Tehnica hibridrii

Pentru a avea rezultate n obinerea organismelor hibride, acestea sunt condiionate de executarea corect a urmtoarelor operaii: alegerea genitorilor, asigurarea coincidenei la nflorire a acestora, alegerea plantelor care particip la hibridare, precum i a inflorescenelor i florilor, castrarea, izolarea i polenizarea, controlul fecundrii, recoltarea seminelor hibride. Alegerea genitorilor. Alegerea corect a formelor parentale este o condiie esenial pentru obinerea unor rezultate scontate n hibridrile sexuate. n acest sens, este nevoie de o cunoatere detaliat a caracterelor i nsuirilor pe care le posed toate sursele de germoplasm din colecie, precum i a modului de condiionare genetic a acestora, cunoatere care este posibil numai pe baza unor studii amnunite efectuate n timp. Criteriile de alegere a formelor parentale se stabilesc n funcie de obiectivele urmrite n ameliorarea fiecrei specii. Un prim criteriu l constituie valoarea caracterelor i nsuirilor pozitive pe care le posed cele dou forme parentale i un numr ct mai mic de nsuiri negative. Pentru obinerea unor hibrizi valoroi este necesar s se foloseasc drept forme parentale ecotipuri ndeprtate geografic, dar ale cror perioade de nflorire s coincid pentru uurarea polenizrilor. Dac programul de ameliorare permite, este indicat ca unul dintre genitori s fie soiul zonat, a crui putere de adaptare la condiiile climatice este cunoscut. Cellalt genitor trebuie s participe cu unele caractere sau nsuiri complementare n care soiul zonat este deficitar. n cazul n care se practic hibridri interspecifice sau intergenerice, un rol foarte mare l joac aptitudinea pentru hibridare ndeprtat a formelor parentale. Indiferent de programul de ameliorare, pentru ca hibridarea s fie eficient, formele parentale trebuie s fie homozigote cel puin pentru perechile de alele care condiioneaz caracterele sau nsuirile a cror combinare se urmrete. Cele mai bune rezultate, ns, se obin cnd la ncruciarea speciilor autogame se folosesc linii pure, iar la speciile alogame linii consangvinizate. Atunci cnd se urmrete combinarea "n hibrid" a unor caractere cu ereditate simpl, exteriorizate tranant n fenotip (form, mrime, culoare), alegerea genitorilor este facil. Dimpotriv, dac se urmrete combinarea unor caractere condiionate poligenic, alegerea formelor parentale este o lucrare mult mai laborioas. n astfel de cazuri este necesar studierea valorii hibridologice a formelor parentale prin hibridri ciclice sau dialele, pentru a se putea stabili capacitatea combinativ general i, respectiv, capacitatea combinativ specific a acestora. Datorit numrului foarte mare de combinaii necesare n studiile hibridologice se recomand efectuarea hibridrilor ciclice, dup care, se vor reine pentru hibridrile dialele numai formele de material biologic care au prezentat cea mai bun capacitate combinativ general. n general, partenerii trebuie s posede caracterele i nsuirile pe care urmrim s le transferm noului hibrid, exprimate n cel mai nalt grad, printre acestea trebuind s se numere obligatoriu elementele care condiioneaz productivitatea (coeficienii de fertilitate i indicii de productivitate). De asemenea, nu se neglijeaz nici nsuirile fiziologice, biochimice i tehnologice. Conteaz de asemenea, homozigoia genitorilor, mcar pentru caracterele i nsuirile pe care dorim s le ntruneasc noul organism hibrid. Din acest motiv, n lucrrile de hibridare la

