Cursuri Culturi de Celule Si Tesuturi PDF

UNIVERSITATEA DE ȘTIINTE AGRONOMICE ȘI
MEDICINĂ VETERINARĂ - BUCUREŞTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
Capitolul 1. Introducere. Culturi de celule vegetaleElemente esenţiale implicate în
culturile de celule şi ţesuturi vegetaleAplicaţii ale culturilor de celule şi ţesuturi
vegetale
Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea plantelor

Procedee de propagare (multiplicarea clonală sau clonarea)
Cultura de meristeme (mericlonare) – procedeu eficient de propagare
Cultura de explante caulinare cu muguri axilari sau apicali
Propagarea clonală prin organogeneză directă
Multiplicarea plantelor prin protoclonare
Propagarea prin embriogeneză somatică
Apomixia – ca metodă de propagare clonală
Seminţe sintetice
Propagarea prin organogeneză indirectă
Microaltoirea
Capitolul 3. Microorganismele, posibili aliaţi ai propagării plantelor
3.1. Simbioza de tip micoriza
Capitolul 4. Conservarea materialului biologic vegetal prin metode in vitro
4.1. Propagarea prin organogeneză sau embriogeneză – aspecte generale ale fazelor
dezvoltării
Capitolul 5. Potenţialul utilizării sistemului culturii hairy roots indus de Agrobacterium
rhizogenes în studii de morfogeneză
5.1. Hairy roots - ca modalitate de înrădăcinare a genotipurilor recalcitrante la sistemul
clasic de înrădăcinare in vitro
5.2. Potenţialul morfogenetic al explantelor de tip hairy roots
Capitolul 6. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în ameliorarea plantelor
6.1. Transfer de gene
6.2. Tehnologia protoplaştilor (fuziuni celulare)
6.3. Haploidie experimentală
6.4. Variabilitate somaclonală
6.5. Fecundarea in vitro
6.6. Cultura de embrioni zigotici
Capitolul 7. Cultura de hairy roots – implicaţii în producerea de metaboliţi secundari
7.1. Condiţii care facilitează sau perturbă obţinerea rădăcinilor hairy roots
7.2. Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de tip hairy roots şi producerea de
metaboliţi secundari
7.3. Cultura de hairy roots la nivel de bioreactor şi producerea de metaboliţi secundari
Capitolul 8. Culturi de celule animale
8.1. Elemente esenţiale implicate în culturile de celule şi ţesuturi animale
8.2. Aplicaţii ale culturilor de celule şi ţesuturi animale
Capitolul 9. Bioetică
9.1. Implicaţii ale bioeticii în utilizarea culturilor de celule şi ţesuturi vegetale
9.2. Implicaţii ale bioeticii în utilizarea culturilor de celule şi ţesuturi animale
Capitolul 10. Culturile de celule şi ţesuturi – domeniu aflat în avangarda cercetării
ştiinţifice
10.1. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi ţesuturi în realizarea de
alimente
10.2. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi ţesuturi în realizarea de
medicamente
10.3. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi ţesuturi în biosecuritate
Capitolul 1
Iluminarea cu radiaţie de culoare roşie, de putere mică,
emisă de către diodele laser, conduce la germinarea
mai rapidă a seminţelor şi dezvoltarea plantulelor în
condiţii sănatoase şi nestresante, fiind astfel preferată în
tratamentele de biostimulare a materialului vegetal
(RBC1).
Embriogeneza sensu stricto constă din dezvoltarea
embrionului, pornind de la zigot şi parcurgând cele patru stadii
principale (globular, cordiform, torpedo, cotiledonar).
RBC2*
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-
313x.2000.00670.x/full
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j
.1365-313x.2000.00670.x/full
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313x.2000.00670.x/full
2.1. Procedee de propagare (multiplicarea clonală sau clonarea)


Pseudococcus calceolariae vector pentru CSSV.
(Gândacul făinos)
https://en.wikipedia.org/wiki/Cacao_swollen-shoot_virus
https://images.search.yahoo.com/images/v
iew;_ylt=AwrB8qC_wOdWd2oA70gunIlQ;_
ylu=X3oDMTIzNnR0Y2tjBHNlYwNzcgRzbGs
DaW1nBG9pZAM3OWIyMDBkYjg4NWY3ZjA
5MWIzMDc2ZjJlOTJkODM0YwRncG9zAzI1B
Gl0A2Jpbmc-
?.origin=&back=https%3A%2F%2Fimages
.search.yahoo.com%2Fyhs%2Fsearch%3F
p%3DCacao%2Bswollen-
shoot%2Bvirus%2B%2528CSSV%2529%2
Bno%26n%3D60%26ei%3DUTF-
8%26fr%3Dyhs-mozilla-
002%26fr2%3Dsb-top-
images.search.yahoo.com%26hsimp%3Dy
hs-
002%26hspart%3Dmozilla%26tab%3Dorg
anic%26ri%3D25&w=350&h=350&imgurl
=ictvdb.bio-
mirror.cn%2FWIntkey%2FImages%2Fem_
cauli_PPI_CSSV_b1_350.jpg&rurl=http%3A
%2F%2Fictvdb.bio-
mirror.cn%2FWIntkey%2FImages%2Fem_
cauli_PPI_CSSV_b1.htm&size=78.9KB&na
me=%3Cb%3ECocoa%3C%2Fb%3E+%3C
b%3Eswollen+shoot%3C%2Fb%3E+%3C
b%3Evirus%3C%2Fb%3E+-
+presented+by+Dr+John+Antoniw+%28j
ohn.antoniw+...&p=Cacao+swollen-
shoot+virus+%28CSSV%29+no&oid=79b2
00db885f7f091b3076f2e92d834c&fr2=sb-
top-images.search.yahoo.com&fr=yhs-
mozilla-
002&tt=%3Cb%3ECocoa%3C%2Fb%3E+
%3Cb%3Eswollen+shoot%3C%2Fb%3E+
%3Cb%3Evirus%3C%2Fb%3E+-
+presented+by+Dr+John+Antoniw+%28j
ohn.antoniw+...&b=0&ni=168&no=25&ts=
&tab=organic&sigr=123thu73s&sigb=1674
elbt8&sigi=120gmv9ld&sigt=12v6ieclt&sig
n=12v6ieclt&.crumb=NhN313Oot4Z&fr=yh
s-mozilla-002&fr2=sb-top-
images.search.yahoo.com&hsimp=yhs-
002&hspart=mozilla
Theobroma cacao L.
https://en.wikipedia.org/wiki/Theobroma_cacao
History of Cell Culture
1907- Frog embryo nerve fiber outgrowth by Harrison.

1912- Explants of chick embryo tissues by Carrel, Burrows.
1943- Development of mouse lymphocyte cell line by Earle, et al.
1948- First use of antibiotics in tissue culture by Keilova.
1949- Growth of virus in cell culture by Enders, et al.
1952- Polio virus grown in monkey kidney cells by Kew, et al.
1952- Development of HeLa cell line by Gey, et al.
1955- Development of defined cell culture media by Eagle.
1958- Recognition of importance of mycoplasma by Coriell.
1961- Demonstration of the finite lifespan of normal human cells by Hayflick and Moorhead.
1964- Discovery of pluripotency of embryonic stem cells by Kleinsmith and Pierce.
1970- Development of laminar flow cabinets for cell culture, Kruse et al.
1976- Totipotency of embryonic stem cells described by Illmensee and Mintz.
1977- Cross-contamination of many cell lines with HeLa cells confirmed, Nelson-Rees &
Glandermeyer.
1983- Regulation of cell cycle and cycling reported by many.
1983- Development of reconstituted cell cultures by Bell and others.
1989- Transformation, malignancy, oncogenes reviewed by Weinberg.
1990- Application of cell culture to production of biotherapeutic agents.
1998- Production of cartilage by tissue engineered cell culture by Aigner et al.
2000- Mapping of the human genome.
2007- Use of viral vectors to reprogram adult cells to embryonic state (induced pluripotent stem
cells) by Yu et al.
2008 and beyond- Era of induced pluripotent stem cells – promises and challenges.
Cartof dulce
Trestie de zahăr
Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

