NEISSERIA GONORRHOEAE

(gonococcus, GC)
1879 Albert Neisser descrie gonococul

 Totdeauna patogenă, specific umană

 Produce 62 milioane cazuri de gonoree pe glob/an
o În USA 1994, 800 000 cazuri, 5 bilioane $/ an pentru tratarea ITS
 Transmisie sexuală
 Infecţia simptomatică/asimptomatică a mucoaselor urogenitale, rectală,
faringiană, conjunctivală la nou nascuţi
 Fără tratament, cauză majoră pentru :
o boala inflamatorie pelvină,
o infertilitate tubală
o sarcină ectopică
o prostatită, stricturi uretrale
o infecţie diseminată
 Posibilitate de asociere cu alte ITS
 Facilitează transmisia HIV
 Rezistentă la multe antibiotice printre care penicilină, tetraciclină, eritromicină
 Antibiotice eficiente : cefalosporine, fluorochinolone, spectinomicină. Apar tulpini
rezistente şi la acestea

 România : în prezent nu se cunosc morbiditatea, incidenţa, prevalenţa, nici

spectrul de rezistenţă la antibiotice şi circulaţia tulpinilor rezistente

1
 ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR ÎN INFECŢIA GONOCOCICĂ

Recoltare secreţie cu tampon special

AA (uretră, cervix, vagin, rect, faringe,
conjunctivă nou născut)

Mediu transport
(maxim 24h laborator)
Imediat

GC selectiv# : 370C, 5% CO2, 18h

BB Morfologie colonii : translucide, roz-gri, S, margini definite,
diametru 0.5-1mm
Rezultatul :poate fi trimis laboratorulu
Microscopie ID prezumtiv, Gen
 Gram : coci diplo, G negativi, intra şi extra PMN Rezultatul poate fi
 preparat proaspăt lamă-lamelă : trichomonas, t trimis medicului
levuri
Testul Oxidazei : pozitiv

Repicare colonii suspecte pe GC neselectiv, pentru

obţinere cultură pură : 370C, 5% CO2, 18h
Microscopie Gram : coci reniformi în diplo, tetrade,
grupuri, Gram negativi
CC Testul Oxidazei : pozitiv

Reacţie Superoxol : explozivă +4

API (-lactamază)
ID definitiv, Specie
D GonoGen : coaglutinare cu anticorpi
D
EE monoclonali anti Protein I

EE o Sensibilitate antibiotice# :
DD metoda difuzimetrică
EE

# Pentru administrarea rapidă a tratamentului este acceptabilă testarea sensibilităţii la

antibiotice din cultura primară.
Anexa A. Recoltare şi transport probe

2
1. Condiţii recoltare
- Tamponul pentru recoltare : fibre special tratate, atoxice. Nu se
recomandă fibre sintetice deoarece nu absorb bine lichidele.
- Se recomanda recoltarea de probe duble (la cel puţin 1h după
urinare), un tampon pentru însămânţare (directă, când este posibil)
sau mediu de transport şi unul pentru frotiu
- Pentru însămânţare directă se poate folosi şi probă de urină (mijlocul
jetului), centrifugată şi sedimentul însămânţat pe mediu selectiv

2. Transport : probele recoltate se pot transporta fie în mediul de transport, fie după însămânţare
directă pe mediul selectiv.
- Tamponul se imersează imediat în mediu semisolid de transport
(Amies), unde N.gonorrhoeae poate supravieţui până la 12h,
viabilitatea descrescând rapid după 24h.
- Dacă există condiţii de însămânţare pe loc, placa se poate păstra la
temperatura camerei (maxim 5h) sau la 37 0C ,în ambele cazuri în
atmosfera umedă cu 5% CO2 (cel mai simplu în exicator cu lumânare),
până va fi transportată.
- Placa însămânţată se transportă în sac/pungă de plastic sigilat
conţinând o pastilă generatoare de CO 2 şi puţină vată/hârtie de filtru
umezită

Probele pentru cultură NU se transportă niciodată pe tampon uscat şi NU se refrigerează.

3. Primire probe în laborator

- Probele primite din teritoriu de luni până joi sunt prelucrate imediat, în
ordinea sosirii
- Dacă se primeşte un singur tampon se procedează mai întâi la
însămânţare şi apoi la executarea frotiului
- Probele primite vinerea trebuiesc însămânţate imediat şi incubate la
370 în atmosferă umedă cu 5% CO2. Este posibil ca viabilitatea să se
piardă până luni (nu obligatoriu), dar se poate face un diagnostic
prezumtiv al coloniilor suspecte prin coloraţie Gram şi reacţia Oxidazei,
deoarece acestea nu necesită microorganisme viabile.
Probe inacceptabile
- probe expuse la temperaturi extreme (refrigerate sau dincolo de 29 0C)
- probe mai vechi de 24h în mediu de transport
- probe însămânţate pe medii uscate, contaminate, expirate
- probe însămânţate şi transportate în pungi de plastic fără pastilă CO 2
şi atmosferă umedă
- probe fără ID ( fără nume, nr. înregistrare expeditor, etc.)

