baze n cadrul structurii tertiare pliate. (c). O reprezentare trid.imensional a ARN redat dup studii

n toate moleculele de ARN care au fost analizate pn in prezent. Bazele ncercuite cu linii nherupte snt .iferite la alte tipuri de ARNf. Numerotarea bazelor ncepe de la captu1 5'. Nucleotidele aeobignuite gsite la ARN

de difracfie n raze X.

Descifrarea secvenlei de baze din structura primar monocatenar a ARN pen,tru alanin la drojdie precum qi a structurii sale secundare cnfiguraia spatial cu negiuni monoca,tenare qi bicatenare - au permis lui HolLey $i colaboratorilor si s

68

frunzei de trifoi pentru aceast configuralie spafial eare s-a dovedi,t a fi valalbil pentru oate tipurile de ARN. Pentru aceast realizare Holley a fost distins cu premiul Nobel. Folosind datele de secvenfiere a ARN pentuu ala.. nin extras de La drojdie, Khorana qi colaib. au nealizat pe cale chimic, prima sintez a unei ,gene, gena care dirijeaza sinteza ARN pentru alanin. ARNf se sintetizeaz pe mari! de ADN prin intervenlia ARN-polimqoaei qi apare mai rnti ca molecul pr,ecursoare care, dup transcriere, este supus prnlucrrilor posttranscripfionale. Moleculele precursoare la ARN ca Ei la ARNnz prezint la captul 5' o secven! suplimentar numit secvenla conductoare sau din cap (leader) iar la captul 3' alt secverr! suplimentar numit secven{a din coad (troiler). De asrnenea, precunsorul ARN pnezint secvenfe interpuse in cadnul secvenlei care va constitui seeventa ARN matu'r funcfional. Printre prelucrarile posttranscripfionale unele deermin excizia unor nucleotide din pre-ARN sub acfiunea' enzimei RN-ae P (P de la precursoare) pe cnd ,altele determin adi{ia la captul 3' al monocatenei a-secvenlei 5' NCf A 3', implicat n aminoacilarea ARN. Implicarca secven!,ei CCA n amivezi sinnoacilarea ARN (atagarrea aminoacidului activat teza proteinie) a fost dovedit n experienle de ndeprtare a acesteia folosind fosfodiestntaza, din venin de qarpe care aclioneaz numai asupra acestui capt monocatenar ,al moleculei ARN. ARN lipsit de secvenla CCA de Ia captul 3' pierde capacitatea de a accepta aminoacizi. Capacitatea acceptoare pierdu,t a unui ARN tratat cu fosfodiesteraz poate fi redobndit dac acest ARNf deficient este pus lntr-un amestec de reacfie care confine o enzim special (terminaltransferaza) ce are capacitatea de a ,aduga nucl,eotide terminaie fr a necurge la mperecherea complementar de baze cu o matri! polinucleotidic qi substraturile sale CTP qi ATP. Alte prelucrri posttranscriplionale snt cele care realizeaz modificarea chimic a unora dintre nucleotidele rmase. Printre modificrile ehimice mai importante snt metilarea gi formarea pseudouridinei. Modificrile chimice ale nucleotidelor obiEnuite (incluse n ca,ena pre-ARN n timpul transcrierii sale de pe matrila ADN) care due la convertirea lor n nucleotide neobiEnuite snt cataliza,te de enzime speciale existente att Ia procariote ct gi 1a eucariote. O astfel de enzim convertegte grupul NHz de pe carbonul 2 al acidului adenilic din pre-ARN n grupul OH
elab,oreze modelul
69

F
creind astfel un rest inozin la un.ele situri ale catenei preARN. Atrt enzime transfer grupul nretil (enzimele se numesc n cqnsecinfa metilaz,e) la hipoxantin, guanin sau uracil din pre-ARN spne a da I*, G', G- sau T. n sfrqit, alte enzime rearanjeaz legturile dintre inelutr pirimldinic qi ri,boz spne a converti uracilul n pseudouracil sau spre a hidrogena inelul, convertind uracilul n dihidrouridin. Asemenea prelucrri posttranscripfionale au putut fi sfirdiate ,n cazul microinfecliei nucleului de drojdie de ,bere n ovocita de broasc. Prelucrrile posttranscriplionale implic n cazul precursorului ARN (pre-ARN) pentru tirozin de la drojdie, elimin:rrea secvemfelor inrerpuse din pre-ARNf (descris prirna dat de ctr.e Goodmatr Ei colarboratorii n 1977), excizia secvenlelor suplimentar 5' Leader $i 3' trailer, adugarea secventei CCA la captul 3'. Toate aceste prelucrri au loc n nucleu. Tot n nucleu mai snt modificate, n cazul ARN pentru tirozin de la droidi,e sintetizat n ovocite de broasc microinjectate cu nucleu .de drojdie, cel pulin Sapte ribonucleotide nain,te ca ARN s fie transportat din nucleu n citoplasm (Melton Ei colab., 1980). Aoeste modificri ce duc la formarea n pre-ARN a 5 metil-citozinei (m5C), 1, metil-adenozina (-lA), pseudouridina (r) 9i dihidrouridina (DHU) apar n nucleu. O singur modificare apare n cioplasm qi anume a guaninei. S-a constatat c modificril'e apar ntr-o ordin'e pnecis, strict, cane 3e coreleaz cu schimbrile din dimensiunea precurff)rului ARN deterrninate de eliminarea secvenlelor leoder qi trailer. Astfel, de nd,at ce secvenf"a leader este eliminat Ei este adugat 3'CCA, U din regiunea antioodonului este modificat n pseudouridin (tY). Determinarea secvenfei ADN corespunznd Ia 4 din cele B gene ARN pentru tirozin ( ADNyr) de la SacchmwnVces cereuisiae a condus l,a consta,tarea c aceste gene ARN pentru tirozin conlin o secven! interpus de 14 baz'e adiacente anticodonului car'e nu este prezent n ARN rnatur qi deci ea este eiiminat n cadrul prelucrrilor p'osttranscripfionale. Maturarea precursorilor ARN diviza't n mod oonvenlional n dou procse separate reduoerea dimensiunii Ei modificarea de ibaze reprezint u,n proces unic, cci cele dou aspeote snt inim legate, desfqur,flndu-se conoentr,an't. Succresilrnea ordonat a etapelor de prelucrare posttranscripfional a ARN n general qi a ARNf n'special, sugereaz c enzimele de ma^uurafie care condilioneaz transformanea pre-ARN rr ARN matur au capacitatea, unele de a recunoaqte precursori cu sec70

snt nral redundante. Teoretic ,ar trebui s fi,e un numr de 64 tipuri diferite de ARNf care s traduc m,esajul genetic (vezi codul genetic). Au fost izolate n stare pur aproape toate tipurile de ARN, iar la pese 20 dintre ele a fost stabilit secvenla de nucleotide a monocatenei (structura primar). Genele pentru ARNf ca gi c,ele ribozomale snt prezente att Ia procariote ct gi ia eucarioe n copii multiple (40-80 la procariote, 32A-14A0 la eucariote), n unele cazuri fiind distribuite grupat n genom formnd aqa-numitii clasteri. Fieca,re aminoacid are cel pulin un ARN specific care intervine n activarea sa n cadrul biosintnrei protcinice. Uneori, acelagi aminoacid poate fi activat de dou tipuri, diferite de ARN care s-au numit ARNf isooccepori. Specificarea unui aceluiaqi ,amfuroacid de dou tipuri de ARN ar fi o msur elaborat n cursul evoluliei de a asigura realizarea biosintnzei proteinice n condifiile n care ]a nivelul unuia dintre ARN isoaccepori s-a manifestat felomenul mutagen.

venF 5' leadq, iar aitele de a recunoaqte gi accepta ca substrat pre.ARN fr aceast secvent 5' leader. Este posib,ii ca n aoeas't capaciae de recunoaqtere s joaoe un utumit rol qi secvenfele interpuse. Ar trelbui s fie un numr de cel pulin 61 tipuri de A-RN care s traduc mesajul genetic (vezi eodul genetic) qi care ar corespunde celor 61 aodoni sens din ARNrn. Ta E. coli snt 30-40 tipuri diferite de ARN specificagi de gene limitat redundante. La eucariote, genele pentru ARNf

Fiecare moleeul de ARN prezint rogiuni specifice de interacfiune cu alte molecule, negiuni, n care nu apar mperecheri de ,baze prezentndu-se ca bucle Ia nivelul crora bazele snt expuse avnd posibili,atea interacliunii cu alte elemente. Astfel, secvenfa CCA de la captul 3' al moleculei ARN este implicat n ataEarea aminoacidului corespun ztor la molecula ARNf, h vederea transportului su. Fiind aceeaqi la toate moleculele ARN, secvenfa CCA nu este implicat n specificitatea a,taErii aminoacidului la ARN. Molecula ARN prezint ns o regiune care confer specificitate ARN prin care acresta r,ecunoatte n mod specific un aminoacid dat. Aceast regiune es.te variabil la diferitele tipuri de ARN. De asemenea, molecul'a ARNf mai prezint o regiune de recunoaqtere a ri'bozomului reprezentat de prima bucl din modelul frunzei de trifoi, alctuit din 7 baze nemperecheae, numit bucla TI'C, precum qi o rcgiune de recunoaqtere a codonului din ARNm, regiune care s-a numit

7l

F
anticodon sau nodoc (opusul lui codon) qi car,e este format, ca gi eodonul din ,trei bazp, ,azotate (tripleta). Ea se afl n 'bucla antioodonului. Regiunea anticodonului este specific fiecrui tip de ARN gi ea courdifioneaz recunoagterea cprect a codonului din ARNrz cotrespunztor aminoacidului purtat de ARNf gi- care este specificat (codificat) de ctre oodonul din ARNm. ntre prima bucl qi bucla anticodonului se afl o bucl mic numit ,,ciot6'. Recunoas.terea codonului de ctre antioodon se bazeaz pe principiul complementaritlii bazelor azotate de tip (A U A
codon

don etc.) care se asociaz tempor,ar prin formarea unor punfi d,e- hidrogen. Codonul qi anticodonul snt ,orientate antipar,alel

- 321

U A U anticodon; C G A codon

12 3

L23 G C U antico- 321 -

(5'-t3' codonul, 3'+5' anticodonul).

mal structural qi funcfional. Dar, potrvit ipotezei oscilrii (u:obble) elarborat de Crick n 1960, une'ori un flntlpit tip de ARNf are capacitateoa de a recunoaqte prin ,anticodonul su mai mul{i codoni (triplete) care ns se deos,ebesc doar prin cea de-a treia 'baz,. nsearnn c in cad'rul internelafiei codn-anticodon, esenfial n d,escifrar,ea, decodificarea (traducerea) mesajului genetic transcris n ARNrn, primele dou perechi de baze prezint o mai mare specificitate a mperecherii pe cnd c,ea de a treia capt caracter oscilant. Astfel U aflat n conformitate cu antiparalelismui imperecheril,or cle ,baze pe primul loc n secvenfa anticodonuiui (altfel, ea ocup tot locul trei n acesta dac considerm orientarea general de la stnga l,a dreapta) poate s se mperecheze cu A dar Ei cu G afiate n codonul ARNrn ca cea de a treia'baz. Tot astfel G din antioodon poate recunoaqte, n aceleaqi condifii tipologice att C ct qi u, iar hipoxantina poate recunoaEte u, c si A aflate n pozilia a tr,eia n codon. Nu acelagi lucru este pentru C qi A a,flae n pozifia ulrtim (considernd sensul gen,eral stnga+dreapta) n an,ticodon. Acesea nu pot recunoa$te qi nu se mpereoheaz dect cu bazele oomplementare conespunztoare a,flate n a treia pz\ie n codon qi anum,e

mper,echerea corect codom-anticodon condilioneaz plasan catena polipeptidic oe se sintetizeaz. ,a unui aminoacid dat Ia l,ocul corespunztor, sintetizndu-se astfel o protein norr.sa

GqiU.

72

enzim activatoare specific pentru fiecar,e amimoacid. Inifierea tuturor catenelor polipepti'dice (tradueerii mesajului genetic) se realiznaz, prin intervenfia aqFnumitului ARN i,nifiator. Aoesta este ARN ce transfer N-formilm'etionina (ARN/M"') l,a ,bacterii, virusuri, mitocondrii qi cloroplase qi ARN ce transfer metionina (ARNtue\ la eucariote. Func{ia ARN este n esen! legat de decodificarea mesajutui genetic. Dar ARN mai poate juca rol qi n alte procese celulare, mai ales la baeterii cum ar fi negl,area activitlii genelor (operoni) care dirijeaz sinteza unor aminoacizi, transportul unor aminoagizi necesari formrii punlilor interpeptidice din perelii celulari ai bacteriilor, sin'teza am.inoacilfosfatidilglicerolului, adilia terminal a resturiior aminoacizi la proteine etc. n cazul n care Eenel,e pentru ARN sufer mutatie se sintetiz.eaz ARN la care este alterat specificitatea de recunoaqere de ctre ,antioodon a codonului corespunztor datorit modificrilor ce apar n bucla antic,odonului sau adiacent e.. IJn asemenea ARN va putea s recunoasc codoni rLonsens sau missens, care condilione'az fie terminarea la'nfului polipeptidic n primul caz, fie ncluderea n lanful polipeptidic a unui aminoacid necor,espunztor datorit modificrii prin substitufie a secvenlei de baz n cel de-al doilea caz. ARN nuclear heerogen gi ARN crornozomnl. La eucariote se mai descriu qi alte d,ou tipuri de ARN celular. Ese vorba de ARN nuclear heterog'sn Ei ARN cromozsmnl. 6. ARN nuclear heterogen (ARNhn) reprezint o clas de molecule ARN cu greutate molecular variarbil ntr,e 105 qi 2 X tz daltoni cu dur,ata de via! scurt (5-10 minute) fiind instabil. metabolic. ARNhn rep'ezint cca 3olo din totalul ARN oelul'ar. Fiiurd sintetizat pe matrila ADN are o compozifie de ibaze eomplernentar ADN. Are un con{inut G + C de cca 4A-450/o cu mult mai mic dect cel aI ARNr care este de cca 700/0. Est localizat :r afara nucleolului. Din ARNhn deriv, n urma prelucrrilor posttranscripfional,e ARNzn, din care cauz, ARNhz s-a mai numit ARN prernesager sau pre-ARNrn. Partea din ARNhn care nu nepnezint ARNnz este transcris de pe ADN care prezfurt secvenle repertate de nucleotide qi care se pare c snt implicate n me73

Cea de a patra bucl din modelul frunzei de trifoi conline 6-12 tbaze nemperecheate. Ea s-a numit bucla dihidrouracilului, fiind implicat n legarea ARN la o,minmrilsintetozd,

7
canisme de reglare. Aceast parte a ARNhn poate prezena o conformafi,e caraceristic sub form de ac de pr numit structur lwirpin qi care se formeaz prin mperecheri intracatenane de baze complemerrtare. 7. ARN crarLozatnol (ARNc). Este un tip de ARN complementar unor secvenfe specifice din ADN cromozomal al eucariotelor. O parte din acest ARNc reprezint molecule precursoare ale ARNzn, ARNr, gi ARN. ARN croroZohd, pe de alt parte se cr,ede c reprezint o categorie de ARN celular legat de interacliunea ADN-proteine creia i confer specificitate de secven!, acest tip d'e ARN legndu-se covalent I'a proteinele cfomozomale histone. Greutatea molecular a ARNc ,este mai mic dect ca a ARN cci cuprinde doar 30 pn La 50 rrucleotide. Confine pn la 270/o dihidrour,acil. Nu se $tie nc dac ARNc este ntr-adevr un tip aparte de ARN celular sau repr,ezint un produs de degr,adare a ARNhn. Snt date dup care ARNc intervine n,tr-un mod specific n reglarea activittii genice la eucariote, avnd efect derepresor asupra geurelor represate prin complexar,ea ADN cu hisonele. B. ARN airol. La unii fagi oa Ei la unele virusuri vegetale Ei animaie miezul de acid nucleic este reprezentat de ARN, PUtttor n aoest oaz de informafie genetic primar din cane cauzi se mai numeqte Ei ARN geneti,c. ARN uiral poate fi mon,ocatenar (bacteriof,agii Fz $i R17, virusul moz,eicului tutunului, virusul gripal qi polio). Reovirusurile au ARN 'bicatenar. Moleculele ARN snt liniare, niciodat circulare. ARN airal ndeplineqte att rol de matrif pentru replicarea sa n veder,ea multiplicrii panticulelor viraie ct qi rol de ARN rnesryer pentru sinrteza de proteine virale specifice. Genomul viral ARN ndeplineEte deci o funclie dubl, gen'omul qi tran-

scriptul fiind ntr-un anume sens unul qi acelagi lucru gi aceeaqi enzim numit replimzd, sau tronscriptazd,, de fapt o ARN polimeraz servind att funcfia de replioare ct Ei funclia de transcriere. Cel mai bine studiat este ARN al fagilor QP $i R17 la care s-a realizat secvenflenea nucleotidelor n cea rnai mane pa,rte. Astfel cromozomul fa,gului R17 alc,tuit dintr-o monocatem ARN conline cca 3510 mucleotide, purdnd informafia pentru sinrteza a 3 proteine Ei rmnnd nc 580 nucleotide, primele 100 urucleotide de la oaptttl 5' nefiind niciodat traduse n pr"otein ca dealtfel nici cele 50 nucleotide oare pneced captul 3'. Captul 3' al catenei confine secvenrta 5' . . . CCA CCCA-3' qi se
74

PPP

PPP

A
U

^ "

U
A

pr,"r",;;;;i
t+t

REPL'T A2 A

G:C A:U U:A c =G 6=C U:A

A

PPP

A,
U

L .+[, (a tena -nartl)

nrptirazi

(-)

u
A

A,

c
AoH

A--U c =G ::U:. ,OHV. A

\----w.-J

A
C

A
5

RF

'

^l J

ARN progen

Fig. 31. Replicarea ARN viral. RF - forma, replicativA dublu-catenar. admie c aceast secven! este recunoscut specific de ctre enzima replicaz. Pe parcursul secventei ARN apar posi'biliti de mperecheri complementare intnacatenare cu formare de structuri buclate de tip hairgnn, structuri impliaate n conferirea de stabilitate monocateil]ei ARN n timpul infecfiei, n mpachearea sa ntr-o form mai cmpact n capsida fagic. n vederea sintezei proteinelor virale moleculele de ARN viral,, acfi'onnd ca ARNnz se ataqeaz, la rirbozomii celulei gazd formnd poliri'bozomi. Im,edia dup injectarea ABN viral n celula gazd Ei legarea sa de riib,ozomii celulei gazd este sintehzat ,e!zima ARN sinfu,tazd (ARN-re plicozd) care catalizeazi formarea unei c:atene complem,entare nealiznd astfel replicarea ARN viral (Fig. 31). Dac se consider oatena inifial', care ptrunde n celula gazdei drept ca;tena ,,*tt ea se,rye$te ca matri! pentru sinteza caenei complernentare ,-u pe principiutr mperecherii de baze complementare cu formarea de punfi cle hidrogen, realizndu-se pemtru un anumit timp o structur bicatenar ARN numit tormd replicatiud, (Rtr'). Au loc a,poi multe runde de replicare ale formei replicative bioaenare. Unele din catenele + nou sinetizate acfioneaz ca ARNnr dictnd sinteza de replicaz qi pr'oeine ale capsidei. Alte oatene f , dar nu este exclus ca Ei unele din acelea care au participat la sinteza pro75

dovetlite pnA ln prezent; linia subfire continu - lagganismul special de transfet de informaJie

Fig. 32. Dogma centralA revizuit a biologiei moleculare. Diagrama red relaliile de transfer de informafie dintre mecromoleculele informafionale: liniile gtoase - re-

latii

liniile ntrerupte - transfer de informafie nedovedit pn u prezent.

verstranscriete) care are loc in celulele infectate cu oncovirusuri ;

de la ARN la ADN

(re-

teinic, devin mpachetae n capsida proteinic a noilor particule fagice, corrrstituind cromozomul viral. Iat deci c avem aici de-a faoe cu o dualitate n care aoeeaqi rnolecul de ARN viral poate funcliona att ca materi,al genetic ct qi ca ARNm. 9. Reuerstmnscrierea. Pn acum ,an analizat tnansferul informaliei genetice de la ADN la ADN in procesul replicrii ADN de l,a ADN la ARN n procesul transcrierii gi de Ia ARN la ARN n replicarea ARN viral. Pn n anul 7970 a dinuit ideea, cristalizat n a{a-numita dogmrt 'a biologiei mpleculare (Fi'S. 32), potrivit creia transmiterea informafi,ei ereditare se f,ace unidirecfional n sensul ADN--*ARN-+proteine. n anul 7970 Temin gi Mizutani pe de o parte gi Baltimore pe de alta au descris o ADN polim,erozd dependent de ARN izolat din uirionii virusurilor onoogene ARN (ri,bovirusuri oncpgene din farnilia Retrouirifue) Si din celule infectate cu asemn,ar virusuri ca gi din celule transformatre malirgn. Aceast enzim ar capacitatea de a transcrie ARN natural sau sintetic qi de a sintetiza astfel, folosind ca matri! ARN, o cpie oomple'mentar ADNc. Este deci o violare a dogmei centra,le a biologiei moleculare cci n acest caz ernzima ADN-polimerazd,, dependent de ARN, condifioneaz transferul informaliei genetice de Ia ARN l,a ADN. Din aceast oauz a fost numit inuertazd, reuertazd sau reuerstranscriptazd i,ar procesul sintezei unei oopii ADN pe ma'trit ARN s-a numit inverstranscriene sau rwqstranscriere. Reverstranscriptaza folosegte ca substrat dezoxiribonucleotid-trifosfafi, este depende,nt de o matrif ARN Si pentru reacfia de polimenzarc ureoesit un ARN gnim,er cu rol de a inifia sinteza catsnei ADN la oare se leag printr-o legtur
76

covalent fosfodieseric. De asimenea enzima necesi pentru r'e'acfia neverstranscrierii ioni bivatlenfi de Mg qi Mn. Drp adr,rgarea primului dezoxiribonucl'eotd la gfupul 3'JH al primerului ARN, reacfi,a de reverstr,anseriere se desfgoar prin adugarea succesiv de dezoxiriboqlucleortide, oane se mper'echeaa cu 'bazele comple'rnentare din matrila ARN, ntre dezoxiribonucl'eotide statbilindu-se leghrri oovalente fosfodiesterice. Monocatena ADN astfel sinetizat, copie a matrilei AFIN, formeraz cu aceasta,, prin interm,ediul punlilor de hidrogen dintre bazele oomplemenare o structur tbicaenar hi,brid ARN-ADN, Intervime se parre o ribonucleozd. H care hidrolizeaz. ARN dirrr hilbrid astfel, ca mourocatena ADN poate servi ca matri{ pentru sineza unei catene complem'entare. Rezult un ADN bicaenar purttor de informalie genetic viral qi care se poate inf,egna n oromozomrul. oerlrulei gazd sub fonn,a a oeea ce a fost numit prwirus. Fr a duce la \in oelulei infectae, pB oalea reverstranscrierii, celula gazd este ns transformat malign. La un momeurt dat, sub influenfa diferitilor faotori mutageni, fizici, chimici sau rbio,logici (infectia cu {rn alt virus) provirusul ADN se desprinde din cromozomul gazd qi poate transcrie molecule de ARN viral, asi'gurind astfel multiplcarea virusului oncogen. ADN proviral se integreazi n cromozomul gazd n regiuni, om,oloage, inegrarea fiind oondifionat de o enzim numit integrazd. pe cnd n excizia sa pe lng inegr,az intervine qi o ercio,nazd. In'tegrarea gi excizia ADN pr,oviral snt n esmrf fenomene reoombinatorii de tip rupere-reunire (vezi recombinarea genetic). Virusurile oncogene preziht un genom repreuen'tat de ARN rnonocatenar avnd o constant de sedimentare de 78 S, care cuprinde patru gene simbolizatn g@g, onc, i.rw qi poZ. Gena gog specific proteineLe virale interure avnd ca produs primar o protein cu masa molecular de 76 000 daloni. Gena otzc specific o proein implicat n inducerea tramsformrii maligne a celulelor n creqtere. Gena inu esbe legat de sinteza glicoproein'ei de la suprafala nveliqului virio.nului, iar gena pol specific sinteza inve'rstnanscriptaa,ei (reverstranscriptaz'ei).

n 1969, Huebner gi Todaro au elaborat ipoteza oncogenei, potrivit creia toate celulele contin n ADN o uirogend, adic ,o gen oare oonfime informafia geuretic a urnui virus incluznd qi ,aceea pentru transformarea malign a celulei gazd, adic
77

cu ADN gazd dsa lunul generafiilor celulare. n mod normal oelula a elaborat mecarrisme de represi,e a virogenei. Cnd mecanismul de represie este alterat virogena se exprim qi duce prin activitate'a onoogenei la transformarea malign a celulei. Alteranea meoanismului de represie apare n urma ac{iunii diferililor agenti fizici, chirrici sau biologici. Desi'gur virusurile onoogene pot fi ribovirusuri (ARN) sau dezoxiriibovirusuri (virusuri ADN). Reverstranscrierea este 'ns specific ribovir'usurilor oncogsne.

oncogna. Virogena este replicait qi transmis odat

Capitolul

III
MH}ITAR

ORGANIZAREA MATEEIALT]LI]I

Sisemel,e biologice cuprind dou tipuri fundamentale de organizare Ei e,nume orgonizorea ui,w'ld qi orgm,iznrea celulord,. La rndul su orgamizarea celular cuprinde dou tipr:ri divergene de ,organizare: organizarea procariot Ei organiza,rrea eucariot, precum qi un tip intermediar, organizarea ntezwriotd (Gavril, 1978).

1. ORGANIZAREA

VIBALA

Asupra concepttrlui de virus a fost etraborat neoent un excelent studiu critic (7nrnea, Ei Herlea, 1974). Statutul particular af sisternului viral poate fi desprins de expresia aforistic a lui Lwoff care n 1957 afirm c ,,virusurile pot fi oonsiderate ca virusuri, din cauz c virusurile snt virusurir(. Virusurile se caraceriznav prin existenta n structur'a lor a unui singur tip de acid nucleic (fie ADN, fie ARN, niciodat ambele tipuri d,e acid nucleic). Virusurile nu cresc, DU se divid qi nu posed aparat enzimatic pentru produoere de energie. Prin aceasta virusurile se deosebese esenfial de toate celelalte sisteme bioLogice existente actualmente n natura. Dar virusurile pot fi oonsider,ae touqi sisteme biologice prin faptul c ele pr'ezint caracterlstici structunale qi dimensiunri cpnstane, pot suferi rnutafii qi recomibinane genetic qi pr'eziurt o ontogenez, precis n care pe seama materialului biologic ail celulei gad, materialul lor genetie dirijeaz formarea noilor particule vira,le, asigurnd astfel perpetuarea lor. Viruzurile au orgranizare acelular. Particul,a viral com79

plet numit oirion sau virusul infeclios matur reprezint o unta,te de structur qi funcfie atctuit dintr-un mveliE proteinic capsida $i un miez de acid nucl,eic. Miezul de acid nucleic este reprezentelt de ADN la d.ezoriboairusuri qi de ARN I'a ribatirusuri. Acizii nucleici virali nu snt asociafl cu pr,oteine cu exceptia unor cazuri ur care se descrie exisenfa n interiorul capsidei a unei proeine implieat n mpachetarea (supraspiralizarea) acidului nucleic viral obligat s fie cantonat ntr-un spa{iu foarte restrns. Alte tipuri de proteine virale ,,interne( au rol enzimatic (replieaza sau reaerstrans*i.pfuza
de exemplu).

tea infeca o al. specie de bacterie, ba mai mul.t prezint pretulpin de E. eoli. O singur exoepfie se impune a fi amintit. Este vonba de virusul PIV? care infecteaz peste 40 de specii, diferie de planrte Ei chiar o insect. n afar de virion, virusul se mai poate afla sub form de vinus vege,artiv crorespunznd eromozomului viral aflat liber n citoplasma celulei gazd n ,timpul mul'tiplicrii sale sau sub form de provirus cnd este integr,at n eromozomul gazd. n cazul dezoxiri,bovirusurilor, ADN poate fi dublu-catenar (liniar sau circulan), sau monocatenar, circular. Acesta din urm devine dublu-catenar n timput nepticrii. La ri'bovirusuri precum ,ba,c,teriofagii 8p, Rn pi fz, VMT, unele vimsuri 'animal,e (influ'enza gi alt poliomeliti) ARN este monocatenar qi devine dublu-c,atenar n timpul replicrii. Reovirusul are un ARN duiblu-oatenar chiar atr:nci cnd es,te n stare de virion. virusurile planelor au n gener,al un ARN duiblu-c'atenar. La reovirus qi alte virusuri animale genomul viral este segmeltat adic ARN ese rreprez*ntafi prin mai multe piese de z4,R.f bicaenar. Genomul ARN al virusului gripal ,este disc,oniuruu. El este monocaenar si format din g fr,agmente avnd o greutae molecular cuprins rtre 105 gi 106 daloni realiznd o m,as molecular de 5,5 X 106 daloni.
ferfur,! pmrtru o ,anumit
80

Miezul de ,acid nucleic vira. se mai numegte crarnozo'm uirol. Virusurile snt par,azilt obligali de nivel gearetic, deoarece virusurile, nu se reproduc de sine stttor, ci ele se reproduc pe searna componentelor oelulei ,gazd dup planurile anhitecturale furscrise n informa{ia ereditar viral depozitat n miezul de acid nueleic ADN sau ARN. Datori acestui fapt marea majoritate a virusurilor rnanifest o nalt qi striot specificitate de gazd: un virus oe infecteaz Eseherichia coli bunoar, n mod normal nu va pu-

Virusurile gripale, paragripale qi rabdovirusurile se numesc virusuri cu caten negativ deoarece ARN-ul lor nu are funclie mesager, $i ptrunznd n oelula gazd,, nu poate induce sinteza proteinelor virale specifice, din asemenea virusuri neputndu-se extnage ARN viral infectant. n particulele virale ale acestor virusuri exist enzima transcri,ptazd care asigur transcrierea unei catene ,,*tt pe catena inilial ,,-sc. Transcrierea qi replicarea ar putea fi reaLizat de aceeagi enzim ARN trarrscriptaz,, sau enzima de transcriere este modifica,t prin adilia unei proteine din celula gazd astfel c ea d,evine o
Dimensiunea genomului viral variaz ntre 3000 nucieotide qi peste 10 000 nucleotide, codificnd ntre 3 Ei 10 proteine cu o secvenf de cca 140-160 arnin,oacizi. Bacteriof,agii ARN reprezinti unele dintre cele mai mici virusuri avnd cca 3300 nucleotide care cor,espund la 3 gene priurcipale, dou specificnd proteine structurale al'e virusului iar a tr,eia specificnd ARNreplicaz.

Adenovirusurile mai mici prezint o macromol,ecul d,e ADN sub form circular att la nivelul virionului ct gi n forma sa replicativ, pe cnd n cele mari, la nivelul virionului, ADN se prezint ca o molecul filamentoas lung de 6 pm Ia fagul qzg ee infecteaz bacteri,a Bacillus su,btilis gi de 47-52 pm la fagii de tip Tz $i Ta ai bacteriei E. coli. Virusul variolei aviare are o molecul de ADN lu,ng de 93 pm. *FglI l. al bacteriei E. coli ,ar, o molecul de ADN lung de 16 pm qi care prezint la oapete prelungiri monocatenare din care cauz aceste ca,pete snt ,,lipicioase6r sau ,,adezivea, adic au secvenfe oomplementare pe seama crora molecula bioaenrar linian de ADN se circuLanzeazi in aitro ca qi n timpul cnd se afl n celula b,acterian. $i fag'ii Tz, Ta, Te $i T7 pr,ezint secvenle terminale repetate n moleculele limiare dublu-caten'are de ADN dar ele se afl la n,ivelul unor regiuni dublu-catenare, neputndu-se realiza circularizarea. Forma circular protejeaz macromol,ecula ADN de atacul

sintetaza.

De regula ns la nivelul ADN vira nu se afl secvente repetate de baze. Se cronstat c virusurile car,e au acid nucleic reprezentat de o molecul monocatenar n virioar aceasta devine dublucatenar n timpul replicrii. Monocatena reprezint rnesagerul Ia fagi pnecum QF qi f2 oar, patrunznd n celula gazd poate fi
$ Descifrtnd tainele ereditfii, vol.

exonucleazelor.

81

7
direet tradus de maqinria de sinte'z proeinic a celulei gazd. n aL,te cazuri, caena care ptrunde reprezint complementul mesajului, aqa cum este cazul lui p X 174. n aoest @2, neplicarea rnonocaenei este primul eveniment qi numai dup aceasta aparatul genetic este disponibil pentru tra,nssriere. n ,eoncluzie se po,ate spune c informafia genetic a virusurilor se afl codifica n cnomozornul viral care este neprezentat fie de ,q,,DN, fie de ARN gi care se afl sub form de m'olecule liniare sau circul,ane rbicatenare saru monocatenare. Moleculele monocatenare d,e ADN sau de A.R,N ,capt n timpul replicrii form bicatenar, reprezentnd inermediari r,eplicativi sau forme replicative.

2. OBGANIZAREA CELULABA
organizarre celular. Organizarea celular a nepnezentat o etap

Toate sistemele biologice cu excepfia virusurilor pnezin'ta

esenfial n organizarea qi evolufia ma'teriei vii care a oferit enorme posibilitti qi perspective evolutive. Deosebirea principal dintre virusuri Ei celule courst n faptul c niciod,at o particul viral nu va pute,a da naqtere direct la alte dou particule virale prin diviziune. n cazul celulelor, orict de simple ar fi ele, chiar arflate la limita superioar dimensiogi ricketiile, ,nail a particutreilor virale, cum snt 'micr,oplasmele multiplicarea presupune diviziunea unei celule preexistente prin care nezult dou celule fiice identice. La berza, multiplicrii celulare st o fin coordona,re ntre replica'rea ADN qi distribu{ia produqilor de replicare n celulele fiice prin interverrfia unor mecanisme specializafre qi extrem de diversificate. Toae celulele au de asemenea ambel,e tipuri de acizi nucleici qi un sistem propriu de sintez proteinic. n cadrul organizrii celul,are se deose,besc dou tipuri oarprocariot gi eucariot qi un ip dinale de onganiz,ar'e genetic intermediar mezocariot.

2.1. ORGANIZAEEA PROCABIOTA

Aoest tip de orga,nizare car,acteriz,e,az. bacteriile, actinomicetele qi al'gele albastre-verzi ururnite inc cianobacterii, prezentnd tote atributele sisemului biologic oelular, inclusiv auto82

r,eproduoerea si morfogeneza autonom. Materialul ior ereditar este reprezentat de o molecul circular dublu-catenar de ADN care se mai numeqte crom ozom bacterian. Cor,espondentul m,orfologic a'l crorozcmului circular bacterian este ucleoidul bacterian care prezint la nivel ultrastructural ca Ei geuoforul algelor alibastre-verzi fibrile fine de ADN care au un diam,etru de 25 A lGavril qi Tciur, 1978). Nucleoidul bacterian nu este separat fa! de citoplasm, de ctr,e o structur mem,branar, astfel c aoeste organisme nu au un nucleu ,adevrat. Materialul genetic nu est nchis n,tr-un spafiu genertic definit, astfeL c r,porturile sale cu citopl,asma snt directe. La procariote relafia- ADN-cromozom este de toal omologie. cromozomul bacterian cuprinde, urr set complet de determinanli genetici (gene) ai tuturor caracterelor unei celule bacteriene, pentru me,taibolism energetic, biosinteze c'elulane, creqtere qi diviziune ca gi penru regl'area activitlilor intracelulare. ADN bacerian nu se asociaz de regul cu proteine tbazice histonice. Date recente indic prezenla, la bacteria E. coli Ei ],a cianobacteriile Annbaena qi Aplwno&psa, asociate la ADN, a unor proteine 'bazice d'e tip hison cu greutate moleoular mic de 10.000 dalto,ni. Structura supercpiraliza;t a ADN bacterian este menlinut de ctre ARN. Cnomozomul circular bacterian reprezint suportul fizic al unicului grup de nln{uire a genelor, toate genele bacteriene fifurd ransmise n bloc la descemden{i. El reprezinrti cea mai rDBr mol,ecul descris pn n prezent n'tr-un sstem ibiologie cuprinznd un numr de coa 2000-3000 de ,gene. Are un perimetru de 1400 pm. Circularitatea cromozomului bacterian l pnotejeaz faf de acfiunea depolimerizatoare a unor enzime precum dezoxiribonucleaza. Date asupra circularittii cromozomului ibacteria,n au fost obfinute, prin urmrirea procsului de " conjugare bacterian. S-a constatat astfel c n cadrul acestui pnocs transfenrl, de gene de Ia celula donor l,a celula receptor se face cu o secvenfialitate precis qi determinat n rtimp (Jaeob qi Wollman, 1961). Ulerior Cainns (1963) aduce dovezi ooncludente electronomicrpsoopice qi autoradiografice care probeae, circularitatea, cnomozomului baetrerian. Toate ibacterlile, cu o posibil excepfie a bacteri ' Psqud,omonos, prezin,t cromozom circular. Se cunoagte nc putin despre organizarea unor asemenea inele de peste 1000 pm lungime, aflate n celul,e a cror lungime nu depEeqte l-2 pm. Crom,ozornul ,bacterian pnezin't un punct de ataqare pe membrana celular, iar atagarea aceasta reclam sintez proteinc. Snt date dup cane
83

situl de ,ataryare la membrana celular corespr:nde unei negiuni dim cromozomul bacterian bogat n secvenle A-T. De regul fiecare celul tbacterian are un singur cromozom dar fur cazurile cnd replicarea cromozomului nu este urmat de diviziunea celul,ei pot apare 2-4 cromozomi. Dar aoeqti cromozomi multipli nu aduc o informalie genetic suplimenar, ei reprezentnd copii identice ale crromozomului original. Condifia normal a celulei bacteriene este haploidia, cci ea prezin,t un
singur set de determinali ereditani (gene). n ,afara cromozomului circular suportul grupului principal de gene n citoplasma celulei bacteriene se pot efla una sau mai mule structuri eneditare adifionale, extracromozom,al (separ:ate fizic de cromozomul principal) confilrnd fiecare coa 0,5-2010 din ADN total al oelul,ei, cane au fost numite plasmide. Ele se replic indepemden,t de cromozomul principal bacterian qi sint moqtenite sta,bil. Ele snt r,epliconi tipici. Plasmida (termen introdus de Lederberg, fur 1952) reprezi,n't o molecul circular de ADN ',bicatena'r, mult mai mic 1lo/o) co,mpanativ cu c\ea a cromozomului ibacterian. Plasmida poart 6-10 geille fiind de f,apt un cromozom bacterian miniatural. 'Ca exemple de plasmide pot fi considerafte factorul de ser (F), Jactorul de rezistm.fd la ontibiotice (R), factorul colcinogeni,c (col), fagti temperafi cum ar fi fagul ,, care n stare de profag, se integre'az in cnomozomul gazd tot astfel precum se poate integra qi factorul F. n stare integrat asemenea structuri ,poart numel,e de episomi. Unele plasmide au fost numie conjugoni, datorit proprietfilor de a se comporta ca factori determinafi ai conjugrii, fiind tr,ansmisi'bile de la o c'elul la a'l'ta n procesul oonjugarii. Datorit tra,nsferului de plasmide de la o celul la ,alta ,ca gi a pierderii spontane a unora dinrtre ele, celula bacterian se afl ntr-o stare permanent de variabilitate genotipic asigurndu-se astfel o mai bun qi uruanlat adaptare a acestora la mediul lor de via!. Dat fiind implicarea plasmidelor n fenomenele de rezisten! la antibioticre, studiul 1,or a cptat un mare impuls n ultimul timp cnd au aprut tulpini ,bacterie'ne multipiu r,ezisten,te. Dar n prezen studiul plasmidelor bacteriene este intensificat qi prin ace'ea c aceste structuri moleculare s-au dovedit a fi excelen{i crugi ai unor fragmene de ADN euoariot, reprezentnd un fe} de ,,cal trnoiams prin care
84

est'e introdus

purtor

zizului ADN recombinant.

intr-o celul bacterian un fnqgmen d'e ADN al unei gene eucarioe. Ese vor"ba de realiTrea aqa-

2.2. ORGANIZABEA EUCARIOTA

Cu exceptia bacteriil,or, aetinomioetelor gi cianobacteriitlor, toate sistemele hiologioe celulare au materia,lul ereditar ndelimitat de pr'ocnrucleul chis intr-un spafiu genetic sele fuurdameartale ale citoplasmei prin intermediul unei membrane duhl electronooptic qi prevzut cu pori (anuli) prin car,e se realizeaz schimbul reciproc material-informa{ional
nucleu-citoplasm.

