Subiecte

1. Definii factorul de selectivitate al unei coloane () n cazul a 2 specii. Factorul de selectivitate al unei coloane reprezint raportul dintre constanta de distribuie a speciei mai puternic reinut de coloan i constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan. KB constanta de distribuie a speciei mai puternic reinut de coloan KA - constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan. este prin definiie mai mare dect 1. Factorul de selectivitate se utilizeaz mpreun cu factorul de retenie la rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice. 2. Care sunt efectele variaiei temperaturii asupra cromatogramelor? Temperatura influeneaz coeficientul de difuzie care este o msur a mprtierii benzii cromatografice. Creterea temperaturii duce la scderea vscozitii fazei mobile i astfel la creterea vitezei de curgere a acesteia. Cu ct viteza de curgere a fazei mobile este mai mare, cu att procesul de difuziune este mai redus. De asemenea, temperatura intervine i n valorile coeficienilor de transfer de mas. Transferul de mas depinde de vscozitatea fazei mobile, care este invers proporional cu temperatura. Astfel, prin creterea temperaturii, crete numrul proceselor de transfer de mas, crete numrul de talere teoretice, ceea ce duce la creterea eficienei coloanei i la o rezoluie de separare mai bun. 3. Care este semnificaia termenului de eluie n gradient? Termenul de eluie n gradient semnific modificarea fazei mobile n timpul separrii cromatografice, prin creterea continu a concentraiei, obinndu-se un gradient de concentraie, cu scopul obinerii condiiilor optime de separare pentru fiecare din componentele probei, De exemplu, la concentraii mici de solvent vor fi separai compuii care interacioneaz slab cu faza staionar, iar pe msur ce cretem concentraia fazei mobile vor fi antrenai pe coloan i compuii care interacioneaz mai puternic cu faza staionar. 4. Cromatografia cantitativ pe coloan metode de analiz. 5. Pentru determinarea volumului spaiului gol se utilizeaz : a. albastrul de bromfenol b. Coomassie Brillant blue c. Blue dextran 2000 d. albastru de metilen Precizai caracteristicile unei substane utilizabile n determinarea volumului total al unei coloane. c. Blue dextran 2000 Pentru ca o substan s poat fi utilizat n determinarea volumului total al unei coloane aceasta trebuie s nu interacioneze cu faza staionar, s aib o mas molecular foarte mare i s fie un un compus colorat, pentru a se putea urmri eluarea lui din coloan. 6. Descriei succint trei metode de determinare a masei moleculare a unei proteine.

Electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezenta de dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE) presupune tratarea proteinelor cu SDS, un detergent denaturant care se leag la proteine i determin anularea sarcinilor lor intrinseci, conferindu-le o sarcin global negativ. Astfel, separarea electroforetic va avea loc numai n funcie de masa molecular a proteinelor. Prin utilizarea unor markeri de mas molecular se poate determina masa proteinei de interes, prin extrapolare pe graficul logM=f(Rf), unde Rf =distana parcurs de protein/distana parcurs de colorantul de urmrire. Gel-filtrarea : prin trecerea unui amestec proteic pe coloan, componentele probei vor interaciona cu suportul astfel : proteinele cu V mic vor ptrunde mai adnc n porii suportului, proteinele cu V mai mare vor interaciona mai puin cu suportul, iar proteinele foarte mari nu vor interaciona deloc. Determinarea masei moleculare a unei proteine necunoscute se face extrapolnd V eluie al proteinei pe graficul log M=f(Ve), realizat cu ajutorul unor proteine cu mas molecular cunoscut. Electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezen de bromur de cetil trimetil amoniu (CATPAGE) este o metod care permite determinarea maselor moleculare a proteinelor native. CTAB este un detergent care leag proteinele, conferindu-le sarcin net pozitiv. Acestea vor migra ctre polul pozitiv i se vor separa n funcie de masa lor molecular. 7. Se pregtete o soluie de acrilamid-bisacrilamid prin dizolvarea a 7,3 g acrilamid si 0,2 g bisacrilamid n 25 ml ap distilat. Din aceast soluie se folosesc 2,5 ml la pregtirea unui amestec de polimerizare cu un volum final de 10 ml. a. Calculati T% initial i final b. Calculati C% initial i final c. Gelul obinut se poate utiliza drept gel de concentrare sau de separare? a. T% = cantitatea de acrilamid plus cantitatea de bisacrilamid n 100 ml soluie 25 ml soluie.(7,3+0,2) g acrilamid+bisacrilamid 100 ml soluie.T% initial T% initial = (7,3+0,2)x4=30%. 100 ml.30 g acrilamid+bisacrilamid 2,5 mlx x=0,75 g acrilamid+bisacrilamid 10 ml.0,75 g acrilamid+bisacrilamid 100 ml.T% final T% final=7,5% b. C%= C% initial = 25 ml soluie.7,3 g acrilamid0,2 g bisacrilamid 2,5 ml soluie.xy x=0,73 g acrilamid ; y=0,02 g bisacrilamid

