Variabilitatea somaclonală si importanta sa,

in ameliorarea plantelor

1.Definiție, tipuri ale variabilității somaclonale

Variabilitatea manifestată de plantele regenerate din culturi in vitro a fost numită

variabilitate somaclonală (Larkin și Scowcroft,1981). Pentru desemnarea variabilității plantelor
originare din protoblaști și gametofiți se mai folosesc și termenii de variabilitate protoclonală și
respectiv gametoclonală.
Variația generată in vitro, este de două tipuri: genetică (mutațională) și epigenetică (de
expresie). Atunci când nu se cunoaște natura variației, se folosește termenul variantă. Termenii
de variație genetică sau mutantă se utilizează pentru a desemna variația care se transmite sexuat
conform legilor eredității sau se menține la mai multe generații obținute prin multiplicare
vegetativă. Variația epigenetică – rezultat al modificării expresiei genelor, este, de obicei,
instabilă.

2. Metode de obținere și evaluarea a variabilității somaclonale

Pentru a obține plante mutante sau variante somaclonale, se recomandă parcurgerea

următoarelor etape:
- Introducerea și apoi menținerea calusului sau a suspensiei celulare, prin subcultivări
repetate;
- Regenerarea unui mare număr de plante din celulele cultivate, timp îndelungat, sub formă
de calusuri sau suspensii;
- Studierea plantelor regenerate și a descendenței lor pentru identificarea caracterelor
calitative și cantitative variabile;
- Evaluarea stabilității caracterului selecționat, în decursul mai multor generații;
- Multiplicarea și/sau utilizarea în programele de ameliorare a mutantelor/variantelor
stabile.

1
 În funcție de scopul urmărit, există două opțiuni: stabilitate sau variabilitate. Stabilitatea este
dorită în micropropagare și inginerie genetică, în timp ce variabilitatea este utilă în selecție și
ameliorare. În ambele cazuri, trebuie evaluată populația plantelor regenerate la nivel fenotipic,
biochimic, citogenetic și molecular. De asemenea, ori de câte ori este posibilă, este oportună o
analiză a descendenței, pentru a se stabili natura și modul de transmitere ereditară a modificărilor
apărute. De exemplu, la speciile ornamentale, plantele regenerate in vitro prezintă numeroase
variații somaclonale ale unor caractere calitative, identificabile prin studiul morfologiei
frunzelor, florilor etc. (tabelul 1).( Mohan Jain și Geert–Jan DeKlerk, 1998)

Tabelul 1

Variația somaclonală observată la plantele ornamentale, regenerate in vitro (după

Mohan Jain și Geert–Jan DeKlerk, 1998)

Specia Morfologia Morfologia Culoarea Forma florii Variegarea

frunzei frunzei florii frunzei
Violeta africană - + + + -
Begonia + + + + -
Anturium + - - - -
Crizantemă + + + + -
Garoafă + - + + -
Coleus - - - - -
Ciclamen + + + + -
Dalia + - - - -
Crin + - - - -
Fuxia - - + + +
Gerbera + + + - -
Hawortia + + - - -
Kalanchoe + + + + -
Koleria + + + + -
Margareta + + - - -
Orhidee - - + + -
Pelargonium + + + + +
Petunia - + - + -
Poinsetia - - - - +
Ranunculus + - + - -
Rododendrom + + - + -
Trandafir + + - - -
La crizanteme, a fost raportată și variabilitatea unor caractere cantitative: înălțimea
plantei, nr. de flori, etc.

