Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cuprins ................................................................................................................................................. 2
1. Introducere ....................................................................................................................................... 3
2. Materiale i metode .......................................................................................................................... 6
2.1. Reactivi i materiale .................................................................................................................. 6
2.2. Instrumentaie ............................................................................................................................ 6
2.3. Prepararea standard i curba de calibrare .................................................................................. 6
2.4. Probele i standardele de extracie ............................................................................................ 6
2.5. Derivatizarea standardelor de histamin i extractelor de prob ............................................... 7
2.6. Condiie cromatografic ............................................................................................................ 7
3. Rezultate i discuii .......................................................................................................................... 8
3.1. mbuntirea metodei cromatografice ...................................................................................... 8
3.2. Studiu de stabilitate ................................................................................................................... 9
3.3. Identitate i specificitate ............................................................................................................ 9
4. Concluzii ........................................................................................................................................ 11
Bibliografie......................................................................................................................................... 12
2
1. Introducere
Determinarea histaminei este relevant pentru sigurana, calitatea i comerul petilor.
Recent, un studiu realizat de Uniunea European a comparat metodele Codex i metodele
mandatelor UE pentru analiza histaminei. S-a observat c rezultatele au fost subestimate i respectiv,
supraestimate [Evangelista et al., 2016]. Rspunsul la aceast problem s-a ncercat a fi gsit n
numeroase studii efectuate n scopul determinrii coninutului de histamin, prin sugerarea
diferitelor metode de analiz.
n proiectul de fa, este prezentat metoda propus de Altieri et al. (2016), pentru
determinarea histaminei din produsele de pete. Acetia propun pentru controlul european oficial al
produselor alimentare, determinarea histaminei din produsele de pete prin metoda RP- HPLCUV-
DAD. n acest scop, aceast metod a fost modificat i validat, conform instruciunilor
internaionale.
Histamina (2-(4-imidazolil) etilamin, Numr CAS 51-45-6) este o amin biogen, produs
post-mortem n muchiul petilor scombroizi, prin decarboxilarea histidinei (-aminoacid) de ctre
enzimele bacteriene sau enzimele tisulare. Formarea histaminei n produsele din pete este direct
corelat cu concentraia de histidin din esuturi i nivelul de microorganisme prezente n produs.
Au fost identificate ;i alte amine biogene n pete descompus - putresceina, cadaverina - i n
produse din pete - tiramina - produs prin decarboxilarea ornitinei, lizinei i respectiv, tirozinei
[Altieri et al., 2016].
Histamina este prezent ntr-un numr mare de alimente. De asemenea, este o substan
endogen care apare n mod natural n corpul uman, jucnd funcii fiziologice importante
[Evangelista et al., 2016; Gloria, 2005; Smolinska et al., 2014]. Cu toate acestea, un nivel ridicat de
histamin prezent n produsele alimentare pot provoca intoxicaii alimentare. Histamina sau
intoxicaia scombroid (sindromul scombroid) este lider n cauzarea intoxicaiilor alimentare,
asociate cu consumul de pete cu un coninut ridicat de histamin, ca atare, sau n prezena altor
amine biogene (spre exemplu putresceina sau cadaverina), care pot potenia efectul toxic al
histaminei.
De obicei, sindromul scombroid este asociat cu o varietate de simptome, inclusiv erupii
cutanate, grea, vrsturi, diaree, nroirea feei, umflarea feei i limbii, transpiraie, dureri de cap,
ameeli, palpitaii, arsur oral, gust metalic i hipotensiune. Cu toate acestea, nu au fost raportate
cazuri de via n pericol. Gravitatea simptomelor variaz n funcie de cantitatea de histamin
3
ingerat i sensibilitatea individului la histamin [Evangelista et al., 2016; Bulushi et al., 2009;
DAloia et al., 2011; Yesudhason et al., 2013].
n zilele noastre, a fost recomandat un consum crescut de pete, datorit proprietilor sale de
promovare a sntii. Cu toate acestea, unii peti pot conduce la intoxicaii cu histamin, n cazul n
care nu este asigurat calitatea [Evangelista et al., 2016]. Printre speciile de pete bogate n coninut
de histidin se numr tonul, macroul, sardinele, heringul, anoa i alte specii pelagice, care
reprezint producia semnificativ de pete la nivel mondial [Altieri et al., 2016].
