Standard internaţional ISO 13843

Prima ediţie 2017-06

Calitatea apei — Cerinţe pentru stabilirea caracteristicilor de performanţă

ale metodelor microbiologice cantitative

Nr. referinţă
ISO 13843:2017(E)

1
Cuvânt înainte
ISO (Organizaţia Internaţională pentru Standardizare) este o federaţie mondială
de organisme naţionale de standardizare (organisme membre ISO). Activitatea
de pregătire de standarde internaţionale este în mod normal realizată prin
intermediul comitetelor tehnice ISO. Fiecare organism interesat de un subiect
pentru care a fost realizat un comitet tehnic are dreptul de a fi reprezentat în
acel comitet. Organizaţiile internaţionale,organizaţiile guvernamentale şi
neguvernamentale, împreună cu ISO, participă la aceste activităţi. ISO
colaborează îndeaproape cu Comisia Internaţională Electrotehnică (IEC) privind
toate aspectele ce ţin de standardizare în domeniul electrotehnic.

Procedurile utilizate pentru acest document şi cele pentru întreţinere sunt

descrise în Directivele ISO/IEC, Partea 1. In particular, diferitele criterii de
aprobare necesitate de diferite tipuri de documente ISO trebuie avute in vedere.
Acest document a fost redactat în conformitate cu regulile editoriale ale
Directivelor ISO /IEC, Partea 2.

Standardul Internaţional ISO 13843 a fost pregătit de Comitetul Tehnic ISO/TC

147, Calitatea Apei, Subcomitetul SC 4, metode microbiochimice.

Prima ediţie a ISO 13843 înlocuieşte ISO/TR 13843:2000, care a fost revizuita
tehnic.

2
Introducere
Metodele sunt considerate microbiologice atunci când estimarea cantitativă se bazează pe
numărarea particulelor microbiale fie direct, cu un microscop, sau indirect, pe baza creşterii
(multiplicării) în colonii, turbiditate, schimbare de culoare sau fluorescenţă. Principiile şi procedurile
din acest document sunt cunoscute drept numărare microscopică, cel mai probabil număr (MPN) sau
numărare a coloniilor. Majoritatea procedurilor pentru determinarea caracteristicilor de performanţă
descrişi în acest document sunt aplicabile pentru toate cele trei metode. Acolo unde procedurile nu
sunt aplicabile, sunt oferite sugestii alternative in cadrul documentului sau in Anexele D şi E (pentru
repetabilitate, reproductibilitate, sau incertitudine a numărării).
Numărarea bacteriofagelor este în cele mai mult situaţii similară cu numărarea coloniilor bacteriene.
Unele dintre metodele microbiologice mai noi, precum cele care utilizează hibridizare fluorescenta in
situ (FISH) sau reacţie în lanţ a polimerazei (PCR), pot fi şi ele acoperite de acest document. Însă pot
necesita o atenţie deosebita, în funcţie de modul de folosire. Aspectele importante in acest situații
includ mecanismul de determinare a numărului microbilor prezenti (precum curba standard pentru
qPCR sau numărare microscopica pentru FISH) şi viabilitatea organismelor detectate. Daca astfel de
tehnici sunt utilizate pentru confirmare ca si parte a metodei, atunci toate secţiunile acestui document
sunt relevante.
Deşi nu este esenţial, pe perioada caracterizării metodelor microbiologice poate fi benefic să se
genereze date utilizând organisme stresate. Pot fi utilizate diferite metode pentru stresarea
organismelor, însă cele două cele mai utile pentru apă sunt stresarea cu dezinfectant (cu clor) şi
eliminarea nutrienţilor cauzate de organisme în medii cu nutrienti reduşi (apa potabila si alte ape
oligotropice) pentru o perioada anterior testării. Efectul asupra unora dintre caracteristicile de
performanta ale „stresării” organismelor este aproape total dependent de tipul si gradul de stresare
aplicat, fiind inadecvat sa se includă astfel de detalii in acest document. Exista totuşi descrieri in
literatura de specialitate pe care laboratoarele le pot consulta in cazul in care doresc să determine
caracteristicile de performanţă ale unei metode cu celule stresate.

3
Standard Internaţional ISO 13843:2017(E)

Calitatea apei — Cerinţe pentru stabilirea caracteristicilor

de performanţă ale metodelor microbiologice cantitative
1 Domeniu de aplicare
Acest document vizează caracterizarea metodelor microbiologice. În acest document, caracterizare
presupune studierea parametrilor care pot fi măsuraţi pentru a descrie cum se va comporta probabil
metoda în anumite condiţii date, care pot fi descrise ca şi caracteristici de performanţă. Documentul
descrie procedurile care pot fi utilizate pentru validarea ulterioară sau verificarea metodei.
Accentul se pune pe metode cantitative selective, iar acest document se aplică tuturor tipurilor de
apă. Pentru metodele care nu se bazează pe numărare microscopică directă, numărare a coloniilor
sau metoda numărului cel mai probabil, aplicabilitatea procedurilor descrise în acest document
trebuie analizată cu atenţie.
2 Referinţe normative
Următoarele documente sunt invocate în text, într-o asemenea manieră încât constituie referinţe
pentru prezentul standard. Pentru referințele datate, se va utiliza doar ediția citată. Pentru cele
nedatate, se va folosi cea mai recenta, împreună cu amendamentele.
ISO 17994:2014, Calitatea apei — Cerinţe pentru compararea recuperării relative a
microorganismelor prin doua metode cantitative
3 Termeni şi definiţii
În acest document, se aplică următorii termeni şi definiţii.
ISO şi IEC păstrează baze de date cu terminologia, care se găsesc la adresele:
— IEC Electropedia: http://www.electropedia.org
— ISO Online browsing platform: http://iso.org/obp
3.1
acurateţe
acurateţe a măsurării
apropierea dintre valoarea măsurată şi cantitatea premăsurată a unei valori măsurate
NOTA 1: : Conceptul 'acurateţe a măsurării' nu este o cantitate şi nu îi este conferită o valoare
cantitativă numerică. Se spune că o măsurătoare este precisă atunci când oferă o eroare la
măsurare mai mică.
NOTA 2: : 'Acurateţe a măsurării' este uneori înţeleasă drept apropiere între valorile cantitative
măsurate, care sunt atribuite valorii măsurate.
3.2 analit
Componentă reprezentată şi reprezentativă în numele unei cantităţi măsurabile
NOTA 1:: In microbiologia apei analitul este în mod ideal definit drept o listă de specii definite
taxonomic. In majoritatea cazurilor, in practică analitul poate fi definit doar prin includerea in grupuri
mai puţin precise decât definiţiile taxonomice.
[SURSA: ISO 17511:2003, 3.2[14]]
3.3
parte pentru analiză
parte pentru test

4
volum de particule in suspensie (probă) inoculat într-o unitate de detectare (placa agar, filtru cu
membrana, tub test, caroiaj pentru microscop)

3.4 eroare sistematica

eroare de măsurare
estimare a unei erori sistematice de măsurare, sau diferenţa sistematică dintre valoarea desemnata
cantitativ şi media rezultatelor măsurărilor
3.5
caracteristici ale categoriei
caracteristică a performanţei metodei, exprimată numeric ca şi frecvenţă relativă pe baza P/A sau
clasificării +/ -
3.6
unitate care formează colonii CFU
particula care formează colonii
CFP
organism (sau grup de organisme) cu abilitatea de a forma colonii în anumite in anumite condiţii
specificate
NOTA 1:: Termenul a fost introdus iniţial pentru a transmite ideea că o colonie poate apărea nu
numai dintr-o singură celulă ci şi dintr-un lanţ solid sau o grupare de celule, un grup de spori, etc. A
fost în mod eronat utilizată pentru prezentarea numărului de colonii observate în raport cu numărul
de entităţi vii plantate în mediul de analiză. Unitatea de creştere, particula viabilă, sunt termeni cu
acelaşi înțeles, însă transmiţând mai bine ideea iniţială, fiind aplicată nu numai pentru metodele de
numărare a coloniilor, ci şi pentru cel mai probabil număr (MPN).
3.7
realizare a metodei in colaborare
metodă sau test de performanţă în laborator prin care mai multe laboratoare se alătură în cadrul unui
experiment planificat şi coordonat de un laborator lider.
NOTA 1:; testele in colaborare sunt în general de două tipuri. Exerciţiile de intercalibrare vizează să
le permită laboratoarelor să-şi compare rezultatele analitice cu cele ale altor laboratoare participante.
NOTA 2:: testele de performanta ale metodei produc estimări ale preciziei (repetabilitate,
reproductibilitate) din datele acumulate atunci când mai multe laboratoare participante studiază
probe identice cu o metodă strict standardizată.
3.8
numărare confirmat a coloniilor
numărare verificata a coloniilor
numărare prezumtivă a coloniilor corectă pentru rezultate fals pozitive
NOTA 1: : Matematic:

Unde
c este numărarea prezumtivă;

5
 p este rata pozitivă adevărată;
n este numărul rezultatelor pozitive prezumtive izolate pentru confirmare;
k este numărul confirmat.
3.9
Numărare coroborata numărare coroborata
Numărare realizată atunci când se utilizează o procedură secundară de confirmare.

3.10
nivel de detecție
concentraţie minimă a organismelor care produc dovezi ale creşterii cu o probabilitate P = 0,95 atunci
când se inoculează într-un mediu de cultură specificat şi se incubează în condiţii definite
NOTA 1:: nivelul teoretic care se conformează acestei definiţii este o medie a trei celule viabile într-un
volum de inoculare.
3.11
set de detectare
combinaţie de plăci sau tuburi pe baza căreia se realizează estimarea cantitativă a concentraţiei
microbiale a probei.
NOTA 1:: Setul de detectare este setul de plăci sau tuburi utilizate pentru estimarea numerică a unei
singure valori.
EXEMPLU plăci paralele cu o suspensie, plăci cu diluţii succesive, sistem MPN cu 3*5 tuburi.
3.12
detector
detector de particule
placă cu o matrice solidă sau o eprubetă cu lichid conţinând un mediu nutrient pentru numărare sau
detectare a particulelor active biologic.

3.13
eficienţă
E
Fracţie de colonii care sunt corect desemnate drept pozitive si negative
NOTA 1:: Matematic

Unde
a este numărul coloniilor tipice confirmate drept organisme vizate (adevărat pozitive);
d este numărul coloniilor atipice confirmate ca nefiind organismul viza (adevărat negative);
n este numărul total de colonii testate pentru confirmare.
3.14
Fals negative

6
rezultat indicat de metoda de testare ca fiind negativ, care s-a dovedit ulterior că conţine organismul
vizat
3.15
fals pozitiv
rezultat indicat de metoda de testare ca fiind pozitiv, care s-a dovedit ulterior că nu conţine
organismul vizat

3.16
germen
Entitate capabilă să aibă activitate biologică (precum respirare sau reproducere într-un mediu cu
nutrienţi)

3.17
limita determinării
cea mai mică concentraţie a analitul per parte pentru analiză unde incertitudinea standard relativă
preconizată este egală cu o valoare specifică

3.18
numărare definită pe bază de metodă
Numărare obţinută prin utilizarea doar a procedurilor metodei descrise
3.19
distribuţie binomiala negativa
distribuţie statistică particulară "supradispersată " a rezultatelor numărării

NOTA 1:; variaţia sa poate fi exprimata drept

NOTA 2:: In acest document, pătratul deviaţiei standard operaţionale relative (u0) este substituit de
inversul exponentului (l/k) al ecuaţiei standard pentru distribuție binomiala negativa.
3.20 valori atipice
Membru al unui set de valori care nu este conform cu alţi membri ai aceluiaşi set
NOTA 1:: o valoare extremă care în mod normal apare la întâmplare în mai puţin de 1 % din testele
repetitive, însă mai frecvent dacă apare o situaţie anormală. Procedurile de testare statistică pot fi
utilizate pentru a cuantifica această probabilitate.

3.21
supra-dispersăre
variaţie în exces a caracterului aleatoriu Poisson
NOTA 1:: detectat calitativ prin indicele Poisson al dispersiei şi măsurat cantitativ prin estimarea
parametrului u0 (deviaţia standard operaționala relativă) a distribuției binomiale negative.
3.22
numărări paralele
numere de particule sau colonii în părți pentru analiză egale, extrase din aceeaşi suspensie

7
3.23
Distribuţie Poisson
Distribuţie pe deplin întâmplătoare a numărului particulelor atunci când se prelevează dintr-o
suspensie perfect amestecata.
NOTA 1:: Probabilitatea P(k) observării a exact k unitari într-o parte pentru testare atunci când media
este egală cu μ este calculată cu formula:

3.24 precizie
Precizie de măsurare
Apropiere între valorile indicate sau valorile cantitative măsurate obţinută prin măsurători repetate pe
acelaşi obiect, sau similar, în condiţii specificate.

NOTA 1:: precizia de măsurare este de obicei exprimata numeric prin măsuri ale impreciziei, precum
deviaţia standard, variaţia, sau coeficientul de variaţie în condiţii specificate ale măsurării.

NOTA 2:: Condiţiile specificate pot fi, de exemplu, condiţii de repetabilitate a măsurării, condiţii de
măsurare a preciziei intermediare, sau condiţii de reproductibilitate a măsurării (vezi ISO 572S-3).
NOTA: 3: precizia de măsurare este utilizate pentru definirea repetabilităţii măsurării, precizia
măsurării intermediare şi reproductibilitatea măsurării.

3.25
Proporţionalitate
Acord între numărătoarea particulelor observate cu volumul (sau diluţia) unei serii de părţi pentru
analiză dintr-o suspensie cu aceeaşi rădăcină.
NOTA 1:: Proporționalitatea este evaluată drept valoarea G2 statistică de probabilitate cu n-1 grade
de libertate.
3.26
Recuperare
Termen general utilizat pentru numărul de particule estimate într-o parte de testare sau probă,
înţelegând că este un număr adevărat (deşi necunoscut) de particule din care 100 % sau mai puţine
sunt „recuperate” prin metodologia utilizată
NOTA 1:: un alt termen similar folosit este productivitate (vezi ISO 11133[12]).
3.27
recuperare relativă
raport al numărului de colonii obţinut de două metode testate pe părţi egale pentru testare din
aceeaşi suspensie

8
3.28
deviaţia standard operaţională relativă
U0

variabilitatea operaţională, exprimată ca şi incertitudine standard relativă, asociată cu paşii tehnici ai

procedurii analitice
NOTA 1:: deviaţia standard operaţională relativă este adesea exprimată în procente.
3.29
variaţia operaţională relativă

Constanta de supra-dispersăre, pătratul deviației standard operaţionale relative

3.30
deviaţia standard relativă

Estimare a deviaţiei standard a populaţiei dintr-o probă de n rezultate divizată de media probei
3.31
variaţie relativă

pătratul deviației standard relative

3.32
repetabilitate
Repetabilitatea măsurării
Precizie a măsurării într-un set de condiţii de repetabilitate a măsurării
3.33
condiţii de repetabilitate
condiţie a măsurării, dintr-un set de condiţii care includ aceeaşi procedură de măsurare, aceiaşi
operatori, acelaşi sistem de măsurare, aceleaşi condiţii de operare şi aceeaşi locaţie, şi măsuratori
repetate pe acelaşi obiect sau unul similar, într-o perioadă scurtă de timp.

3.34
reproductibilitate
Măsurare reproductibilitate
Precizie de măsurare în condiţii de reproductibilitate a măsurării
NOTA 1:: termenii statistici relevanți sunt prezentați in ISO 5725 si ISO 5725-2 .
3.35
condiţii de reproductibilitate
conditie a măsurării, dintr-un set de condiţii, care include locaţii diferite, operatori diferite şi sisteme
de rare, şi măsurări repetate pe acelaşi obiect sau unul similar.

9
3.36
robusteţe
Lipsă de sensibilitate a unei metode analitice faţă de mici schimbări ale procedurii
NOTA 1:: pentru examinarea robusteții este recomandat ca metoda să fie „abuzată” de o manieră
controlată.

3.37
sensibilitate
Fracţie dintr-un număr total de culturi sau colonii pozitive corect desemnate în procesul de inspecţie.
3.38
specificitate
Fracţie dintr-un număr total de culturi sau colonii negative corect desemnate în procesul de inspecţie.
3.39
incertitudine standard
incertitudinea rezultatului unei măsurători exprimată ca şi deviație standard
3.40
incertitudine a numărării
deviaţia standard relativă a rezultatelor numărării repetate a coloniilor sau particulelor de este
aceeaşi placă sau câmp(uri) în condiţiile stipulate (aceeaşi persoană, persoane diferite într-un
laborator)
3.41 verificare
Realizarea unei a doua caracterizări de un laborator diferit pentru confirmarea rezultatelor
caracterizării iniţiale

4 Concepte de bază
4.1 General
În ceea ce priveşte statistica particulelor, numărarea la microscop respectă aceleaşi legi ca şi
numărarea viabilă, însă cu excepţia metodelor pentru microcolonii, nu au aceleaşi probleme
biologice asociate cu creşterea / tulpini diferite, complexe catalogate specific sau alţi agenţi utilizaţi
pentru identificarea ţintei şi totodată nu se schimbă principiile de bază. Pot fi aplicate aceleaşi
principii ca cele utilizate cu metodele coloniilor selective. Pentru o înţelegere mai detaliată a teoriei şi
aplicării formulei utilizate în acest document, baza matematică pentru variaţia întâlnită în toate
aceste tipuri de metodă este descrisă în Anexa A.