3
Anexa B 1. Prepararea şi însămânţarea mediilor de cultură

Prepararea mediului GC selectiv

( GC bază + 1% hemoglobină + 1% supliment nutritiv + supliment selectiv)

- Se dizolvă 7.2g pulbere GC Agar bază în 100ml apă distilată (AD), sub
agitare pe plită electrică
- Fierbere 1min. şi autoclavare 15min. la 121 0C
- Se răceşte în baie de apă până la 50 0C

- Se dizolvă 2g Hemoglobină solubilă în 10 ml AD caldă (45-50 0C )şi se

completează treptat cu AD caldă ad 100ml pe agitator magnetic
- Autoclavare 15min. la 1210C
- Se răceşte în baie de apă până la 50 0C

- Se reconstituie steril o fiolă de supliment nutritiv (IsoVitaleX , VITOX)

în solventul ataşat. Se utilizează imediat sau se poate păstra 2 săptămâni la +4 0C
- Se reconstituie steril o fiolă de supliment selectiv conform
instrucţiunilor ataşate
( de ex. pentru VCN-Oxoid fiola se reconstituie cu 2ml etanol 50% şi se adaugă la
500ml mediu)

- Se adaugă steril 100ml soluţie Hemoglobină sterilă, 2ml supliment

nutritiv şi 0.4ml supliment selectiv (VCN) la 100ml GC bază. Se amestecă uşor prin
rotire fără să se producă spumă.

- Se repartizează steril câte 20ml mediu în placi Petri de polistiren,

sterile (15x100mm) aşezate pe o suprafaţă perfect orizontală, pentru a se obţine o
grosime uniformă de 4mm. Plăcile se acoperă cu capacul şi se păstrează câteva ore la
temperatura camerei pentru evaporarea condensului.
- Plăcile se depozitează cu capacul în jos, la + 40C, în pungi de plastic
închise.

QC mediu preparat :

Eficienţă de creştere
- Se însămânţează câte o placă de mediu cu următoarele tulpini de
control :
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Staphilococcus epidermidis ATCC 12228
Proteus mirabilis ATCC 43071
- Inoculul : o ansă de 10l din cultură în mediu lichid de 18h, diluată
1/10 în soluţie salină 0.85%
- Pentru gonococ se poate folosi şi o suspensie în soluţie salină din
cultură de 18h pe mediu solid adusă la densitatea 0.5 McFarland
- Plăcile însămânţate se incubează 18h la 37 0 în atmosferă umedă cu
5% CO2 după care se înregistrează eficienţa creşterii
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 : creştere optimă
Staphilococcus epidermidis ATCC 12228 : inhibiţie parţială sau totală
Proteus mirabilis ATCC 43071 : inhibiţie parţială sau totală

4
 - În paralel se însămânţează acelaşi mediu fără supliment selectiv,
pentru compararea rezultatelor

Sterilitate
- Se incubează, minim o placă (teoretic 2% din numărul de plăci
turnate), în condiţiile standard timp de 72h
- Placa trebuie să rămână sterilă. În cazul apariţiei câtorva colonii de
contaminare se repetă testarea.
- Lotul de mediu se invalidează dacă la repetare reapare contaminarea.

Prepararea mediului GC neselectiv pentru testarea sensibilităţii la antibiotice – metoda difuzimetrică

( GC bază + 1% supliment nutritiv)

- Deoarece mediul Muller-Hinton solid nu poate susţine creşterea

N.gonorrhoeae, se utilizează mediul GC bază adiţionat 1% cu
supliment nutritiv. Nu se adaugă hemoglobină deoarece poate afecta
susceptibilitatea N.gono la antibiotice.
- Mediul se prepară la fel ca şi mediul selectiv fiind adiţionat numai cu
supliment nutritiv, în aceleaşi condiţii

QC mediu preparat :

Eficienţa creşterii
- Se însămânţează o placă de mediu cu tulpina de control :
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
- Inoculul : o ansă de 10l din cultură în mediu lichid de 18h, diluată
1/100 în soluţie salină 0.85%
- Pentru gonococ se poate folosi şi o suspensie în soluţie salină din
cultură de 18h pe mediu solid adusă la densitatea 0.5 McFarland şi diluată 1/100
- Plăca însămânţată se incubează 18h la 37 0 în atmosferă umedă cu 5%
CO2 după care se înregistrează eficienţa creşterii
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 : creştere optimă

Sterilitate
- Se incubează, minim o placă (teoretic 2% din numărul de plăci
turnate), în condiţiile standard timp de 72h
- Placa trebuie să rămână sterilă. În cazul apariţiei câtorva colonii de
contaminare se repetă testarea.
- Lotul de mediu se invalidează dacă la repetare reapare contaminarea.

Mediile se prepară în cantităţi previzibil de utilizat în maximum 30 zile, de preferat 15 zile.

