Acizi nucleici- Structura acizilor nucleici.

Structura ADN
Introducere

• Acizii nucleici sunt produși de policondensare a nucleotidelor

• Au rolul de a păstra și mijloci transferul de informație genetică în lumea vie

• Dogma centrală a biologiei moleculare:

r
epl
ica
re
r
eve
rs
tr
ans
cr
ie
re
A
DN A
RN
m P
r
ote
in
ã
t
ran
sc
ri
ere t
rad
uc
er
e
• Se cunosc 2 clase de acizi nucleici:

– Acid dezoxiribonucleic (ADN)

– Acid ribonucleic (ARN)

• ADN conține informația genetică cu privire la biosinteza proteinelor (la om 50 000-100 000
proteine); are rolul de a stoca și transmite această informație la generația următoare

• ARN îndeplinește diverse funcții în procesul de biosinteză a proteinelor:

– ARNm –ARN mesager, transportă informația genetică din nucleu la ribozomi

– ARNt – ARN de transport, transportă aminoacizii necesari biosintezei proteice

– ARNr –ARN ribozomal, este component esențial al ribozomilor

Structura acizilor nucleici

• Pentoză – D-b-riboză (în ARN) sau D-b-dezoxiriboză (în ADN)

• Baze azotate – molecule plane, relativ insolubile în apă, având un maxim de absorbție în UV
între 252-271 nm.

– Purinice (derivați ai purinei): adenina (6-amino-purina), guanina (2-amino-6-hidroxi-

purina)

– Pirimidinice (derivați ai pirimidinei): citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina), timina

(2,4-dihidroxi-5-metil pirimidina sau 5-metil uracil; se găsește numai în ADN) și
uracilul ( 2,4-dihidroxi-pirimidina; se găsește numai în ARN)

• Acid fosforic
6 5 4
7
1N N 3N 5
8
2 2 6
N 4 N
H9
N
3 1

Purinã Pirimidinã

NH2 O

N N
N HN

N N H2N N N
H H

Adeninã Guaninã

NH2 O O
CH3
N HN HN

O N O N O N
H H H

Citozinã Uracil Timinã

 Baze azotate

• Prezintă tautomerie:

– Lactam-lactim; structurile lactam sunt mai stabile

– Amino-imino (cele care nu conțin grupări hidroxil); structurile amino sunt mai stabile

O O
H

N
H
C CN

f
o
rma
l
ac
ta
m f
o
rma
l
ac
ti
m
(
ma
is
t
ab
i
lã
)

N
H2
N
H
NC N
HC

f
o
rma
am
in
o f
o
rma
i
mi
no
(
ma
is
t
ab
i
lã
)

Nucleozide

• Rezultă prin stabilirea unei legături N-glicozidice între hidroxilul glicozidic de la C 1’ al

pentozei și atomul de N din poziția 9 a unei baze purinice, sau atomul de N din poziția 1 a
unei baze pirimidinice

Ribonucleozide

NH2 O NH2 O

N N N HN
N HN

N N H2N N N O N O N

CH2OH O CH2OH O CH2OH O CH2OH O

H H H H H H H H
H H H H H H H H
OH OH OH OH OH OH OH OH

Adenozinã Guanozinã Citidinã Uridinã

Dezoxiribonucleozide

N H O N H 2 O
2
C H 3
N N N H N
N H N

N N H 2 N N N O N O N

C H 2 O H O C H 2 O H O C H 2 O H O C H 2 O H O
H H H H H H H H
H H H H H H H H
O H H O H H O H H O H H

D e o x ia d e n o z in ã D e o x ig u a n o z in ã D e o x ic itid in ã T im id in ã
Nucleotide

• Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor; în structura acizilor nucleici intră nucleozide fosforilate
la C 5’ al pentozei

• Se pot adăuga 1,2 sau 3 resturi fosfat formând nucleozid mono, di și trifosfați
NH2