plantelor
2.1.1. Cultura de meristeme (mericlonare) – procedeu eficient de
propagare
Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

plantelor
propagare
2.1.2. Cultura de explante caulinare cu muguri axilari sau apicali
https://images.search.yahoo.com/images/
view;_ylt=AwrB8o_exQJXPxAA2WQunIlQ;
_ylu=X3oDMTIzc2ZzNnFqBHNlYwNzcgRzb
GsDaW1nBG9pZAM2MmM1YzM1NzA5Mm
ViNTM0MWQ2MjU0NTViNGVlYWU4NARnc
G9zAzYzBGl0A2Jpbmc-
?.origin=&back=https%3A%2F%2Fimage
s.search.yahoo.com%2Fyhs%2Fsearch%
3Fp%3DApomixis%26fr%3Dyhs-mozilla-
002%26hsimp%3Dyhs-
002%26hspart%3Dmozilla%26nost%3D1
%26tab%3Dorganic%26ri%3D63&w=350
&h=602&imgurl=plantsinaction.science.u
q.edu.au%2Fedition1%2F%3Fq%3Dfiles
%2Fimagecache%2Ffigure-
thumb%2FFig%25207.15.png&rurl=http
%3A%2F%2Fplantsinaction.science.uq.ed
u.au%2Fedition1%2F%3Fq%3Dcontent%
2F7-2-2-vegetative-options-
reproduction&size=148.9KB&name=Figur
e+7.15+Apomixix+pathways+in+angiosp
erm+ovules.+Three+possible+...&p=Apo
mixis&oid=62c5c357092eb5341d625455b
4eeae84&fr2=&fr=yhs-mozilla-
002&tt=Figure+7.15+Apomixix+pathway
s+in+angiosperm+ovules.+Three+possibl
e+...&b=61&ni=128&no=63&ts=&tab=or
ganic&sigr=131uhv3rb&sigb=13utlat5k&si
gi=12pegtsod&sigt=126nbejcs&sign=126
nbejcs&.crumb=NhN313Oot4Z&fr=yhs-
mozilla-002&hsimp=yhs-
002&hspart=mozilla
Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

plantelor

propagare
2.1.2. Cultura de explante caulinare cu muguri axilari sau apicali
2.1.3. Propagarea clonală prin organogeneză directă
2.1.4. Multiplicarea plantelor prin protoclonare
2.1.5. Propagarea prin embriogeneză somatică

2.1.6. Apomixia – ca metodă de propagare clonală
Capitolul 3. Microorganismele, posibili aliaţi ai

propagării plantelor
Capitolul 3. Microorganismele, posibili

aliaţi ai propagării plantelor
RBC 6
RBC 6
RBC 6
• Ectomicorizele
• Endomicorizele
Capitolul 4. Conservarea materialului

biologic vegetal prin metode in vitro
Capitolul 4. Conservarea materialului

biologic vegetal prin metode in vitro
latus
u
cornic
us
Lot
t s
o
ro
y
air
h
https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/
10.1186/1471-2229-9-78
https://www.mdpi.com/1420-3049/24/8/1586/htm
e rium
act
gr ob
en es
A izog
rh
RBC9
RBC9
crown gall
https://microbewiki.kenyon.edu/images/2/27/Gall.jpg
Agrobacterium tumefaciens
Fig. 2: Figure shows tumor forming ability of selected Fig. 1: Figure shows tumor forming ability of selected isolates on
isolates on potato disc. (A) AtAh0116, (B) AtTg0117, (C) AtTa0112, (D) carrot disc. (A) AtAh0116, (B) AtTg0117, (C) AtTa0112, (D) AtAc0114, (E)
AtAc0114, (E) AtSl0105 and (F) AtRc0107 AtSl0105 and (F) AtRc0107
M. Soriful Islam, Mst. Munsina Akter, M. Atikur Rahman, M. Mostafizur Rahman, Most. Mauluda Akhtar and M. Firoz Alam, 2010. Isolation of Agrobacterium
tumefaciens Strains from Crown Gall Sample of Dicot Plants in Bangladesh. Current Research in Bacteriology, 3: 27-36.
DOI: 10.3923/crb.2010.27.36
URL: https://scialert.net/abstract/?doi=crb.2010.27.36
crown gall
https://player.slideplayer.com/14/4434722/data/images/img2.jpg
crown gall
a
a s ativ
z
Ory
n rice
de
Gol
h t t p s : / / i m a g e . s l i d e s h a r e c d n . c o m / a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s p p t- 1 3 1 2 1 5 0 6 5 5 3 7 -
phpapp01/95/agrobacterium-tumefacienspptit-is-a-slide-presentation-on-interkingdom-gene-
transfer-9-638.jpg?cb=1387090693
(= N de la o specie şi citoplasma de la
ambele specii) – RBC9
Capitolul 6. Culturi de celule şi ţesuturi

utilizate în ameliorarea plantelor
Disciplina „CULTURI DE
CELULE ŞI ŢESUTURI
VEGETALE”
C 11
Capitolul 7. Cultura de hairy roots – implicaţii în producerea

de metaboliţi secundari
• 7.1. Condiţii care facilitează sau perturbă obţinerea

rădăcinilor hairy roots
• 7.2. Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de tip
hairy roots şi producerea de metaboliţi secundari
• 7.3. Cultura de hairy roots la nivel de bioreactor şi
producerea de metaboliţi secundari
https://www.slideshare.net/anjaliparab_87/hairy-root-cell-culture
https://www.google.com/search?q=hairy+roots&tbm=isch&tbs=rimg:CTz4n5RxLcVDIjg0z5LAG4Lp_1y
FAGUTz4IGoYDAoPfo2hFRzrJdeGP-
pMKe6KPe_1tpjFRW3xmjoLvCQ2cdkcN2POHioSCTTPksAbgun_1Eb9YtV8W3MfTKhIJIUAZRPPggagRK9
wUT0HV14YqEglgMCg9-jaEVBEWfVhlPfpVDyoSCXOsl14Y_16kwEaVNt7b8BuVvKhIJp7oo97-
2mMUReMnRN_1sBq4MqEglFbfGaOgu8JBHw3B8dRZ9ZxyoSCTZx2Rw3Y84eEWQzB4bEFGJB&tbo=u&s
a=X&ved=2ahUKEwjytvPSxrLiAhVEKuwKHXueCCAQ9C96BAgBEBs&biw=1280&bih=610&dpr=1.5#img
rc=JP60xoE2c0ljRM:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669014003938
• Optimization of ginseng cell culture in

airlift bioreactors and developing the
large-scale production system
dii=CRdKY4sKK23iEM:&imgrc=tVk3E4rOaeNgZM:
dii=BdFemDQeu7zV6M:&imgrc=tVk3E4rOaeNgZM:
Capitolul 7. Cultura de hairy roots –

implicaţii în producerea de metaboliţi
secundari
În contextul unei tot mai strânse

legături, între cercetarea teoretic
fundamentală şi aplicaţia biotehnologică,
cultura de hairy roots oferă un potenţial
aplicativ deosebit în diferite domenii între
care un loc important îl ocupă şi biosinteza
metaboliţilor secundari.
C11
Interesul pentru acest sistem experimental este
generat de o serie de elemente între care pot fi
menţionate:
• plantele constituie o sursă de metaboliţi secundari, încă,
neexploatată la potenţialul maxim (RBC11);
• cultura de rădăcini a fost primul sistem in vitro uzitat
pentru studii pe termen lung la plante (RBC11);
• cultura de hairy roots (rădăcini firoase), realizată in vitro
începe să devină o practică viabilă şi sub aspect
economic (RBC11);
C11
• comparativ cu suspensiile celulare unde producţia
compuşilor biosintetizaţi la nivelul celulelor scade
alarmant simultan cu reducerea gradului de diferenţiere
al acestora, într-o cultură de rădăcini se produce o
cantitate mult mai mare de metaboliţi secundari utili
(RBC11);
• cultura in vitro de rădăcini normale realizată în absenţa
unor fitoreglatori înregistrează un nivel scăzut al
proliferării celulare (RBC11).
C11
• Metaboliţii secundari biosintetizaţi in vitro prin cultură de