4.2 Caracterizare
Caracterizarea unei metode microbiologice se bazează în mare măsură pe examinare şi exprimare a
caracteristicilor de performanţă ale acelei metode.
Caracterizarea este un proces de oferire de informaţii privind evoluţia şi performanţa probabilă a
acelei proceduri sub un set specific de circumstanţe. Acest document nu vizează să ofere linii
directoare pentru fiecare caracteristică de performanţă specificată, ci să ofere îndrumare privind ce
parametri ar trebui determinaţi şi modul cel mai bun de a-i analiza pentru realizarea comparaţiei.
Metodele care au caracteristici de performanţă „slabe” încă pot fi utile.
Caracterizarea este un proces explorator care vizează stabilirea setului probabil de caracteristici de
performanţă ale unei metode noi, modificate sau inadecvat caracterizate. Trebuie să ducă la
specificaţii numerice şi descriptive pentru performanţă şi să includă o descriere detaliată şi fără

10
ambiguităţi a ţintei de interes (precum colonie, eprubetă sau placă pozitivă). Valorile generate nu
trebuie să fie utilizate ca şi limite întrucât se pot schimba, în funcţie de laborator, matrice sau chiar
probe specifice.
Caracterizarea este realizată de un singur laborator în primă fază, pentru a determina performanţa
probabilă a metodei test într-un laborator specific.
Poate fi realizat un studiu al metodei in colaborare ca şi pas suplimentar pentru evaluarea
caracteristicilor de performanţă intre laboratoare.
NOTA: un laborator care dezvoltă o metodă proprie sau o variantă a unui standard existent poate
realiza paşii caracterizării.
Este important ca tehnicienii implicaţi în caracterizarea unei metode să dispună de o experienţă
considerabilă în utilizarea altor metode microbiologice.
Caracteristicile de performanţă acoperite de acest document sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabel 1 — Caracteristici de performanţă descrise în acest document

Parametru Definiţie
Sensibilitate a, b, c Fracţie a numărului total de rezultate pozitive e corect desemnate
la numărătoare
Specificitate a, b, c Fracţie a numărului total de rezultate negative f corect desemnate
la numărătoare
Rata false pozitive a, b Fracţie a rezultatelor pozitive (precum colonii tipice) care ulterior
se dovedesc că nu sunt organismele vizate
Rată false negative a, Fracţie a rezultatelor pozitive negative (precum colonii atipice)
b
care se dovedesc organisme vizate
Selectivitate a, b, c Raport al numărului de colonii vizate faţă de numărul total de
colonii în volumul probă
Eficienţă a, b Fracţie a totalului coloniilor corect desemnate la numărătoare
a
Necesar pentru determinarea caracteristicilor de performanţă
b
Necesar pentru verificarea cu un singur laborator
c specificaţie de îndrumare oferită.
d Metodele pentru reproductibilitate intre laboratoare şi precizie sunt descrise în Anexa F. utilizarea acestor metode
trebuie avută în vedere atunci când performanţa între laboratoare este foarte importantă, de exemplu când sunt
dezvoltate metode pentru conformarea la reglementări.
e
Rezultatele pozitive pot fi numărări de colonii, vase de reacţie pozitive (MPN) sau numărări de celule.
f
Rezultatele negative pot fi colonii atipice, vase de reacţie negative (MPN) sau celule fără caracteristicile specifice
necesare..

11
Parametru Definiție
a
Limite superioare Capătul superior al intervalului de lucru pentru care metoda este
utilă (în speţă numărul maxim de colonii numărabile per placă,
sau alte sisteme de detecţie)

Repetabilitate a, b, c Precizie în condiții de repetabilitate (aceiaşi operatori, aceleaşi

condiţii de operare, perioada scurta...)
Reproductibilitate a Precizie în condiţii de reproductibilitate intralaborator

Robusteţe a Măsură a capacităţii unui test de a rămâne neafectat de

variaţii mici dar deliberate în condiţiile de testare (precum
temperatură)

Recuperare relativă a Eficienţa cu care o metodă recuperează organismele vizate

dintr-o probă atunci când este comparată cu o alta procedură
(această comparaţie trebuie realizată acolo unde există o metodă
alternativă pentru acelaşi organism. Este preferată comparaţia cu
o metodă ISO de referinţă.)
Incertitudine a deviaţia standard relativă a numărării repetate a organismelor
numărării a, b vizate, obţinută prin numărare repetată (plăci, câmpuri, eprubete,
etc.) în condiţiile stipulate (aceeaşi persoană, persoană diferită,
acelaşi laborator, etc.)
a
Necesar pentru determinarea caracteristicilor de performanţă.
b
Necesar pentru verificare la un singur laborator
c
specificaţia de îndrumare oferită.
d
Metode pentru reproductibilitate interlaborator şi precizie sunt descrise în Anexa E. Utilizarea
acestor metode este indicată atunci când performanţa interlaborator este de importanţă
deosebită, de exemplu când sunt dezvoltate metode pentru conformarea la reglementări.
e
rezultatele pozitive pot fi numărări de colonii, vase cu reacţie pozitivă, (MPN) sau numărări ale
celulelor.
f
rezultatele negative pot fi colonii atipice, vase cu reacţie negativă (MPN) sau celule fără
caracteristicile specifice.

Când reproductibilitate interlaborator şi precizia nu formează parte a caracteristicilor de

performanţă descrise în corpul acestui document, în anumite situaţii cunoaşterea acestor
parametri este foarte dezirabilă. Astfel de situaţii includ metode care sunt folosite pentru
conformare la reglementări sau atunci când datele de la o varietate de laboratoare sunt
comparate din oricare dintre motive. De aceea, metodele sugerate pentru determinarea
reproductibilităţii interlaborator sunt descrise în Anexa E.
4.3 Verificare
Verificarea are loc atunci când un laborator începe să implementeze o metodă dezvoltată în altă
locaţie. Verificarea se concentrează asupra obţinerii de dovezi potrivit cărora laboratorul este
capabil să genereze date de performanţă similare cu cele obţinute în caracterizarea primară. Nu
este util să se stabilească limite pentru diferitele componente ale caracterizării metodei întrucât
acestea pot varia în funcţie de multe aspecte ale metodei, tipul de probă şi laboratorul care
realizează procedura.
Datele de verificare trebuie utilizate pentru a stabili tipul şi calitatea datelor care sunt probabil să
fie generate de laborator cu o anumită procedură şi la orice tip de probă.
12
În mod tipic, verificarea utilizează formele selectate şi simplificate ale aceleiaşi proceduri
utilizate în caracterizarea metodei, însă se extind în mod posibil pe o perioadă mai îndelungată.
Probele naturale sunt materialele de test optime iar activitatea trebuie să vizeze doar acele
aspecte ale performanţei metodei care sunt de interes pentru laborator. Cerinţele pentru
verificarea în caz de laborator unic sunt descrise în Clauza 7.
4.4 Compararea metodei
Performanţa metodei constă în multe aspecte. Nu există doar un singur test al comparării
metodei şi nici criterii numerice pentru aceasta. O metodă poate fi superioară în specificitate şi
totodată inferioară în termeni ai recuperării. Toate informaţiile colective despre robusteţe,
precizie şi specificitate obţinute pe perioada testelor de caracterizare pot fi utilizate pentru
compararea metodei. Metodele doar trebuie testate în paralele pentru comparări privind
recuperarea.
Este necesar să se aplice două metode în paralel asupra aceloraşi probe atunci când se
dezvoltă o metodă proprie, şi totodată atunci când sunt colectate informaţii pentru a justifica
utilizarea unei metode alternative.
Studiile de recuperare relativă ale unei metode alternative raportat la o metodă de referinţă,
organizată conform ISO 17994, implică în mod preferabil o gamă extinsă de probă şi
participarea mai multor laboratoare, ceea ce permite extinderea gamei probei într-o regiune
geografică mai extinsă. Însă uneori poate fi necesar să fie verificat rezultatul unei studiu de
recuperare al metodei alternative în condiţii ecologice, sau într-o zonă geografică care nu a fost
reprezentată într-un test în colaborare precedent.
Când un laborator trebuie doar să confirme rezultatul comparării unei metode deja testate şi
oficial acceptate, poate profita de rezultatele testului precedent. Laboratorul trebuie să aibă
acces la raportul comparaţiei. Trebuie să aibă la dispoziţie estimări ale mediei şi deviaţiei
standard a diferenţei relative. Formula (3) prezentată în ISO 17994:2014, 5.4.3 poate fi aplicată
pentru estimarea numărului recomandat de probe. Indiferent de rezultatul calculului, numărul de
probe nu trebuie să fie mai mic de 30.
O metodă care oferă cel mai ridicat nivel de recuperare a organismelor vizate este în mod
evident cea mai bună atunci când este necesară confirmarea pentru utilizare rutinieră. O
metodă care oferă rezultate ale recuperării mai mici, însă care nu necesită confirmare, poate fi
preferabilă. Dacă nivelurile ridicate ale ratelor fals negative sau ratelor fals pozitive din cadrul
caracterizării nu pot fi corectate prin definiţii mai rafinate ale coloniilor vizate sau alte proceduri,
metoda poate fi considerată ca nefiind validă. Comparaţia a două metode microbiologice
trebuie să includă o comparare a caracteristicilor lor de performanţă (în speţă, caracterizare)
împreună cu o comparaţie concretă a recuperării, folosind probe contaminate naturale sau
probe cu conţinut foarte ridicat din microorganismele vizate, aşa cum este specificat în ISO
17994.
4.5 Probe
Un concept popular este acela potrivit căruia caracterizarea şi compararea metodelor trebuie
realizată cu probe naturale, cu concentraţii naturale de microbi. Deşi în mod conceptual este o
idee bună, există şi excepţii în anumite circumstanţe.
Probele artificiale (materiale de referinţă, probe cu concentraţii mari) sunt utilizate în sistemele
interne şi externe de asigurare a calităţii, pentru a asigura eficienţa de bază a laboratoarelor
care participă la exerciţii de caracterizare a metodelor.
Probele cu concentraţii mari pot fi utile şi chiar necesare în procesele de verificare şi oricând
este dificil; de identificat probe naturale cu organisme ţintă. Marja concentraţiei optime pentru
caracterizarea metodelor microbiologice este mai reducă decât marja este lucru proiectată.
Concentraţii mari sunt inutile. Astfel de probe reflectă culturi pure şi nu pun la încercare metoda
sau laboratorul.
Probele cu conţinut bacterian foarte scăzut trebuie studiate pentru motive ce ţin de sănătatea
publică, însă nu sunt adecvate pentru comparaţii ale metodelor sau alte exerciţii de
13
caracterizare pentru motive statistice. Utilizarea lor este inevitabilă în multe situaţii. În particular
acolo unde o metodă încearcă să identifice două tipuri de organisme ţintă pe aceeaşi placă
(precum totali coliformi şi E.coli), numărul scăzut de organisme este în mod obişnuit inevitabil.
Numărul şi varietatea probelor examinate trebuie să fie adecvate. Fără ajutorul statisticii nu
există modalităţi obiective de adoptare a deciziilor. În unele situaţii, prima probă studiată poate
oferi răspunsul potrivit căruia metoda este suficient de bună. De obicei, însă, sunt necesare mai
multe probe. Alegerea unui număr prea redus de probe poate să nu ducă la rezultate
reprezentative.
Indicaţii specifice privind numărul şi tipurile de probe (împreună cu conţinutul microbian) sunt
prezentate în 6.1.
5 Specificaţii: valori indicative
Raportat istoric, standardele au fost de puţin ajutor pentru laboratoarele care încercau să se
asigure că aplică metoda corect şi obţin rezultate valide. Ce pare să lipsească este însăşi
reprezentarea concisă a ceea ce laboratoarele ar trebui să facă pentru a verifica că metoda
funcţionează şi la ei în mod adecvat şi modul de a distinge între performanţa bună şi cea mai
puţin bună.
O clauză a caracteristicilor de performanţă va fi adăugată la toate standardele ISO care vizează
metode de microbiologie a apei şi va face referire la microbii şi grupurile de microbi definiţi.
Formatul pentru metodele numărării coloniilor ar putea include următoarele:
a) Sensibilitate: In general mai mare de 90 %;
b) Specificitate: In general mai mare de 80 %;
c) Selectivitate: Rezultatele nu sunt în general valide dacă selectivitatea este mai mică
de 10 %.
a) Incertitudine a numărării: incertitudinea numărării individuale (o persoană) rămâne
în general sub urel = ± 0,03. incertitudinea numărării intralaborator este mai mică de ure]
= ± 0,05. Incertitudinea numărării intralaborator mai mare de 0,1 este un semn clar al
existenţei unor probleme sau dificultăţi.
b) Repetabilitate (plăci paralele): variaţia este în cadrul Distribuţiei Poisson. Dacă nu,
mărimea supra-dispersării trebuie prezentată.
c) Limită superioară: pentru metode de filtrare prin membrana, o marjă cotată este
între 0 CFU şi 80 CFU, în timp ce pentru metodele de numărare folosind un vas Petri
de 90 mm marja poate fi 0 CFU la 300 CFU. Suprafaţa unui filtru cu membrana de 47
mm este aprox 25 % din cea a unui Vas Petri de 90 mm. Aceste limite superioare
depind de mărimea creşterii mediului (neţintă), numărul diferitelor tipuri de organisme
ţintă (precum total coliformi şi E.coli) şi mărimea coloniei.
.
6 Planuri pentru determinarea caracteristicilor de performanţă ale unei metode
6.1 Consideraţii generale
Deşi este în general mai bine să se utilizeze probe care sunt în mod natural
contaminate cu organismele ţintă, în unele situaţii acestea nu facilitează determinarea
caracteristicilor de performanta vizate. În astfel de situaţii, utilizarea materialelor de
referinţă poate fi adecvată. În mod alternativ, probele pot fi „îmbogăţite” cu un număr
cunoscut de organisme ţintă obţinute din surse comerciale.
Indiferent de procedura utilizată pentru pregătirea probelor, trebuie acordată atenţie
amestecării adecvate pentru a facilita distribuirea aleatorie a organismelor. Numărul
vizat de organisme ţintă din probă depinde de metoda de interes, dar în general este
practică o marjă între 10 şi 60 de unităţi formatoare de colonii per parte pentru test.
14
Numărul reprezintă un compromis între un număr mai mare dezirabil şi numărul de
colonii care este practic pentru o membrană sau placă.
6.2 Determinarea sensibilitate, specificităţii, eficienţei, selectivităţii, ratei fals
pozitive şi ratei fals negative
6.2.1 Tip de probe ce urmează să fie utilizate
Sunt pregătite probe adecvate conţinând 20 - 80 total unităţi formatoare de colonii (10 -
60 CFU organisme vizate) per parte pentru test. Probele sunt apoi examinate prin
procedura studiată. Sunt numărate coloniile tipice şi atipice (în speţă cele care au
apariţia tipică a organismelor vizate şi cele care nu o au). Toate coloniile tipice şi atipice
sunt apoi identificate folosind o procedură adecvată care poate include kituri de
identificare microbiană disponibile comercial, secvenţă ADN sau alte proceduri
specificate.
Metoda de preparare a probei va varia în funcţie de metoda şi tipurile de probe
analizate. Dacă sunt disponibile probe natural contaminate cu un nivel adecvat de
organisme ţintă, acestea ar trebui să fie cele folosite. Însă în multe cazuri nu sunt
disponibile probe contaminate natural (precum pentru metode elaborate pentru apa
potabilă). În astfel de cazuri, materialul pregătit în laborator cu concentraţii mari (folosind
surse adecvate de organisme ţintă, precum râuri sau apă de canalizare) poate fi utilizat
pentru pregătirea de probe. Această abordare are beneficiul de a include organisme
non-ţintă care sunt probabil să fie întâlnite în apa potabilă contaminată în raport similar
cu ceea ce există în „lumea reală”.
Utilizarea materialelor de referinţă trebuie evitată pentru că alegerea tulpinilor utilizate
direct influenţează direct finalitatea experimentului.
6.2.2 Numărul de probe
Vor fi folosite minim 20 de probe din surse diferite. Dacă se utilizează apă potabilă sau de
canalizare pentru pregătirea materialului dopat, aceasta trebuie obţinută din cel puţin trei surse.
Este important să se examineze un număr adecvat de colonii „atipice”, deşi atunci când metoda
este foarte selectivă acestea pot fi dificil de găsit.
6.2.3 Procedură
Probele sunt incubate şi toate coloniile „conformate” în conformitate cu procedurile adecvate
pentru metodă (precum pentru ISO 9308-1). Unde metodele nu au proceduri de confirmare
(precum ISO 9308-2) descrise, rezultatele sunt înregistrate aşa cum este descris în metodă fără
confirmare. Coloniile (sau vasele de reacţie, eprubete, etc.) sunt înregistrate ca pozitive sau
negative.
Când se determină sensibilitatea, specificitatea, rata fals pozitiva şi rata fals negativa, este
necesar să se aplice încă un test de confirmare pentru a confirma sau nega rezultatele generate
de metoda test. Acest test suplimentar este numit confirmare secundară. Astfel de metode pot
include kituri de identificare disponibile comercial, alte metode fenotipice (precum teste pentru
un anumit sistem enzimatic), teste ale compoziţiei chimice (precum MALDI-TOF) sau metode
moleculare. Alegerea metodei va influenţa rezultatul datelor şi trebuie acordată atenţie la
selectarea procedurii întrucât vor defini ţinta. Acolo unde este posibil, procedura utilizată pentru
sprijinirea testului iniţial de confirmare trebuie să se bazeze pe o procedură eficientă taxonomică
sau pe teste care reflectă definirea organismelor vizate aşa cum este descris în standardul
relevant. De exemplu, la caracterizarea unui test pentru Escherichia coli, părțile izolate pot fi
supuse unui test de tip 16S ribosomal RNA secvențial pentru a determina dacă sunt cu adevărat
E.coli.
6.2.4 caracteristici de performanţă specifici categoriei
6.2.4.1 Când este inclus în metodă un pas de confirmare, datele de identificare pot fi divizate
în patru categorii:
a) numărul de colonii tipice confirmate ca fiind organismul vizat in testul primar de
15
 confirmare cu identitatea fiind susţinută de testul de identificare secundar (adevărat
pozitive);
b) numărul de colonii atipice, sau colonii tipice care sunt negative in testul primar de
confirmare identificate ca fiind organismul vizat de testul de identificare secundar (fals
negative);
c) numărul de colonii tipice confirmate ca fiind organismul vizat de testul primar de
confirmare care se dovedesc ulterior ca nu sunt organismul vizat de testul de identificare
secundar (fals pozitive);
d) numărul de colonii atipice sau colonii tipice care sunt negative in testul primar de
confirmare care sunt dovedite de testul de identificare secundar ca nefiind organismul vizat
(adevărat negative).
6.2.4.2 pentru metodele fără procedură de confirmare, datele de identificare pot fi divizate în
patru categorii:
a) numărul de colonii tipice identificate ca fiind organismul vizat de un test extern de
identificare (adevărat pozitive);
b) numărul de colonii atipice identificate ca fiind organismul vizat de un test extern de
identificare (fals negative);
c) numărul de colonii tipice identificate ca nefiind organismul vizat de un test extern de
identificare (fals pozitive);
d) numărul de colonii atipice identificate ca nefiind organismul vizat de un test extern de
identificare (adevărat negative).
6.2.4.3 Frecvenţa acestor categorii poate fi exprimată într-o diagramă 2 x 2:

