CHIMIE ANALITICĂ ŞI

INSTRUMENTALĂ II

METODE DE SEPARARE
 Clasificarea metodelor de separare
Separarea reprezintă operaţia prin care un amestec este divizat în două
sau mai multe fracţiuni cu compoziţii diferite. Scopul acestei operaţii este
de a concentra un component în raport cu alţi componenţi ce fac parte din
matricea probei.

Metodele de separare și purificare se aplică unei matrice a probei:

► la scară de laborator : metode analitice și preparative
► la scară industrială

După separare urmează detecția (analiza calitativă) și apoi determinarea

cantitativă.
Clasificarea metodelor de separare
Metodele de separare pot fi grupate în diferite categorii având în
vedere procesele de bază :

A.Metode de separare bazate pe echilibrul între faze

B.Metode de separare bazate pe viteza de transport

C.Metode de separare bazate pe natura procesului

 Clasificarea metodelor de separare
A. Metode bazate pe echilibrul dintre faze

►Echilibrul gaz-lichid
● Absorbţia
● Distilarea
● Cromatografia gaz-lichid
● Fracţionarea spumelor

► Echilibrul gaz-solid
● Adsorbţia
● Sublimarea
● Cromatografia gaz-solid

► Echilibrul lichid-lichid
● Extracţia lichid-lichid
● Flotaţia ionică

► Echilibrul lichid-solid
● Precipitarea
●Topirea zonală
● Cristalizarea fracţionată
● Schimbul ionic
● Adsorbţia
● Extracţia solid-lichid
 Clasificarea metodelor de separare
B. Metode de separare bazate pe viteza de transport
În aceste procese sunt implicate proprietăţile cinetice ale componenţilor din
amestec. Aceste metode includ vitezele de transport prin membrane, vitezele de
migrare în câmp electric, magnetic, gravitaţional sau termic.

►Separare bazată pe câmpuri

● Electroforeza
● Ultracentrifugarea
● Termodifuziunea
● Spectrometria de masă

►Separare bazată pe membrane

● Ultrafiltrarea
● Electrodializa
● Osmoza inversă
● Electroosmoza
● Distilarea osmotică
 Clasificarea metodelor de separare
C. Metode de separare bazate pe natura procesului
► Mecanic (forţa motrice este fizică-presiunea sau forţa centrifugă)
● Filtrare
● Centrifugare
► Fizic (forţa motrice este diferenţa între p.t, p.f. sau sublimare)
● Distilarea
● Vaporizarea
● Sublimarea
● Condensarea
● Uscarea
● Cristalizarea
► Chimic
● Precipitare
● Hidratare / solvatare
● Complexare
 Clasificarea metodelor de separare
De asemenea, după ce componenţii din amestec au fost separaţi se alege
metoda de determinare cea mai adecvată dintre următoarele metode:

1. Fizice
► Optice: emisie, RMN, infraroşu, vizibil, ultraviolet, raze X, fluorescenţă,
absorbţie atomică ;
► Electrice: polarografie, conductivitate, potenţial, cronopotenţial;
► Alte tipuri: radioactivitate, refractometrie, densitate, conductibilitate
termică ;

2. Chimice
► Titrimetrice: acido-bazice, redox, precipitare, complexometrice
► Electrometrice: amperometrie, potenţiometrie, coulometrie
► Alte tipuri: gravimetrie, analiza de gaze, cinetice ;
 Clasificarea metodelor de separare

• Separarea ca şi concentrarea sunt modalităţi de prelucrare a probelor

şi se includ în schema generală a unui proces analitic de măsură.

• Prelucrarea probelor prin proceduri de separare este precedată şi

influenţată de prelevarea acestora şi urmată de analiza propriu-zisă.

