Subiectul 92

Biogeneza lizozomilor

Lizozomii sunt organite delimitate de o endomembrană, conțin hidrolaze

acide (~50 enzime hidrolitice solubile) cu rol în digestia celulară a nutrienților, dar
și a (macro)moleculelor intra-/extra-celulare sau organitelor care nu mai sunt
necesare.

Functia lor se bazeaza pe bogatul continut in hidrolaze acide, pe care celula

le produce si le directioneaza corect printr-o colaborare inalt specializata intre RE
si compelxul Golgi, care implica si un trafic adecvat, selectiv de membrana. Acest
proces poarta denumirea de biogeneza lizozomala.

Biogeneza lizozomala consta in

 biosinteza proteinelor lizozomale (enzime + proteine ale mb

lizozomale) in RE
 maturarea, sortarea si directionarea spre lizozomi a bagajului
molecular specific in ap. Golgi

Biogeneza lizozomala prezinta 2 aspecte mai bine cunoscute:

1. marcarea enzimelor lizozomale

2. sortarea, segregarea moleculelor si vezicularea lizozomilor primari

Ambele fenomene se petrec la nivelul ap. Golgi.

1. Marcarea enzimelor lizozomale presupune formarea unei etichete

(manozo-6-fosfat, M6P).
 Prima etapa: de la nivelul retelei cis-Golgi, proteinele care sunt
destinate a sfarsi ca enzime lizozomale si care poarta obligatoriu
structuri oligozaharidice N-glicozidice sunt complexate de enzima N-
acetilglucozaminil-fosfotransferaza, care modifica cel putin una
dintre manoze prin transferarea unei N-acetil-glucozamine impreuna
 cu un fosfat => se formeaza un precursor al etichetei finale M6P.
Specificitatea interactiunii dintre viitoarea enzima lizozomala si N-
acetil-glucozaminil-fosfotransferaza este asigurata de un semnal
conformational.
 A doua etapa: nu este clar unde are loc, dar consta in prelucrarea
ulterioara a etichetei la forma ei finala. Cert este insa faptul ca in
reteaua trans-Golgi, capacul de N-acetil-glucozamina nu mai
mascheaza eticheta M6P, care devine functionala si este folosita in
procesele de sortare, segregare si producere a lizozomilor primari.
2. Sortarea are la baza interactiunea M6P cu un receptor specific
transmembranar (receptorul la M6P). Receptorul la randul sau, folosit
pentru segregarea si aglomerarea componentelor lizozomale la nivelul unor
structuri cu invelis de clatrina din reteaua trans-Golgi. Acestea evagineaza
din structurile trans-Golgiene si se desprind, pierzandu-si invelisul de
clatrina si devenind lizozomi primari.

In etapa urmatoare, lizozomii primari fuzioneaza:

- cu endozomi tarzii => lizozomi secundari

- cu lizozomi secundari preexistenti => sporindu-le bagajul de enzime cu
componente proaspete.

Biogeneza lizozomilor se sfarseste cu procesele de reciclare a

componentelor membranare implicate in sortare, segreare, veziculare si transport
directionat al lizozomilor primari.

In ciuda faptului ca enzimele lizozomale sunt functionale deja in reteaua

trans-Golgi, ele nu pot activa aici deoarece pH-ul in lumenul structurii este cu cel
putin o unitate mai ridicat decat in lizozom (desi tot acid, este putin mai acid).
 Subiectul 93
Mitocondria: aspectul la MO şi ultrastructure

Mitocondria (condriozomul) este un organit celular delimitat de un sistem

de două membrane, având ca funcţie de bază producerea de ATP. Este un organit
semiautonom, adica se afla in relatie de simbioza cu celula si este capabila de
autoreplicare prin fisiune binara.

Are lungimea de 1.5-2 microni si diametrul de 0.3-0.5 microni.

 MO(structura):
- hematoxilina ferica Regaud(coloratie citochimica)=> structuri
granulare negre cu aspectul unor scame, fire de ata
- verde Janus B (colorant vital)=> evidentierea plasticitatii
morfologice a mitocondriei. Caracterul de colorant vital al
verdelui Janus B este dat de capacitatea sa de a patrunde si de
a fi oxidat in mitocondrie => colorarea organitului in verde
smarald
- rodamina 123(colorant vital)=> devine fluorescenta prin
oxidare intramitocondriala

Cu ajutorul colorantilor vitali, a fost caracterizata plasticitatea

mitocondriilor, adica posibilitatea acestora de a-si schimba forma, de a fuziona
sau fisiona. Acesti coloranti vitali au permis prin tehnicile actuale de microscopie
de fluorescenta, inclusiv microscopie confocala, sa se observe morfologia
labirintica si inretelata a mitocondriilor dintr-o celula.