C% final= Gelul realizat se poate utiliza ca gel de separare deoarece are un T% suficient de mare pentru ca procesul de cernere molecular s se desfoare. Gelul nu poate fi utilizat ca gel de concentrare, deoarece acestea trebuie s aib un T% mai mic : 4-5%. 8. Precizai o serie de metode de denaturare utilizate n analiza electroforetic a unei proteine. - denaturare cu detergeni (SDS, LDS, CTAB) - denaturare folosind uree (6-8M) - denaturare cu clorur de guanidin (6-8 M) - denaturare folosind ageni reductori ai punilor disulfurice : -mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol. - denaturare prin incubare la fierbere 9. Determinati masele moleculare (lgMM) ale celor doua proteine separate prin PAGE (linia 3) Markerii moleculari sunt miozina (200 kDa), betagalactozidaza (116 kDa), fosforilaza b (97 kDa), albumina serica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anhidraza carbonica (31 kDa), inhibitorul tripsinei (21,5 kDa) si lizozimul (14,4 kDa).

MM 200000 116000 97000 66000 45000 31000 21500 14400

lg MM 5,30103 5,064458 4,986772 4,819544 4,653213 4,491362 4,332438 4,158362

10. Se amestec 28,5 g acrilamid cu 0,5 g bisacrilamid i se aduce la 100 ml cu ap distilat a. Calculai T% si C% b. Se realizeaz un amestec de polimerizare compus din Gel 1 Acrilamid/bisacrilamid 2,69 ml Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 2,5 ml Ap distilat 4,75 ml SDS 100l TEMED 20l

Gel 2 Acrilamid/bisacrilamid 0,85 ml Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 ; 1,3 ml Ap distilat 2,8 ml SDS 50l TEMED 5l Calculai T% si C%. Care este rolul celor doua geluri? a. T%=28,5+0,5=29% C%= b. Soluie stoc acrilamid/bisacrilamid T=29% Gel 1 : 100 ml29 g acrilamid+bisacrilamid 2,69 mlx ; x= g V gel 1 = 2,69+2,5+4,75+0,1+0,02=10,06 ml 0,78 g.10,06 ml T%..........100 ml T%=7,75% 100 ml....28,5 g acrilamid........0,5g bisacrilamid 2,69 ml....a g acrilamid.............b g bisacrilamid a=0,76665 g ; b=0,01345 C%= 1,72 % Gel 2 : 100 ml29 g acrilamid+bisacrilamid 0,85 mlx ; x= 0,2465g V gel 2 = 0,85+1,3+2,8+0,05+0,005=5,005 ml 0,2465 g.5,005 ml T%..........100 ml T%=4,92% C%=1,72% 11. Definii Ka si Kav (asemnari/deosebiri) 12. Avantajele eluiei n trepte n cadrul eluiei n trepte, coloana este eluat cu soluii cu putere de eluie cresctoare. Avantajele acestei metode sunt timpul scurt de realizare i obinerea componentelor probei ntr-o form mai concentrat. 13. n cazul cromatografiei n strat subire n sistem cloroform-butanol 7:3, o proba A se rezolv n 2 spoturi intim legate. Expunei cile/metodele de crestere a rezolutiei. 14. Fenomene de adsorbie nespecific enumerai cauze 15. Completai locurile libere

