LIVIU ROMAN MARIUS BOJITA

ROBERT SANDULESCU DANIELA LUCIA MUNTEAN

VALIDAREA
METODELOR ANALITICE

Editura Medicali,
Bucurejti, 2007
 CUPRINS
2007 Editura MEDICALA
INTCODUCERE 3

VOLUMUL-I-

CAP.l.METODOLOGIAANALITICAGENERALA. 6
1.1 Alegerea metodei de analiza 8
Descrierea CEP a Bibliotecii Na|ionale a Romanies
CAP.2. PROBLEMS §1 TENDINfE ACTUALEINANALIZA. 18
Roman Liviu 2.1. Problems ?i exigente actuale ale analizei 18
2.1.1. Formularea problemei ce trebuie rezolvata prin analiza 19
Validarea metodelor analitice / Liviu Roman, Marius Bojita, 2.1.2. Exigente actuale ale analizei 19
Robert SSndulescu, Daniela Lucia Muntean — Bucure§ti: Editura 2.1.3. Tendinje actuale in analiza. 20
Medicala, 2007 2.1.3.1. Optimizarea proceselor de separare 22
2.1.3.2. Optimizarea detecfiei §i a determinarii cantitative. 31
2.1.4. Parametrii de calitate mai important! „ 32
ISBN 978-973-39-0610-0 2.1.5. Economicitatea analizelor 33

I. Roman Liviu CAP.3. SUBSTANTESTANDARD $1KIATEWALEFARMACEUTICEDE

II. Bojijfi Marius REFEKJNfA. 34
3.1. Rolul substanjelor standard sau etalon 34
IE. Sandulescu Robert 3.2. Materiale de referinta pentru analiza fermaceutica 37
IV. Muntean Daniela Lucia 3.2.1. Aspecte generate 37
3.2.2. Substance farmaceutice de referinfa. 37
543.9 3.2.3.Duratadevia|a,pastrarea§i data de expirare 38
3.3. Standardepentru impuritati farmaceutice. 39
3.3.1. Utilizare, siguranta 51 manipulare 40
3.3.2. Materiale de referinta pentru impuritati organice volatile produse de radian
international, USA 40
3.4. Substanfe controlate 41
3.5. Informatii generale de comanda 42
3.6. Farmacopeea americana ;i formularul de standarde de referin|a 42
3.7. Substance de referinfa, preparate biologice de referinta ?i spectre dupa
farmacopeea europeana 47
3.8. Substance de referinfa ale farmacopeii britanice 51
3.9. Farmacopeea franceza 52
3.10. Farmacopeeajaponeza 53
3.11. Farmacopeea elvefiana 54
3.12. Organizatia mondiala a sanatatii - OMS 54
Tiparul cxecutat la 3.13.Surscdeinforrnare 59
3.14. Substante de referinta pentru analiza impuritatilor farmaceutice 62
UNTVERSITATEA ,,BOGDAN-VODA" CLUJ-NAPOCA 3.15. Materiale de referinta pentru macro- §i microdozari 51 pentru analiza elementelor
SO • G8 inurme 65
400560 Cluj-Napoca • Str. Grigore Alexandrescu nr. 26A • Tel: 00-40-264- 598.787 3.16. Standarde pentru spectroscopie 69
Fax: 00-40-264- 591.830 • email: ubvfa.ubv.ro
 3.17. Unitafi de masura 51 conversia lor 70 CAP. 6. STABILITATEA MEDICAMENTELOR. 187
6.1.Notiuni introductive 187
CAP.4. PARAMETRIIDE CALJTATEPENTRUEVAWAREA REZULTATELOR 6.2. Calcule de stabilitate s. 188
ANALITICE. 77 6.3. Degradarea unor medicamente prin hidroliza 190
4.1. Exactitate si precizie 77 6.4. Degradarea unor medicamente prin oxidare 197
4.2. Tipuri deerori 79
4.2.1.Erori sistematice 79 CAP. 7. METODOLOGIA GENERALADE VALIDAREA METODELOR DE ANALIZA
4.2.2. Erori de metoda 80 §1 CONTROL 201
4.2.3. Erori personale 80 7.1. Rolul validarii in analiza farmaceutica. precizia, criterii de acceptanta. 201
4.2.4. Erori aleatoare 81 7.2. Rolul validarii in analiza farmaceutica 220
4.3. Tratarea statistics a datelor experimentale 83 7.3. Variabilitatea analitica si parametrii de validare 222
4.4.Utilizarea statisticii la evaluarea datelor analitice si asigurarea calitafii analitice..90 7.3.1. Precizia 222
4.4.1. Intervalul de incredere 91 7.3.2. Nivelele de precizie si variabilitatea deviafiei standard 222
4.4.2. Aplicarea statisticii la verificarea unei ipoteze 94 7.4. Criterii de validare a metodelor de analiza. 235
4.4.3. Compararea unei medii experimentale cu valoarea 7.4.1. Definipj mai importante 237
adevarata 95 7.4.2. Raportul de validare 252
4.4.4. Compararea a doua medii experimentale 96 7.5. Protocol comun de studiu pentru dozarea unei materii prime dintr-o formi
4.4.5. Compararea preciziei masuratorilor 97 farmaceutica .253
4.4.6. Detectarea erorilor personale grave 99 75.1. Studii de liniaritate, exactitate si fidelitate 253"
4.4.7. Estimarea limitei de detectie 101 7.5.2. Protocol pentru o forma farmaceutica reconstituita 254
4.4.8. Estimarea limitei de cuantificare 102 7.5.3. Protocol de liniaritate si exactitate 255
4.4.9. Trasareaunei curbe de etalonare 103 7.5.4. Estimarea regasirii medii 261
4.4.10.Calibrarea prin reducerea lucrului experimental fara pierderi de informafie..! 10 7.5.5. Fidelitatea. 262
4.4.11. Asigurarea calitatii analitice 119 7.6. Sensibilitatea 275
7.7. Limita de detectie 279
CAP.5. CALJTATEA MEDICAMENTULUI. OBIECTIVE§1 PROBLEMS. 125 7.8. Limita de cuantificare 281
5.1. Organizarea controlului de medicamente in romania 125 7.9. Robustetea. .282
5.2. Norme nafionale actuale elaborate de A.N.M., referitoare la calitatea 7.10. Test de validare a dreptei de regresie cu schimbarea prealabilS a variabilei 288
medicamentelor 127 7.10.1. Test de comparare cu zero a ordonantei la origina 291
5.2.1. Hotarareanr. 4/1999 a A.N.M 127 7.11. Analiza variantei-ANOVA 292
5.2.2. Reguliledebunapracticadelaborator 133 7.11.1. Notiuni generate 292
5.2.3. Colecjia de e$antioane 147 7.11.2. Analiza ANOVAcuun factor. 293
5.2.4. HotaraYea nr. 6/1999 privind activitatea A.N.M. in domeniul inspecjiei 7.11.3. Testul ANOVA cu doi factori 304
farmaceutice 149
5.3. Ordinul nr. 1030/2004 151 CAP. 8. VALIDAREA UNEIMETODELICHID - CROMATOGRAFIE. 313
5.3.1. Ordinulnr. 119/2004 151 8.1. Nofiuni introductive 313
5.3.2. Norma din 09/02/2004 164 8.2. Alegerea coloanelor $i a fazelor mobile 314
5.4. Concepte si norme Internationale privind calitatea medicamentului 172 8.3. Evaluarea preciziei 319
5.5. Cadrul juridic international 175 8.4. Evaluarea exactita|ii si a liniaritatii 319
5.6. Norme privitoare la asigurarea calitatii procesului de preparare a 8.5. Adoptarea deciziei de acceptanfa a metodei 325
medicamentelor 177 8.6. Limitele de detectie si de cuantificare. 326
5.6.1. Asigurarea calitatii procesului de preparare a medicamentelor 177 8.7. Specificitatea si selectivitatea metodei 327
5.6.2. Norme de buna fabricate 178 8.8. Alt! parametrii de performanja a metodei 329
5.6.3. Norme de buna practica in laboratoarele de analiza 180 8.9. Aplicafii practice 335
5.6.4. Aparatura 184 8.9.1. Validarea unor metode HPLC de determinare a albuterolului si
bambuterolului.... 335
 8.9.2. Determinarea simultana a tizanidinei si a rofecoxibului din forme farmaceutice 12.5.2. Exactitatea 473
de dozaj prin HPLC 51HPTLC 343 12.5.3. Precizia 473
8.9.3. Determinarea prin HPLC a aciclovirului 5! a impuritatilor inrudite 355 12.5.4. Specificitatea 475
12.6. Studiul de validare a dizolvarii substanjelor medicamentoase 480
VOLUMUL-n- 12.6.1. Prepararea probei substantei cercetate 481
12.6.2. Testarea calitativS a dizolvarii 483
CAP. 9. CR1TERII STANDARD DE VAUDARE. APLICAJULA DETERMINAREA IN 12.6.3. Validarea prepararii probei 484
UVA VITAMINEI D3 DIN VITAMINOL, DUPA SEPARAREA El PRIN 12.6.4. Validarea metodei de dizolvare 488
HPLC 377 12.7. Determinarea apei dintr-un ingredient farmaceutic activ printr-o metodS
9.1. Criterii standard de validare 377 coulometrica validata 491
9.2. Validarea unei metode de determinare in UV a vitaminei D3 din vitaminol, dup5 12.7.1.Reactivi simateriale 491
separarea sa prin HPLC 384 12.7.2. Validarea metodei 493
9.2.1. Separarea vitaminei D3 prin HPLC 384 12.8. Studiul de validare a unui test pentru metale grele .496
9.3. Dozarea vitaminei D3 in UV la 254 nm 387 12.8.1. Validarea metodei de dozare a metalelor grele 498

CAP. 10. VALIDAREA UNEI METODE GAZCROMATOGRAFICE. 400 CAP. 13.ASIGURAREA CALITATHPROCESULUIDEPREPARAREA
lO.l.Notiuniintroductive 400 MEDICAMENTULUI. 506
10.2. Conditii deoperarein cromatografia de gaze 403 13.1. Normele de bun5 fabricate sau preparare .._ 508
10.3. Aplicafii ale cromatografiei de gaze in analiza si controlul medicamentelor....406 13.2. Validarea stabilitafii 509
10.3.1. Separarea GC a unor barbiturice si aunor amfetamine si precursori 410 13.3. Norme de buna practica in laboratoarele de analiza 510
10.4. Cuplajul GC-MS asocial cu radia|ii moleculare supersonice In analiza de mare 13.4. Cerinfe $i reglementSri ale validarii in industria medicamentelor. 515
viteza 412 13.4.1 Definifii importante 517
10.5. Cuplajul LC-GC 418 13.4.2. Analiza substan|elor inrudite 518
10.6. Cuplajul HPLC-HRGC 420 13.4.3. Convenabilitatea analizei unei substanje inrudite 521
10.7. Determinarea urmelor de solvent! organic! dintr-un complex aluminic 422 13.4.4. Validarea experimentala a substantelor inrudite 524
10.7.1 Efectuarea analizei 422 13.4.5. Robusteteaunei metode de analiza. 532
10.7.2. Protocol operator 426 13.5. Unele aspecte privind validarea producerii industriale a medicamentelor 533
10.7.3.DatelevaIidariipropriu-zise 433 13.6. Standarde calitative in medicatia generica 538
13.6.1. Asigurarea calitafii medicamentelor generice 538
CAP. 11. SPECTROSCOPIA RMN IN ANALIZA MEDICAMENTELOR 436 13.6.2, bioechivalenta medicamentelor generice 539
11.1. Aspecte generale 436
11.2. Spectroscopia RMN in farmacopeile mtemajionale 438 CAP. 14. UTILIZAREA CHEMOMETRIEI IN ANALIZA §1CONTROLUL
11.3. Detectia impuritatilor farmaceutice 440 MEDICAMENTELOR 542
11.4. Validarea spectroscopiei RMN - cantitativS 443 14.1.Preprocesareaprobelor 542
11.4.1. Aspecte generale 443 14.2. Netezirea sau curatirea semnalului analitic de zgomotul de fond 543
11.4.2.BazeleRMN-cantitative 444 14.2.1. Netezirea medie 546
11.4.3. Validarea unei metode RMN 445 14.2.2. Cura^irea medie succesiva 547
14.2.3. Curatirea mediana succesiva 548
CAP. 12. VALIDAREA ANALITICA IN ETAPA DECERCETARE-DEZVOLTARE A 14.2.4. Curatirea polinominala succesiva 548
MEDICAMENTULUI 462 14.2.5. Curajirea cu filtrul Fourier 548
12.1. Cercetarea pentru noi molecule active si faza preclinica 463 14.3.Corectii aleliniei debaza 550
12.2 Fazele clinice de testare 463 14.3.1. Abordarea de modelare explicits 550
12.3. Aplicarea gmp in procesul de dezvoltare 465 14.3.2.Derivate 552
12.4. Cerinfele unui sistem convenabil pentru testarea eficientei 470 14.3.3. Diferenta simpla continua 553
12.5. Parametrii strategiilor de validare 471 14.3.4. Diferenta medie succesiva/continua 554
12.5.1. Liniaritatea 471 14.3.5. Metoda Savitzky-Golay si Gorry 554
 14.4. Tipuri de funcjii de calibrare 555 16.13.2. Prepararea solutiilor probelor si de standarde de calibrare si Stabilitatea
14.4.1. Nivelul unic de calibrare 555 lor. 639
14.4.2. Calibrarea multi - nivel 555 16.13.3. Procedeul analitic sau modul delucru ..639
14.5. Controlul calitatii formularilor farmaceutice continand catecolamine 558 16.13.4. Validarea rezultatelor 641
14.5.1. Designul statistic experimental aplicat la medicamente 559 16.14. Determinarea rapida a canabinoidelor in produsi alimentari de canepa prin
14.5.2. Aplicarea designului statistic la determinarea nimesulidei si a combinatiei HPLC-MS 645
diazepam-otiloniu 560 16.14.1. Date generale 645
14.5.3. Determinarea CZE a clortlidratului de rufloxacina 561
14.5.4. Utilizarea statisticii variate pentru determinarea altor medicamente 563 CAP. 17. VALIDAREA METODELOR BIOANALITICE NO1. 657
14.5.6. Designul Plackett-Burmann 565 17.1. Nojiuni introductive * 657
14.6. Metode chemometrice de determinare a unor antidepresive si studiul solubilitajii 17.2. Profilele preciziei 659
lor 566 17.3. Metodadozei eficace 661
14.6.1. Metoda raportului spectrelor derivate cu divizor dublu 568 17.4. Estimarea exactitajii 662
14.6.2. Determinarea experimentala a imipraminei, amitriptilinei §i perfenazinei....570 17.5. Test de validare a susceptililitatii antibiotice 666
14.6.3. Teste aplicate pentru tablete 571 17.6. Determinarea homocisteinei plasmatice prin metodologia fluorescenta de
14.6.4. Rezultate si discufii 571 polarizare imunoexperimentalS 667
14.6.5. Exprimarea valorii analitice 577 17.7. Reactivitatea incrucisata. 671
14.6.6. Uniformitatea continutului. teste de dizolvare 579 17.8. Determinarea activitatii enzimatice a p-galactoxidazei.. 672
17.9. Utilizarea unor derivafi de hapten pentru prepararea imunogenului 674
CAP. 15. VAL1DAREA $1INTERPRETAREA DATELORINANALIZA 17.10. Stabilirea valorilor care trebuie sa fie eliminate pentru experienjele
CLINICA. 583 semicantitative ale canabinoidelor 676
IS.l.NoJiuni introductive, 583 17.11. Exemplificarea analizei statistice ANOVA a unor date bioanalitice 678
15.2. Obiective in chimia si analiza clinica. 585
15.3. Interpretarea informatiilor si luarea deciziilor. 586 CAP. 18. NORMEDEACREDITAREA LABORATOARELORDEANALIZA $1
15.4. Abordarea Bayesiana in luarea deciziilor 593 CONTROL 690
15.5. Validarea generate a rezultatelor testelor clinice si atestelor analitice ....595 18.1. Aspecte generale referitoare la acreditare 690
15.6. Analiza caracteristicilor receptorului operator 599 18.2. Acreditarea laboratoarelor de analize in Europa 691
18.3. Criteriide acreditare 693
CAP. 16. VALIDAREA METODELOR BIOANALITICE CLINICE 610 18.4. Etapele acreditarii laboratoarelor de analize 694
16.1.No{iuni generale 610 18.5. Normede acreditare a laboratoarelor de analize in Romania 701
16.2.Practica validarii actuale a metodelor bioanalitice 612 18.6. Unele aspecte ale acreditarii laboratoarelor de analiza din universitati 705
16.2.1. Definitii siparametrii important! 612 18.6.1. Norme ISO si IEC pentru asigurarea calitatii metodelor de analiza 707
16.3. Selectivitatea metodelor bioanalitice 614 18.6.2. Certificarea calitafii managementului unui laborator INNA 708
16.4. Standarde de referinfa si curba standard 615 18.6.3. Competenta tehnicS a personalului 709
16.5. Exactitatea si precizia 617 18.6.4. Materiale de referin{5 si de calibrare '. 709
16.6. Regasirea procentualS 617
16.7. Stabilitatea analitului 618
16.8. Alte verificari suplimentare 619
16.9. Determinarea metabolifilor. 622
16.10. Cercetarea stereoizomerilor 623
16.11. Raportul de validare 623
16.12. Obiectivele chimiei analitice clinice 625
16.12.1. Evaluarea exactitafii 634
16.13. Determinarea bioanalitica a lumefautrinei si validarea metodei 638
16.13.1. Substante $i metoda 638
 INTRODUCERS

