ACIZII GRAȘI

DETECTAREA FALSIFICĂRII ULEIULUI DE IN

PE BAZA PROFILELOR ACIZILOR GRAȘI
FOLOSIND SPECTROSCOPIA ATOMICĂ DE
MASĂ
- Proiect -

Introducere
 Uleiul de semințe de in, cunoscut și sub denumirea de ulei de in, este obținut din
semințele din plantele Linum usitatissimum (familia Linaceae), care au un conținut bogat de
acizi grași esențiali (în special acizi grași omega-3) și fitoestrogeni lignani.
Recent, uleiul de semințe de in a prezentat un interes crescut datorită potențialelor sale
beneficii în sănătate asociate componentelor sale active. Cu un conținut ridicat de acizi grași
Omega-3 din semințele de in, uleiul joacă un rol important în reducerea riscurile asociate
bolilor inflamatorii și autoimune, boli cardiovasculare, diabet, colon, cancer de ovar și
prostată. În plus, uleiul de semințe de in conține toți aminoacizii esențiali cruciali pentru
sinteza proteinelor care reglează și mențin corect funcțiile celulare. Prin urmare, în ultimele
două decenii, uleiul de semințe de in a câștigat popularitate, fiind folosit deseori în dieta
umană pentru îmbunătățirea nutriției și stării de sănătate. Uleiul de in este folosit și în dieta
animalelor pentru îmbunătățirea calității produselor rezultate.
Datorită potențialelor beneficii pentru sănătate, uleiul de semințe de in este mai mult
scump decât alte uleiuri comestibile,ceea ce îl face tentant falsificărilor, uleiului de in
falsificat devenind un risc emergent care încalcă drepturile și interesele consumatorilor și ar
putea fi dăunător pentru sănătatea umană. Evaluarea autenticității uleiurilor vegetale
comestibile este o problema greu de rezolvat la nivel mondial, asemenea falsificărilor
uleiurilor de măsline în țările occidentale. Prin urmare există o cerere mare pentru
descoperirea unor metode de detectare fiabile pentru uleiul falsificat. Cele mai utilizate
metode sunt: lichid cromatografia, gaz cromatografia, spectroscopia în infraroșu,
spectroscopia de fluorescență și spectroscopia Raman. Acizii grași sunt componentele
dominante în uleiuri comestibile, a căror compoziție este relativ stabilă în semințele
oleaginoase. Mai mult, acizii grași polinesaturați (PUFA) în uleiul de semințe de in, în special
PUFA omega-3, sunt foarte importante contribuind la funcțiile nutriționale.
Intuitiv, acid alfa linolenic (ALA) ar putea fi o alegere bună pentru a detecta
falsificarea uleiului din semințele de in având în vedere faptul că acest ulei are un conținut
relativ mai mare de acid a-linolenic (ALA) decât majoritatea altor uleiuri comestibile.
Cu toate acestea, în conformitate cu standardul chinez, conținutul relativ de ALA în
uleiul de semințe de in variază în general de la 39% la 62% putând ajunge la aproximativ
73% în cazul anumitor soiuri. Însă această metodă nu este sigură din cauza faptului ca uleiul
poate fi falsificat cu alte uleiuri cu conținut ridicat de ALA, dar cu preț mai redus precum
uleiul de bumbac. De aceea este necesară o metodă de analiză a datelor multivariate a
profilurilor de acizi grași pentru detectarea falsificării uleiului de in. În analiza datelor
multivariate, chemometria este un puternic instrument de analiză multivariat a datelor
împotriva fraudei petroliere, utilizat pentru clasificarea eșantioanelor necunoscute prin
comparare cu altele similare pentru determinarea probelor falsificate. Metode chimometrice,
cum ar fi analiza componentelor principale (PCA), analiză ierarhică de cluster (HCA), hărți
auto-organizate pe baza parametrilor haotici și analiza discriminantă a clusterului (CDA) au
fost folosite pentru a distinge uleiurile comestibile de uleiurile de gătit reciclate rafinate,
identificarea uleiuri comestibile și detectarea falsificării uleiului de măsline extravirgin cu
uleiuri comestibile inferioare calitativ.
Evident, mai mulți acizi grași existenți într-un ulei indică o probabilitate mai mare de
detectare a uleiurilor comestibile falsificate cu alte uleiuri. În acest studiu, profilurile de acizi
grași din uleiul de semințe de in au fost analizate prin cromatografie de gaze cuplată cu
spectrometrie de masă pentru a obține mai multe informații despre acizii grași.
Ulterior, un model de clasificare a uleiul de in și alte 5 tipuri de uleiuri comestibile
precum și un etalon pentru uleiurile de in și pentru cele falsificate au fost construite de PCA
și o mașină vectorială cu suport recursiv (R-SVM). Modelul construit în acest studiu ar putea
fi utilizat pentru a detecta eficient ulei de in falsificat.