N
N

N N

O O O
-O P O P O P O
5' O
H H 1'
O- O- O
-
H H
OH X
Acid adenilic (adenozin 5'-monofosfat, AMP)
or acid deoxiadenilic (deoxiadenozin 5'-monofosfat, dAMP)
Adenozin 5'-difosfat, ADP
or deoxiadenozin 5'-difosfat, dADP)
Adenozin 5'-trifosfat, ATP
or deoxiadenozin 5'-trifosfat, dATP)

Nucleotide naturale libere

• Pe lângă nucleotidele care constituie elemente de construcție a acizilor nucleici, există o serie
de nucleotide care îndeplinesc roluri importante în țesuturi:

– Compuși macroergici – ATP, GTP

– Componenți structurali ai unor coenzime – NAD+, NADP+, FAD

– Mesageri secunzi ai unor hormoni – AMPc, GMPc

– Donori de grupări metil – S-adenozil metionina (SAM)

– Acceptori de fosfat în fosforilarea oxidativă – ADP

– Efectori alosterici ai activității enzimelor

N H 2
N H2
N
N
N
N
N N
N N
C H3
O C H2 O
H O O C CH CH 2 CH 2
S CH 2 O H H
-
H H O P O H H
N H2 H H O H
O H O H O

S -a d e n o z ilm e t io n in a A M P c ic lic (A M P c )

Metilxantinele = derivați metilați ai xantinei, identificați la plante; prezintă proprietăți

farmacologice O O CH 3

N H3C N
HN N

O N N O N N
H H
CH3

Xantina Cafeina

O O CH3
H3C N N
N HN

O N N O N N
H
CH3 CH3

Teofilina Teobromina
Structura primară covalentă a acizilor nucleici

• Acizii nucleici sunt formați din nucleozide legate fosfat diesteric

• Gruparea –OH de la C 3’ a unui nucleozid este legată de gruparea –OH de la C 5’ a

nucleozidului următor prin legătură fosfat diesterică

• Fiecare catenă are două capete:

– Capătul 5’ – la care gruparea –OH de la C 5’ are atașat un rest fosfat

– Capătul 3’ – la care gruparea –OH de la C 3’ nu este angajată într-o legătură

internucleotidică

• Prin convenție o catenă este scrisă întotdeauna în direcția 5’ – 3’

• În fiecare catenă polinucleotidică (cu mai mult de 50 nucleotide), legăturile dintre nucleotide
au aceeași orientare de-a lungul lanțului, catenele având o polaritate specifică

• Două lanțuri polinucleotidice sunt antiparalele când unul evoluează în direcția 5’  3’ iar
celălalt în direcția 3’  5’

• Diversitatea polinucleotidelor este dată de bazele azotate legate de scheletul format de

moleculele de monozaharid legate între ele fosfat diesteric
NH2
Capãt 5'-terminal
N 5'
N P
3'
N 5' A
O N
- P
O P O CH2 O 3'
- H H NH2 5'
O C
H H
OH,H N
O P
3'
O 5' G
- P O N
O
legãturã fosfat O
O
diestericã CH2 O
H H O 3'
H H
OH,H N
O HN
O
- P H2N N N
O
O
CH2 O
H H
H H
OH OH,H

Capãt 3'-terminal

Structura secundară a ADN

• Propusă de Watson și Crick (1953) pe baza rezultatelor altor cercetători:

– Prin analiză cromatografică s-a stabilit că în toate tipurile de ADN numărul de baze
purinice este egal cu numărul bazelor pirimidinice (A+G = T+C)
 – Prin difracție cu raze X s-a stabilit că ADN are 2 perioade de identitate, una de 34 Å
iar alta de

3,4 Å

• Două catene antiparalele formează o dublă elice cu orientare dreaptă, prin răsucire de la
stânga la dreapta în jurul unui ax

• Scheletul extern este format din ciclurile pentozelor legate între ele fosfat diesteric