La nivelul nucleului m,aterialul ereditar este organiz,at ntr-o substan! numit cromntind.. Aceasta r,eprezint forma interfazic a un,or stnrcturi oaracteristice care la eucariotele superioare apar doar ur timpult diviziunii nucleare qi care s-au numit cromnzqrni. Cromatina prezint dou stri funclionale alternative qi reversiibile: euqomntinn qi hetqocromnti,na. Eu.b,azici

cromatina prezint proprietli de oolorare normale cu color,anfii qi un ciclu de c'ondensane sandard (condeursare n diviziune; deoondensare n inrerfaz). I;a nivelul rucrromartinrei de regul se afl secvenle unice d,e ADN. La nivelul eucromatinei ADN se replic timpuriu, la nceputul fazei S. Eucromatina reprezint partea activ genetic (n rtranseriere) a cnomatin'ei inerfazice, la nivelul, su aflndu-se c,ea mai mare parte din protefurele nonhistone cane oondifion'eazi func{ionarea materialului ereditar in replicare sau transcriere. Hetenocromatina prezint un ciclu atipic de condensare (alociclic) reprezentnd cromatina care ese condensat qi n interfaz, aprnd sub form de cnomooentri. La nivelul su replicarea ADN este ntrziat,. Ese inactiv n transcrier,e qi sufer sulbreplicare. Heerocromatina constitutiv, localizat n regiuni specifioe al,e cromozomilor cuprinde ADN, care prezint secvenfe repetate de nu,cleo,tide. Prin heterocromatinizarea diferenfiat a eucromatinei rezult heerocrornatina facultativ. Heterpcromatina se clor:az, n tot timpul ciclulu celular din care cauz se spune c ea mamifest heteropimud, pozitiv. ntre eucromatin si heterocromatfur apar diferenlieri qi la nivelul structurii fizice. Astfel, pe cnd eucromatina are ea
85

elemente ulrtnastructunale pnedominante fibrel,e nucleohistonice de cirea 100 A dia,rretru, la nivelut heterocromotinei ,se af] fibre nucleohistonice de 250 A, deoareoe aoesea apar mai coilldensate, mai oonrtractante, de unde qi r'eacfia lor Fzulgen-pozitiv mai in'tens. Dac euctomatina cuprinde genetre majore, heterocromatina prezint mai ales funcfii reglatoare oontrolnd activitatea genelor din eucrpmatin qi raa muta{iei, moditicnd specific acliunea unor gene, penetran{a, expresivitatea gi specificitatea 1or. Rolul structural a,l heterocromatinei este legat de stabilizarea structurii centr'omericre qi a capetel'or cromozomului (telomer,e), de mperecherea cr,ornoZomilor n naeioz, contrplul schimbului reciproc de gene ntre cr,omozomi omologi (crossing-over). Rolul funclional al heerocromatinei este legat Si de controlul transportului substaurlelor prin membrana nuclear ca gi de contnolul diferentierii celul,are. Cel. mai evident rol al heterocromatinei este legat de inactivarea (represia) activitlii genice n mecanismul compensa{iei de doz. Se disting trei categorii principale de heterocromatin: heterocromntnd constitutiud, prezemt tot timpul qi n toti- nucleii celulelor unui organism fiind looalizat n regiuni specifice ale cromoz,omilor iar n nucleul interfazic se poae aglomera ntr-o mas cromatic evident numit crornocentru; heerocromatind facultutiad, legat de oompensarea dozei de gene la oele dou sexe ale mamiferelor prin care unul, dintre cromozomii de sex X este inactivat genetic prin heterocromatinizar,e, realizndu-se un echilitbru ntre genele sexlincate la cele dou s'exe la mamif,ere; heterouomntinn condtensatd, distribuit diferenfiat de la tesut la lesut, aprnd n cursul maturrii celulare printr-un proces care hlocheaz,o anUrrrit informa ie genetic n anumite oelule. Diferiele ipuri de heterocroma'tin constitutiv pot fi evidenfi,ate prin metode m,oderne de colorare a cromozomilor metaf,azici in care se produe experimen'tal regiuni d,iferenfiat oolorate sau fluorescene care apar sub forma unui model de bandare specific fiecr''ei specii qi identic pentru cr,omozomii omologi. Snt dou aategorii majone de m,odele de bearzi: bandnre C eviden{iat prin eolorare cu Giemsa dup r:n pretratament specific cu alcalii qi acest m,odel de bandar.e evi86

denfi,az heterocromatfura oonsitutiv aflat de o parte gi de alta a oentromerului; bondure G reprezentind zonele heterocnomatice in'tercalare dispuse deci de-a lungul bralului crornozornului qi care se evidenliaz n urma unui pretratament cu tripsin (hidroLi'z sau denatunare enzima'tic) qi apoi colorare cu Gi'emsa (bamdare G propriu-zis) cu quinacrin fluorescent (benzi Q). Deocamdat nu exist o explicat,ie cuprinztoare a naturii chimic'e a bandrii cromozomale. Compozifi,a chimic a cnomatinei, respectiv cnomozomilor eucariotici este reprezentat n special din ADN qi histone aflate n pr,oporlii apnoximativ egale. m plus se mai arfl cantitti variae de proteine nonhistone Ei o mic cantitate de ARN, ca gi lipide, polizaharide Ei ion'i metalici precum Ca+* qi Mg*f , ultimele compo,nente putnd fi eventual cont,ami-

nanfi oelul,ari. ADN cromozomal formeaz componenta esenfial structural qi funcfional a cromozomului eucariot. Date reoente deun cnomozom mons,treaz echivalenfa o molecul de ADN euoariot, stabilindu-se astfel universaitatea rel,a{iei att la virusuri gi procariote ct $i la eucari,oe. La eucariote ADN pnezint trei tipuri distincte de secven!: secvenle unicre sau nerepetate, secv'enfe mitlociu repetate qi secvenle nalt repet'ate. Secventle mijlociu nepetate snt secvenfe simple cu lungimea de 100-500 perechi de ibaze care snt nepeae de 102 pn la 104 ori ce se furterpun ntre secvenle unice, nerepetate.

de

Sewenfele nalt repetate snt secvenfe simple, repetate 106 ori. n urma denaturrii, ADN cu asemenea secvenle prezinta o vitm mare de reasociere a monocra,tenelor spne a forma structuri bica'tenare (renaturare) ceea ce nu apare n cazul ADN eu secvenfe unice sau ADN viral qi procariot. ADN re,petitiv se afl de regul n regiu,nile heterocr'omatioe dispuse la oapetele cromozomului eucariot (tel,omere) sau n regiunea centromerului. ADN repetitlv este de regul inactiv transcripfiona,l.

ADN cu secvenfe mijlociu (intermediar) re'petate cuprinde par,te genele ribozom,ale qi pentru ARN qi oonstituie subsratnl fizie al arnplificrii (reitndrii) genice. ADN cu sesvenfe unice, nerepetitiv, cuprinde informafia genetic pentnt slnteza di,feritelor proteine celulare.

ln

8T

Cantitatea de ADN repetitiv variaz de la 20 la 800/o dfu.r totalul ADN. La unele specii secvenfele nalt repetate snt reprezentae de 6-13 perechi de baze gi n acest caz prin ultracentrifugare n gradient de CsCl sau sucroz asemenea fracfiune de ADN na,lit repetitiv se separ ca o band aparte de frac{iunea principal de ADN, formnd oeea ce se numegte ADN satelit. Genomul eucariot apare ca un genrorr d,e tip intuspers n care secvenfele unice alterneaz, cu secvenle nalt sau mijl'ociu
repetate.

nuclear poa'te codifica proteine. La Drosofila, pe baza unor ana:lize genetioe qi biochimice exacte s-a estimat un numr minim de 5-10 000 de gene structurale. La animale toate lesuturile pr,ezint un set comun de gene funclional.e de ,,ntnefinere( d,e citeva mii de tipuri diferite pe lng a,lte cteva mii sau multe rnii de gene ,active ce f un clion eaz, dif erenfiat. La plante numrul de gene active este estimat de la 3-4000 la drojdie la 13-14 000 Ia ptrunjel 9i orz, pn la 27 000 la tutun. Asemerrea date au o valoar,e pur orientativ.
2.2

ADN mirjlociu nepetitiv codific informalia pentru sinteza ARNr, ARN, ARN 5S qi histonelor, dar funcfia ADN nalt repetitiv nu este pe deplin erxplicat. Se admite c acesta ar reprezenta o ncrctur excesiv a genomului, 'un rbalast evolutiv, dar mai ales ar interveni n reglarea diferitelor funclii genetice, n conservarea formei cnomozomilor, ar servi n spafierea genelor, ca dealtfel $i n crearea de noi gene. ADN repetitiv difer de restul ADN prin conlinutul su mai mare n G -p C sau mai mare n A + T. Organismele eucariote superioare, ptrante gi animale conlin n genomii lor o cantitate de ADN suficient spre a codifica mai mult de 1 000 000 de proteine diferie. Dar snt date co{rrvergente spr concluzia c mumai o parte din ntre,gul genom

I.

ORGAN IZAREA GEN ELO R EU CARIOT E

Dezvoltarea tehnologiei ADN reconxbnan care a permis clon oeluil.a 'bac,erian a drrs la aprofuardarea cunoEtinlelor privind organizarea genel,or euoario'te. Pe aceast cale s-a stabilit c genele eucanio'te au o structur mozatcat, n care secvenfele lor oodificato,are respectiv regiunile
narea de gene eucariote
8B

care vor fi n final tr,aduse :r secvente de arninoacizi nu snt continui ci sn intrerupte de secvente de inserfie sau de intercalare netraduse, numite cu un termen general ADN silenfios. Cel mai bine studiat caz de organizare a unei gene eucarioe care se ncadreaz, ur aces,t tip este gena pentru ovalhumin, o protein din albuEul de ou. n acest caz, scventa genic codificatoare a secvenlei de aminoacizi din ovalhumin este sepanat de 7 regiuni neaodifica'toane de lungimi vaniabile interpuse n oadrul secvenlei oodifiea,oare gi separnd-o pe aceasta n mai mule segmemte. Secvenga codificatoare de baze car,e va fi exprimat, deci tradus n secvenfa de aminoacizi este deei divizat in regimni care au fost numite de ctre Gilbert (1978) ertroni, sau eni pe cn'd regiunile interpuse, neoodificatoane, transcrise n ARNm dar netraduse n protein s-au numit introni. Asemenea organizare genic a fost eviden$at Ei la alte geme precum: gene pentru ARN de Ia drojdie, gene pentru histone, gene pentru ARNr de la drosofil, gena gnobinei de iepure Ei Eoareee, genele imunoglobulinei Ei genele mitocondriale de la drojdie. Se pare c asemenea organizare este cvasiubicvitar Ia' eucariote. Gena F-globinei de la goarece prezint dou inserfii, una de 116 Ei alta de 642 perechi de baze. Gena B-globinei de iepure pnezint 'o ,organiz,ate asemnoare cu acea de Ia gena F-Slobinei de goarece cu excepfia secvenlelor d'e inserfie care prezint'o puternic divergen! evolutiv. n cazul genelor pentru hemoglobin qi ovalbumin intronii cuprfnd secvenle unice sau de pufine ori r,epetate, genele structunale fiind repr,ezentate ca regul de secvenle unice, n,erepetate de ADN. n cazuL geurelor hemogl'obinei s-a demonstrat 'transcrierea intnom.ilor n ARNnz precursor (pre-ARNm) sau ARN heterogen (hnAP.N) care va fi supus pnelucrrilor posttranscriplionale spre a d,a naEere ARNrzl mntur cel care va fi:ncfiona ca mesager n sinteza proteinei. n cadrul ARNrn matur qi fun,cfional n traducere nu mai apar secvenfele intronice, ceea oe mseamn c ele snt excizate r oadrul prelucrrii pre-ARNnz. Preluerarea posttranscripfi'onal a We-AP"Nne se re'alizeaz surb acfiunea unor enzime specifi,o, de tipul RN-azei P. ,care taie, excizeaza intronii qi apoi, atre enzirne, 'posbil de tipul ligazei ARN numite de aloire, lipesc extronii spre a genera ARNnz mahr (Herdeld gi Kiper, 1.979). n cadruL prelucrrilor posttranscripfionale al,e preARNrn intr Ei poliadeniL,anea sa la captul 3' gi mod'ificarea
B9

(
ronr
AON jntroni
L

t2

Geno

ovolbum in ei

3/.5
3,

c0E
5.--

FFe ARNm.

I
3'

g6o,enp

rirl

?m Gppp

oosttron*notio- -VrX
thatri

t)oodcritoreo to Y! ; t(t .31 nEtilorco aoniloq 'bl.tlotco.crcizb intronibt C sudoreo exonilor) ciftelc hdrc trrnimeo eronilor 11-7; +i o irrroto? (A 6) h nunib alc n$Fotide

o Pra.lnlm Y/7Dn

lw t

W
trzz?
UAA
Tc|minorcg

r8z

to(hrctr

tg.

33. OtgqnlTassa genel ovalbuminei.

chimic posttrarnscripfio,nal a nucleotidelor prin metilare suib actiunea unor enzime specifice metilaze. Aoeast metilare se ad'mite c are ,loc la nivelul exonitor care astfel dervin rezis'tenti la acfi,unea enzimelor exonucleazioe. Eorzimele de clivare ,actioneaz asupra secvenfelor intronice cu,re nu au suferit metil.area qi asffe1 au rmas sensibile Ia enzimele de clivare. Se neraliz,eaz, apoi trnirea segme'ntelor exo{rice sub actiunea unor enzime specifice de 'legare sau altoire (splicing). Modelul acesta (Fig. 33) admite c regiunile codificatoare din pne-ARN care vor de* rleni adiacente n cadr,ul ARNnz vor fi aduse n nemijlocit cronti,guitate prin ibuclarea secvenf elor intronice. Regiunile exo nice eontigui vor fi u,nite ,covalent, printr-o reacfie de ligare
90

nilor Ei unirea exonilor din pnecursonrl ARNm (pne-anNm) o oa'tegorie de molecule mici, discrete, stajbile de ARN mic nucl"eor (snRNA) a cror lungime variaz ntre 90 qi 220 nucleotide. Acest ARN nuclear mic este asociat cu proteine formnd partibule mucleare mici ribonucleopnoeinlioe (snRNP). Pe bciza observafiil'or c secvenfa de nucleotide de Ia capatul 5' al unei ssilreoe categorii de sn RNA prezint complementaritate cu joncliunile introni-exoni de la diferite tipuri de ARNnz pentru insulin de qo,bolan (5' Exon CAGGUAUGU + Intron
CUACUUCCAGG Exon 3') catena 2 a imunoglobulinei, catena B de gl,obin de Soarec, ovalbumina de gin gi firbroina firului d,e mase de la Bmnbyr, aoeqti oeroetbor,i ,au impl,icat snRNA n excizia intnonilor qi unirea exonilor spre a forma ARNnr mntu,r, n ultimut timp se confer intronilor anumite roluri funcfionalre n prelucrrile pne-ARNnz. S-a stabilit c gena miooonflrial pentru citocrpmul b de Ia drojdie are Ei ea o structur rnozaicat cu exoni qi introni. Mutafia poate afecta a'tt regitrnea exonic ct Ei cea intronic, ,evidenfiindu-se peste 200 muta'nte care au afectat gena ci,tocromului b. Mutafia att la nivelul intronilor ct Si la nivelul exonilor duce la alterarea structurii gi fun$iei citocromului b. Dac nntr-o experien{ de compl'ementa$ie genetic particip la ncruci,$are o tulpin A cu mutalia la nivelul exonului qi o tulpin B cu ,rnutafia la nivelul intr,onului (ambele tulpini incapabile de a simtetiza citocnom b qi de a fermenta gluooza) la nivelul zigotului apare oomplementalia Ei se realizeaz, sinteza citocromului b func{ional. Slonimski a demonstrat c exonii n,ormali furnizali de celula de tip B cu mutalie intronic servesc la si,nteza citrocromului b n zigot iar intronii normali furniza{i de c,elula tip A, cu mutalie exonic, furnizmz informafia genetic neoesar alipirii exonilor n ARNrn matur. S-a stabilit astfel, fr echivoc funcfia intronilor n lipirea exonilor. Echipa lui Slonimski consider c intronii servesc ca un ,,model de asamblare( spre a permirte enzimei (enzimelor) de clivare qi unire s realizeze excizia intromilor Ei legarea exoni1or. O porfiune din intr,on ofer o secvenf-ghid care formeaz cu alte elemente oomptrementare din pre-ARNrn o structur tranzitorie capabil de a menfine adiacente extremitfile exo91

l,ntracatearar. Bruclarea reglunilor intronioe, excizia lor qi ligar'ea ul.terioar a regiunilor extronice apar oa rezultat al interproteine. acfiunilor compl,exe acid nucleic gi colab. (1980) au implicat n excizia introFl,eoent, Lerner

urilor alturafi. Ori, mutafia la nivelul intnonilor m,piedic formarea de asemenea structuri rtranzittorii. Este positbiil oa smvenfa ghid s fie oferit de acele molecule mici de sn, RNA despre care s-a vorbirt mai nafurte. Exist Ei ipoteza c intronii codific ,,proteimele mesagere(, diferite de cele codificate de exoni. Aceste proteine au fost tbotezae ,,ARN-motltrazeK. Se admite c primul intron furmizeaz. o protein de alipire, ARN-matutaza, pe cnd ceilalli furnizeaz ,,secven{ele-ghid66 ale ARN. Proteinele mesagere sau proteinele-m ar avea o secvenf de amino'acizi care la un capt numit globul eronic este hidnofil, iar la cellalt cap, coresprmznd la intron, este hidroftrb, prinzndu-se de anvelopa nuclear, Isnd captul hidrofil (g1obu1 exonic) liber. n procesul de traducere a mesajului, rihozomul se ,asocia,z cu exonul nr. 1 din ARNrn qi mcepe s se formeze o catem polipeptidic identic la un, capt cu globul'ul exonic al proteinei-rn. Aceasta porfiune a proteinei-nz ar servi n inlierea ea,tenelor identice polipeptidice sintetizate pe ribozom prin traducerea aceleiaqi molecule de ARNnz. Se mai admite c anvelopa nucleara confime enzimele necesare prelucrrii pre-ARNrn, ma,i ales cele necesare exciziei intronilor Ei alipirii exonil,or n ARNnn martur care va fi trecut n cioplasma. Aceste ipoteze nu se exclud gi mai degrab se completeaz. Este de relilrut c aceast structur mozaicat a genelor eucariote este specific lor qi este legat de separarea celor dou procse esenfiale ale decodificrii informaliei reditare, transcrierea Ei traducerea n spalii diferite, primul n nucleul, al doilea 1n ci'toplasm. Trec,erea mesagerului prin mernbrana nuclear este obligaorie qi aceast trecere se dovedeEte a fi un proces foarte complex. R,eoent s-a constatat c gena insulinei umane conline dou secvenf,e de interealare, una n cadrul regiunii transcrise ntr-un segment netradus 5' al ARNzn qi alta care ntrerupe regiunea codi'ficatoare C-peptidic (Bell Ei colab. 1980). Compararea genelor insulinei urnane Si de $oarece ara existenla de regiuni potenfial reglatoare n cadrul segmentului de ADN ce precede gena sugerrrd c forma ancestral a genei insulinei a avut dou secven{e de intercalare. Dealtfel, la mamifere s-au descris dou tipuri de organizare a genei pentru insulin: g,ena pentru insulin la om qi qobolan II prezint dou secvenle interpuse pe cnd gena de qobolaqr I are o singur secven! interpus. Semnifica{ia acestei organzn a genelor eucariote este deosebit. Se admite c prezen$a secvenfelor interpuse (introni)
92

a putut accelera evolutia cci a perrnrs construlrea de noi proteine din segmente ale genelor deja existente (Eaton, 1980). Potrivit acesei ipoeze, secautlele codificatoare (eroni) cor,espumd prlilor func{ionale ale proeinei. Trebuie precizat c la procariote ADN necodificatnr (silenfio's) nu apare n interiorul genei ca la eucariote, ci ntre gene. ADN al cromozomilor eucariotici este replicat semiconservativ qi bidirecliona\ fiecare cromozom avnd numeroase unitfi de replicane (cca 2-10 X 104 pe eelul), care snt aranjate n tandem eare funclioneaz asincrpn gi a cror lungime vaar ntre 20 Ei 70 pm. Replicarea ADN cromozomal se desfEoar mult mai arcet dect a ADN bacterian avnd o vitez de 0,52,0 pm/minut, fa! de 30 pm/minut ct este la bacterii. Fteplcarea ADN eucariotic neeesit sintez proteinic simultan.

Membrana nuclear joac un rol important n inifierea Ei desfgurarea replicrii. Asociat cu ADN cromozomal qi interacfionnd cu grupele fosfat ale acestuia prin forfe ionice qi electrosta'tice se afl proteinele cromozomale histonice care au caracter bazic prin care snt neutra,lizate grupele acide fosfat. La eucariote exist o cerin! strict ca ADN nou sintetiza,t s se asocieze cu histonele astfel nct s formeze complexe urucleohistonice. Acest fapt este demonstrat de intima asociere a sintezei ADN qi a histonelor n aceeaEi faz S a cicluiui ce-

cromatina constitutiv centromeric, este bogat

ADN ce se replic timpuriu este relativ boga,t n G + C pe cnd cel care se replic trziu, de ,obicei fiind localiza,t n hetero-

+.

lular. Histonele nou sintetizate se ooncentreaz n vederea asocierii cu ADN nou sintetizat n imediata veciintate a bifurca-

Histonele joac pe de o parte rol structural n menlinerea Ei controlul conformafiei cromozomului eucariot n ciclul celular, n spiralizarea qi condensaxea cromatinei, iar pe de a,lta n reglanea,genic grosier care duce Ia diferenlierea de modele de represie genic cu specificitate de,lesut n timpul dezvoltrii. Histonele aclioneaz astfel ca rprs,orii generalizafi ai activit{ii ge'nice cci, condilionnd condensarea cromatinei Ei superspiralizarea ADN, determin inhibifia steric a transcrierii n aceast stare cond,ensat ADN neputnd funcfiona ca mari!
93

liei de replicare

I
n transcriere, numai cr,omatina difuz prezentnd
,o intens

activitate de matrifa. Au fost descrise 5 tipuri de histon simbolizate Hr Hza, Hzb, H3 Ei Htt. Dup oompozifia n aminoacizi se deosebesc histone rbogate n arginin (HB fi H4), hisone bogate n lizin (Hr gi Hzb) gi histone cu confinut aproxima'tiv egal de arginin Ei lizin (Hza). n structura cromatinel aceste fracliuni histonice, cu exceptia H1 intr n cantitli echimolar,e. Studiile de secvenliere fl aoestor fracliuni histonice au evidenfiat lipsa unei specificitti de lesut a I'or dar mai ales naltul conservatism aI secvenlei lor cu exceplia francfiunii HL car prezint o mai mare variabilitate. S-a realr*r't o im,agfure simplist n ceea ce priveEte conservatismul sewenfei hisonelor miezului nucleozomic H*, Hzb, Hs gi H4. Astzi s-a neurunfat la ideea c aceste francfiuni histonice snt nalt conservate (Isen'berg, 1979). n cadrul fiecareia dintre cele ciurci clase de histone Ht, Hza, Hzb, Hs 9i Ha secvenfa de aminoacizi poate prezenta anumite varia{ii. Exlst deci subtipuri ale aoestor clase hist'onice, fie n embriogenez, fie n timpul maturrii unor oelule specializ,ate. Variabilitatea histonei H1 se datoreqte modificrilor pos,ttraducoane. Variabilita'tea celorl'alte clase de histone se baz,eaz. pe divergente evolutive semnificative. n cadrul unei clase particulare de histon exist suibtipuri care au struc'turi primare diferite. Histona Hzb reprezint un hibrid ,evolutiv cci la ,aoeasta cca prima treime a moleculei este varialbil, restul fiind foarte puternic conservat. Hisona Hs de la vitel Ei plante prezint divergenle de secven! fa! de H3 de la Tetrahymenn gi drojdie. Ha de la vifel diverge fa{ de Ha de L'a Tetrah'gmena. Aoeste divergenle snt ins mul't mai mici oomparativ cu cele ale altor proteine, astf,el c histonele H3 Qi Ht, trebuie nc s fie oonsiderate ca proteine nalt conservate. Histonele H3 qi Ha au pantea,bazic amino qi partea globular carboxil. Pr,esiunea selectiv a conservat regiunea globular, n parte din necesitatea ineracliunii hisom-histon, aceste imteracfiuni avnd I'oc ntre regiuni globulare. Nu se cunoaqt'e de ce ,8u fost conservate qi prfile bazice. Este posibit ca aceste pr{i baziee s fi fost oonservate n vederea staloilirii interacliunii cu ADN car aPBr

La Sacchnrom,gces ce/rwisiae se afl patru clase de histone dar nu se gtie dac este qi histona H1. Mai mult, histonele H2o H2b qi H3 de la aceast drojdie se deoseb,esc de clasele cor,espondente de histone de la plante Ei animale. H3 de drojdie de
94

ca substan! acid.

exemplu preziart o mai mare mobilitate pe geluri de aciduree Ei nu posed nici cistein gi nici metionin. Micronucleii de Tetrahgmena au numai clasele histonice Hya, H2b gi Ha, fiind lipsite aparent de histonele H3 gi Hr. n cromatina ciupercilor se afl histone care se deose,besc fa! de cele de la alte euoariote, eritrociele nucleate de psri confin o singur fracfiune histonic desemnat F2C i'ar n spermatnznizi celule foarte specializate care nu sintetizeaz. ARN sau proteine locul histonelor este luat de protamine (proteine foarte ,bogate n arginiar). Rolul histonelor n represia genic general este demonstrat chiar Ei prin acest caz al eritrocitelor nucleate de psri, al cror nucleu este nefunclional, ADN-uI su fiind represat prin interacliunea cu histona FzC sau H5. Mamiferele au ales o alt alternativ evolutiv a acestei represii enuclearea eritrocitului matur. Histonele sint supuse unor modificri posttraductoare (postsirr,tez) qi anume metilare, acetilare qi fosforilare. Prin acetilarea resturilor aminoacilice din histon este reglat interac{iunea histonelor cu ADN, permifnd funclionarea acestuia ca marit n transcriere. Alte modificri sfurt implicate n realizarea complexelor nucleohisonice dintre ADN nou sintetizat, gi histonrele nou sintetizate sau n modificarea spiralizrii cromozomale, ea qi n alte feuromene (schimbri n activitatea cromozomal n tfunpul ciclului celular sau diferenfierii, menlinerea conforrnafiei corecte a histonelor fata de ADN). Fosforilarea H1 n special a fost implicat n condensarea cromozomilor, Schinrbrile n organizarea structural a cromatinei snt necesare peu:tru progresarea eiclului cromozomal (eondensare-decondensare) Ei se crede c snt reglate :r special prin modificarea proteinelor cromozomaJ.e precum fosforilarea, acetilarea, metilarea Ei poli (ADP-rihozil)-area. Fosforilarea histonei H1 este se pare cel mai important factor care regleaz condensarea cromozomal (Matsumoto qi colab., 1980). Forma fosforilat a H1 este deci implicat n inifierea condensriii cro'mozomale. Activitatea H1 fosforilate este strns corelat cu activitatea mitotic ,a celulelor iar fosfokinazo histonei H1 este imptcat n ini{ierea mitozei. Rolul specific al'variatelortipuri de histone n structura qi funclia crornatinei este nc neprecis stabilit. O modificare a Hxo sub forma de A2a apane a fi preferenlial localizat n regiuni inactive ale gmomului. S-a mai descris Ei metil'area Ei rirbozilarea histonelor, fr a se cunoaEte semnificalia acestor modificri.
95

Genele pentru diferitele fracfiuni histonice snt prezente n mai mulrte cupii per genom gi rele pot fi dispuse fur andem pe acelaqi segment ADN. Repetivitatea genelor pentru histone este :erut de necesitatea unei sinteze bogate de histone ntr-un interval scurt de timp ce corespunde fazei S cnd ane loc gi sinteza ADN. Histonele snt sintetizate n citoplasm qi apoi traarsferate n nucleu. Cnd este blocat sinteza proteinic d,ar nu qi a ADN, histonele parentale se leag numai la wrul dintre duplexurile fiice. Sineza histonelor este intim asociata cu sinteza ADN. Cnd sinteza ADN este ,blocat, sinteza histonelor soade rapid, deoar,eoe poliribozomii mici asoeiafi cu ARNn pentru histone, satre este de tip 7 S-g S, s:rt preferenlial dezorganizagi. Numai histona H5 din eritrocitele de psri nu se sintetizeaz coordona,t cu sinteza ADN. Ea este sintetizat n ti,mpul maturarii eritrocitelor, proba'bil spre a bloca majoritatea genelor nucl,eare, lsnd funcfionale doar cteva, in spet genele hemoglobiurei aviar.e. Cea mai important canacteristic a genelor pentru histone este gruparea lor sfns, lincajul strns dintre genele ce dirijeaz sinteza tipurilor de histon (Kedes, 1979). Cele mai intens studiate snt genele histonice de la drosofil, dar mai ales de la ariciul de mare. Ele au fost clonate n celula bacterian prin tehmica ADN recombinant. Genele penrru histone s-au d,ovedit c, pe lng lincajul l,or n tandem n ordinea H4, Hs, H2a, Hzb, Hr, ele snt repetitive, printre singurele gene codificat,osr,e de proteine care snt repetitive. Regiunile codificatoare ale gemelor histonice snt interdigitate cu secvenle spa,tiartoa,ne necodificat'o,arne. Prin hlbridare ARNnz histone (9 S) cu ADN de arici de mare, s- artat c genele pentru histone snt reiter,ate de cteva su'te de ,ori n genomul de arici de mare. S,ecvenfe).e codificatoare snt bogate n per,echi GC, pe cnd secvenlele spafia'toare snt bogate n perechi AT. Secvenlele codificatoar,e pentru hisone r,eprezint 0,20/o din ADN otal d,e arici de mare, pe cnd secvenfele spafiatoare reprezint 0,50/o din gen,omul haploid. La numeroase specii de arici de m'are s-a reugit alctuir.ea hrfilor unitlilor de repetilie a genelor pentru histone. S-a demonstrat pstrarea topologiei (loca1izrii gi iungimii) regiunilor spafiaoare. La Drosophi,la melanogw,ster, genele pentru histoure se carteaz n regiunea 39 D-E din braful stng al cromozomului 2. ARNnr. pentru histon,e de arici de mare, marcat radioactiv, hirbrideaz n aceeaqi regiune. La oh, genele pentru histon,e au fost cartate pe cromozomul 7, banda negativ G1 q 34.
96

Genele pentru hlstone de

sofi1.

dif,erirt de aceea a genelor hisrtonelor de

la drojdie au o organizare cel'a

arici de m'are gi dro-

n afara histonelor, n structura cromainei mai intr gi pro., teinele nonhistone numite tnc hqtone, inoorect numite proteine acide deoarece punctul izoelectric al lor variaz din zona acid pn n zoma bazic. Ele reprezint enzime ale metabolismului cromozomal cum ar fi ADN polimeraza, AII,N polimero,za, NAD sintetnza, nucleosidtrifosfateza, apoi diverse alte proteine cu-caracter acid precum molecule proteinice implicate n activita0ea genie, activatori qi represori ca gi alte proteine cromozomale. Proteinele nonhistoniee snt sintetizate n citoplasm Ei apoi transferate n mucleu. Ele snt foarte variabile, heterogene, att ca structur ct gi ca funcfiune, preze,ntnd o vrfiez mult mai mare de sintez $i de degradare (turnovt) comparativ cu histonele. Greutatea lor molecul,ar variaz ntre 10.003 qi peste 150.000 de daltoni pe cnd a histonelor este circumscris n limitele a 10.000-20.000 dalto,ni. Proteinele nonhistonic,e se caracerizeaz, prin specificita,te de lesut gi specificitate de speci'e. Aceste proteine snt implicate n reglajul fin aI activitlii genice, din intenacfiunea lor cu histonele rezult derepresia unei gene date qi transcrierea pe s,egmentul corespunztor din ADN. Ele pot ileteracliona nu numai cu histonele dar gi cu ADN Ei ARN. Zonele din genom active n transcriere snt mul't mai ,bogate n pnoteine nonhistone clect cele inactive n tramscriere. Aoel,agi lucru este valabil pentru celule Ei lesuturile tn care au loc sinteze active gi care prezint o cantitate mai mare de proeine nonhis'tonice. n reglarea transcrierii gemice un ro1 important t foac fosforilarea pnoteinelor nonhistonice. Prin aceast modificare a proteirnelor nonhistonice histonele pot fi scoase din complexele nucleohistonice ale unui segment dat din genom, lsnd posibilitatea ca gena saru genele din acea regitr,ne s fie transcrise
Defintori ai informa{iei ereditare, cromozomii snt n numr, mrime Ei f,orm caracteristici fiecrei specii. Totalitatsa cromozomilor unei celule formeaz oomplementul su crpmozomal numit nc genaffu Numrul de cromozomi al oricrei celule somatice la indivizii ce se reproduc pe cale sexuat este dublu (dipl,oid) fa! de complementul crom,ozomal' al eelulelor reproEi deci s func{ioneze.

ductoare (gamefi). La microscopul optic crom'ozomii apar ca structuri sferice sau baghetiforme, cu dimensiune variabil ntre 1 qi 30 pm.
/ - Descifrnd tainele ereditfii, vol.
I

97

ce rezult. Cromozomii omologi au aceea.gi structur qi funclie (poart acel'eagi g{ne, aceea;i informafie 'ereditar). Omul are de exemplu n gernitura diploid a tuturor celulelor somatice cte 46 de cromozomi, dintre care 23 de provenien! matern qi 23 de provenienf patern. Aranjamentul cromozomilor, prin dispunerea lor ordonat n per,echi de cromozomi, considernd numrul, forma, mrimea qi orice alt caracteristic specific complementuL cromozomal al u,nei specii sau linii celulare duce la ob{inerea cariotipului acelei specii sau linii celulare. Cariotipul uman a fost stabilit n anul 1956 de ctre Tjio qi Levan, a fost standandizat prin conferinlele de la Denver, Londna qi Chicago gi definitivat ulterior, pe baza studiului rn'odelelor de ,bandare (colorare diferenfiat a cromozomilor) la Conf,erinta de la Paris din anul t971. Metodele de 'bandare au permis nu numai identificarea exact a omologilor din cadrul fiecrei perechi de cromozomi, care se poate face cu o anumit doz, de relativitate datorit subiectivismului cercetatorului qi prin metodele clasice dar, pe baza oomparrii modelului de benzi al omologului matern qi al omologului de origine patern, s-u putut stabili rnodificrile exacte, structurale, ale cromozomilor, modificri' care au stat la ,baza evoluliei cariotipului ce a nsofit evolulia speciei sau stau la ba,za diferitelor maladii numeric Ei mai ales structuralcromozomale. n cadrul fi'ecrei perechi de cromozorni, modelul de benzi trebuie s fie identic la cei doi omologi n condilii normale. Cari.otipul uman este a1ctuit din 22 perechi de autuzomi (cromozomi identici la ambele sexe) gi o pereche de cromozomi de ser sau heterozonti, identici sau omologi la fem,eie (XX) qi ureidentici, neomologi, nepurtnd aceleagi gene 1a ibrbat (XY). Cromozomii dirr per,echile 13, L4, 75,21 Ei 22 snt crom'ozomi organizatori nucleolo,ri (NO) din care cauz, snt afirmafii dup care la origiu:e, specia uman ar fi un pemtaploid. Maimulele
98

La organismele c se r.'eproduc pe cale sexuat n cornplernentul cr.omoznmal cromozomii se a'fl sub form de pereche, fiind doi cte doi omologi, la mivelul fiecrei perechi un cromozom fiind de origiare patern (adus de spermatozoid n timpul fecundrii, la formarea zigotului) iar aiul fiind de origine matern (adus de ovul la nivelul zigotului). Din unirea garniturilor haploide ale garnefil.or :r procesul fecundrii se reface n zrgot o garnitur diploid oare prin diviziunile mitotice *succsive ale acestuia va fi transmis fiecrei celule a organismu-

lui

drrtnopoide au un cariotip asernnor oarecum oelui uman. Cimpanzeul, cel mai apropiat de om are 48 de crpmozomi Ei se admite c dintr-o specie oomun au putu deri;va specia uman qi primatele prin remanieri numerie qi structural cromozomale de tip fu,ziune-fisiune csntricd sau qrrcuploidii. Prezenla unui crornozom suplimentar n perechea 21 condilioneaz un sindrom foarte grav a:1, tri.somiei 2t sav rrlngolisntul. Aproape toate anomaliile numerice care af'ecteaz cromczomii snt corelate cu aparilia de grave sindroame cu defecte fizice gi psihice.$i aber,a{iile structural eromozomale snt extrem de grave. Delelia parlial a bra{ului seurt al cromozomului din perechea a 5-a condilioneaz, sindromul cri-Cu-chat (tiptul pisieii) cu napoiere mintal a copilului Ei moarte prematur. n leucemie este de asemenea implicat o translocalie ntre cromozomii I Ei 22. Studiul cari,otipului este deci de interes major att la plante ct Ei la animale incluznd omul. La porumb exist o garnitur dipl,oid de 20 cromozomi care alctuiesc 10 pereehi. Deci ri fiecare celui se afl dou seturi identice de crornozomi. Crcinozomii de la nivelul unui set snt ns neomologi, snt diferili ca m,orfologie qi dim,ensiune, puntnd Ei gene diferite. La'organismele diploide informalia ereditar apare astft tedundantd. Crganizarea multicr,omozomal a genomuluir eucariot este rerut gi de particularitlile realizrii reeomhinrii genetice la eucariote cu implicafii n oonferirea unei mai mari flexibi,litti evolutive. Cromozomul eucariot prezint dou unitfi structural,e longitudinale care au fost numite cnomntide, libere pe toat lungimea crornozomului cu excepfia unei. regiun care s-& numit cons'tric,tie primnrd I,a nivelul creia este loc,alizat centro,m'qul, o zon. specializat a cromozormului pentm atagarea sa la fibrele fusului de diviziune. Reginrnea centromeric const din nurneroas'e fibne cromatice, aqezate latur pe latur, ce pot treoe de la un bra! la ,altul croma'tidei (fibre intercromatidice). Morfol'ogia cromozomului eucariot este determfurat de plasar,ea constricliei primare de-a lungul acestuia. Astfel, cromozomul este m.etacent-ric, pnezentind dou brafe egale c,nd oentnomerul este localizat n pozifie median. Cnd centromerul este plasat n afara regiunii mediane apar dou 'brafe cromozom,ale in,egale Ei cromozomul se numeqte suAmatrcentric. Cnd centromerul se afl deplasat spre un crapt al cnomozomului apar dou ,brate inegale dintre care unul foarte lung gi altul
99

foarte scurt, izodiarnetric gi cromozomuL se numeqte subtelocentric. n sfrgit, aunci ,cnd centromerul se af1 pe captul crom,ozomului, deci terminal, exist un singulbra! cromozorqlal

La nivelul cromatidei au fosi descrise filamente spirale, reciproc ncolcite care s-au numit cronl,o'trem,e qi care prezirrt din I'oc n 1'oc ngrogri care s-au numit cromomere. Cromomer,ele conf'er cromonemei un aspect moniiiforrn foarte evident n tirnpul profazei din mitoz, dar mai ales din meioz, ar,anjamentul qi numrul cromomerelor fiind o caracteristic
de specie.