Materiale și metode
Un total de 20 de probe de in au fost achiziționate din diferite regiuni, iar uleiurile din
semințe au fost preparate cu ajutorul utilajelor de fabricare a uleiului (TZC0502, Brand of
TEN GUARD, Foshan, China). Între timp, 22 de probe de ulei reprezentând aproape toate
tipurile de ulei de in de pe piața chineză au fost achiziționate de la diferite companii.
0,06 g ulei de semințe a fost diluat cu 2 ml dietil eter /eter de petrol (1: 1 v / v). Apoi,
1 mL 0,4 M KOH-CH3OH a fost adăugat la diluție, vortexat și păstrat la temperatura camerei
timp de 2,5 ore. După aceasta, s-au adăugat 2 ml apă redistilată, vortexat și centrifugat la
4500 rpm timp de 2 min. În cele din urmă, faza organică de 50 ml care conține esteri metilici
ai acidului gras (FAME) au fost colectate și diluate cu 950 ml eter petrolier înainte de analiza
GC-MS.
Analiza GC-MS a fost realizată cu un gaz cromatograf Agilent GC 7890 interfațat cu
un spectrometru de masă Agilent 5973. În sistemul de cromatografie cu gaz echipat cu
coloană capilară cu silice topită DB-23 (30 m 0,25 mm 0,25 mm), heliu (99,999% puritate) a
fost utilizat ca gaz purtător la un debit de 1,2 ml min−1. Temperatura coloanei a fost prima
dată setată la 100 ° C și a menținută timp de 0,2 min, apoi crescută la 215 C cu o viteză de 10
̊C / min și menținută timp de 0,1 min, până când temperatura finală a atins 224 ̊ C cu o viteză
de 2 ̊ C / min și a fost menținută suplimentar 0,2 min.
Durata totală de rulare a fost de 16,5 min. Acesta este condiția optimă de programare
a temperaturii atât pentru separare cât și pentru timpul de rulare. Condițiile spectrometrice de
masă au fost următoarele: modul de ionizare electronică (EI) a fost la 70 eV; temperaturile
injectorului, sursei de ioni și a detectorului au fost de 220̊ C, 250 ̊C și respectiv 150 ̊C.

Identificarea FAME-urilor
Acizii grași din probele de ulei din semințe au fost identificați prin retenție
caracteristicile spectrale de masă. Această identificare a fost efectuată în următorii trei pași:
(1) O căutare automată de masă spectrală a fost folosită pentru a identifica toate FAME-urile
din fiecare cromatogramă, timpul de retenție a FAME-urile a fost utilizat pentru calcularea
luminescenței electrochimice(ECL), (3) Valorile ECL ale acizilor grași din probe au fost
comparați cu cei ai acizilor grași din baza noastră de pentru a identifica FAME nesaturate.

Analiza multivariată
Matricea de date include conținutul relativ al acizilor grași din uleiurile comestibile.
Baza de date cu acizi grași pentru uleiuri comestibile este formată din 17 eșantioane de ulei
de soia, 75 de probe de ulei de arahide colectate de la majoritatea zonelor producătoare, 57
probe de ulei de semințe de floarea soarelui, 76 eșantioane ulei de rapiță și 73 probe de ulei
de susan achiziționate de la diferite zone de producție. Datele pentru uleiurile falsificate au
fost implementată în Matlab 2011a pentru Windows (The Mathworks, Natick, MA). Pentru a
stabili un model discriminator precis pentru uleiul de semințe de in și uleiurile falsificate, 42
probe de ulei falsificat au fost simulate prin amestecarea a cinci tipuri de ulei cu ulei de in
până când conținutul acestor uleiuri a atins 10% în proporții aleatorii.
În cele din urmă, a fost stabilit un model discriminant pentru uleiul din semințele de in
și uleiurile falsificate de R-SVM iar modelul discriminant a fost validat.
Datele au fost procesate pe un computer personal Pentium 4 care rulează Windows.