hairy roots, prezintă aceleaşi proprietăţi ca şi cei obţinuţi
in vivo din rădăcini normale (RBC11). Deci, pot fi
valorificaţi în aceleaşi domenii de activitate (industria
farmaceutică, industria chimică, industria alimentară,
industria textilă şi cercetarea ştiinţifică).
C11
• Obţinerea de proteine bioactive este, deasemenea, una
dintre aplicaţiile majore ale culturii hairy roots, prin
implicaţiile etice şi financiare pe care le poate avea în
medicină.
• Savary B. J. şi Flores H. E. (1994), folosind hairy roots de
Trichosanthes sp. au reuşit identificarea unor extracte
(cu greutate moleculară de 32 – 35 kD), prin a căror
purificare poate fi obţinut polipeptidul trichosanthin care
are efect de inactivare a ribozomilor şi a demonstrat in
vitro capacitatea de inhibare a replicării HIV.
C11
• Biosinteza de metaboliţi secundari prin cultura

in vitro de hairy roots (rădăcini firoase),
depinde de un conglomerat de elemente care
pot influenţa substanţial procesele metabolice
desfăşurate la nivelul acestor structuri
biologice.
C11
• Printre elementele acestui conglomerat pot fi

menţionate (RBC11):
 temperatura,
 lumina,
 umiditatea relativă a aerului,
 starea fizică şi compoziţia chimică a mediului nutritiv,
 anumite substanţe cu proprietăţi de semnale specifice
(oligozaharidele, unii acizi, anumite metale, etc.).
C11
• Reducerea temperaturii de la 24ºC la 19,5ºC a

condus la creşterea cu 75% a cantităţii de
alcaloizi indolici obţinuţi într-o cultură hairy roots
de Catharanthus roseus (L.) G. Don (după
Toivonen L. şi colab., 1992).
C11
• Pentru a sublinia potenţialul rădăcinilor firoase (hairy
roots), în studiul procesului de citodiferenţierea vegetală
poate fi menţionat un experiment realizat la Rubia
tinctorum L., în care s-au obţinut prin transformare cu
Agrobacterium rhizogenes plante ce pot fi utilizate ca
surse de explante pentru realizarea de calus
(biosintetizator de pigmenţi), capabil să genereze
numeroase rădăcini biosintetizatoare de pigmenţi
clorofilieni (după Jurcoane Ş. şi colab., 2004).
C11
• Datorită posibilităţilor de activare sau de generare a unor
căi metabolice, care în condiţii normale nu sunt
funcţionale, apare şi perspectiva identificării unor
substanţe sau a unor precursori ai acestora care în mod
normal nu sunt evidenţiate la nivelul rădăcinilor
adventive de tip hairy roots (rădăcini firoase). Totuşi,
este necesar să nu neglijăm nici reversul acestei
posibilităţi. Adică, implicit, apare posibilitatea nedorită de
dezactivare a biosintezei unui precursor sau a unei
substanţe de interes.
C11
• Producerea metaboliţilor secundari prin utilizarea

sistemului experimental Agrobacterium rhizogenes
poate beneficia de introducerea unei gene de interes,
genă care prin produsul său să inducă sau să intervină în
biosinteza unei anumite substanţe (RBC11).
• Prin transferul de la drojdii la Nicotiana tabacum L. a
genei care codifică ornitin-decarboxilaza a fost mărită
cantitatea de nicotină produsă în cultura de hairy roots
(după Hamill J. D. şi colab., 1990).
C11
• O altă aplicaţie importantă a rădăcinilor firoase

(hairy roots), producătoare de metaboliţi utili
constă în biosinteza de anticorpi monoclonali la
nivel de bioreactor (după Corry J. P. şi colab.,
1993; Wongsamuth R. şi Doran P. M., 1997).
C11
• De la nivelul hairy roots de Phytolacca americana

L. a fost raportată izolarea şi caracterizarea unei
proteinei PAP-H, care are efect antifungic asupra
unor fungi din rizosferă (după Rhizoctonia solani
şi Trichoderma reesi), prin inactivarea ribozomilor
acestora (după Park S. – W. şi colab., 2002).
C11
• Cercetări relativ recente vin să confirme viabilitatea
capacităţilor biosintetice ale culturii hairy roots. De
exemplu, din hairy roots (rădăcini firoase), de la Lupinus
mutabilis cv. Potosi sunt biosintetizate izoflavone în
cantitate de două ori mai mare faţă de rădăcinile
netransformate (după Bagaoglu M. şi colab., 2004). De
asemenea, glicozidul solasodină a fost produs în sistemul
hairy roots de la Physalis minima Linn. în cantitate de 20
de ori mai mare decât cea biosintetizată de rădăcinile
normale (după Putalun W. şi colab., 2004).
7.1. Condiţii care facilitează sau perturbă obţinerea

rădăcinilor hairy roots
Celulele vegetale rănite (mecanic), biosintetizează anumite

substanţe care au rol de chemo-atractanţi pentru
bacteriile din specia Agrobacterium rhizogenes. Dintre
aceste molecule - semnal care funcţionează ca mediatori
ai realizării infecţiei au fost identificate:
– aminoacizi şi compuşi fenolici (acetosingon, alcool
coniferilic, ferulat de etil şi bromoacetosiringon),
– flavonoizi (calcona şi luteolina), şi
– monoglucide (arabinoză, acid galacturonic, acid
glucuronic, galactoză, glucoză şi xiloză).
C11
• Infectarea celulelor vegetale de către bacteriile

inductoare de hairy roots poate fi stimulată prin
suplimentarea cu glucide (glucoză sau galactoză),
atunci când cantitatea moleculelor - semnal de
natură fenolică produsă de celula vegetală rănită
este redusă (după Cangelosi G. A. şi colab., 1990).
C11
• A fost lansată chiar ipoteza că acidul 3 -

indolilacetic (AIA), acidul 2,4 - diclorofenoxiacetic
(2,4 - D) şi etilena (compuşi recunoscuţi pentru
implicaţiile lor în reglarea creşterii celulelor
vegetale), sunt capabili să funcţioneze ca elicitori -
chimici implicaţi în obţinerea rădăcinilor hairy roots
(după Ispas I., 2001).
C11
• Cercetările efectuate şi publicate, până în

prezent, conduc la ideea că nu există un
indicator chimic universal cu efect de
elicitor în relizarea infecţiei cu
Agrobacterium rhizogenes.
C11
• În cazul plantelor rezistente la infecţia cu

Agrobacterium rhizogenes, s-a constatat că,
poate fi utilă cultivarea materialului biologic
vegetal, aflat în stadiul de pre-inoculare în
suspensia cu Agrobacterium rhizogenes, pe un
mediu nutritiv suplimentat cu acetosiringon sau
acid vanilic.
C11
• În plus, în funcţie de natura explantelor infectate cu
tulpini de Agrobacterium rhizogenes se constată o
reactivitate diferenţiată a acestora. De exemplu, la Vitis
vinifera L. fragmentele de limb foliar şi peţiol au
demonstrat o reactivitate mai ridicată decât explantele
de ax tulpinal (după Maximilian C. şi colab., 2003).
• Practic, pentru obţinerea rădăcinilor hairy roots este
necesar să fie întrunite condiţiile care să eludeze
complexul de factori stresanţi (rănirea mecanică,
condiţiile de osmoză, etc.), astfel încât aceştia să devină
piese - intermediare utile acesteia.
C11
Gazde pentru obţinerea rădăcinilor

hairy roots
C11
În prezent, speciile bacteriene grupate în cadrul
genului Agrobacterium pot fi clasificate după spectrul
de gazde şi formele de manifestare ale bolii (A.
rhizogenes, A. tumefaciens, A. rubi, A. radiobacter şi A.
vitis), sau după caracteristicile metabolice şi cele ale
creşterii bacteriene în varietăţi biologice („biovar“) –
RBC11:
• *de tip I - A. tumefaciens şi A. rubi;
• *de tip II - A. rhizogenes;
• *de tip III - A. vitis.
C11
• Bacteriile din genul Agrobacterium pot