Pentru fiecare lot de mediu se înregistrează :

- provenienţa ingredientelor şi termenul de valabilitate
- data preparării şi data expirării
- preparator
- rezultate QC

5
Însămânţarea probelor în mediul de cultură şi incubarea

- Se scot plăcile cu mediu de la + 40C şi se lasă pe masă până ajung la

temperatura camerei şi se evaporă condensul
- Proba se însămânţează sub formă de ” Z ” : se descarcă tamponul
sub forma unei linii verticale pe diametrul plăcii şi cu o ansă sterilă se execută dispersia în zig-
zag peste descărcarea primară
- Placa însămânţată se incubează 18-24h la 37 0, în atmosferă umedă,
cu 5% CO2
- Neisseria gonorrhoeae produce diferite tipuri de colonii care pot varia
în diametru de la 0.5 la 1mm, se consistenţă S, translucide, roz-gri, cu margini bine definite.
Coloniile mici sunt convexe iar cele mari sunt mai aplatizate. Unele tulpini foarte pretenţioase
produc colonii foarte micii 0.25mm diametru.
- La 18h este posibil să apară doar un număr mic de colonii caz în care
se recomandă repicarea pe o placă nouă şi redispersia pe placa iniţială a coloniilor rămase.
Plăcile se incubează în aceleaşi condiţii încă 18h. Dacă subcultura produce o creştere
acceptabilă placa iniţială poate fi aruncată.
- Dacă după 18h nu apare nici o colonie pe placa iniţială, se
reincubează încă 18h şi la nevoie până la 72h.
- Dacă coloniile au morfologie tipică de N.gonorrhoeae (indiferent de
timpul de incubare) aunci se continuă cu procedura de identificare.
- De fiecare dată când s-au deschis exicatorul sau sacul de plastic, în
care sunt incubate culturile, se reaprinde lumânarea sau se pune o nouă pastilă generatoare de
CO2. Deasemenea se asigură prezenţa umidităţii ( hârtie de filtru umezită).
- Aspectul coloniilor la Neisserii nepatogene, mai frecvent izolate :

o Neisseria lactamica produce colonii identice cu

N.gonorrhoeae, dar uşor gălbui.
o Neisseria sicca produce colonii 1-3mm în diametru, uneori
aderente de mediu şi cu suprafaţa încreţită, opace, pigmentate în galben.

6
Anexa B 2. Microscopie

Coloraţia Gram
1. Frotiu din produsul patologic: se roteşte tamponul pe suprafaţa lamei, nu se freacă de lamă
pentru a nu strica structura celulelor
2. Frotiu din cultură : se depune o picătură de soluţie salină 0.85% pe lamă în care se
emulsionează o porţiune de colonie suspectă, fie cu ansa fie cu un tampon (pe care se poate
executa ulterior reacţia Oxidazei).
3. Frotiurile se usucă la aer şi apoi se fixează la flacără (încălzire uşoară)
4. Coloraţia :
a. violet de genţiană 1min., spălare cu apă curgătoare,
b. lugol 2min.
c. decolorare cu alcool-acetonă, secunde
d. spălare cu apă curgătoare
e. fuxină fenicată diluată 1/10 1min.
f. spălare şi uscare
5. Examinare la microscop cu imersie :
a. Frotiu din produs patologic : Neisseria gonorrhoeae apare sub formă de diplococi
reniformi Gram negativi extra- şi intra-PMN
b. Frotiu din cultură : Neisseria gonorrhoeae apare sub formă de coci reniformi Gram
negativi, în diplo, terade sau grămezi

QC

Se execută un frotiu din amestec de culturi de 18 h de E.coli (sigur Gram negativ) şi

Staphylococcus aureus (sigur Gram pozitiv), care se colorează în paralel cu frotiurile din produsul
patologic sau culturile de testat.

Coloraţia este validată numai în cazul în care frotiurile de control au aspectul caracteristic : E.coli ,
Gram negativ şi Staphylococcus aureus, Gram pozitiv.

7
Anexa B 3. Testul Oxidazei

Testul detectează prezenţa Citocromului c din lanţul respirator.

Se execută cu/pe colonii suspecte (de 18h) diplococi Gram negativi de pe medii selective şi neselective.
Reactivul = 1% N,N,N ,N - tetramethyl-p-phenylendiamine dihydrochloride
Deoarece reactivul este toxic nu se recomandă executarea testului direct în placă, mai ales dacă au
crescut puţine colonii

Testul Oxidazei pe tampon :

- Se detaşează una-două colonii suspecte cu un tampon
- Se picură o picătură de reactiv direct pe tampon

- Reacţie pozitivă : apariţia culorii violet în 10 secunde

- Reacţie negativă : culoarea nu se schimbă

Testul oxidazei pe hârtie de filtru :

- Se depune o picătură de reactiv pe hârtia de filtru, aşezată într-o placă
Petri
- Se depune cu ansa o porţiune de colonie suspectă pe hârtia de filtru
cu reactiv şi se freacă uşor.

- Reacţie pozitivă : apariţia culorii violet în 10 secunde

- Reacţie negativă : culoarea nu se schimbă

Testul Oxidazei pe benzi impregnate cu reactiv şi uscate (IC) :

- Se depune cu ansa o porţiune de colonie suspectă pe banda de hârtie
impregnată cu reactiv şi se freacă uşor.