Număr prezumtiv

+ -

Număr + a b a+b
confirmat
- c d c+d

a+c b+d n
Numărul total de teste este: a + b + c + d=n.
sensibilitatea, specificitatea, selectivitatea, rata fals pozitiva şi rata fals negativa s pentru
organismele vizate poate fi calculată astfel:
Sensibilitate = a / (a + b)
Specificitate = d / (c + d)
Rata fals pozitiva = c / (a + c)
Rata fals negativa = b / (b + d)
Selectivitate = a / n
Un alt parametru, eficienţă (E), care prezintă fracţia coloniilor corect desemnate, poate fi
calculată drept E = (a + d) / n.
Numărătoarea confirmată are legătură cu organisme care au fost vizate de aceeaşi metodă,
fiind descrise în proceduri ca fiind organismele vizate. Acolo unde metoda în sine include o
procedură de confirmare (precum producţia de indol din triptofan pentru E. coli) această
metodă va fi suficientă. Unde procedura nu include un pas de confirmare (precum ISO 9308-2)
atunci pot fi utilizate confirmări alternative (confirmare secundară). Astfel de metode pot include
kituri de identificare disponibile comercial, alte metode fenotipice (precum teste pentru o

16
anumita trăsătură sau sistem enzimatic), teste ale compoziției chimice(precum MALDI-TOF)
sau metode moleculare. Alegerea
Alegerea metodei va influenţa rezultatul datelor şi trebuie acordată atenţie la selectarea
procedurii de confirmare întrucât va defini ţinta.
NOTA: pentru metodele MPN, poate fi aplicată aceeaşi procedura. Termenul "colonii" poate fi
schimbate cu "alicote", “tipic” in “pozitiv” şi “atipic” in “negativ”.

6.2.5 Exemplu
Metoda ISO 9308-1 utilizează un mediu care conţine substraturi cromogenice pentru β -D-
galactosidase şi β -D-glucuronidase. În consecinţă, coloniile coliforme sunt colorate roz spre
roşu, coloniile de E. coli sunt albastru spre violet, iar coloniile care nu sunt vizate nu sunt
colorate. Nu este nevoie de confirmare pentru E. coli când se foloseşte această metodă.
Pentru caracterizarea primară a metodei de recuperare a E. coli, poate fi utilizată
secvenţialitatea 16S rRNA ca şi procedură secundară de confirmare. Pe perioada validării
toate coloniile, albastru/ violet, roz/roşu şi cele incolore vor fi examinate cu secvenţierea 16S
rRNA.
Într-un experiment primar de caracterizare, 300 de colonii albastru/violet sunt
evidenţiate în secvenţiere, şi 285 se dovedesc E. coli. Un total de 600 colonii roz/roşu
sunt evidenţiate în secvenţiere şi 30 se dovedesc E. coli. Un total de 300 de colonii
incolore sunt evidenţiate în secvenţiere şi niciuna nu se dovedeşte a fi E. coli.
Tabelul 2 prezintă rezultatele din cele 20 de probe analizate pentru caracterizarea
primară a metodei prezentate mai sus.
Tabelul 2 — reprezentarea tabelară a rezultatelor pentru determinarea
caracteristicilor categoriei

Probă a b c d
1 15 3 1 42
2 8 0 0 33
3 4 1 0 26
4 15 3 1 50
5 16 1 0 45
6 12 5 0 48
7 6 0 1 38
8 10 1 1 29
9 14 2 0 53
10 18 0 2 51
11 17 2 0 45
12 19 0 1 63
13 13 2 2 40
14 11 3 1 39
15 13 0 0 35
16 25 3 2 33
17 21 1 0 54
18 16 0 1 55
19 15 1 2 40
20 17 2 0 51
Sumă 285 30 15 870
17
În acest scenariu, sunt generate următoarele date:

Numărare definită pe bază de metodă

+ -
Numărare + 285 30 315
coroborata
- 15 870 885
300 900 1200

Numărarea definită pe bază de metodă este rezultatul obţinut atunci când sunt urmate
metodele descrise în procedura originală. Numărare coroborata este cea obţinută după
confirmarea secundară.
Numărul total de teste (n) este 1 200.
Sensibilitatea, specificitatea, selectivitatea, rata fals pozitiva si rata fals negativa pentru
organismele vizate poate fi calculată astfel:

Sensibilitate = a / (a + b), în speţă 285/315 = 90,5 %

Specificitate = d/(c + d), în speţă 870/885 = 98,3 %
Rata fals pozitiva = c/(a + c), în speţă 15/300 = 5,0 %
Rata fals negativa = b/(b + d), în speţă 30/900 = 3,3 %
Selectivitate = a / n, în speţă 285/1 200 = 23,8 %
Un alt parametru, eficienţa (E), care prezintă fracţia coloniilor corect desenate, poate fi calculată
drept E = (a + d) / n, în speţă 1155/1 200 = 96,3 %.

6.3 Determinarea limitei superioare şi analizarea limitei inferioare de detecţie

6.3.1 Marja de lucru
Marja de lucru a unei metode este adesea specificată în descrierea originală a procedurii sau
este definită de producători în cazul testelor disponibile în comerţ.
Însă cifrele nu sunt întotdeauna precise şi pot varia în cazul a tipuri diferite de probe.
Pentru metode bazate pe MPN, marja de lucru va fi determinată de mărimea probei utilizate şi
de numărul de reactoare utilizate. Limita superioară practică a fost depăşită atunci când toate
eprubetele tuturor diluţiilor sunt găsite drept pozitive.
6.3.2 Limita superioară raportată la linearitate
În cazul metodelor de numărare a coloniilor, precizia se îmbunătăţeşte teoretic odată cu numărul
coloniilor vizate observate în setul de detecţie. Limitele superioare sunt definite de cerinţele de
spaţiu şi de interacţiunile aferente ale coloniilor de microbi.
În practică, metodele de numărare a coloniilor au o limită superioară per unitate de detectare
care variază în funcţie de situaţia de testare. Detectorul pentru numărarea coloniilor (placa agar,
filtru cu membrana) devine „înfundat” sau saturat din mai multe motive, numărul coloniilor vizate
fiind doar unul dintre acestea.
Fiecare metodă are o limită superioară de încredere. Nu este un număr clar fixat, ci o regiune de
colonii unde numărarea pe placă devine prea nesigură pentru a crea premisele unei enumerări
valide.

18
Un aranjament experimental, bazat pe serii bine gradate de diluţii sau volume, cu refacerea
plăcilor şi numărării, oferă datele necesare pentru determinarea limitei superioare de lucru.
O probă lichidă atent amestecată este prediluată până la o densitate care oferă numărul
preconizat de colonii per placă, care uneori depăşeşte limita superioară asumată a performanţei
detectorului. O serie de şase sau şapte alte diluţii cu paşi de diluţie 1:2 este continuată din
suspensia iniţială. Trei plăci paralele sunt însămânţate din fiecare diluţie. Plăcile din diluţii cu o
medie de peste 20 de colonii per placă sunt roşii.
Datele sunt analizate în ceea ce priveşte proporţionalitatea şi supra-dispersărea plăcilor paralele
plecând de la premisa unui caracter aleatoriu perfect în fiecare fază ca şi bază a evaluării.
O singură valoare a testului G2 este considerată ca având utilitate limitată. Realizarea de teste
similare de proporţionalitate pe probe diferite ajută la determinarea celui mai mare rezultat al
coloniilor acolo unde proporționalitatea nu este suficientă.
6.3.3 Tipul şi numărul de probe ce urmează să fie utilizate
Marja de lucru a unei metode poate fi determinată de folosirea de probe natural contaminate,
culturi pure sau probe dopate cu material contaminat conţinând organismul vizat (precum apă
de canalizare sau organisme enterice). Cel mai practic este să se folosească o cultură pură.
Este necesară examinarea a minim 20 de probe.
NOTA 1: Determinarea marjei de lucru poate fi complicată pentru metodele în care sunt
două organisme ţintă pe aceeaşi placă, de exemplu pentru detectarea simultană de
coliformi totali şi E.coli pe un singur filtru cu membrană. În astfel de cazuri, marja de
lucru poate fi diferită pentru coli total si E.coli dacă E.coli sunt prezenţi în probă
împreună cu alţi coli totali. La determinarea marjei de lucru pentru aceste tipuri de
metode, marja de lucru poate fi raportată ca şi numărul total de colonii vizate prezente,
întrucât raportul dintre E.coli şi alţi coliformi va varia de la probă la proba.
NOTA 2: Un alt factor care creează confuzie la determinarea marjei de lucru este
reprezentat de selectivitatea procedurii. De exemplu, o metodă bazată pe filtrarea prin
membrană pentru detectarea colilor totali şi/sau E.coli care are o selectivitate scăzută
poate permite multor altor organisme care nu sunt vizate să se dezvolte. Creşterea
acestor organisme poate afecta sau inhiba creşterea organismelor vizate. In astfel de
cazuri, marja de lucru poate fi prezentată în termeni ai numărului total de colonii vizate şi
nevizate pe membrană, întrucât marja de lucru este semnificativ afectată de creşterea si
organismelor care nu sunt vizate.
6.3.4 Exemplu
6.3.4.1 Preparare
O proba naturala a fost pre-diluată până la un nivel adecvat şi o serie de diluţii cu şase
paşi succesivi 1:2 a fost preparată.
Au fost realizate trei plăci paralele din fiecare diluţie folosind tehnica împrăștierii la
suprafaţă. Coloniile au fost numărate după incubare iar rezultatele sunt prezentate în
Tabelul 3.

19
 Tabelul 3 — Prezentarea rezultatelor într-un experiment de linearitate

Diluţie Numărări paralele Sumă Medie Volum Si/Ri

_ relativ
Si
X
Ri
-1
2 121 204 162 487 162,3 32 15,2
2-2 109 128 148 385 128,3 16 24,1
2-3 111 114 97 322 107,3 8 40,3
2-4 56 60 68 184 61,3 4 46,0
2-5 36 29 24 89 29,7 2 44,5
2-6 11 13 17 41 13,7 1 41,0
Total: 1508 63 -
NOTA: formula utilizată pentru calcule este prezentata in Anexa C, Formula (C.1)
6.3.4.2 Test de proporţionalitate generală
Acordul dintre sumele numărărilor paralele ale coloniilor şi volumele relative respective
32/16/8/4/2/1 este calculat folosind suma numărărilor paralele şi valoarea G2 generala
(Formula (C.1)) după cum urmează:
G52 = 2 [487ln(487/32) + 385ln(385/16) + 322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) +
41ln(41/l) -1 508ln(1 508/63)] = 292,526.
Statistica testului are 6 - 1 = 5 grade de libertate. The Valoarea indicelui este comparata
cu distribuţia x2 cu 5 grade de libertate, care corespunde valorii de 11,070 pentru 5 % si
15,086 pentru 1 %.
Valoarea calculată depăşeşte valoarea teoretică pentru 1 % (15,086) ceea ce însemnă
că linearitatea generală a rezultatelor este scăzută.

6.3.4.3 Interpretarea datelor şi alte măsuri

Sistemul detector nu a fost linear în această probă în marja de numărare a coloniei de la 41/3 =
14 la 487/3 = 162 colonii per placa. Din inspectarea numărului per volum relativ (Si/Ri), poate fi
observat că numerele mari ale coloniilor deviază cel mai mult de la aşteptări. În cele patru diluţii
de la 2-3 la 2-6 numărul per volum relativ (Si/Ri) a fost aproximativ constant, aproximativ 43 în
medie. O schimbare bruscă a apărut între diluţiile 2-3 şi 2-2.
Detectorul a devenit nefuncţional chiar înainte de 160 de colonii per placă, întrucât au crescut
mai puţine colonii decât se preconiza pentru diluţiile 2 -2 şi 2-1. Raportul 2:1 între diluţiile
succesive nu este vizibil în numărarea coloniilor la concentraţiile mai mari, ceea ce indică faptul
că la concentraţii ridicate rezultatele nu sunt lineare.
Aceeaşi analiză a proporţionalităţii poate fi repetată fără rezultatele primei diluţii. Acordul dintre
sumele pentru cele cinci diluţii este calculat astfel:
G42 = 2 [385ln(385/16) + 322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) + 41ln(41/l) -
1021ln(l 021/31)] = 81,933.
Cu patru grade de libertate valorile de referinţă pentru statistica testului sunt 9,488 pentru 5 % şi
13,277 pentru 1 %. Proporţionalitatea a fost în continuare în afara controlului statistic când
media cea mai ridicată a fost 128.
Următorul pas este testul de proporţionalitate pentru patru diluţii:
G32 = 2 [322ln(322/8) + 184ln(184/4) + 89ln(89/2) + 41ln(41/l) - 636ln(636/15)] = 2,328.
Valorile de referinţă pentru trei grade de libertate 7,815 pentru 5 % şi 11,345 pentru 1 % sunt
mult mai mari decât valoarea observată de 2,328. Nu rămân semne de deviaţie sistematică din
testul de proporţionalitate în cele patru diluţii care încep cu un rezultat mediu de 107.
20
Poate fi concluzionat că linearitatea este vizibilă doar când proba devine mai diluată. Punctul la
care linearitatea nu este percepută, imediat după ce numărul coloniilor per placa devine mai
mare decât 100, determină limita superioară a metodei.
Un plan similar ar trebui repetat cu cel puţin 20 de probe pentru determinarea marjei de lucru.
Abordarea este aplicabilă doar cu metodele pentru colonii.
6.3.5 Limita inferioară de detecţie
Limita inferioară de detecţie nu poate fi determinată prin experimentare şi ţine în mare parte de
definire şi volumul probei analizate. O explicaţie detaliată este prezentată în Anexa B.
6.4 Evaluarea preciziei: determinarea repetabilităţii şi reproductibilităţii
6.4.1 General
Seria ISO 5725 a fost dezvoltată ca şi document de îndrumare pentru caracterizarea variabilităţii
metodelor standard de măsurare. Două măsurări ale variabilităţii (sau preciziei), repetabilităţii şi
reproductibilităţii sunt acceptate în mult discipline ca şi reprezentative pentru datele întâlnite în
procesele de măsurare.
Caracterizarea unei noi metode ar trebui să ofere valorile iniţiale ale estimărilor preciziei. Alte
laboratoare
Alte laboratoare au nevoie de aceste informaţii pentru verificarea metodei iar ulterior pentru
stabilirea sistemelor de control analitic al calităţii.
Aplicate la metodele microbiologice pentru apă, ISO 5725-l, ISO 5725-2 şi ISO 5725-3 necesită
unele adaptări deoarece principiile generale se aplică datelor continue şi nu datelor discrete.
Principalele niveluri de precizie sunt în general evaluate în două condiţii:
— condiţii de repetabilitate care se referă la variabilitate între măsurători pe probe identice în
condiţii identice. În cazuri ideale, aceste condiţii de analiză se preconizează să urmeze o
distribuţie Poisson. In practică, nu se întâmplă mereu acest lucru. Cazurile de
supradimensionare pot fi detectate prin experimente între numărări paralele (vezi Anexa D şi
6.4.2.)
— condiţiile de reproductibilitate care se referă la variabilitatea între măsuri făcute pe materiale
identice în condiţii diferite, de către laboratoare diferite, urmând aceeaşi metodă de măsurare.
La nivel teoretic, reproductibilitatea include efecte cauzate de diferenţe între instrumente,
reactivi, operatori, laboratoare şi condiţii de mediu. Evaluarea acestui nivel de precizie pentru
metode microbiologice conduce la o variaţie operaţională relativă care include factori de
variabilitate maximă pentru incertitudine (vezi Anexa F).
O a treia măsură a preciziei unei metode poate fi evaluată într-un laborator cu planificare
experimentală specifică (descompunere a erorii sistematice în componente elementare precum
operator, echipament, efecte materiale, …). Este cunoscut drept reproductibilitate intralaborator
sau precizie intermediară (vezi 6.4.3. şi Anexa D) pentru mai multe detalii.
6.4.2 Repetabilitate
6.4.2.1 Proiectare
Proiectarea pentru determinarea repetabilităţii unei metode constă în 10 dubluri ale aceleiaşi
probe, care sunt analizate în condiţii de repetabilitate, în speţă de acelaşi tehnician, în aceeaşi
zi, în aproximativ acelaşi timp şi cu toate probele incubate în acelaşi incubator.
A minimum de trei seturi de date de repetabilitate trebuie să fie pregătite folosind diferite surse
de organisme ţintă. Probele naturale trebuie pregătite folosind diferite surse de organisme ţintă.
Sunt preferate probele naturale.