Validarea unei metode de analiza este o metodologie de verificare si de confirmare a

validitatii stiintifice a unei metode de analiza. In acelasi timp, conceptul de validare poate
fi inteles si ca metodologie de acreditare stiintifica a unei metode de analizS, avand drept
scop sa demonstreze ca metoda considerata (sau procedeul analitic) corespunde utilizarii
pentru care a fost conceputa, elaboratfi si verificata.
Dupa Farmacopeea Americana, USP-XXI, validarea unei metode analitice este un
proces prin care, utilizand studii de laborator, deci prin determinari experimentale si ana-
lize matematico-statistice, se confirms ca performanfele caracteristice ale metodei validate
satisfac cerintele pentru aplicatiile practice intentionate. Prin urmare, validarea. ca
metodologie de verificare si confirmare, are ca obiect cresterea increderii comunitatii
stiintifice in rezultatele fumizate de metodele de analiza si control, tinand seama de varia-
bilitatea ce apare la aplicarea unei metode de citre diferi|i analisti, in laboratoare diferite,
uneori cu aparatura diferita, dar de acelasi tip etc.
Se poate spune ca validarea este o components importanta in determinarea si asigu-
rarea increderii in repetabilitatea si rcproductibilitatea rezultatelor analitice, in asigurarea
calitatii acestor rezultate, deci si in metoda de analiza ce conduce la aceste rezultate.
Conceptul de validare si lucrarile numeroase ce au ca obiect aceasta components
importanta a analizei este relativ nou. In 1985 a avut loc o conferinta care a reunit produca-
torii americani de medicamente (Pharmaceutical Manufacturing Association, Quality
Control Section) si reprezentantii Comisiei pentru Farmacopeea Americana, conferinta la
care au fost elaborate unele recomandari privind validarea metodelor de analiza. In 1986
revista "Pharmacopoeial Forum" a publicat un articol intitulat "Current Concept for the
validation of compendia! assays", care a starnit dezbateri si confruntari de opinii in perioa-
da 1986-1988. Din aceste dezbateri s-a desprins concluzia ca este necesara elaborarea unui
capital pentru USP, privitor la validarea tuturor metodelor analitice ce se aplica la medica-
mente, capitol ce urma s5 fie oficializat in USP, editiile XX -XXV.
 in 1988, tot revista "Pharmacopoeial Forum" a publicat un text intitulat "Validation Sandulescu, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998), au aparut numeroase lucrari, review-uri, pu-
of compendial assay-guidelines", care a fost apoi inclus in suplimentul USP-XXI, ca un blicatii, ca si noi documente si norme europene, americane etc, ceea ce a impus revizuirea,
capital aparte intitulat "Validation of compendial methods" pus in aplicare din ianuarie completarea si corijarea unor erori sau scapari, astfel incat sa poata fi elaborate aceasta a
1990, capital ce a aparut si in USP XXII - XXV. doua editie, imbunatatita, mai extinsa si mai utila prin problematica si exemplele mai
Pe de alta parte, pentru a veni in sprijinul producatorilor de medicamente, in vederea bogate si mai bine puse la punct.
obtinerii autorizatiilor de fabricate pe baza dosarelor ce le-au intocmit pentru validare, In context, este de mentionat ca, in actuala editie, sunt cuprinse si Normele Nationale
"Federal Code of Regulation" a publicat un text intitulat "Guidelines for submitting sam- ale Agentiei Nationale a Medicamentului, referitoare la calitatea medicamentului (1999),
ples and analytical data for method evaluation". precum si Ordinul nr. 1030/2004 al Ministerului Sanata|ii, pentru modificarea Ordinului
Concomitent, au avut loc diverse si ample comentarii asupra aceleiasi probleme a Ministerului Sanatatii nr. 119/2004 pentru aprobarea "Normelor privind autorizarea si
producatorilor europeni de medicamente, dezbateri ce au determinat "Comitetul CEE pen- fiinctionarea laboratoarelor care efectueaza analize medicale". Tot aici este de precizat ca
tru specialitati fannaceutice, Grupul pentru calitatea medicamentelor", sa elaboreze o nota in acest an (28.03.2005) au aparut uncle "Norme metodologice de acreditare", elaborate de
explicativa al carei text final a fost adoptat in august 1989 cu Nr. CEE/844/87 si care a con- RENAR - Romania, care este Asociatia de Acreditare din Romania (Romanian
stituit apoi nucleul elaborarii unor reglementari privind metodologia validarii metodelor de Accreditation Association).
analiza si control in tarile europene avansate, mai ales in acelea care sunt membre ale CEE Din aceasta succinta expunere de motive rezulta necesitatea $i insemnatatea
(Franta, Marea Britanie, Germania, Belgia, Italia, Olanda etc.). elaborarii si publicarii acestei lucrari utile pentru cercetatorii analisti din toate domeniile de
Cu toate divergentele de opinii privitoare la conceptele si definitiile utilizate sau la activitate, cu precadere pentru cei ce lucreaza in industria medicamentelor, in laboratoarele
modul de abordare a problemelor, necesitatea validarii tuturor metodelor si procedeelor de analiza si control, in laboratoarele clinice (de chimie clinica), de biochimie, de biologic
analitice este azi unanim acceptata. In perioada 1990- 1996 au aparut numeroase materiale in general si de biologic moleculara, in laboratoarele de control al mediului (apa, aer, sol,
si carti privitoare la metodologia validarii metodelor si procedeelor de analiza, ca si la apli- alimente) etc. Apreciem cJ in prezent si cu atat mai inult in viitor nu se mai poate concepe
carea practica a acestei metodologii. fn Romania, aceasta este prima carte de acest fel, si accepta sa se lucreze cu metode de analiza nevalidate, neverificate, care nu indeplinesc
prima editie fiind publicata in anul 1998. criteriile stiintifice de acceptanta impuse de comunitatea stiintific^ internationala si mai
fn prezent exista o adevarata strategic a validarii, in stransa legatura cu conceptele si ales de cea europeana, in perspectiva aderarii Romaniei la Comunitatea Europeana.
tendintele ce sunt incluse in strategia analitica in general, desigur cu accent pe strategia Suntem deschisi observatiilor si sugestiilor cititorilor si confratilor nostri.
analizei si controlului de medicamente, care implica analiza si controlul puritatii materiilor
prime utilizate in producerea medicamentelor, a produsilor intermediari, a substantelor
medicamentoase finale si a formelor farmaceutice rezultate prin conditionarea lor.
Pe de alta parte, este cunoscut faptul ca nici o substanta medicamentoasa sau nici un Autorii
medicament nu poate patrunde pe piata europeana si pe cea americana fara a fi insotite de
dosarul de validare aferent.
Trebuie subliniat faptul ca principalul scop al validarii consta in selectarea celor mai
bune si mai accesibile metode de detectie si de dozare a unei specii medicamentoase, sau
a unor impuritati farmaceutice, produsi de degradare (metaboliti), numiti si substante inru-
dite sau a unor componente biologice. Astfel de metode se bazeaza pe date si performante
obiective, deziderat cerut de reglementarile in domeniul analizei si controlului de medica-
mente, ca si de cele referitoare la laboratoarele clinice, care trebuie sa aiba la indemana,
atunci cand se introduc metode sau teste noi de analiza, documentatia aferenta privind
descrierea detaliata a metodei si a datelor validarii.
insemnatatea deosebita a validarii rezulta si din faptul ca rezultatcle analitice
fumizate de metodele confirmate si acceptate trebuie sa fie de mare Jncredere, deci sa fie
sigure, deoarece, pe baza lor si a altar date clinice, se adopts decizii de mare raspundere in
stabilirea diagnosticului si a conduitei terapeutice, de care depinde refacerea omului
suferind.
Mai trebuie subliniat ca, de la aparitia primei editii a lucrarii "Validarea metodelor de
analiza si control, Bazele teoretice si practice" (Liviu Roman, Marius Bojita, Robert
 Formularea iniJialS a problemei In analizS.

Atomi, ioni, grupari Cantitatea, starea,

functionale, molecule concentratia

Pregatirea ejantionului
prin pretratare

(^SeparareJ) Trecere intr-o

CAP. 1. METODOLOGIA ANALITICA GENERALA forma masurabil&

Metode combinate

fn toate domeniile. de activitate umana se folosesc metode de analiza a substantelor

Selectarea metodei
chimice, medicamentoase sau nu, de mteres biologic si medical, de interes alimentar etc.,
- fizica
metode care trebuie sa fie performante, deci de foarte buna calitate. - chimica
Marimea masurata
Conceptul de performanta inseamna valoare, ceea ce in orice domeniu inseamna cali- - directa
tate, iar calitatea este cerinta fundamentals a dezvoltarii, adica a progresului stiin^ific, - indirecta
tehnic si tehnologic, ceea ce inseamna, mai ales in condi^iile actuate, competitie intre pro-
ducatorii de medicamente, dar si intre producatorii de bunuri de larga utilitate publica.
Aceasta competitie in domeniul medicamentului inseamna calitatea materiilor prime, a
Rezultatul masuratorii
produsilor intermediari, a produsilor finali si a formelor de dozaj, respectiv a medica-
mentelor in forma finala de distributie. Calitatea inseamna si stabilitatea medicamentelor
in timp si lipsa toxicitatii si actiunilor adverse sau eel putin minimizarea acestora. Dar cali- Analiza calitativa, cantitativiL,
tatea, in orice etapa si in orice domeniu, se atesta prin buletinele de analiza, deci prin determinari de structura
metodele de analiza fizice, chimice si instrumentale, iar calitatea metodelor de analiza se
atesta prin validarea acestora conform metodologiei de validare, metodologie care are la
baza metodologia analitica ale carei etape si faze sunt reprezentate prin Strategia analitica Evaluarea:
- analiza erorilor
(Fig. 1.1). Prin parcurgerea tuturor acestor etape si a rigorilor ce se impun in fiecare etapa, - prezentarea datelor
se urmareste optimizarea continua a metodelor de analiza, in pas cu dezvoltarea stiintifica - protocol analitic
si tehnologica, ceea ce inseamna optimizarea procedeelor de separare a analitilor, opti-
mizarea detectiei (specificitate, selectivitate, limita de detectie), a determinarii cantitative
(exactitate. precizie, repetabilitate, reproductibilitate, limita de cuantificare) si a evaluarii Fig. 1.1. Strategia analitica generals
rezultatelor analitice, care trebuie sa fie obiective si de mare incredere; adica ele trebuie sa
fie sigure, iar acest ultim aspect este de importanta capitala, deoarece pe baza sigurantci Din examinarea schemes strategiei analitice generale se poate constata ca
rezultatelor analitice se iau decizii, ceea ce, in domeniul medical si farmaceutic, inseamna strategic cuprinde practic toate etapele executarii unei analize, care implied:
calitatea viejii si redarea sansei de a trai oamenilor bolnavi. 1) formularea si cunoasterea problemei care trebuie rezolvata prin analiza;
2) cunoasterea calitativa a naturii si compozijiei materialului dat pentru analiza:
atomi, ioni, molecule, molecule complexe, macromolecule, grupari functionale,
 natura matricei etc., precum si cantitatea de material de aualizat, starea lui, even- Tabelul 1.1- ClasiGcarea epantioanelor de analiza in functie de cantitatea de analit
tual concentratia aproximativa; $i de tipul epantionului
3) esantionarea, care implica pregatirea materialului prin omogenizarea lui si eval-
uarea cantitatii potrivite de material in vederea executarii analizei; S domeniul de masa al esantionului
P C proportia P
4) pregatirea esantionului, deci a probei, in cadrul unui proces complex de pregatire Q domeniul de masa absoluta
si pretratare a probei, care implica: cantarirea exacts a cantitatii de proba, esantioane microscopice
+2 grame (g) +2
dizolvarea (cu evitarea contaminarii cu impuritati si a pierderilor de analit), +1 +1
imbogStirea / preconcentrarea analitului pentru a-1 aduce la un nivel de concen-
0 decigrame (dg) compus principal 0
tratie detectabil si dozabil, purificarea analitului prin separare (extractie, cro-
-1 centrigrame (eg) semi-micro -1
matografie etc.), transformarea analitului intr-o forma masurabila, prin derivati- -2 miligrame (mg) microscopic compus secundar -2
zare chimica, utilizand metode potrivite, singure sau combinate sub forma unor -3 micrograme ( g) submicroscopic -3
cuplaje de metode, una de separare si alta de detectie-dozare; -4 ultramicroscopic urme -4
5) marimea ce trebuie masurata si selectarea metodei de masurare, efectuarea -5 -5
masuratorii, care serveste in analiza calitativa (detectie) si cantitativa (dozare), -6 nanograme (ng) -6
pentru determinari structurale etc.; -7 ppm -7
6) evaluarea rezultatelor analitice si a erorilor; -8 -8
7) prezentarea datelor sub forma unui protocol analitic care trebuie sa includa -9 picograme (pg) -9
descrierea tuturor fazelor si procedeelor utilizate, rezultatele finale obiectivizate -10 ppb -10
prin calcule matematice si statistice; -11 microurme -11
8) formularea concluziilor si luarea deciziei in raport cu problema analitica data -12 femtograme (fm) -12
initial si cu ceea ce asteapta beneficiarul in legatura cu aceasta. -13 nanourme ppt -13
-14 -14
-15 attograme (ag) -15
1.1. Alegerea metodei de analiza -16 ppq -16
-17 picourme -17
Alegerea metodei de analiza se face tinand seama de o serie de. criterii, intre care: -18 -18
problema analitica care trebuie sa fie rezolvata, natura probei si complexitatea matricei
probei, etapele necesare a fi parcurse, operatii care trebuie sa fie facute, cantitatea de mate- Nota: p reprezinta exponentni lui 10 f al unitatii d& masurare
rial (esantion) data pentru analiza, de cerintele impuse de beneficiar in privinta speci-
ficitatii, selectivitatii, sensibilitatii, costurilor, sigurantei (certitudinii) datelor care se obtin
etc.
finand seama de toate aceste aspecte, nu se poate face o clasificare generala rig-
uroasa a tuturor metodelor de analizS, dar se pot face clasificari in functie de anumiti Tabelul 1.2. Tipuri de component! fi marimea probei
parametri. Astfel, in tabelul 1.1 este prezentata o clasificare a metodelor de analiza in
functie de cantitatea de analit si de tipul sau forma esantionului. Component! de analizat
O clasificare a componentilor in functie de natura lor si de marimea probei ce trebuie Component! Component! Component! minor! Grame proba
luata in lucru este prezentata mai sugestiv si mai exact in tabelul 1.2, iar in tabelul 1.3 este major! secundari (urme)
10-18 - 10-19 10-21 10-24. 1Q-27 10-18 (attogramica)
prezentata sensibilitatea comparative a metodelor de analiza.
La alegerea metodelor de analiza trebuie sa se tina seama de domeniile de concen- ~ io-15 - io-16 10-18 10-21 . i0-24 10-15 (femtogramica)
10-12 - 10-13 10-15 10-18 . 10-21 10-12 (picogramica)
tratie in care o metoda ofera rezultate de incredere, deci exacte si precise. De aceea, in
tabelul 1.4 sunt prezentate metodele cantitative de analiza In functie de domeniile de con- 10-9 - 10-10 io-12 10-15-10-18 1Q-9 (nanogramica)
centratie in care pot ele opera si unele dintre caracteristicile lor. In tabelul 1.5 sunt date
6
IO- -IO- 7
10-9 10-12-10-15 1Q-6 (microgramica)
3
metodele electroanalitice si domeniile de concentratie in care opereaza si de care depinde IO- - l(H io-« 10-9-10-12 10'3 (miligramica)
sensibilitatea lor.
Tabelul 1.3. Compararea sensibilitatilor metodelor analitice in funcfie de tipul lor Urtnare din pag. 10
Cromatografia 10-4-10-9 2-5 organic buna rapida - moderat -
Metoda de analizl Sensibilitatea (multicom- moderata mare
microgravimetrica pana la 10 g (1 ng) ponent)
(Crotnatograiia pana la 5 organic mare mare ridicat
microvolumetrica intre 10'9 - lO'10 g (1 - 0,1 ng)
capilara micelara 10-18
absorbjia atomica electrotermala pana la 1Q-11 g (0,01 ng) cu detectie (6000 mol.)
fluorimetria pana la lO'11 - 10'12 g (0,01 ng - 1 pi5) fluorescenta)
Spectroscopia atom- 10-7-10-12 5 anorganic mare mare ridicat
analiza prin masuratori cinetice panaialO- 1 3 g(0,lpg)
ica de emisie
Cromatografia de gaze panalalO- 1 3 g(0,lpg) Spectroscopia atom- 10-6-10-9 5 anorganic mare mare moderat -
activarea cu neutron! pana la 10'14 g (0,01 pg) ica de absorbtie ridicat
tehnici radioizotopice pana la 1047 g (0,01 ag) Cinetica 10-2-10-10 3 - anorganic buna - mare moderat
- organic moderata
Intr-o maniera similara, se pot face subclasificari ale diverselor tipuri de metode, de - enzime mare
exemplu cromatografice, specrrofotometrice, termice etc. RadiochimicS. 10-12-10-15 2-3 - anorganic mare mare mare
- organic
In acest context trebuie precizat ca, pentru a obtine rezultate analitice bune, de
mcredere, este necesara o atenta prelevare si. pregatire a probei. Asa, de exemplu, primul
pas in efectuarea unei analize este obtinerea unei probe reprezentative si omogene, in care Tabelul 1.5. Tipuri de metode electroanalitice $i domeniile de concentrate
concentratia analitului este uniforma in toata masa materialului de analizat sau in tot volu- in care se pot aplica
mul solutiei sale. Omogenizarea probei, mai ales daca se pleaca de la materiale solide,
implica triturarea atenta a materialului (de exemplu, comprimate), fara pierderi si fara con- stripping voltametria