• Un rol important în dezvoltarea şi optimizarea acestui proces îl au

dependenţele dintre parametrii unei etape şi informaţia obţinută din
proces.
 Clasificarea metodelor de separare
Reprezentarea etapelor unui proces analitic de măsură
 Clasificarea tehnicilor de separare
Separarea pe bază de Tehnica de separare
Mărime Filtrare, Dializă, Excluziune
spațială
Masă și densitate Centrifugare

Schimbare a proprietăților Distilare, Sublimare,

fizice Recristalizare
Schimbare a proprietăților Precipitare, Schimb ionic,
chimice Volatilizare, Electrodepunere

Partiție între faze Extracție, Cromatografie

 Caracteristicile metodelor de separare
Metodele de separare pot fi caracterizate prin următorii parametri:
► Adaptabilitate: capacitatea metodei de separare de a putea fi aplicată
unor componenţi cu proprietăţi cât mai variate: volatili, nevolatili,
macromolecule. O metodă este cu atât mai adaptabilă cu cât poate fi
aplicată la separarea unor amestecuri cu proprietăţi cât mai variate.
► Capacitatea de încărcare: cantitatea maximă dintr-un amestec ce poate
fi separată cu eficienţă bună printr-un singur proces.
► Capacitatea de fracţionare a unui proces de separare: numărul maxim
de componenţi ce pot fi separaţi printr-o singură operaţie.
► Selectivitatea: capacitatea intrinsecă a unei metode de separare de a
distinge doi componenţi pe baza unor fenomene fundamentale fizico-
chimice.
► Viteza de separare şi aparatura utilizată sunt parametri ce au un rol
important mai ales în lucrările de laborator, de rutină. Se preferă metodele
rapide şi care nu necesită o aparatură sofisticată şi un preţ de achiziţionare
foarte mare.
 Separarea analiților din matrice
Matricea (compoziţia) unei probe este alcătuită din:
► analiți
► interferenți

Obiectivul separării: eliminarea analitului sau interferentului din matrice.

Interferentul trebuie eliminat dacă acesta are o contribuție însemnată la

semnalul măsurat.

Observații
- eliminarea interferentului poate duce și la pierderea de analit;
- reducerea pierderii analitului poate conduce la regăsirea unei părți din
interferent
 Eficiența separării
Eficiența separării este determinată de regăsirea analitului și
eliminarea interferentului :

R = C x Vfinal/C0 x Viniţial,

unde:
R = regăsirea sau randamentul de regăsire
C = concentrația după separare
C0 = concentrația inițială
 Eficiența separării

Totuşi, eficiența separării poate induce o eroare relativă de aceea se

poate scrie:

Esep = (Sprobă - S*probă) / S*probă ,

unde:
Sprobă = semnalul real

S*probă = semnalul pentru o regăsire completă

 Tehnici de separare
FILTRAREA
● utilizează ca mediu de filtrare: hârtia de fitru, creuzetul filtrant
● viteza de filtrare depinde de dimensiunea porilor mediului de filtrare
Ex. viteză rapidă = d > 20-25μm
viteză scăzută = d > 2-3 μm
 Tehnici de separare
Dializa
-utilizează membrane semipermeabile confecționate din celuloză cu
dimensiunea porilor de 1-5nm
 Tehnici de separare
Centrifugarea
-se utilizează în cazul suspensiilor;
-se bazează pe viteza diferită de sedimentare sub acțiunea unei viteze unghiulare;
-se utilizează în special în separările biochimice
Distilarea
-se bazează pe diferențe între punctele de fierbere;
 EXTRACȚIA
Extracția

► Se bazează pe principiul partiției diferite a analitului și/sau

interferenților între două faze nemiscibile.

► Funcție de natura fazelor se clasifică:

● lichid-lichid,
● lichid solid,
● gaz-solid, etc.

Exemplu: în extracția lichid-lichid, avem 2 faze

lichide nemiscibile, prin agitare se separă
faza mai densă la partea inferioară a unei
pâlnii de separare,
 EXTRACȚIA
Extracția în fază solidă
 EXTRACȚIA
Extracția în mod continuu
-este utilizată în cazul în care analitul are un coeficient
de partiție nefavorabil în faza de extras;
-conduce la randamente superioare de extracție.
Exemple:
• Soxhlet
• Microunde
• Fluide supercritice
 EXTRACȚIA

• Procesul de extracţie este un proces reversibil ce atinge un

echilibru, numit şi repartiţie sau distribuţie între două faze.

• Dacă cele două faze sunt lichide, atunci acestea sunt nemiscibile
între ele, iar extracţia se numeşte lichid-lichid.