Ei cromozomul se numeEte telocentric.

Structura bicromatidic a cromozomului eucariot metafazic este caracteristic perioadei cuprinse ntre aparilia cromozomilor la debutul, diviziunii nucleare gi sfrEitul metafazei. La nivelul fiecrei cromatide-surori din cromozomuL m,et,af.azic se afl cte un du'blu-helix ADN. Monomemia sau uninemin cromozomului eucari'ot a fost dovedit pentru prima dat autoradiogra,fic n 1957 de ctre Taylor gi colaib. (1957) Ei apoi prin cercetri rbiochimice pe ADN din cromozomii de drosofil de ctre Kavenoff qi colrab. (1973). AceeaEi uninemie apare n cromozomul anafazic echivalent de fapt cu o cromatid a cromozomului metaf.azc. Ipo'teza unin'erniei cromozomu'lui eucariot este susflnut de dovezi ,biochimice, ultrastructurale si genetice. Recent, Okada Ei Comings (1979) au evidenliat la nivelul cromozomilor metaf azcl de hamster chinezesc tratali cu acetat de arnoniu 4M qL ntinqi pe s,uprafa{a apei distilate, existenfa unei organizri de un ordin mai n,alt a ADN, care n urma unui asenrenea tratameurt este eliberat sub forma unor serii regulate de rozete conectate de porliuni liniane de ADN numite interrozete. Lungimea medie a regiunii n care moiecula ADN capt oonfiguralia de r,ozet este de 14 pm care este apropi,at de lungimea medie de 10 Fm a ADN cromomeric din cromozomii politenici de drosofil. Segmentul interrozet are o iungime medie de 4,2 pm. Proteinele matrixului nuclear nehistonice care includ qi cantitli semnifica'tive de octind qi tubulind snt iemplicate n formarea rozetelor. C'ea mai lung pies de ADN descris n nucieii eelulelor umane are 22.0A0 1rm. Tayl'or Ei Hozier (1976) au stabiiit c unitatea de replicare la celulel'e ovariene de hamster chinezesc este de 4 [m lungime, ceea ce implic cca 550.000 situri de iniliere n nucleul diploid (2.200 000 um : 4 Fm). Complementul uman diploid con{ine 6,9 X 10-12 gm de ADN. mprlind aceast valoare cu 3,L4X10rs gm/prm de dubiu heiix ADN se
100

calculeaz 2,2 metri (2.2A0.000 pm) de ADN per nucieu ciip,oid uman (Bahr, 7977). Caracteristic pentru eucariotele evoluate este existenla unui ciclu cromozomal numit ciclul condensdrii Ei decondewrii qornozorrnllui. Cromonemele sau cr,omonemata cel.e dou fibrile longitudinale ale cromozomului euoariot - prezint proprietatea de a se spiraliza mai mutrt sau mai pulin (spiralizare eromozomal) ceea ce determin varialii n forma cromozomilor n timputr ciclului celular. Spiralizar,ea cromonemelor este nsolit de condensar.ea cromozomului, procesul a,tingncl maximum n metafaz cnd cromozomul prezint cea mai constant morfologie. n timpul diviziunii cromozomul apare sub forrna sa transportoare, form cerut de o repartizare echilibrat a informa{iei ereditare n celulele fiice. Dup realizarea acestei repartizri care are loc n anafaz gi desvrEit n telof,az cromozomul trece de la forma transprortoare la forma sa funcfional n cadrul nucleului interfazic. n forma funclional cromozomul atinge gradul maxim de spiralizare a cromonemei,or, nsoli de decondensarea qi desigur pierderea individualitlii cromozomului. Materialul cromozomilor se va organiza sub nftiqarea cromatinei interf azice. Se pare c cloar cromonemele qi pstreaz continuitatea att la nivelul cromozomilor ct qi la nivelul, nucleului interfazic. Se cunosc puline iucruri despre cauzele qi, mecanismele spiralizrii qi despiralizrii cromozomului eucari'ot. Cercetritre din ultimul timp pun pe seama fosforilrii proein,elor cromozomale histonice, n spe! Hr eondensarea cromatinei la debutulr diviziunii. Nucleul inerfazic este metalbolic activ, la nivelul su avncl loc intense sinteze ale componentelor majore ale celulei gi n primul rnd sinteza ADN gi a proteinelor cromozomale histonice. Durblarea eantitlii de ADN ese o condilie necesar desfqurrii mitozei Ei impune diviziunea. Cnd replicarea cromozomilor nu este urmat de diviziunea nucleului qi ulteri,or a citoplasmei iau naEtere diplocrorrtozomi, cromozo'mii fii neseparndu-se n ciou celule fiice, rezultnd o eelul care este endoploid avnd o cantitate dubl, sau corespunznd la un multiplu aI cantitlii dipl'oide de cromozomi, depinznd de numrul de cicluri de replicare desfqurate fr interpunerea mitozei. Un caz interesant este oferit de celulele glandelor saivar,e de diptere n care endociclurile duc 1a formarea cromozomilor politeni. Prin politenie se nfelege desfEurarea de runde multiple de replicare a cromozomilor, fr ca cromatidele
101

fiice s se separe n nuclei

dicul;ar pe iungimea bralului cromozomal. Cromozomii politeni reprezint astfel forma interfazic a cromozomiLor obiqnuifi la nivelui cr,ora s-au desfEurat multiple runde cle replicare. Dirnensiunea unor as,emenea cromozomi ,este de peste 200 ori mai mare ca a cromozomilor obiqnuili din care deriv. Deoareae are Ioc un pioces de mperechere somatic 'a cr,ofiozomilor omologi n timpul politeniziri lor, numrul cromozomilor politeni aparent reprezint iumtate din acela ai cromozomilor obignuili. Din asocierea intim (mperecherea) la acelaEi nivel a cnomomei'elor iclentice ale celor doi omologi rezult un model de bandare specific fiecrei specii, pe baza cruia se poate alctui o cariare citolog'ic a gen'el,or, admi!nd c fiecrei benzi i corespunde o gen. n anumite regitini benziie (cromomerele) prezint o dispunere lax, deslnat a fibrilelor, rezultnd structuri caracteristice care s-au numit puf e, iar cele car au o extindere mai mare au fost nurnite inele Balbiani. La nivelul aces0or structuri a fost evidenliat prin experienfe autoradiografice cu 3H-uridin, desfqurarea unei intense transcrieri ge* netice. n cursul dezvoltrii ontogenetice pufele apar ntr-o anumit ,ordin,e, indiciu c ar'e loc o activare diferenliat, eqalonat a geneior, n funclie de necesittile de moment ale celulei. Cromozomii poiiteni au fost descriEi gi la angiosperme, protozoare, n unele celule transformate maiign. La plante cromozomii. politeni nu snt mperecheafi, prezentnd o structur granular, fr a prezenta benzi distincte. Cromozomii politeni apar n celulele nalt diferenfiate care nu -se mai divicl gi deci care reprezint punctul terminus al unei iinii celulare date. Astfel, cromozomii politeni nu vor mai r.eveni niciodat la forma o,biqnuit, celulele n care se a,fl (de exemplu cele clin glandel'e salivare ale larvelor de diptere) funclionnd foalte intens ntr-un moment precis circumscris al o,ntogeniei dup care mor (glandele salivare ale ,adultului se dezvolt ulterior din celule care ,au crornozomi obignuifi). Polite,nia ajut tocmai n realizarea unei asemenea funclionri la parametri metabolci maximi. n timpul meiozei n nucleul ovocitei primare, mai al,es la batracieni dar si alte verterbrate qi nevertebrate s-a descrs un tip special de cromozomi care apare mai ales n stadiul de dira2

reaiizeaz o -structur cr,omoz,omal politenic n care alerneaz ,henzi clare qi benzi ntunecarte dispuse transversal, perpen-

fii

dif,erili. Rrnnnd asociate ele

ploten pr,elungit. Acest tip de sromozomi numit larnPbru.sh (n perie de sticl cle lamp) este specfie acestei faze Ei este reversibil. cci n fazele ulterioare ale meiozei el revine la forma tipic de crornozoml

zi la Drosaphila. Dimen;iunea CIromozomului lampbnsh poate depEi pe aceea a cromozomului politen ajungnd la 1 m,rn, dar diametrul su este foarte subfire. Din cromomerele sale stnt pnoiectate lateral bucle n perechi avnd diferite forme qi dimensiuni (Ftg. 34). Aceste bucle au o ax fin reprezentat d,e ADN $i din ea snt proiecta,e flbre eare snt acoperite de un matrix c este alctuit din ARN gi protein.
Aflndu-se

spe'cific acelei specii. Acest tip de cromozomi apane qi n spermatogene-

' ..tl

Fig. 3a. Cromozomi ,,iampbrush" din ovoeite de Tritutus uiridescens. Ei reprezint bivalenfi (cromozomi omologi) qi deci douA

stucturi bicatenare d,e ADN

regiuni strns spiralizate-cromomerele.

prezentnd

meioze se nlelege un bivalent, adic doi cromozomi omologi mperecheali. Bucia lateral apare n acest caz ca unitate de iransriere. Fiecare bucl apare asimetric n sensul c la nivelul uneia dintre inserliile sal,e n cromomer este fin qi lipsit de fibre reprezentnd captul su gol, urud, de la care se remarc un gradient de lungime al ii:relor ce snt proiectate din bucl, ia nceput scurte Ei de','enind progresiv mai lungi pe msur ce se apropie de eellalt capt al buclei unde se inser n cromomer. Este posibil ca la nivelul captului gol sinteza ARN s fie blocat sau asimetria s apar ca un rezultat ai polarizrii formrii buciei. Buclele snt considerate a reprezenta modificri reversibile al'e structurii crornozomale la nivelul unor gene active, acest fapt fiind
c fiecare cnomozom lernpbrush neprezint de fapt
103

n mijlocul profazei primei

gi de reducerea sau anularea lor atunci cind se cu inhitbitori ai transcrierii genetice. La unele ur'oCele (salamandr de exemplu) din unele bucle care snt omoloage pufelor cromozomilor politeni, se desprind continuu structuri circulare care confin ADN qi care reprezint nucleolii extracromozomali, rezulrtafi n urma unu proces de extrareplicare care se numeqte amplificore genicd. Printr-o asemenea extrareplicare, cantitatea de ADN se mreEte considerabil, uneori depEind chiar ca'ntitatea de ADN a cromozomil,or ndemonstrat
ac{ioneaz,
EiEi.

chere,a omologilor (n primul caz este vorba de o mperedrere somatic, n al, doilea de o mperechere norma'l meiotic).

pufare

uD,eI asemnri cum

ntre cromoz,omii politeni gi cromozomii larnpbrwh apar ar fi amplificarea genic, fenomenul de

respectiv ,buclare, structura cromomeric, mpere-

Marea deosebire din'tre aceste dou tipuri particulare de cromozomi, dar de excepfional important n nlelegerea fenomenului ereditar, este c n eazul cromozomilor politeni, spre deosebire de cromozomii la,rrtpbrush, transformarea (rnetarnorfozal este ireversi,bil. tri nu vor mai reveni la forma rrormal, tipic a cromozomilor obiqnuili ci funcfioneaz ntr-un stadiu critic al vielii celulei, respectiv individului (stadiul larvar III) cnd snt necesare sinteze de proteine, nespectiv enzime ale glandetor salivare. Dup ndeplinirea rostului 1or, celul,ele glandelor salivare se autolizeaz qi odat cu ele Ei crornozomii politeni. uriaqi Cromozomii tmnpbru,sh, dup ee qi ndeplinesc funcfia tor de sintez inteurs de ARNr revin, ncepnd din diochinezd. qi mai ales n me'tof'azo I a meiozei, la forma normal de bivalenfi asigurnd continuitatea genetic n linia germinal.
2.2.2. STT|UCTU

RA ELECTRONOMICROSCOPrcA A CROMATINEI $r A cRoMozoMuLUr EucARror

Cercetrile de microscopie electronic asupra cromatinei interfazice qi a cromozomului metafazic au stabilit c unitatea de structur a cromatinei eucariote este nucleosomul, o structur periodic, repetitiv de hisone qi ADN. Fibra de cromatin este flexirbil $i pe ea se afl particule sferice dispuse precum mrgeiele ntr-un girag. Nucl'eosomii se afl deci att n
104

cromatina interfazic, cit Ei n cromozomul metafazic, n eucrornatina qi heterocromatin, pe aceast baz putndu-se ,explica continuitatea structural la nivel celular a materialului genetic la eucariote. Particula nucleosomal are un cliametru de 70-110 A. Nucleosomul este alctuit dintr-un octamer histonic n care intr n cantitli egale fracliunile histonice H2a, Hzb, Hs gi Ha dar n dublu exemplar. Octamerul histonic ar.e o greutate molecular de 110.000 daltoni. El se asociaz cu ADN de lungime corespunznd la 200 perechi de ,baze. ADN st l,a periferia octamerului nfqurat ca o superhelice plat (Fig. 35). ntre particulele nucleosomice se afl de asemenea ADN, lung de 1,83 nm, neasociat cu histone. Nu se qtie nc cum particip fracfiunea hist,onic H1 la structura cr'omatinei. n ciuda unor deosebiri de vederi privind forrna qi dimensiunea nucleozomului, numrul de perechi de baze ,asociate acestuia Ei lungimea ADN intercromozomal este cliar c nucleozomul este o unitate de baz a cnomatinei eucariote. Dimensiunile sale snt de 70-1,25 A, form de disc (se mai numeqte gi platizom\ sau sferic, fiind nfquna't de 2 ,or Ei jumtate ntr-o dispozilie ncr.elit de o lungime de ADN care are 140200 de perechi de nucleotide. Dup Gottesfeld Ei oolaboratorii (1975) num'ai portiunile inactive ale ADN snt orgal'li,ciecsl-, nizate n nucleozomi. Histona H1 este implicat n superspiralizarea nucleo--l zomilor qi a ADN internucleozomal qi mpachetarea lor n fibra de cromatin (Rahr. i977).
t I
I I I I I

Fig. 35. Relafa dintre structura ADN, oligomeri

diametru este suptaspbalizat n interiorul subuni-

l,-"^ l3LsA
I
I

histonici gi fibtile de cromatin de diferite dimen-

siuni (grosimi). Duplexul ADN de circa 25 L

tfilor cromatinei (NUCLEOZOM.I cu un pas (u1fime) de 504, spte a da o fibr de 100 A. aga cum apare la microscopul electronic. ntregul complex nucleohistonic este din nou spiralizat (nfagurat) cu uu pas de 500 A qi o raz d.e 130 A spre a da o flbr d.e 200 A *t. cum se vede la 'nicroscopul electronic. Potliunile (ntind.erile) de ADN liber dintre nucleozomi n mod normal snt mai lungi
dect este aAtat u aceastA scheml.

i
I
I t

l i
!

50

loo*-!l
200 A

I ':ti
i

105

ln fibra de cromatin ADN se afl sub forma superspiralizat raportul lungime ADN : lungime fibra de cromatin fiind de cca 30 la 1. Nucleozomii snt mesllinufi n fiibra de cromatin prin cooperarea proteinelor specifioe cum ar fi histona H1, nonhisbonele Ei proteinele contr,actile. Cnd celula trece prin stadiul postreplicativ G2 aI ciclului ceiular, cele dor-r fibre replicate n stadiul precedent de sintez S al interfazei se condenseaz sprc a forma jumtatea unui cromozom (cromatida), pliindu-se n cromatide surori. Fiecare cromozom este pliat ntr-o oonfiguralie specific n metafaz. Structura electronornicroscopic a cromozomului eucariot relev natura fibroas a fibrei nucleohistonice care nu prezint capete iibere. Cercetri recente efectuate de ctr,e Loemml de la Universitatea Princeton din New Jersey arat c 'organizarea cromatinei n cromozomul metafazic are la baz o re{ea de proteine nonhistonice. ndeprtnd histonel'e qi majoritatea proteinelor n,onhistonice din cromozomii metafazici umani a ajuns la constatarea c ADN cr,omozomal rmne ntr-o structur organizat qi compact care apare ca un miez central ce prezint morfologia cromozomilor metafazici intacfi, fiind nconjurat de un halou de ADN. Structura miezului central este dezorganizat, n urma tratamentului moderat cu tripsin. Prroduqii de digestie au fost analizali electroforetic. S-au evidenliat peste 30 fracliuni de proteine nonhistonice. Aceste ceroetri aduc date noi referitoare la structutra cromozomului eucariot Ei ,arat c aceasta se bazeaz, n primul rnd pe existenta unei matrice de proteine nonhistonice care eonfer cnomozomultri metafazic forma s,a caracteristic. Aceste oercetri urmeaz s fie confirmate.
2.2.3. COMP LEXU

SINAPTIN EM AL

electrondens numit spaliu de mpereehere. Regiunea centnal ane o l{ime constant de 1000 A, reprezentnd qi distan}a din106

n meiocite apare ca structur caracteristic prezent doar la eucariote cotnplerul sinaptinemal (C. S.) descris pentru prima dat, n-1956, de ctre Moses. C. S. este,o stmctur tripartit (Fig. 36) eviden{iat numai eleetronomicroscopic, prezennd dou componente laterale Ei o regiune central mai putin

Fig. 36. Complexul sunaptinemal (CS). A. n spermatocitele de

turA direct cu membrana nuclear, r 48.000 (dup Maillet gi Foillot,

Philaenus spumariws se remarc dimensiunile complexului sinaptinemal n absenla materialului cromatic. Mrire r 78.000. B. complexe sinaptinemale n:,ultiple, n lega1965).

cromozomii omologi n pa.chiben, indiferent de lungirnea cromozomilor omologi qi conlinutul de ADN din aoeEtia. n regiunea centr,al se afl elementul central, care are 200 A d;ametru. Spaliul dintre regiunea central Ei eiemen'tele laterale ste traversat de filamente fine. La lcuste Ei asoomicete, componentele laer,al,e apar cq o structur ba,ndat cu o periodicitate de apnoximativ 100 A. Cromatina crom.ozomiloi omologi vine n contact cu elementele laterale ale C. S., pe ntreaga lor trungime. Ambele capete ale bivalentului snt ataqate la membr,ana nuclear prin tel'omerele 1or. La formele la care n pachiten apare o distribulie n ,buchet a bivaien{il'or, ambel'e capete ale bivalenlilor sn,t atasate ntr-o regiune restrns a rnem,branei nucleare, adiacent centriolului. Formarea CS ncepe cu sinteza unei componente laterale n spaliul dintre crornatideiesurori ale fiecrui cromozom leptotenic (nc aflat sub form de univalent, nemperecheat cu omologul su) gi capetele fiecrui cnomozom leptotenic (avnd ntre cromatidele sale un element lateral), snt ataEate la membrana muclear. Are loc alinierea relativ a cromozomilor om,ologi pe un spafiu de cca 3000 A, fr a se cunoagte mecanismut rin care e realizeaz aceast mperechere prea}abil a omologll,or. Elemen'tele laterale ale c. s. ce aparlin omologilor se asociaz avnd lroc asamblarea C. S. care determin o mperechere foarte exact, cromomer la cromomer, punct la punct a crelor doi cromozomi omologi cu f,ormarea 'bivalen{ilor. Pmtru asamb}anea c. S., elemen-

tre

fi7

C. S. mediind schimbul dintre moleculele de ADN ale omologilor. C. S. apare ca o structur ri,bonucleopr,oteinic. Aceast aser'{iune se bazeaz, pe rezultatul digestiei enzimatice cu DNazd care dizolv cromatina bivalentului fr a altera structura complexului sinaptinemal. Rezult c ADN nu este un component major a1 C. S., Putnd fi pnezent ns n cantitli imfime. In schimb, ribonucle,aza dezorganizeaz regiunea central gi cea mai mare parte a elementelor laterale. Prezenfa componsntei proteinice n C. S. este dovedit de rezuitatul digestiei cu enzime proteolitice (tripsina). Elementele laterale dau reac{ii citochimioe care indic prezenla n ele de proteine bazice de tip histon, r,egiunea central dnd reacfie ciiochimic diferit de aceea a elementel,or 1atera1e. Exist unele afirmalii dup care ADN rmas nereplicat n faza S premeiotic qi replicat n zigoten (Stern gi Hota, 1969, Hota qi Stern, 197I) ar media mperecherea cromoz,omilor omologi d'ar dup al{i autori (Westergaard Ei Wettstein, 1972) nsEi componenta lateral a C. S. poart informa{ia pentru mperecherea sit 1a sit a cromatidelor cromozomilor omologi.

semnuL citologic al schimbului intercromozomal (cr,ossing-over),

tele lateraLe ale fiecrui omolog sufer o transpozilie dintre cromatidele surori spre exterior, dep.asare determinat de rotirea cromatidel,or surori fa! de componenta lateral. Este posibil ca componenta central a C. S. s derive din elementel,e laterale omoloage prin existenfa unor fibrile dar Westergaard Ei Wettsein (L971, 1972) admit c elementul central al C. S. ar fi sintetizat n nucleol de unde migreaz la Locul de unire a elementelror laterale. n diplotenul trziu C. S. se dez'organizeaz iar omologii snt respinqi de l,a nivelul bivalentului fr ns a se separa, rmnind unili la nivelul chiasmelor

xuri ADN. Dup uneLe ipoteze ar exista gene care codific sintnza unor proteine alosteriee de imperechere, capabile s se ataqeze la anumite secven{e cle nucleotide. Ar exista dou tipuri de asemenea proteine de mperechere, unele caracteristice regiunilor e.ucromatice, alt,ele caracteristice regiunilor heterocromatice. Dup alt ipotez, ar exista gene de fuziune care ar dirija sinteza unor proteine de mperecher'e bivalente specifice celor doi cromozomi omologi ai fiecrui bivalent. Acese gene ar fi derivat printr-un crossing-over inegal ntre cromozomi omolo.gi.
T.OB

Complexele sinaptinemale mediaz formarea de heteroduple-

3. CARACTBRISTICILE ORGANI.ZAR,IT EUCARIOTE 1. nchiderea materialului ereditar ntr-un spafiu genetic reprezentat de nucleu. 2. Asocierea permanent a ADN gi histonelor cu formarea fi,brelor nucLeohiston iae. 3. Prezenfa a trei clase de secven! n ADN: secvenfe unice, secven{e moderat r,epetate Ei secvenle nalt repetate. 4. Dif,eren{ierea a dou stri funclional'e ale cromatinei eucromatina qi heterocromatina. 5. Evo1u{ia unui ciclu de condensare Ei decondensare a cromatinei. 6. Organizar,ea unui fus de diviziune eare asigur repartizarea echilibrat a produgil,or de replicare. 7. Specializarea la nivelul cromozomului a unei regiuni de atagare la fibrele fusului de diviziune centromer (cineochor). B. Organizarea nucleolului ca structur intranuclear specializat n sinteza ARN riboz,omat. El este asociat cu regiunea or,ganizator nucleolard, (N. O.) a unuia sau a mai multor cromozomi. 9. Aparifia unui centri.ol cilindric cu formula ultrastructural I X 3 fiiamente, implicat n organizarea fusului de diviziune.

4. PROCARTOTB-EUCARIOTE, O COMPARATIE Procariotele prezint ADN necomplexat cu proteine bazice hisonice (cu unele exoeplii E. coli, Anabaena, Aphonocapsa). ADN procariot nu prezint secvenfe repetate (excepfie gene rib,ozomale prezenbe n cteva copii). Nici ADN viral nu prezint, secvenle repetate de baze cu exceplia fagilor din grupa T par (Tz, T4, T6) al cror cromozom prezint repetilii de baz,e la fiecare capt. Procarioele nu au materialutr ereditar ncadrat ntru-un spaliu genetic defi,nit. Cantitatea de ADN este mult mai mare Ia eucariote, corespunznd unei cantitfi mai mari de informalie eneditar (tabelul 2).
109

Tabelul 2 Datc crntitatlve prlvlnil genomul vlral 9l eelular](ilup J.E. Taytor)

fagul

pX t74 fagul T
),

Polioma

0,00158 0,00186
7

fagul T 4 Vinrsul Fowlpox

0,0122 0,0172

I I

0,0520t6 0,0930t6
0,45

I I

E. coli Lark E. coli Cairns

Chlamydomonas

x l0-r x x x
10-r 10-r

1,530 1,400 10,200 6.12

15,64

3
1,8

Drojdie
Neurospora

4,6
2,5 22,0 53 0,45 0,45 0,18 0,20
0,7

10-t

Angiosperme

Raphanus sstiYun Vicia faba Llium longfflorum Xanthorhize Aquitegia Drosophlla melauogaster
Chironomus

850,00

I
6

7.480
18.020
153 153

t2
r8
7

Neverte-

61,2 68,0

btate

pallidivittatus Pegti (specii diferite)

Dpnoi: Protoptenrs
Lepidosireu

-2,8

238-952
17.000 42.160
1.666

50 124 4,9 24,6 94,5

Vertebrate

Amphibia Bufo
Salamandra

l3 l3
t2

8.364

Plethodon Necturus maculosus Reptile

32.130

Ord. Squamata Ord. Crocodylia

PAsri Matnifere-hamster Om

2,1-2,3 2,9-3,1
3,5 3,0

g,t-4,2

986-

7t4-782
1054 1428

18-23
2t
23

1054-

I I90
1.020

110

Eucariotele conlin de cca sute de mii de ori mai mul ADN dect virusurile gi de mii de ori mai mulr dec,t bacteriile. -tixist ns mari varia{ii cantitative chiar n cadnrl aceluiaqi grup de organisme eucariote. Drojdiile ibunoara, eucariote tipice, conlin o cantitate de ADN nu cu nurlt mai mare dect bacteria E. coli, pe c,nd n nucleii unor dinoflagelate se afl mai mult ADN dect la om. Nru exist deci o relafie simpl, d,irect ntre cantitatea de ADN qi aceea d,e informafie ereditar. (ADN nerepetitiv). 5. GBNOMUL EXTRANUCLEAR

La eucariote, n afara nucleului se afl molecule informalionale de ADN oanton'ate la nivelul unor organite specifice precum mitocondri.ile qi clwoplastele ca Si n kinetozomii, de la ciliate, granulii bazali ai flagelilor organismel,or flagelate qi kinetoplastele de la Trggnnosamidre. Din ace,ast cauz celula eucariot apare ca o strucur multigernornic :r care, alturi de un genom nuclear exist cel pufin al{i doi genomi diferifi genomul cloroplrastic specifie celulei vegetale extranucleari Ei genomul mitocondrial, comun cel.ulei vegetal.e qi animale (Fig. 37), ADN orgamitelor, localizat n matrixul acestora, prezint. un aspect ultrastructurafl. simitlar aceluia al, nucleoidrilui baeterian sau cionobacterian, n car'e se rm,arc o retea tridi-

z o
o
o
r
IU

t c fD I

.l

slendard

Fig. 37. Fractiunile de ADN

gracil,is.

(a) Bandarea care apae n tubul de centrifug care conline ADN de Euglena gracilis
(centru gi dreapta) gi ADN de fag SP 8 folosit ca standard (stnga). (b) Analiza spectrofotometric ln ultraviolet a be[zilor. Banda cu densitatea 1,743 corespund.e ADN martor SP 8. Banda
principal

celular delaEuglena

(J

(,

s
6

= )
.g
-o

foiitocondrie

ADN

/ADN
c

loroplastic

din centru corespunde ADN nuclear. ADN mitocondrial bandeaz la 1,691 iar ADN cloroplastic bandeaz la 1,686 (greutate molecular 9,2 x:106 d.altoni).

.o

14

o
r.69r .0c6

greu

dens;latee(9

crf) uot 111

fibrile fine de ADN cu orientare randomizat, avnd un diametru de cca 25 A. nseamn c gi n acest caz este vorba de lipsa asocierii ADN cu histonele. De regul. ADN extranuclear se prezint ca molecule circulare bicatenare de ADN, dar gi sub form de moleeule liniare. ADN extranuclear se replic dup modelul semioons'ervativ qi relativ independent de replicarea ADN nuclear avnd echipament enzimatic propriu de r,eplicare gi de transcriere. Organitele celulei eucarioe, cloropl,astele gi mitocondriile, prezint un sistem autonom de sintez proteinic echipament enzimatic propriu cu ribozomi specifici de tip procariot (70 S) qi cu ARN specific. Exist ns o strns independen! ntre funclionarea genomului nuclear Ei a celui cioroplastic sau mitooondrial. ADN mitocondriatr este o structur circulrar dublucatenar care are o greutate molecular ce varlaz, ntre 1X 107 Ei 5X107 daltoni. EI are o dimensiune mai mare la ciuperci, pr'otiste gi plante superioare. Mamiferele au un genom mitocondrial mie de 1 X tOt daltoni. I"a drojdie, ADN mtocondrial are 5 X 102 daltoni ceea ce corespunde Ia 75 [<ilo,baze. Prmele gene cane au fost desemnate a codifica cCImponente ale maEinriei de sintez proteinic mioeondrial au fost desemnate gene sg7, $i el.e includ genele pentru ARNr qi ARN mitooondrial (Tzagoloff Ei Macino, L977). La Soccharom,yces cereaisine s-au descris cel pu,Ln 30 tipuri diferite de ARN mitooondrial. Numrul toal de specii izoaccepoare de ARN este n acord cu ipoteza usobble (vezi codul genetic). La Socclwromgces nu este necesar importul de ARN citoplasmatic pentru sinteza proteinic pe ribozomi mitocondri,ali. La Tetrahgmena ns numai ARN pentru leucin, fenilalanin, triptofan qi tirozin snt sintetizati pe matrif de ADN mitooondrial, restul fiind importafi din cit,oplasm, avnd origine nuclear. Aminoacil sintetazele mitooondriale, factori de inifiere a sintezei protein'elor n mitoeondrii Ei cele mai mule proteine ri'bozomale snt produgi ai genelor nucleare sinte'tizati pe ribozomi citoplasmatici. Mutafia ,,pokytt de la Neurospora cmsso apare ca rezultat al absenlei unei pr,oteine specifice a subunitfii ribozomale mici (30 S) a ribozomilor mitooondriali. Aeeast pnotein a fost desemnat uar I qi este codificat de o gen mitocondrial. A doua cl,as mportant de gene mitocondriale a fost desemnat genele mit Ei crodific pnoteine ce funcfioneaz n tnansportul electronilor qi fosforilarea oxidativ. Mutaliil'e mit afecteaz
mensional de

tL2

trei complexe ale membranei interne, eitocromoxidaza, coenzima QHz-citocrom c, reductaza Ei ATP-a,m oligomicin sensibil.

Din totalul a nou prot'eine sintetizate n mitocondrii qase s-au dovedit a fi specificate de ADN mitocondrial. S-au descris trei grupe de complementafie mitocondrial ori 7, ori 2 Ei ori 3 care intervin n codificarea subunitlilor citocromoxidazelor sfurtetizate n mitocondrii. Mutafiile din grupul de complementatie cob snt deficiente n ciocromul b. Un grup de mutante mitooondriale deficiente n ATP-azd desemnate pho 2 prezint leziuni n componenta proteolipidic a ATP-azei. La S. cereusioe mutantele citoplasmatice spontane ,,petite66 prezint unitli genomice mitocondriale n care un segment excizat al genomului parental de tip slbatic (normal) a fost amplificat n tandern. Acest segm.ent excizat devine unitatea repetat a genomului ,,petite66. Acest genom ,,petite( la rndul su, deqi produsul unui eveniment mutafional poate suferi cieI,efii care duc la genomuri ,,petite( secundare, avnd unitli repetate mai scurte (Gaiiland qi colab., 1980). Studiul mutante1or spontane ,,petite( arat c n mod frecvent capetele segmentului excizat corespund la secvenfe scurte ale genomului de tip slbatic care snt extrem de bogate n GC. Astfel, clu,sterii. (grupri masive) de GC snt localiza! n segmente lungi ,bogate in AT. Repetifii de secvenle s-au dovedit a fi prezente att la niveLutr clu,sterilor GC ct qi a spapiatorilor AT, ceea ce face pnobabil posibilitatea ca excizia s se realizeze prin'tr-un mecanism de recombin'are nelegitim cu specificitate de sit, ntre secvenfe omoloage. Combinarea metodelor de eartare genetic qi de cartare fizic a dus la cartarea markerilor mit- Ei de rnezisten! la antibiotice din genomul mitooondrial de la S. cereaisine. Pe oalea analizei co-retenfiei q co-delefiei alelelor mutante fur Ei din ADN mitooondrial al mutantel'or peti.te (qJ Ei a analizei produqilor de recomrbinare (analiz gen'etic) din ncmciqri bi- qi trifactorirale, s-a sta{bilit circularitatea hrfii genetice mitocondri'ale, unicul grup d,e lincaj genic mitocondrial avnd ca suport fizic molecula circular dublu-eatenar de ADN mitocondrial. G'enele ribozomale mitocondriale Ei pentru ARN mitocondrial au fost cart"ate priur hitbridarea acestor produgi eu fragmente de ADNmt de la tipul siibatic $i de la tipul p- $teti.te) gener,ate prin restrielie cu endonucleaze de restricfie.
8 - Descifrind tainele eredit|ii, vol. I 113

Harta genetic mitooondrial evidenfiaz o oonsiderabil dispersie a genelor care ooclific funcfii nrudite. Cele trei gene structurale car,e codific citocromoxidaza snt separate d,e secvenfe care conlin genele sgn q mit. Geurele ARNr, ARN qi ATP-caei snt de asemenea distribuite mprqtiat n tot genomul mitocondrial. Aoeast distribufie specific a genelor mitocondriale eltimin posibilitatea expresiei lor ooordonate contr'olat prin simteza unui ARNrn policistronic, gsnele mittooondriale, spre deosebir,e de oele de procariote, apar a fi transcrise individual, caracteristic specific qi genelor nucleare euoariote. Clor,oplastul plantelor superioare conline un numr mare de molecule circulare, identice cu ADN cu o greutate moleculiatr de cca 9 X tOz da,l,toni. Fiesarc nro.lpcul oonline furformafia genetic total a orgarnitului (Brner, 1980). Ca urmane, numru1 de copii ale fiecrei gen,e cloroplastice per celul poate ajunge 1a cteva mii, depinznd de numnr,l de cloroplaste per celul Ei de cel al moleculelor de ADN per cloroplast. Cu ajuorutr endonucleazelor de restricfie s-a stabil.it harta fizic s, ,gDoffiului clonoplastic qi au fost cartae genele pentru ARNr, ABN, subunitatea mare a frracliunii proteinice I gi pentru unele polipeptide neidentificate. S-a stabilit c genele ARNr snt localizae n cadrul unor r'egiuni cu secvente repetate din ADN (in cadrul a dou repetifii inversate la spanac, porum,b qi Chlotrydommtas gi n cadrul a trei repetifii n tandem mai mici.7a Euglenn). Pe ribozomii cloropl,astici snt sintetir.ate mai mult de 90 po'lipeptide distfurcte, incluzind gi subunitaea mare a fracliunii proteinice I (ce particip n cataliza enzimatic a fotosintezei), trei surbunitli ale factomlui de cuplare CFt doi factori de elonga{ie qi ciocromii. Un numr mare de proteine clonoplastice snt si,:rtel:zatn pe riibozomi citoplrasmatici qi includ enzime ale ciclului Calvin, enzimele sintezei pigmentului ADN polim erazal polipeptidel,e tilncoidelor qi memrbra,,nele anvelopei cloroplastului. Polipeptidele snt evident sintntizate n citoplasm, ca precursori avnd ,o secven{ semnal. Aceast secven{ adifional permie transportul specific prin anvelopa cloropiastul,ui dup care este eliminart. n membrana anvelopei cloroplastului se afl receptori specifici pentru secvenla semnal a moleculelor pr,ecursoare, facilitnd trecerile prin membran. Recen,t, au fost izolafi crLmomi cloroplnstici intacfi de la alga Euglenn ca qi de Ia numer,oase plante superioare Ei s-a
114

constatat c aceEtia snt circulari, avnd o circumferif de cca 45 [rh, ceea ce cor'espunde la cantitatea de ADN de la fagii
T2 sau Ta.