- Reacţie pozitivă : apariţia culorii violet în 2-3 secunde

- Reacţie negativă : culoarea nu se schimbă

QC :
Martor pozitiv – Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Martor negativ – E.coli ATCC 4157

Neisseria gonorrhoeae este întotdeauna Oxidază pozitivă

8
Anexa D 1. Testul Superoxol

Testul identifică prezenţa catalazei; este peste 92% specific pentru Neisseria gonorrhoeae.
Se execută pe cultură pură (de 18h), medii selective şi neselective.

Reactivul = peroxid de hidrogen (apă oxigenată) 30%

Execuţia testului :
- Pe o lamă curată se depune cu ansa o porţiune de cultură pură de 18h
- Peste cultură se depune o picătură de reactiv

- Reacţie pozitivă : apariţia instantanee de spumă

o Neisseria gonorrhoeae : reacţie explozivă (4+)

o Neisserii negonococice : reacţie moderată (2+)
o K. denitrificans : reacţie negativă (-)

Deoarece N.meningitidis şi M.catarrhalis produc uneori reacţii pozitive, dar nu explozive, se recomandă
ca testul să fie executat de catre o persoană experimentată.

Testul Superoxol este considerat test diferenţial şi nu definitiv, dar un rezultat negativ exclude prezenţa
N. gonorrhoeae

QC :
Martor pozitiv – Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Martor slab pozitiv – Neisseria sicca ATCC 9913
Martor negativ – E.coli ATCC 4157

Anexa D 2. Testul pentru -lactamază

Testul pentru -lactamază se poate executa în cadrul testului API, sau independent cu discuri de
Nitrocefin.
Se execută pe cultură pură (de 18h), medii selective şi neselective.

Metoda cu discuri Nitrocefin :

- cu o pensă sterilă se plasează un disc de Nitrocefin pe o lamă curată
- se depune o picătură AD sterilă pe disc şi se aşteaptă până este
absorbită complet (apa nu trebuie să fie în exces)
- se depune cu ansa o porţiune de cultură de 18h peste disc şi se freacă
uşor

- Reacţie pozitivă : apare culoarea roşu violet în 5min.

- Reacţie negativă : culoarea nu se schimbă

9
QC :
Martor pozitiv – Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426
Martor negativ – Neisseria gonorrhoeae ATCC 49981
Un rezultat pozitiv indică producerea de -lactamază de către tulpina testată.
Anexa D 3. Sistemul de identificare API-NH (Neisseria – Haemophylus)

Galeria API-NH conţine 10 microtuburi cu substraturi uscate pentru realizarea a 12 teste de identificare
(reacţii enzimatice sau fermentaţii de zaharuri) precum şi detecţia penicilinazei.
Se execută numai pe culturi pure de 18-20h.
Reacţiile produse în timpul incubarii probelor cu cele 10 substraturi se traduc prin schimbări spontane
de culoare sau sunt relevate prin adăugare de reactivi specifici.
După două ore de incubare aerobă la 37 0C, citirea rezultatelor se face vizual iar identificarea se face cu
ajutorul Listei de profiluri numerice (sau softului furnizat de producător).

Reactivi şi materiale furnizate în trusă Reactivi suplimentari

Galerii API-NH Standard McFarland 4
Soluţie salină 0.85% (2ml) Ulei mineral
Reactiv James (5ml) : R1, R2 Pipete automate 20-200l
Reactiv ZYM B (3ml) Stativ pentru fiole
Tampoane
Cutii de incubaţie
Fise de rezultate

Procedura (a se vedea schema Procedură)

1. Pregătirea galeriei :
 se scoate galeria din ambalajul individual,
 se pune în cutia de incubare, care serveşte drept suport şi protejează galeria de
contaminare şi deshidratare
 se noteză numărul probei pe marginea cutiei de incubare (nu pe capac).

2. Pregătirea inoculului
 Se deschide o fiolă de soluţie salină (2ml)
 Cu ajutorul unui tampon se prelevă mai multe colonii izolate şi se realizează o suspensie de
opacitate 4 McFarland bine omogenizată
 Suspensia trebuie utilizată imediat după preparare
3. Inocularea galeriei
 Repartizează suspensiei bacteriane în lăcaşele galeriei se face ţinând galeria uşor înclinată
înainte şi vârful pipetei sprijinit pe marginea porţiunii deschise (”cupule”), pentru evitarea
formării de bule
 Primele 7 lăcaşuri, PEN-URE, se umplu cu cîte 50l suspensie numai în portiunea închisă
(”tube”)
 Ultimile trei lacaşuri, LIP-GAL, se umplu cu 150l suspensie în abbele compartimente, tub şi
cupulă, evitându-se formarea unui menisc convex
 Primele 7 lăcaşuri se acoperă cu ulei mineral
 Se închide cu capacul cutia de incubare
4. Incubarea galeriei : 2-2.15h la 370C, atmosferă aerobă
5. Citirea rezultatelor ( schimbarea de culoare)
 se face vizual după incubare, cu ajutorul Tabelului de citire şi reacţiile spontane din
cele 10 lăcaşuri se notează pe fişele de rezultate, cu + sau –

10
  În ultimile trei lăcaşuri, care sunt bifuncţionale, s-a citit rezultatul pentru LIP, PAL şi
GAL .
 În microtuburile 8 şi 9 se adaugă cîte o picătură de Reactiv ZYM B, iar în 10, o picatură
de Reactiv JAMES. Se aşteaptă trei minute şi se citeşte rezultatul reacţiei conform
Tabelului de citire, notându-se în fişa de rezultate.
 Dacă reacţia LIP este pozitivă (coloraţie albastră) se interpretează reacţia ProA ca
negativă indiferent dacă s-a adăugat ZYM B sau nu
 Dacă după două ore de incubare mai multe reacţii (fermentare, penicilinază) sunt
îndoielnice se reincubează galeria încă două ore şi se recitesc numai primele 7
microtuburi.