• Specia chimică asupra căreia se acţionează în acest proces se

numeşte analit.

• Dintre aplicaţiile analitice ale extracţiei lichid-lichid, cele mai

importante se referă la cazul în care unul dintre lichide este apa sau
o soluţie parţial apoasă.
 EXTRACȚIA
Funcţie de procedeul experimental, extracţiile lichid-lichid pot fi:
• simple, efectuate în una sau mai multe etape (extracţii repetate); atunci
când randamentul de extracţie este mic, faza în care se găsesc analiţii de
interes este supusă unei noi operaţii de extracţie, în final cumulându-se
volumele de extractant;
• complexe, prin care extracţia este combinată cu alte operaţii analitice, cum
ar fi distilarea, vaporizarea, centrifugarea; de asemenea, membranele
lichide se bazează, în principiu, pe trei faze lichide nemiscibile; unele
procedee de derivatizare chimică sunt bazate pe reacţii chimice care au loc
la interfaţa dintre cele două straturi nemiscibile;
• efectuate în varianta statică sau dinamică (în care fazele sunt în mişcare,
ce poate fi în aceeaşi direcţie sau în contra-curent);
• bazate pe un volum de extractant de la ordinul sutelor de mL până la
extracţii într-o singură picătură de extractant (micro-extracţie), suspendată
de capătul acului unei seringi.
 CROMATOGRAFIA
• Separarea cromatografică are la bază interacţiunea diferenţiată a
componenţilor unei probe faţă de două faze, numite: faza staţionară şi faza
mobilă (aflată în mişcare faţă de faza staţionară).

• Procesul se petrece într-o coloană cromatografică, sau pe suprafaţa plană a

unei plăci pe care este depusă faza staţionară.

• Analiza cromatografică este un proces cuplat între separarea cromatografică

şi determinarea (detecţia) compuşilor separaţi (proces care se bazează pe
măsurarea unei proprietăţi fizice).

• Separările cromatografice pot fi clasificate fie din punct de vedere al naturii

celor două faze (staţionară şi mobilă), fie din punct de vedere al mecanismului
de separare, fie din punctul de vedere constructiv al ansamblului de faze.
 CROMATOGRAFIA
• Din punct de vedere al naturii celor două faze distingem următoarele clase
de separări cromatografice:

► Cromatografie de gaze (GC) în care faza mobilă este un gaz inert; în

funcţie de natura fazei staţionare se disting următoarele tehnici gaz-
cromatografice:
a) separarea gaz-lichid în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza
staţionară este un „lichid”, depus pe un suport inert, sau pe peretele unei
coloane cromatografice;
b) separare gaz-solid (SGC), în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza
staţionară este un solid;

► Cromatografia de lichide (LC), în care faza mobilă este un lichid, iar

faza staţionară este de regulă un solid;

► Cromatografie în fluide supercritice (SFC), în care faza mobilă este un

fluid supercritic.
 CROMATOGRAFIA
Mecanismul care stă la baza de separării cromatografice se poate baza pe: 1)
adsorbţie; 2) repartiţie; 3) schimb ionic; 4) excluziune sterică, etc.

