Farmacie II

LUCRAREA 1

Norme de protecţie a muncii în laboratorul de microbiologie

In laboratorul de microbiologie se lucrează cu material infectios. Microorganismele potenţial

patogene sau patogene, pot fi izolate în diferite produse patologice (prescurtat p.p.) (ex. sânge,
urină, materii fecale, puroi, diferite alte secreţii etc) sau în culturi. Pentru prevenirea raspandirii
germenilor din materialul infecţios, precum si pentru a evita suprainfectarea acestor materiale cu
germeni straini, trebuie aplicate strict reguli de ordine interioara:
1. Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator. Cei care pot intra, o vor face după
însuşirea regulilor de protecţia muncii si semnarea procesului verbal;
2. Toate produsele biologice sunt considerate ca potenţial infecţioase;
3. Echipamentului de protecţie este obligatoriu (halat cu maneci lungi); în funcţie de situaţie ar
putea fi necesară purtarea de mănuşi, ochelari, mască etc;
4. Când becul de gaz este aprins, nu purtăm mănuşi de latex, în apropiere;
5. Nu este voie să se mănânce sau să bea în sala de lucrări practice;
6. Este interzisă introducerea în gură a oricărui tip de obiect; pipetarea cu gura nu este permisă;
7. Dacă există materiale contaminate, este bine să luăm legătura cu asistentul de grupă care ne
va sfătui cum trebuie să procedăm; toate activităţile de prelucrare a microorganismelor se
realizează în vecinătatea becului de gaz, aprins;
9. însămânţările se efectuează "la flacără"; Ansa bacteriologică se sterilizează ct la roşu", atât
bucla cât şi firul ansei (iar portansa se flambează) înainte şi după folosire;
10. Înainte de începerea oricărui test sau a oricărei manevre, trebuie să ne „schiţăm" în minte tot
ce avem de făcut; dacă este ceva care nu ne este clar, trebuie să întrebăm asistentul de grupă;
11. Pipetele contaminate nu se decontaminează „la roşu"; trebuie să le introducem în flaconul
pregătit de personalul catedrei, care este pus pe masa de lucru înainte de începerea lucrării
practice, conţinând substanţe dezinfectante;
12. Orice alt obiect, nemenţionat mai sus, trebuie decontaminat, dar pentru această activitate ne
adresăm asistentului de grupă;
13. In cazul în care are loc contaminarea accidentală a suprafeţei mesei de lucru, cu substanţe
diverse, cu reactivi, cu produse patologice sau culturi trebuie să anunţăm neîntârziat acest
eveniment asistentului de grupă; acesta ne va îndruma în procesul de decontaminare, după
caz;
14. La sfârşitului lucrului în laborator trebuie să se spele mâinile cu apă şi săpun.
Respectarea acestor norme de protecţie este strict necesară.
Exemple de echipamente care pot fi utilizate în laborator.
Exemple de echipamente care pot fi utilizate în laboratorul de microbiologic
In laboratorul de microbiologic putem utiliza:
I. Microscoape, lupe şi truse de coloranţi,
3. Termostate şi băi de apă sau de nisip,
4. Frigidere,
5. Centrifugi şi balanţe,
6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a ţesuturilor,
7. Aparate pentru distilarea şi demineralizarea apei,
8. Aparate pentru stabilirea pH-ului,
9. Fotometre sau colorimetre,
10. Distribuitoare pentru medii de cultură,
II. Aparate şi dispozitive pentru sterilizare şi dezinfecţie,
12. Containere pentru materialul contaminat,
13. Inventar de sticlărie,
14. Inventar de material plastic şi cauciuc,
15. Alte articole de laborator: trepiede, stelaje, site de azbest, becuri Bunsen, anse
bacteriologice, diferite tampoane etc.
Farmacie II

Cu toate că nu intră în „dotarea standard" a unui laborator în care se efectuează lucrările practice
pentru studenţi, trebuie să cunoaştem că există şi cabinete de siguranţă biologică (incinte, boxe,
nişe, hote), clasificate după cum urmează:
1. cabinetul de clasă I, în care,aerul curat antrenează aerosolii produşi dinspre persoana care
lucrează şi care se află în laborator către mediul exterior, printr-un filtru,
2. cabinetul de clasă II, în care aerul curat pătrunde filtrat, este recirculat prin filtre astfel
încât suprafaţa de lucru vine în contact cu aer steril,
3. cabinetul de clasă ITI este complet închis; medicul îşi introduce mâinile în zona de lucru
prin mănuşi fixate etanş la aparat; aerul este atât admis cât şi evacuat prin filtre.