Componenta Acrilamida Bis

T=7,5% 4,75 g 0,25 g 0,375 g

T=10% 9,5 g

Componenta Acrilamida Bis

T=5% 4,75 g 0,25 g

T=7,5% 7,125 g 0,375 g

T=10% 9,5 g 0,5 g

16. Aplicaii ale electroforezei n flux liber continuu n separarea celulelor 17. Calculai masa molecular a unei proteine utiliznd relaia log M = -1,10 log a + 6,23 valorile experimentale sunt : D (cm) 0,15 0,25 0,4 0,56 0,77 1 1,2 V*h*103 2,5 5 7,5 15 20 25 30

D (cm) 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 V*h*103

panta dreptei = 26,80471244 log M = -1,10 log(26,804) + 6,23 M = 45600,30341 Da 18. Explicai rolul Blue Dextran 2000 n cromatografie. Ce se poate spune despre o protein care migreaza odat cu Blue Dextran? Cum se poate crete tR pentru aceasta protein?

Blue dextran 2000 se utilizeaz pentru determinarea timpului mort (tM) i a volumului spaiului gol (void volume) n gel-filtrare. Blue dextran 2000 este un conjugat al dextranului (polizaharid cu masa molecular foarte mare ) cu un colorant i datorit mrimii foarte mari trece prin coloan fr a interaciona cu aceasta. Timpul de eluie al blue dextran 2000 pe coloan va reprezenta tM, iar volumul de eluie va fi void volume. Dac o protein migreaz o dat cu blue dextran 2000 se poate spune c aceasta nu interacioneaz cu faza staionar, din cauza mrimii foarte mari care nu permite ptrunderea acesteia prin porii gelului. Pentru a crete tR pentru aceast protein trebuie s alegem un domeniu de selectivitate n care s se regseasc proteina de interes. n funcie de mrimea proteinei alegem mrimi diferite ale particulelor gelului. 19. Un compus A nu poate fi extras din linia de start n sistemul cloroform-metanol-ap 7:2:1. ncercai s explicai fenomenul si s gasii soluia adecvat pentru a produce migrarea acestuia pe support. Compusul a rmas n linia de start deoarece alegerea fazei mobile nu a fost adecvat, aceasta fiind prea puin polar n raport cu compusul pentru a permite eluarea acestuia pe suportul cromatografic. Pentru a produce migrarea compusul A pe suport putem s mrim proporia metanolului n sistemul de solveni ales sau putem s folosim un solvent mai polar. 20. In cazul cromatografiei de schimb ionic se poate vorbi de void volume? Ce proprieti trebuie s aib o substan pentru msurarea acestuia? Void volume se poate determina i n cazul cromatografiei de schimb ionic. n acest caz, se introduce pe coloan o protein care posed aceeai sarcin superficial ca i sarcina schimbtorului de ioni. Aceast protein nu va interaciona deloc cu schimbtorul de ioni, astfel nct se poate determina volumul spaiului gol ca fiind volumul necesar eluiei proteinei pe coloan. 21. Explicai relaia dintre timpul de retenie i volumul de eluie. Timpul de retenie i volumul de eluie sunt termeni echivaleni i sunt caracteristice pentru un compus dat. Timpul de retenie este definit ca timpul necesar unui compus s treac printr-o coloan cromatografic, n timp ce volumul de eluie reprezint volumul de faz mobil necesar eluiei acelui compus de pe coloan. 22. Gel filtrare principiu, aplicatii, avantaje, dezavantaje 23. Preparai 10 ml gel poliacrilamid cu T=10% dintr-un amestec acrilamidbisacrilamid 29,2:0,8 g/100 ml. Calculai C%. Calculai volumul de ap tiind c amestecul de polimerizare conine 2.5 ml tampon Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8, 0.1 ml APS 10% ; 0.05 ml TEMED i 0.1 ml SDS. Care este rolul : APS, TEMED i SDS? Ce fel de gel s-a preparat? Care este rolul su n separarea electroforetic? Peste acest gel se toarn un nou gel cu T=4%, dar tamponul utilizat are pH 6,8. Care este rolul acestui gel? Modificarea lui T% conduce la modificarea C%? 29,2 g acrilamid i 0,8 g bisacrilamid C%= T=10% 10 g acrilamid+bisacrilamid xg 100 ml 10 ml