transforma genetic specii mai mult sau
mai puţin îndepărtate taxonomic
(dicotiledonate, monocotiledonate,
gimnosperme, fungi – drojdii, ascomicete,
bazidiomicete – şi, chiar, celule umane) –
http://mmbr.asm.org/cgi/content/full
67/1/16.
C11
• Prin spectrul larg de gazde pe care îl au bacteriile din
genul Agrobacterium şi prin faptul că acestea constituie
un exemplu de inginerie genetică naturală este posibil, în
anumite condiţii, ca acestea să devină mai devreme sau
mai târziu un proceeu care să asigure valorificarea
comercială pe scară largă a avantajelor ingineriei
genetice.
C11
• În prezent, se poate afirma în mod cert, faptul că există
un număr considerabil de specii vegetale din zeci de
familii la care a fost raportată realizarea cu succes a
transformării genetice cu Agrobacterium rhizogenes.
Deasemenea, un fapt bine cunoscut este fenomenul
conform căruia plantele rezistente la infecţia cu
Agrobacterium rhizogenes, uneori, beneficiază de o cale
a realizării infecţiei prin utilizarea anumitor substanţe
exogene (acetosiringon, acid vanilic, ferulat, etc.), în
compoziţia mediului nutritiv folosit pentru faza de pre-
infecţie (RBC11).
C11
• Tulpinile de Agrobacterium rhizogenes utilizate în

experimente de inginerie genetică, se pare că, nu
prezintă un spectru de gazde mai larg decât cel pe
care îl prezentau sub forma sălbatică (RBC11).
C11
• Dintre plantele transgenice obţinute prin transformare
mediată de Agrobacterium rhizogenes menţionăm:
Anthyllis vulneraria L., Brassica napus L., Cucumis
satives L., Ipomoea batatus (L.) Lam., Larix decidua
Mill., Lycopersicon esculentum L., Medicago truncatula
Gaertn., Nicotiana tabacum L., Robinia pseudoacasia L.,
Solanum tuberosum L., Verticordia grandis J. Drumm.,
Vinca minor L., Vitis vinifera L. (după Giri A., Narasu M.
L., 2000).
C11
• Speciile de plante utilizate pentru transformare

prin infecţie cu Agrobacterium tumefaciens pot
deveni gazde şi pentru transformarea prin
infecţie cu Agrobacterium rhizogenes (RBC11).
C11
• Dintre plantele la care a fost comunicată realizarea

culturii de tip hairy roots pot fi menţionate Lupinus
mutabilis cv. Potosi (după Babaoglu M. şi colab., 2004) şi
Physalis minima Linn. (după Putalun W. şi colab., 2004).
7.2. Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de

tip hairy roots şi producerea de metaboliţi
secundari
Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de tip hairy

roots (rădăcini firoase), aflate în cultură depinde de o
serie de elemente (genotipul vegetal existent în faza de
pre-transformare genetică cu Agrobacterium rhizogenes,
compoziţia chimică şi starea fizică a mediului nutritiv,
etc.), care pot face ca aceasta să fie viabilă (deci,
stabilă), pentru un număr de 2 – 3 pasaje sau chiar
pentru zeci de pasaje (RBC11).
C11
• Cultura de hairy roots (rădăcini firoase), realizată de la
Duboisia sp. poate fi păstrată 2 – 3 pasaje (după Yukimune
Y. şi colab., 1994), în timp ce cultura de hairy roots (rădăcini
firoase), de la Datura stramonium L. a fost menţinută timp
de cinci ani (după Maldonato – Mendoza I. E. şi colab.,
1993). Această diferenţă, substanţială între numărul de
pasaje pe parcursul cărora rădăcinile adventive de tip hairy
roots (rădăcini firoase), sunt stabile din punct de vedere
genetic, necesită aprofundarea şi lărgirea ariei de studiu a
elementelor care intervin atât în menţinerea unui anumit
statut genetic cât şi în reglarea expresiei genice ca factor de
bază al citodiferenţierii.
7.3. Cultura de hairy roots la nivel de bioreactor şi

producerea de metaboliţi secundari
Valorificarea la nivel industrial a capacităţilor biosintetice

ale hairy roots (rădăcini firoase), poate fi realizată prin
cultivarea acestora la nivel de bioreactor (RBC11). Deşi,
cultivarea acestui tip de rădăcini poate fi efectuată
pornind de la un inocul de dimensiuni reduse şi
beneficiază de o rată ridicată a creşterii celulare
(RBC11), realizarea culturii la nivel de bioreactor este o
provocare care necesită, încă, nenumărate studii.
C11
• O problemă frecvent întâlnită este, apariţia senescenţei la

nivelul anumitor ţesuturi, datorită formării unei mase
radiculare compacte care nu permite accesul oxigenului
până la nivelul tuturor ţesuturilor (RBC11). Prin urmare,
pentru a cultiva hairy roots (rădăcini firoase), la nivel de
bioreactor este necesară folosirea unui bioreactor adecvat,
care să controleze toţi parametrii principali de natură fizică
şi chimică (RBC11).
C11
• Deşi, numărul acestor parametri nu este deloc mic,

prin cultivarea de hairy roots (rădăcini firoase), de
la Lithospermum erythrorhizon L. la nivel de
bioreactor se obţine shikonin în cantitate de
aproximativ 5 mg/zi timp de 220 zile (după
Shimomura K. şi colab., 1991).
C11
• De asemenea, prin cultivarea la nivel de bioreactor a

hairy roots (rădăcini firoase), de la Beta vulgaris L.
se produce colorantul roşu numit betacianin (după
Kino-Oka M. şi colab., 1992).
C11
• În general, cultura de tip hairy roots (rădăcini firoase),
poate fi realizată într-un bioreactor care utilizează aer în
cantitate redusă (de exemplu, cultura de hairy roots de
la Catharanthus roseus L. – Nuutila A. M. şi colab.,
1994), sau care beneficiază de agitare (după Rhodes M.
J. C. şi colab., 1986).
• Totuşi, cultura de tip hairy roots (rădăcini firoase),
realizată la nivel de bioreactor reprezintă un factor de
stres pentru celulele vegetale menţinute în condiţii de
agitare.
C11
• Utilizarea unui mediu nutritiv artificial caracterizat

prin prezenţa a două faze (apoasă cu rol de nutriţie şi
organică cu scop de fixare), poate conduce la
creşterea cantităţii de tiofene la 30 – 70% faţă de
1% cât se înregistrează în cazul madiului bazat pe
existenţa unei faze (după Buitelaar R. M. şi colab.,
1991).
C11
• Cultivarea hairy roots (rădăcini firoase), de Rubia
tinctorum L. pe un mediu nutritiv Murashige şi Skoog
(1962) - MS - , care a avut fructoza ca unică sursă de
carbon şi azotul sub formă de nitrat, a dus atât la
creşterea semnificativă a biomasei radiculare cât şi la
mărirea substanţială a biosintazei de pigmenţi
(antrachinone), comparativ cu mediul nutritiv MS
suplimentat cu sucroză şi NH4+ (după Kino-Oka M. şi
colab., 1994).
C11
• Acumularea de puerarin din hairy roots

