REPLICAREA

• Modele replicative (experimentul Moselson

& Stahl)
• Mecanismul de policondensare selectivă a
ADN-ului
• ADN polimeraza I (enzima lui Kornberg)
• Origini de replicare, bifurcaţii de replicare
• ADN polimeraza III, alte proteine
 Modele replicative
conservativ semiconservativ dispers

ADN parental

ADN după o
rundă de
multiplicare
Moselson şi Stahl 1996
Mecanismul policondensarii selective a ADN-ului
 O- P
-
O P
O
O O
O Baza Baza
Baza Baza O
O 3'

Primer O Primer
HO
O O O
-
P
O O - O O
HO P O P O Baza Baza
O - - O
HO P O P O P O O
- - -
O
O O O Baza Baza
O
HO

HO 5'

Nucleozid trifosfat

catena ADN
matrita
Amorsarea sintezei catenei ADN
 ADN polimeraza I (enzima lui
Kornberg)

Artur Kornberg
(1918-2007)
Premiul Nobel 1959 medicină
Creșterea bulei de replicare
 Bifurcație de replicare (I)

Alberts, B. (2003). "DNA replication and recombination." Nature 421(6921): 431-435.

 Bifurcație de replicare (II)
1. prin actiunea helicazei, duplexul ADN se desface 6. Primaza asistă sinteza primerului
2. Primaza, atașată de helicază amorsează catena 7. Catena disociază de pe primosom
leader 8. Catena se asociază cu ADN polimeraza III de
3. Catena întîrziată după separare, în spatele pe ramura dicontinuă.
helicazei, suferă o buclare 9. Se continuă polmerizarea pana la intalnirea
4. La un moment dat bucla se atasează pe primerului fragmentului precedent, când
primosom fiind oreintată în sensul 5’-3’ al catena disociază de pe ADN poli III.
parcurgerii sale de catre acesta. 10. Aceasta se va reasocia cu primerul din
amonte.

Robinson, A. and A.M. van Oijen, Bacterial replication, transcription and translation: mechanistic insights from
single-molecule biochemical studies. Nature Reviews Microbiology, 2013. 11(5): p. 303-315.

Un film didactic al replicării : http://www.youtube.com/watch?v=HD_J8KhL4QU

SECVENȚAREA ADN
 Dideoxi nucleotidă

deoxinucleotida
 5'
C A T T CCG AC T T G A
3' catena de secvenţat
3' A A C T 5' primer
PPP
X

dXTP Sequenase 2 ddXTP O

(unul dintre componenţi

este -32 P marcat)
H H

ddATP ddCTP ddTTP ddGTP

ddA G G C T G A A C T ddC T G A A C T ddT G A A C T ddG A A C T

ddA A G G C T G A A C T ddT A A G G C T G A A C T ddGC T G A A C T

ddG G C T G A A C T

ddG T A A G G C T G A A C T

A C T G
G
T secvenţa
A complementară
Sens A celei căutate în
migrare G sensul sintezei
G
C
T
G
Tehnici ce evită utilizarea marcării radioactive, prin marcarea fluorescentă a:

•Identică a nucleotidei 5`terminale din primer (patru experimente, 4 benzi)

•Diferită a nucleotidei 5`terminale din primer (patru experimente, o bandă)
•Diferită a fiecărui tip de ddNTP (un experiment, o bandă)
Laborator de secvențare ADN
 ataşare primer, racire, terminare policondensare
denaturare demarare policondensare
capat 5' terminal fragmente
intermediare
Principiul metodei PCR fragmente
(Polymerase Chain Reaction) iniţiale

Kary Mullis (1944-) primeri

Premiul Nobel 1993

fragmente
de interes
(pentru
care
se dispune
de primeri)

fragmente
de finale ( se vor
regãsi în cea mai
mare proportie în
amestecul final)