S-a oonstatat c genele cloropLastice care codific diferitele enzime sau proteine ce particip n fotosintez sau n morfogeneza organitului sau ,genele mitocondriale ai crnor produgi dirijeaz sinteza unor enzime ce intervin n lantul transportorilor de electroni sau a unor protein,e structurale sufer mutafie gi recombinare. Ele alctuiesc ca Ei la pruoariote un singur grup de nlnfuire. Cercetri de hibridare molecular au demonstrat lipsa unei omologii ntre ADN nuclear qi ADN extranuclear. O analogie mai mare apare ntre ADN extranuclear qi ADN bacterian sau ciano'bacterian, de unde s-a tras concluzia c organitele celulei eucariote ar fi derivat prin endosimbioza unor strmoqi de tip prooariot bacteriile pentru mitooondrii, cianobacteriile pentru cloroplaste (Gawil, 1978). Exist gi alternativa ca celula eucariot s derive prin transformara progresiv a celulei procariote, organitele citoplasmatice ale celulei eucariote provenind prin transformarea mem'branelor tilacoide Ei prin compartimentaiizarea genomului inifial n genom nuclear, mitocondrial, cloroplastic etc.

Capitolul IV
CODIFICAREA BIOCHIMICA SI EXPRESIA GENICA

1. GBNERALITATI

Gena reprezint un segment din macromotrecula ADN a crui secven! de nucleotide deline, sub form oodificat biochimic, informalia genetic necesar pentru sinteza unei catene polipeptidice. Aceast informalie este transmis n prooesul de transcriere unei monocatene ARN car poart astfel mesajutr genetic ce dirijeaz includerea n catena polipeptidic a
aminoacizilor cor'espun ztor. Secvenfa genic codificaoare este precedat de ,o secven{ necodi.ficatoare de circa 50 nucleo'tide care s-a numit regiune promotor, r'eprezentnd situl de aaqare a ARN polimerozei n vederea transcrierii. De asrtrlea n cadrul genei se mai afl o rqgiune implicat n r'eglarea transcrierii genei qi care a fost numit regiune operatoare. Uneori dou sau mai multe gene care defin informafia genetic ce dirijeaz sinteza unor enzime ce intervin n aceeaqi cale metabolic pot avea acelagi promotor qi acel,aqi operator. n acest caz asemenea gene snt tr,anscrise sub forma unui tr,anscript comun care poate fi apoi clivat n diferite caene ARNrn purttoar,e al,e mes,ajului genetic pentru fiecane caten polipeptidic. Gene1e care delin inf,ormafia genetic pentru sinteza polipeptidelor se numesc gene structurale. Tr.anscriptele 1or reprezentate de ARNrn snt traduse n pol,ipeptide. Genele car'e delin informalia genetic pentru sinteza ARNr se numese gene ribozqmnle. Transcriptele lor nu snt traduse. Conversia (traduoerea) mesajului genetic din limbaj de acid nucleic construi,t din cele patru nucleotide ntr-un limbaj pro116

teinic, construit din cei 20 aminoacizi principali este mediat

de un sistem de codifioare-decodificare cunoscut sub numele de cod genetic. Aceast conversie se realizeaz la nivelul riibozomiqi are ioc prin participarea lor iocul sintezei proteinice celor trei categorii principale de ARN celular: AItNm, ARN qi ARNr. Ideea prof'etic a lui E. Schrdinger din anii L944-t945 despre natura relafiei dintre actzii nucleici Ei proteine formulat n termeni de codificare biochimic s-a dovedit real Ei cristaiizat sub denumirea dogmei centrale a biologiei molecul.are elaborat n anul 1956 d,e ctr,e Crick. Dogma central a biol'ogiei molecular,e a admis transferul unidireclional al informafiei genetice ADN + ARN -> pr,otein,e. Ulterior, descoperirea reverstranscrierii a adus coreclii dogmei centrale a biologiei moleculare, demonstrnd posibilitatea unui transfer invers de infor,mafie genetic de la ARN l:a ADN.

2. CODUL GENBTIC
Codui genetic repnezint un sistem biochimic prin care se dintre acizii nucleici Ei pr,oteine. Relafila dinrtre muafia uurei gene Ei blocarea unor eape specifice aie unui lan! meta,bolic 1a Neurospora a fost stabilit nainte de 1944 de ctre Beadle gi Tatum su,b formula metapolipeptidd foric: o gemd, o enzirnd. Colineoritatea gend, a fost ulterior d,emonstrat n numer'oase cazuri. Astfel, n 1957 Ingram Ei Husit au artat c hemoglobinele de tip A qi S au o structur primar car,e difer printr-un singur aminoacid (fig. 3B). Hemoglobina S este ,o hemogl,obin mutant. S-a tras concluzia c mutafia a alter:at pozilia nucleotidelor la nivelul genei iar aceast al,terare a fost tr'adus printr-o alternare a poziliei unui aminoacid n catena polipeptidic. Veridicitatea colinearittii nucle'otidel,or de Ia nivelul genei cu aminoacizii de la nivelul oatenei polipeptidice a fost demon;strat experimental de ctre Yanofsky n t964. Anaiiznd mutantii armotrofi de E. coli induqi prin iradiere UV, deficienli n proteina A a triptofansintetazei, protein care reprezint o caten polipeptidic de 267 aminoacizi, autorul a constaat c n pozili,a 2t0, mutanta A2s ,at arginina iar mutanta Aa6 are acidul glutamic pe cnd tipul normal prezint n pozilia respectiv glicin,a. Pe
sta'bileEte relafia

Itr

HbA
t,4 .

HbS
-Y\./ ti\ /.-.\

153 i-11,

d}i,3 d""t %o* I

i9&\ ()

ts

Fig. 38. Comparatia cromatogramelor peptid.elor produse prin digestie cu tripsna a hemoglobinei normale 6ffe; gi h.e-moglobtnei din celule faliforse (I{bs) din care teiese modifiss3sa ln pozifia peptidei 4.

aeeast tlelz, s-a tr,as comcltuzia c o schimbare n secvenfa de nucleotide determin nlocuinea unui aminoacid cu altul, de unde dovada oolinearitfii nucl,eotide anninoracizi, respectiv o colinearittii gen-protein. fur an'ul 1952 Doumce $i apoi n anul 1954 Gamow, bazafi pe desooperirea lui Astlbury gi Bell din 1938 care au constaat prin ceroetri crisalografice c spaliul dintre urucleotide l,n ADN este aproximativ egal cu spa{iul dintre aminoacizi n ca,tena polipeptidic, emit ipoteza potrivi creia secvmfa, lniar de nueleotide d,in ADN determin secventa liniar a arninoacizilor din catenele polipeptidice ale moleculelor proteinice. Gamow a analizat s'tatlstic relafla dintre polinucleotide, reprezentnd cuvinte lunagi scrise intr-un alfalbet cu patru iiere (cele paftru ibaze azotate) gi poli,peptidice, reprezentnd cuvinte lungi scrise ntr-un alfabet cu 20 litere (reprezentate de crei 20 amin'oacizi prineipati). Dac seevenfa de nucleotide din acidul urucleic determin secven{a de aminoacizi dilr polipeptid se pune problema relafiei dintre cele 4 herze azota'te gi cei 20 aminoacizi principali n termeni de determinare cantitativ: cte baz,e azotate determin un aminoacid? Dac se' admie c o singur baz azotat deermin (specific sau codific) un singur aminoacid atunci n virtutea relafiei 4L:4 nu vor putea fi specifica{i dect 4 aminoaqzi. Tot astfel eombinri de cte dou 'baze azotarte, potrivit rela!ei 42:16 snt instrficiente spr,e a specifica toti cet 20,ami118

noacizi principali. Doar combinri de cte 3 baze azotate (43 - 64) pot s ofere posibilitatea specificarii tuturor celor 20 aminoacizi principali qi s mai rmm nc qi alte posibiltti
suplimentare de specificare. Relalia nucleotide-amin,oacid a fost dovedit experimental studiindu-se mutafiile induse de ctre acidul nitros la VMf,. a crui capsid const din 2L50 catene polipeptidice ideurtice, fiecare confinnd c'te 158 amimoacizi. Mutatiile indtrse de ctre acidul nitros sint tmnzifiii de tipul A. + G sau C -+ U (vezi, mutageneza). n urma aparifiei acestor mutalii la nivelul nucieotideloldin ARN genetic al, \[VIT, care ndeplneqte qi rul de ARNrn, apar modificri qi n catena polipeptidic. Aceste modificri snt de tipul unor substitufii de aminoacizi: Prolin -> Serin -+ Fenilalanin sau Prolin -> Leucin - Fenilalanin. S-a dedus c Prolina ese specificat de un codon la care ce pu{in dou nucleotide snt fie A, fie C. Tranzifia A -+ G sau Q + U a unei,a din ac,este nueleotide trebuie c genereaz codonul Serinei, respectiv pe acela aI Leucinei. n oodonul Fenilalaninei ambele mucleotide trebuie s fie G sau U. Pe seama unor deducfii asemnaoare qi a analizei variantelor hemogtobinei umane, Nir,enlberg a descifrat n 1961 codul genetic. Efectundu-se studii genetioe supra mutantelor induse cu proflavin la bacterinfagul Ta s-a dernonstrat experimental c unitaea care codific un aminoacid este tripleta de uruclEotide care s-a numit codon. Asemenea studii n care s-au aplicat teste de recombinare cu tipul slbatic au conrdus la ooncluzia c n urm,a acfiunii proflavinei are loc fie adifia, fie delefia de baze din secvenfa polinueleotidic. Astfel, exist mutante inifiale nota,te convenlional cu ,,-( qi mutante naturale de reversie notate cu ,,f c. O secventa initial, normal de nuclieotide va fi citit din trei rr trei baze azotatm spre a dirija de fiecar,e dat plasarea fur lanlul polipeptidic a unui aminoacid. Dac se admite c secventa de nucleotid,e reprezentind cadrul de citire ncepe s fie citit dintr-un punct fix, delefia unei singure perechi de urucleotide va duce la schimbarea tuturor tripletel,or, modificnd cadrul de citire Ei atunci n oatena polipeptidic r'or fi ncluqi cu totul alfi aminoacizi dect n cazul normal' Are loc citinea greEit a aodului. Astfel, dac cadrulr
119

normal de cirtire est'e GACG. GAG. GAG. GAG, insmlia uniui singur C Ia nivelul sgefii va determina urmtorul cadru de citire: GAG. GAC. GGA. GGA. etc. Tot astfel dele,tia lui A va produce de aseme,nea schimbarea cadrului de citire GAG. GAG. GAG. GAG Ei atunci secvenla de triplete va fi GAG. GGG. AGG. AGG. etc. n ambele cazuri este sehim,bat totalmente cadrul de citire mai ales dac asemenea alrterri se produc la nceputul genei. Se sintetizeaz o protein anormal, mutant sau
nefunclional. Dac n urma mutafiei, dup ce a avut loc inilial o delefie a unei perechi de baze azotate, va avea loc adifla unei alte perechi de baze ,azotate ur porliuni 'adiacente a,le aceeiagi gene se poate restabili ordinea ur'ormal a nucleotidelor (se reface cadrul de citire) Ei ea va fi citit normal. Astfel, considerqrd polinucleotida GAG, inserlia lui C urrnat de delelia lui A va refaee cadml normal de citire, va avea loc o citire corect a sa $i se va sintetiza ur-r polipeptid normal:

GAG. GAG. GGA. GGA. GGG. GAG. GAG... chiar dac cteva triplete pe portiunea n care se realizeaz aditra qi dele{ia vor fi modificate. Delefia sau adilia uneia, a dou sau a patru pereehi de nucleotide nu reface ordinea normal a nucleotidelor respectiv a codonil,or qi are loc sinteza unei proteine mutante. n anul 1961 Nirenbeng qi Matthey pe de o parte qi Ktrorana pe de alta, folosind ARNrn sintetizafi artificial ce aonfineau o secven! cunoscut de nucleotide, au r,euEit s sintetir,ez,e i.n uitro diferite polipeptide n sisteme aceiulare care oonlineau ribozomi, factori proteinici necesari pentru sinteza polipeptidic precum qi tot setul de ARNf. S-a analizat apoi oompozilia polipeptidelor sintetizate. Astf,el cnd au folosit un homopolimer poLiribonucleotidic format numai din uracil @oli U) a fost sintetizat in uitro polipeptidul polifenilalanina. Astf,el, s-a demonstrat c tripleta UUU specific aminoacidul fenilalanina. Cnd s-a f,olosi;t poli-C s-a sintetizat polprolin,a. Poli-A determin sinteza polilizinei. Numai poli-G nu a putut fi verificat inifial cci formeaz ntre nesturile guanin puntl de hidrogen care determin aonformafli spaliale multicatenare spirale la care rirbozomii nu s,e pot ataEa. Ulteri,or s-a stabilit c GGG codific glicin;a. Experienlele de verficare a propriettilor de oodificare al,e polimeritror au fost oontinuate lundu-se r considerane oopolimeri. Pe aceiast baz. s-a stabilit c poli A-G deermin ncorporarea lizinei ntr-o caten polipeptidic
120

'

peptidic a alaninei, argininei gi prolinei. O secvenla repetitiv CUCUCU determin sinteza unui polipeptid n care leucina alberneaz cu serina. Au fost folosifi ,aPoi oopolimeri cu 2 ,baze azota,te in proporfii diferite qi cu 3 rbaze azotate diferite reugindu-se sinteza de polipeptide artificiale n care erau incluqi divergi aminoacizi. Prin asemenea experienfe s-a putut de'termina direct relalia de specificare a aminoacizilor de ctre nucleotide. Dar prin ele nu se putea stabili ordinea nucleotidelor n cadrul tripletelor. Pentru aceasta a fost sintetizat artificial un ARNm alctuit din dou nucleotide diferite dar la care se gti'a care este ordinea acestor nucleotide. De exempliu s-a oonstruit un ARN,rn artificial de tip UGU-GUG-UGU-GUG etc. qi s-a constatat c el dirijeaz sin,teza unui polipeptid n care cisieina alterneaz cu valina" Pe aceast cale s-a putut determina experimental ordinea nucleotid,elor celor mai multe triplete. Ulterior, pe ,baza unor tehnici sofisticate care au inclus hidroliza ritbonucleazic a ARNrn, ultracentrifugare,a fracfionat Ei electroforeza I'izaelor, cromatografia pe hrtie cu stabilirea Jingerprin-urilor diferitelor oligonucl'eotide,'analiza spectrofotometric n ultraviolet Ei analiza ,,de vecintates prin care se poate stabili p'ozllia radicalilor fosforici s-a putut deterrnina ordinea nucleotidelor n diferitele triplete. n studiul codificrii bi'ochimice a fost apliaat Ei metoda ARN fixali pe ribozomi sub inidentificrii aminoacizilor fluenla unui codon cunoscut. Aceast metod ca Ei cel,elalte prin care s-a descifrat codul genetic s-au bazat pe constatarea c ionii Mg++ n ooncentrelie mare mpiedic disocierea ribozomilor 70 S n subunittile sale Ei permit acestora s inilieze traducerea fr oodonul inifiator AUG. Astfel, n 1964, Nirenberg a sintetizat trinucleotide cu secven{e de baze cunoscute, acesfea au fost asociate cu ribozomii Ei s-a urmrit care dintre ARN' se leag l,a un rastoa complex. De exemplu, trinucleotidul 5' GCC 3' legat la rirbozom a determinat ataqarea la oompiexu. format doar a ARNf pentru alanin dintr-un amestee de diferill ARNf. Tot astfel, 5' GUU 3' aclionnd ca A-RNrn, determin Legarea la ribozomi doar a ARN pentru valin. Pe aceast cale s-a putut stabili direct semnificafia de codificare a fiecrui codon. Astfel, s-a rezolvat semnifica{ia d'e codificare a trei izomeri UzG: UUG-leucin; UGU-cisten; GUU valin. Folosind aceast cal,e s-a reuEit descifrarea n totalitate a codului genetic. Crick a sugerat aranjarea codonilor ntr-r-rn tabe'l c,ane s reprezinte grafic oodul genetic. Semnificatia acestui

pe cnd poli C-G determin ncorporarea ntr-o caten poh-

t2l

tofansintetaza de E. coli, q proeina \lAdT. Mutafiile de su'bstitufie afecteaz de regul o singur nucleotid din catena polinucleotidic. O mutafie de substitulie care apane cu mane frecvenf la hemoglobfura uman duce la nlocuirea valinei cu izoleucina. Cum valina este codifica't de GUU ian izoleucina de 1 A 2U s-ra, tras eonehrzi,a e ,ordinea nucleotidelor m tripleta izoleucine este AUU, codonul va}inei devenind prin sutbstitufia G cu A codonul izoleucinei. Printr-o anafiz de acest fel s-au putut d,ovedi experimental raporturile de oodifi@ne gi s-a descifrat oodul genetic (fig. 39). Cea mai ,neambigua validare a codultui ggnetic stalbilit prin experienfe
q
J 3)

tabel pentru Biologie este cpmparabil cu ,8c a tarbelului periodic al elementelor pentru Chimie. Au fost studiatc de asemenea mutafiile car determin substitufia unor aminoacizi dn mol.ecula unor proteiure birrecunoscute ca sesvenf de alninoaciz cum snt hemoglobina, trip-

J O

, c
a

c.od.onii lor$rerur, eare

GIr-NII' - glutarnlna; Gly : glicina ; Mct : metionina; Phe : fenilalanina; Pro : prollne i Scr : serna; Tht : treonina; Tr! : triptofan; Tyr : ttrozite; Yol : ynlilg. Codonii ocr*, amber V ofal desemnafi cu un cec regru dnt
nu specific nici un ntninoacid, teprezentnd. codoni terrnii{

Fig. 39. Reptezentarea codului genetic ARNza. Codonii se formeazl ponrind din centnr spte periferie. La periferia cercului snt dispugi sminsa,gizi codlficafl de eodonii corespunztorl. Ala : alanina; Ary : argininl; AsP : acid aspartlc; lsy'-Nlfr : ssParagina; Cys : cisteina; Gkt : aciil glutanric;

natori ai catenei polipeptidice. Codonii desemnafi cu us, triuaghi snt codon' tniliatori ai catcnei (AG gi GUG). Cu un ptrat sint dese'.'nali alinoacizii codificali de codoni tltferiti care se deosebesc dup prima baz.

t22

donii care specific dilerifi aminoacizi d.intr-un fragmenl at proteinei interne & capsldei. Secvenfa d.e nucleottle din ARNllerRlT ca gi cea de a,minqsqizi 6in proteina capsidei au fost ns total stabi[te, lenacindu-se colinearitatea nucleotlde-arnheagizi 9i n acelagi timp veridicitatea codonilorflstabilifi prin experiente inclirecte (dup Goodenough & Levine, 1974).

Fig. 40. Un fragmsn! rlin ARNz de R17'cu co-

,"u

Ir cr, i A
meljU

/u' <U _

i\ tn. 'c\
)

Al
g
A.

Lu rir [c In !U [c serl C Lr, iU rgiG iC

[L ;sn i A In |-A tr,'ulU

li-, - LT

'.C

u l.r. tJ J Ci
A.rlo'.

lire
iren
lara

_l

i.J_j

i-:-J

G-l

c it'e GJ. Al .A lasn cl

C
c

Ul AI

lillo ''" Lu
in uitro a fost r,ealizat prin
teza proeinei capsidei.

.-, f-G

Ul

cr

|te,"

compararea secvenfei de ,aminoacizi din pnoteina capsidei fagului R17 cu secventa de nucleotide a ARNnz de .R17 n r,egiunea moleculei care dicteaz sinSeevenfa teoretic, stabilit prin experiente in uitro s-a consatat a eorespunde exact cu secventa de amirroacizi din pr'oeina capsidei (fig. 40.)

3. CARACTERISTICILE CODULUI GENETIC

Snt posibili 64 de codoni sau triplee potrivit relaliei Dintnc aoestia doi snt eodonii de inifiere gi anume AUG $i GUG, care mareheaz ncepuhrl uoii caterte polipeptidice. Ei deterrnin initienea oatenei polipeptidice prin fureorporarea formilmetioninei la E. coli qi metionfurei la eucarioe. Alti trei codoni nu oodific nici un aminoacid (snt oodoni
43

:64.

t23

nonsens), ei indicnd ns sfrgitul unei catene polipeptidice (codor sfop). Acegtia snt codonii ocru- UIAJ{, arnbrd: IIAG qi azw: UGA. Codonul UGA separ genele n cadrul unui mesaj genetic policistronic. Codul genetie are cinci canaceristici esenfiale: este universal, neacoperit, fr virgule, degenerat gi ambiguu. Caracterul de uniuersalitate al codului genetic ne arat c r:n anumit codon codific un acelagi amimoacid. la orice organism, indiferent de treapta evolutiv pe care se afl, de la virusuri p,n la om. Prin mutafle codul genetic il'tu se sehimb; este schimbat informalia ereditar, iar n traducerea acesteia ntr-o protein mutant funclioneaz acelagi cod care functjoneaz Ei n traducerea informaliei er'editare normale de la tipui normal (s,l'batic). Universalitaea codului geuretic a fost demonstrat experimental n cazul sintezei proteinice desfgurarte n sisteme ,acelulare provenite de la ,bacterii qi mamifere sub influenla unui aeeluiagi ARN,nz sintetizat ,artificial, cnd se oblin aceieaEi proteine, indiferent dac sistemul aoelular este provenit de la bacterie sau de la mamifer. Hemoglobina de iepur,e a putut fi sintetizat artificial folosindu-se ribozomii qi ARNnz din reticulocie de iepure gi ARN de E. coli. Experienfele de inginerie genetic (prin care gene de la m,amifer pentru insulin, pentru hennoglobirl, pemtru hormonul de cre$tere, pentru o?Lgiotensittd, II precum qi g,ene ritbozomale sau pentru histon de la arici de mane qi drosofil au fost introduse n celula rbacteriarr E. coli) au artat c poate fi dirijat sinteza de produqi ge,nici specif,ici eucariotelor, folosindu-se aparatul tbarcterian de traducere ribozomul. Este dovad,a clar a universalitlii codului genetic. Dar, pro'ba,bil cea mai evident dsmourstrare a universalitii oodului gernetic a fost realizat de J. Gurdon, care a puri,ficat ARNnz pentru hemoglo,bin din reticulocite de iepure gi I-a injectat n ovocite de b,roasc unde aparatul de sin0ez proteirnic, de traducere a mesajului gen,etic al broaEtei sintetizeaz he,mogl,obin stabil de iepure, chiar dac celulele ovocitare nu simtetizeaz niciodat hemoglobin. Mesajul genetic al oricrui sistem biologic poate fi tradus de maginria de traducre a .oricrui alt sis'trem rbiologic. Codul genetic este deci universal. Neacoperirea cod,onitor. Codonii succsivi, vecini, n oare se organrz,eaz,,o secventa de nuoleotide a ,unei gene ce specific o protein da,t nu se aooper, nu-qi mprumut nucleotide, nu au nici o nucleotid comun. Ei reprezint unitti de codi-

t24

ca aceqtia s se suprapun. Dou caracteristici ale codonului genetic snt foarte importante n traducerea mesajului genetic. Este vorba de degenerarea qi arnbiguitatea codului genetic. Carocterul de degenerare a codului genetic ne arat c in unele cazuri un acel,aqi aminoacid este specificat de mai mulfi codoni. Astfel, feniltala,nina este specificat de UUU dar gi d'e UUC. Serina este specific'at de 6 oodoni: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC. Tot astfel leucina este codificat de 6 codoni: UUA, UUG, CUA, CUC, CUU, CUG. Dar codonii n care predominant este guanin,a (ce determin aparilia de structuri secundare) snt de regul ineficienli n biosinteza proteinic. Diferi{ii codoni care au ns primele dou nucl.eotide identice pot specifica acelagi aminoacid. $i aminoacidul arginin este codificat de 6 triplete. Numai metionina gi triptofanul snt codificali de cte un singur codon (AUG respectiv UGG). Ambiguitstea codului genctic este redus. Ambiguitatea nseamn recunoaqterea de ctre antioodonul dintr-un ARN a mai multor codoni din ARNm Ei deci posibilitatea ca un codon s specifice mai mulli aminoacizi. Astfel codonul AUG este recunocut att de ctr,e antictdonul' lui rtFtNmer (cnd este n interionrl mesajului cadrului de citire) ct Ei anticodonul lui ARNrme' (cnd este I.a nceputul oadrului de citire). Tot la fel, codonul GUG poate specifica att formilmetionina cnd este la nceputul cadrului de citire ct gi valina cnd este n interiorul mesajului. Amin,oacizii cu proprietfi structurale similare au tendinfa de a avea codoni nrudifi. AEa se face c acidul aspartic q acidul glutamic prezint codoni similari GAU gi GAC n primul caz, respectiv GAA Ei GAG n al doilea caz. Tot astfel aminoacizii aromatici fenilalanina, tirozina qi triptofanul snt codificali de triplete care ncep cu U. Se admite c aceast proprietate de oodificare a fost stabilit n decursul evolufiei, ea prezentnd avantaje errolutive cci nlocuirea prin mutalie a unui aminoacid cu altul n catena polipeptidic este cu att mai pufin duntoare cu ct aminoacizii nlocuifi au proprietli
725

rcar'e de sine stttoare, nesuprapuse. De asemenea, ntre sfrEitul unui codon Ei nceputul codonului urmtor nu exist spalii sau nucleotide. Codui genetic este agadar fr virgue, lipsind semnalele speciale care s marcheze sfrgitul unui codon qi nceputul codonului urmtor. La fagul cp X 174 gene diferite, adiacente ns gi mprumut nucleotide sau codoni fr ns

5'

Acfl
ARNrn
( codoni)

Anticcdoni drn
AFr\{i

Fig. 41. Decodificarea informaliei ered.itare

ritatea qi antipolaritatea tripletelor rtin ADN, codonilor din

ARNza.gi a anticodonilor din ARN).

(complementa-

mai asemntoare, ceea ce face ca proteina mutant s poat

Crick a elarborat ipoteza oscildrii (utobbte) spre a explica ambiguitatea. Astfel, U aflat n pozifia a 3-a n tripleta anticodonului, la captul 5' al acestuia se poate mperechea att cu A ct qi cu G. Astfel, primel,e dou nucleotide snt cele rnai semnificative $i mai exacte n codircare, pe cnd cea de-a treia baz a codonului este oscilant. Flexibilitatea celei de-a treia baze a unui codon a prezentat de asemenea avantaje selective minimaliznd consecinfele erorilor. n cadrul interacfiunii codon-an'ticodon (fig. 4l) interaclioneaz mai nti nucleotid,a captul,ui 5' al codonului cu nucleotida captului 3' al anticodonulrui. n al doilea rnd interaclioneaz nucleotidele plasate la mijlocul codo'nului qi anticodonului. Dup Criok, se admite c, odat mperecheate primele d'ou baze, cea de-a treia baz, din codon Ei anticodon prezint o oarecare oscilalie n mperechere. Astfe1 baza purinic inoszrzo (I) car prezint proprietli strueturale asemntoane guaninei se afl n unii anticodoni qi se poate mperechea n mod normal cu citozfura (C) din codonul ARNrn. Cnd ns I ocup pozilia a treia in anticodon ea se poate mperechea cu U sau cu A aflate n pozifia a treia n codonul ARNrn. Asemenea mperecheri de baze se numesc perechi de boze oscil.onte (wobbl,e). O moiecul de ARN ce ar ataEat serina qi avnd anticodonul
L26

fi nc funclional.

ARNm pentru serin UCC, UCU, qi UCA. Tot astfel U plasat n pozifia a treia n anticodon se poate mperechea att cu A ct gi cu G plasali n pozilia a treia n eodonul ARNrz. Regulile,,wobbler pentru mperecherea codon-anticodon atest existenfa a numai 54 anicodoni care s se mperechgze cu 61 codoni deoarece baza A nu se afl miciodat n prima pozitie a anticodonilor. Absenfa lui A din prima pozifie a tutur,or an,ticodonilor cunoscufi se crede c este rezul,tatul acfiunii dezsrninazei anticodonale care schimb adenina la hipoxan'tin, antiaodonii care ncep cu inozina (I) fiind caracteristici aminoacizilor care snt codificafi de mai mult de doi codoni aqa cum este valina (Jukes, 1977). Absenla unui antioodon IAA penru femilalanin se explic prin elminarea sa din cauza letaiitlii cci s-ar putea ,,mperechea greqit( cu UUA (teucin) qi cu atfi oodoni ce specific cu totul,a$i aminoacizi. Jukes apreciaz c mai curnd dezaminarea anticodonukri gi nu ,,oscilarea( explic de ce nu se ntlnesc 61 tipuri de ARN. Unii anticodoni din moleculele ARN confin baze modificate n pozifia I, altele dect hipoxantina. Asemenea modificri mrese oscilarea codon-anticodon fr insa a genera ambiguitate n urcorporarea amilroacizilor n timpul sin'tezei polipeptidice. Eaolugia cod,ului. Universalitatea codul'tri genetic la organismele acttrale este un indiciu pe de o parte a vechimii sale, iar pe de alta c e} a rmas, neschimbat n cursul evolugiei. S-au emis dou ipoteze cane ar explica aceste aspecte: ipoteza ster*shimic gi ipoteza accidentul,ui nghefat. Ipoteza stereoelti.micd admite existenfa unei relafli sterice dintre codon, respeetiv anticodon qi arninoacidul specificat. Stebilitatea evolutiv a codului ca gi struetura sa au derivat din stereochimia preordonat a elementelor sae. Ipotem accidenhui nghefat admite c structura codului genetic a evoluat prin hazard dar, din momentul n care n celula ancestral comun ,tuturor formelor prezente actuale au fost stabilite relaliile exacte de codificar,e, acestea au devenit vitale, nct o evolufi.e ulterioar a codului a devenit imposibil. Orice mutalie n relafiile de codificare a devenit letat pentru individul biologic l,a care acasta a apnrt. Prima ipotez nu es'te probat de experienlele n care alanina ataqa,t la ARN pentru cistein a fost inclus n catena pol,ipeptidic n locul cistein,ei. Aceasta arat c aminoaeidul nu este ,,vnat( de codonul din ARNrn n etapa de asamblare a polipeptidutui. Snt date care ara c aminacidul'nu este re721

3'-AGf-5' va interacgiona cu codourii

nainte chiar de apari\a aminmcil-ARNt sinbetazelor, ca,re au nalt specificitate ca Ei nainte de aparifia nsgi a adaptorului ARN. Sinteza proteinic 1a nceput, dup Crick qi Woese a fost un pnoces imprecis, desfgurat cu un grad sc2t de speeificitate funclional, n proteinele protoorganismelor putnd intra oricare dintre amin,oacizii unui gnrp care sirr-t similari structural. De exemplu, unul qi aoelaEi codon ar fi putut specifica alanina qi glicina, ,al'tul treonina qi serina. n oodonii tripleli ambigui primitivi numai primele dou nucleotide participa n realitate n procesui, de recunoaqtere. Ulterior, cea de a tneia urueleotid a fost inclus n procesul de recunoajqtere deqi la un nivel mai sczut de specificitate dect cea admis prin ipoteza

lui. Este ns foarte prdbabil ca asemenea nelafii stereochimice s fi fost de mare importanf n etapa timpurie ,a istoriei vielii

cunoscut de ctre anticodon n etapa de activare a amrnoacidu-

oscilrii. Ipoteza accidentului nghefat este pe de o parte dificil de respins Ei pe de alt parte gr,eu de sprijinit cu date actuale.

4. BTOSINTEZA PROTEINICA.
Proteinele joac un rol cheie n meta,bolismul ceiular. nsqi func{ia materialul,ui ereditar este condifionat de funcfionarea proteinelor cu rol enzim'atic sau structural. Enrzimele particip la replicarqea ADN gi ARN, la transcrierea genetica etc. Proteinele structurale intr n structura cromatinei, n componenla membranelor, a altor componente oelulare qi particip la asamblarea nsgi a ribozomilor. Toate r,eacliile chimice din celul sn cartalizate de regul cle ,enzime. Enzimele proteine tipice particip n nsqi sinteza proteinic. Ast- cteva sute de molecule de diferite proteine snt necesare fel, pentru sinteza unui sin,gur lan! polipeptidic. Este o rennoit povar pentru celul s sintetizeze o caten polipeptidic, dar ea este cerut de o traducere exact a mesajului genetic. Proteinele snt polimeri de aminoacizi. Toli aminoacizii, cu exceplia prolinei, au o structur de bazi comun, prezentnd un radical R, o grupare COOH Ei o grupare NHz. Prolina are doar gruparea COOH Ei un atom de N inclus in radical. Unii arninoacizi snt b,azici (iizina, arginina qi histidina). Lizina poart un rest NHz n cadrul radicalului.
L2B

Acest rest are tendinfa de a accepta protoni devenind Alfi aminoacizi snt acizi purtnd la nivelul radiea'lului-NHt. resturi COOH care au tendinla de a pierde protoni. Exist Ei amin,oacizi aromatici care prezint inele nesaturate de carbon n radicaiii lor. Doi aminoacizi poart un atom de sulf n radical (cisteina, metionin,a). Legarea aminoacizil'or ntre ei (polimerizarea) se face n urma inter,acliunii grupu,lui a-NH2 al, unui a,tninoiacid cu grupui a-COOH al celui de-al doilea aminoacid cu elirberarea unei

OH ilt molecule d,e ap. Se formeaz, o legtur peptidic A-C-N-.