polarografia puls diferentiala

Tabelul 1.4. Clasificarea metodelor cantitative de analiza $i caracteristicile lor
Domeniul Viteza polarografia cu scanare rapida.
Precizia Tip de Selectivi-
Metoda de cone. de Costul
aprox. % analit tatea polarografia AC
ruol/L executie
CHIMICE coulometria; 1 const,
Gravimetria 10-1-10-2 0,1 - anorganic slaba - mica scazut voltametria - electrod solid
- organic moderata polarografia DC
Titrimetria chimica lo-i-io-4 0,1 - 1,0 - anorganic idem idem idem
amperometria
- organic
INSTRUMENTALE potentiometria
Titrarea lo-i-io-6 2 - anorganic buna mare idem I '
coulometria; E const
potenjiometrica
Voltametria 10-3-10-10 2-5 - anorganic buna moderata moderat j_
- organic 10'° 10-'M 10 M 107M 10'M 10 M
4
Electrogravimetria lo-i-io- 0,01 - 2 - anorganic moderata slab- moderat
- organic moderata
Spectro fotometria 10-3-10-8 2 - anorganic buna mare - slab- taminarea lui. La fel de importanta este si etapa de dizolvare / pretratare, prin care trebuie
- organic moderata moderata moderat sa se asigure un domeniu de concentratie a analitului corespunzator domeniului de concen-
Spectrotluorimetria 10-6-10-9 2 - 5 - organic moderata moderata moderat tratie in care poate opera metoda. De regula, la prelevarea si pregatirea / pretratarea mate-
rialelor date spre analiza trebuie sa se aiba in vedere cantitatea necesara efectiv analizei,
Continuare in pag. 11
10 11
dar si asigurarea unei contraprobe in cuantum indestulator pentru eventuale verificari sau
expertize. Exista si cazuri in care probele sunt cantitativ mici, de aceea ele se consuma inte-
gral sau, daca este posibil, se aleg metode de analiza nedestructive.
In cazul probelor biologice (sange, urina etc.), compozitia lor variaza mult daca
recoltarea se face inainte si dupa masa sau chiar dimineaja, inaintea servirii mesei (mai ales
pentru urina) care, uneori, trebuie sa fie colectata pe 24 ore.
Analistul trebuie sa tina seama ca pentru conservarea probelor/analitilor trebuie sa se
adauge unii reactivi, cum este NaF pentru glucoza, sau anticoagulanti, ca de exemplu
acidul citric si citratul de sodiu, substante care pot afecta si falsifica rezultatele analitice.
Este important sa se pastreze contraprobe pentru expertize in caz de litigiu sau de nevoia
repetarii analizei pentru dobandirea certitudinii lor.
Frecvent, la obtinerea probelor trebuie sa se ia unele precautiuni pentru a preveni si
micsora contaminarea, pierderea de analit si descompunerea probelor sau modificarea
matricei lor datorata aerului, luminii sau containerelor utilizate. De asemenea, probele tre-
buie sa fie ferite de umezeala, iar probele care contin enzime usor degradabile trebuie sa
fie analizate imediat dupa prelevare. Aceasta prevedere este valabila si pentru concentratii-
le in urme, care se pot pierde prin adsorbtie pe peretii containerelor in timpul transportului
si conservarii.
fn cazul probelor solide, acestea trebuie sa fie uscate in prealabil, deci inaintea efec-
tuarii analizei, in etuva, la 110-120°C, timp de 2 ore, dupa care se introduc in exicator pen-
tru a se raci in absenta umiditatii si a aerului.
Toate aspectele mentionate mai sus trebuie respectate si avute in vedere, deoarece
cuantumul erorii produse in etapa de esantionare-prelevare este de 40-45% din eroarea
totals, deci foarte mare si ea trebuie redusa la maximum.
Esantionarea include, in primul rand, obtinerea unor probe analitice "valide", omo-
gene si reprezentative, de aceea aceasta etapa este una dificila in mersul analizei si ea nece-
sita o anumita "tratare statistica" pentru corecta prelevare si prelucrare-pregatire a probelor.
Aceasta tratare statistica este necesara deoarece exactitatea si precizia masuratorilor
analitice sunt afectate si limitate de erori intr-o masura mai mare decat in etapele de
masurare analitica.
In tratarea statistica a esantionarii trebuie sa se defineasca, mai intai, "varianta ge-
nerala" a analizei, S 0 care se exprima prin suma varianjelor esantionarii, Ss, si a "restu-
lui de operajii analitice", S2a :
c^ O^_i_ C1^ f~\ \\
On — Oc "> ij,, V^'-^J
Varianta datorata esantionarii se poate cunoaste atunci cand se prepara probe multi-
ple din materialul dat pentru analiza si utilizand tehnici precise de masurare a semnalelor
analitice. Trebuie precizat ca, reducand valoarea variantei S a la 1/3 din valoarea variantei
esantionSrii, se obtine un castig mic.
12
Se considers, pentru exemplificare, cazul unei deviatii standard absolute pentru
esantionare egala cu 3,0%, iar deviatia standard absolutS a analizei este Sa= 1%; in acest caz:
S20= (3,0)2 + (1,0)2 = 10, iar S0 = 3,2%.
Deoarece imprecizia esantionarii este egala cu 0,93, iar aceea a rnasuratorii analitice
cu 0,07 (caz in care S^ = 1% = 0,93 + 0,07%), rezulta o contributie practic neinsemnata a
variantei analizei (Sa = 0,07%) si o contributie mare a variantei esantionarii (Ss = 3,0%) la
varian^a generala S,,.
Din aceste consideratii se desprinde "concluzia" ca, atunci cand imprecizia
esantionarii probei este mai mare, este mai bine sa se execute un numar mai mare de
analize pe un numar mare de probe, chiar printr-o metoda mai putin precisa, dar mai
rapida.
Evident ca ideal este sa se lucreze pe un numar rezonabil de probe (n = 3-5), dar cu
o foarte mare atentie in fazele de prelucrare si pretratare, pentru a micsora cat mai mult ero-
rile, respectiv incertitudinea acestei faze importante a analizei.
Pe de altS parte, trebuie stiut ca valoarea adevarata (care face obiectul masuratorii
analitice) trebuie s5 se incadreze in domeniul de concentratie al continutului in analit al
materialului integral dat spre analiza; acest domeniu (interval) se poate estima cu un test
"t", la un nivel de incredere dat, utilizand relatia:
= (1.2)
•Jn
din care se scoate expresia de calcul a testului:
±/=-
Se reaminteste ca X reprezinta media aritmetica a rezultatelor analitice obtinute
printr-o anumita metoda de analiza a materialului dat, iar s este deviatia standard a unei
probe individuale, obtinuta anterior printr-o analiza a unor probe dintr-un material similar
sau pe materialul dat, daca se pot executa suficiente probe; n este numarul de probe efec-
tuate in analiza.
Tot in acest context al tratarii statistice a esantionarii se pune si problema "marimii
minime" a unei probe, utilizand procedee statistice potrivite pentru materiale heterogene,
procedee bazate pe varianta esantionarii. Asa, de exemplu, pentru o populatie de particule
a unor specii diferite, foarte bine amestecate pentru omogenizare, marimea minima a
probei, pentru cantitati individuale, se poate calcula din "constanta de esantionare" a lui
Ingamell - K^.
aR2 = Ks (1.4)
in care a este masa (greutatea) probei analizate, R este deviatia standard relativa (procen-
tuala) a compozitiei probei, iar Ks este cantitatea de proba pentru o incertitudine de 1% a
esantionarii, la un nivel de siguranta de 68% (±o); constanta Ks se obtine determinand
13
deviatia standard dintr-o serie de probe cu greutatea a; din relatia ultima rezulta ca varianta (jgviatie standard finala a rezultatelor R = 0,01%, se pleaca de la valoarea testului t = 1,96
esantionarii este invers proportionals cu greutatea probei. pentru n = °° (vezi Tabelul 4.1, p. 94, cu valorile lui t), la un nivel de siguranta de 95%;
2 2
Revenind la marimea minima a unui esanlion initial, se considera, pentru exemplifi- aceasta valoare a lui t, ca si valorile S S si S X servesc la calcularea numarului preliminar
care, ca un material dat pentru analiza confine Ks = 0,54 g N2 %; daca trebuie sS se deter- de probe:
mine azotul prin analiza, cu o precizie de 0,2% (R = 0,2%), cantitatea minima a de esantion
' (0.020)' _ 3,8416 • 0,0004
care trebuie asigurata pentru executarea analizei este egala cu: • 6,0 probe
S* (0,016)" 0,000256
0,45 Dar pentru npr = 6, valoarea t = 2,447 (si nu cu t pentru n = °=), deci in aceste circum-
(1.5)
de unde:
stan{e:

0,45 , = (2.447? • (0,020? = 5,9870 - 0,0004

—— = 11,25 g
0,04 (0,016)? 0,000256
Desigur ca cele 11,25 g material de analizat trebuie sa fie macinate fin pentru omo- insS. pentru n = 9, valoare lui t = 2,262 si prin urmare:
genizare, iar din materialul omogenizat se cantaresc probe de cateva zeci sau sute de mg,
la balanta analitica, in functie de metoda de analiza aleasa, respectiv de sensibilitatea ei si _ (2,262?-(0,020? 5,1166' 0,0004 = 7,999 = 8,0 probe
in functie de tipurile de component! si de marimea probei.
**' (0,016? 0,000256
O alta problems importanta, in contextul esantionarii $i prelucrarii probei, este aceea
a numarului minim de analize care trebuie efectuate, pentru a obtine un nivel de incredere In concluzie, pentru a obtine o deviatie standard finala de R = 0,016% a rezultatelor
si de siguranta corespunzator pentru rezultatele analitice, iar pentru aceasta se utilizeaza analitice, trebuie sa se analizeze opt probe la un nivel de incredere de 95%, rezonabil.
relatia: In unele cazuri se impune o separate foarte buna a componentilor dintr-o probS. Asa,
.7 nt
de exemplu, in analiza si controlul medicamentelor ilicite este necesara separarea analitilor
(1.6) prin cromatografie capilara micelara electrocinetica (numita si electroforeza capilara in
R -X2
2
mediu micelar), MEKC (micellar electrokinetic capillary chromatography), metoda care
in care: are o foarte mare capacitate de rezolutie, asa cum rezulta din Fig. 1.2
r= valoarea testului Student pentru nivelul de incredere dorit (90%, 95% sau 99%);
5 j = varianta esantionarii; Fig. 1.2. Separarea prin MEKC a unor droguri cfe interes judiciar
R - deviatia standard relativa acceptabila a mediei rezultatelor analitice; be c
d
j
a
X = media aritmetica a rezultatelor analitice obtinute prin analiza. 0,40- 2-
0,35-
£ 1

0,30-
Marimile X si Ss se pot obtine din masuratori analitice preliminare (sau pot fi B
r
cunoscute din masuratori similare anterioare); pe de alt5 parte, trebuie retinut ca produsul 0,25- D

dintre media aritmetica X si varianta Ss reprezinta deviatia standard absoluta, iar 0,20-
i k
R = SX/X', prin urmare, ecuatia anterioara se poate serie astfel: 0,15-
1 p
0,10-

(1.7) 0,05-
n- j_
0.00
Marimile Ss si Sx se pot exprima ca deviatii standard absolute sau relative. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Pentru exemplificare, se considera un material care confine 5% analit (g/g), deviatia
standard relativa a esantionarii fund Ss = 0,020%; deviatia standard R = 0,16% (pentru un Conditii: capilarS de 47 cm cu d.i. = 50 \im; dislanja pani la detector: 25 cm; voltaj = 20 IcV; T = 40°C,
tampon SDS 85 mM/fos&t 8,5 raM/borat 8,5 mM/15% acctonitril, pH = 8,5; detector UV, 210 nm;
nivel de incredere de 95%), iar deviatia standard pentru continurul de 5% analit este Sx = cone, probei 250 mg/mL din fiecare drog
0,08%. (a) psilocibina, (b) morfina, (c) fenobarbital, (d) psilocini, (e) codeina, (f) metaqualona, (g) LSD, (h) heroina,
Pentru calcularea numarului minim de probe care trebuie sa fie analizate, pentru o (i) amfetamina, (j) librium, (k) cocaina, (1) metamfetamini, (m) lorazepam, (n) diazepatn, (o) fentanil, (p) PCP,
(q) canabidiol, (r)^-THC-tetrahidrocanabinol

14 15
 Asa cum se poate observa din figura 1.2, separarea MEKC a drogurilor analizate se
face cu forme foarte bune, inguste, ale picurilor $i nu se observa nici o descompunere, pen-
tru nici una dintre substantele cercetate, desigur in conditiile stabilite. Electroforeza MEKC
1 Liviu Roman, Robert SSndulescu, Cbimie analitica, Vol. 2, Analiza chimica
s-a dovedit foarte potrivita pentru aceste droguri, deoarece toate substantele sunt si trebuie cantitativa, Ed. Didactica §i Pedagocica, Bucure?ti, 1999 (a se vedea $i vol. 3);
sa fie eluate inainte sau in timpul micelar (tmc), care este in aceste cazuri mai mic de 45
: 2 Darius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean, Analiza fi contmlul
minute. jnedicamentelor, Ed. Intelcredo, Deva, 2003
Se poate spune ca MEKC este o tehnica foarte buna pentru analiza heroinei confis-
3 Candin Liteanu, Elena Hopartean, Chimie analitica cantitativa, Volumetria, Ed.
cate, deoarece se poate determina prin aceasta tehnica heroina, produsii de baza §i falsifi- Didactica si Pedagogica, Bucure§ti, 1972
catorii, in mai putin de 7 minute, timp care include si spalarea.
4 Constantin Gh. Macarovici, Analiza chimica cantitativa anorganica, Ed. Academiei,
Uneori, pentru imbunatatirea detec|iei analitilor este necesara o derivatizare preala- Bucuresti, 1979
bila sau preconcentrare a lor prealabila cand se produce o cre$tere a concentrarii de zeci,
5 Christian G.D., Analytical Chemistry, Fifth Edition J, Wiley and Sons Inc., New York,
sute sau mii de ori, asa cum rezulta din Tabelul 1.6 dat in contimiare.
1994
Desigur ca mai exista §i alte multe aspecte privind metodologia analitica, dar aici s-au
6 Mahuzier G., Hamon M., Ferrier D., Prognon P., Cbimie Analytique, Tome 2,
prezentat numai cateva mai importante pentru injelegerea nevoii de a fi respectate exi- Methodes de Separation, 3eme Edition, Masson, Paris, 1999
gen^ele actuale ale analizei in general, ale controlului de medicamente in particular §i ale
validarii.

Tabelul 1.6. Metode de preconcentrare pentru imbunatatirea detectiei in CE

Factorul Factorul
Metoda dc cre§tere Metoda de cre$tere
a concentrate! a concentratici
Derivatizarea 100-1000 Legarea directa intracapilara 1000
analitului a ligandului
Puterea detectorilor 100-1000 Legarea directa a ligandului 100-500
la membrana
Aglomerarea probei 50 Legarea ligandului la granu- 50-3000
(preconcentrarea) le de silicagel
Amplificarea 1000 Legarea ligandului la granu- 200
campului le de silicagel (1 fiita)
Izotacoforeza 20-1000 Legarea ligandului la granu- 50-7000
le de silicagel (2 frite)
Izotacoforeza 20-1000 Ligand legat la microcanale 500-4000
pasagera multiple (1 frita)
Focalizarea 100-1000
izoelectrica
Fibre poroase 3000
Concentrate generala 5000