6. Interpretarea
Identificarea se realizează cu ajutorul profilului numeric : pe Fişa de rezultate, testele sunt
separate în grupe de câte trei începând cu al doilea microtub (GLU), fiecare având atribuită cîte
o valoare (1, 2 sau 4).
Sumele valorilor din interiorul fiecărui grup, corespunzătoare reacţiilor pozitive, realizează un
profil numeric de 4 cifre. Acest profil, introdus în Lista de profiluri numerice, identifică tulpina
testată.
Testul Penicilinază (PEN), primul microtub, care nu a fost codificat, pozitiv (galben, galben-
verde) interzice tratarea cu penicilina a pacientului şi subliniază necesitatea antibiogramei
pentru găsirea altor -lactamine.

Profilul a două specii de Neisseria negonococice mai frecvent întâlnite :

GLU FRU MAL SAC ODC URE LIP PA GAL ProA GGT IND Profil
L
N.sicca + + + (+) - - - - - + - - 7101
N. + - + - - - - - + + - - 5041
lactamica

QC :
Controlul bacteriologic al galeriei se face cu tulpinile de referinţă :

Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426

Haemophilus influenzae ATCC 10211

PEN GLU FRU MAL SAC ODC URE LIP PAL GAL ProA GGT IND Profil
N. -/+ + - - - - - - - - + - - 1001
g
H.i - + +/- - - + + - + - - - + 3624

Limitele testului
o Sistemul API-NH este destinat identificării numai a speciilor din baza de date a producătorului
o În cazul obţinerii unui profil îndoielnic cu ProA pentru Neisseria gonorrhoeae este necesară
verificarea identificării cu un test alternativ (ex. reducerea nitratilor şi nitriţilor)
o Capacitatea de identificare corectă de către API-NH a speciilor de Neisseria este în jur de 98%

11
PROCEDURĂ - API

12
13
 TABEL CITIRE REZULTATE API-NH

Test Substrat Reacţie Rezultate

negativ pozitiv
1. PEN K-benzylpenicilline PENicillinază Albastru Galben
Galben-verde
(absenţa penicilinazei) (prezenţa penicilinazei)
2. GLU D-glucose Acidificare (GLUcoză)
3. FRU D-fructose Acidificare (FRUctoză) Roşu Galben
4. MAL D-maltose Acidificare (MALtoză) Roşu-portocaliu Portocaliu
5. SAC D-saccharose Acidificare (SACcharose)
6. ODC L-ornithine OrnitinDeCarboxilază Galben-verde Albastru
Gri-verde
7. URE Ureea UREază Galben Roz-violet
8a. LIP 5-bromo-3-indoxyl- LIPază Incolor Albastru
caprate Gri-pal (+ precipitat)
9a. PAL 4-nitrophenyl- Phosphatase ALcaline Incolor Galben
phosphate-2CHA Galben-pal
10a. GAL 4-nitrophenyl-D- GALactozidază Incolor Galben
galactopyranoside
8b. ProA L-proline-4-methoxi-- ProlinArylamidază ZYM B / 3 minute
naphtylamide Galben Portocaliu
Portocaliu-pal
Dacă LIP este pozitivă, ProA este neg. (Brun dacă este LIP pozitiv)
9b. GGT -glutamyl- methoxi-- Gama-GlutamilTransferază ZYM B / 3 minute
naphtylamide Galben Portocaliu
Portocaliu-pal
(galben-portocaliu dacă PAL este
pozitiv )
10b. IND L-tryptophane INDole JAMES / 3 minute
Incolor Roz

FIŞĂ DE REZULTATE

14
15
 LISTĂ DE PROFILURI NUMERICE

PROCENTAJ REACŢII POZITIVE OBŢINUT CU API

16
 (SENSIBILITATE)

Anexa D 4. Identificarea tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae prin testul GonoGen

17
GonoGen este un test colorimetric de coaglutinare cu anticorpi monoclonali pentru identificarea
confirmatorie a Neisseria gonorrhoeae. Are o specificitate de 99% şi sensibilitate de 100%.
Se poate executa pe culturi pure, culturi mixte şi pe culturi neviabile (de ex. culturi al căror transport a
durat 10 zile).