(rădăcini firoase), de la Pueraria phaseoloide
L. este de două sute de ori mai mare în
cultura la nivel de bioreactor (2,5 l), faţă de
cea la nivel de vas de cultură (250 ml) – după
Kintzios S. şi colab., 2004.
C11
• Cultura de hairy roots (rădăcini firoase),

realizată la nivel de bioreactor întâmpină
numeroase impedimente. Avantajele pe care
aceasta le implică, justifică însă pe deplin
cercetările efectuate pentru lărgirea perpetuă
a ariei de metaboliţi secundari biosintetizaţi.
8. Culturi de celule animale
 8.1. Elemente esenţiale implicate în culturile de

celule şi ţesuturi animale
 8.2. Aplicaţii ale culturilor de celule şi ţesuturi
animale
 Definiţie. Culturile de celule (ţesuturi), animale
realizează propagarea in vitro a unui fragment de
ţesut sau a unor celule dispersate preluate din
structuri tisulare prin izolare enzimatică (RBC12).
 Observaţie. Condiţiile specifice cultivării in vitro

trebuie să asigure homeostazia şi proliferarea
celulară.
 8.1. Elemente esenţiale implicate în culturile de
celule şi ţesuturi animale
Elementele vitale ale culturilor de celule animale sunt
(RBC12):
 celulele vii
 - exemple de surse potenţiale: ţesut embrionar, ţesut
adult, ţesut tumoral
 mediul nutritiv
 - conţine ca elemente de bază:
 - soluţie salină tamponată (Hanks);
 - aport proteic (ser fetal);
 - vitamine şi aminoacizi esenţiali;
 - antibiotice (penicilina, streptomicina, etc.);
 - antifungice (stamicina, griseofulvina, etc.)
 Clasificarea culturilor de celule animale, uzual,
poate fi realizată în următoarele elemente
(RBC12):
 1. culturi de organ;
 2. culturi de celule dispersate;
 3. culturi primare;
 4. tulpini celulare;
 5. linii celulare continue sau stabile şi
 6. celule transformate.
 culturi de organ
 - constau din fragmente de organ cultivate in vitro

pentru menţinerea intactă atât a arhitecturii cât şi a
funcţiei celulelor diferenţiate (RBC12).
 culturi de celule dispersate
 constau din celele dispersate obţinute prin

dezmembrarea ţesuturilor sub acţiune enzimatică şi
agitare macanică (RBC12);
 după durata menţinerii viabilităţii în condiţii in vitro
acestea pot fi clasificate în (RBC12):
 culturi primare,
 tulpini celulare şi
 linii celulare
 culturi primare
 sunt obţinute prin (RBC12):

 - separarea enzimatică a celulelor unui organ proaspăt
recoltat
 - însămânţarea în vasul de cultură
 - celulele se ataşează şi formează un monostrat
 nr. de pasaje = 3 – 5 / cultură (RBC12)
 tulpini celulare
 nr. de pasaje = 50 – 60 / cultură

 sunt numite şi linii diploide (RBC12)
 linii celulare continue sau stabile
 nr. de pasaje = cultivare în serie pentru un timp

nelimitat / cultură
 sunt numite şi linii heteroploide (RBC12)
 celule transformate
 sunt linii celulare care au beneficiat de o mutaţie stabilă,

spontană sau indusă
 observaţie: în acest caz mutaţia apărută este menţinută
indefinit
 nr. de pasaje = cultivare în serie pentru un timp
nelimitat / cultură (RBC12)
 8.2. Aplicaţii ale culturilor de celule şi ţesuturi animale
8.2. 1. Clonarea terapeutică

8.2. 2. Celulele stem
8.2. 3. Terapia genică
8.2.1. Clonarea terapeutică
 Utilizări posibile (RBC12):

 corectarea unor deficienţe ereditare;
 tratarea unor maladii incurabile.
 Avantaj(RBC12):
 obţinerea de grefe sau organe, care după utilizarea în
transplante, nu vor provoca răspunsuri autoimune.
Tehnica (RBC12):
 (- nu se îndepărtează nucleul ovulului);
 - în ovul se injectează nucleul unei celule care provine de la
persoana clonată;
 - se aşteaptă un timp în care cei doi nuclei stabilesc gradul
de „toleranţă” reciprocă;
 - se aplică denuclearizarea (enuclearea);
 - se utilizează un stimul pentru a iniţia diviziunea
complexului.
Observaţie: doar 5 % din embrioni ajung în stadiul de
blastocite.
8.2.2. Celulele stem
 Definiţie. Celulele stem sunt nediferenţiate şi au

capacitatea de a forma orice tip de celulă din cele
peste 200 existente în organismul uman (RBC12).
 Utilizări posibile (RBC12):

 - surse de transplant;
 - surse de material biologic pentru ingineria
ţesuturilor.
Clasificare (RBC12):
 - celule stem embrionare

(situate în blastocit);
 - celule stem adulte

(situate în măduva osoasă, sânge, creier, epidermă,
măduva spinării, ficat, pancreas, ?).
Tehnica utilizată în cazul valorificării celulelor stem (RBC12)
zigot organism adult
diviziuni timp de 5 zile
blastocit
extragerea celulelor stem
linii celulare de cultură

(celule nediferenţiate)
activare biochimică specifică
dirijarea dezvoltării celulelor stem în funcţie de necesităţi

(surse de „piese de schimb”)
Celulele stem adulte faţă de cele embrionare prezintă
(RBC12):
 - dezavantajele următoare
 - raritatea şi
 - identificarea dificilă;
 - avantajul că
 - nu implică distrugerea embrionilor umani.
Dezavantajul principal al celulelor stem (RBC12):

controlul artificial al diviziunilor şi diferenţierilor celulare
nu este, încă, descifrat pe deplin.
 Experimentele și cercetările efectuate pe celule stem
embrionare au început din anul 1998, când un grup de
oameni de știință conduși de dr. James Thomson de la
Universitatea din Wisconsin, SUA, a pus bazele unei
metode de izolare și cultivare a celulelor. Așadar, în ciuda
faptului că celulele stem au, teoretic, multiple aplicații
practice, cercetarea lor este încă la început (RBC12).
Celulele stem adulte, cum ar fi celulele
hematoformatoare din măduva roşie a oaselor (numite și
celule stem hematopoietice), sunt, în prezent, singurele
tipuri folosite în tratarea unor boli cum ar fi
leucemiile sau hemopatiile maligne (= periculoase) –
RBC12.
 Cercetătorii consideră că atâta timp cât
așteptările sunt realiste, rezultatele terapiei cu
celule stem îi pot surprinde chiar și pe cei mai
pesimiști.
 Studiile si experimentele desfasurate in ultimii ani au
demonstrat ca aceste celule au capacitatea de a
influenta decisiv numeroase domenii ale medicinei,
atat datorita abilitatii de formare a celulelor de tipul
neuronilor, hepatocitelor, cardiomiocitelor, celulelor
pancreatice sau endoteliale (RBC12), cat si prin
posibilitatea de a interactiona in mod direct cu aceste
celule modificandu-le materialul genetic in vederea
folosirii lor in cadrul terapiei genice (RBC12).
 Condiția de bază, însă, este să nu se plece de la premiza

că celulele stem vor reprezenta tratamentul universal
pentru orice boala.
 Între bolile pentru care se studiază intensiv
tratamentul cu celule stem sunt incluse (RBC12):
 diabetul,
 boala Parkinson, boala Crohn,
 afectiuni cardiace,
 boli genetice,
 cancere,
 precum și leziuni medulo-spinale.
 Implant de celule stem la porci
România (USAMVCN)
Implantarea de celule stem adulte, recoltate din

ţesutul adipos al porcilor, permite regenerarea osoasa a
alveolelor (= fiecare dintre cavitățile sferice de dimensiuni
mici, situate în oasele maxilarelor, în care sunt înfipți dinții)
– RBC12.
Celulele stem implantate interactioneaza cu
celulele stem care exista deja in tesuturi, dezvoltandu-se
catre os, iar alveola unde a fost un dinte, in loc sa se
reduca cu 20-30 la suta, se va prezerva la dimensiunea
din momentul extractiei si nu va mai exista resorbtia
osoasa – RBC12.
Avantaj: permite evitarea materialelor care întăresc

osul, dar pot să nu fie tolerate de organism (RBC12).
http://www.ziare.com/social/spital/premiera-nationala-la-cluj-implant-de-celule-stem-la-porci-proiectul-poate-fi-extins-si-la-om-1352895
 Carnea realizată in vitro din celule stem de vacă
Olanda
Au fost prelevate 10.000 de celule stem de la bovine,
care au fost apoi lasate sa se multiplice de mai mult de un
miliard de ori, pentru a se obtine tesut similar muschiului
de vita (RBC12).
In doua luni din 10.000 de celule stem se pot obtine
50.000 tone de carne (RBC12).
Avantaje (RBC12):
1.tehnica de lucru ar putea fi adaptata pentru alte
animale, fara ca animalele sa mai fie sacrificate,;
2. costuri reduse;
3. mai putine gaze cu efect sera si
4. pana in 2050, cererea de carne de pe piata se va
dubla si va fi greu de acoperit.
Dezavantaj (RBC12):
gustul nu este identic cu cel specific
 Neuroni din celule stem
SUA
Celulele stem recoltate din uter uman s-au transformat in