2
Evaluarea calitativă ți cantitativă a unor enzime, proteine sau metaboliți secundari, permite
identificarea variantelor somaclonale apărute ca urmare a unor mutații genetice sau a
modificărilor induse de cultura in vitro, în modul de reglare al expresiei familiilor de multigene.
De exemplu, rezultatele studiului comparativ al cantităților de alcaloizi tropanici și al spectrelor
alcaloidice de 19 gametoclone și la plante de origine, aparținând speciei Datura innoxia (laur
indian), au evidențiat o amplă variabilitate mai ale din punct de vedere calitativ.
Studiul numărului și structurii cromozomilor permite corelarea modificărilor fenotipice
cu schimbările induse in vitro la nivelul genomului. La lucernă, analiza cariotipului unei
protoclone ce prezintă modificări fenotipice a evidențiat existența unui număr aneuploid de
cromozomi și a două translocații.
Prin metodele moleculare, este posibilă evidențierea variației metilării ADN, ca și a
modificării succesiunii bazelor sau a numărului de copii ale secvențelor repetate la plantele
regenerate din celule care au parcurs unul sau mai multe cicluri de cultură in vitro. Atunci când
variuațiile fenotipice ale somaclonelor nu pot fi asociate unor modificări ale structurii și/sau
numărului cromozomilor evidențiate prin analiye citogenetice, trebuie studiată descendența
obținută prin autofecundare. Într-un asemenea caz, pot fi întîlnite mai multe situații :
- Identificarea descendenței cu planta de origine,
- Uniformitatea descendenței în privința unui caracter fenotipic nou,
- Segregarea descendenței conform rapoartelor mendeleiene.
În primul caz, este vorba de variante. În al doilea, de o mutație homozigotă, de o expresie
genetică nouă sau de amplificarea ori deleția regiunii de pe cromozom implicate în determinarea
caracterului respectiv. În al treilea caz, este vorba de o mutație la nivelul unui locus implicat în
determinarea unui caracter calitativ. Mutație care poate fi dominantă, codominantă sau recesivă.
Mutațiile genetice pot fi induse și prin transpoziție sau restructurări cromozomiale minore, care
nu pot fi detectate prin analiza cariotipului . Pentru a determina compartimentul celular implicat
în apariția variabilității și modului de transmitere a noului caracter, se poate recurge și la
încrucișări dialele sau reciproce.
4. Factorii care influențează spectrul și amplitudinea variabilității somaclonale

Apariția variabilității în populațiile regenerațiilor este o regulă. Frecvența și natura

variațiilor depind de o serie de factori, a căror implicare va fi ilustrată, în majoritatea cazurilor,
prin rezultatele unor cercetări proprii.

3
 Modul de regenerare. La Datura innoxia, toate plantele regenerate prin embriogeneză
somatică directă au fost diploide, în timp ce 70% dintre regenerații obținuți prin organogeneză
indirectă au fost poliploizi. Stabilitatea regeneraților obținuți prin embriogeneză somatică a mai
fost raportată și la speciile Panicum, Pennisetum, Horodeum etc. (Badea E.M., Raicu P., 1983)
Natura explantului. În general, regenerații din explante organizate, cu meristeme
preformate din plantă, sunt stabili din punct de vedere genetic. Explantele lipsite de meristeme
preformate, care dediferențiază, generează însă o mare variabilitate, pentru că sunt formate din
tipuri celulare, diferențiate structural și funcțional. La numeroase specii de plante, diferențierea
celulară, este însoțită de modificări calitative și cantitative, ale ADN genomic, endopoliploidie,
amplificarea sau deleția unor secvențe etc. În consecință, atunci când sunt folosite, ca explante
pentru obținerea calusului segmente de frunză sau rădăcină, celulele diferențiate dediferențiază,
adică încep să se devidă. Condiția nucleară in vivo se va reflecta, astfel in vitro, prin formarea
unei populații de celule cu modificări la nivelul genomului. Modificări ce se vor regăsi și la
regeneranți.
Natura explantului influențează atât frecvența, cât și spectrul variațiilor. De exemplu, la
soma și gametoclone de grâu, a fost înregistrat un singur tip de modificare a gluteninelorcu
greutate muleculară mare, cu o fregvență mai mare la plantele cu originea în microspori (tabelul
2). În schimb fregvența variațiilor enzimogramelor beta-amilazei a fost de numai 13% la
gametoclone, ți de 59% la somaclone.
Tabelul 2

Numărul și frecvența variațiilor subunităților gluteninice cu greutate moleculară mare

la gameto și somaclone, comparativ cu linia de origine (*)

Tipurile Nr. Tipurile de preoteinograme Totalul variațiilor

I* II
regenerării plantelor
Nr. % Nr. %
Nr. %
analizate
Gametoclone 16 12 75 4 25 4 25
somaclone 38 36 95 2 5 2 5

Genotipul. Influențează atât capacitatea de regenerare in vitro, cât și amplitudinea

variației somaclonale. De exemplu, la somaclone de grâu provenite din două soiuri și două linii
dublu haploide au fost evidențiate, prin studiul meiozei, diferențe genotipice majore. Frecvența