x=1 g acrilamid+bisacrilamid

T% initial=30% 30 g 100 ml 1 g acrilamid+bisacrilamid y=3,33 ml soluie acrilamid + bisacrilamid VH20=10-(3,33+2,5+0,1+0,05+0,1)=3,92 ml Gelul preparat reprezint un gel de poliacrilamid cu SDS i are rolul de a separa proteinele n funcie de masa lor molecular, fiind gel de separare ntr-o electroforez in sistem discontinuu. Gelul cu T=4% reprezint gelul de concentrare i are rolul de a stivui componentele probei n benzi subiri, proteinele migrnd sub aceast form n gelul de separare, unde sunt rezolvate. Modificarea T% nu duce la modificarea C%. 24. Metode de transfer pe membrane i de detectie dup transfer. 25. Electroforeza n camp pulsatoriu principiu, aparatur, utilizri. 26. Definii urmtorii termeni : eluie, faza mobil, faza staionar, constanta de distribuie, timp de retenie, factor de selectivitate, nlimea talerului teoretic, rezoluia coloanei, eluent. Eluie trecrea compuilor pe coloan la adugarea continu de faz mobil Faza mobil solventul utillizat pentru eluia probelor Faza staionar mediul utilizat n cromatografie prin care componentele probei trec i unde sunt separate n funcie de tria interaciei stabilite cu faza staionar Constanta de distribuie raportul dintre concentraia molar a solutului din faza staionar i concentraia molar a solutului din faza mobil Timp de retenie timpul necesar unui compus s treac printr-o coloan cromatografic Factor de selectivitate raportul dintre constanta de distribuie a speciei mai puternic reinut de coloan i constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan. nlimea talerului teoretic raportul dintre lungimea coloanei mpachetate i numrul talere teoretice; la nivelul fiecrui taler teoretic se stabilete un echilibru ntre faza mobil i faza staionar. Rezoluia coloanei msur a capacitii coloanei de separare a 2 analii Eluent volumul de faz mobil 27. Descriei problema general a eluiei. 28. Cum poate fi manipulat factorul de retentie n cazul unui solut? n cazul cromatografiei cu faza mobil gazoas, factorul de retenie poate fi crescut prin creterea temperaturii. n schimb, n cazul cromatografiei cu faz mobil lichid, creterea temperaturii are un efect neglijabil asupra factorului de retenie, n acest caz, factorul de retenie putnd fi modificat prin schimbarea compoziiei solventului. Creterea factorului de retenie duce n general la creterea rezoluiei, mbuntind semnificativ separarea compuilor. 29. Definii procesul de alterare a fazei mobile i stationare. Exemple 30. Descriei o metod de determinare a numrului de talere teoretice dintr-o coloan. 31. Caracterizai timpul de retentie i volumul de eluie n cazul unui solut. 32. Descriei tipul de cromatografie de partiie n functie de starea stationar i mobil. 33. Dou proteine A i B se determin prin focalizare izoelectric avnd pIA=7,5 i pIB=8,0. Cele doua proteine se separ prin cromatografie de schimb ionic. Stabilii tamponul de eluie i matricea cromatografic utilizat.