neuroni după injectarea in cobaii al caror creier degenera intr-o
afectiune asemanatoare cu Parkinsonul (RBC12).
Avantaj (RBC12):
1. femeile care sufera de Parkinson ar putea fi propriii lor
donatori de celule stem
2. pentru ca aceste celule sunt usor de recoltat, s-ar putea pune
chiar bazele unor banci, cu celule stem
3. nu sunt respinse de sistemul imunitar, precum alte celule
stem.
Maladia Parkinson este considerata un bun candidat pentru tratamentul cu celule stem. Este
cauzata de distrugerea celulelor din creier care produc dopamina, care are un rol in miscare.
Pacientii bolnavi de Parkinson pot chiar paraliza, neexistand un tratament pentru aceasta
boala (RBC12).
 Celulele stem adulte prezinta, comparativ cu celulele
stem embrionare, anumite avantaje si dezavantaje care
le indica sau nu in utilizarea terapeutica.
 Avantaje (RBC12):
 1. nu exista probleme de ordin etic in ceea ce priveste
utilizarea lor;
 2. daca donorul si primitorul sunt aceeasi persoana, nu
exista riscul respingerii transplantului celular prin
interventia sistemului imun
Dezavantaje:
1. dacă, donorul este diferit de acceptor, poate sa apara o

reactie imuna din partea organismului gazda care sa
duca la respingerea transplantului (RBC12);
 2. sunt celule mature și nu au capacitate mare de
proliferare, în sensul că pot genera doar anumite tipuri
celulare, în număr limitat (RBC12). Această observație
este susținută de experimente efectuate pe animale care
demonstrează că celulele stem de origine sangvină sunt
capabile să formeze hepatocite și celule cu rol în
refacerea integrității tegumentului (RBC12). Practic,
această observație se traduce prin faptul că celulele stem
adulte pot fi utilizate în tratamentul unui spectru
restrâns de boli (RBC12). În comparție, celulele stem
embrionare sunt capabile să formeze orice tip de celulă
și astfel să fie folosite în tratamentul mai multor boli
(RBC12);
3. în cadrul unui organism, celulele stem adulte sunt greu
de identificat (RBC12). Chiar și dacș sunt identificate,
numărul lor fiind redus, nu pot fi utilizate în multe
scopuri.
Spre deosebire de acestea, celulele stem embrionare sunt
ușor de reperat, deoarece formează populația celulară
dominantă în organismul embrionului, practic orice tip de
celula embrionară putând juca rol de celulă stem (RBC12).
De asemenea, celulele embrionare se pot divide de un
număr nelimitat de ori, generând tot timpul celule noi în
cantități utile, atât pentru cercetare cât și pentru terapie
(RBC12).
4. celulele stem adulte se dezvolta greu, fapt evidențiat
de numeroase studii (RBC12), care au arătat durata lungă
de timp, chiar de ordinul lunilor, necesară unor celule
stem adulte pentru a se transforma în tipul particular de
celule vizat inițial, fapt deosebit de dezavantajos în cazul
în care starea pacientului aflat în tratament impune
transplantarea rapidă a celulelor (RBC12). Celulele stem
embrionare însă au rata de diviziune rapidă și pot fi chiar
depozitate, astfel că dacă apare nevoia administrării lor,
aceasta se poate realiza imediat (RBC12).
8.2.3. Terapia genică
 Avantaje potenţiale (RBC12):

 vindecarea unor maladii şi
 eradicarea unor boli ereditare.
 Dezavantaj(RBC12):
 - utilizarea vectorilor virali poate cauza efecte de poziţie.
Tehnica(RBC12):
 - celulele care trebuie transformate (tratate), sunt

prelevate de la donator şi transferate în cultură in vitro;
 - se adaugă vectorul care conţine gena de interes;
 - se realizează selecţia celulelor transformate;
 - se reintroduc celulele transformate în organismul
pacientului prin:
 - injecţie intravenoasă sau
 - transplant de măduvă osoasă.
 Observaţie.
Există raportări cu date experimentale care au fost
obţinute prin cercetări realizate pe şoarece şi om (SUA,
Anglia, Germania, Franţa, Austria, Polonia, Suedia,
China, Japonia, ?) – RBC12.
Direcții
posibile
https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-
center/antibodies-resource-library/cell-signaling-pathways/hematopoiesis-pluripotent-stem-
cells.html
Factori
declanșatori
cu rol
”cheie”
https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-
center/antibodies-resource-library/cell-signaling-pathways/hematopoiesis-pluripotent-stem-
cells.html
https://link.springer.com/article/10.1186/scrt81/figures/1
https://www.mdpi.com/2075-4426/10/1/8/htm
n Ce este OMG ?
n Eveniment de modificare genetică - ce implică și ce nu implică ?
n Care sunt căile principale de modificare a expresiei genetice prin
tehnicile de ADN-recombinant ?
OMG = orice organism, cu FAO - Glosarul oficial de termeni
excepţia celui uman, al cărui
material genetic a fost OMG = organism viu, căruia,
modificat altfel decât prin prin intermediul tehnicilor de
încrucișare și/sau recombinare inginerie genetică i s-a
naturală. - RBC13 transferat o genă sau i s-au
transferat mai multe gene
specifice altui organism viu care
aparține altei specii. - RBC13
• USA - Comisia de bioetică • UE - Directiva 2000/18/CE
OMG = organism viu a cărui OMG = organism viu (cu

informaţie genetică a fost excepţia fiinţei umane), al
modificată prin inginerie cărui material genetic a fost
genetică pentru: accentuarea modificat de o manieră care
unor caracteristici; conferirea nu se poate realiza pe căi
unor caracteristici dezirabile, naturale prin intermediul
noi; atenuarea sau eliminarea multiplicării sau recombinării.
caracteristicilor considerate ca - RBC13
indezirabile. - RBC13
Un eveniment de modificare genetică implică (RBC13):
1. orice recombinare a ADN-ului ca urmare a
inserţiei unui fragment de ADN exogen
sau
2. producerea prin intermediul unui vector, fie că se
utilizează procedee:
- fizice,
- mecanice ori
- chimice.
A. Green revolution
B. Nesincronizare
C. Elemente cheie
ntensitatea creșterii cantitative
a producției agricole în ultimele decenii a fost sub
intensitatea creşterii numerice a populației.
E. coli și Salmonella sunt bacterii G
Suedia (1977 - 1978), și Japonia (1979 - 1980),
realizează biotehnologii de obţinere a insulinei. În
prezent, peste 98% din insulina utilizată pentru tratarea
pacienților cu diabet (cca. 25% din populaţia globului, din
care cca. 30% sunt insulino-dependenţi), este obţinută
din OMG. - RBC13
Precizare. Succesul comercial şi calitatea absolut

identică a insulinei de biosinteză a estompat o parte
din neliniştile comunităţii ştiinţifice exprimate la
prima CONFERINȚĂ DE BIOETICĂ (1973).
Principiile generale ale bioeticii moderne și întrebările
obligatorii ale acestora
Culturi de celule şi
ţesuturi”
C 14
10. Culturile de celule şi ţesuturi – domeniu aflat în
avangarda cercetării ştiinţifice
◼ Culturile de celule şi ţesuturi sunt unul dintre domeniile

aflate în avangarda cercetării ştiinţifice datorită
potenţialului de aplicare în realizarea de:
◼ alimente,
◼ medicamene şi
◼ biosecuritate.
10.1. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi ţesuturi
în realizarea de alimente
◼ în cazul structurilor biologice

animale, derivă din perpetuarea
genotipurilor valoroase prin
CLONARE
10.1.1. Metode de clonare
Metode de clonare aplicate la