speciile autogame, se utilizeaz frecvent liniile pure iar la cele alogame, liniile consangvinizate. Uneori, din diferite motive, se pot folosi ca genitori i forme heterozigote. n acest caz, ns, alegerea celor mai potrivii genitori este foarte dificil deoarece n cadrul speciilor alogame aproape fiecare plant reprezint un genotip diferit. n astfel de situaii se recomand alegerea unor grupe de plante care s posede ct mai multe nsuiri pozitive. Pentru a se putea controla dac hibridarea s-a produs sau nu, se recomand ca genitorul mascul s posede unele caractere dominante bine evideniate n fenotip. n acest caz, dac n urma ncrucirii n generaia F1 plantele prezint caracterele formei materne, rezult c plantele respective s-au dezvoltat din semine autopolenizate i, deci, hibridarea nu a reuit. Asigurarea coincidenei la nflorire a celor dou forme parentale este, de asemenea, necesar pentru reuita hibridrii. Pentru aceasta, n funcie de decalajul existent ntre cei doi genitori, se folosesc mai multe metode, dintre care mai frecvente sunt: nsmnarea la epoci diferite, grbirea sau ncetinirea vegetaiei, precum i unele procedee mecanice. Dac se urmrete grbirea vegetaiei, se expun plantele la temperaturi mai ridicate, se trateaz cu stimulatori de cretere, se mrete doza de ngrminte cu fosfor sau, n sfrit, plantele se expun la durate i intensiti diferite de iluminare n funcie de specie. n cazul n care se urmrete ncetinirea vegetaiei la una din formele parentale, plantele vor fi expuse la temperaturi mai sczute, seminele se vor trata cu inhibitori de cretere, se va mri doza de ngrminte cu azot. Printre procedeele mecanice folosite ndeosebi la speciile pomicole, amintim: depozitarea zpezii n jurul tulpinilor i meninerea acesteia pn primvara trziu, acoperirea plantelor cu folii de polietilen, ciupirea mugurilor floriferi etc. Dac se constat c toate aceste procedee nu sunt eficiente, se va folosi polen conservat. Alegerea plantelor care particip la hibridare, a inflorescenelor i florilor. Partenerii oricrei hibridri trebuie s fie plante bine dezvoltate, sntoase, viguroase i productive. Acestea trebuie s fie semnate sau plantate n condiii optime, pentru a exterioriza ct mai bine caracterele i nsuirile valoroase. La aceste exemplare se vor alege cele mai dezvoltate inflorescene (spicul principal la cereale, inflorescenele bazale la leguminoase, inflorescenele de la baza lstarilor la via de vie, inflorescenele de la baza ramurilor la speciile pomicole), iar din cadrul inflorescenei numai florile normal dezvoltate. Pentru polenizare se vor folosi numai inflorescene bine expuse i bine hrnite, pentru a se asigura obinerea de ct mai multe semine hibride. Dac inflorescenele prezint un numr mare de flori n stadii diferite de dezvoltare, se vor reine pentru polenizare numai jumtate dintre acestea, cele normal dezvoltate, nlturndu-se acelea care au fost polenizate deja, cele prea tinere sau afectate de unii duntori. Castrarea (emascularea) reprezint operaia de ndeprtare a staminelor la florile hermafrodite, a florilor mascule la plantele monoice i a indivizilor masculi la speciile dioice. n lucrrile de creare a materialului iniial nou, castrarea se execut ntotdeauna manual, cu instrumentar adecvat, n funcie de specia cu care se lucreaz. Unele procedee chimice de sterilizare a polenului la plantele femele, ca i castrarea genetic (androsterilitatea), se utilizeaz numai n procesul de obinere a seminei. Eliminarea elementelor sexuale mascule se face obligatoriu nainte de maturarea acestora.

Castrarea se execut, de regul, dimineaa, dup ce se ridic roua sau spre sear, pentru a se evita ariele din timpul zilei care afecteaz florile femele. De asemenea, se vor evita zilele cu vnturi puternice. Imediat dup castrare se controleaz calitatea lucrrii, dup care, inflorescenele se izoleaz cu pungi de hrtie pergament sau din tifon, rezistente la factorii climatici. Dimensiunile izolatorilor sunt condiionate de mrimea inflorescenelor ce urmeaz a fi izolate. Polenizarea se execut la momentul optim, adic atunci cnd pe suprafaa stigmatului apare o secreie specific ce marcheaz gradul de receptivitate maxim pentru fecundare. n funcie de specie i de metoda de hibridare utilizat, polenizarea poate fi: forat, liber sau semiliber. Polenizarea forat se practic n cazul hibridrii liniilor pure la plantele autogame sau a liniilor consangvinizate la speciile alogame. Operaia const n depunerea polenului de la genitorul patern, recoltat proaspt sau conservat, pe stigmatul formei materne. Imediat dup efectuarea polenizrii cu ajutorul unor pensule fine, tampoane de vat sau pulverizatoare speciale, inflorescenele se vor izola din nou i se vor eticheta. Pe etichete se vor meniona datele privind genitorul mascul, momentul polenizrii i numele celui care a efectuat operaia. Polenizarea liber presupune ndeprtarea componentelor sexuale mascule ale florilor femele i lsarea liber a inflorescenelor pentru a se poleniza entomofil sau anemofil cu polenul genitorului mascul semnat alturat. Metoda se practic, de asemenea, la speciile alogame autosterile sau androsterile. Inconveninetul polenizrii libere const n faptul c, n combinaiile hibride rezultate, nu se cunosc dect genitorii materni. Polenizarea liber se utilizeaz ndeosebi n procesul de producere de smn. Polenizarea semiliber asigur cunoaterea ambilor parteneri care particip la ncruciare. Metoda const n introducerea sub acelai izolator a celor doi parteneri sau a inflorescenelor acestora, dup ndeprtarea componentelor mascule ale florilor partenerului matern. De regul, pentru a se realiza un procent mai mare de flori polenizate, sub izolator se introduc insecte polenizatoare. Procentul de semine hibride, deci de reuit a ncrucirilor, n condiiile n care se respect toate regulile impuse n astfel de lucrri este condiionat n mare msur de gradul de viabilitate a polenului (proaspt sau conservat) i de receptivitatea stigmatelor pentru polen. Viabilitatea polenului este maxim n primele zile de la ajungerea la maturitate a acestuia, dup care scade treptat. Pstrat n condiii optime ns, i poate menine viabilitatea o perioad mai mare de timp. Astfel, la via de vie, se menioneaz c n condiii de umiditate i temperaturi sczute viabilitatea polenului se poate menine peste patru ani. n ce privete controlul viabilitii, acesta se poate face att n condiii de cmp ct i de laborator. Pentru examinarea n cmp se folosesc plantele test ale cror stigmate se polenizeaz cu polen recoltat n diferite etape i pstrat corespunztor. n laborator, grunciorii de polen se vor trece pe medii speciale la temperatur i umiditate favorabile, dup care, la microscop, se va observa gradul de germinare.