Cnd aceti peti sunt supui la temperaturi de peste 4oC n timpul i/sau dup capturare,
inclusiv n timpul depozitrii, manipulrii i prelucrrii, decarboxilarea bacterian a histidinei poate
duce la formarea de histamin. Caracteristicile senzoriale ale petilor afectai de formarea nivelului
ridicat de histamin reprezint semne clare de alterare.
n 1996, organizaia Food and Drug Administration (FDA) din Statele Unite ale Americii a
implementat programul HACCP pentru fructele de mare, cu scopul preveniri pericolelor de
procesare a fructelor de mare, care ar putea duce la toxiinfecii alimentare. A fost stabilit un nivel de
de histamin de 50 mg/kg n port, pentru scombroide sau peti scombroizi. Codex Alimentarius
limiteaz histamina n pete i produse din pete la 200 mg/kg. Regelmentarea european limiteaz
coninutul de histamin n pete i produse din specii asociate cu un nivel ridicat de histidin, la 100
i 200 mg/kg [Evangelista et al., 2016].
Nivelul de histamin produs n scombroide sau n alt pete care conine histidin, poate fi
utilizat pentru a evalua gradul de alterare a petelui; este frecvent considerat ca fiind unul dintre
biomarkerii (indicator funcional sau biochimic) pentru controlul calitii, n timpul produciei de
alimente, transportului i marketingului [Peng et al., 2008].
O larg varietate de metode analitice sunt disponibile pentru detectarea coninutului de
histamin din produsele de pete: metode de rutin att cantitative, ct i calitative, folosind
colorimetrica, tehnici imunoenzimatice i cromatografice (GC, HPLC) [Altieri et al., 2016; Beljaars
et al., 1998; Lupo & Mozola, 2011]. Metoda HPLC cu diferite tipuri de detectoare a fost cea mai
rspndit metod utilizat.
n literatur, multe dintre metodele HPLC disponibile pentru determinarea histaminei din
pete necesit derivatizare chimic (clorur de dansil) sau o-ftalalaldehid pentru a mbunti
detectarea aminei biogenice prin absorbie UV-VIS sau fluorescen, iar pasul de fluorescen poate
fi pre-coloan, pe coloan sau post-coloan [Altieri et al., 2016; Beljaars et al., 1998; Eerola et al.,
1993; Staruszkiewicz, Waldron, & Bond, 1977]. De asemenea, metoda UHPLC, o tehnic de
4
separare de nou generaie a fost dezvoltat, dar aceasta necesit echipament specific [Altieri et al.,
2016; Latorre-Moratalla et al., 2009].
Metoda HPLC, utilizat de Altieri et al. (2016), pentru cuantificarea histaminei din pete i
produse pe baz de pete, folosete o faz lichid de extracie i derivatizare cu clorur de dansil,
potrivit metodei utilizate de Kse et al. (2011), cu eliminarea unui caz de interferen, prezent n
unele produse din pete (conserve). Noua metod a fost, de asemenea, validat potrivit ghidului
internaional [EURACHEM Guide, 2014], iar performana a fost evaluat prin participarea la un
sistem european de teste de competen.
5
2. Materiale i metode
2.1. Reactivi i materiale
Diclorhidratul de histamin 99%, 1,7 diaminoheptanul 98%, heptilamina 99%, clorura de
dansil i acidul percloric 70% au fost achiziionate de la Sigma-Aldrich (SUA). Hidroxidul de sodiu,
carbonatul acid de sodiu, soluia de amoniac (25% v/v) i acetona au fost achiziionate de la J.T.