16 17

inntele beneficiarului analizei, de nature materialului de analizat, de felul si cantitatea
CAP. 2. PROBLEMS §1TENDINTE ACTUALE
IN ANALIZA
2.1. Probleme §i exigente actuale ale analizei
In general, metodele de analiza (chimice si instrumentale) au un rol principal, funda-
mental in asigurarea calitatii medicamentelor, dar si a calitatii mediului, a calitatii actului
medical concretizat in diagnosticul formulat in fiecare caz in parte. De asemenea, metodele
de analiza sunt indispensabile in cercetarea stiintifica, in laboratoarele de interes biomedi-
cal, in domeniul agricol si alimentar, in domeniul bunurilor de larg consum etc. Efectuarea
analizelor in domeniul controlului calitatii medicamentului si in laboratoarele clinicer este
asigurata de persoane cu inalta calificare care trebuie sa aiba un volum impresionant de
cunostin^e fundamentale de chimie generala, chimie analitica, chimie anorganica, de
chimie fizica, fizica, matematica si statistics si, evident, de informatica. Prin urmare, cei ce
lucreaza pentni atestarea calitatii in aceste domenii de foarte mare interes public trebuie sa
aiba o temeinica si bogata cultura profesionala (pe langa aceea generala), dublata de un
inalt simt al raspunderii pentru rezultatele analitice pe care le produc si pe baza carora se
iau decizii, care nu este ingaduit sa puna in pericol sanatatea sau chiar viata oamenilor.
lata de ce conceperea si elaborarea metodelor de analiza si control chimie si instru-
mental se constitute intr-o adevarata stiinta, care trebuie sa tina seama de strategia analitica
generala, de strategia de validare, de legile, normativele si conventiile nationale si inter-
nationale in acest domeniu, de exigentele si tendintele actuale care se manifesta in dome-
niul vast al metodelor de analiza.
18
2.1.1. Formularea problemei ce trebuie rezolvata prin analiza
Forenularea problemei care trebuie sa fie rezolvata prin analiza impune cunoasterea
domeniului pentru a putea concepe si proiecta traseul detaliat al analizei, in functie de ce-
probei (solida, lichida, gazoasa, omogena sau heterogena), de compozitia probei (natura
matricei, prezenfa unor interferenti si tipul acestora, daca este vorba de materii prime, reac-
tivi, produsi intermediari sau fini^i, de probe clinice-biologice, de mediu etc.).
La toate acestea trebuie sa se adauge cunoasterea cat mai larga si profunda a datelor
anterioare si actuale din literatura, referitoare la problema analitica si la caracteristicile
aparatelor si instrumentelor de analiza, referitoare la etapele preanalitice care implica
esantionarea - pregatirea materialului, dizolvarea, preconcentrarea si purificarea analitului
(daca acestea sunt necesare), existenta interferentilor, a efectelor lor si, in general, a
efectelor matricei si modalitatile de rninimizare sau eliminare a acestora (deci a zgomotu-
lui de fond), astfel incat senmalul analitic care trebuie sa se obtina sa fie curat, lipsit de
efecte si semnale secundare, parazite, care influenteaza negativ rezultatele analitice,
uneori compromitand analiza.
Mai trebuie avut in vedere ca analistul trebuie sa evite la maximum erorile personale
datorate neglijentei sau ignorantei. De asemenea, trebuie stiut ca erorile comise in etapele
preanalitice, deci inaintea masuratorii, cum sunt cele din etapele de pregatire si pretratare,
care impun procese de omogenizare, filtrare, extractie, preconcentrare, precipitare etc., la
care se adauga si erorile comise direct de analist, pot atinge un cuantum de pana la 90%
din eroarea finala.
De aceea, unul dintre succesele importante obtinute de un analist este tocmai redu-
cerea pana la zero a erorilor preanalitice, ceea ce este posibil numai daca analistul cunoaste
aceste probleme, daca el dispune de maiestria profesionala reala, bazata pe o experienta
bogata, pe pregatirea sa teoretica si practica si pe probitatea sa stiintifica si morala.
2.1.2. Exigente actuale ale analizei
In lumina celor expuse mai sus, se pot formula urmatoarele cerinte si exigente referi-
toare la metodele de analiza si aplicatiile lor in diverse domenii:
1) cunoasterea problemei de analizat, bine formulata si definita;
2) ce fel de informafii trebuie sa se obtina prin analiza;
3) ce fel de proba trebuie sa se analizeze:
- daca ea este reprezentativa si omogena;
- compozitia probei, natura matricei, componentii majori, minori, urme, activi
sau ingrediente inactive;
4) ce pregatire si ce pretratament trebuie sa se aplice probei:
- omogenizare;
- daca este necesara o dizolvare specials (acida, bazica, oxidativa, in faza solida
sau lichida, etc.);
- daca este necesara preconcentrarea, separarea si purificarea analipilor sau a
componentelor straine;
19
 5) care sunt cele mai potrivite procedee si tehnici de pregatire si pretratare, implicit
procedeele de eliminare sau reducere la minimum (daca este posibil, pana la zero)
a interferentilor, efectelor dc matrice in general si a zgomotului de fond, care sunt
surse importante de semnale parazite sau secundare, cu efect nedorit asupra
puritatii semnalului analitic si, implicit, asupra calitatii rezultatelor analitice;
6) care este domeniul de concentratie al analitului in proba si ce trebuie facut in cazul can-
titatilor foarte mici pentru aducerea lui la nivelul concentratiei detectabile si dozabile;
- care sunt impuritatile farmaceuticc din proba, concentratia lor (fie si aproxima-
tiva) si structura lor;
7) ce fel de masuratori (marimi) chimice si instrumentale (sau ambele) trebuie sa se
faca si sa se evalueze, ce fel de instrumente de analiza trebuie sa se utilizeze sau
cuplaje de metode (de separare, detectie si dozare) pentru a se obtine in final
regasiri procentuale acceptabile:
- care este specificitatea, selectivitatea si sensibilitatea metodei de analiza care
trebuie aplicata;
- ce posibilitati de optimizare a acestor parametri exista (ex.: derivatizare pre-
analitica, precoloana cromatografica sau postcoloana);
- ce performante au analizoarele sau instrumentele preconizate a fi utilizate si
daca acestea corespund exigentelor referitoare la exactitatea, fidelitatea = pre-
cizia (repetabilitatea si reproductibilitatea rezultatelor);
- daca aceste instrumente de analiza sunt certificate, deci cu performante cunos-
cute si corifirmate;
8) ce puritate trebuie sa aiba apa, solventii, reactivii si alte materiale de laborator,
pentru a se evita contaminarea probelor si implicit, interferentele suplimentare;
9) ce substante si materiale standard, de referinta sunt necesare, de unde provin
(NIST, PROMOCHEM etc.), pentru:
- substantele medicamentoase;
- impuritatile farmaceutice;
10) daca metodele si procedeele de analiza ce se intentioneaza a fi utilizate corespund
legislatiei si normativelor in vigoare, nationale si intemationale, deci sunt vali-
date sau recunoscute ca metode performante;
11) costurile implicate si bugetul disponibil, daca este posibila reducerea lor prin
reducerea lucrului experimental fara pierdere de informatie; deci scaderea rapor-
tului costuri/beneficii;
12) timpul pentru analiza si predarea protocolului cu datele obtinute, beneficiarului.
2.1.3. Tendintele actuate in analiza
Desigur ca pot fi formulate si alte cerinte pe langa cele prezentate mai sus, dar nu
au fost expuse deoarece, in continuare, vor rezulta din tendintele ce se manifests in
prezent in domeniul analizei (dar si din expunerile ulterioare). Aceste tending sunt strans
legate de problematica generala a analizei, inclusiv de aceea a analizei si controlului de
medicaments, dar mai ales de aspectele privind optimizarea proceselor analitice funda-
mentale.
20
Cunoasterea cerintelor, exigentelor si a tendinfelor actuale care se manifests in dome-
niul analizei este o obligatie majora pentru to{i cei ce executa analize si slujesc "functia de
service" a chimiei analitice si deci a metodelor de analiza si control, care trebuie sa stie si
sa con?tientizeze ca rezultatele analitice fumizate de ei trebuie sa fie exacte, precise
(fidele), corecte, deci de mare incredere, deoarece pe baza lor se adopta decizii in toate
domeniile de activitate, precum:
1) domeniul productiei medicamentelor, ceea ce impune controlul riguros al cali-
tatii:
- materiilor prime utilizate in sinteza medicamentelor;
- produsilor intermediari;
- produsilor finiti, inclusiv al formelor farmaceutice;
- conservarii in depozite, pe raft sau in farmacii;
- stabilitatii medicamentelor in timp;
- controlului toxicologic;
- studiilor privind mecanismele de actiune a medicamentelor;
- studiilor de biodisponibilitate si metabolizarea medicamentelor;
- controlului abuzurilor de medicamente, cu accent pe consumul de droguri;
- extractelor de plante medicinale;
- produselor cosmetice;.
2) domeniul medical $i biologic:
- calitatea analizelor biochimice si in general al analizelor clinice in laboratoarele
clinice; inclusiv in cazul unor urgente medicale, cand de calitatea deciziilor
depinde viata bobiavilor;
- calitatea analizelor in medicina legala si toxicologia judiciara;
- calitatea analizelor in biologia moleculara;
3) domeniul alimentelor cu accent pe calitatea:
- analizelor de pesticide si alte substante controlate, precum coloranti, edulco-
ranti, conservanti etc., in preparatele de lapte, carne, bauturi racoritoare, con-
serve de legume, peste, fructe etc.;
4) domeniile tehnice:
- chimica: industria chimica in care se produc :
- carburanti;
- solventi;
- detergenti;
- coloranti si vopsele;
- agenti de curatire;
- de prospectare si extractie: gaze naturale, petrol, minereuri diverse;
- de prelucrare metalurgica.
Desigur ca la aceste domenii se mai pot adauga cercetarile arheologice in care se fac
numeroase analize chimice si fizico-chimice, pictura, sculptura etc.
Indiferent de domeniul in care se aplica procedee, tehnici si metode de analiza,
deciziile care se iau pe baza rezultatelor analitice au si un caracter juridic, deci analistul are
o mare raspundere juridica, iar prin aceasta se confera aceasta raspundere actului
analitic.
21
 Din toate acestea decurge necesitatea lucrului experimental ingrijit, atent, scrupulos ^ ,coon
(pedant), components personals importanta a actului analitic de control-calitate. $,
intrucat obiectivele mari ale metodelor analitice sunt separarea, purificarea, detecjia | "OCOCH,
si cuantificarea sau dozarea analijilor, dar si a impuritatilor, se expun in continuare cateva <^ aspirtnS
dintre tendin^ele ce se manifests in prezent in domeniile acestea. «,
i—coon

2.1.3.1. Optimizarea proceselor de separare CH,

ihuprofcn
(ncid2-<4-izobuiil-
Ideal ar fi ca analizele sa se poatS efectua direct pe proba data pentru analiza, fara fcnil) propionir) 10 IS 0 i
nici o prelucrare si pretratare prealabila si eventual fara distrugerea analijilor. Acest
deziderat este rar indeplinit si posibil. De aceea, in majoritatea cazurilor este necesara
separarea anali^ilor si in prezent se pune un mare accent pe optimizarea proceselor de Fig. 2.1. Extractia SPE fi detenninarea HPLC a aspirinei
separare, ceea ce implica evitarea, pe cat posibil, a procedeelor de precipitare si fil- din capsule de Alka-Seltzer (a) fi a ibuprofenului din urina (b)
trare, adesea greoaie si laborioase si uneori cu pierderi de analit si cu posibila conta-
minare a probei si inlocuirea lor cu procedee de extractie, cromatografice, electrofore- b) extractia unor xantine din serul uman pe faza solida SPE si separare HPLC; prin
tice etc.: acest procedeu, durata tuturor proceselor de extractie, separarea, detectia, dozarea, calcul-
ul rezultatelor si validarea dureaza numai 2-3 ore; Fig. 2.2.
1) procedee de extractie optimizate, cum sunt:
Fig. 2.2. Detenninarea SPE+HPLC
- extractia lichid-Iichid, cu varianta extractiei sinergice, cu amestecuri de sol- automata a xantinelor introduse in
venti a caror capacitate de extractie se potenteaza reciproc; aceasta capacitate ser; 0,5 ppm cu HySphere Resin GP
depinde de structura solventului, de bazicitatea lui, de orientarea sterica a ato- ca sorbent SPE
milor donori, de polaritatea solventilor, de pH-ul solutiilor, de existenta reacti- Conditii de extractie-separare:
ilor secundare posibile (de precipitare, complexare etc.); pentru evaluarea cali- - coloana LiChrospherRPIS (1224,0 mm),
tatii extractiei se calculeaza: constanta sau coeficientul de repartitie, factorul de particulc cu d = 5 (im; - elusnt: acetonitril
12% tn apa, la 1 mL/min; - protocol SPE: -
recuperare, factorul de separare, randamentul de extractie, regasirea procentuala solvatarca sorbcntului: 2 mL CHjOH,
etc. (vezi "Analiza si Controlul Medicamentelor", vol. 1, pag. 386 si urma- apoi 2 mL apa la 5 mT /min;
i i
toarele, M. Boji^a, L. Roman. R. SSndulescu, R. Oprean, Ed. Intelcredo - Deva, ( I I 2 3 - 4 5 f > 7 X ' J ! 0 - 100 |iL injectat cu 2,5 mL apa la 2 mL/min.
2002/2003);
- extractia in faza solida — SPE, care se bazeaza pe procese elementare de transfer
de masa din solutia de analit pe o faza stationara solida (procese analoge cu cele - spre deosebire de alte procedee de extractie (ex.: microextractia), cuplajul SPE-
cromatografice); fazele stafionare sunt selective, cu granulometrie de 40-60 [im; HPLC nu este prea laborios ?i corespunde mai bine metodologiei de validare,
dintre acestea se pot men^iona octadecilsilanul (Si-C18), Si-C8, Si-C6H5, Si-CN deoarece nu urmareste numai cresterea regasirii procentuale (ceea ce, din punct
(vezi op. citat mai sus, pag. 416); de vedere al validarii este important dar, nu este suficient), ci si compararea
- prin aplicarea acestei metode se simplifies matricea probei, deoarece prin fixarea capacitatii de retentie a sorbentilor, precum ?i eficienta lor, de asemenea se poate
analitului in cartu? se elimina toti componentii indezirabili in efluentul care urmari si determina si proeentajul de intarziere a trecerii solutiei prin carhis si
paraseste cartusul; apoi se spala cartusul (care este in fond o minicoloana cro- procentajul de adsorbtie in sistemul de pregatire al probei; in prezent, acest mod
matografica) cu solventi potriviti, dupa care se elueaza analitul extras de asemenea de extractie, separare, detectie este automatizat complet; in Fig. 2.3 se prezinta
cu un alt solvent potrivit, care contine numai analitul pur, separat; in continuare se o schema de principiu pentru extractie SPE-HPLC/MS (extractul SPE este
dau doua exemple de aplicatii ale extractiei SPE asociate cu HPLC: transferal printr-o capilara direct in cromatograful HPLC; fiecare pic care
a) extractia aspirin ei din capsule de Alka-Seltzer de 100 mg, dupa dizolvare in 100 paraseste capilara coloanei HPLC este transferat direct in camera de ionizare a
mL apa distilata si a ibuprofenului din urina, pe cartuse de Polysorb MP-2; cromatogramele unui spectrometru de masa).
corespunzatoare sunt date in Fig. 2.1

23
 Fig. 2.3. Schema de principiu
a unui cuplaj SPE-HPLC/MS

-A= modul de extracfie, care aratS

pozijia valvei (1);
- cartusul se conditioneaza inaintea
extracfici pria sp&laic cu solvent
eliberat din iwitatea SOU;
ddertomlUV-Vfc
- se iojecteaza in cartuy o porfiune
alicota din solufia anahtului, iar
interferenfii sunt iudeplrtafi prin
sp&larc (in cflucnt); Fig. 2.4. Schema cuplajului-sistem SPME-HPLC (a) fi a SPME
-se elueaza analilii din cartuy cu un
- filtre (b): 1 = tab polimer-eler-cetonS, PEEK; 2 - douipiese din PEEKwanson inchis;
solvent potrivit si se transfers in
coloana HPLC, iar efluentul este 3 — legatorH din otel inox in forma de T de 1/16 inch (I inch = 2,54 cm), Valco Instruments Co.
eliberare Huston - Texas; 4 = tub PEEK cu piesa de legaturS de 0,005 inch d.i. (Sigma Aldrige); 5 = tuburi
Cartu§e condus in MS.
solvent SPE inox de 1/16 inch o.d. si 0,02 inch d.i. (Supelco)

- pentru exemplificare, se prezinta extractia SPE si separarea GC/MS a Iidocainei

printre avantajele extractiei in faza soiida — SPE se numara urmatoarele: (anestezic local) din solutii care contin 1 ng/mL, utilizand fibre de sticla de 7 m acoperite
- se obtin extracte de puritate determinata de selectivitatea si eficienta sor- cu PDMS - faza legata (neafectata de ceilalti componenti din proba); Fig. 2.5.
benjilor;
- capacitatea mare de extractie prin varierea polaritatii;
- mi se produce emulsionarea probei;
- se reduce consumul de solventi organici;
- se lucreaza la presume joasa, consum mic de energie;
- miniaturizarea aparaturii si simplificarea unor procese analitice;
- regasiri procentuale rnari datorita preconcentrarii, practic cantitative a
analijilor;
(b) (c)
- posibilitati de derivatizare pre- si post-extractie;
- posibilitatea cu cuplare cu HPLC si GC; 8,33 timp (min) 9,16 8,33 timp (min) 9,16 8,33 timp (min) 9,16
- aplicatii largi in analiza si controlul medicamentelor, cu limite de detectie
foarte mici, de ng, nM etc. Fig. 2.5. Cromatograma GC-MS a Jidocainei

dupa extractia ei din metanol (a), din hidroxid de sodiu neutralizat

• mieroextraetia in faza soiida - SPME, care este o tehnica de concentrare si
separare a analitilor din proba, procese ce se realizeaza pe o faza legata depusa
pe fibre de sticla, dispuse sub forma unui manuncbi acoperit cu un polimer si
fixat intr-un tub de otel inox, introdus intr-o seringa prevazuta la un capat cu
un ac de otel inox; acest manunchi de fibra de sticla poate fi considerat ca o
sonda care se introduce cu un capat in solutia probei, iar dupa un timp se
scoate; analitii se repartizeaza pe suprafata polimerului, de aceea acest capat al
sondei (care a fost introdus in solutia probei) se orienteaza astfel incat analitul
(sau analitii) de pe fibre sa fie in contact cu interfata de desorbtie pentru sepa-
rare HPLC sau GC; In Fig. 2.4 se prezinta schema cuplajului SPME-HPLC.
cu acid trifluoracetic (b) si din fosfat 0,25 M cu pH = 12 (c)
au fost supuse extractiei probe de 2 mL, la 22°C, timp de 40 min, apoi ana-
litul a fost desorbit la 250 C, timp de 3 min; coloana GC a fost de 30 cm
0,25 mm, d.i. = 0,25 m, d.p. HP-MS; detectia s-a facut cu capcana ionica
MS cu ionizare prin impact electronic (aria picurilor = 3030019 pentru a;
1587462 pentru b; 5084767 pentru c).
• este de mentionat ca nurneroase substante rnedicamentoase se extrag prin
microextrac{ie SPME, urmata de analiza lichid-cromatografica LC asociata cu
MS, pentru a se evita concentratiile man de saruri care pot interfera; in Fig. 2.6
se prezinta date comparative pentru analiza dexametazonei prin LC-MS, dupa

24 25
 extracjia ei prin SPME.