Matricea cromatografic : carboximetil Sephadex (CM-Sephadex) Soluie tampon : tampon acetat pH 4,6 Eluie n gradient sau n trepte cu NaCl 34. Cromatograma de mai jos prezint modul de separare a celor doua proteine. Calculai rezoluia de separare a celor dou proteine i factorul de asimetrie al acestora. Care este factorul de trenare?

35. Descriei succint o metod cromatografic de determinare a masei moleculare a celor dou proteine. 36. Amestecul celor doua proteine se supune separrii prin electroforez nativ pe un gel de poliacrilamid preparat astfel : Gel de concentrare (T=4,5%) Acrilamid (29,5 g) si bisacrilamid (0,5 g) aduse la 100 ml Tampon Tris-HCl pH 6,8 1,3 Ap distilat Persulfat de amoniu 20 l TEMED 5 l Volum total 5 ml Gel de separare (T= ) Acrilamid (29,5 g) si bisacrilamid (0,5 g) aduse la 100 ml Tampon Tris-HCl pH 6,8 Ap distilat Persulfat de amoniu TEMED Volum total

3,33 ml 2,5 4,14 50 l 10 l 10 ml

a. Determinati T% si C% in soluia de acrilamid : bisacrilamid iniial. b. Completai locurile libere din cele dou tabele.

c. Care este C% n gelul de concentrare? Dar in gelul de separare? a. T%=29,5 g acrilamid+0,5 g bisacrilamid=30% C%= x100=1,66% b. Gel de concentrare (T=4,5%) Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) aduse la 100 ml Tampon Tris-HCl pH 6,8 Apa distilata Persulfat de amoniu TEMED Volum total 4,5 g acrilamid+bisacrilamid100 ml x........5 ml 30 g100 ml 0,225 g..y

0,75 ml 1,3 ml 2,925 ml 20 l 5 l 5 ml x=0,225 g

y=0,75 ml acrilamid+bisacrilamid

Gel de separare (T= 10% ) Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) aduse la 100 ml Tampon Tris-HCl pH 6,8 Apa distilata Persulfat de amoniu TEMED Volum total 100 ml......30 g 3,33 ml.....x x=0,99 g

3,33 ml 2,5 ml 4,14 ml 50 l 10 l 10 ml

0,99 g...10 ml T%...........100 ml c. C% are aceeai valoare n ambele geluri i este egal cu C% din soluia iniial. C%= x100=1,66%

37. Tamponul de migrare utilizat este Tris-glicina pH 8,3. Explicai succint rolul glicinei n separarea electroforetic a celor doua proteine. Ionul glicinat are rol de ion terminal pentru c este un ion lent i migreaz ultimul. ntre ionul glicinat i ionul clorur (care este ionul frontal, deoarece migreaz rapid n cmpul electroforetic) se dispun componentele proteice ale probei, aceasta fiind stivuite n gelul de concentrare i migrnd n gelul de separare sub aceast form. 38. Amestecul celor dou proteine se separ apoi prin electroforez pe gel de poliacrilamid n prezen de SDS. Dupa colorare, proteina B conduce la dou benzi.