21
6.4.2.2 Exemplu: Tabel cu rezultate
Tabelul 4 prezintă 3 serii de 10 măsurări obţinute in condiţii de repetabilitate cu metoda plăcii.
Tabelul 4 — Tabele cu rezultate obţinute în 3 experimente de repetabilitate
Proba Măsurări repetate (plăci)

1 63 65 77 59 69 61 55 65 33 90
2 47 60 40 57 24 39 57 52 35 54
3 21 16 20 24 21 34 23 26 18 14
NOTA: formula utilizată pentru următoarele calcule este prezentată în Anexa A, Formula (A.8) şi Anexa D, Formula
(D.1) şi (D.2)

6.4.2.3 Exemplu: Detectarea supra-dispersării prin aplicarea indicelui Poisson de

dispersie
Pentru proba 1, valoarea observată a x2r-1 = [10 x (632+652+772+...+332+902) / (63+65+77+...
+33+90)] -(63+65+77+...+33+90) = 30,582.
Pentru prima serie:

Medie aritmetică ( ) = 63,7

2
Variaţie (S ) = 216,456
Variaţia operaţională relativă (u20) = (216,456 - 63,7) / 63,72 = 0,038.
In Tabelul 5 sunt prezentate valorile calculate ale variaţie operaţionale relative pentru
cele trei probe analizate.

Probă Medie aritmetică Variaţie Valoare Variaţia operaţională

observată a relativă
S2
x2r-1 u20
1 63,7 216,456 30,582 0,038
2 46,5 136,278 26,376 0,042
3 21,7 31.789 13,184 0,021

Potrivit distribuţiei Chi-pătrat, valoarea critică de probabilitate 0,05 pentru (10-1) grade
de libertate este: 16,919.
Valoarea observată a x2r-1 este mai mare decât valoare critică de probabilitate 0,05
pentru probele 1 şi 2, motiv pentru care este detectată o supra-dispersăre semnificativă
în seriile de măsurători repetate. Variația operaționala relativă u20 oferă un ordin de
mărime al variabilităţii operaţionale pentru fiecare serie de măsurători repetate.
Pentru proba 3, valoarea observată a x2r-1 este mai mică decât valoarea probabilităţii
critice de 0,05. Variabilitatea observată între numărări paralele este conformă cu
Distribuţia Poisson. Chiar dacă nu este semnificativă statistic, variaţia operațională
relativă calculată poate fi păstrată pentru 3 probe pentru o evaluare globală.
Variaţia operaţională relativă medie pentru cele 3 probe este egală cu 0,034. Expresia
finală a deviaţiei standard relative a repetabilităţii în % este rădăcina pătrată a variaţiei
operaţionale relative medii (18,4 %). Corespunde cu performanţa metodei pe materialul
de test in condiţii de repetabilitate.

22
6.4.3 Reproductibilitate intralaborator
6.4.3.1 Proiectare
Reproductibilitatea intralaborator este cunoscută şi drept reproductibilitate intermediară
[sau precizie intermediară]. Este evaluată prin realizarea seturilor de dubluri în condiţii
cât mai diferit posibil într-un singur laborator (precum tehnicieni diferiţi, incubatoare
diferite şi diferite loturi de medii...).
Poate fi utilizată metoda descrisă în ISO 29201. Întregul proces analitic este duplicat
utilizând variaţia maximă a parametrilor de laborator. Probele naturale vor fi studiate
oricând este posibil. Se recomandă cel puţin 30 de probe.
6.4.3.2 Exemplu de numărare de colonii
Tabelul 6 prezintă rezultatele a 10 probe analizate în 2 duplicate x1 şi x2 realizate în
condiţii cât mai diferit posibil în laborator (condiţii de reproductibilitate intralaborator).

Tabelul 6 — Numărul coloniilor pentru zece probe analizate în duplicat

Probă Duplicat Medie aritmetică Variaţie Variaţia
operaţională
x1 x2 S2
relativă
1 34 23 28,5 60,5 0,039
2 17 15 16 2 -0,055
3 11 27 19 128 0,302
4 40 21 30,5 180,5 0,161
5 42 25 33,5 144,5 0,099
6 43 38 40,5 12,5 -0,017
7 25 12 18,5 84,5 0,193
8 34 28 31 18 -0,014
9 58 39 48,5 180,5 0,056
10 37 48 42,5 60,5 0,010
NOTA 1: formula utilizată pentru calculul din Tabelul 6 este prezentată în Anexa D ,
Formula (D.2)

NOTA 2: La nivel teoretic, variaţia nu poate fi negativă. Însă când estimarea variaţiei
este obţinută prin scădere iar variaţiile experimentale se bazează pe numere mici de
duplicate, astfel de situaţii pot totuşi apărea.

Variaţia operaţională relativă medie din setul de 10 perechi este 0,077. Rădăcina pătrată
a variaţiei operaţionale relative medii (27,8 %) corespunde performanţei metodei pe
materialul test in condiţii de reproductibilitate intralaborator.
6.4.3.3 Exemplu pentru sistemele MPN
Au fost analizate 10 probe în duplicat utilizând metoda MPN. Pentru fiecare probă, au
fost realizate două măsurări în condiţii intralaborator, pentru a analiza variabilitatea
maximă a condiţiilor analitice din cadrul laboratorului. Datele sunt prezentate în Tabelul
7.

23
 Tabel 7 — Rezultate MPN pentru 10 probe analizate in duplicat
Proba Măsurătoare Limita Limita Limita Limita Suprapunere
inferioară superioar inferioară superioar a intervalelor
de ă de de ă de de încredere
încredere încredere încredere încredere in condiţii de
T0,1 reproductibili
T1,1 T0,2 T1,2
tate
intralaborator

M1 M2

1 600,1 176,1 419,3 858,9 97,2 319,1 Nu

2 2 086,6 1 148,4 1 560,4 2 790,4 850,7 1 550,3 Nu
3 1 885,3 1 362,8 1 413,0 2 515,5 1 017,3 1 825,5 Da
4 76,8 110,0 31,9 184,9 52,5 230,6 Da
5 1 672,6 2 094,8 1 254,0 2 230,9 1 566,3 2 801,6 Da
6 799,8 311,8 576,6 1 109,5 196,4 494,9 Nu
7 196,7 143,8 111,8 346,3 74,9 276,2 Da
8 1 202,0 1316,6 892,5 1 618,7 981,6 1 765,8 Da
9 7 100,7 7 682,9 4 488,8 11 232,5 4 845,4 12 181,9 Da
10 7 682,9 3 421,3 4 845,4 12 181,9 2 450,4 4 777,0 Nu

Tabelul 8 prezintă variaţiile operaţionale relative pentru rezultate MPN.

Tabelul 8 — Calculul variaţiei operaţionale relative pentru rezultate MPN

Proba Reproductibil Variabilitate Variabilitate Variabilitate Variaţia
itatea intrinsecă intrinsecă a intrinsecă operaţională
intralaborator pentru pentru a doua medie relativă
prima replică
u2R u2d u20
replică u2 d2
u2d1
1 0,752 0,034 0,092 0,063 0,689
2 0,178 0,022 0,023 0,023 0,156
3 0,053 0,022 0,022 0,022 0,031
4 0,065 0,201 0,143 0,172 -0,107
5 0,025 0,022 0,022 0,022 0,004
6 0,444 0,028 0,056 0,042 0,402
7 0,049 0,083 0,111 0,097 -0,048
8 0,004 0,023 0,022 0,023 -0,019
9 0,003 0,055 0,055 0,055 -0,052
10 0,327 0,055 0,029 0,042 0,285
NOTA: Formulele utilizate pentru calculele din Tabelul 8 sunt prezentată în Anexa D, Formula
(D.4), (D.5), (D.6), (D.7)

24
Variaţia operaţională relativă medie calculată din setul de 10 perechi este 0,134.
Rădăcina sa pătrată (36,6 %) este variabilitatea metodei observată în condiţii de
reproductibilitate intralaborator.
6.5 Robusteţe
6.5.1 General
Robusteţea însemnă toleranţa faţa de mici modificări la nivelul procedurii sau faţă de variaţii
inevitabile în condiţiile mediului de laborator.
Determinarea robusteţii variază în funcţie de procedura studiată. Sunt necesare studii
specifice.
Scopul unor astfel de studii este de a specifica limitele în care o metodă poate fi preconizată să
fie adecvată pentru scopul vizat. Aspectele legate de robusteţe pot duce la limitări în ceea ce
priveşte mărimea şi condiţiile utilizării metodei.

6.5.2 Proiectare experimentală pentru efecte induse de timp şi temperatură

Pentru majoritatea metodelor microbiologice, timpul şi temperatura de incubare sunt
importante. Interacţiunea dintre membrane şi mediu şi/sau mediu şi vas de reacţie pot fi şi ele
importante
Pentru kiturile de testare pregătite comercial, durata de viaţă a unui produs poate fi un
parametru de interes.
Când se studiază robusteţea unei metode, probele contaminate natural sau dopate trebuie
analizate la valorile extreme ale parametrului studiat. Aceleaşi plăci pot fi interpretate în mod
repetat, reintroducând plăcile în incubator pentru incubare suplimentară după fiecare citire.
De exemplu, dacă procedura unei metode stipulează o marjă de temperatură de (35 ± 1) °C
atunci proba trebuie analizată şi la 34 °C şi la 36 °C. Dacă perioada de incubare este de 18 h
la 22 h atunci proba trebuie citită in intervalul 18 h - 22 h. ar putea fi preferabil să se producă
date privind robusteţea în forma unei matrice folosind (de exemplu) temperaturile minime şi
maxime de incubare pentru durata minimă şi maximă de incubare.
Un alt plan este de a pregăti o serie de plăci paralele, care apoi sunt introduse în părţi diferite
ale incubatorului şi scoase pe rând la diferite perioade. Al doilea aspect relevant de referă la
efectele spaţiului de incubare (vezi ISO 29201[15]). Dacă dezvoltatorul unei metode pretinde că
metoda este aplicabilă pentru o gamă considerabilă de temperaturi, sunt necesare experimente
implicând mai multe incubatoare stabilite la temperaturi diferite.
Trebuie colectate cel puţin 30 de date pentru fiecare parametru.
Datele trebuie culese folosind minim trei surse de organisme ţintă, fie culturi de referinţă sau
material dopat pregătit de laborator.
Metodele grafice şi testele statistice standard, precum testele parametrice şi non-parametrice
ale interfeţei pot fi utilizate pentru analiza datelor, indiferent dacă acestea sunt generate prin
numărare microscopică directă, MPN sau numărare a coloniilor
6.6 Recuperare relativă
6.6.1 General
Gradul de adevăr se referă la apropierea rezultatelor observate de valoarea adevărată, însă nu
există grad absolut de adevăr al rezultatului unui test microbiologic.
Cel mai bun lucru care se poate face este să se consimtă asupra unei valori adevărate
consensuale. Aceasta poate fi rezultatul determinat de o altă metodă, media unui material de
referinţă certificat oferit de producător sau media observaţiilor în diferite laboratoare, în lucrări
de asigurare a calităţii.
Recuperarea relativă este cel mai bun demers pentru determinarea cantitativă a erorii
sistematice (deviaţiei de la valoarea adevărată).
25
Când filtrele cu membrana sunt parte a metodei, acestea trebuie utilizate în comparaţii privind
recuperarea. Însă filtrele cu membrana pot crea o parte a erorii sistematice şi astfel afecta
recuperarea relativă. Pentru informaţii privind comparaţii referitoare la recuperare vezi ISO 1113
3 şi ISO 7704. Mai mult, interacţiunea dintre filtrele cu membrana şi mediul nutrient este de
interes şi poate contribui semnificativ la eroarea sistematică.
6.6.2 Determinarea recuperării relative
Recuperarea reală prin intermediul unei metode poate fi abordată cu teste de cultură sau probe
sterilizate dopate folosind metode neselective ca şi referinţă (vezi şi ISO 11133). Există
materiale de referinţă în acest sens. Aceste aproximări depind însă de eficienţa de recuperare a
metodelor utilizate în testarea materialului de referinţă sau în determinarea valorii de referinţă.
Eficienţa recuperării diferitelor metode microbiologice variază considerabil şi poate fi semnificativ
afectată de efectele de matrice. Este astfel prudent să se determine recuperarea relativă a
metodelor cu diferitele matrice testate.
Pentru determinarea recuperării relative, pot fi utilizate probe natural contaminate, probe dopate
sau culturi pure. Pentru metodele vizând apa potabilă, la alegerea probei care urmează să fie
utilizată pentru astfel de studii valoarea organismelor ţintă adăugate probei dopate trebuie să
depăşească nivelurile care apar în mod tipi cu cel puţin un ordin de mărime. Pentru celelalte
matrice, precum apa pentru activităţi recreative, biosolide şi apă uzată, numărul organismelor
ţintă întâlnite în mod obişnuit este în general adecvat, însă proba poate necesita diluţie.
Trebuie utilizate cel puţin trei organisme diferite pentru experimentele cu dopare, urmând ca
minim o treime din date să fie colectate.
Pentru a fi cât mai realişti, recuperarea relativă trebuie apoi studiată folosind probe natural
contaminate mai degrabă decât materiale de test artificiale. Alternative, pot fi utilizate probe
dopate cu materiale contaminate natural.
Pentru evitarea interpretării subiective, comparaţia trebuie să se bazeze pe numărări
confirmate generate prin confirmarea tuturor coloniilor.
Procedura descrisă în ISO 17994 este recomandată pentru determinarea performanţei
recuperării relative a metodei. (atât numărare colonii cât şi MPN).

6.7. Incertitudine a numărării

6.7.1 General
Nivelul de încredere al numărării este studiat prin numărări repetate ale coloniilor din
aceeaşi placă într-un timp scurt. Observaţiile privind incertitudinea numărării vor oferi
prima impresie a problemelor potenţiale legate de utilizarea pe scară largă a metodei.
Potrivit ISO 29201, repetabilitatea si reproductibilitatea intralaborator a numărării va fi
evaluată, în speţă estimări numerice individuale sau colective ale incertitudinii numărării
exprimate ca deviaţie standard relativă.
Incertitudinea numărării serveşte ca şi valoare de bază atunci când se estimează alte
caracteristici ale robusteţei, precum sensibilitatea în timp.
Pentru metode bazate pe MPN, incertitudinea intralaborator a citirii de către diferiţi
operatori poate fi studiată şi aşa cum este prezentat în ISO 2920. Rezultatele aceluiaşi
sistem MPN pot fi citite de diferiţi operatori. Calculele incertitudinii sunt realizate folosind
valorile MPN obţinute de fiecare operator.

26
6.7.2 Planificare experimentală pentru evaluarea incertitudinii numărării coloniilor
— se citeşte aceeaşi placă în mod repetat în condiţii uniforme, în speţă intr-un interval
de timp mai scurt decât toleranţa admisă pentru metodă. În practică, aceasta înseamnă
un interval maxim de o oră.
— Plăcile pentru numărare repetată trebuie să fie selectate aleatoriu, ignorând plăcile
cu mai puţin de 20 de colonii şi fără alegerea celor neobişnuite. Plăcile alese trebuie să
reprezinte întreaga marjă de lucru a metodei.
— Pentru o estimare de încredere, trebuie să fie disponibile cel puţin 30 de plăci.