Fig. 2.7. Schema sistemului de extractie-analiza prin injectie In flux continuu

Fig. 2.6. Cromatograme LC-MS ale dexametazonei
din solutii 15% de NaCl (a) si de NaOH - neutralizat cu acid trifluoracetic (b)
-0,1 mg/mL dexamctazona; -programare injector cu 15 cai de retragere;
- 40nL£ecare la 140 fJlVmio; -pic 1, injectie 5 pL, arie: 3800000;
- pic 2, injectie 5 u.L, arie: 7000000; - pic 3, injectie 5 /*L, arie; 13000;
-pic 4, la tub, arie 69.
Nota: la utilizarea metanolului si a acetonitrilului (ambii solventi miscibili cu apa), s-au
constatat diferente la extractia unor anestezice locale, precum carbisocaina, hepta-
caina, pentacaina, dar si in cazul mexiletinei (antiaritmic), stoladinei (cardioprotec-
tor) si a unor beta-blocante; de aceea s-a lucrat la concentratii reduse de acetonitril,
(nesegmentat) - FIA
1 = pompa pcristaltica; 2 = derivatizare; 3 = valvS de injecjie a probei de 12 mL
sau 25 mL; 4 = probe apoasc; 5 = baie de ghcata pentru raciiea clorofonnului;
6 = amestecarea fazelor; 7 = separare de faze; 8 = fotomctru;
9,10, 11 = evacuare; R = 0 , 1 5 m 5 i L = 2 m = serpentine din teflon de 0,8 mm
- extractia prih sistemul AASP (advanced automated sample processor), produs de
Varian, in care este vorba de extractie in faza solida, pentru concentrarea, separarea
si purificarea analitilor si pentru indepartarea componentilor indezirabili odata cu
matricea lor si efectele de matrice; Fig. 2.8.
AASP v a l w a !n}cc|K

cu o eliberare eficienta a medicamentelor din cartusul SiO^ - CIS (Sep-Pak CIS,

Silipore CIS, CP-Elut CIS si Separcol-Si CIS); s-a utilizat un GC - Hewlett-
Packard Model 5880 - cu detector termoionic.

g™ . — SorbaK SK3, - CIB

- extractia in flux segments! cu bule de aer (SFA = segmented flow analysis) sau in
flux continuu nesegmentat, cu injectie in flux - FIA (flow injection analysis);
analiza FIA s-a dovedit a fi de preferat deoarece, in acest caz, nu are loc o dispersie
excesiva a analitilor si nici contaminarea, beneficiind si de alte avantaje, intre care:
- viteza de analiza mai mare, intre 100 si 300 de analize pe ora;
- timp de raspuns mai bun, de regula mai putin de 1 min. intre injectia probei si
semnalul-raspuns al detectorului; Fig. 2.8. Sistemul de separare-purificartepreanalitica prin AASP
- timpi de pornire si de oprire mai mici, de cca. 5 min pentru fiecare; - acest sistem include un sistem miniaturizat de extractie SPE in faza solida, dotat cu
- echipament mai simplu, mai economic. casete con{in§nd cate 10 cartuse incarcate cu 40-50 mg SiO2 - Cl 8; acest modul se
- in Fig. 2.7 se prezinta o schema de principiu a sistemului de extractie-analiza prin poate cupla cu un cromatograf HPLC, determinarea necesitand parcurgerea urma-
injectie in flux continuu (FIA): toarelor etape:
- solvatarea fazei legate, indepartarea excesului de agent de solvatare cu o solutie

26 27
 similara cu aceea a matricei probei;
• preconditionarea probei prin ajustarea pH-ului (daca este cazul) si adaugarea
standardului intern;
• trecerea solutiei probei prin cartus pentru rejinerea analitilor pe SiO2 - CIS;
• indepartarea interferentilor indezirabili cu o solute potrivita care sa nu poata
dizolva analitii;
• eluarea analifilor cu o faza mobila potrivita si evaporarea eluentului pana la
uscare (daca se poate);
• dizolvarea analitilor din reziduul uscat intr-un solvent potrivit, ceea ce se
numeste "reconstiruirea probei", dar cu analiji separaji si purificati prin
AASP;
• injectarea unei parti alicote din proba reconstituita in sistemul HPLC; Fig. 2.10. Diagrama de faza
• acest sistem are avantajul ca purificarea analitilor prin AASP are un efect bene- presiune-temperatura
fic asupra rezolutiei picurilor, asa cum se poate observa din Fig. 2.9: pentru bioxidul de carbon

metanolul pentru CO2, care nu poate extrage analitii polari;

a) farii purificare
b) cu purificare
Fig. 2.9. Efeclul sistemului de purificare SPE a frontului cromatograGc
- sistemul AASP de extractie-purificare a fost aplicat la separarea si purificarea
unor benzodiazepine din ser, intre care clordiazeproxid si diazepam (tran-
chilizant minor) si a propranololului (beta-blocant) de metabolitii sai (4-OH
propranolol si prometalol).
- eliminarea fluidului supercritic din extract se face printr-o simpla destindere,
cand el se volatilizeaza practic instantaneu, recuperandu-se si reutilizandu-se;
- reziduul ramas este analitul extras, concentrat si purificat, care este supus ime-
diat analizei; in Fig. 2.11 se prezinta schema generala a unui sistem SFE (a),
care se poate cupla cu un sistem GC (ex.: GC 5890 Series n - Hewlett-Packard)
cu detector cu captura de electron! pentru detenninarea regasirii procentuale; in
Fig. 2.11 (b) este prezentata gazcromatograma unui ulei esenjial de Syzygium
aromaticum (cuisoare), din care s-au separat si detectat eugenolul (1), -cari-
ofilenul (2), -cariofilenul (3) si eugenolul acetat (4), cu o foarte buna rezolutie:
- pentru separarea analitilor se mai pot utiliza cromatografia de lichide (HPLC,
5000000
- 3S-C. 2SOO pa (aprox.
4SOOOOO 172,2 aim)
- limp exuac'ie: 20 min
4000000 ,
- prcs. extracts; 450
•M

- extractia cu fluide supercritice - SPE (Supercritical fluid extraction) este o 3000000 |

tehnica de separare-purificare-concentrare in care "solventul de extractie este un

fluid supercritic omogen" (numit si gaz dens), care se afla in domeniul supercri-
debUmelru 15000M
tic util, format la o presume si temperatura superioare punctului critic C (Fig. 1000000
2.10); presiunea si temperatura critice sunt caracteristice fiecarei faze-fluid; asa, de 500000
exemplu, in cazul CO2 presiunea critica Pc = 72,9 ban (atmosfere), iar temperatu-
0 10.00 20.00 30.00 40,00
ra critica Tc = 31 °C;
- un fluid supercritic are cateva caracteristici importante, intre care: (a) (b)
- densitate apropiata de aceea a lichidului din care provine, in functie de pre- Fig. 2.11. Schema unui sistem SFE
siune; deci densitatea poate varia;
- vascozitatea, care este inferioara lichidului din care provine; de exemplu), pe strat subtire, in faza gazoasa, de excludere difuzie, de afinitate
- capacitatea de dizolvare mai mare decat aceea a lichidului din care provine; etc., precum si electroforeza pe gel, hartie cromatografica, dar mai ales electro-
aceasta capacitate se poate man prin adaugarea unui modificator, cum este foreza capilara zonala in mediu micelar;

28
 - optimizarea metodelor cromatografice de separare se face prin: - (rebuie precizat ca aceste coloane se pot utiliza si la separarea, detectia si dozarea
- optimizarea coloanelor, deci a fazelor stationare legate chimic, a granulajiei, altor tipuri de medicamente, mai ales baze organice medicamentoase (ex.: alcaloizii), anti-
suprafe^ei specifice, a polarita^i pentru metodele LC, mai ales HPLC; histaminicele, vitaminele hidrosolubile, catecolaminele etc. (coloanele Vydac mentionate
- optimizarea coloanelor pentru cromatografia capilara electrocinetica, cro- mai sus sunt cu faze inverse).
matografia cu fluide supercritice, cromatografia de gaze, cromatografia
pe schimbatori de ioni, pe site moleculare; 2.1.3.2. Optimizarea detectiei $i a deterrainarii cantitative
- optimizarea parametrilor operational!: diametrul particulelor si cresterea
numarului de platouri teoretice implicit a rezolutiei, la care se adauga 1) Optimizarea detecfiei, ceea ce se manifests in tendinta de optimizare a detectorilor
programarea temperaturii, presiunii si compozitia fazei mobile, prin instrumentali, cum sunt:
automatizarea modulelor de fumizare a acestora; - cei spectrofotometrici UV-VIS cu diode In serie (sau bareta de diode);
asa cum s-a aratat mai sus, una din tendintele manifeste si presante este, in prezent, . cei defluorescen^acu raze X,fluorofotometricisi de cherniluminiscenta;
optimizarea coloanelor cromatografice de separare, cuplate cu detectori elec- - cei de radioactivitate si RMN;
trochimici, spectrofotometrici, MS-spectrometrici etc.; pentru exemplificare, in Fig. - cei de spectrometrie de masa;
2.12 si in Fig. 2.13 se prezinta cromatogramele HPLC obtinute la separarea unor - detectorii electrochimici, cum sunt cei de conductivitate, potentiometrie si, in general, cei
anticonvulsivante si a unor antidepresive, pe coloane Vydac 208 HS 3410 — C8: voltamperometrici (amperometrici, voltametrici, polarografici etc.); in continuare se fac
referiri mai ales la acesti detectori mai putin cunoscuti, dar care cunosc in prezent o dez-
voltare accentuata; in context, o atentie aparte merit! sa fie acordata electrozilor pe baza de
carbon:
- de carbon vitros ca atare sau acoperit cu un film de mercur, argint sau aur, sau cu film
Fig. 2.12. Separarea. unor polimeric dopat cu modificatori;
an ticon vulsivan te - electrozi pasta de carbon modificata cu agenti complexanti chelatanti (cu grupari
functionale cu atomi de azot, oxigen si sulf) sau cu biocomponente (deci biosenzori),
- coloana Vydac 208HS3410-C8; cum sunt enzimele (asociate cu cofactor si mediator), celulele de culrura, ^esuturi, bac-
- 3 |i; 4,6100 mm; eluent: ACN; terii, anticorpi etc.;
- 15-50% la 1,5 mL/min; - electrozii cu fibre de carbon sau de sticla sub forma de manunchi, imbracate intr-un film
- 1 = barbital; 2 = fenacetamid; polimeric, pe care se fixeaza componente electroactive;
3 = etotoin; 4 = fenobarbital; - electrozii membrana polimerica din PVC, teflon (rrifluorpolietilena), polipirol, poliani-
~5 = fensuximid; 6 = mefenitoin; lina etc., dopate cu componente electroactive (diversi reactivi care asigura selectivitatea
7 = carbamazepin; si sensibilitatea, cum sunt agentii chelatanti, polioxometalatii etc.);
8 = metsuximid; 9 = diazepam - electrozii picatura de mercur sau picatura de mercur suspendata utilizati in polarografie, in
Uirfn.
stripping voltametria cu puls normal sau differential, cu acumulare catodica adsorbtiva etc.;
cu astfel de senzori si biosenzori se pot atinge limite de detectie in domeniul 10"9-10"12
mol/L;
- in afara de senzorii mentionati mai exista senzori cu efect de camp (ISFET), senzorii gal-
Fig.2.13. Separarea unor antidepresive vanici, de gaze (O2, H, CO, CO2 etc.) cu semiconductor! sau traductori de masa sensibili,
precum si electrozi membrana din argila (in general silicati); anumite tipuri de argile se
- coloana Vydac 208HS3410-C8; pot utiliza si in amestec cu pasta de carbon care este componenta preponderenta.
- 3 |i; 4,6100 mm; eluent: fosfat 0,25 M; 2) Optimizarea determinarii cantitative prin:
- pH = 3; acetom'tril 25% la 20 mL/min.; - scaderea limitei de cuantificare a substantelor medicamentoase, metabolitilor si a impu-
- detecfie UV; ritatilor farmaceutice;
- 1 =doxepin; 2 = desipramin; 3 ~ imipramin; -utilizarea standardelor de referinta de certa puritate, deci de certa calitate, pentru sub-
4 = nortriptilin; 5 = amitriptilin stantele medicamentoase, impuritati farmaceutice, interferenti si metaboliti;
- cresterea exactitatii si fidelitatii (preciziei) metodelor de analiza, deci a sigiirantei rezul-
fain. tatelor;

30 31
M
- diminuarea drastica a erorilor, mai ales in etapele preanalitice prin lucrul experimental
corect, riguros, ingrijit etc., precum si reducerea zgomotului de fond;
- calcularea corecta a rezultatelor analitice, evaluarea statistics a erorilor prin utilizarea
analizelor statistice, a algoritmilor, a testelor de concordanta, de liniaritate etc.;
- utilizarea chemometriei in procesul de programare a experimentelor;
- validarea metodelor noi de analiza si utilizarea in determinarile analitice numai a metode-
lor recunoscute, confirmate si validate.
2.1.4. Parametrii de calitate mai important!
Inainte de rezumarea acestor parametri, trebuie precizat ca in modul de abordare si
de efectuare a analizei trebuie sa se tina seama de problema care trebuie sa fie rezolvata
prin analiza, de complexitatea ei, de rapiditatea necesara (de exemplu, in laboratorul clinic
adesea se impune efectuarea unor analize-teste rapide, chiar in timpul interventiilor chirur-
gicale) etc.
- pentru exemplificare, se mentioneaza problema din ce in ce mai grava a dopajului cu
substante interzise, cum sunt stimulentele, steroidele, diureticele, narcoticele, analgezicele,
-blocantele, sedativele, hipnoticele etc., care impune adesea testarea rapida a_unora dintre
metabolitii lor, deoarece in intoxicatii grave, deci in situatii limita, nu se pot detecta subs-
tantele ca atare care au fost utilizate; de regula, testarea se face din probe de urina (sau
sange) pentru identificare, iar daca timpul permite, §i dozarea lor instrumentala rapida prin
HPLC, GC, GC-MS, MS, RMN etc., cu extractie SPE sau fara extractie;
- parametrii de calitate mai importanti sunt urmatorii:
- specificitatea si selectivitatea;
- sensibilitatea: - pragul de detectie;
- pragul de cuantificare;
- liniaritatea semnal analitic / concentratie; domeniul de concentratie sau de activitate;
- oblicitatea / abaterea: curbe etalon, parametri statistic! - coeficient de corelatie;
- precizia sau fidelitatea metodei de analiza:
- repetabilitatea, coeficientul de variatie CV al acesteia;
- reproductibilitatea, coeficientul ei de variatie;
- precizia intermediara;
- robustetea;
- exactitatea, exprimata prin regasirea procentuala;
- exprimarea rezultatului final, X, RSD, a, s, S p , t, intervalul de incredere,
evaluarea erorilor, eliminarea controlata a rezultatelor indoielnice;
- puritatea semnalului analitic:
- interference, efecte, zgomot de fond;
- netezirea sau curatirea semnalului analitic automat (programe)
sau prin algoritmi;
- eliminarea efectelor indezirabile;
- parametrii operatori pentru diversele metode de analiza.
32
2.1.5. Economicitatea analizelor
Acest obiectiv se refera la stiinja organizarii cercetarii, adica la managementul eco-
rnic al cercetarii, ceea ce implica gestionarea corecta a sumelor investite in aparatura,
vi standarde, solvenfi etc., cu generozitate, dar si cu raspundere. In lume, numai in
iomeniul sanatatii si eel farmaceutic, se cheltuiesc sume enorme pentru zeci de miliarde de
re De aceea laboratoarele ?i institutiile in care se fac analize trebuie sa tina seama de
• nortul costuri/beneficii, care trebuie sa fie cat mai mic; iar pentru aceasta trebuie sa se
iba jn vedere urmatoarele cerinte:
- documentarea corecta cu privire la problemele analitice de rezolvat;
- programarea numarului de analize necesare, a reactivilor, materialelor de referinta,
solventilor etc.;
- utilizarea judicioasa a fondurilor si a instrumentelor de analiza;
- reducerea la strictul necesar a consumului de reactivi, materiale, energie etc.;
- reducerea la maximum a numarului de analize gresite pentru reducerea costurilor si
a risipei;
- reducerea pierderilor de analiti si a contaminarii, precum ?i a erorilor, pana la elimi-
narea lor, in etapele preanalitice, deci inaintea masuratorilor analitice;
- reducerea lucrului experimental fara pierderi de informatie, ceea ce inseamna
reducerea costurilor, reducerea tiinpului per analiza si reducerea efortului uman;
- asigurarea obiectivitatii si sigurantei rezultatelor analitice, respectiv a increderii in
aceste rezultate, prin indeplinirea conditiilor/criteriilor de acceptanta, conform
normelor actuale de validare a metodelor si rezultatelor statistice;
- cresterea continua a gradului de instructie si calificare a specialistilor in acest dome-
niu, ceea ce asigura atat competenta lor, cat si responsabilitatea lor profesionala,
etica si juridica;
in acest mod se pot indeplini cele trei man deziderate in domeniul produselor farmaceutice:
- calitate; - siguran^a; - eficienta terapeutica.
1. Liviu Roman, Robert Sandulescu, Chimie analitica,
- Vol. 1, Analiza chimica calitativa, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1999
- Vol. 2, Analiza cbimica cantitativa, Ed. Didactica ?i Pedagogic!, Bucuresti, 1999
- Vol. 3, Metode de separare $i analiza instrumentala, Ed. Didactica si Pedagogica,
Bucuresti, 1999
2. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza fi
control, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998
3. Marius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean,, Analiza fi controlul
medicamentelor, Vol. 1 si Vol. 2, Ed. Intelcredo, Deva, 2003
4. Kenner C.T., O'Brien R.E., Analytical Separation and Determination, A Textbook on
Quantitative Analysis, The MacMillan Company, New York, 1971
5. Liteanu C., Gocan S., Bold A., Separatologie analitica, Ed. Didactica si Pedagogica,
Bucuresti, 1981
6. Morait Gh., Roman L., Chimie analitica, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1983
33
 p ntru determinarea concentratiei constituentilor acestor materiale se utilizeazS, de
fobicei, trei metodologii:
- analiza printr-o metoda standard, de referinta, validatS in prealabil;
- - analiza prin mai multe metode independente, dar fiabile;
if - analiza intr-o retea de mai multe laboratoare asociate, tehnic competente si care sunt
ft bine infbrmate cu privire la materialul de cercetat (este deci vorba de studii colabo-
§ rative, interlaboratoare).
J| La utilizarea materialelor de referintS etalon pentru detectarea unei oblicitati (aba-
lieri), adesea se intalneste situatia in care media analizelor efectuate pe etalon difera putin
Ike rezultatul sau continutul teoretic; in astfel de cazuri se pune problema cunoasterii fap-
Itului ca aceasta diferen^a se datoreaza unei erori aleatoare sau erorii sistematice a (obli-
CAP. 3. SUBSTANTE STANDARD SI MATERIALE fbitatii) metodei, ceea ce se poate stabili printr-un test statistic dat putin mai jos.
1 In cazul in care nu exista (sau nu este disponibil) un esantion etalon, concomitent
FARMACEUTICE DE REFERINTA leu metoda testata se poate utiliza o a doua metoda independents si fiabila, care trebuie
Ea difere cat mai putin posibil de aceea testata, pentru a micsora la maximum posibili-