a. Ce se poate spune despre cele doua proteine? b. Care este rolul SDS? c. Care este rolul -mercaptoetanolului? a. Proteina A este alctuit dintr-o singur caten polipeptidic, n timp ce proteina B este o protein oligomer, fiind alctuit din 2 subuniti. b. SDS este un detergent anionic, care are rolul de a conferi proteinelor o sarcin total negativ, sarcinile intrinseci ale proteinelor devenind neglijabile, astfel nct separarea se realizeaz numai n funcie de masa molecular. c. -mercaptoetanolul este un agent reductor al punilor disulfurice i este implicat n denaturarea proteinelor i separarea acestora n subunitile componente. 39. Variabilele cinetice care afecteaz mprtierea zonei cromatografice. 40. Utilizarea gel-filtrrii la separrile de grup ale proteinelor. 41. Rini schimbtoare de ioni utilizate n cromatografia de schimb ionic a proteinelor. Caracteristici. 42. Factorii care influeneaz rezoluia de separare i mobilitatea electroforetic. - pH-ul soluiei tampon sarcina electric este funcie de pH, deci alegerea unei soluii tampon cu pH corespunztor conduce la rezoluii de separare superioare; - difuziunea post-electroforetic apare de la oprirea curentului electric pn n momentul prelucrrii gelului i depinde de tipul de electroforez; - factori proprii particulelor care se separ : mrime, form, sarcin, concentraie, grad de hidratare, grad de disociere; - factori caracteristici mediului de separare : pH, vscozitate, intensitatea cmpului electric, timpul de migrare; 43. Aplicaii ale electroforezei frontale. 44. Calculul voltajului n sistemele electroforetice pe gel de agaroz submarine. 45. Factorii de care depinde viteza reaciei de polimerizare a acrilamidei : bisacrilamidei. - concentraia de monomeri i de radicali liberi - temperatura (reacia de iniiere necesit cldur) - puritatea reactivilor - concentraia de inhibitori : oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor, acesta putnd fi eliminat prin dezaerare. Ali inhibitori : amidele alifatice, H+ 46. Principiul separrii proteinelor prin cromatografie de afinitate. 47. Principiul separrii proteinelor prin cromatografie de afinitate cu ion de metal imobilizat. 48. Definii Rf n cromatografie i electroforez (asemnri i deosebiri). 49. Rezoluia de separare n cromatografie i electroforez. 50. Sisteme utilizate n denaturarea proteinelor n cazul electroforezei. 51. Rezoluia coloanei. 52. Prezentai succint o tehnic de cromatografie pe coloan. 53. Diagrama Ferguson n cazul a dou proteine care difer prin sarcin dar au aceeai dimensiune moleculara. Ce reprezint intersecia cu axa OY? Diagrama Ferguson se obine prin separarea celor dou proteine n geluri cu T% cresctor i reprezentarea grafic a mobilitii electroforetice relative (Rm, Rf) funcie de T%. Panta dreptei obinute este o msur a masei moleculare i se numete factor

de retardare. Intersecia cu axa OY reprezint mobilitatea electroforetic relativ n condiii libere i reprezint o msur a sarcinii electrice. n acest caz, diagrama Ferguson va fi reprezentat de 2 drepte paralele, cu pant egal, dar care vor intersecta axa OY n puncte diferite, n funcie de sarcina electric a proteinelor. 54. Componentele unui sistem de polimerizare n SDS-PAGE n condiii denaturante. Descriei succint rolul fiecrui component. Componente : Gel de poliacrilamid alctuit din monomerii acrilamid i bisacrilamid. Acrilamida este o substan care sufer o polimerizare cap-coad pentru a produce polimeri lungi. Aceti polimeri sunt legai n reea de ctre bisacrilamid, care este agentul de reticulare. APS este o surs de radicali liberi i are rol de iniiator al reaciei de polimerizare. TEMED este catalizatorul reaciei de polimerizare, crescnd viteza de polimerizare. SDS este un detergent ionic folosit pentru a denatura proteinele. SDS se leag la proteine n proporie mare, astfel nct sarcina intrinsec a proteinelor devine neglijabil fa de sarcinile negative induse de prezena detergentului. Soluia tampon are rol n meninerea pH-ului la valoarea dorit i de asemenea, confer contraionii necesari migrrii electroforetice. 55. Se prepar un amestec de polimerizare : 2,5 ml acrilamid:bisacrilamid 29,5:0,5g% 2,5 ml tampon Tris-HCl pH 8, 1,5M 100 l persulfat de amoniu 50 l TEMED ap distilat pn la 10 ml. Calculai T% initial i final i C% initial i final. T% initial=29,5+0,5=30% 100 ml soluie.30 g acrilamid+bisacrilamid 2,5 mlx x=0,75 g acrilamid+bisacrilamid 0,75 g acrilamid+bisacrilamid n 10 ml amestec de polimerizare T%.................................................100 ml T% final=7,5% C% iniial=C% final= 56. Punctul isoelectric al 6 fosfogluconat dehidrogenazei este 6. Explicai de ce tampoanele folosite n cromatografia pe DEAE-celuloz trebuie s aib pH mai mare de 6, dar mai mic de 9, pentru ca enzima s se lege la suport. Se va lega aceast enzim la CM-celuloz n acelai domeniu de pH folosit pentru DEAE-celuloz? Explicai. n ce domeniu de pH v ateptai s se lege aceast dehidrogenaz la CM celuloz? Explicai. DEAE celuloza este un schimbtor de ioni ncrcat pozitiv i leag proteine cu sarcini negative. La valori de pH mai mari de pH-ul izoelectric, proteinele au sarcin net negativ i enzima se poate lega la suport. Totui, nu se poate lucra la orice valoare de