4
aberațiilor meiotice a fost de 27,77% la plantele provenite din cele două soiuri, și de 72,72% la
regeneranții derivați din haploizii dublați. Aceste rezultate sugerează faptul că plantele care au
mai parcurs un ciclu de cultură in vitro, ciclu destinat obținerii haploizilor sunt mai puțin stabile
dacăt soiurile, prezentând cu o frecvență mare (42,65%)restructurări cromozomiale, sugerate de
anomaliile din meioză.
Nivelul de ploidie. În general, frecvența variației somaclonale este mai mare la speciile
poliploide și las cele propagate vegetativ (trestia de zahar, cartoful, unele plante ornamentale
etc.). Amplitudini remarcabile ale variației somaclonale au fost înregistrate însă și la unele specii
care se reproduc sexuat, fie ele poliploide (lucerna) sau diploide (orezul).
Durata culturii. Calusurile și suspensiile celulare menținute in vitro, timp îndelungat
sunt o excelentă sursă de variabilitate. Există însă riscul ca ele să își piardă complet potențialul
regenerativ. Dacă se urmărește stabilitatea clonală, se reduce deci la minim timpul menținerii
culturilor in vitro (in cazul micropropagării) sau se recurge la crioconservare (în cazul băncilor
de germoplasmă). În întreprinderile care practică micropropagarea în scop comercial, culturile
unor specii ornamentale sunt reinițiate periodic, deoarece creșterea numărului de cicluri de
propagare este asociată cu frecvența mare a apariției varianțelor fenotipice.
Substanțele reglatoare ale creșterii. Efectele unui anumit tip de hormoni asupra
frecvenței variației somaclonale nu sunt pe deplin elucidate. Creșterea amplitudinii variației
manifestate de regeneranți odată cu sporirea concentrației hormonilor, în mediile de cultură in
vitro, a fost demonstrata însă la căpșun ,begonie. Se presupune că hormonii nu au efect mutagen
direct, și acționează indirect, stimulând creșterea neorganizată sau selecționând celulele cu un
anumit nivel de ploidie.
5. Tipuri de modificări genetice asociate variabilității somaclonale
În celula vegetală cultivată in vitro, apar frecvent o serie de modificări la nivelul
materialului genetic: poliploidii, aneuploidii, restructurări cromozomiale, schimbări ale structurii
și expresiei genelor etc., Unele dintre aceste modificări au fost observate și descrise și la plantele
obținute prin mutageneză clasică. Modificări prezentate în continuare în funcție de frecvența
apariției lor in vitro comparativ cu mutageneza clasică.
a) Modificări similare cu cele obținute prin mutageneză clasică: poliploidia și
aneuploidia

5
 Prin cultura de celule și țesuturi in vitro, au fost obținuți poliploizi la numeroase specii cultivate:
orez, orz, porumb, tutun etc. La Nicotina tabacum, din clus indus din măduvă de tulpină
prelevată de la plante haploide și diploide au fost obținuți dihaploizi și respectiv tetraploizi cu o
frecvență variabilă în funcție de soi. (tabelul 3) (Badea E.M., Raicu P., 1983)
Tabelul 3

Regenerarea poliploizilor în culturi de calus la tutun

Soiul Nr. cromozomilor ai Nr. plantelor Rata plantelor

n 2n 4n
plantei donor analizate
Virginia n 42 41 52 7
Havana N 33 42 50 8
Havana 2n 26 - 60 40
Frecvența mare a diploizilor în populația de plante regenerate din calus haploid recomandă
regenerarea in vitro, drept o tehnică eficientă de obținere a haploizilor dublați la tutun.
Poliploidia poate preexista în explante sub forma celulelor cu nuclei endoreduplicați, dar poate să
apară și in vitro, prin două mecanisme: perturbarea funcției fusului micotic și endoreduplicarea
cromozomilor.
Cercetările citogenetice efectuate în cursul procesului de calusare a explantelor constând din
embrioni imaturi au evidențiat apariția celulelor poliploide in vitro la grâu. În momentul
inoculării, toate mitozele din celulele explantelor au fost normale și diploide. Variabilitatea
cromozomială a apărut foarte repede în cultură (într-un interval de 1-2 zile), cu o rată diferită în
funcție de genotip, dar a scăzut treptat în perioada de calusare (tabelul 4), fapt ce sugerează
existența unui proces de eliminare a tipurilor celulare care suferă de pierderi mari de informație.
(Verzea M., et. co.1993)
Tabelul 4
Frecvența aberațiilor mitotice și a celulelor poliploide și a celulelor poliploide în
calusurile de grâu în curs de formare
Vârsta Celule de diviziune
calusului Specia nr Rata Sx d p Celule tetraploide
aberațiilor 0,1% % Sx d P
% 0,1%
8 Triticum aestivum 235 6,70 1,63 4,18 *** 2,59 0,07 1,33 ***
Triticum durum 160 2,52 0,09 1,26 0,06