Baker (Center Valley, PA, USA), acetonitrilul de calitate HPLC a fost achiziionat de la Sigma
Aldrich (Saint Luise, MO, USA), acetatul de amoniu a fost achiziionat de la MP Biomedicals
(Santa Ana, USA). Apa ultrapur a fost obinut ntr-un sistem de purificare Millipore (Elix/Milli-Q,
Milford, MA, USA).
2.2. Instrumentaie
Sistemul HPLC utilizat a fost Agilent seria 1100, echipat cu prelevator automat i detector cu
matrice de diode - Diode Array Detector (DAD), avnd coloan Zorbax (Eclipse XDB C18 4.6 x
150 mm 5 m).
Pe lng sistemul utilizat, echipamentul de laborator a inclus: pipete automate calibrate
Transferpette de la Brand Tech Scientific (Essex, CT, USA) i o centrifug PK 121 achiziionat de
la ALC DJB Labcare (Buckinghamshire, England).
7
3. Rezultate i discuii
3.1. mbuntirea metodei cromatografice
Pentru metoda lui Altieri et al. (2016), pe lng nlturarea interferenei vrfului
cromatografic al histaminei, principalele diferene, comparativ cu metoda lui Kse et al. (2011), sunt
gradientul utilizat pentru eluarea histaminei i pH-ul solventului n faza mobil. Cantitatea iniial
de solvent organic a fost redus, cu scopul de a crete timpul de retenie a histaminei i a mbunti
separarea. Cu toate acestea, aceast strategie nu a fost suficient i pH-ul solventului A a fost
modificat.
n plus, a fost introdus utilizarea unui standard intern. Au fost evaluate 1,7 diaminoheptanul
i heptilamina, iar 1,7 diaminoheptanul a fost selectat ca standard intern mai potrivit. n figura 1A i
1B sunt artate cromatogramele probelor de ton nainte i dup schimbrile fazei mobile i respectiv,
condiiilor de eluare.
Fig. 1.A. Cromatograma probelor de ton cu vrf de interferen (condiii cromatografice: acetat de amoniu 0.1 M
ca solvent A i acetonitril ca solvent B. Gradientul de eluie a fost iniiat cu 50% A i 50% B i terminat n 19
minute cu 90% B, iar timpul de rulare de 20 de minute.
8
Fig. 1.B. Cromatograma probelor de ton dup mbuntirile metodei (condiii finale cromatografice).
9
apoase cu histamina separat din probele de pete. La testarea posibilelor interferene dintr-o soluie
apoas, cu coninut de alte amine biogene (putrescein, cadaverin, spermidin, tiramin), nu s-a
depistat nicio suprapunere (Figura 2.).
Figura 2. Cromatograma unei soluii apoase cu coninut de amine biogene: 1. Putrescein timp de retenie (T.R.)
16.81 min. 2. Cadaverina T.R. 17.699 min. 3. Histamina T.R. 18,17 min. 4. 1,7 diaminoheptan T.R. 19.74
min. 5. Heptilamina T.R. 20.506 min. 6. Tiramina T.R. 21.645 min. 7. Spermidina T.R. 22.603 min.
10
4. Concluzii
Statele membre UE organizeaz planurile naionale de control pentru a garanta sigurana
produselor alimentare i pentru a asigura verificarea conformitii cu legislaia privind produsele
alimentare.
Histamina reprezint un risc pentru sntate, prin urmare, n ceea ce privete sntatea
uman i sigurana alimentar, este important s se determine cu exactitate nivelul su din pete i
produse din pete.
A foast dezvoltat o metod validat complet, adecvat testrii probei de control oficial, n
conformitate cu cerinele UE (Regulamentul CE 882/04), precum i ndeplinirii criteriului de
siguran alimentar (Regulamentul CE 2073/05).
Nivelurile de concentraie a studiului de validare i diferitele matrici de pete au fost alese
lundu-se n considerare mai multe produse pescreti, precum i limitele relative ale histaminei
stabilite n Regulamentul UE. Rezultatele obinute demonstreaz c metoda este adecvat pentru a fi
aplicat n controlul oficial al produselor alimentare. Mai mult dect att, sistemul implementat de
control al calitii garanteaz fiabilitatea rezultatelor obinute n timpul activitilor de control
oficiale europene.