Rezultate
Identificarea și cuantificarea acizilor grași din uleiul de semințe de in. Pentru a obține
mai multe informații despre compoziția acizilor grași din uleiul de in, metoda GC / MS-SIM
a fost utilizată pentru a analiza acizi grași necunoscuți. Pe de o parte, FAME necunoscuți în
probe ar putea să fie identificați pe bază de ioni și indicii de retenție selectați, iar pe de alta
parte ceilalți acizi grași pot fi cuantificați. Așa cum se arată în Fig. 1, au fost identificate
automat 11 FAME saturați în funcție de peack-uri și timpul de retenție, inclusiv 12: 0, 14: 0,
15: 0 ,16: 0, 17: 0, 18: 0, 20: 0, 21: 0, 22: 0, 23: 0 și 24: 0.

Fig. 1. Cromatograma ionilor unei probe de ulei de in

Timpul de retenție și suma abundențelor relative cu valoarea raportului m / z 55, 67 și

79 au fost folosite pentru a valida dacă FAME-urile saturate formau lanţuri drepte. Ulterior,
timpii de retenție ai celor 11 FAME saturați au fost utilizați pentru a calcula valorile ECL ale
altor vârfuri.
Timpul de retenție al apexului fiecărui vârf a fost considerat ca timpul de retenție al
FAME-ului corespunzător.
Valorile ECL ale FAME-urilor cautate din uleiurile comestibile au fost comparate cu
date din baza de date personalizată construită condiții similare cu studiul nostru anterior
(Zhang și colab., 2012). Folosind această metodă, 12 FAME nesaturate au fost identificate și
validate după standarde autentice, așa cum se arată în tabelul 1. Mai mult, 3 FAME nesaturate
au fost preluate din baza de date Chrombox și ultimele 2 FAME-uri nesaturate au fost deduse
pe baza caracteristicilor spectrale de masă.
În total au fost identificate 28 FAME și cuantificate pentru analizele multivariate
ulterioare, semnificativ mai multe decât în studiul anterior pentru uleiurile de in
 În metabolomica comparativă, abundența metaboliților este adesea folosită pentru
analiza multivariatelor ulterioare. În acest studiu a fost utilizată compoziția de acizi grași în
procente ca rezultate cantitative pentru uleiul de semințe de in, așa cum sunt enumerate în
tabelul1.

PCA și harta căldurii

După ce acizii grași din uleiurile de in au fost determinați și cuantificați, matricea de
date a conținutului lor relativ a fost preprocesată prin transformarea generalizată a jurnalului
și scalarea Pareto. Apoi, PCA și harta căldurii au fost utilizate pentru a arăta clustering-ul
probelor și distribuția variabilă în semințele de in și alte uleiuri comestibile. Diagrama de scor
din Fig. 2a arată că uleiurile din semințele de in și alte uleiuri comestibile pot fi separate, așa
cum sunt afișate pe computerul 2 și 4.
Pentru a investiga distribuțiile variabile în cele cinci grupuri, o hartă a căldurii a fost
produsă pentru profilele de acizi grași din cele șase uleiuri vegetale. Așa cum se arată în Fig.
2b, rezultatele analizei clusterului de similaritate au fost obținute de PCA.
Un aspect important a fost acela că am găsit distribuții variabile în cele două grupe ale
harții de căldură, unde 18: 3 n-3c (acid a-linolenic) și 18: 3 n-6c (acid g-linolenic) au fost
identificate ca substanțe care ar putea diferenția uleiul de semințe de in de celelalte uleiuri
comestibile. Uleiul de in are conținut relativ ridicat de acizi linolenici și prin urmare, nu este
dificil să distingi uleiul de semințe de in de celelalte cinci uleiuri comestibile. În această
situație, ALA ar putea fi angajat ca marker pentru detectarea falsificării uleiului de in prin
setarea pragului ALA la 39% 
 Fig. 2a Valoarea PCA la al 2-lea și al 4-lea PC, cercul roșu: uleiuri de in, cercul
verde: alte cinci uleiuri comestibile. Uleiurile de in ar putea fi complet separate de alte cinci
uleiuri comestibile, ceea ce indică faptul că profilurile de acizi grași ar putea reflecta
diferențele dintre diferitele tipuri de uleiuri comestibile