6
16 Triticum aestivum 150 6,92 0,16 2,67 *** 1,41 0,07 0,02 ***
Triticum durum 236 4,25 0,08 1,43 0,05
24 Triticum aestivum 319 2,53 0,04 0,90 *** 0,67 0,02 0,75 ***
Triticum durum 320 0,05 0,05 1,42 0,02

Variabilitatea cromozomială descrisă în calusurile de grâu a fost clasificată în:

- Poliploidie (nu mai mare de 4n)
- Aneuploidie (anafaze și telofaze cu cromozomi retardați)
- Restructurări cromozomiale (inele, fragmente punți)
Aneuploidia este indusă in vitro prin fragmentarea nucleară (amitoză) a celulelor cu grad
mare de endopoliploidie, urmată de mitoză sau de comportarea anormală a cromozomilor în
cursul mitozei. Aneuploizii sunt mai frecvenți în populațiile de plante regenerate la speciile
poliploide decât la speciile diploide. Frecvența apariției plantelor aneuploide este influențată de
asemenea, de tipul de sistem de cultură și de durata culturii.
b) Modificări similare celor obținute prin mutageneză clasică, dar înregistrate cu
frecvențe mai mari in vitro: restructurările cromozomiale și mutațiile citoplasmatice
Analiza cariotipului în celulele mitotice ale plantelor regenerate și studiul meiozei sunt
modalități de evaluare a variațiilor numerice și structurale ale cromozomilor induse prin
cultivarea in vitro. Modalități care au făcut posibilă evidențierea prezenței translocațiilor
reciproce, a delețiilor, inversiilor, fragmentelor centrice și acentrice, a izocromozomilor și
cromozomilor dicentrici. Aceste rearanjamente crozomiale pot determina pierderea unor gene
sau modificarea expresiei genelor ca urmare a “efectului de poziție”. De exemplu, cu ocazia
studiului meiozei la somaclone de Avena, s-a constatat că anomaliile cele mai frecvente au
constat în rupturi și pierderi de fragmente cromozomiale. Peste 20% din plantele regenerate
prezentau una sau mai multe translocații si/sau deleții. La grâu, analiza meiozei la somaclone a
evidențiat o frecvență neobișnuit de mare a translocațiilor. Rezultatele analizelor efectuate la 29
de somaclone de grâu au evidențiat prezența univalenților și cromozomilor retardași în anafaza I
și a micronucleilor în tetrade. Aceste anomalii meiotice observate la nivelul plantelor regenerate
sugerează apariția delițiilor și/sau translocațiilor în celulele cultivate in vitro care au parcurs
procesul de regenerare. De altfel, existența unor celule cu fragmente de cromozomi ți cu
cromozomi inelari în calusurile de Triticum aestivum, și de Triticum durum, confirmă această
supoziție. (Verzea M., et. co.1994)