Procesele cromatografice pot decurge şi printr-o combinaţie a acestor

mecanisme.
Funcţie de mecanismul de separare, cromatografia de lichide (în care
polaritatea şi hidrofobicitatea analiţilor, a fazei staţionare şi a fazei mobile joacă
un rol determinant) se împarte în trei variante:
► cromatografia de lichide în faza normală (denumită aşa mai degrabă din
punctul de vedere istoric), în care faza staţionară este polară, iar faza
mobilă este nepolară;
► cromatografia de lichide în faza inversă, în care faza staţionară este
nepolară şi hidrofobă, iar faza mobilă este polară.
► cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic, în care faza
staţionară este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu pH
controlat.
 CROMATOGRAFIA
Cromatografia poate fi împărţită în următoarele domenii generale:
1.Cromatografia de adsorbţie
2.Cromatografia de repartiţie
3.Cromatografia de excludere
4.Cromatografia de schimb ionic
Repartiţia poate fi realizată: pe hârtie (cromatografia pe hârtie), într-o
coloană (repartiţia pe coloană, faza inversă şi cromatografia de gaze)
sau în strat subţire (cromatografia în strat subţire). Principiul
fundamental al repartiţiei este acelaşi în toate aceste cazuri. Diferenţa
constă în maniera în care este efectuată repartiţia .
• Toate procedeele cromatografice implică o fază mobilă care trece
peste o fază staţionară. Aşadar solutul este distribuit între cele 2
faze, motivul particular pentru modul în care are loc distribuţia
reprezentând cheia sistemului cromatografic .
 CROMATOGRAFIA
Principiul
-trecerea continuă a unei faze mobile peste o fază
fixă (staționară);
-proba care conține componenții de separat se
introduce în faza mobilă;
-are loc o distribuție continuă a componenților între
faza mobilă și cea staționară;
-fiecare component are un coeficient propriu de
distribuție între faze, acesta contribuind la
separarea componenților datorită vitezelor
diferite de migrare.
 CROMATOGRAFIA
Clasificarea metodelor cromatografice:
-funcție de natura fazelor;
-funcție de mecanismul de separare (adsorbție,
repartiție, schimb ionic, excludere);
-după modul de contact dintre faza mobilă și cea
staționară:
-cromatografia pe coloană
-cromatografia planară: pe hârtie, pe strat
subțire
 Parametrii unei separări cromatografice

• Cromatograma reprezintă dependenţa în timp a proprietăţii

măsurate de detectorul sistemul cromatografic.

• Intr-o cromatogramă întâlnim picuri cromatografice şi o linie de bază

(constantă sau variabilă).

• O separare cromatografică a unui amestec de n componenţi trebuie

să conducă la o cromatogramă cu n picuri cromatografice.

• Semnalul cromatografic este numit pic cromatografic, a cărui

formă redă de fapt o imagine a echilibrelor de distribuţie ale
moleculelor de analit între faza mobilă şi faza staţionară, care se
petrec în coloana cromatografică.
 Parametrii unei separări cromatografice

• Graficul redă cromatograma HPLC a unei probe conţinând 14 hidrocarburi

aromatice polinucleare în acetonitril.

• După cum se
observă, numărul de
picuri cromatografice
este egal cu 14; dintre
acestea doar picurile
10 şi 11 nu sunt
perfect separate
în linia de bază.
 Parametrii unei separări cromatografice

Parametrii unui pic cromatografic ideal (de formă Gauss)

 Parametrii unei separări cromatografice

• In practică, integrarea picurilor se face în mod automat cu ajutorul unui

soft al sistemului de achiziţie şi prelucrare a datelor cu care este dotat
sistemul cromatografic, fiind precizată aria minimă a pic-ului ce poate fi
măsurată.
• Sub această limită picurile cromatografice din cromatograma
înregistrată nu vor fi raportate de către soft-ul sistemului de achiziţie şi
prelucrare a datelor. Integrarea se poate face şi manual de către
analist.
• Problema alegerii liniei de bază („baseline”), faţă de care se va face
integrarea, este dificilă atunci când picurile cromatografice se apropie
ca mărime de semnalele din linia de bază (analitul se găseşte în proba
injectată la limita de detecţie a detectorului cromatografic).
• In acest caz, analistul trebuie, într-o bună aproximaţie vizuală, să
stabilească media semnalului de bază faţă de care se vor alege
punctele X şi Y în care se va integra picul cromatografic.
 Parametrii unei separări cromatografice