Prin polimerizarea aminoacizil'or rezult o ca,ten polipeptidic

care are un schelet de N qi C sub form de zig-zag analog scheletului glucido-fosforic al catenei polinucleotidice cu radicalii R

proiectafi n afar ntr-o manier alternativa. Distribuirea liniar a aminoacizilor n caena polipeptidic reprezint stu:uotura primar a potrifptdei oonsiderat. fn a,numite condilii fiziologice, de temperatur sau de pH ,Er ioc interacfiunea diferililor aminoacizi din catena polipepticlic prin intermediul unor punti de H, al, unor leghrri bisulfidice (S-S) clucnd la configuralii spafiale bi- sau tridirnensi,onaie. Prin puni de hidrogen dintre aminoacizi vecini rezult o structur secundar regulat numit aonfigura{ia u-helix, ai crei modei a fost elaiborat pentru prima dat de ctre 1,. Pau-. Iing nainte de 1940. Proteinele pot fi alctuite dintr-o singur caten polipepticlic (mioglo,bina, histonetre, ADN-polimeraza etc.) sau din 2, 3 sau n catene polipeptidice n care caz ele prezint o str"nctur cuaternar. Astfel, hemoglobina ,este alctuit din patru catene polipeptidice separate numite globine, dou catene c Ei dou cate'ne B, rasociate ntr-un mod complex. ARN polimeraza de E. coli este o protein oligomeric alctuit din 6 subunitli polipeplidice.
4.1. DESFASURATiEA

pnocnsur,ur DE Brosrnrnz

I'ROTEINICA

Ribozomii joac un rol esen!al n ibiosin't'ez.a proieinic, adic n decodificarea informafiei genetice. Ei condili'oneaz interacfiunea speciflc, codon-onticodun, fapt evidenliat prin eln$ - Dr:;cifrind tainele ereditatii, vol. I 129

perient n care s-a urmrit ac{iunea streptomicinei. S-a constatat c acest antibiotic poate altera procesul de decoriilicare a ARNnr. Streptomicina reduce de trei ori rata de ncolpcrare a fenilalaninei n polifeni'alanin cnd se folosegte un sistem acelular de sintez proteinic n care n calitate cle AIirTr:i. est'e utilizat poli-U. Reducerea ratei de ncorporare rr fenilai.aninei este ns nso{it de ncorporarea leucinei (CLTTJ), izoleucinei (AUU), tirozin,ei (UAU) qi serinei (UCU). Con:luzia e.ste c prezenfa streptomicinei permite altor tipuri de ARN, altele dect ARN legitim pentru fenilalanin sr rspund Ia codonii tlUU n traducrea ARNm poli-U. Citirea greqit a codului genetic este determinat de interacliunea streptomicinei cu ribozomii din am,esecul d.e re,ac{ie a sistemului acelular de sintez proteinic. Situl de acliune al streptomicinei este subunitatea ribozomal 30 S, fapt dovedit de experiente de asamblare a particulelor ri'bozomale din subuniti 30 S de la tipul mutant re zistent la streptomicin gi subr.rrnitti 50 S de Ia tipul nornnal sensirbil. Asemenea ribozomi sub acfiunea streptomicinei nu condifioneaz o citire greqit a mesagerului genetic. Nomura a efectuat experienfe de disociere a subunittilor 30 S extrase de Ia bacterii rezistente qi de la ,bacerii sensi'bile la streptomiein^ qi a separat proteinele ribozomale din aceast subunitate (21 proteine ribozomale S) prin eL,ectroforez,. Dupa 6ceea a reconstituit suibunitati rirbozomale 30 S prin amestecarea de variate combinafii ale celor 2L de proteine ribozomale S cu molecule de ARNr 16 S. Subunit{ile 30 S reconsti,tuite au fost amestecate cu subuniti 50 S gi au rezultat ribozomi care au fost folosifi n sisteme acelulare de sintez proteinic. Nomura a constatat c sensibilitaea sau rezistenla ribozomilor reconstituili la citirea greqit indusa de streptomicin a mesajului genetic confinut de ARNnz depinde n ntrqgime de faptul dac o singur protein ribozomal S, qi anume proteina ribozomal S12, deriv de Ia subunitti 30 S a'le rbacteriilor streptomicinosensi'bile sau streptomicino nezistente. La formele sensi,bile ia streptomicin, acest antitbiotic se combin cu dou situri din ARNr 16 S blocnd sinteza proteinic. Tulpinele rbacteriea-re rezistente la streptomicin au proteina Srz modificat, ceea ce face s fie ascunse cele dou situri de legare a streptomicinei. Dovada, suplimentar c proteina ribozomal S12 particip n procesul de recunoaqtere codon-anticodon a fost adus de constatarea c unii supresor nonsens care snt eficienfi ]a tipul slbatic, normal streptomicino-sensitbil snt ineficien{i la mutan$ii streptomicino-rezistenfi. Secven]ier'ea aminoacizilor pro130

teinei ri'bozomale Srz a evidenliat faptul c la tiput str,eptomicino-rezistent apar substtufii de a,minoacizi n pozifiile 42 sau 87. Iat deci c o simpla substitutrie de aminoacizi n oatena polipeptidic Srz interfer cu fidelitatea cu car oodonii ARNm snt mperecheafi cu anticodonii ARN n procesul deoodificrii mesajului genetic. Desfqurarea procesului de biosintez proeinic presupune inifierea, alungirea qi terminarea catenei ca qi n cazul sintezei polinucleotidelor
4.I.I. INITIEREA CATENEI POLIPEPTIDICE
arnin,oacid N-terminal qi terminrd cu un aminoacid C-terminal. ARNrr, care poartA mesa{ul peurtru sinteza unei catene po-

Catena polipeptidic ,este sintetizat treptat noepnd cu un

lipeptidice qi care deci dicteaza secventa de aminoacin a acesteia este citit stadial de ctre aparatul de sinez protefuric, cte un codon la fiecare moment, ncep:rd de la cap,tul 5' spre captul 3', fiecare oodon fiind rcunoscu,t de catre antioodonul cor,espunztot din ARN, aoesta din urm purtnd un aminoacid corespunzlot codonului dfut ARNm. Zamecnik gi Hoaglancl au ajuns la concluzia c prima etap n biosin,tez,a proteinic este activarea aminoacizilor cu ATP catalizat de ctre enzime orninoaeilsinetnze specifiee fiecrui aminoacid. Ac,este enzime au fost descoperite de ctre Paul Berg de l,a Standford University. Ele se mai numesc amino-orcil-ARN-sizefuze qi reprezint factorii celulari care ,,cunoscc eodul genetic, deqi nsgi secvenla lor Ce aminoacizi este codificat n ADN. Aminoacizii nu se ataqeaz direct la matrilee ARNmciprin interrnediul ARN care repr,ezint o moleanld adaptmre de racordare specific, recunoaqterea oodon-anicodon avnd loc pe principiul mperecherii de baze complementare cu f,ormare de punli temporar,e de hidrogen. AtaEarea aminoacidului la adaptor ,este catalizat de enzima amirwacilsintetozd care foloseEte e'nergia rezultat prin hidroliza ATP. Enzima se ataEeaz tra gruparea lateral a aminoacidului (fiecare aminoacid are enzima sa specific de activare) Ei Ia molecula adaptorului (bucla a patra a dihidrouracilului). Aminoacidul, (AA) se combin la nceput cu ATP. nre fosfatul din AMP qi grupul carbonil al aminoacidului se realizeaz. o legtur (-P-O-C-) sta,bil, rezultnd produsul intermediar AA "., AMP. Acesta se leag ferm de enzima activatoare pn ee se ntlneEte cu o molecul
131

de ARN specific, corespunztoare amirroacidului re-cpectiv. ntre riboza adenozinei terminale a gruparii CCA de la captu 3' a,l ARN gi gruparea canboxilic a aminoacidului se stabilete
o legtur sub cataliza aceleiaqi enzime aminoacilsintetaza Energia pus 1a dispozilia -acestei legturi de ctre ATP va fi folosit n formarea legturii pepti-

covaltent, macr@rglc.

dice.

Evenimentele de activare a aminoacidului pot

prezentate:

fi

astfel re-

r
II

AAl +ATP
(AA,

aminoacilsintetaza

(AA,

- AIIP)Er*@-@.
AAr

- AMP)+ARlrll

aminoacilsintetaza

- ARNtr+

AMP.

fenilalanin) intervine ARN sintetazn pentru fenilalanin care face ca prin hidroliz prolina sa fie eliminat. Amnoacil-ARNt sintetrc,a este la rndul su recunoseut (sau recunoagte) bucla dihidrouracil a ARN, care este diferit la diferitele tipuri de ARNf de unde qi explica{ia specificitfii arninmxil-ARNf-sintetozd-ARN.

Legatura AA ARN de tip (-C-O-C-) se stabileqte ntre riboza acidului aderrilic terminal aI, gruprii CCA-3' gi grupul carbonil al aminoacidului. Iat de ce aminoacidul nu trebuie s ajung niciodat pe matrifa ARNm. El trelbuie numai s se ataqeze corect la un ARN corespunztor l,ui. Dac are loc ata$area gregit a unui aminoacid la un ARN care nu i este specific (de exemplu prolina se atageaz la ARNf peurtru

Degi exista mai multe tipuri de ARN pentru un acelaEi aminoacid, din cte se cunoaqte plr acum exista doar o singur aminoa,cit-ARN sintetvzd pentru fiecare aminoacid. Aminoacilarea ARN catalzat de aceste enzime trebuie s fie controlat cu extraordinara precizie cci o ncrcar',e gre$it a unui ARN eu un aminoacid necorespunzator lui are aceeaqi valoare ca mutafia, fiind inserat tn catena polipeptidic ln creqtere un aminoacid gregit (Sdrimmel, 1979). A devenit astfel clar c ARN este implicat n reglarea expresiei genice cci concentrafia de aminoacil-ARN serveqte ca semnal, pentru intrarea sau scoaterea din funcliune a diferitelor gene, intervenind n tnanscrierea genic la un sit dintre promotor gi prima gen siructural (vezi reglajul genetic). Deoarece sinte732

taeele eatalzeaz aminoacilarea ARNf ele snt direct sau indirect irnplicate n reglarea expresiei anumitor gene. Ataqarea unui aminoacid la ARNf specific este evenimentul n cursul cruia informalia din acidul nucleic este confruntat cu aminoacidui pentru prima dat. Froblema recunoaqterii aminoacid-ARN este nc departe de a fi clarifcat. Ea este ns extrem de precis cle vreme ce schimbarea numai a unei baze azotate din secvenla ARN afectcaz proprietlile de recunoagtere ale acestuia. Bucla GTI'CG a ARN se mperecheaz prin baze cu o -secvent complementar din ARNr 5 S qi aceasta pare a fi regiunea responsabil pentru ataEarea la ribozom a ARN ncrcert cu aminoacidul activat. Lungimea constant de I'a captul 3' al ARN la bucla opus a frunzei de trifoi se presu-CCA fi n legtur cu pozi$ionarea corect a aminoacizilor n pune a vederea formrii punlilor peptidice. A treia etapd n inilierea sintezei pr.oteinice se desfEoar pe ribozom. Acesta are suprafefe specifice de legare stereoctrimic corespunztoare a ARNm, a AA-ARNf gi a lanfului polipeptidic n creqtere. Rirbozomul asigur de a$a mani,er asocierea acestor elemente astfel nct anticodonul s poat recunoagte codonul corespunztor ducnd astfel la o corect descifrqre a mesa$ului genetic. Nu se Etie exact care din componentele ribozomale (proteine ribozomaie sau ARNr) ndeplineqte rolul esenfia'l n nlesnirea apoziliei corecte a ARNnz gi a ARN, dar recent s-a stabilit c proteina ri,bozomal contractil 51 are capacitatea de a determina deplierea ARNn in vederea interacfiunii sale cu rirbozomii, legnd apoi ARNnr la subunitatea 30 S (Blumenthal Ei Carmichtetr, 1979). Ea se leag ln ribozom la captul 3' al ARNr 16 S, dar n ribozomi activi ea se afl la un sit diferit. Avnd o greutate molecular mic (70.000 daltoni) se admite c proteina 51 func{ioneaz, n conformalie alungit. Descifrarea mesajuiui genetic determin traducerea sa ntr-o secven! de aminoacizi asambla{i ntr-o cat,en pol,ipeptidic. naine de a ncepe sinteza polipeptidului riibozomul se disociaz n subunitlile sale sub aefiunea factorului de inifi,ere fF.1. ln cadrul formrii complexului'de ini{iere ARNrn se leag de subunitatea ribozomal 30 S prin secvenfa sa Leader care nu este tradus. Apoi are loc asamblarea particulei ribozornale funclionale prin atagarea subunitlii ribozomale mari 50 S. Aminoacil-ARN se asociaz cu subunitat,ea 50 S a ribozomului. Subunitatea 50 S are dou situri: unul a fost desemnat
133

situl amirwacil (A) qi n el ptrunde aminoacil-ARNf corespunztor codonului din ARNm recunoscut, prin anticodonul din ARN qi al doilea sit a fost des,emnat situl peptidil (P) aare accept moleculele de ARN numai dac au trecut prin situl aminoacil, (complexul aminoacil-ARN trecut prin situl' A sufer probabil modificri conformalionale care permit acceptarea sa in situl P). Ini{i'er,e,a propriu-zis a catenef lpolipeptidice are loc atunci cnd situl A aL unui ribozom expune reacliei de recunoagtere codon-anticodon acel codon de inifiere AUG din ARNrn. Acest codon de iniliere corespunde primului .aminoacid din catena polipeptidic. Sitlrl A este ocupat n iniliere de un ARNt pen,tru formilmetionin la pr.ocari,ote sau metionin 1,r ucariote, care prirn anitioodonui su 3' UAC 5' recunoaqte codonul iniliator 5' AUG 3' din ARNrzr.. Acest ARNI are ataEat aminoacidul formilmetionin respectiv metionin. Dup recunoasterea codon-anticodon, ARN care are ataqat primul aminoaci.d al catenei potipeptidice se deplaseaz n sittll P, miEcare realizat prin naintarea ARNrn prin ri,bozom sau in.rer:., prin naintarba ri,bozomului pe ARNm (miqoare de transla!ie), ceea ce face ca situl aminoacil, s vin n dreptul urmtorului codon din ARNrn. Se nlelege c miEcarea de translafie se face de fiecare dat pe o distan! ce corespunde la un codon. Toate catenele polipeptidice noep cu aminoacidul metionin. La procariote toate catenele polipeptidice incep cu N-formilmetionins, car este astfei un aminoacid ,blocat de grupul formit. Dup sinteza pofipeptidei, grupare,a forrmil poa'te fi eliminat. Metionina .este specifica,t de codonul 5'-AUG-3' din ARNzzz, recunoscut de anticodonuL din ARNt'er si acest {ftxr1met este un ARNf de inilier,e. Principiui citirii codonului de ctre anticodon est'e urmtorul: dac un codon din ARNrn este 5'-UUG-3' el va fi recunoscut de ctre un, anticodon din ARN scris n dir,ec{ira invers adic

3'-AAC_.5'. Att metionina ct qi formilmetionina au ca anticodon 5'CAU-3'care se va mperechea cu codonul 5'-AUG-3'qi

acest oodon AUG reprezint codon de ini{iere. Deqi codonul AUG poate fi localizat Ei n interiorul monocatenei ARNm, ARNf de iniliere (iARNt'"') are afinitate rr-umai pentru codonul AUG localizat la captul monocatenei ARNm, sau acest codon de inifiere este clispus pe un segment din ARNTa a). o structur secundar proeminent de tip bucl (lwirpin)" n cadrul inilierii (fig. 42) evenimentele se deruleaz. astfel: o subunitate ribozomai mic imteraclioneaz cu un codon ds
134

lormoro complcrufui
cle

inilicrt

ilctori

ARNtr-md) '

dc inittfe ARNm

ologoco subunitti

ARN'm't ; situt pcptidil nsotit or

deplosorro r'r5oromutui AFNm

tronslocotio

J sit omhoocil

corc vinen iitut

t go?co ARNi'u
dcchngotic)

# l\

(blori

o
Fig. a2. Schema sintezei proteinice. Decodificarea mesajului genetic ncepe eu ctirea codoaului de iniliere.{.UG de cAhe ARNf'-tt Si se termin cu codonul de terminare UAA. Codonul AUG n mod obignuit nu este plasat exact la capAtul 5' al ARNmr ci el este precedat de un rrurrAr de alte nucleotide, dar el ocup o pozilie specifica pe cateua ARNzr putnd fi recunoscut. Tot astfel codonul tenniuator UAA nu este u mod obligatoru ultimul codon din macromolecula AR.Nza. TJneori aceeagi molecul ARNz posed mai mulli codoni de iniliere gi
codoni terminatori condifionnd sinteza mai multot catene polipeptidice.

cazul

135

--.--_.--.-----. ce conline pcptido

tq sttui
P

tronscriereo ARNte

r laoreo fiotaculc; aRnrtFt"

continuorco etop?lo grecedentc pcntru f iccore codon ARNm Pn cc tsta otins codonul tcrmrnoor (UAA, UAG, UGA)

"firl

A*

tlr

@,iu f.met
dlsoctcr?o rbolomutra

etiberoiso
coteF'r oolixDddrce

5ffi f"
I
.>

It tb" t.incr

\
,

tCu

o
AR{rz
nare,

t lr|cl

care specific prote'ruele triptofansintetazei la E. coli, codonul de termlpeglnl gena trp B cstc pattial folosit drept codon de inifiere pentru gena trp A (UGAUG). Transferarea aminoacil-ARN, din situl A n situl P este nsofltl de s schimbarea conformatiei spafiale a moleculei sale (dup Strickberger, lg70).

ini{iere AUG qi cu un iARNt*et, cae poart deci metionina. Se formeaz u,n complex metioni,I-t-ARNfo AtlG numit compler, de ini[iere: Formar,ea oompJexului de initiere implic intervenfra a trei factori proteinici de inifi,ere care au fost desemnafi IFL, IF2 gi 1F3. Rolul exact al acestor fac"tori nu este cunoscut. IF3 mpiedic asocierea subu,nitfior ribozomale 30 S qi 50 S, cnd ribozomul nu este angajat n sinteza proteinic. Bner,gia ne136

csar n inifiere este eliberat prin hidroliza u,nei molecule de GTP car,e este qi ea considera,t facor de ini{iere aunci cnd se leag la fmet-ARN fr a fi hidrolizat. Complexul de inifiere se asociaz apoi cu o subunitate ri,bozomal mare (reac{ie care necesit potasiu), rezultnd ribozomul funcgional (70 S la procariote qi B0 S la eucarioe). Din asocierea ARNr-ARNrn se delimiteaz n subunitatea mare a ribozomului dou situri ominoacil (A) Ei peptidil (P). n momentul asam;blrii particuiei ribozomale funcfionale ARNm este relinut ntr-o adncitur rezultat din pozilia ceLor dou subunitli rirbozomale. ARNm expune n situl A codonul iniliator AUG oare va permite ptrr:rrderea n aeest sit a ARN inifiator JMet ARNtt^"t. IFz aclioneaz apoi ca translocozd. care ca'talizeaz translocafia fmet O**1tmet Ei regiunea corespunztoare codonului AUG din ARNnz din situl A n situl P. Reacfia necesit energie eliberat din hidr'oliza GTP. Translocarea elibereaz situl A care va pUtea agcp1s alt AA ARN corespunztor noului codon din ARNrn. Astfel, ARN funclioneaz nu numai ca un crug de aminoacizi la ribozomi dar Ei ca mol'ecul adapoare care secvenliaz aminoaeizii n catena polipeptidic potrivit instmcfiunilor date de ARNnz.
4.7.2. ALU N GINEA CATEN

EI POLIPEPTIDICE

De ndat ce a avut loc ini{ierea ca,enei polipeptidice prin alinierea codonului iniliator AUG cu antioodonul metionil iARNn''"' gi formarea unei particule rib,ozomale complete, activ n sinteza proeinic, situi P al ribozomului este ocupat de iARNmeriar situl A este liber s primeasc al doilea aminoacil ARN corspunzbor celui de-al d,oilea codon din ARNm. Palticula ribozomal se deplaseaz pe monocatena ARNm, care gi expune astfel succesiv codonii spre a fi r'ecunoscu{i de anticodonul diferi{ilor ARN. Legarea aminoacit-ARNf la situl A este catalzat de un factor proteinic ? care foloseqte de asemenea energia eliberat de GTP. La nivelul sitului P, grupul, a-COOH prseqe legtura cu ARN qi formeaz o legtur peptidic cu grupul a,-NH2 al aminoacidului legat de ARN intna n situl A. recerea aminoacidului de la legtura cu ARN la legtura peptidic se realize'az, prin intervenfia enzimet, peptidiltrmsfemzd, legat
137

de subunitatea mare a ribozomului. Form'area legturii peptidice este catalizat de enzima peptidilplimnrazd, sau aminoacid-polim.erazd. localizat pe subunitatea mare a ribozomului, Se formeaz un dipepticl, iar ARNf din situl P rmne fr aminoacid Ei prsegte ribozomul, al doilea ARN purtnd d,oi aminoacizi unili printr-o legtur peptidic (un rest dipeptid) trece din situl A qi intr n situl P. Aceast trecere din situl A n situi P, condifionat de formarea legturii peptidice a ARN se numeEte ronslocaf,ie (fie. a2). Ea 'este m'ediat de un factor proeinic numit G a crui acfiune este dependent de 'energia eliberat prin hidroliza GTP, ca gi de o notaibil modificare conformalional a structurii rib,ozomului. Totodat ri,bozomul se deplaseaz pe ARNrn pe o distan{ echivalent cu un codon. Noul codon va ajunge la nivelul sitului A, unde va ptrunde un nou aminoacil ARNf cu un anticodon corespunzitor. Pe msur ce ribozomul se miEc n direclia 5'-+3', de-a lungul catenei ARNrn'are loc alungirea catenei polipeptidice qi totodat descifrarea mesajului genetic din ARNm. Cer cetrile lui Fritz Lipmann au artat c n procesul de asamblare a aminoacizilor intervin trei tipuri diferite de proteine care s-au numit fo,ctori de elongofie gi au fost desemnafi EF-'Lu, EF-?" qi EF-G. Acegtia snt compon,ente structurale ale ri,bozomului qi se ataEeaz la particula ribozomal matur doar n faza de funcfionare a aoesteia n asamblanea aminoacizilor in catena polipeptidic. La E. coli, EF-T, Ei ET-T, reprezint 50/o din proteina solubil Ei particip n transferul aminoacil-ARNt La situl aminoacil al ribozomului. Factorul EF_?, faciliteaz 'formarea unui complex dintre f,acorul EF-T", aminoacil-ARN qi GTP. Ribozomul care poart un peptidil-ARN't, n situl su P accept acest complex la situl su a,minoacil. Cnd are loc formarea .egturii peptidice EF-T" este eliber,at iar GTP este hidrolizat spre a da GDP qi fosfat cu ,eliberare de energie. Factorul EF-G particip in tr,,anslocarea (miqcarea d.e transla{ie) a ARN'm pe ribozom spre a fi expus urmorul aodon in situl A. Transl,ocarea implic consum de enrergie derivat din hidroliza unei molecule de GTP n GDP Si P. Elongarea nsqi a eatenei polipeptidice nu necesi energia eliberat prin hidroliza GTP, de'oar,ece energia liber nmagazinat n legtura aminoacil-ARNf este suficient de mane spre a conduce la formarea puntii peptidice. GTP acfioneaz agadar ca ur factor alosteric a crui combinare cu proteina EF-T" determin o modficare conforma138

lional a factorului EF-T, care permite amino-actl-ARN s se lege I'a situl ribozomal cerespunztor. Dup e}ongarea catenei polipeptidice nscnde, GTP este hidrolizat fcnd ca EF-T" s revin la conformafia inilia1 qi s se desprind de pe ribozom. Iat reacfiil'e n care factorii de elongalie snt implica{i n alungirea catenei polipeptidice (Blumenthal gi Carmichael,
1e7e):

EF EF EF EF

T,, . GTP

aaAF.N,

EF'

Tu . aaARN, . GTP

Tn

. aaARNr'

GTP

ribozom

+EF-T,,.GDP+PP

5 ribozom . aaARN, *

To . GDP + EF - T, $EF - Tu . T" -f GDP T. . T. + GTP rsEF - T"' GTP + EF - T".

Viteza de polimerizare a aminoacizilor este de 15 aminoaclzi pe secund. Dup ce un ri;bozom a tradus aproximativ 25 codoni captul 5' al ARNrn devine liber spr a forma un al doilea complex de inifiere qi un al doilea ribozom ncepe miqcarea de-a lungul catenei ARNnz, determinnd siureza unei a doua catene polipeptidice, apoi un al treilea, al patrulea ri-

multor ribozomi la catena ARNm rgzult o structur numit poliribuotu Structura poliriibozomal condilioneaz sintez.a simultan a numeroase ca'terne poUpeptidice care au dirnensiuni diferite la un moment dat, n funcfie de distanfa pe care fiecare ribozom a parcurc+ de la captul 5' spre captul 3' al. catenei ARNm. sajului (sinteza proteinic) au loc simultan, Ei nainte ca s se ermine sinteza AIlNrn, captul su 5' devine asociat cu ribozomul spre a forma un compler dc i,nifiere (fig. 42b). La euoariote transcrierea are troc n nucleu iar tr'aducerea n citoplasm unde se afl ribozomii. Exist o specificiate a activitlii ribozomilor n sinteza proteinic care ar reprezenta o modalitate de reglare a activitfii genelor la nivelul traducerii. Astfel, n sistemele de sintez proeinic in uitro (aceiular) se consta,t e ribozomii izolali din oelulele interfazice snt mai activi dect cei izolali din celule aflate n diviziune. n c,elulele hepatice, ribozomii ataqafi la reticulul endoplasmic
139

bozom q.a.m.d Prin ataEarea mai

La procariote transerierca (sinteza ARNnt) gi traducerea me-

srvesc pentru sineza proteineloor serice pe cnd cei liberi servesc la sinteza proteinelor hepatice specifice neserice.

Alurgirea catenei polipeptidiee poate fi schematizat astfelr

AA1

- ARlill * AA, - ARN'# - GTP - ARNI2 + ARI{lr.

AA1

AA2

Atagarea ribozomilor la monocatena ARNrn facilit eaz, piistrarea structurii liniare, monocaterrar,e a ARNnz, favora,bila unei citiri corecte a mesajului, unei decodificri corespunztoare. rr'- cazul n care pe parcursul catenei ARNnr apar regiuni dublu-catenare ribozomii le desfac spre a permite o
corect selecfionare a AA^,i.{RN.

Lungimea moleculelor ARNnz este heterogen, depinznd dr mrimea mesajului genetic purtat. Ia E. coli mrimea medie a ARNrn este de 900-1500 nucleotide purtnd un mesaj car corespur.de la catene polipeptidice de 300-500 aminoacizi. n sinteza histidinei intervin 10 enzime. Aoestea snt sintetizate sub directia unui mesaj purtat de o singur molecull de ARNnz.
4.L,3, TERMIN

AREA CATENET POLIPEPT IDICE

Cnd ribozomul n deplasarea sa pe ARNnz ntlneEte n slcodon terminator la care nu mai rspunde nici un tip de aminoacil-ARN are loc nrceramea sirutezei caenei polipeptidice cci un asemenea oodon nu este neclu'r.oscut de niei un anticodon ARNf, prezenfa sa n situl A aI ribozomului blocnd adugarea oricrui alrt aminoacid la caena poiipepti,dic. Codonii UAA, UGA Ei UAG snt codoni terminntori. Un,eori exist nu un singur codon terminator ci doi cod,oni termin,atori succesivi spre a asigura c sinteza catenei polipepti'dice se termin n punctul corespunztor. Terminarea catenei polipeptidice este un proces activ qi nu se datoreqte simplulul fapt c un codon nu poate fi citit. Codonii terminator:i (sfop sau nonsens) spre deosebire de codonii sens care snt citili (necunoscufi) de diferitele tipuri de ARN snt recunoscufi de ctre factori proteinici numili Ei factori de eliberare. Semna1ele de terminare repnezentate de cei trei codoni terminatori (nonsens) snt recu-

tui A un

140

noscute de

TF-.R1 rcunoage codonii UAA qi UAG, TF-R2 recunoa$te codonii UAA qi UGA. Codonul UAA (ocru) se pare c este cel mai eficient codon terminator, pe cnd UAG (arnber\ Ei UGA (opal : qzuy) ar reprezenta semnale accesorii care s asigure c terminanea nu equeaz. UAA gi UAG asigur terminarea eficient a traducerii la bacterii n propor{ie de 1000/o.UGA este rareori mai eficient de 980/0, iar la codonii terminatori ,,leakys sla,bi, adicA un terminator aparent gregit citit ca un codon ce specific um amfuroacid, efi,cien{a terminrii ese scazut dar semnificativ. Aceasta duce la alungirea eatmei polipeptidice dincolo de aodonul de termiinare. Codonul terminator interacfiorneaz, cu factori proteinici care au fost notrali cu R, crend,u-se un compler R-codon tenninator-ribozom care blocheaz alungirea n aontinuare a oatenei polipepticlice. Terminarea implic formarea r situl A a u'nui complex ce include fF-& sau TF-R2, codonul ter:rnfurator UAA qi ribozomul. TF-RB acfioneaz atunci enzimatic ia nivetul sitului P spre a separa grupul canboxil al a,minoacidului C terminal de l,egtura sa cu ARN printr-o hidroliz, elibernd peptidul. Blocarea sitului A face ca,polipeptida complet s rrnn esterificat la ARN finat care ocup situl P. Factorul proteinic T-R3 va rupe aceast bgatur, facnd ca sa fie eliberafl dim ribozorn att catena potipeptidi,c ct qi ARN. Totodat are loc dlsocierea riibozomului n sutbuurittile sal,,e mare qi mic, proces mediat de factorul lF3 implicat dupa cum s-a vzut qi n medierea formrii compl,exului de inifiere. n prooesul de berminare a catenei polipeptidice au fost implicate qi proteinele
ribozomale L7 $i Lrz. Sinteza proteinic ese ns'ofit de a.ga-numiul ciclu ribozamnt (ig. 43). Mai nti are loc asam'blarea rirbozomului din sub.unitlile s'ale. Pn n anul 1967 s-a crezut c subunitlile 30 S qi 50 S ale ribozomului snt prfiranrnt cuplate spre a forma un ri,Lmzom matur 70 S dar, din acest an, s-a stabilit c subunit{ile ribozomale se asociaz doar atunci cnd snt active n sinteza proteinic. De ndat oe a fost tradus mesajul genetic din ARNm Si s-a terminat sinteza caenei polipeptidice, ribozomul se disociaz de pe ARNnz, subunitlile ri,bozomului se separ Ei eie qi iau a$i parteneri (30 Sr * 50 51 30 52 + 50 S2 ntr-un eiclu de sintez Ei 30 Sr * 50 52 respectiv 30 Sz + 50 Sr n urmtorul ciciu de sintez. Prin experienfe de marcaj cu izotopi grei Ei radioactivi, Wlesels,on a artat natuna efemer tranzient a cuplrii de subl4',.

(F-&, TF-Rz Fi TF-R1).

trei factori proteinici (enzimatici) de

termfurar,e

() r uet"tn,vat

GLp,

I ltet

tRN,rl

(\i r)

8r
i

J0
,5,

it:

WJ
J

,.:17!^,-

-rY*
j

Alt.! m

,,

--)

{ -:h^ Yiiir
,,nr,-,OnO,\j{f/
tF lu
;,H\'m
7os,

{-n \,.!./lr:';/tl

lerminorea cotenei poLpeptic:

Produs prdein'rc

,,Foqlodde eliberore

I z'-GTP EF-ts ( tr'c" i\6tp+P I sinrezo, " coknei

Fal,pcptidce

s ch e m

o ng oi r n

n il,iii!i "r,i!,iirt
"

to

ri b

uo mo r e

Fig. 13. schema *ffirm:t$;;;ff3;1i,n o.r

rrbozornare

unitti rbozomale in constituirea de particule ribozomale matune, funcfionale. n timpul inifierii ane loc legarea faetorilor de inifiere IF-l , IF-z $i IF-3 la subunitatea 30 S. Inifierea mai necsit ARN formil,metionil la ,bacterii sau ARN-metionina Ia euoariote, ARNnz asociat subunitai 30 S,
GTP. Aceste cCIrnpooeote alctuiese aSa-numitul c.omplex de inifiere. Complexul de inifiere se comrbin cu o subunitate rirbozomal 50 S spre a forma un rirbozom funcfional 70 S. Proeesul este nsotit de hidroliza unei molecule d'e GTP din care rezult energie avnd loc $i eliiberarea facorilor lF. Se desfEoar apoi translocalia ribozomului reprezentnd deplasarea ribozomului de-a lungul ARNnz pe o distanf ce oorespunde cu fie(:are miqcane la trei nucleotide (oodon). Tnanslocalia rilboz,omului este un proc.es aetiv oare nec,esit energie pus la dispozilie prin hidroliza GTP precum qi intenvenfia unui foctor G numit factcr de trarulonfi,e. Siturile de irrteracfiune cu G qi GTP se afl n subunitatea ri;bozomal mare. Pentru realizarea transtrocatiei riibozomale, ARN deacilat (lipsit de aminoacid) trebuie
142

s fie expulzat din situl P, peptidil,-ARN trebuie s se deplaseze din situl A in situtr P, iar ARNm trebuie s se deplaseze pe subunitatea ri'bozomal mic ast'fel, nct s poat expune urmatorul codon n situl A. Dup parcurgerea nfuegii moLecule de ARNm, ribozomul se disociaz n subunitfile sa1e. La o nou reconstituire de particule ribozoma,le, subunitlile ribozomale se pot schimba ntre ele. Reciclarea necesit un faeor cle iniliere numit fontor de disociere rbazomald ce menline poiirirbozomii, inhilb disocienea subunitfilor ri'bozomale naimte d,e a fi disponiibil mesagerul, condifioneaz, intrrile cantitati'u'e a1e subunitfilor mani n polirirbozomi, permite acumularea de subunitli ribozomal,e n loe de acumulare de particule ribozomal,e uniee qi este cerut de legarea ARNrn la
ri,bozomi.

CONCLUZII

,n procesul de biosintez proeinic se realir.eaz, decodificarea informaliei genetice. Procesul de biosintezl proteinic este extrem de oomplex qi implic recunoaseri pe baz de complsmentariate dintre acizii nucleici, fur care ro1, esenfial ane relafia codorr-anicodon. ntreg procesul de biosintez,, proteinic se desfqoar prin intervenlia unui numr mare de alte proteine cu caracter enzimatic sau care funclioneaz in calitate de f,actori de recunoaqtere (inifiere, elon'gare, terminare). Este o refurnoi povar pentru celul cnd qi sintetir,eaz o caen polipeptidic, cci pentru aceasta ea pune ,n funcfiun,e un numr incompararbil mai rnare de alte proteine. n celulele procariote cu ARNnz de scurt durat de via{ reglarea expresiei genelor apare n principal Ia nivelul transcrierii (vezi reglajul genetic). La Eucariote cu ARNnz de durat de via{ mai lung, expresia genic este controlat att la nivelul transcrierii, ct qi a traducerii. Reglarea traducerii n aoest eaz are loc in parte n timpul inifierii catsrelor polipeptidice, ceea ce explic de ce factorii de inifiere eucariotici snt mai numerogi qi mai complicafi str.uctural dec omologii tror proeariotici (Oc}roa S. qi de Haro, 1979). Pe cnd aparatul de furifiene proeariotic oonst di,:r 2 sau 3 faetori de inifiere, cel eucariotic imphca cel putin 7
143

sau B asemenea factori. Faetorul proeariotic IF-7, care mijloceqte legarea metionil-ARN inifiaor, const dinrtr-o singur caten polipeptidic cu greutatea molecular B0 000-90 000, iar factorul de recunoagtere ,a ARNnz IF-3 const dintr-o caten polipeptidic cu greutatea molecular de 23 000 dal,toni. Faetorul de ini{iere eucariotic e IF-2 este eompus din 3 subunitfi cu greutate molecular com,binat de 150 000 daltoni, iar /F-3 are nu mai putin de 10 subunit{i care dau o greutate molecular total de 500 000 daltoni. Controlul tr,aducerii la eucariote implic interven{ia proteinkinaz.,elor care, atunci cnd snt activate nhib traducer,ea. Se cunosc dou mecanisme majore ale oon:tr'olului traducerii la eucariote. Primul controLeaz inilierea catenei polipeptidice prin blocarea funcfionrii factorului de ini{iere e IF-*Z, blocare care este realizat prin fosforilarea uneia dintre cele trei subunitli ale sale. Aceast fosforilare este catalizat de proteinkinaza. Al doilea urecanism de b}ocare a traducerii implic degradarea ARNrn pe calea activrii unei endonucleoze prin intermediul unei oligonucleotide c are o structur neobiqnuit ppp A 2' p 5' A 2' p 5' A. Aceast nucleotid este sinetizat din ATP sub acliunea tot a unei protein-kinnze. Anumite oligonucleotide mici, afl,ae n celulele eucariote, formate aparen n urma digestiei endonucleazice a ARN celular pot afecta traduoerea Ia nivelul elongafiei caenei. EIe pot, fi implicate n tranzilia de la o stare donmant sau liniqtit la o stare activ ca n emergenfa din criptobioz, a artropodului Arternia salina sau n fecundarea ovulului. Bl'ocarea func{iei e IF-Z qi degradarea ARNnz dup cunogtinlele actuale inhib traducerea ntr-o manier neselectiv. CercretriLe viirtoare vor ad.uoe noi dae asupna unor ci se lective de modular a traducerii diferi{il,or mesageri, ca qi asupra rolului fosforilrii proteinelor ribozomale qi factorilor ce intenrin n biosinteza proteinic, allii dect e IF-z. Recent s-a descoperit o protein stimulatoare a e IF-2 desmnrt ESP, car,e determin ca e IF-2 s formeze un complex ternar cu GTP qi ARN metioni,l inifiaor. Aoest aomplex ternar se leag la o subunitate 40 S a ribozomului eucariotic dnd uraqtere la un complex de iniliere n care intr Ei ARNrn. n urma fosforilrii subunitlii mici a e /F-2 este blocat furterac{iunea e IF-Z cu ESP $i astfel nu se poate forma complexul ternar de inifiere, fiind inhi'bat n consecint traducerea (Ochoa Ei Haro, 1979).
144

Capitolul V

$I

CARACERISTICILE ORGAI{IZARII FUNCTIONaRU FACTORILOR EREDTTARI

(GENETOR)

ereditfii. La organismele procariote funclionarea gi transmiterea fae'torilor eneditari prezint un tablou mai putrn complex comparativ cu organismele eucariote. Ciclul de vaf al organismelor prooariote este simplu. Reproducenea lor se realizeaz prin diviziune celular, neexistnd diferenfieri celulare majore. Existenta unui singur cnomozom-genofor substratul fizic unic al tuturor genelor pe care le prezint o-cel,ula procariot, faee ca de regul fiecare gen sa fie prezent ntr-un singur exemplar, ntr-o singur c"opie, n genomul prooariot. Ea se va exprima deci liber n fenotip, n funclie de necesitfile de moment al'e, celulei (vezi reglarea activitlii genice). La eucariote lucrurile snt oeva mai complicate. Existenfa mai multor genofori crpmozomii creeaz premisa prezenfei n genotipul unei celule, respectiv individ, a mai multor copii ale acel.eiaqi gene, adic a unor stri alternative ale acesteia. Comportamentul factorilor ereditari depinde nu numai de' aspecte legate de meoanismul reglrii activitfii genelor, dar qi de oomplexitaea organizrii genomului eucariot qi de prezenfa unei gene date, n aceeaqi celut, n c.'el putin doua stri
al,ternative.
tQ - Descifrud tainele ereditagi, vol. I

Cel care s-a oeupat pentru prma dat de probiema organizri gi funcfionrii faetorilor ereditari, stabilind caracteristicile lor a fost Gregor Mendel, printele Gerreticii Etiinfa