 ME(ultrastructura):
- are mai multe elemente ultrastructurale specifice:
1. membrana mitocondriala externa si interna
2. criste mitocondriale
3. spatiu intermembranar
4. matrice mitocondriala
 5. ribozomi
- un organit invelit intr-o membrana relativ bine intinsa - membrana
mitocondriala externa. In interiorul acesteia si separata de ea, se
evidentiaza o a doua membrana, puternic faldurata, denumita
membrana mitocondriala interna. Faldurile acestei membrane sunt
denumite criste mitocondriale (diametru de 18-20nm) orientate
perpendicular pe axul lung al organitului, dar pot avea si aspect
tubular (cu sectiunea circulara sau triunghiulara)
ex: la celulele secretoare de hormoni steroidici, cele 2
membrane definesc doua compartimente mitocondriale. Acestea
sunt:
1. compartimentul mitocondrial extern (spatiu intermembranar) =
spatiul dintre cele doua membrane mitocondriale si din axul cristelor
2. compartimentul mitocondrial intern (matrice mitocondriala) =
spatiul din interiorul membranei mitocondriale interne
- este cel mai complex compartiment, la nivelul sau gasindu-se
un ADN propriu, fara capete libere = ADN circular, chiar daca forma
sa nu este de cerc
- ribozomii mitocondriali !!!!

ME de inalt voltaj (permite analiza unor sectiuni mai groase ale

preparatelor biologice) a evidentiat aspectul prelung, adesea ramificat al
mitocondriilor =>numarul mitocondriilor intr-o celula este mult mai mic decat am
fi tentati sa credem din examinarea preparatelor standard de ME.

Lucrul acesta este evidentiabil si prin studiul de sectiuni seriate in

microscopia electronica clasica, astfel incat mitocondrii care se evidentiau
independent in unele sectiuni se dovedesc a se uni la nivelul altor sectiuni, adica
se dovedesc a fi parti constitutive ale aceleiasi mitocondrii.
 Subiectul 94
Organizarea moleculară şi funcţiile membranei mitocondriale interne

Membrana mitocondriala interna, desi organizata conform modelului

mozaic fluid, reprezinta o exceptie de la regula in privinta raportului
lipide:proteine. Ea contine 20-30% lipide si 70-80% proteine => rolul sau
metabolic. Insa, rolul de bariera al acestei membrane este, de asemenea,
deosebit de important, pentru buna ei functionare.

Pentru a compensa parca procentul mic de lipide, la nivelul acestei

membrane intalnim un fosfolipid cu o hidrofobicitate mai accentuata=cardiolipina
(~ 15% in procente de compozitie).

Procesul esential desfasurat la nivelul mb mitocondriale interne este

FOSFORILAREA OXIDATIVA ce prezinta 5 complexe proteice, primele 4 apartinand
fenomenului denumit lant transportor de electroni=LANT RESPIRATOR.

Aceste complexe proteice preiau electroni de la NADH, respectiv FADH2, si

ii poarta printr-o succesiune de centre oxido-reducatoare, saracindu-i trepat de
energie, cedandu-i la sfarsit oxigenului.

Acest intreg proces este insotit si de pomparea de protoni din matrice catre
compartimentul mitocondrial extern prin folosirea energiei preluate de la
electronii transportati doar de 3 dintre cele 4 complexe proteice: I,III, IV =
complexe de conservare a energiei. Energia este conservata sub forma unui
gradient electrochimic generat la nivelul membranei mitocondriale interne prin
aceasta pompare directionata de protoni.