O porţiune dintr-o cromatogramă în care picul cromatografic este corect integrat

prin alegerea punctelor X şi Y în linia media a semnalului de bază (ales
neconstant – cu drift).
Schema de principiu a cromatografului
Cromatograful se compune din:
-sursă de eluent
-dispozitiv de introducere al probei,
-coloană
-detector,
la care se adaugă următoarele anexe: dispozitiv de
măsurare şi reglare a debitului, instrument de
înregistrare a semnalului furnizat de detector.
Coloana cromatografică este sediul procesului de
separare.
Schema de principiu a cromatografului
Componentele amestecului separat vor ieşi din
coloană la timpuri diferite, după care sunt
introduse de eluent în detector. Acesta
transformă diferenţa unei proprietăţi fizice
între component şi eluent, într-un semnal
electric, proporţional cu concentraţia
componentului din eluent.
Înregistrarea grafică a semnalului detectorului
funcţie de timp, se numeşte cromatogramă.
Schema de principiu a cromatografului
Schema de principiu a cromatografului
• Timpul la care apare maximul unui pic,
măsurat din momentul introducerii probei se
numeşte timp de reţinere sau retenţie şi este
o caracteristică calitativă a componentului
respectiv. Se notează cu tR
• Înălţimea picului h sau aria lui, A, sunt
caracteristici cantitative, proporţionale cu
cantitatea componentului din probă.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBȚIE
-Rezultă din interacțiunea grupărilor funcționale polare
ale solutului cu zone ale suprafeței adsorbante;

-Solutul este adsorbit funcție de configurația spațială a

funcțiunilor și abilitatea de a forma legături de
hidrogen;

-Este caracteristică cromatografiei în strat subțire.

 CROMATOGRAFIA DE REPARTIȚIE
• Are ca principiu repartiția solutului între două lichide
nemiscibile;
• Este caracteristică cromatografiei pe hârtie și cromatografiei
clasice pe coloană;
• Cromatografie de repartiţie directă (sau cu faze normale -
clasică); faza staționară este un lichid polar iar faza mobilă
este un solvent nepolar
• Cromatografia de repartiţie cu faze inversate, unde faza
staționară este lichid nepolar iar cea mobilă este un amestec
de solvenți polari.
 CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC
• Separarea se bazează pe afinitatea diferită a unei faze
staționare ionice (schimbători de ioni) față de ionii solutului;

 Rășini cationice:
Matrice–A- Y+ + M+ → Matrice-A- M+ + Y+

 Rășini anionice:
Matrice–A+ Y- + X- → Matrice–A+ X- + Y-

Observație: condiția pentru schimbul ionic este ca ionul Y să fie

mai puțin atras de rășină față de ionii solutului
 Procesul cromatografic pe coloană
Conține mai multe etape:
● se introduce proba sub forma unei bande înguste;
● componenții migrează sub
acțiunea fazei mobile;
● componenții se separă
funcție de interacțiunea
cu faza staționară
 CROMATOGRAFIA PLANARĂ

• Faza staționară este planară;

Tipuri de cromatografie planară:
 Pe hârtie
 Pe strat subțire
• Probele sunt aplicate pe faza staționară;
• Separarea în spațiu, developare

Avantaje: simplitate, cost redus, se pot efectua analize simultane

 Cromatografia pe hârtie
• Folosește ca suport pentru faza staționară →hârtia
cromatografică, confecționată din celuloză pură și
caracterizată de: grosime, greutate pe unitatea de
suprafață,
• Mecanismul de separare este predominant
repartiția;
• Faza mobilă este un amestec de faze organice, apă,
aditivi;
• Faza staționară este adsorbită pe hârtie
Observație: necesită atmosferă saturată pentru evitarea
volatilizării fazei staționare
 Cromatografia pe strat subțire

• Operațiile de bază sunt:

-selectarea fazei staționare;
-aplicarea probelor;
-selectarea fazei mobile;
-developarea;
-vizualizarea și detecția;
-analiza cantitativă
 Cromatografia pe strat subțire
• Pentru a se putea demara procesul de eluţie, în prealabil pe placa
cu strat subţire se aplică proba.

• Acest lucru se realizează cu seringi sau micro-pipete, astfel încât să

se obţină aliniate, pe linia de start mai multe spoturi de probe,
respectiv de amestecuri etalon - supuse simultan separării.