Reactivi :
1. Soluţie tampon
2. Reactiv GonoGen (anticorpi)
3. Martor pozitiv de control
4. Martor negativ de control

Alte materiale :
- placă cu godeuri pentru testare
- picător pentru Reactiv 1
- pipete plastic pentru transfer
- tuburi de sticlă 12/75mm (nefurnizate de trusă)

Pregătirea probei
- într-un tub de sticlă se repartizează 0.5ml reactiv 1 cu picătorul special
- cu un tampon se prelevă cultură şi se emulsionează omogen în tubul
cu reactiv 1 la densitatea 1 McFarland; se presează tamponul de
peretele tubului pentru a se minimaliza modificarea volumului de lichid
din tub
- se vortexează reactivul 2 şi se adaugă o picătură în tub cu pipetă de
plastic
- se omogenizează şi se lasă în repaus 5min. pe masă

Testul propriuzis
- cu o pipetă de plastic se repartizează 2 picături de suspensie din tubul
de sticlă într-un godeu din placa de testare
- cu altă pipetă de plastic se adaugă o picătură de reactiv 1 în godeu

- Rezultat pozitiv : buton roşu pe fundul godeului

- Rezultat negativ : buton incolor sau roz pal pe fundul godeului

O reacţie mai intensă decât controlul negativ este interpretată ca reacţie pozitivă.

Dacă reacţia de culoare este este la limită, tubul cu suspensie se mai lasă pe masă încă trei minute,
după care se repetă testul.
Dacă suspensia bacteriană este prea turbidă poate să apară o slabă coloraţie de fond, în care caz nu
se interpretează ca rezultat pozitiv.

QC :
La fiecare testare sunt obligatorii martorii pozitiv şi negativ de control: în cate un tub cu Reactiv 1 se
adaugă câte o picatură din Martorul pozitiv, respectiv negativ de control (un tub pentru fiecare reactiv),
în locul suspensiei bacteriene.
Notă : Protocolul de testare poate suferi unele modificări în funcţie de indicaţiile producătorului trusei.

Anexa E. Testarea sensibilităţii la antibiotice, metoda difuzimetrică

18
Metoda difuzimetrică, prezentată mai jos, este cea recomandată de NCCLS (National Committee for
Clinical Laboratory Standards (2002) şi de WHO, pentru terapia primară a infecţiei gonococice :
ciprofloxacin, azithromycin, ceftriaxone, cefixime, spectinomycin.

Determinarea MIC (Minimal Inhibitory Concentration) prin metoda diluţiei în agar este standardul de
referinţă (gold standard) pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice a Neisseriei gonorrhoeae.
Această metodă este complexă şi dificil de executat.

MIC poate fi determinat şi prin metoda E-test (AB-Biodisk), mult mai uşor de executat.

 Valorile sensibilităţii pot fi afectate de factori ca : modul de testare, mărimea inoculului, condiţiile
de incubare şi concentraţia antibioticelor în discuri
De aceea QC este de maximă importanţă pentru fiecare testare, fără excepţie şi deci,
includerea de tulpini cu sensibilitate cunoscută este OBLIGATORIE.
 O dată stabilit in vitro spectrul de sensibilitate al unei tulpini, aceasta este clasificată ca
sensibilă (S), intermediar sensibilă (I) sau rezistentă (R) la fiecare antibiotic testat, pentru a
indica dacă infecţia răspunde sau nu la antibioticul în cauză.
 Pentru utilizare clinică sensibilitatea la antibiotice trebuie interpretată conform unui ghid
standardizat cu criterii de interpretare ( ex. NCCLS). Aceste criterii trebuie să fie specifice
pentru doza de antibiotic utilizat la tratarea infecţiei. De exemplu criteriile de interpretare a
sensibilităţii N. gonorrhoeae la ciprofloxacin au fost concepute ca să corespundă la terapia cu
doza orală unică de 500mg.
 În laboratoarele clinice locale sensibilitatea la antibiotice trebuie determinată pentru
antibioticelle folosite curent şi de asemenea pentru cele alternative, în cazul apariţiei unei
rezistenţe.
 Dacă laboratoarele locale nu au capacitatea de determinare a sensibilităţii trebuie să trimită
tulpinile izolate, păstrate şi stocate conform standardelor, laboratoarelor regionale mari sau
Laboratorului Naţional de Referinţă.
 Laboratoarele de Referinţă vor executa testări mai extinse în scopul obţinerii unei perspective
globale a rezistenţei antimicrobiene pentru tulpinile de N. gonorrhoeae circulante. De
asemenea, determianrea spectrului de sensibilitate la un număr mai mare de antibiotice
( penicilină, tetraciclină, spectinomycină, cefalosporine, fluorochinolone, macrolide-
azithromycină), permite compararea rezultatelor din zona laboratorului cu izolatele din alte
regiuni.

Procedura

19
Testarea sensibilităţii la antibiotice se execută pe Mediu GC agar base completat cu 1% IsoVitaleX
sau cu un supliment echivalent.
Mediul Mueller Hinton, utilizat în acelaşi scop pentru majoritatea bacteriilor aerobe, nu este
acceptabil pentru Neisseria gonorrhoeae. Dar bulionul M-H poate fi folosit pentru prepararea
suspensiei standardizate (0.5 McFarland)
De asemenea, nu se poate folosi mediu cu supliment de hemoglobină sau alte produse de sânge
(GC chocolate) deoarece acestea pot afecta sensibilitatea Neisseria gonorrhoeae la antibiotice.