145

1. CICLUL DE

VIATA LA ORGANISMELE SUPERIOARE

Organismele eucarioe se pot reproduce fie pe cale asexuat (vegetativ lia plante, somatic la animale) fie pe cale sexuat propriu-zis, cu diferenliere de sexe opuse, mascul Ei femei. Reproducerea asexuat se realizeaz, cel mai adesea pe calea diviziunii celulare la eucariotele inferioare, unioelulare (al,ga Chlorella bunoar) sau prin diferenfiere de orgme de reproducere vegetativ, Ia plante. Eucariotele, mai a}es cele superioare, se car,acterizeazi nsA prin reproduoerea sexuat tipic, n oare s,e difererrliazi anizogamefi gamefi diferifi morfofizi,ologic ovulul la arrimale gi oosfera la plarnte, penru sexul femel, spermatozoidul Ia animale gi nucleul spermatic (derivat din diviziunea nucleului generativ rezulrtat n urma diviziunii nucleului haploid al micr,osporului ,gru,nciorul de pol'en) pentru sexul mascul. n ciclul-de via{ la organismele cu reprodueere sexuat alterneaza 'o f"az, s,exuat (gametofitic) qi a faz vegetativa (sporofitic). La animalele superioare precum Drosophila Ei omul, faza sexuat este reprezentat doar de celulele din linia germinal cane produc gamefii. Ele snt di$oide (2n), se diferenfiaz din celulele liniei somatice prin diviziuni mitotice succesive nc din primele faze ale emrbriogenezei Ei doar ele vor suferi meioza sprc a deveni garne,fi. Plantele nu posed o linie germinal. La plantele care se repnoduc pe cale sexuat, n floare, reprezentnd o parte a sporofitului, u,nele celuie vor fi induse spre a se difermfia n megasporofit la sexul femel qi microsporofit la cel mascul qi aceste oeiule vor suferi meioz'a. n unna meiozei rezult rnegaspori (ovulul) E microspori (polenul) care se divid mitotic spre a produce ceea ce se cheam ga,rnetofit. La plantele inferioare (talofite) ,gametofitul ,este foarte dezvoltat pe cnd sporofitul este redus. La plantele cu flori n special angiosperme, ,gametofitui este foarte redus pe cnd sporofitul (reprezentnd planta ntreag) este foarte dezvoltat. n pr,ocesul de fecundafie din unirea ovulului cu spermatozoidul respectiv a oosferei cu nuc121 spermatic, se reface garnitura diploid de cromozomi, rezutrtrd oul sau zigotul diploid car,e, prin diviziuni succesive va gnera un nou organism. Meioza Ei fecundarea snt ferromene
compensatorii.
146

2. CARACTERISTICILE GENETICE AI..E MEIOZEI

ploid 4C. Dup prima diviziune meiotic rezult dou celule care au o cantitate diploid de ADN (2C) qi cu mumr de cromozomi redus Ia jumare (n). Acrese oelule sufer ,o a dor.l,a diviziune mei.otic qi vor da patru celule cu cantitate haploid de ADN (1C), dar cu acelaqi arumr de eromozomi redus la jumtate (n), n prima diviziune meiotic, anume n gnofom. acesteia evearimentul cel mai important ese sinapsa crpmozomilor omologi cane condifioneaz reducerea aparen't a numrului de cromozomi. Cromozomii ibicromatidici avnd o crantitae 4C de ADN (duplicafi) se asociaz n perechi, pe baz de omologie, formind bivatenfli. n metafaza primei diviziuni meiotice fiecare bivalent se aqaz in placa metafazic, astfel ca unul dintre cromozomii omologi s fie deasupra, iar cel,lalt dedesubtul planului ecuatorial al acesteia. Aceast agezare a cromozomilor omologi oe alcttriesc bivalenfii condifioneaza o disjuncfie (segregare) ordonat spre polti a cromozomilsr omologi, di'n fiecare bivaJent unul diurtre omologi migrtnd spre un pol (deci ntr-un gam,et), cella,lt n mod obl,igaoriu, Iegic de,terminat, migrnd spre polul opus (ntr-un al garnet). Din prima diviziune meiotic nezulrt doi nruclei fii, fiecar.e avnd un numr de cnomozomi reprezerrutind jurntate din gamitura diploid a celulei somatice. De asemenea, acesti nuclei au o cantitate de ADN redus la jumtate faf de cantitatea de ADN a nucleului interfazie de dinainte de meioz. Prima divizir:ne meiotic este redu{ional. Nucleii haploizi rezul,tafi din prima diviziune meiotic sufer, fr a mai avea loc o sintez interfazic de ADN, o a doua diviziune meiotic care se desfqoar dup mecanismul mitotie tipic, cu clivarea longitudinal a centromerului Ei migrarea spre poli nu de cnomozomi bicromatidici ca n prima diviziune meiotic, ci de cromozomi monocromatidici. A dou diviziune meiotic desvrgeqte astfei qi reducerea cantittii de ADN, care de 1a 2 C ajunge a 1 C, canrtiate specific gannefilor haploizi. Iau n,a9ere

lulelor reproductoare. n cadrul ei, dupa o singur runda de neplicare a ADN se desfqoar dou diviziuni nucleare succesive. n urma replicrii ADN, o celul 2n cu o cantitate 2C de ADN va dobndi o cantitae dubl de ADN de nivel tetra-

Meoza este diviziunea celul'ar cane duce

la formarea

ce-

147

patru nuciei hapl'oizi ca rezultat a dou diviziuni meiotice sucCeluiele organismelor diploide care se reproduc pe cale sexuat, prezint dou seturi de cromozomi, unul provenind de la mam, adus la nivel.ul zigotului de ctre ovul, altul provenind de la tat, adus la nivelul zigotului de ctr'e spermatozoid. Fiecare set de cromozomi este atrctuit di,r: crom'ozomi neomologi, neasemntori. n cadrul complementuluii diploid ns, doi cte doi cromor,omisnt asemntori adic omol,ogi, unul fiind de provenien[a matern iar altul de provenienta patern. Asemenea cromozomi ornologi poart aeeleagi gene n loci oorespunzaori qi prezint aceeagi morfologie. Astfel', star,ea diploid a organismelor eucario,te implic existenla locil,or omotogi qi a genelor alele; cel pufin cte dou gen'e din genotipul organismului eucariot controleaz acel'aqi caracter. In timpul meiozei aceEti cromozomi omol'ogi se mpereeh eaz,, formnd bivatenfii. n mperecherea omologiior un rol esenfial revine compl,exul ui sinaptinemal.
cesive.

3. LOCALIZAREA GBNELOR PE CITOMOZOMI

n anul 1903 Sutton a starbilit relalia dintre comportamentul crornozomilor n meioz (segregare) pe de,o parte qi disjunctia (asortarea) independent a genelor pe de alt parte, fapt care a stat la baza elaborrii teoriei cromozomale a ereditfii
S-a putut constata c o gen nu poate s corespund la un cromozom ntreg de vreme ce oricare .organism, fie el, procariot (unde exist un si,ngur cromozom) fie eucariot posed mai multe gene dect cromozomi. Singura posibilitate rmnea 'ca pe un singur cromozom s se afle mai mutrte gene care snt lincate sau nlnluite. S-a stabilit c fiecare gen ocup o anumit pozilie (toczs) strict determinat pe cromozom Ei c pe cromozomii omologi alel,ele unei ,gene ocup pozilii corespunztoare. Mai exact alelele unei gene ocup acelaEi locus pe cromozomii omologi. Ulterior pozilia ocupat de o gen pe cromozom a fost asimilat cu gena ca atare, nct atunci cnd se vorbeqte de un locus genie se nlel,ege gena propriu-zis,. Piuralul de la locus este loci. Genele plasate pe un acelaqi cromozom manifest tendinfa de a se transmite nlnt-uit I,a desce'n'denfi, n virtutea faptului
148

de ctre Morgan qi Ecoala sa,

1919.

c ele snt fizic nlnfuite, iar cnomozomul este trecut ca entitate integr, discret, din celula inifial an celulele fiice. Pe de ,at parte, genele care snt localizatn pe diferifi crorn'ozomi (pe cromozomi neomologi) nefiind nlnfuite segnegA independent unele de altele cci qi perechil,e de cromozomi n anafaza primei diviziuni meiotice (AI) segneg independemt unele de altele. Dac dintr-o pereche dat de crnomozomi, crornozomul de origine matern migreaz spre un pol, n mod legic determinat cromozomutr de origine paern migreaz spre polul opus. Dar, considernd o arlt peredre de cromozomi, ru es'te o'bligatoriu s migreze spne polul spre cane a mi'grat din prima per,eche cromozomul matern tot, cromozomul de origine matern. Astfel, spre poli, n nuclei fii, rezultali din prima diviziune meiotic, vor mlgra cr,omozomi de ori,gine diferit, mate'rn qi patern, migranea fiind un evem.iment determinat stohastic, probarbilistic. n asemena nuctrei vor apar constelalii genetice de cromozomi, respectiv de gene dierite ca origin'e (materne qi paterne), ca provenienf, de cele care au fost la genitori. Aceste concluzii au fost desprinse ns dup ce s-a studiat fenomenul ereditar la nivel ceL,ul,ar. Dar, na,ine de a fi cunoscute mecanismele in,time ale meiozei qi implicarea cromozomitor n ereditate, Gregor Mendel, studiind hibridarea la mazre, a ajuns la concluzii care Ei pstreaz n total,itate valabiliaea qi astazi, astfel c el, clugrul augustin Gregon Memdel, nscu't la Heinuendorf (Cehoslovacia) n t822, este aonsider,at fondatorul qtiintei er.editlii.

4. DESCIFRAREA NATURII GENOMULUI (GENOTIPULUI} PRIN STUDIUL FENOTIPULUI (ANALI7,A GENETICA) (GENETICA FACTORIALA SAU FORMALA)
Cercetrile lui Mendel se deosebesc radical de ceie ale predecesorilor si (cei mai reprezentativi fiind Knight, Goss, Ch. Naudin) prin trei elemente de n,outate: modul de a privi experienla qi de a alege materialul potrivit, introducer,ea discoartinuitfii qi folosirea maril,,or populalii, oeea oe permite exprimarea nezultatelor prin numere Ei pr,elucrarea lor ma'tematic, ca qi folosirea un.ror simrboluri simple pentru desemnarea fac.torilor er,editari de natur corpusculan, prin care devine posi149

mencetat d,ialog diurtre experiment Ei teorie, dintre experimentator qi experienfa sa. Noua metodologie, prelucrarea statistic Ei reprezentarea simbolic impu,n ereditlii o logic intern. Cu Mendel, interpretarea fenomenelor biologioe dobndeqte dintr-o dat rigoare matematic. Gndirea sa a fost o gndire revolufionar. EI a. ajuns la concl,uzia c trsturil,e (caracterele) ereditare ale unui individ snt distincte, fiecare transmi!ndu-se ca unitli separate de l,a printi la descendenli mu direct, aqa cum credeau predecesorii si, ci indirect, prin intermediul unor factori ereditari. Astfel, deqi un individ poate s posede mii de trsturi distinete care alctuiese individualitatea sa, fiecare din aceste trsturi snt controlate de ctre unitli ereditare sau factort eredifuri oare au un caracter discret (n sens de distinct din punct de vedere fizic). Mendel a stabilit c ereditatea urmeaz legi simple qi exacte pe baza crora poae fi prezis comportamentul oricrui factor ereditar care dirijeaz un anumit caracter. Moqtenrea caracerelor se face dup reguli foarte exact'e,

bil un

Prin experien! dar Ei intui{ie genial, Mendel a statuat c diferitele caractere a}e unui organism dat snt determina,e de factori ereditari de natur material, localizali n nucleul eelular, fiind in doz dubl n celulel,e somatice gi n doz simpl n celulele reproduc'oare (gamefi). Prezenfa factorului ereditar n doza dubl a fost probabitr sugerat lui Mendel de participarea a doi incliviei diferifi la uraqterea unui singur individ la organismele c se reprodue pe ca,le sexuait. Este acum uEor pentru noi s apreciem c aceast situafie corespunde cu acea a numruiui de eromozomi sau a cantitlii de ADN, dar Mendel nu qtia acest l,ucru, deoarece la vremea cnd a elaborat tezele sale mu se d,escoperise nici cnomozomii, nici ADN, nici meioza. Mendel a mai stabilit c factorii ereditari n celul,ele somatice fiind n doz. du'bl se afl su,b form de pereche sau cum a definit el cu terrnenul grecesc sub form de alele. Acum qtim c factorul ereditar mendelian este o gen qi c gena poate exista sub forma a dou stri alternative, numite alele din care una este dominnntd (A) gi alta rece'siud (a)" Aceste dou Sri ,a,ternative ate aceleiaqi gene sn,t rezulrtatul posi,bil al mutafiei bidirecfionale: A, ' a. Existenfa genelor poarte fi sesizat numai cnd ele determin un caracter ce poate s apar sub dou stri al,ternative. Abia atunci vom putea qti c exist o gen care, ntr-o anumit stare determin o anumit
150

matematice.

form a caracterului considerat (ibob neted n cazul formei bobului de mazre) qi ntr-o alt stare determin cealalt form a caracterului (bob zbrcit). Cele dou alele ocup acel'agi locus pe o pereche dat de cromozomi omologi. Astfel, dac alela A se afl pe cromozomul cle origine matern, ntr-un anumit sit sau locus, p cromozornul omolog de origine patern, l acelaqi locus se va afl,a fie gena ,,Att, fie ale,la sa ,,a6t. Situarea alelelor poate fi qi reciproc, ,,Att pe cr,omozomul de origine patern qi ,,a( pe cetr de origine maem. ntr-un alt locus pe aceeagi pereche de cromozomi omologi se afl alt gen ,,Btt prezent sub forma alelelor ,,Bs qi ,,bs. Genele A Ei B, fiind plasate pe acelagi cromozom se transmit de regul mpreun la descendenfi. Pe celelalte perechi de cromozomi se afl alte gene (X, Y, Z etc.) qi transmiterea lor la descendentr nu este legat direct de transmiterea genelor A Ei B. Gena A prezent cu alelele sale A gi o n ace,laqi locus pe ,cei doi cromozomi ,omologi poate determina variafia expresiei fenotipice de regul a unui singur caracter. Prezenfa unei gene sub forma a dou stri alternative (alele) poae fi comparat cu un ntreruptor electric care prezint dou stri posibile, alternative: nchis n acest caz lumina este stins; - deschisEiEi n acest caz lumina este aprins. - exemplificm din experienlele lui Mendel. EI a efectua S hibridri de mazre. Mazrea prezint mari avantaje pentnt studiul comportrii factorilor eneditari (genelor) deoarece este o planta autogam (fiecar'e plant produae att polen ct qi ovuie) qi prin autofecundare se pstreaz nealterat puritatea genetic. Din aceast cauz mazr,ea prezint multe soiuri pure 'care se d,eosebesc tranqant ntre el,e prin caractene contrastante ,bob verde; flori roqii ,bob zbrcit; bob galben (bob neted port pitic etc.) car,e se mai numesc fl'ori al'b,e; port nalt - earacere alelomorfe qi- care pot fi o'bservate cu uEurin!. Pugi ritatea genetic a unui soi este d'ovedit de faptul c prin ,out,ofecundare se pstreaz nealterate caractercle sale, adic se transmit fidel, neschim,ba;te, de-a lungul generafiilor, dnd o ,d,escenden! uniform qi asemntoare formei inifiale. Pe de alt parte, un soi impur genetic va da naqtere prin auofecundare la o desoendent neuniJorm, ad.ic va segrega.
151

4.1. MONOHIBRIDAREA,

ncnrciqind un soi pur de mazre cu bob neted, cu un soi pur de mazre cu bob zbrcirt Meardel a ,oblinut n prima generafe (F1) organisme hibride cane prezentau feno,tipic (exteriorizau) doar caraeterul de boib need. Experien{a de ncruciqare ln car'e se ia n considerafie doar o pereche de canactere aletomorfe se numegte experien! de m,onohibridare. n al doilea an, a cultivat rboabel.e hitbride dirl Ft lsnd pl,antele s se autopolenizeze Ei a oibfinut cea de-a doua generafie (Fz) de plante. n ,acest cazp lng plante care fceau boabe uretede au aprut qi plante care fceau boab,e zbrcie. Deoarece n prim,a generafie, dintre cele dou caractere contrastan,te neted-zbrclt, s-a manrife,stat doar caracerul de bob neted, Mendel a numit acest caracter, caracter dominan, iar factoruL ereditar care l determin l-a considerat factor ereditar dominant qi l-a simbolizat cu litera mare ,,Ao. n acelaqi timp caracerul de bob zbrcit, neexprimat n Fr, a fost consid'erat oarracter reeesiu, iar factoml care t determinr a fost considerat factor ereditar recesiv qi a fost n,otat cu litera mic ,,at'. n virtutea celor spuse pn acu.m, experienta de hibridare a lu Mendel poate fi astfel scheuratizat (fig. 44). Analiza femotipic a celei de-a doua generalii (Fz) a artat c proporlia dintne plantele cu iboabe netede gi pl,antele cu boabe zbrcite era de 750/o neted la 250/o zbrcit, sau simplificat de 3:1. Aoesta a fost numit rraport de segregare Ei s-a, cofrstatat a fi aproximativ acelaEi n toae experienlele de hibridare de acest tip. Analiza genotipic judecat dup feno'tip gi bazat pe inrtuilie a sugerat e exist trei categorii diferite genotipiee de organisme AA, Aa qi aa. Aparilia doar a dou caegorii fenotipice de organisme n cadrul unei popul'a{ii n care probabilistic apar patru posibilirtli de combinare a gamefilor i-a sugerat lui Mendel c n cazul structurii genotipice Aa se exerioriaeaz qi ca n oazul hllorizilor din F1, doar carastenrl" dominant. Probabilita,tea aparifiei caracterului dominant ese de 3/4, ar a oelui recesiv este de l/4, de unde raportul fenotipic de segregare 3:1, oel genotipic fiind de 1 AA:2 Aa: 1 oo. De
152

PARINTI fGenitorii' -*Hc'r czrgol recesiv botr zbkit'

Meroz cr

isepororeo toctonlrr erdrl.rr n gometi drfecrlr I

Gomei'

PRMA
(hitrrcel

GENERAIIE (Fl)

I II I \_y

orEor-,sme t00Tohererozigote

rtil
,

"/?

ii'
Gomeir

'ol
I

o >-:
frt
50Vo 75%o

il
24o,6

tD frr;
l---_--

DOUA

GENERATIE (Fzl)

hofiozrgot domrnonte heterozigote

bob neted

Seg.egore drp, z Jlo homozrgot recesive J SenotiR I l, 2,1l:

25o4bob zbrcil
'l

'l

Segregore dr.rp, lfenotrp (3 neted: t zurcrt )

Fg. 44. Monohibridarea

(segregarea
ereditar).

sau separarea factorilor

fapt, rezultatele experimentale oblinute de Mendel privind raportui fenotipic de segregare n cteva experiente snt redats n tabeiul 3. s considerm cteva aspecte legate de oomportamentul factorilor ereditari. Factorul reditar A este dominant. El condilioneaz un caracter dominant, caracter care se manifest n toate generaliile, indif,erent dac intr sau nu alturi de factorul ereditar recesiu n struc"tura genetic (,n genotipul) celulei, respectiv organismui consi'derat. EI se exprim n- fenotip att cnd se afl n d,oz du'bl (AA) ct gi atunci cnd s,e afl
153

Tabel nr. 3 Raportul lcuotiplo de segregare n erperienlele lui lIendel

Genitori (Prinfi) Plante de bob neted x Plante cu bob zbrcit Plante cu bob galben x plante cu bob verde Plante cu flori rogii x Plante cu flori albe plante cu pstAi verzi x plante cu psti galbene

Fl bob neted

F2

lnaport dr segfegae
I

5471

plante cu
boabe

2,96: I

uetede
1850

plante cu
boabe zbrcite
galbene verzi. 3,01 3,15

bob galben

6022
2001

:I :I

flori

rorsii

psti verzi

705 224 428

rogii
albe

t52

vetzi
galbene

2,82: I

genetic AA este homozigo't Ao es,be heterozigot. Factorul eredita'r a este recesiv. El condilioneaz un caraeter recesiv E nu se poate exprima atunci cnd intr n structura genotipului alturi de factorul ereditar dominant (A) la formele heterozigote (Aa). Se spuo, c Ia organismele heterozigote dominanla poate s mascheze genotipul. La organismele homozigote recesive (aa) fenotipul refl,ect genotipul. Factorul ereditar recesiv nu se manifest dect atunci cnd se afl n doz dubl, adie este plasat pe ambii cromozomi omologi, stare care se numegte hmozigotd recesiud (aa). O singur situalie se cunoaqte n care n mod normal factoml ereditar recesiv se exprim atunci cnd se afl n doz simpl. Este cazul factorilor erreditari plasali pe cromozomii de sx Ia masculul de drosofil sau mamifere. Formula cromozomal a sexului mascul n aeeste cazuri este XY. Cei d'oi cromozomi de sex nu ,alcatuiesc o pereche, nefiind omologi. Dealtfel ei nici nu Be mperecheaz, intim pe toat lungimea lor n meioz. Cromozomul Y poart foarte puline gene priqrtre care qi cele care intervin n masculinizare. Cromozomul X este un cromozom activ genetic. El poart mule gene. Dac o gen de pe crqmozomul X se afl n stare recesiv (a), ea se exprim fenotipic chiar fiind n doz simpl, cci pe cromozomul Y, urefiind omolog cu X, nu se poate afla niciodata alela sa dominant (A). Aceast stare, n care gena recesiv ,,a35 s,e exprim fenotipic, chiar cnd se afl ntr-un si,ngur exemplar se nu,meste
d"omirwnd pe cnd structura genetic
154

n doz simpl (Aa). Structura

stare de hemizigolie. Hemizigolia poate apare gi la organismele aneuploide monosomice la car.e lipseqte unul din crornozomi unei perechi de cronnozomi. Un alt aspect legat de f'actorii ereditari mendelieni se refer la segregore. n procesul hibridrii, factorul ereditar dominant nu se amestec cu factorul eredita,r recsiv. Fii'nd de natur corpuscular, aceEti facori numai coexist n genotipul hibrid, se altur, fr ns a se contopi. Factorul ereditar dominant nu determin nici o alterare a factorului eredi'tar recesiv, ci numai nu-i permite exprimarea sa fen,otipic (1 ,,domins). Acest lucru este dovedit de reaparifia factorului ereditar reoesiv n generalia F2. Raporturile dintre factori ereditari, dominant Ei recesiv snt mai degrab raporturi funclionale, cel reoesiv neputnd fu'ncfiona 'n prezenfa celui dominant, sau produsul su de sintez este acoperit de produsul specificat de fact,oruL domina,nt.

Reaparifia factorului recesiv n F2 a sugerat lui Mendel fenomenul de segregare. Segregarea factorilor ereditari se suprapune segregrii cromozomilor omologi din bivalenli ,n timpul meiozei. Fiecare din cei doi cromozomi omol,ogi conline fie factorul ereditar ,,A((, fi,e factorul ereditar ,,as a,ja nct prin separarea lor spre poli opuqi, aceEti factori ereditari vor fi separati qi ei n nuclei diferili respectiv n gamefl diferifi att la pr'intele de sex femel ct Ei la printele de sex mascul. Cncl ntr-o ce1ul se afl dou alele (Aa) acestea vor fi distribuite egai n gameli. Din cei patru produgi ai meiozei (gameti) doi vor primi 'alela ,,Att $i ali doi alela ,,as. Raportul de segregare alelic este 24:2a sar simplificat 1:1. Acest fenom'en de segregare, disjunclie sau dezbinare a factorilor ereditari se numegte principiul, segregdrii sau prima lege a lui Mendel. Ea statueaz c dac orgarnismele pot fi pure din punct de vedere genetic (homozigote domirnante AA sau homozigote recesive oo) sau impure di'n punct de veder",e genetic (heterozigote Aa), gamelii snt legic puri din punct de vedere genetic prin faptul c, derivnd n urma divizunii meiotice, cnd are loc reducerea numrului cle cromozomi respectiv separarea factorilor ereditari, ei confi,n fie f,ac0orul ,eneditar A, fie factorul ereditar o, nici,odat, n condilii normrale, ,arnbii faet'ori er,edirt'ari. Principiul segregnii (s,eparrii f,acoriior erreditari)

tn.(,

oo<2, AA<1)

aplic n cazul factorilor ered.itari

plasali n acelagi locus pe cromozomi omologi.

155

nismele homozigote de cele heterozigote. Reducerea heterozigoliei Ei creEterea homozigofiei are mare irnportamta ,n practica ameliorrii. D,e exemplu, fenomenul cle heterozs (vigoare hi'brid) are la baz,, ca mecanism genetic, constitufia 1000/o heterozigot, a organismelor hibride. Inseamn c acest fenomen se manifest cel mai intens n prima generafie. n celelalte g'enerafii prin sqgregare se redute graAul de heterozrgofie qi implicit valoarea heterozisului. Totoda(. segreganea are importan! practic n o',blinerea de forme homo-

Considernd fenomenul segregrii, se constat c dac n F1 org'anismele rezulta'te din ncrucigarea a doi geniori puri genetic (soiuri pure sau linii pure) snt TAAo/o h,eterozigote, datorit fenornenului de segregare, procentul organismelor heterozigote se reduce, cu fiecare generalie la jumtate (fig. 4b) astfel c teoretic, dup circa B generafii, n populalia respectiv predomin organismele homozigote. Prin autopolenizarea organismelor homozigote rezult doar organ,isme homozigote conform sehemei di,n fig. 45. Prfur autofecundarea organismeior heterozigote a,re loc segregarea oaracterel.or. Aceasta este o cale de a deosebi orga-

,/-1,
tY
I

F1 (orsantsnp t00o/o hpteroz::tFt

l(

Aufofecu ndare segreg )

?5"/"

l7j",/o 17.90/o

5o/o

l?,5o/o '/

{5"h

5 a/"

Fig. 45. Schema

red.ucerii heterozigofie

fiecare generalie de autofecundare (autopolenizare).

qi cregterii homozigofiei cu

156

consangonizate) din a caror ncrucihibrizi simpli care, la rndul lor, prin ncruciqare dau hibrizi dubli. Aceste aspecte genetice stau la baza ob{inerii liniilor consangvinizate, a hirbrizil,or simpli Ei dubl,i de po-

zigote

gare se-oblin,

linii prre (linii

de tip incest, mam-fiu, tat-fiic, sor-frarte etc. nct nu se obline o puritate absolut a liniilor consangvinizate. De asemenea segregarea are mare importa.n! n sfatul genetic. O maladie ereditar uman, determinat de o gen recesiv care s-a manifestat la bunici, sare peste o generafie (printi) qi se manifest din nou la copii. n funclie de natur dominant sau recesiv gni qi de fenomenul de segregare se poate stabili riscul de aparilie a'bolii. Cazutr acesta n care un element (alel) al perechii de factori ereditari este complet do,minant iar celaLalt element, este complet recesiv se numqte dominn:nfd completd. n cadrul su, n genenal uru se poate spune, judecnd dup fenotip, dac un ndivid este homozi,got sa,u heterozigot pen,tru alela dominant. Genotipul unui individ care prezint fenotip dominant poate fi otuqi determiurat dup fenotipurile qi frecvenfa lor analizate la desaendenlii pe care acesta i produce n urrt; ncrucigrii sale cu un individ homozrgot recesiv pentru acea pereche de faetori ereditari. Aceast ncruciqare se numeEte test cross. Fenotipurile Ei frecvenga lor la desoendenlii rezultafi din test cross oorespund tipurilor qi frecvenfelor genotipice ale gamelilor produgi de organismul al crui genotip este necunoscut. Cnd individul test'art a avut unul dintre prinfi sau strmoEi recesiv pen'tru perechea de factori er,editari analiza,t, test crossul se mai numeg"te back cross sau retronuucigare. Dominanfa face ca numrul claselor fenotipice s fie mai mic dect numrul claselor genotipice. De asmenea dominanfa cauzeaz, regresia, adic prhfii care snt fen<vtipic extrsm pentru un caracter cantitativ (productivitate) dau descendenfi care snrt n medie mai pulin extremi. Deoarece dominanla mascheaz prezenla geureJ.or recesive, o ncrucigane dintne doi indivizi de acelaEi fenotip (de exemplu cu blana neagr, culoarea fiind un caracter cantitativ A) luafi la ntmplare poate produce descenden{i de culoare deschis (a). Acoast tendin{ a prinlitor (A} care feno,tipic snt extreme, de a da descendenli care nu snt
extreme se numeqte regresie. La orga,nismele polipl,oide fenomenul de s,egregare este rnai cornpltoat, n sensul c raportul de sqgregare este de 35 A :7 o,
L57

rumrb, floarea soarelui etc. La animale consangviurizarea se realizeaz.

prin ncruciqri

deci frecvenfa cu care apare organismul homozigot recesr'v foarte mic (tabelul 4)
Tabelul 4

,este

zlgote AAAA x

Rozultatul lneruelgrll a dou organlsmc poli' plolde reprezentin.l ttntl pure genctlo (homo(AAaa x AAaa)
aaaa)

in a

doua gonorafio

IAA IAAAA I n^o^"

4AAAa

Itoea". lAAaa +eaaa |

lAAaa
4Aaaa

laaaa

Cind se consider perechi d,e factori ereditari ptasali pe crornozomi diferifi se constat c apar aspecte n,oi ale comport-

rii

acestora.

4.2. DIHIBRIDAREA

Mendel qi.a propus s urmr,easc modul cum se transmi simultan dou perechi d'e factori ereditari: una cane determin f'orma bobului (A:neted; wbrcit) Ei alta care determin culoarea bobului (B-galben; b:verd). Pentru aoeasta a ncruciEat un soi pur cu bo,abe neted'e Ei gal'bene (AABB) cu un soi pur care prezenta boabe zbrcite qi verzi (aabb). Asemenea experien! de ncruciqare n car,e se iau n considerafie dou perechi de caractere se nume$te dihibrid&re. ln prima ,gtsneragie a oblinut ,o populafie hibrid pentru am,bele caracter,e (AaBb), care prezenta caracer,ele de rbob neted Ei galben, ceea oe ns@rnnf, c acestea snt caracter,ele dominante, cele de bob zbrcit 9i verde fiind deci canacere recesive. Pentru a obline a doua generalie a lsat s se autopolenzeze plamtetre dubluhibride din prima generalie dup schema din fig. 46. Analiznd tabelul, numit n unele lucrri mai vechi n mod sugestiv ,,gahul cornibinrilor mendeliene(( sau tabelul lui Punett se consbat c prin segregarea facborior erreditari 01 meioz deriv patru cartegorii distincte de game{i rnaseuli qi tot
158

attea de gam'efi femeli. n procesul de fecundare are loc unirea pe baz de probabilitate a gamelilor mascui cu cei femeli, adio fiecare gamet mascul. (sau femel) are Sanse egale cu ale oelorla'lfi 3 de a se uni cu fiecare din gamefii de sex opus. Rezult 16 posibilitli de comdominan!-recesivitate, oriunde se ntLnesc factorii ereditari dominanti A respectiv B va fi exprimat n fenotip caracterul respectiv (neted sau galben). Crrd ei snt prezenS simultan n acelaqi genotip, vor

ptjttli o +

6AMIi

F1

relaliei

binare, respectiv 16 coantbinalii de factori ereditari. n virtutea

,@j@"
F2

AB
AB AAB B

Ab
AABb

aB

a)

AaBB AaBb

fi

exprimate fenotipic att caaB Aa BB AaBb aa3il laarr racterul rneted ct qi canac"terul ab AaBb Aa bb aaBb aa bb gal'bern. Caracterele reaesive vor fi exprimate feurotipie doar n cazul n oare factorii ereditari Fig a6. Dihibtid.area (Segregarea inperechilor recesivi (o qu b) nu snt n pre- dependeut aereditari). de factori zen\a factorilor ereditari dominanfi corespunzbori (A qi B). Din analiza celor 16 combinri de factori ereditari se constat'
urmtoarele
:

Ab AA Bb

AAbb AaBb

jealr

9/16 preznti simultan ambii factori dominanli @B) condi' lionnd expresia caracterului neted gi galben; 3/16 prezint un factor ereditar dominant { altut recesiv ' ondilionnd dezvoltarea unui caracter dominant gi a altui baracter recesiv (l _ bob neted gi verd'e) ; 3/16 prezint cellalt_fa-ctor ereditar dominant 9i pe cellalt recesiv (aB : bob zbrct ;i galben) ; 1/16 prezint. ambii factori ereditari recesivi condilionnd. exprrmarea fenotipic a caracterelor recesive de bob zbrcit gi neted. De fapt, n experienla sa, Mend.el a obligut -n F, 556 de plante diirtre care-315 au produs boabe neted'e ;i ga-1b^e19, 108 6oabe netede gi verzi, l0l boabe zbrcite 9i galbene 9i 32 boabe zbrcite gi verzi.
159

Deoarece probabilitatea apariliei unui caracter dominant este de 314 iar a unuia recesiv este de ll4, gi probabilitatea apariliei simultane a dou evenimente nd.epend.ente este egal cu produsul probabilittii apariliei lor separate (individuale) este u;or s desprindem de unde rezalt"raportul de segregare 9:3 :3:1. Probabilitatea apariliei lui A este de 3/4, a lui B tot de 314, a lui a de ll4iar a lui D tot de l/4. Probabilitatea apanlei simultane a lui A gi B este de 314 x 314 :9/16.

AB Ab :
aB

314

x 314 - 9116 bob neted pi galben 314 x U4: 3/16 bob neted gi verde

:314 x ll4 3116 bob zbrcit gi galben ab: ll4 x ll4: l/16 bob zbhcit gi verde
De fapt raporturile rezult din desfacerea expresiei

G^+:i,)*(+" *ioJ.
Admi!nd c P reprezinti probabilitatea evenirnentului X (gamefi nerecombinali) iar q probabiltatea evenimentului Y (gamefi recombinali) respectiv contaprobabilitatea evenimentului X (l-P) se poate calcula frecvenla apanliei recombinrilor n caz;ri, unei ncrucigri dintre organisme dublu heterozigote (AaBb x AaBb). Rezult patru tipuri de gameli femeli gi patru tipuri de gameli masculi. Dintre acestea, dou snt nerecombinante (AB g ab) gi dou snt recombinate (Ab Si aB). Probabilitatea apariliei unui eveniment este egal cu raportul dintre numrul cazurilor favorabile ;i numrul cazurilor posibile. Probabilitatea apariliei sirnultane a dou evenimente este egal cu produsul probabilitlii apariliei lor separate. Probabilitatea X- P:+.
Probabilitatc'a

I{

:I:;t

+I:li
'z -

Frecvenla gamelilor nerecombinali

Frecvenla gamefilor recombinanli

Q:l -p; - +a
g

-1 -

d
Zt

Pentru a calcula probabilitatea de aparilie a unui anumit tenotip se proce deaz" astfel : pentru fenotipul Ab :

(t r(
e'

pt, p(l-p),p(l-p)
4' 4 ' 4

pr+p-p'+p-pr :_: p(2-p) 2p-p' _

4 4
4

r(

160

din tabelul

Tot astfel se procedeaz' n vederea calculrii probabilitfii de aparilie a celorlalte fenotipuri (AB, afl;t a) folosind datele
5.

Analiza fenotipic a indivizilor din generalia Fz a artat cteva aspecte import,ante privind comportamentul factoril,or rditari. n primul rnd s-a dovedit nc o dat realitatea segregrii factorilor ereditari. Dar mai important este aparilia unor categorii noi de indivizi. Astfel, n clihi,bridare s-a pornit de la clou tipuri de plante: cu bob neted Ei galben (AB) gi cu bob zbrcit Ei vei'de (cb,) gi n F2 au aprut pe ling aceste dou tipuri iniliale nc d'ou tipuri care prezenitau un caracter de la un genitor Ei ait caracter de la cellalt genitor. Avea loc deci 1a descendein{i o dezbinare a cuplurilor de caractere parentale. Si,ngura explicalie plauztbil, era urmtoarea: La nivelul hibridului din prima generalie (AaBb) perechea de factor:i ereditari care determin forma ,bobului (Aa) segreg independent de perechea de factori ereditari care determin culoarea bobului (Bb) Ei astfel se creeaz posibilitatea probabilistic a asortrii independente a factoriior ereditari astfel nct n acelagi g'amet va putea trece un factor ereditar de la o pereche Ei un factor ereditar de ia ceaialt pereche (fig. a7). Acegti gameli se ,numesc game[i recombh,a[i. Dac ,n'u ar fi o segregare independent a cetror dou perechi de factori ereditari, aiunci ar lua naqtere doar dou categorii de gameli qi anume rgamelii nerecom,bi,nanli AB gi ab care ar condiliona formarea a dou caegorii de organisme cu bob neted Ei galben
AABBO t

X aabbd

Fig- 47.

dent a perechilor de cromo-

Segregarea indepensegregaea

fgurndu-se n meioz., Ia fot-

(disjunctia) independent a perechilor de factori ereditari, evenimente cae se presupun reciproc Ai se suprapun, desmaea gamefilor.
I

zorni nsolit de

I -

Descifrnd tainele ereditfii, vol. I

161

(t)

t9
Gamefi

Tabehtl Probabllltflle de aparlflo a dtferltelor fenotlpurl

AB

Ab

aB

ab

o\
a\

(?)
ABAB

r*)
ABAb

{;)
ABaB

(?r
ABab
p)

AB

t?)
Ab

I -p
2

1-p_(l-p)'

p p(l-p)

I -p

oo -2

P ._:

p(l -

ABAb

AbAb

AbaB

Abab p
2

t;)
aB

p 1-p 224

:- p(l -p)

p p_p2 224
AbaB

ppp2 224
aBaB

l_-p_p(l-p)

ABaB

aBab

(*l
ab

1-p_p(l -p)

ppp2 224
Abab
p

p p_p2 224

P.