Recoltarea şi transportul produselor patologice în examenul virusologic

Obţinerea unui rezultat corect la examenul microbiologic impune respectarea unor reguli privind:
• modul de recoltare al produsului patologic (PP)
• metodele de conservare
• modalităţile de transport

Se pun următoarele întrebări:

Ce se recoltează? – care este PP sugestiv pentru stabilirea diagnosticului
- Căutăm virusul:
- la poarta de intrare
- în organe ţintă
- căile de răspândire (sânge, ganglioni)
- căile de eliminare (intestin, secreții, lichid vezicular)
- Căutăm antigenele virale
- umori
- exsudate
- sânge
- urină
- Căutăm anticorpii specifici antivirali
- sânge

Cum se recoltează? – care este calea de acces indicat ă pentru prelevarea PP

Cât se recoltează? – cantitatea produsului prelevat
Când se recoltează? – care este momentul optim de recoltare
În ce scop se recoltează? – precizarea examenelor de laborator solicitate

Se ţine cont de următoarele reguli:

• se folosesc recipiente curate şi sterilizate pentru a preveni contaminarea probelor
• evitarea contactului cu substanţe antiseptice/dezinfectante a produsului
• în unele cazuri trebuie folosite medii de transport
• recipientele de transport se închid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului şi a
personalului care manipulează PP
• produsul să fie însoţit de un bilet de trimitere completat corect
• probele să fie etichetate şi transportate la laborator în cel mai scurt timp posibil

5
Farmacie II

Pentru examen virusologic

- se transportă imediat în recipiente închise ermetic, pe gheaţă, însoţite de formular de cerere de

analiză completată corespunzător
- unele virusuri sunt deosebit de labile şi îşi pierd viabilitatea/infectivitatea rapid (ex:
citomegalovirus, varicella-zoster virus, virusul respirator sinciţial), de aceea dacă produsele nu
pot fi prelucrate imediat trebuie congelate rapid la -70 C
- produsele nu se congelează la -20 C (virusurile îşi pierd viabilitatea)

Nr. Produsul Examen virusologic

Crt. patologic
1. Exudatul se şterge ferm mucoasa faringiană cu un tampon uscat
faringian tampoanele încărcate se aşează în mediu de transport, se
păstrează/se transportă la laborator pe gheaţă
izolarea virusurilor de pe tampoane este mai puţin eficientă
decât izolarea din aspirate sau lavaje, dar recolta rea cu
tamponul este mult mai uşor de efectuat
se transportă la laborator pe gheaţă

2. Secreţia nazală se roteşte tamponul umectat cu mediu de transport în

cavitatea nazală
tampoanele încărcate se aşează în mediu de transport, se
păstrează/se transportă la laborator pe gheaţă
se transportă la laborator pe gheaţă
3. Secreţia nazo- tamponul inserat pe tijă flexibilă se introduce printr-o nară
faringiană pân ă ce se atinge peretele posterior al nazofaringelui, se
aşteaptă câteva secunde şi se retrage
în primele 5 zile de la apariţia simptomelor
se transportă la laborator pe gheaţă
4. Sputa se transportă la laborator pe gheaţă
5. Sânge în cursul diagnosticului serologic
o se recoltează sânge în vacutainere f ără anticoagulanţi
(dop roşu)
o sângele recoltat se transport ăfără refrigerare, la
temperatura camerei
o serul este separat în laborator.
în cazul determinării statusului imun
o se recoltează o singură probă
o pentru detectarea infecţiilor acute se recoltează probe
perechi
o probă de sânge în perioada de stare a bolii
o probă în starea de convalescenţă, interval de 10-14
zile între probe

6. LCR Recoltarea se face în primele 7 zile de la debut

se transportă la laborator pe gheaţă

6
Farmacie II

7. Urina se recoltează jetul mijlociu în recipient steril cu capac filetat

se transportă imediat la laborator pe gheaţă
recoltarea se face
o în primele 2 săptămâni de boal ă
o pentru CMV – oricând pe durata boli
se transportă la laborator pe gheaţă