1. Se ajustează turbiditatea suspensiei bacteriene la valoarea 0.5 McFarland (10 8 CFU/ml).

- Pentru a se evita pierderea viabilităţii, prepararea suspensiei etalonate şi însămânţarea
pe mediu trebuie făcute în maximum 20min.
- Pentru acelaşi motiv, se vor prepara maximum 5 suspensii odată
2. Se calculează numărul de plăci necesare în funcţie de numărul de tulpini şi de antibioticele
utilizate, ţinând cont de faptul că se utilizează 1 placă pentru maximum 3-4 antibiotice.
3. Se suspendă câteva colonii izolate din culturile tulpinilor de testat de 18-20h, şi a tulpinii
utilizate pentru QC, în cîte 2ml soluţie PBS sau bulion M-H.
- Recoltarea se face prin rularea unui tampon peste colonii, care se introduce apoi în
tubul cu PBS/bulion M-H.
- Se omogenizează bine suspensia prin vortexare.
Notă :
a. dacă tulpinile sunt păstrate în cultură înainte de testare, ele trebuie
subcultivate la fiecare 24h înainte de testare
b. dacă tulpinile sunt stocate în congelator ( -20 0C sau –700C) trebuie
subcultivate cel puţin odată înainte de testare.

4. Plăcile se scot de la frigider şi se ţin inversate şi uşor întredeschise în hotă sau termostat până
dispare condensul de pe mediu şi capac
5. Se introduce un tampon steril în suspensia standardizată, eliminându-se excesul de lichid prin
presare/rotire pe interiorul tubului, deasupra nivelului de lichid.
6. Se însămânţează întreaga suprafaţă a plăcii de 3 ori , rotind-o 60 0 de fiecare dată, pentru a se
asigura o creştere confluentă.
7. Plăcile însămânţate se ţin acoperite pe masă, 3-5min până când lichidul inoculului este absorbit
în mediu, deoarece suprafaţa mediului trebuie să fie uscată când se aplică discurile.
8. Folosind pense sterile sau un ”disk dispenser” se aplică pe suprafaţa mediului discurile
selectate. Discurile se presează uşor pentru a adera perfect. Odată, atinsă suprafaţa mediului,
antibioticul începe să difuzeze şi discurile nu mai trebuie mişcate.
Discurile se plasează echidistant între ele şi faţă de marginea pllăcii.
9. Placa acoperită se incubează, inversată, la 37 0C, în atmosferă umedă cu 5% CO2
10. După 20-24h de incubare se citesc rezultatele măsurându-se zonele de inhibiţie cu rigla
milimetrică.
- Se citesc mai întâi rezultatele pentru tulpina QC Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 şi
se compară cu valorile din Tabelul de sensibilitate. Dacă valorile sunt în limitele admise
stabilite atunci se citesc şi se notează rezultatul probelor clinice în Tabelul de
înregistrare

20
 Interpretarea rezultatelor se face conform Tabelului de sensibilitate unde sunt prezentate diametrele
zonelor de inhibiţie şi echivalentul MIC, împreună cu interpretarea conform standardelor NCCLS.
Rezultatele (S, I, R) se consemnează într-un tabel şi sunt expediate imediat laboratorului primar sau
medicului care a recoltat proba.
- dacă valorile se încadrează în categoria valorilor critice - Tabel de valori critice -,
tulpina trebuie retestată;
- dacă se obţine în continuare un MIC înalt se trimite tulpina la LNR
- dacă tulpina reprezintă un nou fenotip de rezistenţă este important ca LNR, care a
confirmat acest fenotip, să disemineze culturi prezervate din tulpina respectivă altor
LNR, pentru a fi inclusă printre tulpininile utilizate drept QC.
- Tulpinile cu un nou spectru de rezistenţă, nedescris până în prezent, nu pot fi folosite
pentru cercetări ştiinţifice decât cu aprobarea laboratorului de origine.

Testarea sensibilităţii la antibiotice poate fi executată şi imediat după identificarea prezumtivă, dar
identificarea definitivă trebuie terminată înainte de a raporta că tulpina în cauză depăşeşte valoarea MIC
critică la unul sau mai multe antibiotice .

Factorii care trebuie avuţi în vedere pentru instituirea unei politici de tratament includ:
- laboratorul trebuie să execute screening-ul şi să raporteze valorile antibioticelor curent
folosite în regiune şi, ideal, pentru cele alternative
- valorile critice ale MIC pot fi utilizate ca instrument pentru iniţierea investigaţiilor
epidemiologice pentru a determina dacă există o asociere între sensibilitatea la
antibiotice in vitro a unei tulpini şi evoluţia clinică
- cefalosporinele cu spectru larg, fluorochinolonele şi spectinomycina sunt recunoscute
ca cele mai eficiente antibiotice pentru tratamentul infecţiei gonococice
- antibioticul şi doza de administrare trebuie să fie eficiente pe cel puţin 95% din tulpinile
locale
- antibioticul trebuie să fie accesibil, iar preţul acceptabil.