6.7.3 Exemplu de incertitudine individuală (sau personală) a numărării coloniilor

Un tehnician familiarizat cu metoda microbiologică trebuie să citească de două ori
diferite plăci, într-un interval scurt (precum mai puțin de o ora). Numărările duplicate
indicate prin x1 şi x2 sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9 — Incertitudine a numărării coloniilor

Placa x1 x2 x1- x2 x1+x2 u2rel,L

1 129 122 7 251 0,002
2 417 377 40 794 0,005
3 73 80 -7 153 0,004
4 49 52 -3 101 0,002
5 86 81 5 167 0,002
6 37 39 -2 76 0,001
7 112 115 -3 227 0,000
8 204 214 -10 418 0,001
9 66 71 -5 137 0,003
10 306 299 7 605 0,000
Suma 1479 1450 0,020
NOTA: The formula utilizata pentru calculele din Tabelul 9 este prezentată în Anexa E,
Formula (E.2),

Estimarea medie a variaţiei relative personale a numărării este valoarea medie u2rel,L = 0,020/10
=0,002. Rădăcina sa pătrată 0,045 indică astfel un standard al incertitudinii relative de 4,5 % al
repetabilităţii numărării de către această persoană.
In acest exemplu cu date reale dedicat numărării coloniilor totale pe medii neselective, deviaţia
standard relativă a repetabilităţii a fost în mare măsură mai mare decât „ideală” ( u2rel,L < 0,02)
însă rămâne sub limita de 0,1.
Dacă valoarea este ridicată (mai mare de 0,1), poate fi util să fie revizuit tabelul pentru a
examina valorile individuale u2rel,L în vederea identificării motivelor. O valoare individuală
accidental mare poate fi responsabilă sau poate exista o tendinţă la nivelul numărului mediu al
coloniilor. Acestea sunt cel mai bine ilustrate grafic prin desenarea valorile u2rel,L raportat la
numărul coloniilor.
6.7.4 Exemplu de incertitudine a numărării intralaborator a coloniilor
Cinci tehnicieni au participat la o sesiune de numărare a coloniilor. Plăci agar standard au fost
alese din determinările disponibile şi au fost citite de fiecare participant. Plăcile cu mai puţin de
20 de colonii au fost omise. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 10.
NOTA: şase plăci sunt mult prea puţine pentru o estimare de încredere, însă ilustrează calculele.
27
Media (m) şi deviaţia standard (s) ale fiecărei plăci sunt prima dată calculate. Din ele sunt
obţinute valorile pentru u2rel,L = s/m (penultima coloană).
Tabelul 10 — Incertitudinea numărării intralaborator

Placa Al A2 Bl B2 B3 m S
urel,L u2rel,L
1 33 26 33 34 33 31,8 3,271 0,103 0,011
2 160 156 166 176 174 166,4 8,649 0,052 0,003
3 142 128 142 146 139 139,4 6,841 0,049 0,002
4 78 97 81 81 83 84,0 7,483 0,089 0,008
5 89 94 81 94 92 90,0 5,431 0,060 0,004
6 38 44 38 42 40 40,4 2,608 0,065 0,004
Sum 540 545 541 573 561 0,031
NOTA formulele utilizata pentru calculele din Tabelul 10 sunt prezentate în Anexa E, Formulele(E.1) şi (E.3)
Suma u2rel,L (suma variaţiilor relative) este 0,031 iar media este 0,005. rădăcina sa pătrata 0,071
este media incertitudinii relative a numărării intralaborator cu această metodă şi acest grup de
operatori (7,1 %).
6.7.5 Exemplu de incertitudine intralaborator privind citirea MPN
Rezultatele a 30 de probe diferite au fost citite de doi operatori diferiţi. Rezultatele primelor cinci
probe sunt prezentate în Tabelul 11:
Tabelul 11 — Incertitudine intralaborator privind citirea MPN

Proba Analist 1 Analist 2 Variaţie relativă

1 1 409,3 1 273,8 0,005
2 3 074,5 2 905,3 0,002
3 4 984,2 5 363,5 0,003
4 1 114,0 1 047,1 0,002
5 651,1 778,3 0,016
medie 0,006
NOTA: formula utilizată pentru calculele variaţiei relative din Tabelul 11 este
prezentată în Anexa E, Formula (E.1) utilizată la pătrat.

Rădăcina pătrată a mediei variaţiei relative este valoarea medie a incertitudinii relative a citirii
MPN de către diferiţi operatori. În exemplul numeric, valoarea sa este 0,077 (7,7 %).

28
7 Planificarea verificării de un singur laborator a metodei
7.1 Consideraţii generale
Această secţiune descrie procedurile care urmează să fie derulate pentru a verifica dacă metoda
funcţionează adecvat într-un laborator dat. Caracteristicile studiate (vezi Tabelul 12) nu sunt la
fel de extinse ca cele utilizate pentru determinarea iniţială a caracteristicilor de performanţă, iar
numărul de date necesare este în general mai mic.

Tabelul 12 — Caracteristici minime de performanţă necesare pentru verificare

într-un singur laborator

Parametru Definiție
Sensibilitate Fracţie a numărului total de rezultate pozitive a corect desemnate la
numărătoare
Specificitate Fracţie a numărului total de rezultate negative b corect desemnate
la numărătoare
Rata fals pozitiva Fracţie a rezultatelor pozitive (precum colonii tipice) care se
demonstrează ulterior că se datorează organismelor care nu sunt
vizate

Rata fals negativa Fracţie a rezultatelor negative (precum colonii atipice) care se
dovedesc a fi organismele vizate
Selectivitate Raportul dintre numărul de colonii vizate şi numărul total de
colonii în volumul probei
Eficienta Fracţie a coloniilor totale corect desemnate la numărătoare

Repetabilitate Precizie în condiţii de repetabilitate (aceiaşi operatori, aceleaşi

condiţii de operare, perioada scurta...)

Incertitudine a Deviaţia standard relativă of numărărilor duplicate a ţintei

numărării obţinute prin numărare repetată (plăci, câmpuri de observare,
eprubete, etc.) în condiţiile stipulate (aceeaşi persoană,
persoană diferită, acelaşi laborator etc.)

a Pozitive pot fi rezultatul numărării coloniilor, vase cu reacţie pozitivă (MPN) or

numărarea celulelor.
b Negative pot fi coloniile atipice, vasele de reacţie negative (MPN) sau celule fără
caracteristicile specifice necesare.

7.2 Calculul sensibilităţii, specificităţii, eficientei, selectivităţii, ratei fals pozitive şi

ratei fals negative
7.2.1 Tip de probă utilizată
Se pregătesc probe conţinând 20 - 80 organisme ţintă per volume. Sunt preferate materiale
contaminate natural pentru pregătirea probei acolo unde este posibil. Pentru bacterii fecale, se
poate utiliza apă de canalizare sau efluent de canalizare. Probele sunt apoi examinate cu
procedura studiată.
Sunt numărate coloniile tipice si atipice (în speţă cele care au imaginea tipică a organismelor
vizate şi cele care nu au aceste caracteristici). Coloniile tipice si atipice sunt apoi identificate

29
folosind o procedură adecvată care poate include utilizarea de kituri disponibile comercial,
secvenţiere ADN sau alte proceduri specificate.
Tipurile de probe care urmează să fie utilizate variază în funcţie de metod studiată şi de
organismele vizate. De exemplu, pentru metodele pentru coliformi totali se poate utiliza în mod
adecvat apă potabilă dopată cu apă de suprafaţă sau efluent de canalizare. Se fac diluţii în apa
potabilă pentru a obţine 20 - 80 organisme ţintă per 100 ml. Pentru metodele de filtrare prin
membrana care detectează atât coliformi totali şi E. coli pe aceeaşi membrană, numărul vizat de
E. coli ar putea fi 10 unităţi formatoare de colonii sau posibil mai puţin.
7.2.2 Număr de probe
Cel puţin cinci probe de apă potabilă trebuie dopate. Apa de suprafaţă sau apa de canalizare
utilizată pentru pregătirea materialului dopat trebuie să fie obţinută din cel puţin două surse.
7.2.3 Procedura pentru confirmare
Probele sunt incubate şi toate coloniile confirmate, în conformitate cu procedurile adecvate
metodei (precum pentru ISO 9308-l toţi coliformii presupuşi trebuie să fie testaţi pentru producţia
de cytochrome oxidase).
Unde metodele nu au proceduri de confirmare (precum ISO 9308-2l), atunci rezultatele sunt
descrise în metoda fără confirmare. Coloniile (sau vasele de reacţie, eprubetele etc.) sunt
înregistrate ca pozitive sau negative.
La determinarea parametrilor sensibilitate, specificitate, rata fals pozitiva şi rata fals negativa
este necesar să se aplice teste suplimentare de confirmare pentru a confirma (corobora) sau
nega rezultatele generate de metoda de testare. Testele bazate pe kituri de identificare
disponibile comercial sau alte metode fenotipice (precum teste pentru o anumita trăsătura sau
sistem enzimatic) sunt recomandate, în timp ce utilizarea testelor compoziţiei chimice (precum
MALDI-TOF) sau a metodelor moleculare poate fi în principal utilizată pentru caracterizarea
primară.
7.2.4 Caracteristici de performanţă categorice
7.2.4.1 Când este inclus un pas de confirmare in metodă, datele de identificare pot fi divizate
în patru categorii:
a) numărul de colonii tipice confirmate ca fiind organismul vizat in testul primar de
confirmare a căror identitate este susţinută prin testul de identificare secundar (adevărat
pozitive);
b) numărul de colonii atipice, sau colonii tipice care sunt negative in testul primar de
confirmare identificate ca fiind organismul vizat de testul de identificare secundar (fals
negative);
c) numărul de colonii tipice confirmate ca fiind organismul vizat de testul primar de
confirmare care se dovedesc ulterior ca nu sunt organismul vizat de testul de identificare
secundar (fals pozitive);
d) numărul de colonii atipice sau colonii tipice care sunt negative in testul primar de
confirmare, care se dovedesc prin testul de identificare secundar că nu sunt organismele
vizate (adevărat negative).
7.2.4.2 în cazul metodelor fără procedură de confirmare:
a) numărul de colonii tipice identificate ca fiind organismul vizat de un test extern de
identificare (adevărat pozitive);
b) numărul de colonii atipice identificate ca fiind organismul vizat de un test extern de
identificare (fals negative);
c) numărul de colonii tipice identificate ca nefiind organismul vizat de un test extern de
identificare (fals pozitive);
d) numărul de colonii atipice identificate ca nefiind organismul vizat de un test extern de
identificare (adevărat negative).

30
7.2.4.3 Frecvenţa acestor categorii poate fi exprimată într-o diagramă de tip 2 x 2:

Rezultat prezumptiv
+ -
Numărare + A b a+b
Confirmată - c d c+d
a+c b+d n

Numărul total de teste este a+ b + c + d = n.

Sensibilitatea, specificitatea, selectivitatea, rata fals pozitiva si rata fals negativa pentru
organismele vizate poate fi calculată astfel:
Sensibilitate = a / (a + b)
Specificitate = d / (c + d)
Rata fals pozitiva = c / (a + c)
Rata fals negativa = b / (b + d)
Selectivitate = a / n
Eficienta (E), care prezintă fracţia coloniilor corect desemnate, poate fi calculată astfel: E = (a +
d) / n.
NOTA: pentru metode MPN poate fi aplicata aceeaşi procedura. Termenul "colonii" poate fi
schimbat cu “alicote", “tipic” în “pozitiv” şi “atipic” in “negativ”.

7.3 Determinarea repetabilităţii

Planificarea pentru determinarea performanţei repetabilităţii unei metode constă în 10 replici ale
aceleiaşi probe care sunt analizate in condiţii de repetabilitate, în speţă de acelaşi tehnician in
aceeaşi zi, la acelaşi moment aproximativ şi cu toate probele incubate în acelaşi incubator.
Cel puţin trei seturi de date de repetabilitate trebuie pregătite utilizând diferite surse şi niveluri de
organisme vizate.
Sunt preferate probe natural contaminate. Cele trei seturi de date sunt apoi colectate şi
examinate utilizând procedura descrisa la punctul 6.4.2.2.

7.4 Incertitudine a numărării

Gradul de încredere al numărătorii este determinat de numărări repetate ale coloniilor de pe
aceeaşi placă, sau eprubete pozitive cu acelaşi sistem MPN, într-un timp scurt. Observaţiile
privind incertitudinea numărării vor oferi o indicaţie privind problemele potenţiale cu utilizarea
metodei. Incertitudinea numărării poate fi determinata cu un singur analist sau mai mulţi. Dacă
mai mulţi analişti realizează în mod rutinier testul, atunci incertitudinea numărării trebuie
determinată cu analişti multipli (vezi 6.7).

7.5 Procedura pentru verificarea de către un singur laborator

Caracteristicile minime necesare pentru verificarea de un singur laborator sunt prezentate în
Tabelul 13.

31
 Tabelul 13 – Cerinţe detaliate pentru procedura de verificare

Caracteristici de Repetabilitate a Incertitudine a

performanta numărării
categorice
Număr minimum de 5 probe: 3 probe- 30 placi (preferabil
probe, colonii/CFU 20 la 80 colonii tipice 1 dată 10 replici dar nu neapărat din
şi replici probe diferite)
/proba. fiecare
Număr > 20 CPU.
100 la 400 colonii -20 CFU la 80 CFU
tipice (şi colonii Nu mai mult de 300
atipice asociate) in colonii per placa de
cele cinci probe. Nu 90 mm sau 80 per
mai mult de 300 de filtru cu membrana de
colonii per placă de 47 mm
90 mm sau 80 per Un analist:
filtru cu membrana
de 47mm. 30 probe * 2
numărări.
Fara replici.
Analişti multipli:
Fiecare analist
numără cele 30 de
doar o dată
Tip de probe (in Probe natural Probe natural Probe natural
ordinea preferintei) contaminate (probe contaminate (probe contaminate (probe
reale). reale). reale).
Apă potabilă dopată Apă potabilă dopată Apă potabilă dopată
cu apă de suprafaţă cu apă de suprafaţă cu apă de suprafaţă
sau efluent de sau efluent de sau efluent de
canalizare. canalizare. canalizare.
(pentru material Materiale de Materiale de referinţă:
dopat, trebuie să referinţă: Apa dopata cu mai
provină din cel puţin Apa dopata cu mai multe tulpini(culturi
două surse). multe tulpini (culturi pure) de colonii tipice
pure) de colonii tipice si atipice colonii
si atipice colonii izolate in laborator.
izolate in laborator.
Analişti Unul sau mai mulți Acelaşi analist, În funcţie de rutina
analiști. acelaşi timp (sau laboratorului,
similar) şi acelaşi incertitudinea
Sunt preferaţi mai
incubator per probă numărării poate fi
mulţi analişti dacă
(probele diferite pot fi calculată pentru un
există
lucrate de analişti analist sau mai mulţi
diferiţi). (N).
Repetabilitatea Numărări repetate ale
trebuie calculată coloniilor în aceleaşi
pentru un singur plăci într-un timp
analist. scurt.

32
Pentru calculul Pentru a obţine Pentru compararea Pentru compararea
parametrilor culturi pure din rezultatelor rezultatelor
necesari coloniile tipice si microbiene microbiene
atipice şi confirma /
identifica diferitele
tulpini utilizând
proceduri adecvate
a Pentru metode MPN, trebuie selectată o marjă adecvată bazată pe planificarea specifică a procedurii MPN
(număr de eprubete /dilutii).

Tabelul 13 (continuare)

33
procedură 1) Daca metoda are Pentru fiecare proba UN ANALIST
un sistem de (10 replici), se Se calculează, pentru
confirmare; calculează: fiecare placă, adaosul
confirmare a tuturor Media aritmetică (x1+x2) şi diferenţa
coloniilor. (x1-x2) ambelor
2) Daca metoda nu numărări.
are un sistem de variaţia relativă a fiecărei
confirmare: perechi de numărări (x1 si
identificare a tuturor x2) este:
coloniilor / tulpinilor
folosind sisteme
adecvate.
4 tipuri (şi numere) Estimarea medie a
de colonii sunt personalului (un analist)
obţinute; pentru variaţia relativă a
numărării este media
Colonii tipice aritmetică a variaţiei
confirmate / relative a diferitelor
identificate ca fiind perechi de numărări.
organismele vizate Rădăcina sa pătrata
(adevărat pozitive). Se compară (folosind (urel,L )x 100 (expresie în
Colonii atipice metode statistice %) este incertitudine
standard relative a
confirmate / adecvate) valoarea repetabilităţii numărării de
identificate ca fiind observată X2r-1 această persoană.
organismele vizate raportat la limitele
N ANALIŞTI
(fals negative). teoretice ale
distribuţiei X2 cu 9 Pentru fiecare placa, se
Colonii tipice calculează variaţia
grade de libertate cu:
confirmate/ relativă:
identificate ca nefiind Valori critice la 5 %
organismele vizate X2r-1;0,05
(fals pozitive).
Valori critice la 1 % - Unde
Colonii atipice X2r-1;0,01
confirmate/ m şi s sunt media aritmetică
şi deviaţia standard a N
identificate ca nefiind replici (corespunzând pentru
organismele vizate N analisti) pentru aceeaşi
(adevărat negative). placa,
Estimarea medie a variaţiei
relative a rezultatelor este
media aritmetică a variaţiei
relative a diferitelor plăci.

a Pentru metodele MPN, trebuie selectată o marja adecvată pe baza numărului specific Elaborare a procedurii MPN
de eprubete/diluţii

34
 Tabelul 13 (continuare)

Caracteristici de Repetabilitate Incertitudine a

performanţă numărării
categorice
Rădăcina pătrată (urel,L)x100
(expresie in %) a mediei
aritmetice a variaţiei relative
a tuturor plăcilor este
incertitudinea estimată a
numărării intralaborator

Rezultate SENSIBILITATE 1) Dacă se observa UN ANALIST

a / (a + b) x2r-1< x2r-1;0,05 Valoarea ideală a
dispersia nu este urel,L is
SPECIFICITATE
semnificativ diferită < 0,02 însă valori <
d/(c + d)
de cea preconizată 0,1 sunt acceptate.
RATA FALS de Distribuţie Dacă valoarea este
POZITIVA Poisson. > 0,1, se
c/(a + c) 2) x r-1;0,05<
2 examineasză valorile
individuale u2rel,L în
RATA FALS x r-1< x r-1;0,01 observată căutare de motive.
2 2

NEGATIVA dispersie semnificativ mai mare

decât cea prezisă de Distribuţia N ANALISTI
b/(b + d) Poisson.
Nivelurile
SELECTIVITATE 3)Dacă x2r-1;0,01 acceptabile variază
a / (a + b + c + d) < x2r-1 observată în funcţie nu doar de
metodă, ci şi de
EFICIENTA Dispersie mult mai numărul de analişti.
(a + d) / (a + b + c + mare decât cea
d) prezisă de Distribuţia
Poisson.