8. Secreţiile se transportă la laborator pe gheaţă

genitale – la
femei
9. Secreţiile se transportă la laborator pe gheaţă
genitale – la
bărbaţi
10. Materii fecale scaun emis spontan
primele 2 – 3 zile de boală
NU conservanţi, medii de transport
NU recoltare cu tamponul – o mare parte de virus se absoarbe
pe tampon
conservare
o refrigerare la 40C
o congelare la -700C
container steril
5 – 10 cm 3
11. Leziuni Lichid vezicular şi raclaje
tegumentare o şansa izolării virusurilor din vezicule este cea mai mare în
primele 3 zile de la apariţia leziunilor
o se aspiră conţinutul veziculelor cu ac steril subţire şi se
introduce într-un volum mic de mediu de transport
o dacă vezicula se sparge, se poate efectua recoltarea cu un
tampon, raclând baza veziculei pentru a ob ţine şi celule,
tamponul încărcat se introduce în mediu de transport
o se transportă pe gheaţă

Cultivarea virusurilor pe culturi celulare

Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive.

Cultura celulară: sistem biologic in vitro alcătuit din celule izolate vii, care îşi păstrează
capacitatea de multiplicare şi nu se organizează în ţesuturi.
Condiţii necesare pentru păstrarea în viaţă a celulelor din cultura celulară:
- condiţii aseptice
- mediu nutritiv (mediu de cultură lichid ce conţine substanţe nutritive, sursă de energie,
factori de creştere, vitamine, sistem tampon, indicator, antibiotice şi antifungice) – mediile
comercializate Eagle, Hanks, M199
- pH adecvat
- temperatură constantă
- atmosferă cu 10% CO2

În funcţie de provenienţa celulelor, culturile celulare se clasifică în:

- culturi de origine animală sau umană
- culturi de celule embrionare sau adulte
- culturi de celule normale sau tumorale
 Farmacie II

Culturile celulare primare sunt culturi realizate direct din ţesuturile sursă.
Liniile celulare stabilizate derivă din culturile primare, se menţin în viaţă timp nelimitat prin
subcultivări.

Realizarea culturilor primare din ţesuturi solide

- se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice

- se fragmentează ţesutul în bucăţi de aprox. 1 mm3, se spală cu soluţie salină
tamponată (SST) pentru îndepărtarea sângelui
- disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare în soluţie de
tripsină 0,25% (enzimă proteolitică, desface legăturile peptidice) pe agitator magnetic (ajută la
desfacerea legăturilor intercelulare)
- colectarea celulelor izolate în vas colector – se face prin filtrare pentru a obţine numai
celule izolate
- repetare tripsinizării până la epuizarea ţesutului, în timpul tripsinizării vasul colector
se păstrează la temperatura de 4C pentru inactivarea tripsinei
- centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea supernatantului (tripsina),
spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv
- controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se colorează
celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să fie vii)
- numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000 celule/ml, repartizare
volume egale în flacoane de culturi celulare
- incubare în poziţie culcată
- urmărirea formării culturii cu microscopul inversat

Culturi provenite din celule:

- normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică până acoperă peretele

flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul inhibiţiei de contact)
- tumorale: se multiplică şi după acoperirea suprafeţei disponibile, cresc în mai multe straturi şi
în suspensie

Subcultivarea culturilor celulare

După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează substanţele nutritive, sursele de

energie, se acidifică mediul. Pentru menţinerea celulelor în viaţă, acestea trebuie pasate,
subcultivate. Se realizează prin versenizare:
- celulele se detaşează de pe peretele flaconului cu soluţie de EDTA (versen)
- se centrifughează
- se spală cu soluţie SST
- se resuspendă în mediu nutritiv
- se verifică viabilitatea celulelor, se numără celulele şi se ajustează la concentraţia
optimă. Se repartizează volume egale în flacoane de cultură celulară.

Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de câteva ori (4-
6) după care celulele mor (apoptoză)
Farmacie II

Culturile realizate din ţesuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule
nediferenţiate), de 60-80x, după care mor.
Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se obţin din ţesuturi tumorale
(HeLa, KB, Detroit, etc) sau din culturi celulare efectuate din ţesuturi normale care au suferit
transformare malignă spontană (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se manevrează
uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.

Inocularea suspensiilor virale în culturile celulare, identificarea izolatelor virale

- se îndepărtează mediul nutritiv şi se introduce în flacon suspensia virală pregătită în

prealabil.
- după o incubare de 1 oră (penetrarea virusurilor în celulele receptive) suspensia se
decantează, se adaugă mediu de întreţinere (mai sărac în substanţe nutritive decât mediul
nutritiv, dar care permite supravieţuirea celulelor)
- se incubează
- în zilele următoare se urmăresc modificările survenite în cultura celulară.
• urmărirea efectelor citopatice (desprinderea celulelor de pe suprafaţa pereţilor,
rotunjirea celulelor, agregarea lor în ciorchine, formarea sinciţiilor)
• detectarea incluziilor virale
• hemadsorbţia – se foloseşte la detectarea replicării virale în cazul în care virusul nu
produce efect citopatic (virusul influenza): membrana celulelor în care se replică virusul are
structura modificată, hematiile adăugate aderă de acestea
• interferenţa: se bazează pe faptul, că o celulă deja infectată cu un virus nu poate fi
infectată cu un alt virus – se foloseşte pentru detectarea virusurilor neproducătoare de ecp
• formarea plajelor
• transformarea spontană
• microscopia electronică
• detectarea antigenelor virale prin reacţii antigen-anticorp
• detectarea acizilor nucleici virali – reacţii de hibridizare, PCR
Farmacie II

Izolarea virusurilor pe oul de găină embrionată

Camera de aer Membrana proprie

Membrana

corioalantoideană
Embrion

Coaja oului
Sacul vitelin Cavitatea amniotică
Inocularea virusurilor se poate face pe: Cavitatea alantoideană
- membrana corioalantoideană
- cavitatea alantoideană sau amniotică
- sacul vitelin
- venele alantoidiene
- embrion

Inocularea pe membrana corioalantoideană

Farmacie II

- la ovoscop se notează pe coajă poziţia camerei de aer şi zona unde membrana

corioalantoideană este cel mai bogat vascularizată
- se antiseptizează coaja în cele două locuri notate anterior
- se perforează cu un ac coaja în zona camerei de aer
- cu o freză se decupează un triunghi din coajă la nivelul membranei
- se perforează membrana proprie şi se aspiră aerul din camera de aer cu ajutorul unei
tetine din cauciuc (membrana proprie se dezlipeşte de membrana corioalantoideană)
- se îndepărtează porţiunea vizibilă din membrana proprie, evidenţiindu-se direct
membrana corioalantoideană
- se depune pe membrană produsul de inoculat cu o pipetă
- după inoculare se astupă orificiile create cu lamelă de sticlă şi parafină

Izolarea virusurilor în animale de laborator

La această metodă se recurge în momentul în care celelalte metode sunt

nesatisfăcătoare. Este necesară cunoaşterea metodelor de contenţie a animalelor
Înainte de inoculare animalele sunt marcate, dacă este necesar sunt anesteziate
(intervenţii dureroase), iar locul inoculării se epilează şi se antiseptizează.
Inocularea se face prin diferite căi:
- intradermic
- subcutanat
- intramuscular
- intravenos
- intraperitoneal
- intranazal
- intracerebral

Suspensiile virale sunt inoculate prin injecţie, inhalare, ingestie, badijonare, etc…

Schema diagnosticului virusologic

I. Metode directe

1. Determinarea virusului, antigenelor virale, acizilor nucleici virali direct din

produsul patologic
o examen microscopic
evidenţierea incluziilor virale – microscopie optic ă microscopie electronică
o reacţii antigen-anticorp (evidenţierea antigenului)
o reacţii de hibridizare, amplificare genică (PCR)

2. Cultivarea virusurilor pe:

o culturi celulare, linii celulare
o oul de găină embrionat
o animale de laborator
Farmacie II

3. Identificarea virusului izolat

o prin modificările caracteristice apărute pe culturile celulare, OGE,
animale de experienţă
o prin metodele de la punctul 1.