I
itea ca un factor comun din proba sa aiba acelasi efect asupra celor doua metode. Este
isa recomandabila, si in acest caz, utilizarea unui test statistic pentru a stabili daca dife-
;nta dintre cele doua metode se datoreazS unei erori aleatoare sau unei erori sistematice
Dblicitatii) (vezi tratarea statistics a rezultatelor analitice — compararea a doua medii
3.1. Rolul substantelor standard sau etalon xperimentale).
,,, In sfarsit, este posibil sa se detecteze unele tipuri de erori constante, efectuand
Substantele etalon sunt substante preparate in stare de puritate avansata, al caror |'dozari blanc", dozari in care se efectueaza o analiza in toate etapele ei, dar in absenta ana-
continut calitativ si cantitativ este garantat; de regula, se considers ca o substanta etalon are Jjitului. Rezultatele analizelor blanc sunt utilizate pentru a corecta masuratorile facute
o puritate acceptabila daca ea are un continut procentual mai mare sau eel putin egal cu jjisupra probei.
99,95%, iar impuritatile individuale sunt mai mici de 10-3-lQ-4%. | Pe de alta parte, este important faptul cS dozajele blanc evidentiaza erorile datorate
Substantele etalon sunt utilizate la obtinerea unor solutii standard, la stabilirea titru- :|contaminantilor interferenti, proveniti din reactivi si din recipientele folosite in efectuarea
lui unor solutii de lucru in analiza de rutina si la verificarea oblicitatii unei metode de anal- fanalizei. La fel de important este si faptul cS dozajele blanc permit sS se corecteze datele
iza (deci a efectului unei erori sistematice asupra unei serii de determinari). De aceea, cea litrarilor chimice, prin evaluarea excesului de titrant necesar pentru a produce virajul indi-
mai buna metoda de apreciere a oblicitatii unei metode de analiza este aceea de a analiza |patorilor la punctul de echivalenta.
cu aceasta metoda substante de referinta sau etalon, denumite in literatura de limba engleza } Revenind la posibilitatea de a stabili daca o metoda de analiza este afectatS de o
mai ales "materiale de referintS etalon" sau "materiale standard de referinta - SRM", al feroare sistematica/oblicitate, arunci cand ea este utilizata la analiza unui esantion etalon cu
caror continut in unui sau mai multi component! este cunoscut (deci se cunoaste concen- |> compozitie exact cunoscuta, se poate folosi un test de comparare a mediei experimentale
tratja jor-\' ' ' |a metodei cu valoarea adevSrata. In acest context, se examineaza si se exemplifies oblici-
Materialele standard de referintS se obtin, de regula, prin sinteza, prin cantarirea aten- jtatea posibila prin Fig. 3.1, in care sunt prezentate doua curbe care arata distributia de
ta a cantitatilor de constituent! puri' necesari, dupa care se amesteca pentru a obtine un ffrecvenfa a rezultatelor analizei unor esantioane identice prin cele doua metode, ale caror
esantion om'ogen, a carui compozitie se calculeaza plecand de la cantitatile initiate cantarite erori aleatoare sunt de aceeasi marime; metoda A nu are oblicitate, iar in acest caz media
(masurate). Evident ca un material etalon sintetic trebuie sa aiba o compozitie globala populatiei UA = xr, deci cu valoarea reala. In schimb, metoda B este afectata de o oblicitate
foarte apropiata de aceea a probelor de analizat. Analistul trebuie sa se asigure de |eroare sistematica) Ob, care este egala cu:
cunoasterea exacta a concentratiei analitului. |
Trebuie spus ca exists o diferenta intre substantele etalon primare si secundare, care 1- O =n -x =n -u.
sunt utilizate pentru obtinerea solutiilor titrate sau pentru dozarea directs a unor analiti si J " r B A
C3-1)
materialele standard de referinta, care includ roci, minerale, amestecuri gazoase, sticle, |
amestecuri de hidrocarburi, poumeri, pulberi urbane (prafuri), ape de ploaie si sedimente I Se face precizarea ca oblicitatea afecteaza cu "aceeasi cantitate (cuantum)" toate
de rauri (ex.: NIST oferS peste 900 de astfel de materiale de referin|a etalon). j^lc seriei de analize (rezultate), care poate fi pozitiva sau negativS. Cand se doreste a se

34 35
 3.2. Materiale de referinta pcuiru analiza farmaceutica
biais
•"S I'll 3.2.1. Aspecte generale

Asa cum se cunoaste, Promochem este eel mai mare distribuitor oficial autorizat pen-
i^tnj standarde de referin^S prevazute in farmacopeile americanS. (USP XXIII - XXV), bri-
tanica europeana si altele; Promochem face disponibile Substantele sale chimice de refe-
t yinta (CRSs) catre utilizatorii industriali, in concordan|a cu listele generale ale USP oficiale
^an anul 1999 - 2005. In acest mod, producatorii de medicamente si laboratoarele de analiza
5si control a medicamentelor au posibilitatea armonizarii activitatii lor, in concordanta cu
*cele mai noi cerinfe si prevederi privind siguran^a si calitatea medicamentelor.
Materialele de referinta sunt, in fapt, substante farmaceutice de referinta utilizate
lin analiza farmaceutica, spre deosebire de "materialele de referinta certificate", care sunt
, ... Iproduse in confbrmitate cu Ghidurile ISO 30-35 si care sunt livrate cu documente de cer-
Itificare detaliate.
Substantele "chimico-farmaceutice de referinta" (CRSs) ocupa o pozilie apartc in
Fig. 3.1. Exemplu de oblicitate, Ofo Scresterea continua a domeniului materialelor de referinta si standarde primare care fac
Sobiectul ofertelor Promochem. De subliniat faptul ca exista cateva diferente intre CRSs si
aCRMs si alte materiale de referinta si standarde, iar necunoasterea lor si incapacitatea de a
evidentia o oblicitate prin analiza unui esantion cu compozitie exacta cunoscuta, este posi- faprecia aceste diferente poate duce la intelegeri gresite.
bil ca media experimentala X sa difere de media populatiei (1 (care exprima valoarea
prezumata, reala, adevarata), asa cum se observa din figura anterioara. Pentru a sti daca 3.2.2. Substante farmaceutice de referinta
aceasta diferenta se datoreaza unei erori aleatoare sau daca ea se datoreaza unei erori sis-
tematice, se compara diferenta X — xr cu diferenta observata, care poate fi determinate de De la inceput, trebuie subliniat faptul ca legislatta in acest domeniu este conceputa
o eroare aleatoare. pentru a proteja si asigura calitatea medicamentelor. Monografiile din farmacopei devin tot
Daca diferenta observata este mai mica decat aceea calculate, pentru un grad de pro- :mai sofisticate, mai complicate, in pas cu dezvoltarea metodelor si tehnicilor analitice, ceea
babilitate dat, se poate respinge ipoteza nula, deoarece X ?i xr sunt identice, deci nu este ice a impus aparitia substantelor de referinta inalt purificate si detaliat caracterizate. Aceste
vorba de o eroare sistematica (oblicitate) semnificativa (adica este posibila o oarecare 'substante raspund cerintelor si exigentelor USP, EP, BP si ale altor farmacopei, cum sunt
eroare sistematica, dar ea este atat de mica incat nu poate fi detectata). J:farmacopeile franceza (FP), elvetiana (SP), japoneza (JP) etc., fiind in continua crestere, ca
Daca diferenta X - xr este net (vizibil) mai mare decat valoarea asteptata (numita si Jo consecinta a nevoii de sisteme de calitate, ca si a calitStii sistemelor, concomitent cu
valoare critica), se poate admite ca diferenta este reala si deci este vorba de o eroare sis- '•cresterea utilizarii medicamentelor generale, specifice.
tematica semnificativa. Aceasta valoare critica, pentru respingerea ipotezei nule, se cal- Din aceste considerente a aparut nevoia "aplicatiilor nemonografice", cum este
culeaza cu ajutorul relatiei: i cazul substantelor nedescrise in monografiile oficiale ale farmacopeilor, dar necesare. Iar
jsubstantele CRSs, utilizate cu aten|ie si responsabilitate, pot satisface aceasta necesitate;
ts
I dar aceste substance trebuie intelese si considerate ca materiale ce raspund procedeelor de
X-x, =± (3.2) Janaliza descrise in farmacopei.
Farmacopeea americana a inrrodus un rezumat al masuratorilor (Summary of
; Measurements), care este o forma de certificare care cuprinde constatarile rapoartelor
N = numarul de masuratori utilizate. colaborative (interlaboratoare) rezultate din procesul de certificare a substantelor care
: "eandideaza" la calitatea si stanitul de substante de referinta; lista acestor substante este
Atunci cand exista o estimare buna a abaterii standard C, se poate inlocui in aceasta ' inclusa in forma completa a cataloagelor Promochem.
ecuatie s cu o si t cu z, care reprezinta abaterea de la medie. Substantele farmaceutice de referinta sunt produse pentru scopuri specifice, caracte-
%nstice, iar producatorii urmeaza riguros protocoalele pentru a objine asigurarea ca aceste
-isubstante de referinta corespund scopurilor propuse. Certificarea lor utilizeaza cerintele de

36 37
baza ale Ghidurilor ISO REMCO, dar sunt modificate de farmacopee pentru a reflecta ce- ; Cu toate acestea, materialele farmaceutice de referinta sunt atent si riguros controlate
rintele monografiilor farmaceutice asociate. Caracteristicile lor daunatoare (toxice) sunt : "tre producatori, ele neavand nici o eticheta sau documente ale producatorilor, care sa
determinate de unele "laboratoarc de referinta" (referente) prin expertii lor, iar datele • ... fafa sau termen de expirare. Pe de alta parte, metodele folosite de catre producatori
sunt supuse unei revederi (revizuiri) riguroase, inainte ca lotul lor sa fie certificat oficial. ; tru controlul produselor lor, ca si recomandarile facute utilizatorilor, variaza. Detaliile
In mod normal, datele actuale si valorile specifice obtinute din procesele de masurare \ t date in introducerea la fiecare sectie, inscriind diferitele colectii CRS in acest catalog.
nu sunt disponibile sau necesare prin monografia m care o astfel de substantS. de referinta ; Substantele farmaceutice de referinta §i materialele de referinta descrise in ca-
este utilizata. taloeul Promochem 1999 sunt publicate de diferite farmacopei, ca o parte integrants
Procedeul de certificare utilizat de USP este descris in introducerea la lista sub- :; monografiei analitice in care utilizarea lor este necesara; este important de retinut ca
stanfelor de referinta a USP, inclusa in cataloged Promochem 2000. Farmacopeea euro- |: ajjstii nastreaza inregistrarile lor, mai ales in legatura cu masele variabile. Promochem
peana, EP, detaliaza procedeul urmat intre-un Ghid Tehnic al EP, axat pe elaborarea mono- .* • ublica cu regularitate catalogul sau, cu toate ca autoritatile publica modificarea mono-
grafiilor, iar capitolul general (1.4) este axat pe Editia 1999 a EP. ' erafiilor ?i a standardelor pc tot parcursul anului. De aceea, se recomanda utilizatorilor
Pentru alte substance de referinta - CRSs a caror puritate reala sau pentru cercetarea " isa obtina cele mai recente informatii prin contactarea Promochem cu regularitate, iar
valorii acesteia este necesara utilizarea lor corecta, ele sunt oferite (livrate) astfel: -pentru substantele de referinta USP sa se aboneze la Pharmacopoeial Forum (PF), iar pen-
- cu eticheta tiparita USP, pe flacon; -?tru substantele de referinta EP sa se aboneze la Pharmeuropa.
- oficializate in catalogul EP-RSC 51 sectia EP a acestui catalog (Promochem); Editia acestui catalog pastrata pe "website" este actualizata si modernizata cu regu-
- inscrise in publicatia BP a standardelor testate oferite cu produsul. Jlaritate ?i se poate consulta si verifica site-ul la www.promochem.com. paginile putandu-
Sse recenza ?i incarca pentru tiparire, folosind Adobe Acrobat Software (vezi mai departe
3.2.3. Durata de viata, pastrarea si data de expirare Isurse de informare - Source of Information).

Substantele farmaceutice de referinta sunt preparate pentru o utilizare definita si 3.3. Standarde pentru impuritati farmaceutice
trebuie sa fie cumparate proaspete, atunci cand este necesar si nu pentru pastrare timp
indelungat. De la prima publicare a catalogului Promochem, in 1995, se mentine interesul pen-
Pastrarea pentru un termen scurt se face la +4 C, la intuneric, afara de cazul altor :itru impuritatile farmaceutice prezente in substantele active (vezi mai departe date referi-
indicatii, cu protectie impotriva umidit&tii. Marimea ambalajului este conceputa pentru a toare la catalogul Promochem 2001 pentru substantele de referinta utilizate in analiza
permite un numar limitat de analize repetate care sunt cerute de "Buna Practica Analitica" • ! impuritatilor farmaceutice).
(Good Analytical Practice), dar ambalajul deschis nu trebuie pastrat pentru utilizare ulte- Farmacopeile Europeana si Britanica au introdus in unele monografii o lista
rioara. fcuprinzand impuritatile care pot fi prezente in substantele active. Pe de altS parte,
Este, de asemenea, important faptul ca tuturor substantelor farmaceutice de referinta J autorilafile de licentiere au aratat un interes mai mare fata de impuritatile prezente
li se dau numere specifice ?i Htere de lot, ele fiind riguros controlate de catre producatori, ; ?in produsele formulate, mai ales in privinta substantelor general active. Acest interes a
fara a li se da insa termene de valabilitate si de expirare. In context, trebuie avut in vedere ; ^determinat solicitarea de la Promochem a unor standarde pentru impuritati, in afara de cele
ca loturile noi sunt preparate in avans pe masura epuizarii asteptate a lotului curent, aflat ; 'intalnite in sursele farmaceutice normale; de aici nevoia de a se intelege necesitatea funda-
in desfacere; noile loturi nu trebuie sa fie distincte de cele vechi. jmentala a standardelor de impuritati, care provin, de regula, din procesele de fabricate sau
Cand un material este retras din van/are, deoarece lotul a fost epuizat (vandut) ^din degradarea produselor finite. Cand impuritatile de degradare au o semnificatie farma-
sau cand lotul nu mai este valabil (fiind prea vechi), utilizatorii trebuie sa-1 utilizeze : ;cologica, testele pentru aceste substante sunt adesea incluse in monografiile substantelor
imediat si sa nu-1 mai pastreze; acest fapt se refera la perioada de timp in care loturile "sunt hprincipale originale (materiile prime principale).
oficiale", iar aceasta informatie de lot este furnizata de USP 5! EP in literatura sau bibli- Testele pentru impuritatile semnificative in procesele farmacologice pot fi incluse in
ografia lor, fiind disponibila totdeauna de la Promochem. "monografiile substantelor originale, dar cum impuritatile multor procese nu sunt cunoscute
Daca are loc o Intarziere in fumizarea (eliberarea) unui nou lot, toti consumatorii care '••a. fi active, nu sunt date in literatura, dar sunt incluse in cateva teste. Referintele farma-
au cerut, dar n-au primit. substantele comandate inainte. vor fi informal! imediat despre :copcilor EP si BP la cunoa$terea impuritatilor se bazeaza pe datele existente in produsele
noul lot disponibil. ;j licentiate. Trebuie subliniat ca nu toate impuritatile vor fi gSsite intr-un lot particular al sub-
Exista rare situatii in care un material este retras de catre producator; si in astfel de istantelor active si ca profilul impuritatilor reale este, de obicei, caracteristic unui proces
cazuri, toate stocurile detinute de utilizatori nu mai sunt valabile si trebuie sa fie dis- p:particular de fabricatie. Numai sursa disponibila a standardelor de impuritati pentru multe
truse. Evident ca Promochem are obligatia sa informeze toti consumatorii care au ?;procese este totusi manufacturata. Producatorii renumiti ofera, de regula, accesul la stan-
cumparat materialul retras. dardele de impuritati specifice proceselor lor, ca parte a dosarului lor "Drug Master File".