L:-P:qO-P) 224

ABab

(?t

I -p
t

L___r_(l-p):

I -p

p(l -

p)

f-!r
2

p p(l-p) 24

(AB) $i cu ibob zbrci,t qi ve,rde'(ab), adic s-ar pstra ,ipurile inifiale, paneurtale, de organsyne.* Cunoscnd c n meioz ar,e loc disjuncfia independent a perrechilor de cromozomi omologi gi qtiind c factorii ereditari snt plasati pe cromozomi, este ugor de tras concluzia c pentru a segrega ind,ependent unra de al,ta, cele dou percchi de fac[ori ereditari Ao Ei Bb tre{buie s fie plasate pe ,pe'rerohi diferite de cromozomi. Segregarea independeu:t a dou pereehi de factori ereditari, respeetiv de caracere n care apare naportuL de segnegare 9 :3 :3 : 1 poate fi uqon redus la segr,egulea a dou cara'cere aleilomorfe, dac se consider segregarea separat a fiecrei perechi de caractere. Astfel, oonsidernd pe,redrea Ao, fcnd abstractie de perechea, Bb r,aportul de segrqgare va fi
_t_

9.3 16'16 3l

t2 - - pentru factorul I 16^

4

gi

-t_ t6'16

l6

pentru factorul 6I sau simplificnd. va

fi

deci

3.1 14

adici 3A la \a

absraclie de perechea Ao.

Situalia este identic pentru perechea Bb, cnd se face

Peutru a cpta o anumit" certitudine, mai exact pentru a se asigura statistic c segregarea este o lege, Mendel a aplicat testul chi-pdtrat y2 l, ! n care se introduc valorile agteptate potrivit raportuloi " sgregare stabilit n alte experienle (9: 3 : 3 : l) gi valorile care se determin n experienla curent
actual.
independent a perechilor de factori ereditari imporqi n prac.tica a,meliorrii face oa din or,ganisme dubuihetn:ozigote de tip {AaBb, prin ,autofecund'are, s se oblin pe lng orgriulistele d,ublu homozigote inigiale (AABB qi aabb) noi categorii de organisme dublu
banti

* Disjuncfia

homozigote (AAbb pi aaBB) ca qi al,te oategorii homozigatn pentru o singu,r pereche de caractere (A,abb sau aaBb). Aceste,a, alturi de onganismele recombinante, pot sA reprezinte obiective irnportante n progr'amele de ,ameliorare.
163

Astfel, dac ntr-o experienf de ttp AABBXaabb se obtin urmtoarele dae (tabelul 6)
Tabelul 6
Caleulul lui

It pontru Eogrogatoa ln F, a raportului g: 3: 3: I

AB
2834 2808 26 676 4,24

Valcri
observate (0)

Ab
920 936
16

Total
951

a;teptate
Diferenfa dr Dr
e

(e)

936

(d:0-e)

t5
225

256

4,27

0,21

valoarea Lui Xz de 2,75 pentru cele 3 grade de libertate (4 clase fenotipice 1) corespunde l,a o probarbilitate de tr'ansgresiune care este mai mare de 0,30 dar mai mic de 0,50 (p inseamn c din 100 de repetri ale - 0,50 - 0,30). Aceasta unei experienfe date, la 30 pn la 50 dintre e1e vor apare devieri probaibile de la naportul 9 :3 :3 : 1, egale sau mai mici dect cele observate. Cum valoar,ee, lui p ese clar mai mare de 0,05, rezultatel'e observate pentru raportul 9 : 3 :3 : 1 sint n acord cu oele agteptate pentru asortrarea independent a d,ou perechi de alele. Repetabilita,tea 1,or cu o asmenea frecven! nu se poate datora ntmplarii ci mai curnd qqor cauze intrinsece a desfEurrii me'c,ansmului ereditar la nivelul c,Blulei dup anumite legi ,exacte. Astfel, segregarea apare egic determinat gi statistic asigura:t. Considerarea caracteruiui statistic al fenomenului ereditar se bazea'z p'e admiterea c fiecare dintre produqii meiozei (gametr) prezint qans egai de a participa n procesul de fecundare. Marile evenimen'te genetice se desfEoar ns n meioz. Cea de-a doua lege el,aborat de Mendel gste legea esortdrii sau. disjwtcfiei indepenlnnte ,a perechilor de factori ereditari (gene) qi se refer la gene oare snt plasate pe cromoz,omi
Niciodat gaarrefii nu vor fi Aa, Bb, ABb etc. dect numai n cazurile anormale, rare cnd are loc nondisjunclia meiotic a cromozomilor oare este nsofit n consecin! de nesegregarea factorilor ereditari. Cnd se fac ncruciqri ntre dou soiuri
164

neomologi.

pure, lundu-se n oonsiderare tnei perechi de factori ereditari (AA, BB, CC X dn bb cc) tabloul segregrii este mult mai cornp1ex. Asemenea experien?e se numesc experienle de trih,ibridare. Se 'oblin cte B tipuri diferlte ca genotip de gamefi att masculi ct qi ferneli Ei r,ezult 64 de oombina{ii dnd un r,aport de segregare de 27:9:9:9:3:3:3:1, ceea oe nseamn c frecvenfa de aparilie a formelor homozigoe este proporlional rnai redus dect n monohibridar,e sau di'hi'bridare. Segregarea independent a per',echilor de fac'tori ,ereditari, respectiv a perechilor de cnomozomi r,eprezint n sin,e un mecanism de recornbinare genutied, intercromozomnld. Acest tip de re oombinare genetic carac bertzea'z, doar organrismele eucariote cci doar ele conlin mai multe grupe de lineaj, r'espectiv mai mulfi cromozomi neomologi. Recombinarea inercrom,ozomal reprezint segregarea de cromozomi ntregi n' meioz care determin segregare,a de gene nelincate adic de perechi de alele localizate n cromozomi n,eomol,ogi. Fenomenul disjuncliei independente a per,echilor de cromozomi respectiv a perechilor d,e factori ereditari este de fapt un fenomen predeterminat de agZarea rand'omizat a om'ologilor din bivalenli fa! de planul ecuatorial al plcii metafazice. n virtutea acestui fapt, prorbabilitatea ca toli cromozomii de origine matern de la nivelul tuturor bivalenfilor s se aEeze deasupra planului ecuaorial sau toli cromozomii de origine patern de la nivelui tuturor bivalenlilor s se aEeze sub planul ecuatoriai al pl,cii metafaziae este egal cu pr'obabilitatea ca aceEti cromozomi de origini diferite s se aqeze unii deasupra, allii dedesubtul planului ecuat'orial. Asemenea agezare randomizat a cromozomilor d'e origin'e matern qi patern fa! de planul ecuaorial al p1cii metafazice n metafaza I condilioneaz distribu{ia independent a perechil,or de cromozomi, respectiv de factori ereditari spre poli n anafaza I. Din aceast cauz este corect interpretarea n termeni de predeterminare pe care o dm fenomenului de disjuncfi'e independent a perechilor de faetori ereditari. n absenfa uriri asemenea predeterminri factorii ereditari de origi,ne matern (AB) ar migra totdeauna la un pol,, pe cnd cei de origine paern (ab) ar rnigra ia po1ul opus, rezulnd doar dou tipuri de game{i (AB, respectiv ab), neexistnd posibilitatea apari{i,ei de gameli recombinanfi, (Ab Ei oB). Distribulia polarizat,a crom,ozomilor particulari ia un pol al fusului de diviziune are l,oc foarte r,ar qi duce la o asortane ner,andomizat $i 1a o segr,egare nerandomizat de markeri ge165

netici. Sqrqgarea independent a perectrilor de f'ac"tori' uditari respectiv a pereohil,or de cromozomi cane asigur necombinarea genetic intercromozomral face ca probatbilitatea ca doi garnefi s fie 'asemntori s fie,foante mic. Astfel, cunsidernd omul, catre aret n gamitura diploid 46 cromozomi, iar n gamefi 23 de cromozorni gi adrnifnd c n fiecare corlozm s-ar a,fla doar o gen, proba,bi,litatea oa doi gamqi s fie iden'tici grenotipic este o" (;)- iar ca doi indivizi um.mri s fie
identici genetic este de

(+ft.

Aceasta reprezint o probabili,tate

extrecn de mic qi este posibil ca n populalia uman de la originile sale s nu fl exisart doi iqldivizi asemntori. Ercepfie ar pu,tea s fac gemenii monozigoli care pot avea o constelalie identic de faretori, ereditari nucleari dar qi n acest caz pot s apar diferenle n oonstelatia de facori ereditari extranuclari (rnitoctndriai de exemplu), distribuirea mitocondriilor n timpull diviziunii fiind mai pufin echilibrat. Distri'bulia echili,bnat a fagtorilor ereditari nucleari este asigunat de mecarnismul mitotic de diviziune. Dar probabilitatea ca doi indivizi ai unei specii dae s fie identiei este qi mai mic dac lum n considera{ie faptul c pe fiecare cromozom n'u se sfl o singur gen ci mai multe gen. Consideirnd spe.cia uma,n rei,ese c fiecare individ este o enrtiste genetic irepetabil. Cercetrile lui' I\ttendel, au pus pia'tra de temelie a Geneticii. Publicate ntr-o rwist de sla,b circulafie sub titlul ,,Versuche ber Pflanzenhybriden( el.e au fost date uitrii. Savanlii timpului erau nc cu a'tenfia ndreptat spre teoria lui Darwin asupra originii speciilor prin seleclie natural, uitind de alte descoperiri tot att de geniale. Se spune c Meurdel nu a avut loc nr seool,trl lui. Elr a fost pur Ei simplu mutat n secolul nostru. Destinul luii qtiinfific a fos' qi mai dramatic dac ne gndim c Menilel a murit cu Bndu} c ceea ce a descoperit el s-ar putea s nu fie o realitate a naturii. Acest fapt s-a datorat efecturii unor ercperiernle de hi,bridare Ia Herupdwrn, plant apomictic, cane nu are deci o meioz ti,pic qi, cum este qi firesc, nu s-{a supus legilor mendeliene a,le eredi;t{ii. Cercetrile lui Mendel a'u revolufi,onat bologia. Pentru prima dat, dup 23 de secole, era drmat concep{ia lui Hippocrate despre transmiterea direct a caracterelor de la, prinli
tra descendenli. 166

Rel'uae 1o alte plante qi la animal,e, legile descoperite de Meerdel privind comporrtarea factorilor ereditmi s-au dovedit tmiveml aplioabile, iar excep(iile nu au fcut dect s currfirilre rqula, extinznd qi' dezvoltnd concep,m lui Mendel despre crndita,te.
4.3. EXCETTII DE LA BAFORTURILE MENDELIENE DE SEIGBEGARB

CAZUBI PABrICUTIIRE DE ENEDITAE

1.3J-.

NMTNANTA INCOMPLETA SAU SEMTDOMTNANTA

Corrtns, redescoperitorul legilor lui Mendel a,lturi de Tschermak qi Hugo de Vries, ncruciqnd un soi de Miruhilis jalng cu ftro.ri roqii (AA) cu 1rr, soi cu flori aXbe (aa) a oblinut n prima genera$e tritbrid (Aa) doar plante eare foeau flori noz. Prin autopolerrizae, acestora (Aa X fu) a ob.tinut n F2 un raport de segregare diferit de cel mendelian ob$nuit (3 : 1).

Amta a fos't de 1 : AA :2 Aa : I u. Dup cum se vede, n acest

otu toz
alb

2s%

50% 25%

rapul de segrcgare Senotipic corespunde cu raportul de segregane fenotipic, iar homozigo{ii dominangl (AAJ se exprim fenotipic diferit (rogu) de heterozigoli (roz). Gena A n,u se marrifest ca, totatr dominrant asupna lui ,d' iar ,pf' nu se ilnanifest ca total, recisiv fat de A. Cele dou gene se nranifesG cu intensi,tat egal. Fenomenul s-a numit dominsnPd
caz

incomple sau sqnidsrnirwr4d. 'n experienfele pe maere era o domirran! complet qi segrqarea in acest Gaz s-a numit segregame de tip Piswn. La Mirabils este vorba de o dominanf incomplet iar segrqgarea sra numit de tip Zm cci fenomenul a fost prima dat observa,t lia porumb prin ncruciEarea un,ei variet{i' cu 'boabe albastre cu o varietate cu rboabe albe din caFe au ie.qi,t plante hi'bride cu boabe violacee. Tot astfel din ncrucigarea unor gini cu penaj negru cu gini cu penaj ,alb, rezult gini de Andaluzia care au penajul al,bastrui. Cum ginile de Andoltns, (cu penajul albstrui) snt impure genetic (,hihride) ele segreg n fieoare generafie, din care cauz n-a fost posibil crearea unei, r'a$e de gini cu penajul albstrui. La om, cel' mai cunoscut exemplu de dorninanf incomplet este oel al anemiei falciforme. Gena muta,n s conditioneaz
r67

sinteza unei forme mutante a catenei 0 a hernoglobinei qi facc ca s apar hemoglobinra HbS n loeu1 hemoglobinei normale HbA. Indivizii hom,ozigoli s/s de regul mor nainte de maturitate, prezentnd anemia falciform. Heterozigolii Sis snt viabili qi prezint eritrocite f,aiciforme, dar anemia 1or nu este att de sever ca la indivizii s/s, prezentnd numai tultburri de respiralie ia altitudini mari, unde oantitatea de oxigen e redus. Cnd hemogiobina unor asemenea indivizi este analizat electroforetic se constat c aceasta oonfine carntitli echimolare de catene normale gi de ca'tene muante {3. Acesta ar fi un caz Ce codominnnfd, dac se consider ,,fe,notipul in vitro((. Aceast,a nseam. n c ambeie gene S gi s funclion e'az cu aproximativ aceeaEi eficien{. Dominanfa lui S este incompiet, dar adesea se consider c cele dou alele S si s snt codominante.
4.3.2. SU P RADOM INNTrr

Cnd fen,otipul heterozigotului (Aa) depqeqte prin caracteristicile sale cantitative ambii genitori homozigoli se nregistreaz. fenomenui de supradominanfd. Supnadominanfa s-a nr,egistrat n cele mai multe cazuri n care se ran,aliz eazi mrilecesirr (zp) iar gena care determin culoarea ro$ie, norm,al a ochiior este dominant (tn+).n stare hetenozigot fu:+/tr.:) se constat o creqtere notabil a cantittii de pigmenfi (n speci,al a sepiapterinei) att fa! de homozigolii cu .oohii abi (u/u:) ct Ei fala de homozigolii normali (u+/ut+1
mea, pr,oductivitatoa qi via,bilitatea descendenlilor. De. exemplu, la Drosophila, gena care deterrnin culoarea alb a ochiLor este

n cazul codominanfei genotipul heterozigot d nagtere la un fenotip diferit faf de ceie det'errninae de genotipuriie ,homozigote. Aoest fenomen se nregistreaz qi n semidominanf (dominan{ incomplet). n cazul codominanlei ns, spre deosebir,e de semidominan{, genele alele ,nu au raport de dominan! sau recesivitate, ele fiind dominante faf .de, alte gene
168

dintr*o serie de mai multe alele, dar codominante uura n raport cu ceaalt. De exempiu, la om grupele sanguine au un determinisiu genic'polialelic. Grupa sanguin A are formula genotipic 14^ homozigot dominant sau l l0 heterozigot. Grupa sauguin B are determinismul genetic LIB respectiv
Grupa sangvin 0 are determinismul genetic 1010. n toate aceste cazuri alelele I ;i lB se manifest ca dominante fa! de alela /0 care este recesiv. Cnd. ns cele dou alele dorninante se ntlnesc n genotipul indivizilor cu grupa sangvin AB, care are deci formula l^lB, nici una dintre ele nu manifest dominan! sau recesivitate f.a!" de cealalt. Ele codomin . fl c9.1d!!io-neaz. apurt.fia.,unui nou fenotip (gtop.* sangvin AB) diferit de cel al prinlilor (mama grupa sangvin A, tata - grupa sangr;i1[ B sau viceversa). Un exemplu tipic de cod,ominan! es'e locusul esterazei- de la Drosophila melonogaster. Una din cele d,ou alele ale ecestei gene pr,oduce o form F ce migreaz rapid (fcrst rnigrattng) pe gelul electroforetic iar cealalt alel produce o form S a enzimei esterazice, ce migreaz neet (slous migroting). Analiza extractelor din indivizi heterozigofi, desemnali F/S arat c cele dou tipuri de enzim snt prezente n cantitfi tga,le. Prezcnfa unei proteine nu are vreun efect aparent asupra eantitlii sau activittii eeleilalte enzime. Asemenea enzime se numesc ismime. Majorita'tea wozlrnelor snt d eterminate printr-o interacliun e al,elic de tip codominan!, gi ele se pun n eviden! n extracte celulare nu prin analiz fenotipic propriu-zis a ntregului org'arrism cci indivizii F/F, F/5, S/S nu pot fi deosebili dup tenotip, ci doar prin analiz electroforetic, tipuriie homozigote prezennd o singur band electroforetic pe cnd tipul hetenozigot prezint dou ,benzi, una F, alta S.
ALELE LTIPLE (POLTALELTA)
Fl.

4.3.4.

MU

Alelele reprezint alternative ale ace,leiagi gene, contro.nd expresii diferite a,le aceluiaqi caracter. n urma mutaliei genei de tip slbatic care de regui este dominar,rrt (A) apare alel,a sa reeesiv (o). Mutafia este mult mai rar n sens invers
169

Genele la organismele diploide se afl sub form de pereche (alele) Ei snt dispuse n, acelagi locus F cromozomi' omologi. Fiecare din crei doi cromozomi ,omologi ai unei perechi va oonline ,n, ,locusul corespunztor doar cte o alel dintr-o pereche de a'lele ,ale unei gene, fie A, fie a. Niciodat cel,e dou alele nu vor fi plasa,te (suprapuse) n aceleqi locus, pe acelaqi cromozom. Proc,esul de mutalie s-a desfEurat progresiv n timp qi el a dus mai nti la aparilia din gena inilial A a alelei sale reces,ive ,,at6. Dar ntr-o alt etap, din aceaEi gen inifial A, & putut deriva alela,q care controleaz o alt expresie a raceluiagi caracter. Mutalia genei A, desfEurat nx diferite sensuri a determinat aparilia unei serii de alele 'c1, @' o3 . . . ant care controleaz varia{ia expresiei aoeluiaqi caracer. Asemenea gene poart numele de polialele sau otrele mttlbiple. Seria h, o2, as. . . an este o serie polialel. Toate aceste alele ocup acelaqi locus pe cromozomii omologi. Aceasa nu nseamn c toate alelele vor fi plasate n acelaqi timp, ntr-un singur locus pe perechea de cromozomi omologi. Fenomenul polialeliei este un fenomen populafional, ceea ce nseamn c la unii indivizi ai populafiei considerate, pe o perectre de cromozomi omologi se afl ntr-un ltocus precis delimitat perechea AA; la alti indivizi pe areeagi pereche de cromozomi omologi, n acel,aqi locus, se va afla pe'rechea are, la alfii ortla q.a.m.d. La indvizii heterozigoti pe tln crornozom omolog, nr-un locus dat se va ,afla alela dominant A, ar pe cella1t cromozom omolog, n acelaEi locus (locus corespunztor) se va aflta fie alela r,ecesiv a1, fie ale,Ia re-

(a-+A).

Cazul citat la codominan! este n acelaEi :timp un caz de polialelie. Cele rei gene IA, Iu $i 70, ocup acelaqi locus pe cromozomii omologi qi oontroleaz variafia grupei sangvine n populafia uman, fcnd ca unii ilrdivizi s ai,b grupa saqgvin A, alfii grupa sangvin B, al,tii grupa sangvin AB qi af{ii gru-

cesiv a2'etc.

Exist un principiu fundamental al imtrnoltogiei potrivit cruia ur orgarrism, n condilii normale, ru va produoe anticorpi mpotriva sa. Astfel, dac una di,n,trre proteinel'e produse d,e un organism este antigenul-P, atunci anticorpul anti-P nu se va produce n serul aceluiaqi organism. Eri,trocitele umane prezint antigene, pe cind serul sarugVin oonfine anticorpi. Cnd serul de la un individ cu grupa sangvin A se amestec cu eritrocitele de la un individ cu grupa sangvin B, apare r.eacfia de aglutinare. Tot la fell se nf;impl cnd serul de Ia indivizi cu
170

pa sangvin 0.

grupa B se amestec cu eritrocitele de la indivizi cu grupa sangvin A. Pe de alt parte, amestecul de ser qi de celule de la acelaqi imdivid, sau mai exact de la indivizi care au aceeaqi grup sangvin nu determin ooa,gularea. Aceste rspunsuri' diferite snrt determinae de o clas de antigene localiaa't pe suprafafa eritrocitelor. Astfel, altea dominant f' specific antigenul A qi anticorpi anti,-B, alela domi,nan 18 specific antigenul B Ei anticorpi anti-A, iar alela recesiv 10 mu specific nici o structur anigenic. Analiza biochimic a eviden{iat, faptul c antigenul A este o o-N-acetil-D-galactozamin, atagat de un gl,icolipid sau glieoprotein, aflnte la slrprafala eritrocitului. Antigenul B es@ o o-D-galactoz. Persoanele cu grupa sangvin A au enzima a-N-acatilgoloctolm.nltransfetwn care ata$eaz galactozamin'a la l,ipidul sau proteina de la suprafafa eritrocitulr.ri. Persoanele cu grupa sangvin B posed q a-D-galncbsilhwtsfeonzd care a,taqeaz galactoza la compugii de pe suprafafa eritrocitului. Pensoa^rrele cu grupa sanrgvin AB au amrbele tipuri de antigene qi deci ambele tipuri de enzime, aparnt n canitti echirnolare (alelele Io Si IB snt codominante). Serul persoanelor cu grupa sangvim AB nu oonline antioorpi an'ti-A, nici, anticorpr ani-B, din cane cauz persoanele cu Brupa sangvin ,48 snt primitori r,uliversal.i de transfuzii
de snge.

Alela -10 nu condilionaz sinteza weunei enzime gi persoanele cu rupa sangvin 0 nu prezinrt antigene A qi urici anrtigene B. Eritrocitele lor sfurt nutne, dar n serul lor se afl att antiaorpi am.rti-A ct qi anticorpi anti-B. Pentru deeearea celtor patru fenotipuri se folosegte neactia de a,glutimarre (fig. 48) cu dou tipuri de antiser (anticorpi) anti'A gi anti-B, conf,orm ta'beului 7. Ier,anhi,a dominanlei celor trei atele este ,(7o : 18) > l0 (tabet S). De regul o alel necesiv (precum este atela l0) care specific o pnotein fur,activ es,te rar comparativ cu alela sa dominant (aqa cum sn alelele fA sau 1"). n cazulr acestor alele ns rapare o @(cpfie de la regul, cci persoanel,er cu grupa sangvfur 0 sflnt muL mai frecvente n popul,afia uman dect persoanele cu alto grupe sangvine, ceea se nseamn c frecvenla genei I0 n populafia um,an este marne. Exist o anumit distrirbufie geogrrafic a grupelor sangvine n populafia uman. Cea mai constant disritbufie o are grupa B. Frewenfa cea mai mare es,te nrqisrat n Asia cenral gi este de 25-300/c. De aici, frecvenfa drescnegtc n toate di-

t7t

Donor (cnhgerc)

G-,ps
Singe

,Je

("

1i + F

,\ *_ */

rol it
L_

__l
genele celulare.

Fig. 45. Acfiunea serului de la peso&ne cu gnlpe sangvine v.riite (receptori)asupra d.iferitelor tipuri de eritrocite (donori).
Aglutinatea celuleloi indic reacfia anticorpilor serului cu anti-

'
Roaegia de aglutinare

Tabelul
sangvlnG

in stabilirsa eelor patru fenotipuri ale grupel

,ArA
tAr0

sau

Galactozamina
(A)

anti-B I B, AB

A9i0

t&" "^t tBto

Galactoza
(B)

anti-A I A, AB
nici un tip
anti-A *

Bqio
(primitor

Galactozamina

(a)+

A,B,ABgi0

Galactoza (B)
toto

Nci ua tip

A,B9i
AB

f anti-B

Numai de la (donator uni

sal)

L72

Tabclul g Btabllirea grupelor sanguine ale eopiiilor rezultafi n eAstorla unor persoenG su rllforito grupe sangvlne Ee laeo dup urmAtoarea sehemA: Grupa sanguin lfenotip) Formula
genotipic

a pArinfilor

posibil
1010

Formula genotipic a copiilor

0x0 0xA 0xB

OxAB

(f enotinur) | "ron" t copiilor i

sanguin

x x y

1010

lolo X lic,lAj --"--l

rtn *- iArn 1010 la10
1010':

I loio I raro lal0

I

lAlo gi
lBlo

l.olo

Asau0 Bsau0 AseuB

A

X lBlB
1B1o

f'--U:r
lala x lal-{
1"r"
lalo x lalo

1o1o'

lBio $i lolo
1 1o gi lAIA
1n1o

r_lg
lBlB
1BlB,
1B1o 1B1o

lalArSi lAlo lAlA:gf lolo

IAlB
e1e1B qi.1B1o

lala x

Asau0 ----_ AB
AB, B A, B, AB, O
AB, A
B B

AxB

lalo x
14,10

1a1A

1 ;

lA,lB, lAlo. 1810. 1o1o ?talB, lAlo

1B1Bl y,1B1B

;a'1410 tBto x lBlo 1B1B I 1a1n lBlrry talB 1a x lAlB

1B1B-

lals | tola 9i ltlo

I ltlE, lplo: ,i lolo I t^tt qi lBtB I tAlB, tnt., latl tBla I lap, IAJBIB

Bsau0
AB sau B AB, B, A A, B, AB

reciile, a,jungnd n Franfa qi Angla 1a 5-t00/0, iar n populatiile naturale ale Australiei $i Americii de sud este foarte
mic sa'u nul. De asemenea, o distrirbufie asemnto,are se nregistrcaz n Africa, unde fnecvenfa gen'ei 18 este oe, mai mare rl Congo, de unde descreqte n toate direcfiile. Gena 7o, prezint frecvenla cea mai mare n Europa de Vest, Australia qi unele zone din America de Nord. Modelul su de distribulie este mai universal, dan mai putin regulat. O frecven! mai mare a sa se nregistreaz n populafiile diil) Tibet, la boEimanii din Africe de sud, pigmei din Congo, negii din Fitripine Ei unele populalii din sudul l,rdin.

L73

mai frecvent in toat trumea, dar cea mai apare n populafiile natunale din Ameftratt^ frecven! rica (indien,i americani), n r-urele regiuni al,e Afriqr" Au^stralia gi Orierrnl mijlociu. n Europa 8 lue o frecventa de 5l4go7r. Unele triburi de indieni americani prezint fiecventa de 100f^ a genei 10. Altele au o frecven! de 490/o I0 Si 1tt/o IA sau
Gerra I0 ese
cnea

(750/o)

n cazul cstoriilor A X 0, B X 0 sau AB X 0, in ca,r'e fe0 apare o r,educre cu 250/o a niumr-ului de oopii cu grupa sangvin A sau B. Indivizii cu gralpa sarlgvin 0 produc in terul sangvin anticorpi A qi B.- fo timpyl, viei intrau-terine, unele celule sangvine de tip A, formate de fo'eiusul A, intr n circulafia sangvin a mamei (mai ales fur timpul naqterii cnd se rupe p}acenta) qi acfioneaz ca rr,tigene care stimuleaz producerea de antioorpi anti-4. La naq'"terea urmtoare anticoipii formafi n tirnpul sarcfurii preoedente trec
meira are grupa Sanvift n, circulafia sangvin a

B7o/s 10 Ei L3o/o 74.

ftului, producndu-i moarteaAsemenea Asatorii dintre femei cu gl:upa 0 qi rbr'bafi cu alte grupe sangvfure se numes c AB0-incom'patibile. niistg de asemenea o corelafie direct dintre grupa sangvin 0 Ei incidenta uloerulnri duodenal, persoanele cu grupa, saqgvin 0 prezentnd o probabilitate de 400/o mai mate d:e a face boale, fa! de persoanele cu celelalte grupe sangvine. .au mai fost descrr$i qi atli loci georici ce scific qi La om alte antigene ale grupelor sangvine. AEa sin detenminan$ti genici M, N gi Rh.
5. FACTORUL Rh

;i

Stud.iindu-se asemnarea imunologic dintre sngele uman cel al maimalei Maccacus rh,esus, s-a constatat c serul iepuriior imunzal cu, eritrocite de maimu! d o puternic reaclie de aglutinare a eritrocitelor la un numr mare de oameni. S-a admis c oamenii pot conline un factor responsabil de aceast reaclie, factor desemnat Rh, de la denumirea speciei de maimuf. Ulterior s-a dovedit c factorul este ereditar gi reprezint alelele rh+ (Rh) ;r rh (Rh- ) ale aceleiagi gene implicate n determinismul reacfiei imunologice. Alela d.ominant rh+ (Rh) condifioneazi reacfia de aglutinare, pe cnd. alela recesiv rh (Rh-) nu determin reaclia de aglutinare. Oamenii pot avea d.eci Rh pozitv ;i Rlz negativ. Cnd cuplurile parentale snt homozigote, nu apar probleme de aglutinare gi descendenlii se nasc normal. Complicaliile apar ns atunci cnd tata are Rlt, poztiv iar mama
174

h-

Rh-

ei
t\

Rh+ Rh+

of

Rh- Rh+

(coPii hetcrozigolil

x Rh. Rh- o /\ + /\ 50%Rh+ Rh( nn Pozitivdar

62Ss7s2i

Rh+ Rh-

ol

50'/o

Rh-Rh-

(Rh negativl

gati )

Fig. a9. Transmiterea factorului Rh.

sangvin a mamei gi d,etermin aici formarea de anticrpi antiRh.- Anticorpii apoi ptrund n circulafia sangvin a ftului. Viala acestui, dac e vorba de prima sarcin nu este periclitat, dat.fiind faptul c titrul anticorpilor nu este prea ridicat. Prima nagtere se desfgoar normal. La a doua nattere ns, embrionul heterozigot (rh+rh- ) d,etermin gi de aceasti dati, prin prezenla factorulu rh+, sintez d.e anticorpi anti -rh n organismul matern. Titrul anticorpilor ant-Rh sintetizali la a doua nagtere se adaug aceluia realzat la prima nattere, dublndu-se. Mama este imunizati a!, de antigenul rh+ de la sarcina precedent prin anticorpii deja prezenlf n corpul su. Dar acegti anticorpi ptrund n circulalia sangvin a ftului gi, fiind n cantitate mare, determin o puternic reacfie de aglutinae a eritrocitelor ftului. Aceast reaclie de aglutinare st la baza malad.iei eritroblastosis foetalis, n urma creia ftul moare. Accidentele d.e eritroblastozi pot fi prevenite fie prin transluzli masive de snge prin care se nlocuiegte o parte din sngele matern, reducndu-se astfel titrul anticorpilor, fie prin scoaterea ftului cu mult timp nainte de termenul na;terii (corespunznd perioadei n care titrul anticorpilor cregte exponenfial) gi cregterea lui n incubator. Snt nc d.ispute privind natura locusului Rh. Unii admit c este vorba de un singur locus genic cu mai multe alele, pe
L75

Rh negativ fig 49. n acest caz se nasc copii heteroziggli (rh* rb+ xih- rh- - rh+ rh-). La prima sarcin, antigenul specificat de factoral rh- al ftului heterozigot ptrunde n circulalia

ca gi n populaliile indiene ale Americii ;i Australiei. Alela rh+ are o distribulie mai neregulat, prezentnd totodat mai multe tipuri. De exemplu, tipul .RZ0 sau cDe are o frecven! d.e 5o/o n populaliile europene, chineze, indiene americane gi aborigene australiene ;i 600/" 1a negrii africani gi pigmei" IIn alt tp, Rh 1 sau CDe are o frecven! de 55% n popuialia european, S 600/" n populaliile asiatice, 58% n populalia de aborigeni australieni gi numai 25% n populaliile africane gi indiene americane. Persoanele cu Rh negativ produc anticorpi fa! de celulele rogii Rh poztive, dar nu are loc gi o reaclie revers. Un interesant fenomen de polialelie a fost descris la Drctsophi,la melanogaster, la care dferitele nuanle a1e culorii ochilor snt determinate de o serie polialel. Astfel, tipul slbatic are ochi de culoare rogie, nuani determinant. de gena dominant 7p1*. Diferitele nuanle ale culorii ochilor, aitele dect culoarea rogie, se manifest recesiv fa! de culoarea rogie a tipului normal. Aga snt culoarea coral, determinat d.e alela , culoarea sngerie (blood,), determinat de alela ubl, culoarea eosin (trf), ciregie (cherry - w), honey (), buff (u\, tinged (ut), pear (r) Si iaory (zai). Alela u este recesiv fa! de toate aceste alele, descrise mai sus gi determin n stare homozigot (ulu) culoarea alb (uhite) a ochilor la drosofil, ea condilionnd absenla oricrui pigment pentru culoarea ochilor. Celelalte alele conditioneaz" producerea unor cantitli variabile de pigment, ele fiind recesive fat de alela u+ dar dominante unele fa! de altele, ordinea descrescnd a dominanlei fiind I
19* nW@ *U)bl ->Uc ->ZlF -*Wi *Wb -->,tyt -*W0 *Uti

cnd allii consid.er c n determinarea acestei reaclii de tip antigen-anticorp intervin mai multe gene strns lincate (sistemul c d t), fiecare cu o a1el dominant gi alta recesiv. Alela recesiv rh este cea mai frecvent (55%) n populafia basc a Spaniei. n Europa, frecvenla genei rh ste de-4}o/o, n Africa de 23o/o iar la negrii american 28%. Ale1a este foarte pulin frecvent sau chiar absent n populalia chinez gi japonez

*tD.

Culoarea ochilor la om este tot un caracter determinat prin alelism multiplu. Seria polialel n acest caz redat n sensui descregterii dominanlei este urmtoarea:
*E

(ochi negri) -> E3t (ochi cprui-verzui) -> Eb, (ochi albagtr: Eb- E3t (ochi negri cu reflexe verzui)

176

6. VARIANTELE ELECTROFOREIICE

$r sEMNrncaTIA LOR
Blectroforeza s-a dovedit a fi o metod foarte util n studiul genetic al populafiilor, n starbilirea relafiilor interalelioc

ductor const din tampon menlinut ntr-un mediu de susfinere hrtia de filtru, acetat de celul'oz sau gel agar, amidon sau poliacrilamid. Moleculele id,em'tice migreaz cu aceeaEi rart qi dup o perioad dat de 'timp se vor ooncentra ntr-un acelaEi punct n mediu formnd o band distinct, bine delimitat. Datorit structurii sale particulare n aminoaeizi, fiecare protei,n are pe de o parte o form gi o dimensiune caracteristic, iar pe de alta o ncrctur electric net pontiv sau negativ. ntr-un cmp electroforetic, are loc o separare clar a diferitelor tipuri de mol,ecule proteinice. Mobilitatea electroforetic reprezint un crieriu fenotipic de studiu al structurii genetice qi variabilittii, iar puterea sa de rezolufie este att de mare nct pot fi decel,ate diferen(,e dintre dou peptide de ordinul a numai un aminoacid. O protein consta dintr-o singur caten polipeptidlc (rnonomm), din dou ca'ene polipeptidiee (dimu\, din trei (trimer), patru (tetrarner) sau mai multe catene polipeptidice (maltim^er). Fiecare caen polpeptidic este sintetlzat de cte o alel. O protein multimeric poate fi format din catene polipeptidioe identice sau neidentiee. Dac are loc omogenizarea drosofilelor omorte ntr-o solufie tampon Ei omogenatul este supus electroforezei, se poate studia modelul ,el,ectr,oforetic aI unor enzime cum ar fi enzimel,e esterazice specificate de locusul est-6. S-a cons,tata c anumite stocuri de musculife difer prin mobitri'tatea electroforetic a esterazelor, unee prezint esteraze c se deplaseaza rapid ntr-o unitate dat de timp, formnd o rband numit ,,Fs de la cuvnul englez ,,fastc. Genotipul unor asemenea musculile este considerat a fi FF. Ale stocuri de muscutrife au un tip de estqozd-6 care se deplaseaz ncet n aoeeagi perioad de timp, formnd o ba,nd numitA ,,S( (de I'a slow) avnd genotipul, SS. n urma unei ncrucigri FF X SS rezult n F1 indivizi heterozigofi (FS) care prezint ambele modele electroforeponos precum
1,2

qi n studiul fenotipului, la nivel molecular. Principial ea se bazeaz pe faptul c moleculele care pnezint o anumit ncrctur electric, suspenda,te ntr-un mediu aonductor de electricitate vor migra n cmpul electric spre polii acestuia, n func{ie de natura ncrcturii lor. Mediul con-

Descifrnd tainele ereditfii, vol. I

T7T

sau subunitti Produse de fiecare alel (fig. 50). Rezulit c duP modelul el,ectroforetic, enzima este' direclra de raz-6 este o protein moii,|irii"" !' s F.s iteior nom,eric. Faptul c ln heFenot ip F terozigoli apar ambele mo6 enotip F F FS , ' .ss dele electroforetice corespUnZ,toare att, alel,ei, F Fig, 50. Reprezentarea diagramatic a fenotipurilor bectroforetice privlnd euzima ct Si alelei S nseamn c esteraz6 6 la D. T9*ogaster (din ese vorba de o rela{ie de Levine, 1973). codominanf dintre cele dou alele. Studiu electroforetic al fosfatazei, a,lca,liiure la drosofil a rreleva aparifia n F1 a unei tbenzi, de morbilitate intermediar FS care repr"ezint de fa,pt o protein hi,brid. S-a apreciat c enzima este un dimer care ln sare homozigo este reprezentat de caene polipeptidic,e identice, pe cnd n: stare hetenozigot poate fi, format fie din subunitfi identioe, fi,e di subunitfi neidentice. De asemerf.e,a formarea unei benzi inermediare, suplimeinrtare bnzii F gi ,benzii, S, indic exist'enfa unei rel,a'fii de oodominanfia dintro alele. Desooperirea unei a,lele O oane oondilion'eaz a,bsenla oricrei ,benzi' ,pe eoloama electroforetic indic existenfa, n de,terr:ninismul genetie al fosfatazei alcaline, ,a unei serii polalele (4 s $i o). Din com'binrafia S X O r,ezult ur fenotip SO n cane se manifest un fenornen de dominan! inr,complert. Electr,oforeza a deveurit astfel r-nr- xclent mij[oc de decetrar,e indirect a genotipului prin auraliza fenotipului la nivel molecular. Tot un caz de polialelie se ntlnegte gi n determinismul genetic al culorii blnii la iepuri de cas 9i a fost evidenliat prin ncrucigri dialele ntre iepurele albino (rt) complet lipsit de pigment melanic, himalaiai (ch) de culoare alb, dar cu extremittile de culoare neagr gi chinchilla (t',) de culoare gri gi tipul slbatic (CC) de culoare neagr. Alela C este dominant fa! de toate celelalte alele (tabelul 9). ferarhia dominanlei este

!!

tice Pentru enzim, nfiind o combinalie dintre diferi,e r:nitfi Proteiniee

Cebc.
L78

Tobclul 0 Scrla dc alele pentru plgmontaa

blnll la lepurl

Fenotipuri
negfu Chiuchilla

Genotiputi posibile
CC, Ch, 66h, Cc
cch Ch

gri

deschis

Cch dah,

CghC

himalaian albino

chcL, chc
cc

7. INTERACTIUNEA GENEI,OR

raporturiile mendeliene. Perechib de gene car'e interacfioneaz, nu ocup 'acrelaqi looq^s .pe cro'Inozomi omol,ogi, ci ele snt plasate fie fur [oci di'ferifi pe ala$i cromozomi sau n cromozomi diferiti, neomoLogi. Ase,menea gene sint nea,lele. Interacfiunea genelor nealele poate schimba uneori felurile fenotipului fr a schimba numrul fenotipurilor. De asemenea cnd. dou perechi de gene nealele afecteaz acelagi caracter, numrul fenotipurilor poate fi mai mic dect numrul genotipurilor. Genele nealele pot interacliona contribuind prin catenele polipeptidice pe care le specific 7a alctuirea unei molecule complexe care servegte ca produs genic funcfional. Holoenzima transcriptazei de la E. coli (arpB'oor) este codificat de 5 gene nealele d, p, p', ar gi o . Tra fel, enzima lactic dehidrogenazl de la om gi alte animale reprezint un tetramer (ArBr), cele patru catene polipeptidice fiind specificate de d.ou gene nelincate A gi B, care cod.ific catene d,e aceeagi lungime, d.ar care au secvenle diferite de aminoacizi. Se pot produce cinci tipuri de molecule de lactic ilekidrogenozd, care difer n reaclia 1or fa! de diferite substraturi An, ArBr, ArB, gi Ba. Tati deci c d.oi loci produc n mod normal 5 produgi funcfionali. Se cunosc, ns gi alele rare ale locilor z{ ti B gi indivizi hibrizi care pot forma f2 tipuri diferite de lactic dehidrogenazi. Un al treilea

Snt numeroase cazurile n carre prrtru exteriori,zarea unui singur caraser colaboreaz mai multe perechi de g,ene d'in ineracfiunea crora pot apare n F1 oaractere cu totul noi, iar n F2 apar allte rapor-Luri de sqgregare ce se, ab,at aparent de la

t79

locus C codific o alt polipeptid care intr n alctuirea enzimei lactic dehidrogenaz, din testicule gi spermatozoz, crescnd numrul potenfial de lactic-dehidrogenaze diferite ce se pot forma n lesuturile germinale. n acest caz interacliunile genice apar imediat dup traducere, nainte ca produsul genic s fie plrs n circuitul metabolic. Diferifi loci nealelici care codific acelaqi produs sau un pr,odus similar se numese izoloci. Nonalelele de la nivelul izolocilor se numesc izogene. n cazul enzimei lactic dehidr,ogerLaza pot interacfiona trei izoloci spre a produce mai multe izoenzime similare lactiedehidrogenazice care s-au numit isozime. Izol.oci sub forma a dou perechi de gene duplicate sn impiicafi n determinaro pigmentafiei pielii la om qi a cariopsei la gru ca Ei a pigmentaliei unor flori. Tipurile de ARN gi ARNr pot fi codificate de izoloci. La E. coli se par'e c exist gene unice pentru fiecane tip de ARN. La drosofila exist circa 60 izoloci pentru ARN reprezentnd circa 750 gffi, localizate n circa 100 si,turi n tot genomul. Exist deci n medie circa 12 izol,oci pentru fiecare tip de
ARN.