bovine
M1
• secţionarea în două a unui embrion aflat în stadiul de
morulă sau blastocist şi
• implantarea fiecărei jumătăţi ebrionare în uterul unei
bovine (1980) – RBC14
M2
• recoltarea de ovocite de la animalele sacrificate,
• maturarea in vitro a ovocitelor până când acestea ajung
la stadiul de metafază II,
• enuclearea ovocitelor şi
• fuzionarea ovocitelor enucleate cu celule embrionare
(prelevate de la un embrion aflat în stadiul de morulă)
– RBC14
Obs. 1. M2 este mai eficientă decât M1
(RBC14)
2. dezavantaje (RBC14):
- numărul de embrioni este de 5 – 6 (în
loc de 20 potenţial),
- doar 30% din embrioni se dezvoltă
până la stadiul de blastocist (chiar 7%
atunci când este utilizată congelarea),
- % de organisme clonate născute este
foarte mic în raport cu % de embrioni,
- din clonele obţinute 5% sunt exagerat
de mari la naştere şi manifestă
fragilitate
Metoda (tehnica), de clonare aplicată la ovine
în cazul Dolly
Etape (RBC14)
- prelevarea prin biopsie a unor celule de glandă mamară de la o oaie din rasa
Finn Dorset (cu capul alb), aflată în ultimul trimestru de gestaţie
- cultivarea in vitro timp de cinci zile pe mediu nutritiv complet a celulelor de
glandă mamară
- transferul celulelor de glandă mamară in vitro pe mediu nutritiv cu nutrienţi
în cantităţi reduse pentru a stopa ciclul celular în stadiul G0 => celule aflate
în stare de cvasi hibernare
- ovocitele au fost obţinute prin perfuzarea oviductelor; în momentul
prelevării ciclul lor celular era stopat în metafaza II => celule care
conţin un singur set de cromozomi (sunt celule haploide)
- enuclearea ovocitelor
- aspirarea
cromozomilor aflaţi în placa metafazică
+
o cantitate de citoplasmă
+
globulul polar adiacent
- ovocitele enuclete sunt incubate pe mediu nutritiv specific la 37ºC
- activarea ovocitelor enucleate utilizând un impuls electric
- fuzionarea celulelor hibernate, prin utilizarea de pulsuri electrice, cu câte
un ovocit nefecundat şi enucleat prelevat de la o oaie din rasa Scottish
Blackface (cu capul negru)
Obs.
- metoda prin care a fost obţinută
Dolly (ovocite enucleate nefecundate
în care se introduce nucleul unei
celule diploide), a fost elaborată din
perioada 1938 – 1952 şi a fost
aplicată iniţial la amfibieni, pentru a
demonstra că fiecare celulă a unui
embrion conţine toată informaţia
genetică a unui individ (RBC14).
Rezultate (RBC14)
• 277 embrioni obţinuţi
+ implantare în oviductele
ligulate ale unor femele
+ 6 zile
◼ 247 embrioni recuperaţi
◼ 29 embrioni s-au dezvoltat până la stadiul
de morulă sau blastocist
◼ implantarea embrionilor în uter (13 oi
purtătoare)
◼ ovina Dolly (primul animal obţinut – Scoţia,
Inst. Roslin, 1996 - cu nucleul unei celule
somatice diferenţiate)
10.2. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi ţesuturi în
realizarea de medicamente
◼ În cazul structurilor biologice animale, derivă din

producerea de substanţe cu efect terapeutic prin
(RBC14):
• cultivarea de celule canceroase
◼ de ex. celulele canceroase preluate din:
◼ hipofiză produc hormoni ai creşterii şi hormoni
adenocorticotropi,
◼ suprarenale fabrică corticosteroizi şi
◼ celule adipoase secretă histamină
• cultivarea de celule normale
◼ de ex. celule normale preluate din:
◼ fibroblaste produc colagen şi mucopolizaharide, iar
◼ neuroblaste biosintetizează factori ai creşterii ţesutului
nervos şi acetil colin esterază
• transgeneză
10.2.1. Transgeneza la animale
• În prezent există numeroase tehnici de

introducere a genelor (transgenelor), în
celulele mamiferelor. Dar, există
deocamdată, multe probleme implicate
în exprimarea şi funcţionarea acestora
la nivelul organismului transgenic.
Avantaje ale transgenezei la
animale
Specificitatea
- caracterul de interes poate fi obţinut cu
„acurateţe“ (spre deosebire de metodele
convenţinale care nu asigură 100% transmiterea
caracteruli de interes) – RBC14
Rapiditatea (viteza)
- caracterul de interes poate fi stabilit doar într-o
generaţie (spre deosebire de metodele
convenţionale care necesită mai multe generaţii
pentru transmiterea caracterului dorit ⁄
caracterelor dorite) – RBC14
Flexibilitatea
- caracterul de interes poate fi transferat chiar
dacă este prezent la o altă specie şi în condiţii
naturale transferul acestuia nu ar fi posibil –
RBC14
Riscuri ale transgenezei la animale
◼ Disfuncţii
• există posibilitatea de afectare a sănătăţii animalelor
transgenice (leucemie, cancer, etc.), atunci când inserţia unei
transgene antrenează modificarea expresiei unei gene ⁄ unor
gene – RBC14
◼ Transferul viral
• este posibil în cazul xenotransplantelor
◼ de ex. Retrovirusurile endogene ale porcinelor pot influenţa celule
umane, în cazurile de xenotransplante de inimă sau pancreas –
RBC14
◼ Răspândirea („fluxul genic“)
• există posibilitatea de transfer a transgenei la nivelul
populaţiei nedomesticite – RBC14
◼ Evoluţia transgenei pe direcţii diferite (RBC14)
• transgena nu se integrează în genomul gazdei
• transgena se integrează în genomul gazdei, dar nu se exprimă
• exprimarea transgenei se realizează în mod similar genei
endogene
◼ de ex. ARNm ce copiază gena pentru insulina umană clonată în
şoareci este înlocuit cu ARNm pentru insulina de şoareci
Metoda de transgeneză pentru
obţinerea ovinei Polly
◼ Echipa de cercetători scoţieni, care a obţinut
oaia clonată numită Dolly, a realizat şi
mielul transgenic numit Polly. Acesta
conţinea transgena umană pentru factorul
IX de coagulare a sângelui (RBC14).
◼ Ulterior, au fost obţinuţi încă cinci miei
transgenici purtători ai acestei gene
(RBC14).
◼ Etape (RBC14)
• celule fetale (de fibroblast), cultivate in vitro
+ introducerea genei de interes (gena umană
ce codifică factorul IX de coagulare a sângelui)
• selecţia celulelor transformate
• fuziuni cu ovule enucleate
• Polly
http://www.google.ro/images?q=transgenic+animals+first+Dolly&hl=ro&gbv=2&gs_l=hp.3..0l2.1
859.5953.0.6281.18.10.0.8.8.0.203.1532.1j8j1.10.0...0.0.Dyz77i3tO0M&oq=transgenic+anim
als+first+Dolly&aq=f&aqi=&aql=
Obs. indicator genetic (marker) = gena pentru rezistenţă la
neomicină (RBC14)
◼ În cazul Polly, transgena s-a exprimat, dar integrarea
acesteia a fost aleatorie. Prin urmare, în anul 1999, tehnica
a fost îmbunătăţită prin realizarea inserţiei transgenei la
situs specific (permite integrarea genei de interes în genomul
celulei gazdă prin recombinarea pe bază de omologie) – RBC14.
◼ Această îmbunătăţire a permis obţinerea oilor transgenice numite
Cupidon şi Diana (RBC14)
◼ Cupidon
◼ conţinea
- doar gena pentru rezistenţă la neomicină ca indicator
genetic (marker), pentru că avea rol de control (RBC14)
◼ Diana
◼ conţinea (RBC14)
• atât gena pentru rezistenţă la neomicină ca indicator genetic
(marker),
• cât şi gena pentru α-1 antitripsină (proteină umană necesară în
tratamentul fibrozei chistice)
Exemple de animale transgenice
Scopuri:
1. obţinerea unei substanţe sau
2. obţinerea de xenogrefe (inimă şi
pancreas), pentru om.
Scop: obţinerea unei substanţe
◼ Şoareci transgenici (2000)

