Diagnostic in infectia HIV/SIDA

Beneficii: tratament, monitorizare, cresterea calitatii vietii

Temeri: agravarea bolii, scaderea calitatii vietii, contagiozitatea

Incarcarea virala: In faza acuta creste incarcarea virala mult, apoi scade si se mentine la un nivel
sesizabil dar mai scazut, pana in perioada SIDA, cand iar creste mult (10^7).
Numarul de celule CD4+: In faza acuta scade pana la un punct in care incarcarea virala este cea mai
mare, apoi creste iar, dar doar pana la vreo 600, dupa care incepe sa scada progresiv pana la moarte,
cand vor fi doar cateva.
Complicatii infectie HIV: encefalopatie

I. Diagnostic serologic:
- teste de triaj (sensibilitate): ELISA, teste rapide
- teste de confirmare (specificitate): western blot, radioimunoprecipitare, imunofluorescenta
indirecta
II. Detectia directa a virusului sau a produselor virale: izolare virala, detecia antigenemiei p24,
detectia acidului nucleic viral (ARN plasmatic sau ADN limfocitar)

I. Diagnostic serologic
ELISA:
1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG x enzima) 1h la 37ºC
4. Spalare
5. Incubare substrat 20-30 min la temperatura camerei
6. Citire la sectrofotometru: probe, martori si cut off.
Substratul adaugat este colorat de catre enzima in functie de cantitatea de anticorpi prezenti in cuva.
ELISA de competitie:
1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC
2. Spalare
3. Incubare substrat 20-30 min la temp camerei
4. Citire la spectrofotometru

Western Blot:
- test imunoblot folosit pentru confirmarea prezentei anticorpilor in diferite infectii. Se bazeaza pe
detectia anticorpilor defalcati pe grupe antigenice
- Se foloseste pentru: detectia proteinelor virale, caracterizarea preparatelor de anticorpi mono si
policlonali, determinarea specificitatii raspunsului imun imptriva antigenelor virale.
- Principiu: proteinele dintr-un lizat viral sunt separate electroforetic dupa greutatea moleculara
prind SDS-PAGE; apoi sunt transferate pe o membrana de nitroceluloza. Apoi se realizeaza detectie
prin anticorpi marcati radioactiv saun enzimatic (colorimetric)
-> electroforeza: se realizeaza pe gel de poliacrilamida, apoi proteinele sunt transferate pe o
membrana de nitroceluloza prin difuzie, electroforeza sau prin afinitate. Fixarea se face prin simpla
absorbtie pasiva, prin legaturi covalente, pe membrana diazotata sau prin legare specifica pe
membrana acoperita de anticorpi.
- Tehnica: SDS-PAGE; transfer; detectia anticorpilor
- criteriu de pozitivitate: 2 env + 1 gag
- gag: gp120, gp41, gp160
- env: p24, p17, p7/p9
Diagnostic:
Daca ELISA e negativ, se face duplicat. Daca si acesta este negativ inseamna ca ori nu este infectat ori
se afla in fereastra serologica -> in care se determina Ag p24, ADN proviral sau ARN HIV.
Daca ELISA este pozitiv se face western blot. Daca acesta este negativ, pacientul se poate afla in
fereastra serologica si se detecteaza Ag p24, ADN proviral sau ARN HIV. Dar poate fi necesara si
repetarea sau executarea unui alt test de confirmare. Daca WB e pozitiv inseamna ca are infectie HIV.

II. Diagnostic molecular

- Amplificarea tintei: PCR, NASBA
- Amplificarea semnalului: B-DNA

PCR: polymerase chain reaction. Este metoda utilizata pentru detectia ADN-ului de orice tip. Se
bazeaza pe obtinerea unui numar mare de catene tinta prin repetarea unui nr de N cicluri ce contin
in principal 3 etape:
- denaturarea: incalzire pentru separarea catenelor
- aditia primerilor la captele secventei tinta: prin racire
- extensia primerilor (sub actiunea ADN polimeraza Taq): se extinde capatul 3' al fiecarui primer;
prin incalzire
RT-PCR: reverstranscriere + PCR.
Etape:
- aditie primer la secventa tinta de ARN
- reverstranscriptazele catalizeaza extensia primerului prin incorporarea nucleotidelor
complementare
- rezulta sinteza ADN complementar pe secventa tinta ARN
Apoi se face PCR.

Detectia ampliconului:
- electroforeza in gel de agar, colorare cu bromura de ethidiu si comparare cu markeri de greutate
moleculare cunoscuta
- hibridizare cu sonde moleculare marcate complementar si apoi detectie (spectrofotometrica)

Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV

Pacienti aflati in fereastra serologica, nou-nascuti din mame seopozitive HIV, initierea si
monitorizarea terapiei antiretrovirale:
- incarcatura virala >5.000-10.000 corelat cu nr CD4 si status clinic
- incarcatura virala > 30.000-50.000 indiferent de nr CD4 si status clinic
- monitorizarea: reducerea incarcaturii sub 50 de copii ARN HIV/ml la 24 de saptamani