Consultarea de A se vedea A se vedea A se vedea

exemple din exemplul de la exemplul de la exemplul de la
caracterizarea punctul 6.2.5 punctul 6.4.2 punctul 6.7.3 (un
primară analist) şi 6.7.4
(mai mulţi analişti)
a Pentru metodele MPN, trebuie selectată o marja adecvată pe baza numărului specific de eprubete/diluţii],

35
36
37
 Anexa A
(informativa)

Modele matematice ale variaţiei

A.l General

Variaţia numărului de particule între părţile pentru teste paralele este considerabilă chiar dacă
suspensia este perfect amestecată (complet aleatorie) şi nu sunt implicate incertitudini tehnice de
măsurare.
Această inevitabilă variaţie intrinsecă este o proprietate a suspensiilor şi este similară pentru toate
metodele microscopice şi de numărare a coloniilor. Poate fi modelată matematic prin Distribuţia
Poisson.
Distribuţia Poisson nu ia în totalitate în calcul variaţia intrinsecă a numărării MPN.

A.2 Precizia intrinsecă a numărării coloniilor

Variaţia Distribuţiei Poisson este egală cu media. Egalitatea mediei şi variaţiei nu dovedeşte că
datele urmează Distribuţia Poisson.
Compatibilitatea este în mod tradiţional testată prin utilizarea indicelui Poisson de dispersie X2r-1
sau valoarea statistică a probabilităţii G2 (vezi şi Anexele C şi D).
Variaţia relativă a Distribuţiei Poisson este relaţia inversă faţă de medie, sau mai general numărul
total de colonii din detector. Aceasta presupune că în cazul metodelor pentru colonii, precizia nu
este o caracteristică constantă a performanţei.
Aceasta presupune că în metodele cu colonii, precizia nu este o caracteristică de performanţă
constantă. Incertitudinea relativa intrinseca poate fi redusă prin creşterea numărului de colonii.

unde
urel este deviaţia standard relativă; s s
este deviaţia standard;
x este numărul de colonii observate.
EXEMPLUL 1: numărarea pe o singură placă dintr-o probă cu o suspensie perfect amestecată, de
exemplu 48 de colonii, are precizia relativă teoretică de
Dependenţa dintre precizia relativă (urel - deviaţia standard relativă) şi numărul particulelor este
ilustrată în Figura A.1. Incertitudinea relativă aleatorie creşte rapid pe măsură ce numărul scade
sub 20.
38
x numărul de colonii observate
urel deviaţia standard relativă
Figura A.l — Deviaţia standard relativă (exprimata in %) a numărului de colonii într-o
suspensie perfect mixată urmând Distribuţia Poisson
Graficul arată de ce numerele coloniilor precum 20, 25, sau 30 au fost în mod tradiţional considerate
cele mai puţin de încredere rezultate statistice. În marja de rezultate de până la zece, care se
întâmplă să fie de interes pentru sănătatea publică, măsurările unice sunt atât de imprecise încât cu
greu pot fi considerate mai bune decât semi-cantitative. Însă precizia relativă poate fi îmbunătăţită
prin realizarea de măsurări repetate.
EXEMPLUL 2 Cinci placi paralele au fost inoculate cu 1 ml parte pentru teste din aceeaşi probă de
laborator. Numărul de colonii numărate a fost: 6, 7, 11, 6, 9.
Suma rezultatelor: 6 + 7 + 11 + 6 + 9 = 39
Media rezultatelor: 39/5 = 8

Precizia relativa teoretica a

Deviaţia standard relativă teoretică a unei singure măsurări a 8 colonii ar fi

Modelul Poisson poate fi utilizat pentru estimarea celei mai mici incertitudini statistice teoretice la
orice numărare de colonii şi în mod opus pentru calculul celui mai mic rezultat pentru a ajunge la op
precizie statistică stipulată (vezi si Anexa B).

39
A.3 Precizia intrinsecă a numărărilor MPN
A.3.1 General
Precizia relativa a metodelor MPN depinde, pe lângă numărătoarea în sine, de alegerea numărului
de eprubete paralele. Distribuţia Poisson este luată în calcul în fiecare suspensie, însă probabilitatea
prezenţei-absenţei reacţiilor pozitive se adaugă variabilităţii intrinseci.

A.3.2 MPN cu o singură diluţie

Precizia relativa a unei singure serii de eprubete n t în termeni ai deviaţiei standard în scara
logaritmică naturală este exprimată prin Formula (A.2)

Litera x din formulă este cel mai probabil număr of organisme per eprubeta care este
exprimat prin Formula (A.3)

unde
M este valoarea MPN;
x este numărul organismelor per eprubeta;
nt este numărul eprubetelor;
np este numărul eprubetelor pozitive.
NOTA: Formula (A.2) şi (A.3) pot fi combinate, ceea ce oferă o formula care
demonstrează că precizia relativa este complet definită de numărul total de eprubete şi de
numărul de eprubete pozitive.

Modul în care precizia relativă a unei MPN variază în funcţie de numărul de eprubete pozitive este
ilustrat în Formula (A.2)

40
np numărul de eprubete pozitive
urel deviaţia standard relativă
Figura A.2 — Deviaţia standard relativă (exprimata in %) a unei singure diluţii MPN cu 50 de
eprubete paralele

Figura A.2 arată că precizia relativa a estimărilor MPN este la minim când 80% din eprubete sunt
pozitive.
Potrivit Formulelor (A.2) si (A.3), cea mai bună precizie ce poate fi obţinută (cea mai mică deviaţie
standard relativă) este astfel o funcţie a numărului de eprubete paralele în conformitate cu
Formula (A.4):

Incertitudinea estimării MPN nu poate deveni mai mică decât atât. Când proporţia rezultatelor
pozitive diferă de 80% incertitudinea standard relativă devine mai mare, însă aşa cum arată Figura
A.2. există o parte relativ lungă şi aproape plată a curbei preciziei între 60 % - 95 % rezultate
pozitive.
A.3.3 Diluţii multiple MPN
A.3.3.1 Precizie "Exactă"
Cu diluţii multiple MPN precizia relativă ia forma unei curbe. Are la fel de multe puncte minime ca
şi nivelurile diluţiei în detector.
Ca şi exemplu, deviaţia standard relativă a fost calculată pentru 3x10 eprubete MPN. Minima
apare atunci când prima, a doua şi a treia serie de eprubete paralele devine 80 % plină de
rezultate pozitive.

41
np numărul de eprubete pozitive
urel deviaţia standard relativă
Figura A-3 Deviaţia standard relativă (exprimata in %) a 3 x 10 eprubete MPN
Axa orizontală reprezintă numărul de eprubete pozitive in întregul set. Curba ondulată arată
deviaţia standard relativă calculată.
Precizia relativa a diluţiilor multiple MPN depinde preponderent de numărul de eprubete paralele
per diluţie. Multiple diluţii nu sunt însă complet fără efect. Ca şi exemplu, Figura A.3 arată că cel
mai mic nivel minim (prima) pentru sistemele 3 x 10 sisteme MPN are valoarea 0,350 (35%) în
timp ce deviaţia standard relativă minimă pentru o singură diluţie MPN cu zece eprubete în
conformitate cu Formula (A.4) este 0,392 (39 %).
A.3.3.2 Precizia caracteristică aproximată
Cochran a propus o deviație standard constanta aproximativa pentru întreaga marjă MPN.
Potrivit ecuaţiei lui Cochran, precizia estimării MPN în scară logaritmică depinde în mod simplu
de numărul de eprubete per diluţie (nt) si de factorul de diluţie (f) între diluţii consecutive.

Constanta 0,58 a fost aleasă pentru diluţii de 10. Dacă factorul de diluţie dintre diluţii este mai
mic de zece, contanta 0,55 poate fi folosită,
Aproximarea lui Cochran este indicată de linia orizontală din Figura A.3. Este vizibil că rezultatul
exact derivă cel mai mult din aproximare atunci când majoritatea eprubetelor din set sunt
negative.
Deviaţia standard a oricărei valori MPN individuale este acum uşor obţinută printr-un program de
calcul. În pofida naturii sale aproximative, formula lui Cochran este utilă în planificarea
experimentală şi comparaţia metodelor (vezi exemplul de mai jos). Oferă o idee a preciziei
caracteristice a unui sistem MPN.

42
EXEMPLU Se pleacă de la ipoteza unei determinări bazate pe sistemul de detecţie MPN de 3x32
loturi în 96 de plăci. Se consideră un factor de diluţie = 3 între diluţiile consecutive. Deviaţia
standard a lg MPN, în conformitate cu formula de aproximare Cochran, este:

Conversia la scară logaritmică naturală oferă rezultatul

Aproximativ 15 % precizie relativă.

A.4 Supra-dispersăre
A.4.1 General
In modelul Poisson incertitudinile tehnice şi de altă natură sunt considerate absente. Pregătirea
suspensiei iniţiale, diluţiei, inoculării, incubării şi numărării coloniilor includ însă şi incertitudini.
Fiecare pas tehnic creşte variabilitatea totală a măsurătorii. Determinările paralele care implică
întreaga procedură analitică nu pot fi preconizate să urmeze Distribuţie Poisson. Poate fi
observată o supra-dispersăre, în speţă variaţie mai mare decât complet aleatorie [în sensul
Poisson], între observaţiile paralele. Această variaţie adiţională depinde parţial de metodă.
Un alt factor care cauzează variaţii mai mari decât Poisson este reprezentat de utilizarea
confirmării parţiale. Supra-dispersărea cauzată de confirmarea parţială depinde de probă şi de
numărul şi tipul de colonii selectate pentru confirmare, nu de metodă în sine. Formează parte a
incertitudinii măsurării [vezi lSO 2920].
Din aceste motive, supra-dispersărea este starea normală a rezultatelor testelor microbiologice iar
Distribuţia Poisson este o aproximare simplificată. Modelul Poisson funcţionează totuşi. Aceasta
se întâmplă când incertitudinea cauzată de variaţia intrinsecă este foarte mare ca urmare a
rezultatelor scăzute. Incertitudinile tehnice sunt prin comparaţie mult mai mici.
A.4.2 Modelul binomial negativ
Cauzele comune ale supra-dispersării, în afară de erori, au efecte aproape proporţionale faţă de
medie sau numărul de colonii. Alte motive pentru acelaşi şablon de supra-dispersăre au fost
descrise anterior. Întrucât precizia intrinsecă ca urmare a împrăştierii aleatorii a particulelor în
suspensie urmează Distribuţia Poisson, iar astfel variaţia totală poate fi exprimată astfel

Unde

este numărul mediu de obiecte numărate (particule, colonii );

uo este supra-dispersărea, deviaţia standard operaţională relativă.
Prima parte a variaţiei este cauzată de procesul Poisson, restul de efectele combinate ale tuturor
factorilor favorizanţi aleatorii pentru supra-dispersăre. O distribuţie statistică cu acest model de
variaţie este numit distribuţie binomiala negativa (alte nume sunt Distribuţie Poisson Gamma si
distribuţie).

43
 Deviaţia standard relativă a distribuţiei este

Figura A.4 prezintă efectul a diferite grade de supra-dispersăre asupra preciziei relative totale
(deviaţia standard relativă)

Unde

înseamnă numărul de colonii

urel deviaţia standard relativă
Figura A.4 — Efectul supra-dispersării asupra preciziei relative totale (deviaţia standard
relativă exprimata in %)
Curba inferioară: modelul Poisson fără supra-dispersăre; curbele superioare: binomial negativ cu
15 % si 30 % supra-dispersăre (variaţie adițională moderată U0 = 0,15 si 0,30).
Media numărului coloniilor necesare pentru o precizie relativă totală este considerabil mai mare
într-o situaţie cu supra-dispersăre decât într-un caz total aleatoriu (Poisson). Poate fi calculată
prin soluţionarea Formulei (A.7) pentru numărul mediu de colonii
EXEMPLU Pentru atingerea unei deviaţii standard relative urel2 = 0,2 atunci când supra-
dispersărea este u0 = 0,15 necesită, conform Formulei (A.7), un număr al coloniilor x = 1/(0,22 -
0,152) = 1/(0,04 - 0,022 5) = 57. Aceeaşi precizie este atinsă într-o situaţie cu totul aleatorie
(Poisson) cu numărul de colonii x = 1/0,22 = 1/0,04 = 25.
NOTA: Este clar că precizia totală mai mică decât supra-dispersărea nu poate fi atinsă în cadrul
unei singure determinări. Întreaga procedură poate fi repetată daca este nevoie de o precizie mai
bună. Cu r determinări paralele, deviaţia standard relativă totală poate fi estimată din

unde

este numărul total de colonii înregistrate;

UQ este constanta supra-dispersării, deviaţia standard operaţională relativă.
44
A.5 Detectarea supra-dispersării
Existenţa deviaţiei semnificative statistic din Distribuţie Poisson poate fi testată prin aplicarea
indicelui Poisson de dispersie pe o serie de numărări paralele

raportat la valoarea statistică corespondentă a ratei de probabilitate care poate fi calculată din

unde in ambele formulele

r este numărul observaţiilor paralele;
ni este ith observaţie (i = 1...r).
ambele indice teoretic (asimptotic) urmează distribuţia chi-pătrat, care permite tragerea de
concluzii statistice privind prezenţa supra-dispersării (sau sub-dispersării).
NOTA: Sub-dispersia indicată un acord „prea apropiat” al numărărilor paralele. Există câteva
motive naturale pentru aceasta. Poate apărea atunci când partea pentru test consumă o parte
extinsă a suspensiei testului. A fost totodată observată că apare atunci când tehnicianul ştie care
plăci aparţin aceleiaşi serii paralele şi ştiind asta îşi direcţionează implicit rezultatele. Sub-
dispersia dispare dacă plăcile paralele sunt codate şi amestecate cu alte plăci pentru a putea fi
ulterior numărate.
A.6 Cuantificarea supra-dispersării
A.6.1 Prima metodă a lui Anscombe
Prima metodă a lui Anscombe este aplicabilă atunci când suficient de multe observaţii
independente asupra unei singure probe sunt disponibile pentru a trage estimări de încredere ale
variaţiei şi mediei. În marja valorilor medii şi variaţiei operaţionale relative care sunt de interes în
utilizarea şi evaluarea metodelor de numărare a coloniilor, metoda lui Anscombe este eficientă.
Constă în soluţionarea Formulei (A.6) pentru u20.

Pentru a fi eficiente, observaţiile trebuie să se regăsească în marja de numărare optimă. Media

nu ar trebui să fie mai mică de 20.
Aceasta se aplică în special dacă scopul este de a estima variabilitatea operaţională într-un
singur experiment. Dacă sunt disponibile mai multe experimente, se va acorda atenţie pentru a
verifica valorile variabilităţii operaţionale, obţinută din rezultate reduse.
A.6.2 Abordarea regresiei
Oriunde sunt disponibile observări paralele pe aceeaşi probă atunci este posibil să se calculeze o
estimare a variaţiei şi mediei. O soluţie, bazată pe Formula (A,6), utilizează data din mai multe
probe. Este avantajos dacă mediile acoperă o gamă extinsă. Seriile cu mai mult de două paralele
sunt preferabile. Cel puţin treizeci de probe trebuie studiate.
Calcularea raportului variaţie-medie (K) din mai multe seturi de replici oferă un număr de

45
( , K) perechi. O linie a regresiei bazată pe aceste date oferă o estimare a variaţiei
operaţionale relative.
Împărţirea ambelor părţi ale Formulei (A.6). cu valoarea medie a numărului de colonii duce
la o ecuaţie a liniei. Panta reprezintă variaţia operaţională relativă.