• şoareci transgenici care conţineau gena
codificatoarea a sintezei hormonului de
creştere de la şobolan (RBC14).
◼ Bovine (martie 2011)
• bovine transgenice care conţineau
gena codificatoarea a sintezei lizozimei
umane (enzima poate fi extrasă din
laptele bovinelor transgenice) – RBC14.
◼ Porcine transgenice (RBC14)
• porci transgenic care conţineau gena
codificatoare a sintezei hormonului de creştere
de la om
• obs.
- dezavantaj
• gena se exprimă pe toată durata de viaţă
a animalului transgenic
- rezolvare
• utilizarea unui promotor care să aibă
funcţionarea activată sau blocată de
factori specifici
◼ Iezi transgenici (1999, Canada)
• iezii transgenici Webster şi Peter care
conţineau gena ce determină sinteza
proteinei din pânza de păianjen (utilă în
obţinerea de fibre rezistente pentru
suturi, ţesături, industria aerospaţială) –
RBC14.
◼ Iepuri transgenici (2000)
• iepurele Babe care conţinea gena
(izolată de la peşti), codificatoare a
sintezei unei proteine asemănătoare
calcitoninei (tratamentul osteoporozei) –
RBC14.
Scop: obţinerea de xenogrefe
(inimă şi pancreas), pentru om
◼ Porcine transgenice
• 9 purceluşi transgenici (2001), care conţineau
gena pentru enzima α 1,3 – galactozil
transferaza => nu apare caracterul antigenic
al organelor porcine faţă de organismul uman
(RBC14).
◼ Somoni transgenici
• somoni transgenici care
conţineau gena codificatoarea
a proteinei ce conferă
rezistenţă la îngheţ
• primele animale transgenic
destinate consumului uman
• obs.
dezavantaj
• promotorul acestei
gene a dus la
funcţionarea genei
pentru hormonul de
creştere al unei specii
de somon => gena
este activă întregul
an în loc să fie activă
doar primăvara =>
somonii transgenici
cresc de 6x mai
repede => profit
◼ http://www.sciencedaily.com/rele
ases/2010/11/101118141539.ht
m
◼ Obs.:
• a. amfibianul Xenopus laevis poate fi
utilizat pentru exprimarea transgenelor
(RBC14);
• b. nematodul Caenorhabditis elegans
este format din 959 celule somatice şi
poate fi utilizat în studii de transgeneză
şi apoptoză (RBC14).
10.3. Potenţialul de aplicare al culturilor de celule şi
ţesuturi în biosecuritate
◼ în prezent, constă din (RBC14):

• obţinerea de structuri biologice
(microbiologice, vegetale sau animale),
modificate genetic prin mijloace care necesită
intervenţie umană;
• conservarea şi valorificarea variabilităţii
genetice existente și
• realizarea de testări cu agenţi biologici care
implică diferite nivele de afectare a sănătăţii
umane.
◼ Culturile de celule şi ţesuturi sunt
mijloace prin care cercetarea
ştiinţifică actuală poate oferi soluţii
pentru o serie de probleme care
influenţează biosecuritatea la nivel
global
• de ex.:
◼ reducerea suprafeţelor de teren agricol;
◼ creşterea cererii de alimente și
◼ scăderea accelerată a volumului de resurse
naturale consacrate pentru obţinerea de
energie.
10.3.1. Nanotehnologia
◼ Manipularea materiei vii la nivel

atomic (nanomicrocosmosul) pentru:
• construirea maşinilor miniaturale care ar
construi alte maşini mai mici decât
moleculele sau
• generarea de energie (RBC14).
◼ Scopuri (RBC14):
• distrugerea de
◼ boli
◼ deşeuri toxice sau
◼ alţi paraziţi celulari
• explorarea şi valorificarea spaţiului cosmic;
• construirea de computere cu performanţe
excepţionale și
• transplantul de organe prin „îmbrăcarea“
organului donat într-un înveliş molecular
biometric care să fie acceptat de organism
◼ Primul pas
• obţinerea unui sistem molecular nou
care să permită obţinerea de
„instrumente“ şi „dispozitive“ utile în
copierea şi sinteza de gene, prin
direcţionarea ribozomilor bacterieni
(RBC14).
◼ Exemple:
• primul complex miniatural care are capacitatea
de a deschide şi de a închide membranele
celulei umane (2000) – RBC14;
• primul motor bionic de mărimea unei molecule,
format dintr-o enzimă legată la o moleculă
construită genetic şi la o nanoparticulă
metalică – RBC14 și
• NPM (nanoparticule metalice magnetizate)
◼ rol.:
• transportă medicamente,
• furnizează energie şi
• hipotermie (RBC14).
Vă doresc sănătate și BAFTĂ ÎN
SESIUNEA CARE URMEAZĂ !

Cursuri Culturi de Celule Si Tesuturi PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Cursuri Culturi de Celule Si Tesuturi PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DE ȘTIINTE AGRONOMICE ȘI

MEDICINĂ VETERINARĂ - BUCUREŞTI

Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea plantelor

Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea plantelor

2.1. Procedee de propagare (multiplicarea clonală sau clonarea)

Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea plantelor

2.1. Procedee de propagare (multiplicarea clonală sau clonarea)

1907- Frog embryo nerve fiber outgrowth by Harrison.

Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

Capitolul 2. Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

Culturi de celule şi ţesuturi utilizate în propagarea

2.1.1. Cultura de meristeme (mericlonare) – procedeu eficient de

2.1.5. Propagarea prin embriogeneză somatică

Capitolul 3. Microorganismele, posibili aliaţi ai

Capitolul 3. Microorganismele, posibili

Capitolul 4. Conservarea materialului

Capitolul 4. Conservarea materialului

Capitolul 6. Culturi de celule şi ţesuturi

Capitolul 7. Cultura de hairy roots – implicaţii în producerea

• 7.1. Condiţii care facilitează sau perturbă obţinerea

• Optimization of ginseng cell culture in

Capitolul 7. Cultura de hairy roots –

În contextul unei tot mai strânse

• Metaboliţii secundari biosintetizaţi in vitro prin cultură de

• Biosinteza de metaboliţi secundari prin cultura

• Printre elementele acestui conglomerat pot fi

• Reducerea temperaturii de la 24ºC la 19,5ºC a

• Producerea metaboliţilor secundari prin utilizarea

• O altă aplicaţie importantă a rădăcinilor firoase

• De la nivelul hairy roots de Phytolacca americana

7.1. Condiţii care facilitează sau perturbă obţinerea

Celulele vegetale rănite (mecanic), biosintetizează anumite

• Infectarea celulelor vegetale de către bacteriile

• A fost lansată chiar ipoteza că acidul 3 -

• Cercetările efectuate şi publicate, până în

• În cazul plantelor rezistente la infecţia cu

Gazde pentru obţinerea rădăcinilor

• Bacteriile din genul Agrobacterium pot

• Tulpinile de Agrobacterium rhizogenes utilizate în

• Speciile de plante utilizate pentru transformare

• Dintre plantele la care a fost comunicată realizarea

7.2. Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de

Stabilitatea genetică a rădăcinilor adventive de tip hairy

7.3. Cultura de hairy roots la nivel de bioreactor şi

Valorificarea la nivel industrial a capacităţilor biosintetice

• O problemă frecvent întâlnită este, apariţia senescenţei la

• Deşi, numărul acestor parametri nu este deloc mic,

• De asemenea, prin cultivarea la nivel de bioreactor a

• Utilizarea unui mediu nutritiv artificial caracterizat

• Acumularea de puerarin din hairy roots

• Cultura de hairy roots (rădăcini firoase),

 8.1. Elemente esenţiale implicate în culturile de

 Observaţie. Condiţiile specifice cultivării in vitro

 - constau din fragmente de organ cultivate in vitro

 constau din celele dispersate obţinute prin

 sunt obţinute prin (RBC12):

 nr. de pasaje = 50 – 60 / cultură

 nr. de pasaje = cultivare în serie pentru un timp

 sunt linii celulare care au beneficiat de o mutaţie stabilă,

8.2. 1. Clonarea terapeutică

 Utilizări posibile (RBC12):

 Definiţie. Celulele stem sunt nediferenţiate şi au

 Utilizări posibile (RBC12):