Determianarea sensibilităţii la agenţii terapeutici ajută autorităţile de Sănătate Publică să revizuiască

continuu recomandările pentru tratamentul populaţiei locale şi să promoveze un control mai eficace al
bolii.

21
Anexa F. Prezervarea şi păstrarea tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae

N. gonorrhoeae este un microorganism foarte pretenţios şi fragil, şi în consecinţă, trebuie să se acorde

maximă atenţie preparării culturilor în scopul stocării. În timpul acestor operaţii este, bineînţeles,
obligatorie menţinerea sterilităţii.

Prepararea suspensiei bacteriene pentru stocare:

- Cu un tampon steril, rulat peste colonii izolate, se prepară o suspensie densă de cultură de 18-
24h în Trypticase Soy Broth (TSB) adiţionat 20% cu glicerol. Nu se utilizează laptele degresat
(skim milk) pentru prepararea culturii bacteriene deoarece acizii graşi din lapte sunt toxici.
- Suspensia se repartizează în criotuburi în cantitate de 0.5-1ml

Stocarea pe termen scurt.

- Tulpinile de N.gonorrhoeae izolate pot fi ţinute sub formă congelată în TSB adiţionat 20% cu
glicerol, maxim două săptămâni la – 20 0C.
- Containerul cu criotuburi se plasează cât mai departe de uşa congelatorului pentru a evita
dezgheţarea accidentală prin deschiderrea repetată a uşii.

Tulpinile de N.gonorrhoeae nu se stochează la temperatura camerei sau la + 4 0C.

Stocarea pe termen lung

- Congelarea la – 700C sau în azot lichid ( - 1960C) este metoda cea mai utilizată.
Pentru minimalizarea pierderii viabilităţii, congelarea suspensiei bacteriene pregătită ca mai
sus, se face rapid în baie de alcool cu gheaţă carbonică până la – 70 0C şi apoi se pune în
congelatorul de – 700C sau în azot lichid.
- Liofilizarea se utilizează în laboratoarele mari cu facilităţile necesare.
Cultura de 18-24h se suspendă în mediul special de liofilizare:

Polyvinyl-pyrrolidone (PVP) 5g
Sucroză 5g
Glutamat de Na 1g
AD ad 100ml
Sterilizare prin membrană filtrantă 0.2

Fiolele liofilizate sunt păstrate la + 4 0C sau – 200C. Anual se deschide câte o fiolă pentru
controlul viabilităţii. Dacă cultura resuspendată nu creşte în 48h se prepară fiole noi.

Recuperarea culturilor după stocare

- Culturile se decongelează la temperatura camerei şi se însămânţează pe mediu neselectiv, cu

ajutorul unui tampon steril. Inoculul trebuie prelevat înainte de decongelarea completă a culturii.
- Criotubul cu suspensia incomplet dezgheţată se poate repune în congelator pentru refolosire.
Dacă suspensia este decongelată complet, nu se mai recongelează şi se prepară o nouă
suspensie pentru stocare.
- Se face cel puţin o subcultură înainte de executarea oricărui test.

22
 - Tulpinile liofilizate sunt suspendate în PBS pH=7.2 sau în TSB şi apoi însămânţate pe mediu
neselectiv. Este de asemenea obligatorie cel puţin o subcultură înainte de orice test.
- Dacă se primesc tulpini liofilizate / congelate de la alte laboratoare este prudent ca
însămânţarea să se facă pe ambele medii, neselectiv şi selectiv, ca precauţie în cazul în care
tulpina nu este pură.

Anse bacteriologice încărcate cu cultură (Culti-Loops):

- anse de unică folosinţă utilizate ca suport pentru liofilizarea directă a culturilor standardizate de
N. gonorrhoeae în special pentru QC dar şi pentru orice tulpină
- fiecare pachet conţine câte 10 anse ambalate individual
- fiecare ansă conţine un film bacterian intact şi uscat; nu se folosesc ansele cu semne de
hidratare
- Culti-Loops se păstrează la 2-80C până la data consemnată pe ambalaj, din care se scoate
cantitatea strict necesară pentru utilizare imediată

Procedură:
- După scoaterea ansei din ambalaj, cu o foarfecă sterilă se detaşează ansa de mâner şi se
cufundă într-un tub cu 0.5-1ml mediu lichid (TSB), proaspăt preparat.
- Se plasează tuburile la 370C până când filmul bacterian ce conţine gelatină se dizolvă complet ,
după care tubul se agită uşor pentru suspendarea bacteriilor.
- Se însămânează câteva picături de suspensie pe mediu neselectiv, preîncălzit la 37 0C, şi se
incubează placa în condiţiile standard pentru 24-48h.

23
 Bibliografie

1. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility

Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Impotance in the Developing World – WHO
2003

2. Genital Tract Culture Manual – 2002, Toronto Mount Sinai Hospital,

Microbiology Dept.

3. CDC- Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP) – 1999, US Dept. of

Health and Human Services

4. Manual of Clinical Microbiology - 7th ed., 1999 – Murray et al.

5. Clinical Practice in STD – 1989, Robertson et al.

6. Laboratory Methods for the Diagnosis of Sexually Transmitted Diseases –

1987, Wentworth- Judson

24
25