Lantul respirator

In LR opereaza complexele I-IV, precum si 2 componente de legatura:

- Ubiquinona - face legatura intre complexele I-II-III

- Citocromul c - leaga complexele III-IV.
Deci: complex I – ubiquinona – complex II – ubiquinona - complex III - citocrom c -
complex IV

Complexul I = complexul NADH- dehidrogenazei

- este cel care introduce in sistem electronii preluati de pe NADH

- este format din peste 40 de subunitati proteice, dintre care 7 sunt tipuri
autonome <=> sunt proteine codificate de ADN-ul mitocondrial propriu si
sintetizate in matricea organitului, prin ribozomi proprii
- contine 1 centru flavinic si 7-8 centre fier-sulf, care prezinta cofactorii unor
asa-numite proteine Fe-S cu raport stoechiometric intre ionii de Fe si cei de
S unitar
- dupa ce preia electronii de pe NADH, ii saraceste in energie in mai multi
pasi, prin trecerea lor de la un centru oxido-reducator la altul, sfarsind prin
a-i preda ubiquinonei = coenzima Q( CoQ)
- energia preluata de la electronii transportati e folosita pentru pomparea de
protoni din matricea mitocondriala in spatiul intermembranar.

Complexul II = complexul succinat-dehidrogenazei

- este singurul complex al LR ce nu pompeaza protoni, desi prezinta 1

domeniu transmembranar
- contine 1 centru flavinic si 3 centre FE-S (din care unul atipic 3Fe-4S),
precum si 1 centru hemic
- introduce in LR electronii preluati de la FADH2, a caror energie este prea
mare pentru a fi preluati la nivelul 1 si preda apoi electronii CoQ.

Complexul III = complexul citocromilor b-c1

- este cel ma bine cunoscut si opereaza ca dimer

- contine mai multe subunitati proteice, dintre care 1 autonoma, contine un
centru Fe-S, 3 centre hemice
- preia electronii de la ubiquinona, le reduce energia in cateva trepte si ii
transfera pe citocromul c
- energia preluata de la electronii transferati este folosita pentru pomparea
de protoni din matrice in compartimentul extern
Complexul 4 = complexul citocromilor a-a3 = complexul citocrom-oxidazei

- este ultimul complex al LR

- prezinta:
 3 subunitati proteice autonome ce formeaza nucleul functional al
complexului
 2 centre hemice
 2 centre cuprice = situri oxido-reducatoare
 opereaza ca dimer
- preia deci electronii de la citocromul c(prin unul din centrii Cu), ii saraceste
de energie(pompand pe baza energiei acumulate protoni), si ii insera pe
oxigen, cu formare de apa
- structureaza 2 canale transmembranare prin care sunt pompati acesti
protoni(1 proton pompat/fiecare electron transportat): canale D, respectiv
K - intrucat la nivelul lor sunt conservati un rest aspartat, respectiv de lizina.
In zona mediana transmembranara a canalului D se afla un rest glumatat,
cu rol esential in pomparea protonilor.

Evident, toate cele 3 complexe ale lantului transportor de electroni si care

conserva energia preluata de la electroni prin pomparea de protoni( este vorba de
complexele I, III, IV) sunt transmembranare. Altfel, nu ar fi posibila operarea lor
ca pompe protonice.

Complexul V = ATP sintaza

- pozitionare transmembranara si foloseste gradientul protonic creat de LR,

disipandu-l pentru a lega o grupare fosfat la ADP
- actioneaza ca o turbina , actiunea sa fiind reversibila, el putand hidroliza
ATP si pompa protoni, in cazul in care gradientul se inverseaza (de unde si
denumirea alternativa de F1F0ATP-aza)
- are arhitectura asemanatoare unui bat de toba, cu 3 parti componente:
cap, gat trunchi. Capul este sferic, voluminos, orientat spre matricea
mitocondriala, iar trunchiul este constituit din portiunea transmembranara
a complexului, gatul facand legatura intre cele doua parti.
Trunchi = componenta F0, componenta transmembranara

Cap si gat = componenta F1, componenta catalitica.

- are 16 proteine, din care 2 autonome

- capul si gatul sunt formate din 5 subunitati notate simbolic α, β, Ƴ, sigma,
epsilon in raport stoechiometric 3:3:1:1:1 . Capul e alcatuit din 3 dimeri α-β
- componenta transmembranara, F0, structureaza un canal protonic prin
care este disipat gradientul realizat de LR. Fluxul protonic prin acest canal
reprezinta forta motrice pentru producerea ATP din ADP si fosfat
- structura globulara a capului se roteste in raport cu portiunea
transmembranara, rotirea implicand 3 pasi a cate 120 de grade. In timpul
acestei rotiri, cei 3 heterodimeri αβ, care formeaza 3 situri active ale
componentei catalitice, trec succesiv prin 3 stari diferite: deschisa, laxa si
stransa, corespunzand astfel:
1. Starea deschisa = lipsa nucleotidului si fosfatului in siturile de legare
2. Starea laxa: legarea ADP-ului si fosfatului
3. Starea stransa: legarea ATP-ului

Se pare ca in aceste stari se consuma energie doar pentru ocuparea siturilor

cu ADP si fosfat respectiv pentru eliberarea de ATP, nu si pentru formarea
implicita a acestuia <=> legarea fosfatului la ADP.