• Întrucât probele se aplică din soluţii diluate (1-2%), în anumiţi

solvenţi, pentru a se evita interferenţa acestora în procesul de eluţie,
plăcile se usucă înainte de introducerea în amestecul de solvenţi.
 Cromatografia pe strat subțire
• Migrarea eluentului are loc sub acţiunea forţelor capilare şi provoacă
migrarea diferenţiată a componentelor amestecului de separat, în
urma simplei scufundări (manuale) a plăcii cromatografice în
eluentul potrivit. Din acest moment, eluentul irigând prin capilaritate
stratul poros, migrează ascendent prin stratul subţire, provocând
separarea. Timpul de separare variază între 3 şi 60 min.
• După eluţie, placa se scoate, se usucă şi dacă spoturile nu se văd,
se trece la vizualizarea acestora (operaţie numită developare).
Pentru aceasta, placa fie se scufundă într-un reactiv, fie se
pulverizează cu acesta. Prin examinarea cromatogramelor eluate şi
uscate în lumină UV, se vor observa spoturi închise la culoare sau
colorate, pe fond fluorescent - luminos.
 Cromatografia pe strat subțire
Placa cromatografică și pozițiile relative ale spoturilor
 Moduri de developare
• Developarea unidimensională;
• Developarea bidimensională (eluare cu un amestec de doi solvenți,
după o primă rotire a plăcii cromatografice cu 90⁰;

Calculul Rf

Rf = a/b ≤ 1,

unde
Rf = parametru de retenție
a = distanța parcursă de analit
b = distanța parcursă de solvent (faza mobilă)
 Cromatografia de gaze
• Procesul de separare cromatografică se desfăşoară în coloana cromatografică.
Coloanele în cromatografia de gaze pot fi clasificate în următoarele tipuri:

1) Coloane umplute, în care umplutura este reprezentată de către faza staţionară

depusă pe un suport inert, iar materialul astfel rezultat este introdus mecanic într-o
coloană (metalică sau silice topită, cu diametrul de ordinul mm şi lungimea de până la
1m).

2) Coloane capilare (WCOT – „wall coated open tubular”) având pe peretele interior un
film lichid imobilizat, cu grosime de strat între 0,1 şi 5 μm (de regulă 0,25 μm).
Coloanele capilare sunt construite din silice topită sau borosilicat, acoperite la exterior
dintr-un strat protector de polimer. Lungimea acestora este de până la 100 m, iar
diametrul interior între 0,05 – 1 mm. Eficienţa acestora este foarte mare, separările
cromatografice pe astfel de coloane atingând 5.000-10.000 talere/m lungime de
coloană.

3) Coloane capilare având pe peretele interior depus un strat cu grosimea de cel

mult 30 μm, alcătuit din particule ale unui suport inert (de exemplu, pământ diatomeic)
pe care este depusă faza staţionară propriu-zisă dată de un film lichid cu grosimea de
maximum 1 μm (SCOT – „support-coated open tubular”).
 Cromatografia de gaze
Secţiunea printr-o coloană de tip WCOT şi SCOT
 Cromatografia de gaze
• Un cromatograf de gaze are trei componente principale: injectorul,
camera de termostatare a coloanei cromatografice şi sistemul
de detecţie (unul sau mai mulţi detectori). Acestora li se alătură
sursa de gaz purtător pentru realizarea fazei mobile a separării
prin GC.

• Injectorul permite plasarea probei în capătul coloanei, într-o zonă

cât mai îngustă. Proba în GC poate fi gazoasă sau lichidă; atunci
când proba este lichidă, componenţii probei trebuie să fie volatili şi
stabili termic la temperatura injectorului, precum şi pe intervalul de
temperatură în care se face separarea cromatografică (domeniul de
temperatură obişnuit pentru separările GC este 20 - 400°C).
 Cromatografia de gaze
Reprezentarea schematică a structurii unui cromatograf de gaze + anexe
 Cromatografia de gaze
• Faza mobilă în GC trebuie să fie inertă din punct de vedere chimic,
de puritate înaltă (fără urme de apă sau oxigen), compatibilă cu tipul
de detecţie aplicat şi convenabilă din punct de vedere al costului.

• Faza mobilă în GC mai este cunoscută şi ca gaz purtător, putând fi

H2, N2, He sau Ar; gazul purtător poate fi produs de un generator de
gaz (H2 sau N2), sau se găseşte stocat în cilindri metalici, de unde
este adus cu un debit controlat de un reductor de presiune în
sistemul cromatografic.