pH, deoarece enzima i poate pierde activitatea biologic, dac se afl la un pH n afara domeniului su de stabilitate. CM-celuloza este un schimbtor de ioni ncrcat negativ i va lega doar proteinele cu sarcin net pozitiv. Enzima nu se poate lega la CM-celuloz n domeniul de pH 6-9, deoarece este ncrcat negativ. Pentru ca 6-fosfogluconat dehidrogenaza s se lege la suport ar trebui lucrat la o valoare de pH sub valoarea pI. 57. Ce metod cromatografic este adecvat pentru separarea urmtoarelor perechi de peptide : Ala-Ala-Lys i Ala-Phe-Lys? Pentru separarea celor dou peptide se poate utiliza cromatografia cu faz invers pe coloan, n care faza staionar este hidrofob i faza mobil este hidrofil, iar proteinele interacioneaz cu faza staionar prin intermediul aminoacizilor nepolari. Aceast metod este foarte specific, permind separarea peptidelor care difer printrun singur aminoacid. 58. Cunoscnd faptul c pI al urmtoarelor proteine sunt : Mioglobin(cal) 7 Hemoglobin(om) 7,1 Ribonucleaz A(bovina) 7,8 Citocrom c (cal) 10,6 indicai ce metode cromatografice ar fi adecvate pentru separarea perechilor de substane : mioglobin-hemoglobin i ribonucleaz A-citocrom c. Mioglobin-hemoglobin cromatografie de gel-filtrare Ribonucleaz A-citocrom c cromatografie de schimb ionic 59. Stabilii corespondena dintre proprietile proteinelor prezentate n coloana din stnga i metodele de separare i purificare prezentate n dreapta. a. Mrime 1. electroforeza b. Sarcin 2. Gel filtrare c. Legare specific 3. Salting-out d. Solubilitate 4. Imunoprecipitare 5. focalizare izoelectric 6. cromatografie de afinitate 7. cromatografie de schimb ionic 8. ultracentrifugare zonal 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. a, b a d c b c b a

60. Descriei succint principiul urmtoarelor tehnici de cromatografie : cromatografie pe hidroxiapatit, cromatografia n faz invers a proteinelor, cromatografia de interacie hidrofob, cromatografia de adsorbie tiofil, cromatografia de schimb ionic.

n care din aceste tehnici se utilizeaz sulfatul de amoniu? Care este rolul lui? Dar clorura de magneziu i clorura de sodiu? 61. Rolul glicinei n electroforeza multifazic pe gel de poliacrilamid. 62. Descriei 3 metode de determinare a masei moleculare n biochimia analitic.