Împrăştierea aleatorie este inevitabil considerabilă dacă estimările mediei şi variaţiei se

bazează pe numere mici de determinări paralele. Avantajul acestei abordări este că
estimarea supra-dispersării se bazează pe o selecţie mare de probe diferite.
Potrivit Formulei (A.ll), valoarea interceptorului y se preconizează să aibă valoarea 1. Poate
să nu fie aşa atunci când ecuaţia privind regresia este exprimată. Dacă valoarea pentru
interceptor este mai mare de 1, indică supra-dispersăre şi la nivelul detectorului, în speţă în
suspensiile test.
NOTA: Formula (A,11) se aplică doar când media se bazează pe colonii care nu s-au
transformat (sau particule). Factorii de diluţie şi/sau logaritmii nu sunt utilizaţi.
A.6.3 Abordarea privind indicele de dispersie (x2 sau G2)
Calculul indicelui de dispersie al determinărilor paralele se aplică în mod obişnuit în scopul
asigurării calităţii în multe laboratoare. În consecinţă, pot fi automat calculate cantităţi
însemnate de date de precizie adecvate pentru calculele de supra-dispersăre. Cea de a
treia metodă de estimare utilizează astfel de date.
Relaţia dintre medie, variaţi şi indicele de dispersie este

Raportul variaţie-medie multiplicat cu gradele de libertate oferă valoarea indicelui (Poisson)

de dispersie. Valoarea corespondentă G2(n-1) statistică a probabilităţii log poate fi în mod
legitim substituită pentru ea. Împărţirea ambelor părţi ale Formulei (A.12) la gradele de
libertate (n-1) oferă raportul variaţie-medie.

Considerând că modelul binomial negativ este cea mai probabilă descriere a variaţiei
statistice a determinărilor paralele, este posibil să se insereze valoarea raportului variaţie-
medie din Formula (A,11)

Rearanjarea şi soluţionarea variaţiei operaţionale relative

46
Media multor estimări (respectiv semnul algebric) ale variaţiilor operaţionale relative din
diferite probe oferă o valoare pentru o constantă generală supra-dispersăre. In această
abordare, Distribuţia Poisson a suspensiilor test este acceptată (vezi A.6.2).

47
A.6.4 Supra-dispersărea la nivelul detectorului
Este o observare clasică aceea că numărările paralele dintr-o singură suspensie poate varia mai
mult decât indică Distribuţia Poisson. La acest nivel, supra-dispersărea este cauzată de erori în
folosirea pipetei, incertitudine a numărării şi erori accidentale, şi posibil de proprietăţi specifice ale
probei şi condiţiilor de incubare.
Supra-dispersărea la nivelul detectorului este o măsură utilă de asigurare a calităţii. Depinde într-
o oarecare măsură şi de metodă. Poate fi detectată de indicii de dispersie (x2, G2) (Vezi A.6.3).

48
 Anexa B
(caracter normativ)
Evaluarea limitelor inferioare
B.1 General
Limitele mai scăzute de lucru ale metodei microbiologice ţin într-o măsură extinsă de
definire.
La concentraţii foarte scăzute ale particulelor, toate metodele microbiologice devin în
mod esenţial metode de detectare. Nivelul fizic teoretic de detecţie pentru toate
metodele este o particulă a organismului ţintă în partea pentru test sau sistem de
detectare, precum MPN.
Întrucât analitul microbiologic constă în particule, există o posibilitate statistică
distinctă ca microbul să nu fie prezent în partea pentru test însă să existe in prova de
laborator.
Nivelul de detecţie este definit ca cea mai mică concentraţie a analitului care poate fi
detectată (95% probabilitate a unui rezultat pozitiv). Numărarea care se conformează
acestei definiţii este, în medie, 3 particule per volum de material testat (vezi detalii în
B.2).
Nivelul de detecţie este proprietatea suspensiilor şi este acelaşi pentru toate
numărările de colonii si metodele MPN.
Alternativ, când poate fi determinata o deviaţie standard relativă consensuală, poate fi
utilizată limita determinarii. Corespunde celei mai mici concentraţii a analitului, unde
deviaţia standard relativă este egală cu limita specificată determinată (vezi şi B.3).
Pentru metodele de numărare a coloniilor
Pentru metodele de numărare a coloniilor, ISO 8199 menţionează o limită a determinării
de 10 particule per parte pentru test, corespunzând unei deviaţii standard relative de
aproximativ 32 %, intr-o situaţie total aleatorie (Poisson).
B.2 Nivel de detecţie bazat pe probabilitate
B.2.1 Model Poisson
Probabilitatea unui rezultat pozitiv p[+] când Distribuţia Poisson prevalează poate fi
calculată din

Soluţionând formula pentru x se ajunge la

unde
e este baza logaritmilor naturali;
x este numărul de particule per parte pentru analiză.
O definiţie populară a nivelului de detecţie este reprezentat de concentraţia la care
probabilitatea detectării prezenţei analitului este egală cu 95 % [p(+) = 0,95].

49
Potrivit ecuaţiei x = ln(l-0,95) = -ln(0,05) = 3,0. Astfel, la rezultatul mediu per parte pentru
test, şansele de detectare a prezenţei analitului sunt egale cu 0,95 (cu condiţia ca
Distribuţia Poisson să prevaleze).
Nivelul de detecţie este proprietatea suspensiilor şi nu se distinge o metodă de alta. Nivelul de
detecţie este acelaşi pentru toate metodele de numărare a coloniilor.

50
B.2.2 Metodelor MPN
Nivelul de detecţie al metodelor MPN poate fi gândit în acelaşi mod ca şi pentru metodele
pentru colonii. Probabilitatea detectării prezenţei analitului în sistemul MPN este dată de
Formula (B.1). indiferent de configuraţia geometrică acelaşi număr mediu de particule este
necesar în sistem pentru a asigura detectarea analitului cu o probabilitate aleasă.

B.2.3 Model binomial negative al supra-dispersării

Nivelul de detecţie, când este definit în termeni ai probabilităţii, poate fi calculat din
probabilitatea unui rezultat negativ. Invocând cercetările lui Anscombe, însă schimbând
simbolurile cu cele utilizate în acest document, probabilitatea unui rezultat negativ
(probabilitate zero) este dată de Formula (B.3)

Rezolvând , se obţine nivelul de detecţie când probabilitatea (frecvenţa relativă) a

rezultatelor negative şi variaţia operaţională relativă.

Aşa cum este evident din Figura A.4 (A.4.2), nivelul de detecţie este mai degrabă puţin
afectat de supra-dispersărea moderată (vezi exemplul de mai jos).
EXEMPLU Concentraţia bacteriană necesitată pentru atingerea unei probabilităţi de 95 %
rezultat pozitiv intr-o situaţie cu supra-dispersăre depinde de variaţia operaţională relativă.
Se acceptă o deviaţie standard operaţională relativă u0 = 0,30. Substituţia directă a
probabilităţii unui rezultat negative p(-) = 1 - p(+) = 1- 0,95 = 0,05 in Formula (B.4) duce la x
= (0,05-0,09 - 1]/0,09 = 3,44. Estimarea corespondentă cu Distribuţia Poisson (fără supra-
dispersăre) ar fi x= -ln(0,05) - 3,00 (vezi B.2.1).
NOTA:
NU există dubiu că aceleaşi cauze ale supra-dispersării ar putea fi afectate şi de rezultatele
MPN paralele. Nu sunt disponibile în prezent date experimentale sau modele matematice
pentru cazul de MPN supra-dispersat.
B.3 Limita determinării bazată pe precizie
B.3.1 General
Concentrația medie necesară pentru o incertitudine relativa specificata poate fi calculată prin
soluţionarea formulelor de precizie pentru numărul de colonii.
B.3.2 Modelul Poisson
Se soluţionează Formula (A.1) pentru numărul de colonii

unde
x este numărul de colonii observate in sistemul de detecţie;
urel este precizia relativă vizata (deviaţia standard relativă).

51
EXEMPLU: într-o situaţie total aleatorie (Poisson), precizia relativă de 20 % este obţinută
atunci când numărul de colonii observate în sistemul de detectare este egal cu x = 1/0,22 =
1/0,04 = 25.
B.3.3 Modelul binomial negativ
Se soluţionează Formula (A.2) pentru numărul de colonii

unde

este numărul mediu de colonii;

urel este precizia relativă vizata;
u0 este deviaţia standard operaţională relativă.
EXEMPLU Pentru atingerea deviaţiei standard relative urel = 0,2 când deviaţia standard
operaţională relativă este u0 = 0,15, potrivit Formulei (B.6) numărul mediu de colonii = 1/
(0,22 - 0,152) = 1/ (0,04 - 0,0225) = 1/0,017 5 = 57. (A se compara cu exemplul de la B.3.2).
B.3.4 Planificare privind nivelurile de detecţie
Indiferent de tehnica analitică, metoda sau organismul vizat, nivelul de detecţie definit în
termeni ai probabilităţilor variază foarte puţin. Doar gradele extreme de supra-dispersăre ar
putea schimba uşor imaginea de ansamblu. Exemplele prezentate anterior arată că o
probabilitate a detectării de 95% ar necesita 3 particule de analit per parte pentru analiză,
în medie. Partea pentru analiză in acest caz este volumul total al suspensiei test plasate în
detector.
O metodă care poate gestiona o parte pentru test de 100 ml are o probabilitate a detectării
de 95 % (5 % probabilitate de neidentificare) a ţintei vizate când media este de aproximativ
trei per parte pentru test. O altă metodă care poate gestiona o parte pentru test de 10 ml
poate detecta la aceeaşi probabilitate doar la densitatea medie de 30 per 100 ml. Astfel de
niveluri de detecţie variază între metode. Este posibil să fie pusă sub îndoială validitatea
metodei dacă este structural limitată, astfel încât probabilitatea detecţiei nu este suficientă
la concentraţiile care apar în mod obişnuit.

52
 Anexa C
(caracter normativ)
Evaluarea limitei superioare
C.l General
Numărul de organisme ţintă per parte pentru test unde linearitatea începe să se deterioreze
este considerată drept limita superioara a metodei.
Linearitate înseamnă o relaţie în linie dreaptă a rezultatului observat cu concentraţia analitului.
În contexte microbiologice, linearitatea reprezintă un răspuns linear al rezultatelor raportat la
volumul părţii pentru testare. Linearitatea este în general bună la capătul scăzut al scalei, în
apropiere de nivelul de detecţie.

C.2 Evaluare statistică a limitei superioare

Calculele statistice se bazează pe procedura indicelui G2:
Se iau n colonii x1, x2,…, xn obţinute din aceeaşi suspensie test în volume sau diluţii care sunt
prezentate drept R1, R2,…, Rn.
Estimarea raportului probabilităţii proporţionalităţii (linearităţii) rezultatelor poate fi calculată din

O valoare ghid poate fi obţinută prin referire la tabelele lui x2 cu n-1 grade de libertate. Valorile
mai mari decât cele din valori indică îndepărtarea de proporţionalitate la nivelurile alese de
probabilitate.
Numărul de germeni per parte pentru test unde linearitatea a fost pierdută poate fi considerată
drept limită superioară.
NOTA: Linearitatea este un aspect al atributului adevăr. Deviaţia de la linearitate se dezvoltă
gradual pe măsură ce numărul de colonii creşte.

53
 Anexa D
[caracter normativ]
Determinarea variabilităţii operaţionale in condiţii de
repetabilitate si reproductibilitate intralaborator
D.l Caz general: Evaluare statistică într-un experiment de
repetabilitate
Un exemplu cu numărul minim necesar de date este prezentat la punctul 6.4.2. Dacă sunt
incluse mai multe date în experimentul privind repetabilitatea, Tabelele D.1 si D.2 si Formulele
(D.l) - (D.3) pot fi utilizate.
Tabelul D.l — Exprimarea rezultatelor într-un experiment privind repetabilitate
Măsurări repetate
n1 n2 …. ni

a) Detectarea supra-dispersării prin aplicarea indicelui Poisson de dispersie

pe fiecare serie de numărări paralele

unde
r este numărul observaţiilor paralele;
ni este observaţia i (i= l...r).
Indicele Poisson de dispersie teoretic (asimptotic) urmează distribuţia chi-pătrat, care permite
tragerea de concluzii statistice privind prezenţa supra-dispersării (sau sub-dispersia).
b) se realizează comparaţia valorii observate x2r-1 cu limitele teoretice ale distribuţiei x2 cu
r-1 grade de libertate.
Pentru o evaluare unilaterală, limitele teoretice sunt:
— valoare critica la 5%: x2r-1 ; 0,05
— valoare critica la 1 %: x2r-1 ; 0,01
c) În funcţie de poziţia valorii observate x2r-1 în relaţie cu limitele teoretice, se determină pentru
fiecare serie analitică semnificaţia dispersiei observate în privinţa dispersiei preconizate a
Distribuţie Poisson.

54
 Tabelul D.2 — Evaluare statistica a setului de date într-un experiment privind
repetabilitatea

Caz Poziţia observată a lui x2r-1 in relaţie Concluzie privind diferenţa dintre
cu limitele teoretice dispersia observată şi dispersia
preconizată de Distribuţia Poisson

1 Observată x2r-1< x2r-1;0,05 Dispersia nu este semnificativ diferită

de cea de cea preconizată de
Distribuţia Poisson
2 x2r-1;0,05 < Observată x2r-1 < x2r-1;0,01 Dispersia este semnificativ mai mare
de cea preconizată de Distribuţia
Poisson
3 x2r-1;0,01< Observată x2r-1 Dispersia este semnificativ mult mai
mare decât cea preconizată de
Distribuţia Poisson

Daca situatiile 2 or 3 sunt observate, variaţia operaţională relativă u20 este calculată
utilizând prima metodă a lui Anscombe.

unde
s2 este variaţia observaţiilor paralele;

este media aritmetica a observaţiilor paralele.

Dacă apare cazul 1, u2 nu este semnificativ diferită de 0. Pentru evaluare globală, poate fi
utilizată variaţia operaţională relativă calculată ca mai sus.
Pentru a fi eficiente, observaţiile trebuie să se regăsească în marja optimă a rezultatelor. Media
nu trebuie să fie mai mică de 20. Această se aplică în special dacă scopul este acela de a estima
variabilitatea operaţională într-un singur experiment. Dacă sunt disponibile mai multe experiment,
vor fi verificate valorile variabilităţii operaţionale obţinute la rezultatele scăzute.

Când sunt procesate statistic seturi diferite de date de repetabilitate, se calculează media
aritmetica a diferitelor variaţii operaţionale relative. Astfel, variaţia operaţională relativă medie
corespunde performanţei repetabilităţii metodei.
Expresia finală a repetabilităţii în % poate fi dedusă din :

55
D.2 Caz general: Evaluare statistica intr-un experiment intralaborator
privind reproductibilitatea pentru metoda de numărare a coloniilor
Un exemplu limitat (cu un număr restrâns de date) este prezentat la punctul 6.4.3.1.
Tabelul D.3 poate fi utilizat pentru procesarea datelor experimentului intralaborator
privind reproductibilitatea.

Tabelul D.3 — Exprimarea rezultatelor numărării coloniilor intr-un experiment

intralaborator privind reproductibilitatea

Proba Numărul Măsurări

1 x11 x12
2 x21 x22

q Xq1 Xq2
2
a) se determină variaţia operaţională relativă u 0 folosind prima metoda a lui Anscombe
pentru fiecare pereche de numărări.
b) Se calculează variaţia operaţională relativă medie din setul de q perechi de numărări
din diferitele probe testate. Expresia finala a reproductibilitatii intralaborator în % este
rădăcina pătrată a variaţiei operaţionale relative medie, multiplicat cu 100.
D.3 Caz general; Evaluare statistica intr-un experiment intralaborator
privind reproductibilitatea pentru metode MPN
Un exemplu prezentat la punctul 6,4.3.2. Tabelele D.4 si D.5 si Formulele (D.4) - (D.7) poate fi
utilizat pentru procesarea datelor experimentului intralaborator privind reproductibilitatea.
Tabelul D.4 — Exprimarea rezultatelor MPN intr-un experiment intralaborator
privind reproductibilitatea

Proba Măsurători Limita Limita Limita Limita Suprapunere a

inferioară superioară inferioară superioară intervalelor de
de de de de încredere în condiţii
încredere încredere încredere încredere de reproductibilitate

Ml M2 T0,1 T1,1 T0,2 T1,2

1 Ml1 M12 T0,1,1 T1,1,1 T0,2,1 T1,2,1 da / nu
2 M21 M22 T0,1,2 T1,1,2 T0,2,2 T1,2,2 da / nu
… … … … … … … …
q Mql Mq2 T0,1,q T1,1,q T0,2,q T1,2,q da / nu

56
 Tabelul D.5 — Calculul variaţiei operaţionale relative pentru rezultate MPN

Proba Reproductibilit Variabilitate Variabilitate Variabilitate Variaţia

atea intrinsecă intrinsecă intrinsecă operaţională
intralaborator pentru prima pentru a doua medie relativă
replică replică u2d u20
2 2
u d1 u d2
u2R’1
1 u2R’1 u2d1,1 u2d2,1 u2d,1 u20,1

2 u2R’2 u2d1,2 u2d2,2 u2d,2 u20,2

… … ... ...
q u2R'q u2d1,q u2d2,q u2d,q u20,q

a) se determină variaţia operaţională relativă u20 pentru fiecare pereche de numărări.

b) se calculează variaţia operaţională relativă medie din setul de q perechi de rezultate MPN
din diferitele probe testate. Expresia finală u0 in condiţii de reproductibilitate intralaborator (in %)
este rădăcina pătrată a variaţiei operaţionale relative medie, multiplicat cu 100.