11
Bibliografie
1. Beljaars, P. L., Van Dijk, R., Jonker, K. M., & Schout, L. J. (1998). Liquid Chromatographic
determination of histamine in fish, sauerkraut, and wine: Interlaboratory study. Journal of
AOAC International, 81, pp. 991998.
2. Bulushi, I. A., Poole, S., Deeth, H. C., & Dykes, G. A. (2009). Biogenic amines in fish: Roles
in intoxication, spoilage, and nitrosamine formation A review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 49, pp. 369377.
3. Csupor D., Boros K., Jedlinszki N., Hohmann J. A Validated RP-HPLC-DAD Method for the
Determination of L-Theanine in Tea, Food Analytical Methods, 2014, 7( 3), pp. 591596.
4. DAloia, A., Vizzard, E., Pina, P. D., Bugatti, S., Magro, F. D., & Raddino, R. (2011). A
scombroid poisoning causing a life-threatening acute pulmonary edema and coronary
syndrome in a young healthy patient. Cardiovascurlar Toxicology, 11, pp. 280283.
5. Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., & Hirvi, T. (1993). Liquid chromatographic
determination of biogenic amines in dry sausages. Journal of AOAC International, 76, pp.
575577.
6. EURACHEM Guide (2014). The fitness for purpose of analytical methods (2nd ed.).
URL:<http://www.eurachem.org/index.php/publications/guides/mv> 23.04.15.
7. Evangelista W.P., Silva T.M., Guidi L.R., Tette P.A.S., Byrro R.M.D., Santiago-Silva P.
Fernandes C., Gloria M.B.A. Quality assurance of histamine analysis in fresh and
canned fish. Food Chemistry 211, 2016, pp. 100106.
8. Gloria, M. B. A. (2005). Bioactive amines. In H. Hui & L. L. Nollet (Eds.). Handbook of
food science, technology and engineering (Vol. 4, pp. 138). New York, NY, USA: Marcel
Dekker
9. Kse, S., Kaklikkaya, N., Koral, S., Tufan, B., Buruk, K. C., & Aydin, F. (2011).
Commercial test kit and the determination of histamine in traditional (ethnic) fish products-
evaluation against an EU accepted HPLC method. Food Chemistry, 125, pp. 14901497.
10. Latorre-Moratalla, M. L., Bosch-Fust, J., Lavizzari, T., Bover-Cid, S., Veciana-Nogus, M.
T., & Vidal-Carou, M. C. (2009). Validation of an ultra-high pressure liquid
chromatographic method for the determination of biologically active amines in food. Journal
of Chromatography A, 1216, pp. 77157720.
12
11. Lopez Sabater, E. I., Rodriguez Jerez, J. J., Roig Sagues, A. X., Lupo, A., & Mozola, M.
(2011). Validation study of a rapid ELISA for detection of histamine in tuna. Journal of
AOAC International, 94, pp. 886899.
12. Peng, J., Fang, K., Xie, D., Ding, B., Yin, J., Cui, X., ... Liu, J. Development of an automated
on-line-pre-column derivatization procedure for sensitive determination of histamine in food
with high-performance liquid chromatography-fluorescence detection. Journal of
Chromatography A, 1209, 2008, pp. 7075.
13. Smolinska, S., Jutel, M., Crameri, R., & OMahony, L. (2014). Histamine and gut mucosal
immune regulation. European Journal of allergy and Clinical Immunology, 69, pp. 273281.
14. Staruszkiewicz, W. F., Waldron, E. M., & Bond, J. F. (1977). Fluorimetric determination of
histamine in tuna: Development of method. Journal of AOAC International, 60, pp. 1125
1130.
15. Yesudhason, P., Al-Zidjali, M., Al-Busaidi, M., Al-Waili, A., Al-Mazrooei, N., & Al-Habsi,
S. (2013). Histamine levels in commercially important fresh and processed fish of Oman
with reference to international standards. Food Chemistry, 140, pp. 777783.
16. www.agilent.com
13