Transportul metabolitilor

Piruvatul si fosfatul sunt preluate din citosol->matrice prin transportori

simport si este necesara disiparea gradientul protonic. Deci, gradientul protonic
format prin actiunea complexelor proteice ale LR de electroni nu este folosit
exclusiv pentru producerea de ATP, ci si pentru transportul unor metaboliti.

Alti 2 metabolitici energetici esentiali sunt ADP si ATP-ul. ADP-ul este

transportat prin membrana -> matrice, iar ATP-ul catre citosol, cei 2 fiind
transportati la schimb, deci, printr-un transportor antiport. Prin intrarea unei
molecule de ADP si iesirea uneia de ATP se introduc in matrice 3 sarcini negative
si sunt expulzate 4 => potentialul membranar este redus.
 O explicatie pentru organizarea membranei mitocondriale interne sub
forma de criste este faptul ca sporeste considerabil suprafata => mareste
functionalitatea ei, fiind posibile mai multe procese simultan pentru acelasi volum
al organitului.
 Subiectul 95
Organizarea moleculară şi funcţiile membranei mitocondriale externe şi a
spaţiului intermembranar

Membrana mitocondriala externa este organizata conform modelului

mozaic fluid, ea avand un raport lipide/proteine corespunzator celui general
valabil.

1. Permeabilitate generoasa, datorita prezentei porinelor, care permit

schimbul nerestrictionat al moleculelor de pana la 5000 daltoni intre
citosol si compartimentul mitocondrial extern.
2. Preluarea de AG din citosol. Acest lucru se realizeaza prin preluarea AG
de pe transportorii lor proteici din citosol = proteine care leaga AG =
FABP = Fatty Acid Binding Protein.

AG sunt esterificati la acil-CoA, prin actiunea acil-CoA sintazei. Acil-CoA

este translocata in versantul intermembranar, unde este transformata sub
actiunea carnitin-acil-transferazei I in acilcarnitina.

Acil-carnitina este preluata de membrana mitocondriala interna, pentru a o

transloca in matricea mitocondriala.

3. Dezaminare oxidativa a aminelor biogene, lucru realizat prin actiunea

monoamin-oxidazei = enzima marker pentru mb mitocondriala externa.

Acest lucru inseamna ca ea se intalneste in celula numai la nivelul acestei

membrane si poate fi folosita pentru aprecierea gradului de puritate al
preparatelor de membrana mitocondriala externa.

Prin actiunea monoamin-oxidazei sunt inactivate epinefrina, norepinefrina,

dopamina, serotonina etc. Produsii de dezaminare sunt apoi metabolizati la
compusi care sunt excretati prin urina.
Spatiul intermembranar

Compartimentul mitocondrial extern poate fi considerat ca un

compartiment tampon intre citosol si mitoplast. La nivelul acestuia se creeaza
practic un microclimat adecvat functionarii optime a mitoplastului.

Intuim ca la nivelul compartimentului intermembranar nu exista diferente

de concentratie fata de citosol in privinta moleculelor de pana la 5000 de daltoni
(datorita porinelor, ce permit traficul lor practic nerestrictionat), respectiv pentru
ionii anorganici aflati liberi in citosol.

La nivelul acestui compartiment mitocondrial se gasesc enzime care

pregatesc o serie de metaboliti energetici esentiali functionarii mitocondriei:

 adenilatkinazei, care transfera un rest fosfat de pe ATP pe AMP,

conform reactiei:

ATP+AMP=2ADP

Deci se consuma o molecula de produs finit al functiei mitocondriale = ATP,

pentru crearea a 2 molecule de substrat, adica se creeaza premizele obtinerii a 2
molecule de ATP, prin consumul uneia singure

 nucleozid-fosfokinaze : transforma nucleozidele in nucleotide, creand

premizele obtinerii unei diversitati de compusi macroergici.
 Subiectul 96
Organizarea moleculară şi funcţiile matricei mitocondriale

Matricea mitocondriala contine: componente necesare replicarii,

transcrierii si traducerii informatiei continute de propriul ADN, ADN proporiu,
ribozomi, enzime necesare β-oxidarii AG, enzime care opereaza in ciclul acizilor
tricarboxilici (fara succinat dehidrogenaza).