• Resturile fosfat sunt ionizate și încărcate negativ la pH fiziologic

• Bazele azotate sunt orientate spre interior și perpendicular pe axul helixului

• Între o bază purinică de pe o catenă și o bază pirimidinică de pe cealaltă catenă, numite baze
complementare, se formează legături de hidrogen; adenina se leagă de timină prin 2
legături de hidrogen iar guanina se leagă de citozină prin 3 legături de hidrogen

Sant mare

H
CH3
N O
H
H N H
N
N H N
Adenină N Timină
N O
H

Sant mic

Sant mare
H
O H N H
H N

N H N H Citozină
Guanină N
N N
N H O

Sant mic

Structura secundară a ADN (forma B)

• Diametrul moleculei este de 20 Å

• Distanța dintre 2 baze adiacente este de 3,4 Å

• Pasul elicei are 10 perechi de baze și o lungime de 34 Å

• Helixul prezintă în exterior două șanțuri: unul mic, cu lățimea de 12 Å și unul mare, cu
lățimea de 22 Å, prin intermediul cărora unele proteine și medicamente vin în contact cu
bazele azotate fără să fie necesară desfacerea dublu helixului

• Între bazele azotate se stabilesc legături dipol-dipol, interacții van Der Waals și interacții
hidrofobe; acestea produc stivuirea bazelor și determină conformația helicoidală a catenei
 Formele structurale A și Z ale ADN

• Structura ADN este dinamică în mediul apos al celulei

• Pe lângă forma B, predominantă în celule, pot exista formele A-E și Z.

• Conformația A – este o elice dreaptă mai compactă, cu un pas de 28

Å si având 11 perechi de baze

• Conformația Z – corespunde unei elice stângă, cu 12 perechi de baze pe spiră și cu un pas al

elicei de 57 Å. Aspectul catenei este de zig-zag, datorită conformației adoptate de bazele
azotate din componență

Denaturarea și renaturarea ADN

• DENATURARE = ruperea legăturilor de hidrogen și a diferitelor tipuri de interacțiuni dintre

catenele moleculei de ADN se poate realiza prin creșterea temperaturii, la valori extreme de
pH (ADN este stabil între pH 4-10) sau la modificarea tăriei ionice a soluției;

• Aceasta duce la separarea celor 2 catene.

• Dacă denaturarea este determinată de modificări de temperatură procesul se numește

TOPIRE

• Prin denaturare se modifică unele proprietăți fizice ale ADN:

– Scade vîscozitatea

– Crește absorbanța la 260 nm (absorbanța bazelor azotate în catenele libere este cu

40% mai mare decât în ADN = efect hipercrom)

– Crește densitatea
 – Se modifică capacitatea de rotire a luminii polarizate
1 .5

1 .4
100

De ns ita te opticã (260 nm)

1.3

1.2
50

1.1
Tm

1.0 0
30 50 70 90
(oC )

• Denaturarea se poate urmări prin creșterea absorbanței la 260 nm

• Temperatura de topire, Tm, este temperatura la care jumătate din ADN este denaturat

• Compoziție ADN în baze azotate influențează Tm; un procent mai mare de GC față de AT din
ADN determină o creștere a Tm. Conținutul de perechi de baze GC la om este de 40% iar
punctul de topire in jur de 87 C

• În celule pentru denaturare se folosesc enzime numite helicaze, care utilizează ATP

• pH >11,3 determină deprotonarea bazelor azotate, ceea ce le împiedică să mai formeze

legături de hidrogen

• Se preferă denaturarea cu soluții de baze pentru a preveni ruperea legăturilor fosfat

diesterice (situație posibilă în cazul temperaturilor mari sau a pH acide)

• La adăugarea unor agenți denaturanți (formamida) se produce destabilizarea legăturilor de

hidrogen dintre baze, putându-se face denaturarea la temperaturi mai mici

• Renaturarea este procesul prin care se reface dublul helix prin restabilirea valorilor de pH,
temperaturii sau tăriei ionice la valorile fiziologice

• Renaturarea este folosită în tehnica hibridizării moleculare care permite combinarea unor
catene de ADN sau a unei catene de ADN cu o catenă de ARN dacă există un grad mare de
complementaritate între cele două catene.