38 39
Un astfel de acces este desigur confidential intre eel care produce si aprovizioneaza si con- Evident ca formularea originala ERU 001, odata modificata. in PF 22, aceasta din
sumator, deoarece facerea publica a informatiilor legate de procese poate fi folositoare con- ? - devine oficiala si numai aceasta este valabila si va continua sa fie disponibila.
curentei. Standardele de impuritati nelistate (neinregistrate) in acest catalog sunt disponi- A mai survenit o modificare la PF 19, data In PF 19 No. 6, facuta la cererea
bile la cerere. ^'P ocean Pharmaceutical Manufacturers Association", adaugandu-se acetonitril, piridina
4i 1,2-dicloretan.
3.3.1. Utilizare, siguranta §i manipulare Noul amestec are compozitia prezentata mai jos si nu a fost niciodatS facuta oficiala
•'•' USP dar este disponibila la Promochem, insa nu este clar, in acest stadiu, dac2 formu-
Este extrem de important faptul ca "mainte de a deschide si utiliza un flacon en o larea va fi modificata pentru a reflecta modificarile descrise in PF 24/4, tabelul 3.2.
substanta etalon, trebuie sa fie chile cu atentie orice fel de documente care insotesc
astfel de substan je". irabe/u/3.2
Si, mai ales, trebuie sa se acorde o atentie specials, marita, instructiunilor refe- Substanta din amestec Cantitatea
ritoare la pre-amestecare, adaugarea diluentului (solventului de diluare) la materialele
- clorura de metilen (diclormetan) 1000 ng/mL
liofilizate si la marimea minima a probei care trebuie sa fie utilizata, deoarece
folosirea unor probe mai niici decat cele recomandate este o sursa de erori. - benzen 200 (ig/mL
Pe de alta parte, trebuie sa se tina seama ca unele materiale farmaceutice de refe- - tricloreteni 200 jig/mL
rinta $i unele materiale judiciare de referinia sunt toxice, neccsitand o manipulare - 1,2-dicloretan 200 ug/mL
speciala (materiale de acest fel sunt identificate in catalog). De altfel, toate materialele - cloroform 100 ug/mL
de referinta trebuie sa fie manipulate cu foarte mare atentie, ca si cum ar fi bio-active, - 1,4-dioxan 200 ug/mL
toxice sau infectante, iar deschiderea ambalajelor (flacoane si fiole), con tin and astfel
- acetonitril 100 Ug/mL
de substante, se face nmnai de catre personalul cunoscator si instruit in acest sens.
Toate substantele farmaceutice si judiciare de referinta si Standardele se utilizeaza - piridina 200 ug/mL
numai pentra nevoile laboratorului de analiza si control si nu se pot utiliza pentru uzul tera-
peutic curent. In continuare, se dau trei produse ERU in tabelul 3.3.

3.3.2. Materiale de referinta pentru impuritati organice volatile produse iTabelul 3.3
de Radian International, USA
Produsul Metoda Volumul
Datele referitoare la USP General Methods 467 Organic Volatile Impurity au fost USP Method <467>
modificate cu regularitate si aduse la zi, dupa introducerea pentru prima data de catre ERU 001 5 x 1 mL
Organic Volatile Impurity Standard
Radian a "Reference Material, ERU 001" in 1995. Metoda particulara specials, privind uti- USP Method <467>
lizarea unui astfel de material, ca si detaliile aferente sau variatii privind aplicarea metodei ERU 002 4 x 1 mL
Modified PF 19 Organic Volatile Impurity
sunt specificate in monografiile individuale in care astfel de teste sunt necesare. USP Method <467>
Amestecul original ERU 001, modificarea in PF 19, Number 3, Page 5335 si ultima ERU 003 4 x 1 mL
Euro EPMA Formula
formulare descrisa in Volume 22, Number 4, Page 2654 al Pharmaceutical Forum sunt date
in tabelul 3.1. 3.4. Substante controlate

Tabelul 3.1 Un numar deloc neglijabil de substante farmaceutice de referinta si judiciare de refe-
Substanta din amestec ERU 001 PF 19/3 PF 22/4 giinta, intre care mai ales narcotice, tranchilizante si alte medicamente de care se face
?: abuz, prezentate in catalogul Promochem, sunt "substante controlate" in tarile de origine
- clorura de metilen 1000 |ig/mL 1000 ug/mL 1000 ug/mL
|corespunzatoare, de exemplu in USA pentru USP, Franta pentru EP si Marea Britanie pen-
- cloroform 500 ug/mL 100 ug/mL 500 ug/mL i'rtm BP, "fiind marcate" pe eticheta produsului cu "controlled substance".
- benzen 1000 ug/mL 200 ug/mL 1000 ug/mL Cumpararea, detinerea si utilizarea substantelor controlate fac obiectul unor
- 1,4-dioxan 1000 ug/mL 200 ug/mL 1000 ug/mL |reglementari nationale si internationale, concepute astfel meat sa limiteze abuzul lor.
- tricloretilena 1000 Ug/rnL 200 ug/mL 1000 ug/mL |De aceea, consumatorul are responsabilitatea obtinerii oricarei autorizatii necesare

40 41
pentru cumpararea, posesia si utilizarea substantelor controlate, supunandu-se omandarea USP Reference Standards Commitee, care aproba selectia si coresponden^a
autoritatii tarii importatoare, inainte de a face comanda. ' rodus nou si lot nou sau de inlocuire, in acord cu procedura descrisa mai jos.
Administrarea complexa, asociata cu aprovizionarea si posesia acestor materiale) S rtimentul, deci domeniul standardelor de referinja disponibile din USP, include:
obliga Promochem sa se asigure ca to\i consumatorii care cer substante controlate sunt - standarde de referinta oficiale curent in USP si NF;
constienti de toate cerintele importante nationale, de sarcinile asociate si timpii firesti de standarde de referinta anterioare, cerute pentru o durata mai scurta, printr-o mono-
eliberare. grafie USP sau prin NF;
Consumatorii doritori sa obtina substance controlate trebuie sa contacteze ofki- - standarde de referinta Food Chemical Codex;
ile Promochem de vanzare, inainte de a comanda, pentru a clarifica impreuna cu substante autentice, care sunt chimicale de inalta puritate, caracterizate, incluzand
specialistii fumizorilor procedeul de urmat si costul exact. medicamente de abuz, care sunt testate colaborativ (interlaboratoare) si facute
Toate cererile de substante controlate trebuie sa fie inaintate In sens si semnate disponibile prin USP incepind cu ianuarie 2000; listele catalogului includ toate
de o persoana autorizata. Comenzile trebuie sa fie insotite de autorizafia originals de amendamentele si produsele devenite oficiale prin USP, rncepand cu ianuarie 2000.
import sau de posesie. Cererile prin fax sunt binevenite, dar comenzile trebuie sa fie tri-
mise cu documente originale prin posti. 1) Producerea §i certificarea standardelor de referinta
Dezvoltarea standardelor de referinta USP este un proces multifazic (cu mai multe
3.5. Informatii generale de comanda 'faze) care implica o cooperare voita (convenita) intre industria farmaceutica, agentiile
J guvernamentale si staff-ul stiintific a] USP si membrii Comitetului de Revizie. Etapele de
Procedeele de furnizare si preturile sunt date in lista de prejuri care insoteste cata- ! urmat ale procesului (pe parcursul a 1-2 ani) sunt urmatoarele:
logul Promochem sau se pot obtine de la oficiile locale de vanzare ale Promochem; cu - prepararea si purificarea materialului "candidat la calitatea de standard de referinta";
aceste oficii trebuie sa se clarifice si detaliile si costurile, mai ales ca pentru unele cazuri - testarea si caracterizarea printr-un studiu colaborativ (interlaboratoare);
(putine) se cer expedi^ii la rece (in frigider), licente speciale, substante controlate etc. - revederea si recenzarea stiintifica initiala; lucrul analitic ulterior este adesea nece-
Preturile pentru "bun a fi expediat in afara EU" sunt de resortul strict al FOB sar, fiind posibila si respingerea materialului candidat si reluarea procedurii;
Shipping, iar pentru produsele care implica procedee speciale de expedite (Cooled - prepararea scrisorii USP Reference Standards Commitee, continand datele studiilor
Shipping, licenta specials, substante controlate etc.) se aplica prefuri aditionale la costurile colaborative, scrisoare ce va fi utilizata de organismul mentionat; acest document
normale de transport. este un raport intern al USP echivalent certificarii si el trebuie sa fie unanim apro-
Odata expediate catre consumator, returnarea materialelor de referinta nu este per- bat si confirmat de datele analitice; analistii trebuie sa solicite acest document;
misa, exceptand cazul ca materialul este alterat. Pentru o astfel de ratiune este foarte impor- - ambalarea si controlul final de calitaie si testarea omogenitajii, a integritatii ambalajului etc.
tant ca utilizatorii sa fie siguri ca produsul cerat, deci comandat, acopera (satisface) nevoile Tinand seama de natura riguroasa a procesului de aprobare si a timpului necesar, este
lor. Tot din astfel de ratiuni, staff-ul tehnic al' Promochem doreste sa discute cu utilizatorii explicabil faptul ca USP nu poate avea.disponibil un lot nou, inainte ca lotul existent sa fie
despre folosirea unui anumit produs in ideea de a verifica daca produsul corespunde sco- epuizat. Dar USP fumizcaza cu regularitate, pentru Promochem, informatii aproximative
purilor pentru care se doreste a fi comandat; service-ul acestor "sfetnici" nu se terminS privind disponibilitatea noului lot recomandat de USP RS.
odata cu vanzarea materialelor de referinta, ei putand discuta cu utilizatorii si aplicatiile In conditii normale, un nou lot devine oficial si pastrat pentru utilizare ulterioara,
unui anumit material de referinta, ei fiind obligati sa acorde asistenta profesionala de spe- inainte ca lotul vechi sa fie complet vandut; modificarea necesara ca un lot vechi sa ramana
cialitate oricand este necesar. oficial inca pentru o perioada de timp implica recertiflcarea pentru a nu elimina lotul vechi
icare mai poate fi bun si a introduce loturile urmatoare, ceea ce implica deseurile inutile.
3.6. Farmacopeea Americana §i formularul de standarde de referinta USP nu ofera un certificat de analiza, dar a fost introdus un rezumat extras din do-
(National Formulary Reference Standards NF) de la Conventia Farmacopeii cumental original realizat de staff-ul USP Division of Drug Standards Development; mai
USA, Inc. jos este prezentat un exemplu de certificat nou; certificatele sunt disponibile pentru toate
.lotunle curente ale USP RS (Refecrence Substances) si pot fi comandate prin Promochem,
Substantele de referinta USP sunt de inalta puritate. deoarece sunt utilizate in (fiind expediate catre utilizatori direct de catre USP.
metode-test oficiale ale USP si NF. Atunci cand aceste substante sunt folosite ca parte a Pe pag. T8 a "USP Standards of Quality" este prezentat un exemplu de rezumat al masurato-
monografiei principale oficiale, aceasta ofera mijloacele de a verifica conformitatea (com- I rilor, pentru un standard de referin|a USP, facut de USP Division of Standards, pe baza constatarilor
plianta) materialului cu standardele pentru identitate, concentrate, calitate si puritate pre- |> laboratoarelor colaborative, privind evaluarea materialului "candidat". Documentul original este in
vazute de USP 24 - NF 19. I acord cu USP Document Disclosure Policy, confidential (Catalog Promochem 1999, p. 9).
Standardele de referinta USP sunt eliberate numai sub autoritatea USP Board of Trustees,