Receptivitatea stigmatelor la genitorii materni este diferit de la o specie la alta i depinde de faza de maturaie i de condiiile de mediu. O influen puternic asupra receptivitii stigmatelor o are modul de polenizare n cadrul speciei (autogam sau alogam). La plantele autogame, pentru a se favoriza autofecundarea, ntotdeauna receptivitatea stigmatelor va fi redus. Dimpotriv, la speciile alogame, stigmatele vor fi viabile i receptive o perioad mai mare de timp pentru a se favoriza polenizarea cu polen provenit de la alte plante.

Hibridarea - principala metodafolosit n ameliorare

Prin hibridare, se reunesc ntr-un singur organism, nou, denumit hibrid, caracterele i nsuirile valoroase provenite de la dou sau mai multe forme parantale. Dup cum s-a menionat, hibrizii prezint n F1, efect heterozis maxim - datorat heterozigoiei totale, dup care, n F2, F3, Fn, denumite generaii segregante, efectul heterozis scade foarte semnificativ i aceasta datorit scderii heterozigoiei i creterii homozigoiei. Generaiile segregante la hibrizi, ofer variabilitate genotipic - ereditar, ridicat i constituie un material valoros folosit n procesul de ameliorare. De asemenea, prin creterea ponderii formelor homozigote, din generaiile segregante avansate (F4, F5, F6) exist posibilitatea identificrii de forme homozigote valoroase ce pot fi folosite la crearea de noi hibrizi. Executarea corect a unei hibridri necesit cunoaterea precis a morfologiei florale, a nfloritului pentru fiecare specie n parte, iar tehnica hibridrii propriu-zise se difereniaz dup modul de polenizare al plantelor. Avem: Hibridarea sexuat la plantele autogame Hibridarea sexuat la plantele alogame Hibridarea sexuat la plantele cu nmulire vegetativ

Hibridarea sexuat la plantele autogame

La plantele ce se polenizeaz cu polenul propriu (autogame), hibridarea este o operaie foarte dificil i necesit mult ncredere, contiinciozitate i profesionalism din partea amelioratorului. Ordinea operaiilor de hibridare este urmtoarea: a - alegerea formelor parentale (genitorilor); b - semnatul n cmpul de hibridare (C.h.) a genitorilor; c - alegerea plantelor-elit ce vor fi hibridate (mam i tat); d - pregtirea genitorilor pentru hibridare (castrare, izolare etc.); e - polenizarea, izolarea i etichetarea; f - recoltarea seminei hibride F0. Hibridarea la gru Morfologia floral. Inflorescena grului este un spic format dintr-un ax principal numit rahis, pe care sunt inserate spiculee ntr-un numr variabil. Un spicule este format din dou glume i 2 - 6 flori (de regul 5 flori: dou laterale fertile i 3 n mijloc ce pot fi sterile). O