7
 La plantele regenerate din culturi in vitro au fost observate și rearanjamente de ADN
cloroplastic (cp) și ADN mitocondrial (mt). De asemenea, a fost semnalată apariția unor plantule
albinotice în cursul regenerării. La cereale apar frecvent astfel de plante în populațiile
regeneranților cu originea în microspori. Fenomenul a fost corelat cu deliția unor regiuni mari de
ADN cp. Pe de altă parte, cultura de țesuturi amplifică și variația ADN mt, cel mai cunoscut caz
fiind regresia porumbului cu citoplasmă T și androsterilitate, la fertilitate.
c) Mutații specifice culturilor in vitro
Din această categorie fac parte: mutantele homozigote recesive; modificarea expresiei
genice în familiile de multigene; amplificarea sau reducerea numărului de copii ale unor secvențe
repetate etc.
Regenerarea unor mutații homozigote recesive din explante heterozigote pentru un
anumit caracter are la bază crossing-over-ul mitotic.
La grâu, a fost studiată variabilitatea indusă de cultivarea in vitro la nivelul locilor
implicați în sinteza unor enzime și proteine de rezervă. Au fost detectate subunități proteice noi ,
aui apărut noi fracții enzimatice fost modificată mobilitatea electroforetică a acestora. A fost
emisă ipoteza conform căreia rearanjamentele induse in vitro ar putea modifica expresia unei
familii de multigene, determinând fie represia unor gene anterior exprimate, fie derepresia unor
gene anterior represate.
Aproximativ 90 % din genomul plantelor superioare este format din ADN repetitiv. Cele
mai multe secvențe sunt înalt sau moderat repetate. Secvențele repetate sunt dispuse în tandem
sau sunt intercalate în genom. O clasă de secvențe repetate codifică ARN. Numărul copiilor/
nucleu variază, de la o specie la alta, într-un interval foarte larg: de la 1300 la 31900.
La cereale, au fost evidențiate la regeneranți schimbări atât calitative cât și cantitative,
amplificări ca și reduceri ale secvențelor ADN ribozomal. La tutun, studiul meiozei la dihaploizi
a evidențiat existența mai multor regiuni cromozomiale amplificate. (Badea E.M., Dăndulescu
D., 2001)

6. Mecanismele variabilității somaclonale în ameliorarea plantelor

Până în prezent au fost avansate trei ipoteze, care sunt prezentate în funcție de numărul
dovezilor acumulate ulterior în sprijinul lor.

8
 Karp (1991,1994) a propus ca mecanism care determină apariția cu frecvență mare a
variațiilor ereditare schimbarea nivelurilor de metilare a ADN, care induce modificări în
frecvența bazelor, prin tranziții de tipul C þ T sau C þ A, și în structura cromatinei. Intensificarea
metilării întârziată ce duce la apariția punților de anafază, la ruperea cromozomilor și la
rearanjamente (translocații, inversii, duplicații, deleții) .
Barbara McClintock (1984), a sugerat că apariția variabilității genetice in vitro este o
reacție de stres. În discursul susținut cu ocazia primirii premiului Nobel, ea a spus: ”Izolarea,
cultivarea în condiții artificiale și obținerea calusului sunt tot atâtea experiențe traumatizante
pentru celule. În aceste condiții, resetarea genomului poate fi anormal reprogramat, sau chiar
restructurat. Aceste schimburi pot da naștere unor expresii fenotipice dintre cele mai diferite.
Expresii care apar la plantele regenerate și la descendenții lor.”
De Klerk (1990) leagă variabilitatea somaclonală de rolul meristemelor în plantă. Rol
care nu se limitează la construirea corpului plantei, ci include și formarea noii generații sexuate.
Pentru că, la un moment dat, se transformă în meristeme florale, meristemele vegetative
funcționează într-un mod similar liniei germinale de animale. În consecință, stabilitatea genetică
trebuie menținută numai în meristeme.

7. Utilizarea variabilității somaclonale în ameliorarea plantelor

Variația somaclonală prezintă atât avantaje cât și dezavantaje considerabile.
Principalele dezavantaje sunt determinate de faptul că apariția și frecvența variațiilor
depind de genotip. Foarte multe schimbări sunt fie lipsite de importanță fie nedorite. Altele sunt
instabile (epigenetice). Multe variații nu sunt noi. Ele au mai apărut fie spontan, fie induse prin
mutageneză. Adesea, caracterele de interes economic nu sunt afectate de variații. În consecință
nu există certitudinea că parcurgerea unui ciclu de cultură va induce modificarea oricărei însușiri
care prezintă un interes specific.
Unul dintre cele mai importante avantaje constă în faptul că variabilitatea somaclonală
este o potențială sursă suplimentară de caractere utile, prețioasă mai ales în cazul speciilor care
înmulțindu-se asexuat sau fiind apomictice, au o bază genetică limitată. La unele specii,
frecvența mare a modificării unor caractere face din variabilitatea somaclonală o sursă de mutații
utile. De exemplu, la grâu au fost regenerate somaclone cu proteine de rezervă modificate. Rata
mare a dublării numărului de cromozomi permite, la unele specii, diploidizarea haploizilor sau

9
obținerea poliploizilor prin regenerarea plantelor in vitro. De asemenea, incidența mare a
rearanjamentelor structurale – mai ales a translocațiilor care au loc în timpul cultivării in vitro
permite realizarea unor introgresii la hibrizii interspecifici și intergenerici (tabelul 5).