Hidroliza acizilor nucleici

• ADN este relativ stabil – poate fi păstrat în soluții apoase la pH ~ neutru

• ADN este rezistent la hidroliza bazică; ARN este hidrolizat la un amestec de 2’ și 3’ nucleotide

• ADN mono și bicatenar precum și ARN poate fi hidrolizat de enzime numite nucleaze:

– Exonucleaze- hidrolizează nucleotidele terminale de la capetele 3’ sau 5’ ale unui lanț

polinucleotidic (ex. ADN polimerazele I și III) producând 3’ mononucleozid fosfați sau
5’ mononucleozid fosfați; se poate produce degradarea totală a acidului nucleic

– Endonucleaze- hidrolizează legături fosfat diesterice din interiorul catenei

polinucleotidice; pot hidroliza și polinucleotide ciclice pentru că nu necesită un capăt
terminal liber
• Deoxiribonucleazele pot fi specifice pentru ADN monocatenar sau dublu catenar

• Un grup special de endonucleaze produse de microorganisme se numesc endonucleaze de

restricție sau restrictaze

• Au fost izolate peste 100 restrictaze și au fost denumite în funcție de specia bacteriană de la
care au fost izolate (deoarece fiecare bacterie conține mai multe restrictaze, se utilizează o
cifră romană pentru a identifica fiecare enzimă)

• Enzimele recunosc secvențe specifice, numite secvențe de recunoaștere având 4-6

nucleotide și taie ambele catene

• Secvențele de recunoaștere sunt palindroame = secvențe cu dublă simetrie rotațională, în

care secvența nucleotidică, citită pe ambele catene în direcția 5 ’  3 ’ este identică

• Unele endonucleaze de restricție taie ADN bicatenar formând capete boante, drepte,
neadezive (“blunt ends”), altele formează capete monocatenare, coezive (“sticky ends”)

5' A A G CTT 3' 5' TG G CCA 3' 5' G A G CTC 3'

3' TTCG A A 5' 3' A CCG G T 5' 3' CTCG A G 5'

H in d III B al I S st I

5' A A G CTT 3' 5' TG G CCA 3' 5' G A G CT C 3'

3' TTCG A A 5' 3' A CC G G T 5' 3' C TCG A G 5'

c a p e te c o e z iv e c a p e te b o a n te c a p e te c o e z iv e

• O enzimă de restricție are aceeași secvență de recunoaștere indiferent de sursa ADN

(bacterian, din plante sau din animale)

• O moleculă de ADN poate să nu aibă nici un situs de recunoaștere, unul sau mii de situsuri

• Capetele ADN pot fi legate de ADN ligază rezultând ADN recombinat, utilizat în ingineria
genetică, diagnosticul prenatal al unor boli genetice sau la alcătuirea hărților de restricție

• La bacterii enzimele de restricție au rol de protecție împotriva infecțiilor virale; bacteria își
metilează A și C din secvența de recunoaștere și astfel și-o protejează

Organizarea ADN la procariote și eucariote

• Moleculele de ADN au de la câteva perechi de baze (virusuri mici) până la miliarde de perechi
de baze (plante, animale)

• Cu excepția unor bacteriofagi care au ADN moncatenar, majoritatea moleculelor de ADN

sunt dublu catenare, liniare sau circulare

• Moleculele de ADN dintr-o celulă alcătuiesc cromozomii celulei

• Fragmentele cromozomiale care conțin informația genetică cu privire la sinteza unui singur
lanț polipeptidic au fost denumite gene.