• Uneori debitul gazului purtător este prea mic faţă de volumul

detectorului (în special când se folosesc coloane capilare), iar în
acest caz se suplimentează necesarul cu un debit de aşa-numit
„make-up gas”.
 Cromatografia de gaze
• Incinta termostatată (cuptorul) asigură regimul termic în coloana
cromatografică. Temperatura fiind un parametru esenţial în
separarea GC, trebuie să fie uniformă pentru toată lungimea
coloanei; fluctuaţii de temperatură influenţează procesul de retenţie
cromatografică şi astfel exactitatea timpilor de retenţie ai analiţilor
din probă, conducând în unele cazuri chiar la splitarea picurilor
cromatografice.
• Instrumentele GC asigură ajustarea rapidă şi controlul temperaturii
într-un interval de 50-450°C. Operarea în regim termic subambiental
presupune utilizarea unui sistem criogenic de răcire, bazat pe N2
sau CO2 lichid.
• Sistemul de achiziţie şi prelucrare a datelor este utilizat şi pentru
programarea unor parametri ai separării (regimul de temperatură)
sau parametrii sistemului de detecţie. Cromatograma poate fi văzută
în timp real, iar gradul de prelucrare a acesteia depinde de
complexitatea softului cu care este dotat calculatorul sistemului.
 Cromatografia de gaze - aplicaţii
• Solvenţii reziduali din probele farmaceutice sunt monitorizaţi cu
ajutorul cromatografiei de gaze (GC), fie prin detectare de ionizare
cu flacără (FID) sau cu spectrometrie de masă.

• În general, metodele GC au fost elaborate pentru a monitoriza

solvenţi de rutină utilizaţi în procesul de sinteză a medicamentelor.

• Solvenţii sunt de obicei folositi în procesul de sinteză a

medicamentelor.

• Aceşti solvenţi din proces nu pot fi eliminati complet prin bunele

practici de fabricaţie practicate cum ar fi congelare-uscare sau
uscarea, în vid, la temperaturi ridicate.
 Cromatografia de gaze - aplicaţii
• Unii solvenţi sunt cunoscuti ca toxici, subliniind astfel, importanţa
limitării prezenţei solvenţiilor reziduali la un nivel minim.
• Conţinutul de solvenţi organici reziduali în produsele farmaceutice
este de obicei măsurat prin cromatografie în fază gazoasă (GC).
Aplicaţiile de rutină prin GC includ:
• analiza probelor cu ingrediente farmaceutice active şi intermediari
lor conform laboratoarelor şi bunelor practici de fabricaţie,
• testarea în proces a solvenţilor reziduali la optimizarea procedurilor
de uscare.
• metode de determinare ale antioxidantilor.
• analiza substantelor biologic active folosite ca aditivi, suplimente
alimentare.
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) acoperă azi,
în proporţie aproximativ 80%, analiza substanţelor organice, organo-
metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte polari sau labili termic
precum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau
sintetici) iar împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct
de sprijin important în analizele chimice moderne.
• Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin
faptul că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă,
cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi analize uneori
imposibil de realizat prin alte tehnici.
• Cuplajul cu spectrometria de masă a transformat, în ultimul timp,
această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor
moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care
se sprijină chimia sintetică actuală şi pe care s-au dezvoltat
biochimia şi biotehnologia modernă.
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• HPLC, folosește o coloană încărcată cu diferite
materiale (faza staționară), o pompă ce împinge
faza(ele) mobilă(e) prin coloana și un detector
care măsoară timpul de retenție ale moleculelor.