Tabelul 5

Exemple care ilustrează utilizarea variației somaclonale

Variația cromozomială Exemple de utilizare

Dublarea numărului de cromozomi pentru
producerea dihaploizilor
Multiplicarea numărului de cromozomi pentru
producerea poliploizilor
Modificarea structurii cromozomilor pentru
realizarea unor introgresii la hibrizi
interspecifici
Variația numărului și structurii cromozomilor
pentru producerea amfiploizilor și realizarea
unor introgresii la hibrizii intergenerici
tutun
Cartof
Tutun
Brassica spp.
Datura innoxia
Lolium multiflorum x Lolium perenne
Hordeum vulgare x Hordeum jubatus
Hordeum vulgare x Hordeum bulbosum
Oryza sativa x Oryza latifolia
Triticum crassum x Hordeum vulgare
Triticum aestivum x Secale cereale
Triticum tauschii x Secale cereale
Hordeum vulgare x Triticum aestivum
Lolium multiflorum x Festuca pratensis
Triticum aestivum x Agropyron sp.
Saccharum officinarum x Sclerotachya
fuchsa

Multe schimbări se reflectă favorabil asupra unor caractere importante din punct de
vedere agronomic, cum sunt rezistența la boli sau la dăunători, productivitatea, conținutul în
proteine, toleranță la stres. În sfârșit pot să apară caractere noi, sau combinații de caractere
interesante la un singur regenerant, sau la scara întregii populații de plante regenerate in vitro.
(Varga P et co., 1994).
Deși este un fenomen relativ nou, care deocamdată nu este controlat, mai ridică încă o
serie de probleme. Variabilitatea somaclonală a făcut deja posibilă obținerea unor soiuri noi la
unele specii: Eustoma grandiflorum, Hemerocallis sp.(soiul Yellow Tinkerbell), Paulownia
tomentosa (Somaclonal Snowstorm), Pelargonium (Velvet Rose), Torenia sp.(Uconn White),

10
Rubus sp. (Lincon Logan), Apium sp. (UC-T3 Somaclone), Ipomoea batata (Scorbet), Medicago
sativa (Sigma).

Bibliografie

1. Badea E.M., Dăndulescu D., 2001 Biotehnologii vegetale, Fundația Biothech,

București, 31-44.
2. Badea E.M., Raicu P., 1983, The effect of genotype and culture age on
morphogenesis potential of Datura innoxia callus cultures and polidy of regenerants.
Rev. Roum.Biol.28, 153-156.
3. Badea E.M., Raicu P., 1983, Experimental androgenesis in Datura innoxia plants
with diferents leveles of ploidy (2n,4n,6n) Rev. Roum.Biol.28, 59-61.
4. Mohan J., De Klerk GJ., 1998, Somaclonal variation in breeding and propagation of
ornamental crops. Pl. Tiss.Cult. and Biotech 4, 63-75.
5. Varga P., Badea E., Schitea M., Martura T., 1994, Sigma, the first alfalfa composed
exclusively of somaclones, Roum Agric. Research.2, 7377.
6. Verzea M., Badea E., Lupușanschi I., Moraru I., Coman I., 1993, Studiul
embirogenezei somatice la formele parentale de hibrizi F1 rezultați din încrucișări
dialele (6x6) la Triticale hexaploid. Lucrările celui de-al IV Simp. Nat. De Cult. De
Cel și Țes. Veg. 154-160.

11
7. Verzea M., Badea E., Lupușanschi I., Moraru I., Răducanu F., Coman I., 1994,
Efectul genotipurilor parentale asupra capacității androgenetice ha hibrizii F1 de
Triticale Hexaploid. Cercet. Genet. Veget. Anim., III, 55-91.

12