floare se compune din dou lodicule, dou palei, androceul (format din 3 stamine) i gineceul (cu ovar, stil i stigmat bilobat). Morfologia floral la gru se prezint n figura 3. Biologia nfloritului - fiind autogam de tip cleistogam, planta de gru posd elementele sexuale mascule i femele n aceeai floare i ajung la maturitate simultan. ~nfloritul ncepe cu spicul principal i se continu cu fraii n ordinea formrii lor. La un spic, nfloritul ncepe cu treimea mijlocie i se continu apoi spre cele dou extremiti. La un spicule, nfloresc primele cele dou flori fertile laterale i apoi,uneori, poate nflori i floarea mijlocie din grupul de trei flori centrale ce sunt, n majoritatea cazurilor, sterile. Durata nfloritului este de 3-5 zile pentru spic n cazul unui timp umed i de 2-3 zile pe timp normal. - Algerea formelor parentale (genitorilor) - ncepe, mai nti, cu genitorul matern, pe rndul special nsmnat , n cmpul de hibridare (Ch) unde cei doi genitori sunt nsmnai n rnduri paralele, la distane ce permit accesul amelioratorilor. Pe rndul fiecrui genitor, se identific plantele-elit, care trenuie s fie cu habitusul normal crescut i dezvoltat, s fie sntoase i s corespund soiului de care aparin. Fiecare plant-elit se eticheteaz. - Pregtirea pentru castrare - este prima operaie care se face de ctre persoana ce urmeaz a executa castrarea (eliminarea staminelor din florile spicului genitorului matern). Pentru aceasta se socate spicul n ntregime din teaca ultimei frunze (stindard), fr ca frunza s fie distrus. Apoi, cu penseta se rup spiculeele bazale i cele terminale ale spicului ntruct, de regul, acestea sunt mai puin dezvoltate. Pe fiecare spic vor rmne 8-10 spiculee fertile, n majoritate fiind din treimea mijlocie. Dup aceast operaie, tot cu penseta se extrag cele trei flori din mijloc ale fiecrui spicule, rmnnd astfel numai florile laterale, totaliznd 16-20 flori pe spic. Operaia se face de la baza spre vrful spicului, de o parte i apoi de cealalt parte a spicului. O ultim operaie, cu foarfeca - se scurteaz vrfurile paleelor rmase, pentru a uura deschiderea florii n vederea castrrii. - Castrarea - vizeaz eliminarea celor trei antere din fiecare floare, fr a vtma gineceul i fr a rupe paleele sau glumele. Operaia de castrare se execut astfel: se prinde spicul cu mna stng, ntre degetul mare i arttor; cu degetul mare se apas uor paleele florii pe locul unde au fost scurtate, permind astfel introducerea pensetei n interiorul florii. Cele 3 stamine din floare se extrag cu penseta, fiecare separat, prin numrare - ordinea fiind aceeai: de jos n sus i de la dreapta spre stnga, pe fiecare parte a spicului. Dup terminarea castrrii, se niveleaz uor spicul, cu mna, de la baz spre vrf, pentru ca florile s revin la poziia lor normal. Spicele castrate se izoleaz cu o pung ngust de pergament prins cu o agraf la baza spicului i etichetat cu creionul: data, soiul, numele persoanei care a castrat etc. - Polenizarea (hibridarea) - se face dup 1-3 zile de la castrare, folosindu-se una din urmtoarele dou metode: polenizarea forat, polenizarea semiliber (semiforat). La polenizarea forat - se recolteaz, mai nti, polenul de pee spicele genitorului patern, dup acelai procedeu ca la castrarea spicelor-mam. Polenul se colecteaz n fiole sau vase Petri, se eticheteaz i se pstreaz la temperatur constant. Se revine, din nou, la elitamam castrat, se scoate izolatorul, se deschide individual fiecare floare i se introduc pe stigmat, 1-3 antere, sau se pensuleaz stigmatul cu un penson de vat, muiat n amestecul de polen-patern. Ordinea polenizrii florilor este aceeai ca i la castrare. Dup polenizarea ultimei flori, se izoleaz cu acelai izolator pe care se mai noteaz denunirea genitorului-patern, data polenizrii i persoana.

La polenizarea semiliber, care este cea mai folosit, dup 1-3 zile de la castrare, se introduce sub izolatorul spicului-matern, 1-2 spice ale genitorului-patern, aflate n momentul de vrf al nfloririi. Pentru a prelungi eliberarea de polen, paiul spicelor paterne se introduce ntr-o eprubet cu ap, fixat pe un tutore nfipt lng planta matern. Curenii de aer, prin micarea izolatorului, vor forma un nor de polen ce va poleniza liber stigmatele spicului matern-castrat.