• Fiecare cromozom conține un set unic de gene

• Totalitatea genelor cuprinse în cromozomii unei celule constituie genomul acesteia

• La procariote avem un singur cromozom, circular, care conține setul complet de gene
pentru specificarea caracterelor celulei (4,6 x 10 6 perechi de baze, lungime aprox. 1,6 mm)

• În celulele procariote, ADN este distribuit într-o masă cromozomială

• În citoplasma celulei se află cantități mici de ADN extracromozomial. Aceste molecule se

numesc plasmide și conțin o cantitate redusă de informație genetică.

• Plasmidele:

• Trec ușor prin membrana celulei gazdă

• Molecule mici, ce codifică gene accesorii - conțin gene ce le conferă bacteriei

rezistență la antibiotice

• Se autoreplică extrem de rapid, independent de ADN cromozomial

• Pot migra de la o celulă cu rezistență la antibiotic la altă celulă, cu sensibilitate la

antibioticul respectiv, făcând-o și pe aceasta rezistentă (pericol pentru terapia cu
antibiotice)

• Sunt utilizate în manipularea genică, fiind vectori pentru fragmente străine de ADN

• La eucariote ADN se află în nucleu

• În perioadele de repaus, materialul se găsește sub formă de cromatină = material amorf,

dispersat în nucleu, care conține ADN, proteine bazice (histone), proteine nehistonice
(hertine) și mici cantități de ARN

• În timpul mitozei cromatina se condensează și se subdivide în cromozomi = complexe ADN-

proteine (o singură moleculă de ADN)

• Genomul uman constă în 46 cromozomi grupați în 23 perechi și conține aproximativ 6 x 10 9

perechi de baze

• Cea mai mare parte a genomului este necodificatoare având rol în reglarea exprimării
genelor în timpul dezvoltării, diferențierii și adaptării la condițiile de mediu

• În mitocondrii se află molecule de ADN circular, cu masă mică, care diferă de ADN nuclear
prin structură și proprietăți (reprezintă 1% din ADN total) ; specifică proteine mitocondriale,
cum ar fi proteine ale lanțului respirator; majoritatea proteinelor mitocondriale sunt însă
specificate de ADN nuclear.

Cromozomii eucariotelor

• Fiecare cromozom conține o singură moleculă de ADN cu o lungime de aprox. 2 m !!!

• Împachetarea presupune scurtarea de 10 000 ori a lungimii sale

• Primul stadiu în condensarea ADN, realizând un grad de compactare egal cu 7, este

nucleozomul

• Nucleozomul este unitatea de bază a cromatinei; fibra de cromatină arată ca un “șirag de

mărgele”, mărgelele fiind nucleozomii iar “ața”= porțiuni de ADN liber (ADN de legătură cu
8-120 perechi de baze)
• Histonele sunt proteine bazice, cu masă moleculară mică, care interacționează ionic cu
anionii fosfat din catenele de ADN

• Există 5 clase de histone:

• Histone bogate în lizină – H2A, H2B

• Histone bogate în arginină – H3, H4

• Histone de legătură – H1, cu rol de protejare a ADN de acțiunea nucleazelor

• Nucleozomul are forma unui cilindru turtit și cuprinde un octamer histonic constituit
din 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 în jurul căruia se înfășoară de aprox. 2 ori, cu răsucire spre
stânga, o secvență de ADN având aprox. 140 perechi de baze

• Histona H1 se leagă de ADN de legătură; ea are rol esențial în etapa următoare de

compactare cu formarea unei structuri care arată ca un solenoid și care asigură o
scurtare de 40 ori a moleculei de ADN

• Solenoizii se asociază între ei determinând o condensare suplimentară

• Proteinele nehistonice din structura cromatinei au rol în destinderea stării

condensate a cromatinei, pentru a permite replicarea și transcrierea și în viabilitatea
celulei

• Nucleozom

• Solenoid