• Timpul de retenție depinde de interacțiunea

dintre faza staționară, moleculele de analizat și
solvenții utilizați.
Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• Pompa este considerată una dintre cele mai importante componente
ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al
eluentului prin întreg sistemul: injector, coloană, detector, mărind
deosebit de mult viteza separării.
• Într-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe,
fiecare furnizând o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca.
200atm).
• Presiunea deosebită este necesară deoarece coloana are o
umplutură de fineţe mare şi în lipsa presiunii, debitul ar fi extrem de
mic.
• Există două tipuri principale de pompe, clasificate astfel în funcţie de
debit: pompe cu presiune constantă (şi debit variabil) şi pompe cu
debit constant.
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• Pompele cu presiune constantă sunt mai simple (si ieftine) şi nu
prezintă pulsaţii în funcţionare (care nu ar permite obţinerea unei linii
de bază netede). Prezintă dezavantajul că debitul trebuie frecvent
modificat pentru a se menţine cât mai constant, ceea ce la separări
de durată pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor
debitul se modifică continuu.
• Astfel că orice modificare de debit (datorită viscozităţii sau
temperaturii eluentului şi a structurii umpluturii) afectează timpul de
retenţie şi totodată semnalul detectorilor, în majoritate sensibili la
concentraţie.
• Pompele cu debit constant nu prezintă dezavantajele de mai sus.
De-a lungul timpului s-au selecţionat două variante: pompele cu
piston (alternative) şi pompele de tip seringă (cu deplasare pozitivă).
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• La pompele cu piston (cele mai utilizate), mişcarea pistoanelor şi a
supapelor cu bilă permit o funcţionare indefinită dar presupun
existenţa unor atenuatoare de pulsaţii - dispozitive care să elimine
micile variaţii de debit. Ele constau dintr-o alternanţă de mai multe
rezistenţe, de exemplu tuburi subţiri şi pot fi incinte cu pereţi elastici,
manometre.
• Pompele cu presiune constantă, asemănătoare cu o seringă dar
având o capacitate mai mare, pompează continuu pe toată durata
separării, pistonul deplasându-se cu o viteză liniară constantă dar
după fiecare cursă este necesară oprirea debitului şi reumplerea cu
solvent a corpului pompei.
• Solvenţii utilizaţi se degazează pentru reducerea efectelor corozive
ale O2, datorită presiunilor ridicate la care se lucrează. De aceea
aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile şi supapele) se execută
din materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje
speciale.
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
• Se cunosc până în prezent mai multe mecanisme de separare prin
coloane, care depind mult de fazele mobilă şi staţionară. Mai exact,
depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazează
retenţia diferenţiată şi separarea.
• Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, după mecanismele principale
amintite, astfel: de adsorbţie, de repartiţie, ionică şi de excluziune
sterică.
• Se disting două moduri de realizare a cromatografiei de repartiţie:
÷ Cromatografie de repartiţie directă (sau cu faze normale - clasică);
÷ Cromatografia de repartiţie cu faze inversate - metoda preferată
actual
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)

• În cromatografia de repartiţie directă faza staţionară este formată

dintr-un lichid polar iar faza mobilă dintr-un solvent organic nepolar

• În cromatografia de repartiţie cu faze inversate, situaţia se

inversează: lichidul imobil este nepolar iar faza mobilă este un
amestec de solvenţi polari.

• De exemplu, una dintre cele mai răspândite faze inversate este cea
staţionară - silicagel, iar cea mobilă - un amestec apă, metanol,
acrilonitril (sau tetrahidrofuran).
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
Separarea unor pesticide prin HPLC
1. Izoproturon 17. Atrazin
2. Profam 18. Carbaril
3. Propazin • Coloană: Supelcosil (SiO2)
4. Terbutilazină • Granulaţia: 5μm, t = 40°C;
5. Linuron • Eluent: 10 până la 90%
6. Propanil acetonitril în apă 0.5%/min;
7. Prometrin • Detector: UV la 225nm;
8. Fenamifos • Debit: 1mL·min–1
9. Fenitrotion
10. Cafeină
11. Metamitron
12. Fenuron
13. Metoxuron
14. Simazin
15. Bromacil
16. Cianazin
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
Analiza unor medicamente antiaritmice prin HPLC

Absorbanţa
[mAU]

1. Procainamidă
2. N-acetil-procainamidă
3. Chinidină
4. Hidrochinidină
5. Disopiramidă

Timp [min]
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
Analiza unor medicamente antiastmatice prin HPLC

Absorbanţa
[mAU]

1. Teobromină
2. Teofilină
3. Enprofilină
4. Cafeină

Timp [min]
 Cromatografia de lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
Analiza unor medicamente sedative prin HPLC

Absorbanţa
[mAU]

1. Oxazepam
2. Clonazepam
3. Flunitrazepam
4. Diazepam

Timp [min]