1. La nivelul matricei mitocondriale se gasesc componentele necesare

replicarii, transcrierii si traducerii informatiei continute de propriul ADN si
biosintetizeaza doar maximum 1% din proteinele necesare functionarii
mitocondriei, restul fiind codificate de ADN-ul nuclear, sintetizate in citosol
si importate de mitocondrie.
Ribozomii din matricea mitocondriala au structura si caracteristicile
ribosomilor procariotici, deosebindu-se astfel de ribozomii din citosolul
celulei. Enzimele necesare procesarii ADN sunt asemanatoare celor din
procariote.
2. Bagajele enzimatice necesare β-oxidarii AG stau la baza producerii de
acetil-CoA, materia prima pentru alta secventa de reactii importante in
realizarea functiei de baza a mitocondriei. Aceste reactii constituie ceea ce
este cunoscut sub numele de ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul acidului
citric/ciclul Krebs).
Enzimele care opereaza in CAT sunt localizate in matricea
mitocondriala, cu exceptia succinat dehidrogenazei ce face parte integranta
dintr-un complex proteic (complexul II) apartinand membranei
mitocondriale interne.
Ciclul Krebs foloseste acetil-CoA rezultata atat din β-oxidarea AG, cat
si din prelucrarea oxidativa a piruvatului importat din citosol. In cadrul
procesului se reduc 3 molecule de NAD+ si una de FAD, cu producerea
NADH, respectiv FADH2, care reprezinta donorii de electroni pentru lantul
transportor de electroni, parte integranta a procesului de fosforilare
oxidativa ce are loc la nivelul membranei mitocondriale interne.

Pe scurt: din β-oxidarea AG si prelucrarea oxidativa a piruvatului

importat din citosol => acetil-Co-A -->intra in CAT = reducerea a 3 molecule
NAD+ si una de FAD cu producere de NADH si FADH2 -> ULTIMELE 2
TRANSPORTA ELECTRONI FOLOSITI IN FOSFORILAREA OXIDATIVA
 Subiectul 97
Biogeneza versus originea mitocondriilor, teoria endosimbiotică

Teoria endosimbiotica reprezinta un model privind originea mitocondriei

care in momentul de fata este unanim recunoscut.

Teoria a fost emisa de mai bine de un secol de insusi Richard Altmann si

presupune ca acum milioane de ani, cand atmosfera terestra isi modifica
proprietatile fizico-chimice, imbogatindu-se in oxigen, o celula aeroba a fost
endocitata de o alta anaeroba, produsul acestei endocitozei castigand o mai buna
capacitate de acomodare la noile conditii. Rezultatul a fost supravietuirea prin
simbioza.

In favoarea acestei teorii se pronunta urmatoarele realitatii biologice:

1. Prezenta cardiolipinei, fosfolipid abundent in membranele bacteriilor, in

membrana mitocondriala interna
2. Prezenta porinelor in membrana mitocondriala externa (porinele au fost
pentru prima data evidentiate in peretele unor bacterii)
3. Existenta ADN-ului propriu, circular (fara capete libere) asa cum este ADN-
ul procariotelor
4. Caracteristicile ribozomilor din matricea mitocondriala: 70S (ca si ribosomii
procariotelor)
5. Sinteza proteica sensibila la cloramfenicol (ca cea din procariote)
insensibila la cicloheximida (blocheaza sinteza proteica pe
ribozomii din citosolul eucariotelor)
6. ARN-polimeraza sensibila la rimfamicina (ca la procariote)
7. Capacitatea proprie de a se divide
 Subiectul 98
Rolul mitocondriilor în distribuţia intracelulară a ionilor de calciu, în producerea
de specii reactive de oxigen şi în apoptoză

Desi este stabilita implicarea mitocondriei in procesele apoptotice,

mecanismele prin care aceasta controleaza apoptoza nu sunt inca pe deplin
elucidate. Ceea ce se cunoaste cu certitudine sunt fapte care evidentiaza
participarea mitocondriei la procesele apoptotice prin participarea pe calea
cascadei caspazelor.