Model discriminatoriu pentru depistarea falsificării

Deoarece profilele de acizi grași din uleiul de semințe de in nu sunt fixate, pragul de
ALA poate să nu funcționeze pentru detectarea acidului linolenic din ulei de in falsificat cu
alte uleiuri comestibile.
Prin urmare, pentru a testa dacă acidomica grasă ar putea realiza identificarea
falsificării uleiului de semințe de in, falsificarea uleiului a fost simulată pe baza faptului că nu
a avut loc nici o reacție chimică pentru acizii grași sau triacilgliceroli când au fost amestecate
mai mult de două uleiuri comestibile.
Astfel a fost simulată falsificarea a 42 de probe de ulei prin amestecarea a 10% din
alte cinci uleiuri în proporții aleatorii cu 90% ulei de semințe de in.
Apoi, a fost construit de R-SVM un model discriminatoriu pentru uleiuri de in pure și
uleiuri falsificate simulate după transformarea generală a jurnalului și scalarea Pareto. R-
SVM a fost dezvoltat pentru a selecta gene sau biomarkeri importanți pentru clasificarea
datelor distorsionate. Metoda R-SVM este potrivită pentru analizarea datelor cu performanțe
ridicate, care sunt distorsionate și capabilă să recupereze caracteristici informative.
Algoritmul detaliat al R-SVM a fost descris în alt articol (Zhang et al., 2006). În
această lucrare, R-SVM a clasificat recursiv probe cu un nucleu liniar și variabile importante
selectate pe baza puterii discriminatorii dintre două clase.
 Un model de clasificare a fost construit recursiv cu diferite subseturi de caracteristici,
care au fost selectate pe baza contribuțiilor lor relative în clasificare folosind rate de eroare de
validare încrucișată.
Cel mai puțin importante caracteristici au fost eliminate în etapele ulterioare. În acest
proces, au fost create o serie de modele SVM, iar modelul cu un număr minim de
caracteristici și o rată de eroare minimă de validare încrucișată de 10 ori a fost selectată ca
model final.
Mai exact, toți din cei 28 de acizi grași sunt importanți atunci când uleiul de semințe
de in este diferențiat de celelalte cinci uleiuri comestibile și amestecurile lor. Rezultatul
validării încrucișate a arătat că 4,4% din rata de eroare a fost obținută din uleiul de semințe de
in falsificat cu 10% din alte cinci uleiuri comestibile. Între timp, am descoperit din Fig. 3b că
este abundența scăzută de acizii grași ar putea fi mai importantă în detectarea falsificării cu
cele cinci uleiuri comestibile.
După construirea modelului R-SVM, acesta ar putea să fie utilizat pentru a detecta
uleiul de semințe de in falsificat cu unul sau mai multe uleiuri comestibile din cele cinci
uleiuri menționate mai sus conform profilelor de acizi grași.
Prin urmare, profilurile de acizi grași din acest studiu ar putea reflecta mai multe
informații despre acizii grași din uleiurile comestibile decât metodele anterioare, facilitând
clasificarea și detectarea falsificării uleiului de in.

Concluzie
Uleiul de in este un ulei comestibil foarte cunoscut, cu cantități mari de componente
nutritive, inclusiv acizi grași esențiali, fitoestrogen lignans, antioxidanți naturali și fibre
alimentare. Falsificarea uleiului este o sursă majoră de probleme de fraudă alimentară în
întreaga lume, și încă nu există o metodă pentru detectare a falsificării uleiului din semințe de
in. În acest studiu au fost analizate profilele de acizi grași din uleiul de semințe de in prin
metoda GC / MS-SIM și apoi utilizat pentru detectarea uleiului de in falsificat cu alte uleiuri
comestibile în combinație cu metode statistice multivariate, inclusiv PCA, harta căldurii și R-
SVM.
Rezultatele au indicat că acidul linolenic a fost un marker pentru detectarea falsificării
uleiului de in prin setarea pragului ALA la 39% și că modelul discriminant construit cu 28 de
acizi grași ar putea identifica uleiul de semințe de in falsificate (10%) cu o precizie ridicată de
95,6%. Folosind strategia profilurilor de acizi grași s-ar putea prevenii înșelarea clienților cu
uleiul de semințe de in falsificate.
 BIBLIOGRAFIE

1.www.elsevier.com/locate/lwt- LWT - Food Science and Technology-Fatty acid profiles

based adulteration detection for flaxseed oil by gas
chromatography mass spectrometry