II.Metode indirecte
- detectarea anticorpilor din serul bolnavilor
- anticorpii se urmăresc în dinamică
Seroconversia: creşterea titrului de anticorpi în probele de ser recoltate la interval de 10-14 zile
(demonstrarea unei infecţii recente, actuale)

TITRUL DE ANTICORPI

timp
momentul infecţiei A B C D

probele A, B: creşterea titrului de anticorpi = seroconversie – infec ţie recentă, diagnostic

pozitiv
probele C, D: nu se detectează seroconversia; infecţia a avut loc în trecut;

Morfologia virală

· Virion = virus
o unitatea virală, morfofuncţională, completă, intactă, infecţioasă, cu diametrul cuprins
între, capabil să infecteze bacterii, plante, animale, omul
· Se multiplică doar în interiorul unei celule vii

· Structura virusurilor
o genom viral - ARN/ADN
o capsida
o înveliş viral

· Morfologia virală
o cubică/icosaedrică: v. herpetic, adenovirus (d), polio (e)
o helicoidală: v. gripal, v. rabic (a,b)
Farmacie II

o binară: bacteriofag (c)

· Aspectul electrono-microscopic al virusurilor

o sferic: v.gripal (b), v.herpetic (d), v. HIV (f)
cilindric, bastonaş: v. mozaicului tutunului
o paralelipiped: v. variolic, v. vaccinia
o cartuş: v. rabic (a)
o filamentos: v. Ebola
o sferic cu coadă: bacteriofag (c)

Dimensiuni
o variabile, variind de la 20-900 nm
o se evidenţiază doar la microscopul electronic

E. coli (bacterie)

v. vaccina

v. mozaicului tutunului poliovirus

adenovirus

Examenul microscopic

Examinare prin microscopie optică (MO)

Prin MO pot fi urmărite incluziile virale (aglomerări de particule virale situate intranuclear sau
intracitoplasmatic).

Coloraţia Mann
Permite evidenţierea incluziilor pe secţiuni de organe incluse în parafină.
Modul de lucru:
· Deparafinare – hidratare în apă distilată
· Amestec de colorant: albastru de metil + eozină gălbuie (24 de ore la 37 C,
1,5-2 ore la 56 C)
· Spălare: alcool absolut
· Diferenţiere cu alcool sodat (preparatul devine roz)
· Spălare: alcool absolut
· Trecere rapidă prin acid acetic (preparatul devine albastru)
Farmacie II

· Clarificare cu xilol
· Montare în balsam de Canada
Se vor colora:
· citoplasma în albastru
· nucleul în violet
· nucleolii în roşu violet
· incluziile în roşu strălucitor
· Ex.: studierea incluziilor virale Babeş-Negri formate de virusul rabiei

Microscopia electronică (ME)

Permite studierea morfologiei, structurii virale.

Pentru ME pot fi prelucrate materiale sub formă de suspensii sau secţiuni.
Prepararea secţiunilor din fragmente de ţesut sau culturi celulare:

· După un anumit tratament (prefixare cu glutaraldehidă, fixare cu tetraoxid de

osmiu, deshidratare) fragmentele se includ în răşini sintetice polimerizabile
(Durcupan, Vestopal), într-o capsulă de gelatină. Răşinile au proprietatea de a se
solidifica în urma polimerizării la 65-95 C.
· Din secţiunile incluse în răşină şi solidificate se decupează secţiuni având
grosimea între 56-200A cu ajutorul ultramicrotomului.
· Pentru susţinerea preparatului examinat se folosesc grile speciale (plasă
metalică ţesută). Pe aceasta se depune o picătură din suspensie sau secţiune
pregătită în prealabil.
· Se efectuează o colorare negativă cu acid fosfotungstic.
· După uscare se examinează la ME, cu o mărire de 20000-40000x, se
efectuează fotografii.
· Se studiază particula virală, forma, detaliile de suprafaţă, incluzii.

Metode îmbunătăţite
· ultracentrifugarea suspensiilor direct pe grilă – permite o depunere şi ataşare
mai fermă a particulelor, a celulelor
· criomicroscopia electronică – se prelucrează secţiuni congelate
· imunomicroscopie electronică – pe grila îmbrăcată cu anticorpi se ataşează
virusurile cu antigenele corespunzătoare