42 43
Tabelul 3.4. Exemplu de rezumat al unor maswatori pentru un standard de referinfa USP
Irythromycin MW 717,93 Nr. Catalog 24201-0
Lot F Formula moleculara: C37H67NO12
loncentratia declarata: 97%. Continutul este stabilit pe o baza "as is", fara uscare.
(potenta declarata)
Preparare si prezentare: fiole de sticla chihlimbarii. Fiecare fiola contine cca. 150 mg.
Conformitate: lotul este potrivit (convenabil) pentru a demonstra confonnitatea (compli-
mta) cu toate cerintele monografiei "Erythromycin USP 23-9 Supl" in care aceasta USP
iS este necesara. Rezultatele pentru lotul actual sunt oferite numai pentru informatie.
'ierdere la uscare: 2,1% in timpul ambalarii (impachetarii)
Continutul titrabil cu HC1O4: potrivit cu concentratia
'uritatea cromatografica prin LC ?i TLC: satisfacatoare pentru aplicatii oficiale
erintele tuturor altor monografii: conforme
Data oficiala: acest rezumat este facut pentru a aplica intreaga perioada a statutului ofi-
cial al acestui lot, stabilita prin catalogul oficial - vezi mai jos, stabilitatea, conservarea-
pastrarea si perioada de utilizare.
Semnatura: ss Vicepresedinte si Director al Dezvoltarii Standardelor
Rockeville, MD 20852, USA, Tel.: Fax: Net:
Evaluarea omogenitatii
Lotul a fost testat pentru omogenitate prin analizarea probelor selectate intamplator
(aleator) in si intre laboratoare. Toate rezultatele au fost intre limitele admise ale metodei.
Nivelul omogenitatii se dovedeste a fi satisfacator pentru procedeul descris in monografie.
Instruction! de utilizare: urmeaza instructiunile de pe eticheta si din monografia
corespunzatoare (potrivita) USP si notele de indramare date in capitolul <11> a!
USP XXIII, USP XXV si once supliment ulterior.
Stabilitate, conservare si perioada de utilizare
Aceasta este responsabilitatea fiecarui analist, de a stabili ca transports
(aprovizionarea) special al standardelor de referinta USP este in executie (in curs de
desfasurare); pot fi cumparate numai cantitati suficiente pentru uzul imediat, trebuind sa
se evite pastrarea timp indelungat.
Pentru asigurarea accesului prompt la ultimele informatii, USPC publica un
"Catalog Oficial al Standardelor de Referinta si Substance autentice", care include denu
mirile loturilor, abonatnentul bilunar al publicatiei "Pharmacopoeial Forum". Acest sis
tern ofera un control mai bun, mai corect si flexibilitate in raspunsul la revizuirile in
folosirea standardelor de referinta, decat distribuirea datelor de expirare a unitatilor indi-
viduale. Catalogul aferent celei mai recente editii a Pharmacopoeial Forum identifies arti-
colele care sunt oficiale in colectia USP Reference Standards, la data publicarii.
In catalogul oficial apar doua coloane pentru identificarea loturilor oficiale:
- prima coloana identified lotul curent oficial existent, expediat dc USPC Reference
Standards Committee;
- in unele cazuri un lot anterior poate fi considerat inca oficial; un astfel de lot poate
fi identificat in coloana a doua; in fapt, acest lot anterior este adus la "statutul ofi-
cial" pentru inca eel mult un an dupa ce lotul curent (actual) este distribuit, excep-
continuare in pag. 45
44
tamTcazuT schimbarii cerintelor monografiei sau a limitarilor stabilitajii, cand lotul
anterior nu mai corespunde.
Acest fel de informatie este de asemenea disponibila in sectia Reference Standards
USP Home Page la www.usp.org.
Autorizarea loturilor oficiale
Autorizarea loturilor oficiale de standarde de referinta USP, cu stabilirea si elibe-
ea lor se face sub autoritatea USP Board of Trustees, dupa recomandarea USP
Reference Standards Committee, care trece printr-un proces de selectie si verificare a
potrivirii fiecarui lot.
Caracteristicile primejdioase (daunatoare) ale fiecarui lot al specimenului selectat
pentru a fi standard sunt determinate de regula independent, in trei sau mai multe
laboratoare ale USP si US FDA (sau altele), care participa la testarea aproape a tuturor
noilor standarde si la inlocuirea standardelor existente; la aceste testari participa labora-
toarele academice si industriale de pe tot cuprinsul USA.
Incertitudinea masuratorilor
Aceasta este caracteristica laboratorului si are loc la data efectuarii analizei, respec-
tiv in timpul analizei. Selectia numarului de specimene replicate sau de standarde cade in
esponsabilitatea laboratorului, fiind direct legate de obtinerea certitudinii dorita privind
concordanja si conformitatea cu cerintele oficiale (vezi USP 23 General Notices si cerinfe
sub "Test Results Statistics and Standards).
Utilizarea materialelor ne-monografice
Pentru a sprijini aplicatiile materialelor ne-monografice (deci neprevazute in mono-
grafii, dar necesare) care sunt permise de USP General Notices, in baza utilizarii unor
metode alternative, se poate utiliza un anumit material notand continutul statuat (stabilit)
anterior. Insa validarea metodei de analizS si standardul utilizat in astfel de situatii si apli-
catii cade in sarcina si responsabilitatea laboratorului individual care efectueaza aplicatia.
Factorii continuitatii sunt atribuiti unor inlocuiri de lot al standardelor de referinta,
pentnl a asigura compatibilitatea rezultatelor pe perioade mai lungi de timp. Acestea sunt
intelesurile strict numai pentru cercetarea oficiala si pentru aceeasi validare a aplicatiilor
pretinse (adica efectuate).
Nota juridica (legala)
Aceasta se refera la faptul ca informatiile continute in acest document se pot utiliza
Qumai pentru procedeele si metodele descrise in versiunea actuala (oficial valabila) a
monografiilor USP.
Prin urmare, nici USP, contractorii acesteia, nici o persoana care actioneaza in
nurhele sau (al USP) nu pot produce:
- nici o garantie, justificare, nici reprezenta sau exprima alte opinii privind acuratetea,
plenitudinea si utilitatea informatiilor din acest document pentru alte procedee si
metode decat cele existente in monografiile in vigoare;
- nici o informatie continuta in acest document nu poate fi utilizata pentru a incalca
contmuare m pag. 46
45
 Tabelul 3.4 continuare din pag. 45
Promochem a initial un program prin care, impreuna cu USP, sa fie aduse "US
recunoasterea drepturilor emitentului; g,, jjj conformitate cu cerintele europene; totusi, chiar si o astfel de informatie a fost
- nu se pot utiliza informatiile si metodele in cauza pentru a produce daune rezultate
"lata din date oferite de ofertanti (care aprovizioneaza) si din domeniul public si nu
din aceasta utilizare; ' fost verificate independent de staff-ul stiintific al Promochem si, prin urmare, nu poate
- in caz de conflict in rezultatele testului sau in privinta cercetarii, sunt determinante
numai metodele si procedeele oficiale, ca si inscrisurile de pe eticheta. g garantata.
O descriere completa a bazelor (fundamentelor) pentru utilizare proprie si pentru
3.7. Substante de referinta, preparate biologice de referinfa si spectre
procedeele de control al lotului, pentru USP NF Reference Standards este data in
dupa Farmacopeea European* (EP)
"General Chopter «11»" a USP-24 NF 19.
Analistii sunt insistent sfaturfi sa revada aceasta sectiune asupra bazelor obisnuite
Comisia Farmacopeii Europene, care se intruneste de trei on pe an, include printre
(uzuale), iar copii ale acestei sectii facuta din USP pentru PC si modificari recomandate
membrii sai, delegati din {Sri care au adoptat aceasta farmacopee.
in suplimente se pot obtine numai de la Promochem, la cerere scrisa.
La intalnirile acestei comisii sunt adoptate monografii noi, ceea ce implica si aparitia
unor noi substante chimice de referinta, EPCRS. Odata adoptate noile monografii EP de
2) Perioada de utilizare si termene de expirare catre comisia mentionati, ele sunt publicate intr-o publicatie anuala sau intr-o fascicula;
apoi ele sunt adoptate de catre membrii statelor incepand cu 1 ianuarie a anului urmator.
Standardele de referinta USP nu sunt etichetate cu o data de expirare, deoarece sis- .- Pentru a sprijini monografiile EP, s-a intocmit o colectie a substantelor de referinja.
temul numarului oficial de lot prezinta o flexibilitate mai mare decat termenul de expirare. i disponibile, care include:
Stocurile USP RS sunt controlate si verificate regulat si riguros, iarprin."Indexul ofi-1 - substante chimice de referinta oficiale in EP (EPCRS);
cial al numarului de lot", tiparit de 6 on/an in Pharmacopoeia! Forum (PF), statutul oficial j - spectre de referinta;
al tuturor loturilor poate fi controlat, fiind reglementat. - preparate de referinta, intre care enzime si substraturi din "International
Lista in PF arata codul pentru identificarea lotului curent. In unele cazuri, un alt cod de Commission on Pharmaceutical Enzymes and Certified Viscozity Standards", de la
lot este identificat sub coloana si conduce la "lotul anterior/data". Once lot indicat in aceastS Laboratoarele Van Swinden.
coloana este de asemenea oficial pana la sfarsitul lunii mentionate; de exemplu, F-l (06/00) Noile liste ale EPCRS sunt publicate de trei on pe an, listele din acest catalog fiind
se refera la faptul ca lotul F-l este oficial pana la 30 iunie 2000. "Nici o informatie" sau fgcute dupa EP List No. 26, October 2000.
"NONE" (deloc, nimic) in coloana exprima faptul ca numai lotul curent oficial poate fi uti- f|
lizat, precum si faptul ca nici un lot anterior nu trebuie utilizat. 1) Legaturi cu alte farmacopei din Europa
Este important ca fiecare analisf are responsabilitatea de a se asigura ca subs- 1
tantele USP de referinta sunt actuate, viabile. Este de apreciat ca, odata ce apare o monografie EP, once substanta de referinja,
• spectru sau preparat cerut, vor fi disponibile.
3) Substante controlate Cand o monografie EP este adoptata de catre membrii statelor Consiliului Europei,
I once material de referinta disponibil din farmacopeile nationale, de exemplu British
Lista USP contine scheme I, II, III si IV cu reglementari privind substantele contro- £ Pharmacopeea (BP) si Pharmacopee Fran9aise (PF), sa inceteze a mai fi valabile, in
late. Informatii privind procedurile speciale ce trebuie aplicate se pot cere de la § favoarea substantelor de referinta EP. Multe Jari membre ale Comisiei Farmacopeii
Promochem pentru detalii si costuri. Europene au adoptat EP pe deplin, iar monografiile lor cer numai EPCRS.
In schimb, alte tari care sunt membre ale Comisiei EP mentin monografiile farma-
4) Fise cu date privind siguranta materialelor copeilor nationale, mai ales pentru formele dozate, care necesita utilizarea substantelor de
referinta separate (corespunzatoare).
Este vorba in fapt de buletine care contin date referitoare la siguranta materialelor, |; In sectiile catalogului Promochem, pentru astfel de substante sunt date liste cu RS
respectiv a tuturor standardelor de referinta USP RS (Material Safety Data Sheets -1 produse pentru monografiile farmacopeilor britanica, franceza si elvetiana.
MSDS), dezvoltate de USP in termeni de USP EPA Occupational Safety and Hazardous % Alte tan membre ale Comisiei EP au monografii nationale care nu necesita substante
Substances Act, care sunt disponibile si care sunt oferite de USP; de notat ca MSDS oferite 1 de referinta speciale, de exemplu DAB (Germania), in timp ce Farmacopeea Italiana uti-
de USP, dar distribuite de Promochem la toti clientii, nu sunt integral conforme cu cerintele * lizeaza un amestec de EPCRS si RS din Farmacopeea Internationala, IP. Substantele de
EU si deci este posibil sa nu fie in concordanta cu "Buletinele de date ale Sigurantei mate- referintS IP sunt descrise (date) in sectia acestui catalog Promochem, referitoare la'WHO
rialelor" ale EP pentru aceleasi substante chimice. (World Health Organization - OMS).

46 47
 In legatura cu producerea si certificarea substantelor de referinta EP si a preparatelor, M terialele de referinta trebuie s£ fie utilizate asa cum sunt livrate, afara de cazul in
acestea sunt selectate si verificate de laboratoarele EP pentru a deveni compatibile (core- noerafia declara c5 este necesar un procedeu de uscare.
spunzatoare) cu. utilizarea, asa cum se prescrie in monografiile principale ale EP.
Certificatele analizelor sau ale altor informatii nu sunt si nici nu pot fi facute disponi- 2) Deschiderea
bile prin Laboratoarele EP, in legatura cu utilizarea prescrisa EP-CRS.
Substantele de referinta din EP sunt concepute pentru aplicatii specifice care sunt Pentru substantele de referinta oferite in flacoane (fiole) de sticla sigilate este reco-
identificate printr-un numar de cod sau numere, incluse in descrierea fiecarui produs. mandat urmatorul procedeu EP de deschidere:
Este posibila si utilizarea altor CRS decat cele date in catalog, dar utilizatorul este - se bate usor flaconul pentru a colecta materialul in partea de jos a ambalajului;
responsabil de verificarea corespunzatoare a EPCRS pentru orice utilizare non-mono- - se taie capatul opus, de exemplu al fiolei, cu o pilS sau creion de diamant;
grafica. In Tabelul 3.5 sunt prezentate unele CRS utilizabile, indicate prin numarul de cod. - se incalzeste taieiura cu o bagheta de sticla incandescenta si se preseaza rapid (prin
apasare);
Tabelul 3.5. Coduri ale unor CRS ?i utilizarea lor . daca sticla nu se sparge, se taie mai profund si pe o lungime mai mare ?i se repeta
procedure;
Codul Utilizarea - este necesara protectia ochilor si a mainilor.
1 Identificarea prin IR Numeroase substante de referinta sunt livrate ca materiale liofilizate, intr-un flacon
2 Identificarea prin TLC cu perete despartitor. De aceea nu trebuie sa se incerce deschiderea flaconului de sticla si
3 Identificarea prin punctul de topire sa se cantareasca pudra. Este important sa fie urmate intocmai instructiunile monografiilor,
3A Identificarea prin depolimerizare iar materialul se dizolva intr-un solvent-tampon, solutia rezultata putandu-se manipula vo-
4 Identificarea prin LC lumetric.
4A Identificarea prin cartografia peptidei
5 Identificarea prin electroforeza 3) Pastrare, perioada de utilizare, termen de expirare
5A Identificarea prin cromatografie de excludere (size exclusion)
6 Identificarea prin GC Substantele chimice de referinta sunt inspectate cu regularitate si analizate in mod
7 Identificarea prin RMN repetat de staff-ul stiintific al EP. Fiecare EP CRS este primita de consumator astfel meat
8 Identificarea prin UV sau colorimetric ea sa fie potrivita pentru utilizarea dorita.
8A Test pentru substante inrudite, prin UV sau colorimetric EP recomanda sa fie cumparat materialul numai atat cat este necesar pentru uzul ime-
9 Test pentru substante inrudite, prin TLC diat, iar flaconul sa fie pastrat nedeschis inainte de utilizare, la +2°C sau la +8°C, in func|ie
10 Test pentru substante inrudite, prin LC de indicatiile date de furnizor.
11 Test pentru substance inrudite, prin cromatografie de excludere Exista substance de referinta prefixate, a caror eticheta este marcata cu semnul ||*||,
12 Test pentru substance inrudite, prin electroforeza care trebuie sa fie pSstrate la -20°C, iar altele marcate (tot prefixate) cu semnul ||**||, care
13 Test pentru substante inrudite, prin GC trebuie sa fie pastrate la -80°C; intre acestea figureaza:
14 Test prin UV sau colorimetric - Interferon alfa 2 a CRS;
15 Test prin LC - Interferon alfa 2 b CRS;
15A Test prin cromatografie de excludere - Interferon gama 1 b CRS;
16 Test prin GC - Solutie CRS de Interferon 1 b de validare;
17 Test microbiologic - Poliovaccin, inactivat, BRP;
18 Biotest - Vaccin Oreion (viu) BRP;
19 Imunotest - Vaccin Rubella (viu) BRP.
19A Test pe substrat cromogenic Pentru Vero si RK 13, ambele prefixate - marcate cu semnul ||***||, este recomandata
20 Test prin titrare volumetrica temperatura azotului lichid.
20A Test prin viteza de hidroliza Odata deschis un flacon continand CRS, EP nu mai poate garanta stabilitatea mate-
21 Metode generale nalului pentru timp mai indelungat, iar CRS neutilizat trebuie sa fie aruncat, nepastrandu-
22 Alte propuneri i se pentru o utilizare ulterioara.
Cele mai multe EP CRS pot fi transportate la temperatura obisnuita, dar unele trebuie
(Catalog Promochem, 2001, pag. 35)
48 49
sa fie mentinute la temperaturi controlate; prin uimare, acestea din urma trebuie sa fie
transportate in conditii speciale care, impreuni cu alte detalii, pot fi obtinute la cerere.
Toate noile substante chimice de referinta EP incep cu "Sena 1" (Lotul sau Grupul
1), iar inlocuirea loturilor se numeroteaza cu 2, 3 etc. Perioada de utilizare si datele de expi-
rare nu sunt date, dar cand se schimba senile (loturile), catalogul EP CRS arata data dupa
care lotul vechi nu mai este oficial.
Spre exemplu, specificatia urmatoare: "Sena 2 este valabila pana la 30 Noiembrie
2000" se refera la faptul ca lotul 2 nu mai este oficial incepand cu data de 1 Decembrie
2000, iar Sena sau Lotul 3 devine oficiala incepand cu aceasta ultima data.
Este insa posibil ca EP sa dea o perioada mica de suprapunere, astfel meat substantele
de referinta ale casei producatoare pot fi re-certificate fa£i de fostele si viitoarele serii sau
loturi.
Potentiala toxicitate a unor substante de referinfj necesita unele precautii pentru
evitarea contactului cu ele pe timpul utilizarii lor. Astfel de substante trebuie sa fie mani-
pulate intr-un spatiu Tnchis, cu manusi, sau trebuie sa fie utilizate manusi si ochelari de pro-
tectie sau imbracaminte specials, si masca de protectie a ochilor si a cailor respiratorii.
Pe de alta parte, produsele biologice, intre care $i sangele, trebuie sa fie conside-
rate ca substante cu rise potential pentru sanatate, ele trebuind sa fie utilizate si vandute in
acord cu procedeele de siguranta stabilite de laboratoare.
4) Substante controlate
I
Lista EP contine un numar de substante supuse programelor III si IV referitoare la p
"Reglementari asupra substantelor controlate"; pentru procedeele speciale de cerere trebuie % cantitative de evaluare si defmirea exacta a activitatii enzimatice pentru enzimele semni-
contactat Promochem, acesta comunicand si costurile.
m Ca o consecinta a acestei cerinte, Federatia Farmaceutica Intemationala - FIP
5) Siguranta materialului. Data - Fise
Fisele referitoare la datele privind siguranta materialelor EP CRS sunt disponibile la
cerere, fiind incluse in editiile CD ROM ale monografiilor Farmacopeii Europene si site- Amylase (pancreatic), spre deosebire de FIP 1 Amylase (fungal).
ul EP. Trebuie precizat ca si astfel de informatii oferite au fost redactate din date fiirnizate
de distribuitori si de la domeniul public si nu au fost verificate independent de staff-ul
stiintific al EP si nici de Promochem, de aceea ele nu pot fi garantate.
6) Lichide certificate pentru masuratori de vascozitate
Lichidele cu vascozitate certificate (Newtoniene) sunt furnizate de Van Swinden
Laboratorium BV si sunt distribuite de Promochem, fiind disponibile cu vascozitati cine-
matice pana la 80.000 mmV1 si sunt certificate la temperaturi cuprinse in domenjul 10 C- toate BP CRS disponibile, necesare pentru a Tntelege si a urma monografiile incluse in BP
140°C.
Vascozitatea cinematica se exprima si se certifica in mmV sau in mPas (vascozitate
dinamica, m), m = v x densitate .
1 mPas = s cps (centipoise)
1 mmV = 1 cts (centistocke)
so
T ' h'dele standard sunt disponibile din stoc in ambalaje de 250 mL si sunt certificate
, On°r la urmatoarele vascozitati:
= 0 6 - 2 1 ; 4,9; 0,19; 33; 52; 57; 66; 85; 104; 130; 170; 215; 270; 340; 425; 530;
630- 830- 1004; 1315; 1818; 3625; 5075; 18.350 sau 47.000 mmVi
m = 0 4; 1,6;' 4,1; 8,17; 28; 45; 49; 57; 74; 91; 114; 145; 190; 240; 300; 375; 470;
580; 745; 866; 1180; 1574; 3150; 4430; 16.200 sau 41.600 mPas
Toate vascozitatile sunt calibrate fata de apa pura. Valorile declarate sunt valori no-
• al ' valorile certificate nu trebuie sa devieze cu mai mult de 10% din valorile nominale.
Incertitudinea vascozitatilor certificate este mai mica de 0,2% la cea mai scazuta vas-
cozitate si este panS la 1,1% la 80.000 mmVi.
Perioada de utilizare. Standardele pana la 500 mPas se bazeaza pe uleiuri minerale
au o viata pe raft de 12 luni de la data certificarii. Peste 500 mPas se utilizeaza
"Polyisobutylene" (poliizobutilena), care are o viata pe raft mai scurta si trebuie sa fie
comandata atunci cand este necesar.
Pe de alta parte, se pot prepara si certifica lichide pentru orice vascozitate cuprinsa
intre 0,6 mmV1 si 80.000 mmV1 (pretul depinde de vascozitatea ceruta, de gradul de pre-
cizie dintre vascozitatea nominala ceruta si certificata, de temperatura si de certificarea
; vascozitatii dinamice).
7) Enzime standard
Comisia intemationala pentru enzime farmaceutice a impus stabilirea unor metode
ficativ farmacologice.
(Federation International Pharmaceutique) a produs si certificat substante de referinta pen-
tru enzime si substraturi.
Produsele FIP cerute in unele monografii sunt marcate cu (EP), ex. FIP 2 (EP) ...
3.8. Substante de referinta ale Farmacopeii Britanice - BP
Substanfele de referinta ale Farmacopeii Britanice - BP-CRS disponibile din BP sunt
publicate sub egida "British Pharmacopeia Commission" si sunt utilizate numai in teste si
incercari ale BP 99.
Lista din catalogul Promochem este actuala, deci oficiala din aprilie 2000 si include
99, care au devenit oficiale la 1 decembrie 2000. Cele mai multe monografii pentru sub-
stantele active sunt coroborate cu monografiile publicate de EP si astfel este necesara uti-
lizarea EP CRS - European Pharmacopoeia Chemical Reference Substances. Detalii ale
acesteia sunt gasite in Lista EP RS (substante de referinta din Farmacopeea Europeans) din
acest catalog Promochem.
51