57
 Anexa E
(caracter normativ)
Incertitudine a numărării
E.1 General
Metodele nu ar trebui să fie în mod nejustificat influenţate de operator. Efectele asociate
operatorului sunt incluse în testele de reproductibilitate (vezi D.2) si realizarea metodei in studiul
în colaborare (vezi Anexa F) folosit pentru evaluarea preciziei. Estimările globale ale incertitudinii
măsurării includ şi efectele asociate operatorului (ISO 29201[15]).
Este util să fie clar identificate efectele operatorilor. Cele mai importante sunt diferenţele dintre
operatori în interpretarea numărărilor prezumptive.
Diferenţele pricind interpretarea pot fi studiate eficient prin citiri paralele ale coloniile din aceleaşi
plăci de către acelaşi operator sau de diferiţi operatori. (vezi E.2 si E.3). Exerciţiul ar trebui să
producă estimări individuale sau colective privind incertitudinea, exprimate ca deviaţie standard
relativă. Deviaţia standard relativă calculată din rezultatele mai multor persoane este mai preciză
decât cea calculată din numărări repetate de către o singură persoană. (o persoană poate în mod
normal să greşească in mod repetat.)
E.2 Determinare statistica a incertitudinii numărării coloniilor si
citirilor MPN
Se pleacă de la premisa unei plăcu cu un număr x (necunoscut) de colonii caracteristice si se
notează cu x1, x2..., xn numerele observate în timpul numărării plăcilor de aceeaşi persoană în
mod repetat sau de către mai multe persoane.
Incertitudinea la numărare urel,L este exprimată ca şi deviaţia standard relativă;

unde

NOTA: aceeaşi formulă în formă la pătrat este utilizată pentru determinarea incertitudinii citirii
MPN.
E.3 Incertitudine individuală (sau personală) a numărării coloniilor
Estimarea corespunde unui sumar al rezultatelor unei persoane care citeşte aceleaşi plăci de
două ori. Variaţia relativă a fiecărei perechi este calculată folosind Formula (E.2).

Estimarea medie a incertitudinii personale a numărării este media aritmetică a variaţiilor relative
ale perechilor de numărări.

58
59
E.4 Incertitudinea numărării intralaborator
Media pătratică a rezultatelor mai multor persoane din acelaşi laborator care citesc aceleaşi plăci

unde
u2rel,Li este variaţia relativă a numărării plăcii ith.
Media pătratică este considerată drept media estimată pătratică raportat la incertitudinea relativă a
numărării.
Pentru o estimare de încredere, n trebuie să fie minim 30.

60
 Anexa F
(caracter normativ)
Determinarea variabilităţii operaţionale (reproductibilitate
interlaborator) intr-un studiu de performanta in colaborare

F.1 Cerinţe pentru un experiment interlaborator privind precizia

Realizarea metodei in colaborare implică mai multe laboratoare şi vizează evaluarea preciziei
interlaboratoare a metodei.
Planul statistic al experimentului este organizat cu un set dat de condiţii precum:
- Mai multe laboratoare (minim 8), capabile să demonstreze că metoda de testare este bine
controlată, analizând probe din acelaşi preparat şi cu aceleaşi materiale;
- Trebuie obţinute cel puţin trei seturi de probe folosind diferite surse de organisme ţintă în
fiecare;
- Replicile (măsurătorile repetate) trebuie să demonstreze că metoda test este bine
controlată într-un singur laborator. Cel puţin două determinări sunt necesare.

F.2 Caz general pentru metodele de numărare a coloniilor - evaluare

statistica pentru un set dat de probe
F.2.1 Abordarea calculului
ISO 5725-2 descrie o estimare a variaţiei reproductibilităţii utilizând metoda analizei variaţiei: S2R
= S2L + S2r unde S2L este variaţia cauzată de eroare de laborator i (eroare sistematică) iar S2r este
variaţia erorii de măsurare. Abordarea se aplică datelor continue în chimie.
Calculul prezentat în această clauză este adaptat pentru utilizare specifică a numărului de colonii
în microbiologie. Variaţiile operaţionale relative s u20,r SI u20,R SUNT ESTIMATE simultan pe baza unui
principiul simplificat al analizei deviaţiei pe baza indicelui Poisson de dispersie.
F.2.2 Determinarea repetabilităţii individuale şi globale pentru laboratoare
a] pentru fiecare laborator, se calculează

numărul total de colonii observate

apoi statistic

b] se calculează gradul de libertate (d.f.) asociat cu

c] se realizează comparaţia fiecărei valori observate a x2r-1 cu distribuţia x2 cu p-1
grade de libertate.
d] se calculează pentru fiecare laborator valoarea lui u2:
61
 e] se finalizează calculul statistic global:

f] se calculează gradul de libertate asociat cu T1: q • (p-1).

g] ca anterior, se compară T1 cu distribuţia x2 cu q • (p-l) grade de libertate.
h) în funcţie de poziţia lui T1 in relatie cu limitele teoretice, se determină specificitatea
diferenţei dintre dispersia observată global şi dispersia preconizată de distribuţia
Poisson:

se calculează în final
F.2.3 Determinarea variabilităţii interlaboratory
a) se calculează numărul total de colonii observate (suma tuturor coloniilor de către diferite
laboratoare).

numărul total de colonii observate

apoi statistic
b) se calculează gradul de libertate asociat cu T2: q-1.
c) se compară T2 cu distribuţia x2 cu q-1 grade de libertate.
d) în funcţie de poziţia lui T2 in relatie cu limitele teoretice, se determină semnificaţia
diferenţei dintre dispersia observată şi dispersia preconizată de Distribuţia Poisson:

se calculează
F.2.4 Determinarea valorilor u20,r si u20,R
Folosind valorile generate în F.3.1 si F.3.2 cele două componente ale preciziei pot fi calculate
aşa cum este prezentat în Tabelul F.2.

62
 Tabelul F.2 — Determinarea valorilor u20,r si u20,R

Daca A ≤0 Daca A >0

2 2
Daca B≤0 Se ia u 0,r =0 Se ia u 0,r =A
Se ia u20,R =0 Se ia u20,R =A

Daca B>0 Se ia u20,r =0 Se calculează u20,r =A

Se ia u20,R =B Se calculează u20,R =A+B

Expresia finală a reproductibilităţii interlaborator în % este rădăcina pătrată din u20,R,

multiplicat cu 100.
F.3 Exemplu pentru metoda de numărare a coloniilor
F.3.1 General
A fost organizat un studiu pentru investigarea parametrilor de precizie ai unei noi metode. Zece
laboratoare au participat la testul interlaboratoare. Fiecare laborator a executat două măsurători
în condiţii de repetabilitate. Vezi Tabelul F.3.
Tabelul F.3 — rezultate obţinute într-un experiment interlaboratoare (o
singură probă)

Laborator Masuratori Sumă Medie Variaţie Valoare Variaţie

repetate in aritmetica observată operaţională
fiecare relativă
a
laborator
x1 x2 x1+ x2 x2r-1 u 20
1 51 60 111 56 40,5 0,730 -0,005
2 37 21 58 29 128 4,414 0,118
3 58 63 121 61 12,5 0,207 -0,013
4 57 59 116 58 2 0,035 -0,017
5 35 42 77 39 24,5 0,636 -0,009
6 74 81 155 78 24,5 0,316 -0,009
7 75 73 148 74 2 0,027 -0,013
8 41 47 88 44 18 0,409 -0,013
9 98 81 179 90 144,5 1,615 0,007
10 53 56 109 55 4,5 0,083 -0,017
Sumă - - 1 162 - - T1 = 0,029
Medie - - - - - 8,470
- A = 0.003

F.3.2 Determinarea dispersiei individuale si globale in condiţii de repetabilitate

Primul pas constă în determinarea semnificaţiei variaţiei operaţionale relative pentru fiecare serie
de măsurători repetate, aşa cum este menţionat în F.2.2. Detectarea unui duplicat de laborator
semnificativ diferit de şablonul general poate conduce la investigaţii specifice privind originea
datelor singulare (valori atipice).
Potrivit distribuţiei chi-pătrat, valoarea critică de probabilitate 0,05 pentru (2-1) grade de libertate
este: 3,842.

63
Pentru setul de date prezentat în Tabelul F.3, doar un duplicat al unui laborator prezintă o
valoare mai mare decât valoarea probabilităţii critice de 0,05 (laboratorul 2). Pot fi
realizate investigaţii privind originea acestor date, pentru a evita perpetuarea greşelilor
sau a problemelor tehnice în setul de date.
Un pas statistic suplimentar poate fi reprezentat de compararea valorii x2r-1 observate de
laboratorul 2 cu valoarea probabilităţii critice de 0,01 pentru (2-1) grade de libertate
(6,635).
Întrucât valoarea x2r-1 a laboratorului 2 este mai mică decât valoarea critică 0,01, se poate
considera că dispersia duplicată este doar îndoielnică şi poate fi utilizată pentru alte
calcule.
Al doilea pas este reprezentat de determinarea variaţia operaţională relative globale in
condiţii de repetabilitate.
Suma T1 a valorii observate x2r-1 pentru setul complet de date este calculată cu Formula
(F4). Pentru cele 10 laboratoare, T1 este egală cu 8,470. Gradul de libertate asociat este
de 10 X (2-1) = 10.
Întrucât T1 este mai mic decât distribuţia critică chi-pătrat de 0,05 cu 10 grade de libertate
(18,307), dispersia observată in condiţii de repetabilitate nu este statistic diferita de
dispersia preconizată de Distribuţia Poisson.
Chiar dacă nu este semnificativ statistic, variaţia operaţională relativă medie (A = 0,003)
poate fi utilizata in continuare pentru calcule.
F.3.3 Determinarea dispersiei interlaborator in condiţii de reproductibilitate
Numărul total de colonii observate (1 162) si suma pentru fiecare laborator din Tabelul F.3
sunt utilizate pentru determinarea variaţiei dintre laboratoare.
Valoarea statistică T2 care corespunde contribuţiei fiecărui laborator la variabilitatea
globala este calculată potrivit Formulei (F.7). In cadrul exemplului, T2 este egală cu
105,694. Gradul de libertate asociat este (10-1) = 9.
Întrucât T2 este mai mare decât distribuţia critică chi-pătrat de 0,05 cu 9 grade de libertate
(16,919), dispersia interlaborator observată este statistic diferita de dispersia preconizată
de Distribuţia Poisson.
Componenta estimată a dispersiei interlaborator B este apoi calculată conform Formulei
(F.8). Valoarea corespondentă pentru setul de date prezentat în Tabelul F.3 este 0,093
(vezi F.2.2).
F.3.4 Expresia finală a parametrilor preciziei interlaborator ai metodei
Performanţa metodei poate fi exprimată în funcţie de valorile A si B estimate anterior (vezi
şi F.2.3). As A>0 si B>0 pentru setul dat de date, expresia finală a preciziei fiind:
In condiţii de repetabilitate: u20,r = A = 0,003.
In condiţii de reproductibilitate: u20,R =A + B = 0,096.
Rădăcina pătrată a u20,r (0,055) indică o variabilitate operaţională de 5,5 % (deviaţia
standard operaţională relativă) a metodei în condiţii de repetabilitate, unde Rădăcina
pătrată a u20,R (0,310) indică o variabilitate operaţională de 31,0 % a metodei in condiţii de
reproductibilitate.
F.4 Exemplu pentru o metodă MPN
Un studiu în colaborare a fost organizat pentru evaluarea preciziei unei nou dezvoltate
metode MPN. Au participat 12 laboratoare. Fiecare laborator a executat două măsurări
repetat în condiţii de repetabilitate. Valorile MPN (MPN 1 si MPN2) si limitele de
încredere (T0, T1) sunt prezentate in Tabelul F.4.

64
 Tabelul F.4 — Rezultate MPN într-un experiment interlaborator (o singură
probă)
Laborator Măsurări Limita Limita Limita Limita Suprapunere
repetate în inferioară superioar inferioară superioar a intervalelor
fiecare de ă de de ă de de încredere
laborator încredere încredere încredere încredere in condiţii de
repetabilitate
Ml M2 T0,1 T1,1 T0,2 T1,2
1 981,2 1198,2 604,3 1 593,1 754,0 1 904,0 Da
2 1 247,5 1 154.2 787,9 1 975,3 723,8 1 840,5 Da
3 802,7 1 077,1 480,7 1 340,3 670,7 1 730,0 Da
4 438,5 792,4 232,4 827,4 473,6 1 325,7 Da
5 1013,2 1 043,1 626,4 1 638.6 647,2 1 681,4 Da
6 916,4 1 351,1 559,5 1 501,1 858,6 2 126,0 Da
7 802,7 1 182,1 480,7 1 340,3 743,0 1 880,7 Da
8 744,6 1 247,5 440,6 1 258,3 787,9 1 975,3 Da
9 484.0 619,1 262,7 891,6 354,3 1 081,7 Da
10 1 014,9 1 351,1 627,6 1 641,1 858,6 2 126,0 Da
11 507,3 826,8 278,4 924,4 497,4 1 374,3 Da
12 597.9 583,0 339,8 1 052.0 329,7 1 031,0 Da
Un prim pas constă în verificarea acordului între rezultatele obţinute in condiţii de
repetabilitate pentru fiecare laborator. O suprapunere a intervalelor de încredere ale celor
două măsurări repetate în cadrul laboratorului este un semn cert al repetabilităţii
acceptabile pentru metoda nou dezvoltată.
Când sunt observate unele dezacorduri izolate (intervalul de încredere al M 1 nu se
suprapune intervalului de încredere al M2), se recomandă investigarea apariţiei unei
anomalii sau nu (problem analitică în cadrul unui laborator, condiţii de repetabilitate care
nu au fost acceptate...).
Când apar dezacorduri pentru o parte considerabilă dintre laboratoare, metoda testată
poate fi considerată ca una care nu este ideală în termeni ai repetabilităţii.
Indiferent de caz, o evaluare a dispersiei in condiţii de repetabilitate si reproductibilitate
poate fi efectuată o analiză unilaterală a variaţiei (ANOVA) după transformarea
logaritmică a datelor.
Utilizarea logaritmilor naturali este recomandată întrucât rezultatele pot fi direct
interpretate ca şi variaţii relative. Dacă sunt utilizaţi logaritmi comuni (baza 10), este
necesară o conversie în variaţii relative prin utilizarea unei constante de multiplicare
5,302, aşa cum prevede ISO 29201. Vezi Tabelul F.5.

65
 Tabelul F.5 — Analiză unilaterală a variaţiei [In transformarea MPN)
Sursa Suma Grade de Medie Valoare statistica
dispersiei pătratelor libertate

Ss DF Ms F
Intre Ss,1 = 1,920 (q-1) = 11 Ms,1 = 0,175 F1/3 = (Ms,1/Ms,3) = 2,917
laboratoare
In laboratoare Ss,3 = 0,716 q(p-l) = 12 Ms,3 = 0,060
(replici)

Total Ss,T = 2,636 (qp-1) = 23

Valoarea critică a lui F corespunzând la un nivel semnificativ de 5 % pentru grade de

libertate 11 si 12 este de 2,717. Valoarea observată a lui F este mai mare decât valoarea
critică. Astfel, eroare interlaborator este semnificativă statistic.
Potrivit ISO 5725-2[3], estimările S2R = S2L + S2r unde S2L este variaţia ca urmare a erorii
interlaboratoare i (eroare sistematica) si S2R este variaţia erorii de măsurare.
S2R =Ms,3 = 0,060
S2R = (Ms,1 - Ms,3)/p = (0,175 - 0.060)/2 = 0,058
S2R = S2L + S2r = 0,058 + 0,060 = 0,118
Întrucât sunt utilizaţi logaritmi naturali, S2r corespunde variaţiei relative in condiţii de
repetabilitate si S2R este variaţia relativă in condiţii de reproductibilitate.
Variabilitatea intrinsecă a rezultatelor MPN (numită şi incertitudine a distribuţiei relative) este
calculată din limita superioară şi inferioară de încredere potrivit ISO 29201. Vezi Formulele
(F.9) si (F.10) si Tabelul F.6.

66
 Tabelul F.6 — Calculul variabilităţii intrinseci a rezultatelor MPN

Laborator Variabilitate Variabilitate Variabilitate

intrinsecă intrinsecă intrinsecă medie
pentru prima pentru a doua
replică replică
u2d1 u2d2 u2d
1 0,061 0,056 0,058
2 0,055 0,057 0,056
3 0,068 0,058 0,063
4 0,105 0,069 0,087
5 0,060 0,059 0,060
6 0,063 0,053 0,058
7 0,068 0,056 0,062
8 0,072 0,055 0,063
9 0,097 0,081 0,089
10 0,060 0,053 0,057
11 0,094 0,067 0,080
12 0,083 0,085 0,084
Mean 0,068
Media pentru u2d este utilizată pentru determinarea a u20,r . si u20,R prin scădere:

Variaţia operaţională relativă in condiţii de repetabilitate este diferenţa dintre variaţia

relativă S2r si variabilitatea intrinseca medie a rezultatelor MPN: u20,R = 0,060 - 0,068 =
-0,008.

In condiţii de repetabilitate, variaţia operaţională relativă of metodei MPN este aproape de

zero. Suprapunerea intervalelor de încredere ale tuturor laboratoarelor a fost o bună
dovadă a dispersiei ideale în condiţii de repetabilitate. In acest exemplu, expresia finală
poate fi u0 ≈ 0%.
Variaţia operaţională relativă in condiţii de reproductibilitate este u20,R = 0,118 - 0,068 =
0,050. Rădăcina sa pătrata corespondentă lui u0,R (0,224) indică o variabilitate
operaţională de 22,4 % (deviaţia standard relativă) a metodei in condiţii de
reproductibilitate.

67