Initial, s-a considerat ca mitocondriile raman neschimbate in timpul

apoptozei, dar s-a observat ca sufera modificari morfologice in apoptoza:

 reducerea dimensiunilor
 sporirea densitatii matricei = picnoza mitocondriala

Aceste condensari sunt evenimente timpurii in apoptoza. Mai mult, in

apoptoza indusa prin deprivarea de factor de creste neurala NGF, la neuronii
simpatici, picnoza mitocondriala este reversibila.

Daca in celulele normale mitocondriile sunt dispersate in toata celula, in

celulele apoptotice ele se redistribuie, aglomerandu-se perinuclear. Se pare ca
acest lucru se datoreaza defectelor din relatia lor cu kinezinele, ce le permit
dispersarea in citoplasma pe baza unui transport dependent de organizarea
microtubulilor.

Totusi, apar si modificari mitocondriale la nivel molecular si biochimic.

Rezultatul: dezorganizarea membranelor mitocondriale cu eliberarea in citosol de
componente intramitocondriale:

- citocrom c
- endonucleaze G
- AIF - Apoptosis-Inducing-Factor
 In general, prezenta citocromului c in citosol este un semnal de evolutie
apoptotica a celulei.

Citocromul c se leaga de un factor de activare al apoptozei = APAF 1

(apoptotic protease activating factor) => un oligomer cu structura simetrica in
spite de roata, continand 7 complexe APAF1-citocrom c = apoptozom

- butucul central e format prin unirea capetelor NH2-terminale ale

molecule de APAF-1 si leaga procaspaza 9 prin domeniile CARD(Caspase
Recruitment Domain) ale celor 2 tipuri de proteine => ii determina activarea si
autoliza => lizeaza procaspaza 3, activand-o si declansand apoptoza.

- spitele sunt formate din restul lantului polipeptidic

Modificarea echilibrului intre factorii pro- si anti-apoptotici din familia

proteinelor BLC-2 determina eliberarea citocromului c. Raportul intre factorii anti-
apoptotici si cei pro-apoptotici este cel care are efect asupra membranelor
mitocondriale. Cresterea expresiei factorilor pro-apoptotici are ca rezultat
permeabilizarea membranelor mitocondriale, cu eliberarea citocromului c si sunt
considerate 3 cai:

1. Capacitatea factorilor pro-apoptotici de a oligomeriza reprezinta de

fapt un mecanism prin care pot structura megacanale

Capacitatea de oligomerizare este datorata prezentei in aceste proteine a

unor domenii BH. Exista 4 domenii BH, factorii anti-apoptotici le contin pe toate
cele 4, iar cei pro-apoptotici sunt fie lipsiti complet de domeniul BH4, fie prezinta
ample modificari la nivelul acestuia.

2. Capacitatea factorilor pro-apoptotici de a altera stabilitatea planara a

bistratelor fosfolipidice

Prin reducerea tensiunii planare a bistratului lipidic, factorii pro-apoptotici

ar putea induce formarea de intreruperi in continuitatea bistratului lipidic sub
forma unor pori sau ar putea organiza complexe lipide-proteine cu deschideri
suficient de largi in structura membranei, care sa permita proteinelor din
compartimentul mitocondrial extern sa difuzeze in citosol, intr-o gama foarte
mare de gabarite moleculare

3. Capacitatea factorilor pro-apoptotici de a modifica permeabilitatea

porinelor din membrana mitocondriala externa

Cand lipozomi cu porine au fost incubati cu BAK/BAX, a fost indusa

deschiderea porilor. Prin porii astfel deschisi, citocromul c, marcat cu fluoresceina,
a trecut nestingherit.

Prin contrast, in experimente similare conduse cu folosire de factori anti-

apoptotici, a fost inregistrata inchiderea porilor.

Ramane de vazut care dintre acestei cai va fi confirmata, sau poate daca
realitatea biologica implica o cale ce combina toate aceste directii pe criterii
dependente de anumite conditii in care procesul apoptotic se poate desfasura.

Cele trei posibile cai descrise fac parte din teoria structurarii de canale in
membrana mitocondriala externa, pentru explicarea pierderilor de componente
intermembranare.