Un caz de interacliune a genelor fr a se modifica raportul, de segregare, dar care duoe la apari ia de fenotipuri noi a fost ntlnit la ncruciqarea dintre rasa de gimi Wgandotte cu creasta tip ,,trandafirs qi rasa de gini Bruhmns cu creasta tip ,,m,azre66. Cele dou caractere snt dominante fa! de tipul ,,creast simpl36 ntlnit la rasa Leghortt. Bateson gi Punnett au admis c tipul de creast ,este determinat de intenacfiunea a dou gene nealel,e R 9i P.

x rrPP Wyandotte Brahmas

RRpp
RrPp creast ,,nuc" Din interacliunea genelor doRrPp x RrPp minante R gi P apare un nou 9/16 RP creast ,,nuc" fenotip-creasta ,,nuc." iar 3/16 Rp creast ,,trand.afir" din interacliunea genelor re3/16 rP creast. ,,mazre" cesive lri !. apare alt nou fe1/16 rp creast simpl notip, creasta simpl.
180

Se cunosc ns qi oazuri de interae{iune genic n care are loc att schimbarea raportului de segregare ct qi aparifia de fenotipuri noi. Acestea snt complem.en'taritatea, epistazia Ei polimeria.

S. COMPLEMENTARITATE GENICA Este fenomenul prin care, din interacliunea a dou sau mai multe gene nealele rezutrt o expresie fenotipic diferit de aceea determinat de fiecare g,en n parte. Genele comple-

mentare pot fi dominante sau recesive. Se deosebe$te o complemeultaritate dominant qi o complementaritate recesiv. n eazul complementaritd.lii dominante este vorba de o interacliune dintre gene nealeie n care exprirnsre unui anumit caracter necesit prezenla concomitent a dou sau mai multe alel,e dominante. Astfel, Bates,on gi Punnett au ncrucigat dou varietli de Lathyrus odoratru cu flori albe qi au oblinut n F1 plante cu fl,ori r,oqii. Aceste plante din F1, auopolenizate au dat o descendent n F2, oar a segregat n raportul de 9 roqii la 7 alibe. Simbolizat, experienla arat, astfel:

AAbb x alb
F,
AaBb
AaBb roFr

aaBB
alb,

AaBb

*9/16 AB I
3lt6
3116 aB

rogii

\7 albe t1rc au I

Ab I

Pentru apa,rifia culorii roqii a petalelor, este necesar interaefiunea a dou gene nealel,e dar n stare dominant, A Si B" Toate oombinafiile n care n stare dominant apare doar una din aceste gene nealele oondi{ioneaz culoarea alb a petaLelor. De asemcnea, culoara al'b este determinat qi de alelele recresive ale aceslor gene nealele. Abaterea de lb raportul mendelian de segregare este numal aparent. Altfei, chiar qi acest fenomen de comptrementaritate confirm tegite mendeliene ale segregrii.
181

genic a fost observat cnd s-a studiat ereditatea formei capsulelor de la ,traista ciobanulnri (Ch:pselln bu;rsvl-paseor*). ncnrcis,ndu-se o varietate cu capsul riunghi,ulara cu o uarietate cu capsul,a ovoid se ob{in n F1 plante cu crapsule triuqghiulare. n Fz apare un raport de segTegare de 15/16 pliante cu capsula ,trir:,nghiular qi l/16 p,ant cu capsula ovoida. Simboliznd experienfa se poate scrie:
.

Exist qi o cornplemcnfuritate rer,esi,u, in sare manifestarea unui a,numit caracter ,necesit prezenfa ooncomittsnt a dou sau mai multe gene nealele, recesve. Acest tip de interacfiune

triunghiular |

A1

ArAsAz x

rarz3z

Fl

ovoid Ar er As aa triunghiular

F2

Lini,a (-) A2) fie a celei recesive (a1 sau a2). Rezul,t c pentru a se exprima caracterul de cupsul ovoid, tr.ebuie s interacfioneze dou gene nealele in ltare reoesiv (q $i oz). S-a co,nstatat c aceast plant este un tetraploid prezentnd nu doi cte doi cromozomi omolqgi, ci patru cte patru cromozomi omologi pmrtru fiecare pereche, din care catrz s-a creat lrosilbilt'atea duplicrii genirce prin poliplloidie, rezultf,,nd gene similare ca acfiune 'dar care snt, nealele situate n, iloci diferi{i, moqtenindu-se ind,ependent.

| t6 r ?r z 4z l/16 ovoid semnific prezenfa, fie a alelpi dominante (A1 sau

1/

I autolrclenizare Ar-A'- 3ll6 Ar - &z &z i tSTtS triunghiular 3/16 ararA2e/16

9. GENE INHIBITOARE SAU INERACTIUNE DOMTNANTa $r RECESTVa

Gene inhiibioare domin'ante au fost observate la mumeroase organisme. La psri, din ncrrrciqa,rea rasei, Leghortl (penaj alb), cu rasa Wgwdoe (penaj alb) se obtine n generafa Fr psri cu penaj altb, ia'r n genenalia Fz'rezult o proportie de
182

13 alh :3 colorat. Acest raport care apare ca o excepfi,e de 'la sqgreganea mendelian se datoreqe faptului c rasa l"qlwrn cu pen;aj alb posed, ,n ac''elaqi timp, gena dominant C (de la

colour), care determin culoarea neqgr qi o gen inhibioare care, n stare dominant, supreseaz rnanifestar@ gerrei C. Rssa Wyandott posed gena c (alela recesiv a geurel domimanre C) care determin n fenotip absenta pigmnitatiei qi gena i, alela reoesiv inactiv n supresia genei, C. fn rncruciqri cu rase cu penaj colonat, rasa Leghm se comport ca domina,nt pe cnd rasa Wyondotte * comport ca recesiv. Indivizii de culoare al,b apar n toate cazuri,le n ca're es'te prezent gern I ca qi n cazurile n care este prezent alela recesiv c. Indivizii cu pena colorat apar numai n cazul n care gerlr C scap de con'trolul genei I qi este alturi de gena i. C C I I l-eghorn alb x ccii Wyandotte alb F. C cli (alb) 9/16 CcIi alb I 3/16 c c I i. " F, 3/16 C cii 1t_- - ^" arb : 3 nesru negru

1116ccii alb

I,t I

10. GENE EPISTATICN

Cnd dou sau mai mulJte gene acfioneaz asupra acelnriaqi caraoter, o gen poate mascra efectul celeilalte gene, cam n acea$i msur ln oare efectul unei gene recesive ese mascat de alela sa dominent. Aoest fenomen prin care o gen poate masca sau supres,a efectul altei gene nealel,ice (situat ntr-un a1i0 losus) a fost m'umit epistazie. Gena epistatic este o gen ce aparfine u,nei perechi de alele, care mpiedic m,anifestarea alelei domilrante dinr-o alt pereche de altele. Gena supresat poart numele de Eend" hipastaticd. Fenomenul de epistazie este implicat n aproape ,toae tipurile de interaclitine genic. Domnanfa implic supresia genic intra-alell7ci (mascarea expresiei umeii aleLe recesive de cre alela dominant din aoeagi I'ocus). trpistazi;a cuprinde su,pnesi,a genic iruter-alelic (masoans pe care o exercit u,n locus genetic {rsupra expresiei ,unui alt locus genic). Raportul feno,ti183

pic clasic de 9 : 3 : 3 : 1 observat l,a desoendenfii unor prinfi dihibrizi se modific datorit epistaziei n raporturi care repre-

zint cornbinalii ale acestuia. Gena epistatic poate fi dominant sau recesiv. a) Gene epi,stutice dominante (12 : 3 : 1) Fenomenul epistaziei dominante a f'ost observat la o ncruciEare ntre Auenn tatua cu boabe negre qi Auena satiua (ovz cuitivat) cu h:oabe galbene.

AABB

(boabe negre)
F1

x
I

aabb (boabe galbene)

AaBb boabe negre ,, AAB negrc La/

Aabb

F2

3 aaBb

cenugii

aabb galben

CeIe 12 oombinafii care conlin gena dominant, A, n stare homozigot sau heter.ozigot snt de culoare neagr; 3 combinafii care au gena dominant B n stare homozigot sau heterozigot qi nu confin gena A snt de culoare cenuqie iar o combinalie cu genele recesive ob pruduce boabe galfbene. Din eele de mai sus rezult c gena dominant A mpiedic expresia genoi dominante B ce determin cul'oarea cenugie qi este deci epistatic pe cnd gena dominante B, a crei acfiun'e este nhibat, este hipostatic.

b. Gene recesiue epi,statice (9 : 3 :4) Un exemplu de epistazie recesiv ni-l ofer ,er,editatea culorii blnii la anumite rase de cini. La ncruciqarea o dou rase de cini, una homozigot alb cu una -homozgot maron, se obfin n F1 numai descendenfi de cul.oare neagr. ncrucigrile indivizilor din F1 au produs descendent n raportul de segregare I negru : 4 alb : 3 maron, ceea c se poate demonstra ln diagrama de mai jos:
184

Bcc (alb)
F1

x
t

bbCC (maron)

BbCc (negru)

I F"
1

bbcc alb-.---

Bbcc alb-------.-bbCc l3.roo:3 4

RbCc negr

n acest caz, alelele B qi b produc culoarea neagr Ei respectiv maron, dar numai n prezenla alelei dominante (C) de la un alt locus. Pentru a distinge aceast inter,acfiune de o relafie dominant qi recesivitate, se spun c. cc este epistatic fa! de B sau b,' adic homozi'gofia alelei c previne formarea oricrui pigment, indiferent de alelrele pentru alte culori. Efectul pe care alelele cc 1 au asupra lui B poart numele de epistozie
recesiud.

11. GENE DUPLICATE CU EFBCT

CUMULATIV (9 :6

: 1)

Dac condilia dominant (fie homozigot, fie heterozigot) la unul din loci (dar nu la amndoi) produce acel,aqi fenotip, raportul de segregare n F2 va fi 9 :6 : 1. De exernplu, trnd'e snt implicate g'ene epistatice n producerea anumitor substanle cum ar fi pigm,enlii, g'enotipurile dominan'te de La fiecare l,ocus pot fi considerate ca producnd n mod independent o unitate de pigme,nt. Astfel, gen,otipurile A-bb qi aoB produc fiecare cte o unitate de pigment, avnd deci acelaqi fenotip. Genotipul aabb nu produce pigment, dar n gen,otipul A-B- efectul es,te cumulativ Si in consecin! vor produce dou unitli de pi;gment (o
cantita0e du,bl). Se poate constata c atr:nci cnd epistazia opereaz ntre doi Loci genici numrul feurotipurilor ce apar la descendentii ruror printi dihibrizi, va fi mai pufin, de patru deqi segregarea are

Ioc pentru dou perechi de gene cu efecte fenotipice diferite. .A.ceasta se datoreqte mascrii efectului unei gene de ctre cealalt, generalia Fz confinrnd numai trei clase fenotipice n loc de patru iar n cazul oomplrcmentaritfii arumarul claselor fenotipice se reduce la dou aga ctun reztrlt din ahelul 10.
185

Tabchtl
Ccle gase tpurl de rapourl eplstatiee

10

Genotipurile

elslslr
fnteracfune dominanta gi recesiv

Gene duplicate cu efect cumulativ

Erprimarea n, fantotiP a genelar

12. PENETRANTa $I EXPRESIVITATE GE0ICA

de-mediu. n interac{iunea oomplex genotip-mediu, genotipul deermin limiele ntre care s poate manifesta fenotipul. n feno,tipuli a doi indivizir oe apartin ,aceleiaqi specii pot s apar diferenle, rru rmrnai debermina,te de n,atura genelor, naur care poate fi dominant sau reoesiv, ci Ei de varialia aourdiliilor de mediu. Mediul deci poate influen;fa raportul, fenotitpic de segregare. O gen prezent la toli indivizi'i fu o anumit oatqgqrie enotipic n anumite oondifii de me'diu poate s s,e exprime n fenoip la oli indivizii, caz n care se spune ca mani est o penetraor! complet s,au de 1000/0, dar n al'te oondilii de qediu, d'eqi pneze,nt la tofl indivizii, ea nu se manfesta 'dect la unii di'n'tre ei gi n aces oau se sprute c o asnr{og gen
186

Genotipul reprezint totatitatea factorilior ereditari (genelor) pe care o specile, un individ i preziort m struchya sa gelnetic (gen,om). Aceste gene se manifest n afiumite conditii de mediu. Din interac{iuna genotipul'ui cu mediul rezult feulotipul, care reprezint to'talitateia caractnelor $i nsuqirilJor (morf'ologic, hioehimice, de comportament etc.) pe care un organism le prezint I'a un moment dat, in oondlii determinrate

are o penetranfa incompleta sau are o penetran! sub L000/0. Prin penetrant se ntelege deci frecvenfa cu care o gen sau o combinafie de gene este exprimat feno'tipic. De exemplu, genele care au fost analizate de Mendel (4, B etc.) prezinrt o penetnanf complet, ele manifestndu-se la tofi indivizi purttori ai lor, pe cnd genele care condifioneaz, rezistrenla sa,u sensibilritatea la bolli au penetran! redus, irroomplet, deoarece ele nu se exprim la ,to!i indivizii, ci doar Ia ,aoeia cane au f'ost supuEi unei infec{ii oaracteristice (aoeasta reprezenthd o anumit condi[ie de mediu). Penetranta este un fenome,n de tip ' totul sau nimic: penetran{ complet sau penetran{ incomplet. Un ex'emplu foarte convinrgtor de penetran{ n-l ofer cazul a doi gemeni monozigrof,, deci care au aoeeaEi structur genotipic,'dar lal care la unul, gera perrtru ,,buz iepure6s ese penetrant (se exprim n f'enotip) iar la cellal,t este neperetrant (nu se exprinn n
fenotip). Penetranfa incompiet caracterizeaz multe gene dominante. Schizofrenia este determinat n unele c,azuri de dou gene domiurante cu penetran! incomplet. Influenla me'diul,ui se exercit nu numai asupra numrului de indivizi care exprim n fenotip o arumit gen ci qi asupr,a rltsnsittii exprimrii n fenotip a acelui caraeter, aspect cane se numegt'e erpresiuitate gen'ic. Oda,t ce gena este penetrant ea va man,ifesta frecvent varialiuni n expresia sa fenotipic. De exemplu, polidactiia la om, determinat de o gen dominrant, prezin expresivitfi degete suplimentare la picior, pidi,ferite: mini normale cioare normale deget'e suplimentare la mn, polidaetil.ia apail:E l,a mna dr'eapt dar nu la sturga, la stnga dar nu la dreapta, sau la am'bele mini qi picioare etc. n condilie heterozirgot (Pp) gena polidactirliei are o peuretramf de mai pufin' de 7000/o cci uneori ea nu reuqeste s produc vreun efeet fenotipic detectabil. Nepenetranla unor gene nseamn, 00/o expresivitate. Datorit condifiilor diferite de mediu, aceeagi gen poate produce sfecte foarte evidente la unii indivizi n timp ce la al,!i indivizi efecte abia vizibile. Gena recresiv ?rg ca,re determin caracterul de aripi vestigiale la drosofiil prezint o expresivi'tate diferit n funcfie de t87

temperafur: la temperatura oamerei apar arlp1 vestigiale dar eare se pot apropia de dimensiunea aripilor normale, pe cnd la temperaturi sczute apar aripi vestigiale propriu-zise (extrem de mici, rudimente de aripi). Mediut intrauterin la mamif,ere, chiar pentru gemeni monozi,gofi poate fi foarte variabil, din punct de vedere al poziliei ocupate de gemeni n uter, aI conexiunilor placentale ,si acestea pot afecta diferit expresivitatea genel,or 1a cei d'oi gemeni. Varialia expresivit{ii unor gene se poate datora ns Ei influenfei unor aite gen,e cdr se numesc gene modificatoore, dintre care unele snt reducdtmre, slbind expresia fenotipic a altei gene neal,ele, iar altele snt amplificatoare, ntrind expresia fenotipic a unei alte gene nealelice. Penetranla qi expresivitatea pot altera raporturile cunoscute de segregare Ei s determine ca ades,ea fenotipul s nu exprime fidel genotipul. Primul care gi-a dat seama de irnportanfa mediului n expresia genic a fost Wilhelm Jahonnsen, cel care de fapt a introdus qi noliunile de gen, gmotip Ei fenotip. Exist qi cazuri de imitalie fenotipic numit fenocopie. In aeest caz un ac,elaEi caracter poate fi produs de alele diferite dar care aclioneaz n medii diferite. Indivizii care difer genotipic Ei oane snt diferili n acelagi mediu pot deveni fenotipic similari cnd condiliile lor de rnedir.l difer. Asffel, tulpini de E. coli his+ gi his- cr,esc Ei respectiv nu eresc pe mediu de cul'tur lipsit de histidin. Dar tulpina hts- va putea creEte ca Ei tulpina h.is+ dac mediul de culrtur eonfine histidim'a. Astfel o oelul his- pe un mediu de cultur care oon{ine histidina este o fenocopie sau o imita{ie fenotipic a unei celule his+. Tot astfel un individ uman car,e sufer de diabet m,aladie ereditar care determin producerea unei insuline anormale dac ia insulina sub form de medicament va deveni o fenocopie a persoanelor genetic normal,e pentru gena insulinei qi care nu iau insulin. Exist qi ca:zuri de fenocopiere a caracterel,or anormale. Astfel, embrionii umani normali ai cror mame au folosit talidomida se vor dezvolta n copii cu diferite rr,ralformafii care imit (fenocopiaz) persoane anormale ce sufer de maladia er,editar focomelin cauzat de o singur g,en mendeli,an n condilie homozigot.
lBB

13. DETERMTNISMUL GENETIC AL CARACTBRELOR CANTITATIVE

Cercetrile lui Mendel s-au referit la analiza unor caractere discrete, discontinui, care se ncadr'eaz n clase discrete de tip neted zbrcit; gal,ben verde. Johansen a cerceta't ns modalitatea de transmitere ,a un,or caractere ce pr'ezint variabil,itate continu, cunoscute drept caractere cantitative. El a lucrat tot pe o planrt autogam ry anume pe fasole. Dintr-un lot initial el a seleclionat L9 boabe de fasole, fiecare avnd o greuta,te specific qi le-a cuitivat spre a obline 19 linii de fasole, care n virtutea faptului c fasolea,este o plant auogam erau pur,e* qi n ceea ce priveqte caracterul greutlii. Din fiecare linie de fasole a selectat apoi boabele ceie mai usoare qi boabele ceie mai grel,e pe care le-'a cultivat separat. n fiecare an a ales din descendenla boabelor ugoare, pe oele mai gr,ele pe car'e de asemenea le-a culrtivat separat. Din cele 19 linii pure d,e fasole snt reprezentate grafic doar liniile 3, 11, 13,qi 17 (fig. 51A). Comparnd aceast di-qtribulie cu distribu{ia greutfii 'boabelor la genitori, n mod surprinztor acestea erau simil,are Astfel, o plant ieqit din boabe de 150 mg aparlinnd iiniei a 3-a d naqtere prin autofecundare la descendenfi ale cror boa,be au o greutate rnedie de 200 mg afiat ntre limitele 150 Ei 250 mg. O situafie asemntoare se nregistreaz n celelaite linii. Johansen a atribuit greutatea rnedie a boabelor ca datorndu-se constituliei geurotipice, pe cnd variafiii'e pozitive sau negative fafa de aceasta ca da,t,or,ndu-se fluctuafiilor de mediu. Din suprapunerea u,nei multitudini de cunbe de distributie det tNi/,, : LiiilAl LiNi... Llti,iAl2
I I

'i

ctifoectJnilare
|

lir
t.
1"

,j;-'.a.:,:a.i;i-'a.ii-

..

,.--\ ,/ -/ --l--:----')v y'.._.-__::*- ,./ -,--\-1*)>'i 5C 2-',; ?tC 1,50 500 55A 5C0 55C (AC 750 80 0 85{}
r,:
!

"rfafecundare a;ttofprundare rl f'l

i4i r A

B ;-t,.i.n

i L 0R i.\t,.r,r

Fig. 51. A. Selecfia celor patru

+

Johansen (explicatii n text).

linti n

experieula lui

game hcrnczigote.

Linia pur reprezint totali,t'atea descendentilor unei pi,ante aut&189

Toisf

ributie

?00

900

Fig.51. B. fneficienfa selecfiei n cadrul liniilor pure (explicafii n text).

termi'nat de sienotip a rez{.rltat o aur a distribu{iei nor,male a frecven!,elor (fig. 518). Aceast experient ,a demonstrat c dife,ritel condi{ii de mediu pot produce diferen{,e fenotipice artre irudivizi, dar aceste diferenle nu se rnoqtenesc. Greutatea boa'belor de fasole apare ca un caracter cantitativ care prezinrt o variabiUtate de tip continuu, oecilnd de la o lraloare minim la una maxim n cadrul unei populafii
date. Johansen' a tras din experien!.ele sale o cvncluzie cu importan{A rna,jor pe rtru pnactica amel,iorrii plantelor qi anima-

pentru

intensitatea culorii roqii la florile de mazre (de la nosu deschis la rogu nchis). Nilsson-Ehle a sta,bilit prrn experier,r,{e de hidridare la gru c n determinsmul culorii ,boabelor intervin trei perechi de gene neale,tre care condi{ioneaz sim'teza trnei eantit{i anumite de pigment. rrcruciqnd un soi de gru cu boabe roqii (AA, BB, CC) cu un, soi cu boabe albe (w, bb, cc) n F1 se obfin plan,te cane formau boabe de culoare rogie (AoBbcc). Prin autofeeundarea indivizilor din Ft a oblinut n F2 un raport gneral de sqgrgare
190

aceas'ta, refel'i'ndu-se la caracteristicile de produc$e) gi anume c selecfia este ineficieort n cadrul liniilor purc. Selecfia este eficient numai in cadrul unei populatii heterqgene (cele 19 linii de fasole luate n ansarnblu). Dar cercetrile sale nu au oferit o rezolvare fll privire Ia natura genotipuri-lor care stau la 'baza celor 19 linii pure diferite. Observa{iile efectuate de suedezul Nilsson-Ehle (1910) au aruncat o lumina Ei asupra acestei probleme. nc din 1906, Yule sugerase ca variafiile cantitative continue ar trrvea la baz o multitudine de gene individuale al cror efect se cumuleaz, este aditiv. Asemenea idei avusese qi Mendel cnd a fost pus n situafia de a explica varia{iile n

lelor (caracterele cantitative fiind de o excepfio,naH wrloare

mtrlativ (aditiv) fie. 52.1 Se deduce e aparifia ctrlorii roqii este determina,t de trei perechi de gene urealele cu efect curnul,ativ ,AA, BB CC, iar culoarea aIbA de alelele lor cn, bb, cc. NilssonEhle a tras concluzia ca numrul total al alelelor domina,nte a celor trei perechi de gtene determin graduJ de pigmentare. Cu alte cuvinte
fiecare gen dominant poate fi oonsiderat cu o conribu{ie de o doz }a culoare rogie iar efecttrl fiecarei doze este qwl qi oitia. L,snd Ia o ,pafte a tneia pereche de gne, se poate

d 63 rosii la I atb. Dar culoarea rosie prezeruta difr'ite nuanfe, sugcrnd existen{a unei sqgrqari pentnr trei gen echivalente cu efect cu-

I
I 20)

calcula probabilitatea de a obfine 0, l, 2, 3 qi 4 doze ale a,lelelor domina,nte din ncrucigarea AaBb X AaBb aga cum rezulta din fig. 53.
Fig, 52.

Observafiile facute de Nilsson-Ehle pot fi explica,te prin prezenfa genelor duplicarte, svnd n vedere faptul c grul este o plant hexa-

alb #r0s"

ploid, La care, deci, fiecare locus este reprezenrtat pri,n 3 perechi de alele, ceag ce distinge ns aceste rezulta,e de cazurile simple de complemeuraritate recesiv este faphrl c, rr* arLresnfa dominanfei, seglegrarea nu d,uce la aparifia a numai dou clrase fenoti,pice, ci caracterul culoarea boa,belor se comport asemantor unui caracter ca-ntitativ.
191

n cazul dou soiuri de gu ce difet prin ttei, petechi de gene care determin culoarea boabelor. Distribulia frecvenfei culorilor este prezentatA n histogramA (dupA Strickberger, 1976).

ncruciglrii

Segregarea caracterelor

Penlru

Penlru B

Pentru A i

Numrul B

tciol

ct.,doze"o"' dmtnonte

Probbir\lolcO

totcl

AA=)c

=1/t ., <i-'-- -Bg5=t/z

--oo

AABB: %e .\ 4qg6:70 =\
AAbb = '46

..-

/.

(roiu locrte inshis)

Vs

=%

-86 =llu Aa-1!z "'l-ad-r/z \o o=h

aa -=.,

,, Aabb:'rB,-,-r./
raBB-'/',s/ -\ a."0: t1s --')
aabb:t/re

^.:t :1/c Aagb

\>
t-

3(ro?c ?rcr,'s)

11,

./ 21ro9u)
l(roguPot)
0 (olb )

oAt

.-E =1/': */ -1 g6=1,/t

L/s lt /ts

o6=y,.

Fig. 53, Segregarea caracterelor-'tr cazul ncruciqrii unei varietfi de gdu cu Rapot de segegare: l5 (l : boabe ro$ii cu o varietate de gru n"lal"nilialbe. Prezenla fiecrei gene se faee simlit n schimbarea gradat a fenotipului, genele cumulndu-qi efectele par{iale. Ideea unui efect de aditivitate cantitativ a genelor asupra fenotipului (adesea numit ereditate can'titativ) a fost o idee r,evolufionar, ea furniznd baza genotipic pentru curba normal adesea gsit la varia{iile caracter,el,or cantitative cum ar fi nlfirnea, greutatea, culoarea etc. Williams (1964) prezint un interesant exemplu de polimerie aCitiv la porumb, al crui endosperm are o constitufi'e triploid (rezultat din feeundarea nucleului secundar al sacului embrionar care este 2 n de ctr,e unul din nucleii .spermatici (n). Relalia dintre numrul dozelor din gena Y, care eondilioneaz culoarea galben a endospermului Ei conlinutul n rzitamina A al ac,estuia $i gena A care determin culoare,a alb a endospermului este redat n tabelul 11.
Tabalul
11

cH'XlHil""l'T#:#"Hl*l,"Ji"ffi
(dln
Doze d.e Y
0

Giosan gi SAdescu, 1972)

l'fff"'

Genotipul

Vit. A (unitti
la gram)
0,05 2,25 5,00 7,50

I
2

vyv yvY
YYY

YIrY
1,92

Se cunosc foarte multe cazuri de pol,imerie cu situa{ii similare celor descrise rnai sus, dar pro,babil cea mai famiiiar este acea a pignentatiei pielii Ia om n care particip cel pufin patru pereehi de gene (gene cuadruplicate). Presupunndu-se

prins ntre 0 Ei B. Cazul siurplificat aI pigmeritaliei pielii la orn este redat de formulele genotipice PLPLPyP, pentru negri i Pt/rPrlp, pentra mulatri tipici ;i Pt:!t/r?, pentru albi, din care rezult c n d.eterminismul acestui caracter cantitativ (d.eterminat n uitim irstan! de cantitatea de pigment melanic sintetizat, n melanofori) intervin dou perechi de gene nealele PrP, i Pr!, 9i c intensitatea pigmentaliei este cu att mai mare c ct mai rnulte alele d.ominante intr ntr-o constitulie genotipic dat. Din cstoria unui negru (PtPlPzPr) cu o femeie a1b (ft|tfrfr\ reaa.Tt" copii mulatri. Din cstoria a doi mulatri (PtptPrp, x x PTPLPT?,) u^ rezulta o descend"ent n care aparg o segregare ntr-un raport diferit de cel mendelian n caatl dihibridrii 9i anume 1 negru (PLPzPz) 4 mulatru nchis (PLPtPzPz sau PrPrPzP),6 mulatru tipic (Pt?tPrfr), 1 alb (!rqrfr?r). Se poate deci conchide c bazele geneticii mendeliene pot explica- ereditatea caracterelor cantitative (care se prezint cu o varialie continu) prin acliunea unui numr mare de gene (polimerie sau poligenie).

pl a fiecrei alele dominante, se cun'osc n,ou cl,ase dierite de pigmenta{ie n care numrul genel,or donninante este cu-

dorainaarfa genelor care produc pigmentafie Ei aditivitatea sim-

14. GENE I..E[ALE

n 1905 geneticianul francez Cunot a studiat o varietate de goareci cu blgn1 galben. n contrast cu ;oarecii ctl blan cenugie ce reprezint tipul slbatic. Prin ncrucigarea goarecilor galbeni cu ;oareci cenugii dintr-o linie pur, el a observat un iaport de segregare 1 : 1. Aceasta sugereaz c alela pentru blna galben este dominant asupra alelei pentru blana cenugie, n urma ncruci;rii ntre ei a goarecilor galbeni, Cunot a regsit descendenfii galbeni gi cenugii n raportul 2:1, o deviere clar de la prop4ia mendelian de 3: 1. Aceasta 1-a dus la concluzia c goarecii galbeni snt het"erozigo!. Raportul de
t$ - Descifrind tainele ereditfii, vol.
I

193

segregare de

2: l, n loc de 3: I arati ci disprut gi anume homozigotii dominanfi.

l/4 din indivizi au

Y/Y
neviabili
25%

v/+

Y/+
galben
/l

x
50%

vl+

galben agouti
25%
Cy)

vl+

+l+
la

Segregarea genei pentru culoare galben ncrucisare Yl+ X Y/+

qoarece, ntr-o

De fapt, raportul t:2:l este transformat n raportulr 2:1 prin moartea clasei homozigote gal'bene n uter.. Tr,elbuie de rnemarcart c gena Y ese dnrnwtt pri'n efectel,e fenotipice asupra culorii; blnii, n plus ea ese gi nacesia n efectul lieral, deoarece alela trebuie s fie homozigot penrtru a determina moartea ftuliui. Se spune c gna Y este dominrant vizibil gi recesiv letal. Efecte'le aoesei gene snt, plei.otropdce adic gena are un efect fenotipic multiplu asupra culorii Ei asupra viabilitfii. n afa,r de I'etalitatea de dominant, n nartur se ntlneq,te q,i o letuli.ffie de recesiaitute descoperit de Baur (1930) Ia Anirrhinrtm mnjus var : cruireq. 'n urma autofecundrii are loc n F1 urmtoarea segregar: L/3 plantre cu frunze verzi,, l/3 ptanrtre cu frunze verde-pal' qi 1/3 plante cu frunae galbene, aga cum rezult di,n, ta,berlul 12.
Tclul
'12

Letalltatoa ds reoeslvitato la Antlrrhinum

cenotirurl

Fenotipul

cc
Cc

verde (normal)
verde pal (aurea)

cc

gAbui (letal)

Cantita'tea de clor,ofil le Antirrhiurum ese controlata de ctre o gen recesiv irreornplet care manifest un efect le'tal n stare homozigot qi un efect fenotipic distinet n stare heter.ozigot.
194

Penetranla genelor letale fie recesive fie dominante poate s vari,eze, astfei c nu toli indivizii afectali genotipic vor fi letali fenotipic. Anumite gene letale au un na1t grad de penetran! ;i expresivitate, permi!nd un mic procent de supravieluire sau chiar deloc (penetran 1000/o) printre genotipurile afectate n stadiul embrionar sau postemrbrionar. Ale gene numite senletole sau su'bvitale permit supravieluirea unei propor{ii mai mari de genotipuri afectate (500/0-300/c). Se vede deci c vitalitatea este un caracter influenlat de un spectru larg de gene, care variaz de la letalitatea complet la subl,eial, la subvital, apoi normal Ei n mod ocazional la supervital sau Ia genotipuri superioare celor medii. Dar, ca regul, genele l,etal,e snt considerate acelea al,e cror efecte cauzeaz moartea organismului, n mod obiEnuit, n primele stadii de dezvoltare, oricum nainte de reproclucere.

15. PLEIOTROPIA

Reprezint un fenomen genetic opus polialeliei. E se nregistreaz atunci cnd o singur gen nu con'troleaz expresia unui sin,gur caracter, ci a mai mulor caractere. Pleiotropia ar putea fi definit ca efectul fen'otipic multiplu al unei sin,gure
gene.

La mazre, chiar l\{endel a constatat c pelechea de gene cal'e determin culoarea fl,orii acfioneaz gi asupra culorii seminfelor gi asupra prezenfei sau absen{ei petelor roqietice de pe stipele. La drosofil, gena ug care determin forma vestigial a aripilor, controleaz, n acelaqi timp qi alte caractere precum distribulia periqorilor pe partea dorsal, modificarea spermatecii, ducind Ei la reclucerea vitalitlii Ei fecunditlii. La mamif,ere, incluznd omul, gena care este impiicat n albinism, afecteaz de asemenea vzul Si auzul. n aoest caz toate sectoarele corpului care snt afectate au o origine comun n dezvoltarea embrionar timpurie qi anume ectodermic. Astlei la om, n cazul sindro,rnului Lobstein, este implicat o
195

gen care determin deopotriv surditatea, fragilitatea vaselor gi modificri ale scl,eroticii. Nu este exclus ca marea majoritate a gerreior s se manifeste pleiotropic, aspect care este izvort din caracterul de in-

tegraiitate ai celulei, respectiv al indi-;idului biologic care, func{ionnd ca sistem unitar Ei avncl o stare aiterat ntr-unul din componentele sale subordonate, prezint alterri qi n alte elemen,te n urma interactiunilor structurai-functional,e.

Redactor: ADRIAN CJR.\NESCU l-elinoredactor: CONS'IANTIN RUSU

Crili

Aprut: 1981. Bun de ti.par: 25.09.1S81. Comancla nr.2l0ll de tipar: 12,2i>. Hr1"ia: velin 90 g/mp. Format: 6f i.Brji 1{)

Tipaiul executat sub comanda nr.312/1981 la nfrcprinderea Poligrafic Cluj, Municipiul Cluj-Napoca B-dul Lenrn nr. 146 Republica Socialist Romnia