Exista si o a doua teorie, teoria ruperii membranei externe, care stipuleaza

ca pierderile s-ar datora umflarii mitocondriei, cu destinderea membranei interne
si fragmentarea celei externe, insa exista un puternic contra-argument: procesul
apoptotic decurge cu consum energetic, care necesita functionalitatea
mitocondriei.
 Subiectul 99
Nucleul celular: definiţie, aspect la MO si ME

Nucleul sau carion este cel mai reprezentativ si cel mai mare organit al
celulei (6-10% din volumul celulei), cu excepţia hematiei adulte, corneocitelor şi
celulelor fibre adulte din cristalin. Este prezent doar in celulele eucariote, este
delimitat de invelisul nuclear si este neparmanent (prezent doar in interfaza).

Are roluri in:

- protejarea informatiei genetice

- este sediul autoreplicarii ADN si transmiterii mesajului genetic
- controlul post-transcriptional

MO (structura)

 cu coloranti bazici (ex: HE) => coloratie violet => nucleul este BAZOFIL
 in coloratia Azan => nucleu rosu
 componente care pot aparea la MO :
- invelis nuclear - la periferie (nu se observa in MO)
- cromatina - bazofila - se observa sub forma de granule, filamente sau
blocuri
- unul sau mai multi nucleoli - se observa mai intens colorati decat
nucleul
- cariolimfa = lichidul nuclear format in mare parte din proteine

Nucleii eucromatici (cromatina activa functional) au aspect veziculos,

prezinta granulatii fine si in general au aspect granular sau fibrilar. Eucromatina
apare palid colorata si contine ADN care poate fi pus in evident prin urmatoarele
metode:

 coloratia Feulgen=> ADN-ul apare colorat rosu-violet

 coloratia MGP (methyl-green pyronin) = reactive Brachet => ADN-ul
apare verde-albastrui, ARN-ul apare rosu
  in microscopia de fluorescenta, cu DAPI => nucleul are fluorescenta
albastra

Nucleii tahicromatici (cromatina inactiva functional) sunt intens bazofili.

Heterocromatina apare intens colorata.

ME(ultrastructura)

1. Invelis nuclear:
- prezent doar in interfaza si este alcatuit din membrana invelisului
nuclear, ce prezinta membrana nucleara interna si membrana
nucleara externa, si din cisterna perinucleara
- membrana externa se continua cu cisterne RER si poate prezenta
ribozomi atasati. Enzime: G6P-aza
- membrana interna este in raport cu o structura fibrilara densa =
lamina nucleara
- por nuclear - eucromatina sparge heterocromatina periferica,
atingand mb nucleara
2. Cromatina:
- poate fi eucromatina, electronoclara, functional activa
- heterocromatina, electronodensa, inactiva functional
3. Matrice nucleara
4. Nucleolul:
- zona electronodensa, neregulata, cu structura fibrilogranulara
 Subiectul 100
Invelişul nuclear: definiţie, organizare, ultrastructură

Invelisul nuclear = anvelopa nucleara, este un complex membranar

caracteristic celulelor eucariote si delimiteaza doar in interfaza ciclului celular
continutul nuclear de citoplasma.

Prezenta invelisului nuclear si a nucleului reprezinta trasatura esentiala

morfologica ce deosebeste celula EK de celula PK si reprezinta un compartiment
subcelular separat in care isi are sediul ADN si in care se desfasoara
autoreplicarea si transcriptia. Prin urmare, invelisul nuclear asigura stabilitatea
genetica mai mare a EK in raport cu PK.

Invelisul nuclear contine:

1. membrana nucleara extern:

- in contact direct cu citoplasma
- pe ea se pot atasa ribozomi
- se continua cu RER
- enzima atasata: G6P-aza
2. spatiul perinuclear:
- spatiul ce separa cele doua membrane ale invelisului nuclear
- grosimea sa este de 200-300 A
- comunica cu lumenul RE
- nu este vid, aici putandu se stoca imunoglobuline si Ca 2+
3. membrana nucleara interna:
- cea care delimiteaza continutul nuclear
- ambele mb au o ultrastructura asemanatoare altor citomb =>
apar trilaminate la ME si au o grosime de cca 70-80 A
4. pori nucleari:
- discontinuitati ale spatiului perinuclear dat de fuzionarea celor 2
mb => mb nucleara externa are continuitate cu mb nucleara interna
 - rolul lor este esential in realizarea schimburilor nucleu-
citoplasma(mai ales ARNm)
- forma porilor variaza intre circular si poligonal
- nr porilor este proportional cu activitatea celulei: cu cat sinteza
de ARN este mai mare, cu atat celula respectiva va avea mai multi
pori
- in medie, porii ocupa 10-20% din invelisul nuclear
- diametrul porilor este de 10 mm in repaus si 25 mm in transport
- in ME, porii nucleari au caracteristic faptul ca se gasesc in zonele
unde eucromatina pare sa sparga heterocromatina periferica,
atingand membrana nucleara
5. lamina nucleara(lamina densa interna)
- se gaseste in raport cu membrana nucleara interna
- un strat electronodens anexat fetei nucleoplasmice a mb
nucleare interne
- o retea de natura proteica cu aspect fibros, ce formeaza suportul
structural al nucleului
- atasarea laminei de invelisul nuclear se realizeaza prin
intermediul unor proteine integrale din MNI si prin atasare de
complexele porilor nucleari
- interactioneaza direct si cu cromatina, functionand astfel ca
punte de legatura intre ADN si invelisul nuclear
- reteaua de filamente este alcatuita din proteine = lamine
nucleare, fiind o clasa speciala de proteine a filamentelor
intermediare.
- apare clar pe imaginile de ME dupa fixarea cu GLUTARALDEHIDA
- sunt 3 tipuri de lamine nucleare: A,B,C
- rol de suport pt membrana nucleara interna, cat si rol in cadrul
diviziunii celulare si anume in dezintegrarea membranei celulare: in
diviziune, laminele se fosforileaza si se dezasambleaza, doar cele de
tip B ramanand atasate de MNI, urmand ca, la sfarsitul telofazei, sa
se desfosforileze => reasamblarea laminei densa nucleare.
 Subiectul 101
Porul nuclear şi rolul său în transport

Porii nucleari sunt discontinuitati ale spatiului perinuclear dat de fuzionarea

celor 2 mb => mb nucleara externa are continuitate cu mb nucleara interna. Rolul
lor este esential in realizarea schimburilor nucleu-citoplasma, in primul rand
permitand trecerea ARNm din nucleu catre aceasta.

 are rol in reglarea schimbului bidimensional selectiv nucleu – citoplasma

 este o structura dinamica ce dispare si apare in functie de activitatea celulei
 o celula activa prezinta 3-4000 de pori

La ME, porul are aspectul unui poligon cu 8 laturi, organizat in jurul unui canal
central:

 3 inele proteice suprapuse = mase anulare (d=20nm):

- 8 citoplasmatice pe care se insera fibrile citoplasmatice cu capetele
libere si dispozitie parallela
- 8 nucleoplasmatice pe care se prind fibrile nucleoplasmatice cu
dispozitie convergenta (=>nu au capetele libere) unite prin inel
nucleoplasmic = cosulet
 complex anular radial: format dintr-o subunitate anulara si una luminala
 8 canale periferice
 complex central: contine o retea fibrilara prin care trec macromolecule in
tranzit, dar blocheaza difuzia pasiva a macromoleculelor de dimensiuni
mari

TRANSPORTUL PRIN COMPLEXUL POR

1. pasiv -> prin canalele periferice trec ioni (K⁺, Na⁺) si molecule mai mici de
60kDa (aa, nucleotide, oligozaharide)
2. activ -> necesita GTP-aze
- viteza este invers proportional cu masa moleculara
- se importa: proteine nucleare (cariofile), enzime necesare replicarii,
complexe ligand - receptor hormonal, factori de transcriere
- substantele importate au secventa semnal de adresare nucleara
(NLS, incarcata pozitiv si bogata in lizina si arginina)=> sunt
recunoscute in citoplasma de importina
- complexul format este legat de fibrilele citoplasmatice si transferat la
por
- se exporta, printr-un mecanism asemanator: ARNt, ARNm, ribozomi
(echivalent, sunt implicate NES si exportina)
 Subiectul 102
Importul nuclear

Pentru a iniția importul nuclear, majoritatea semnalelor de localizare

nucleară trebuie recunoscute de către cărăușii de import nuclear (importine).

Importinele sunt codificate de o familie de gene ale transportului nuclear.

Fiecare membru al familiei codifică o proteină transportor care este specializată
pentru transferul din citosol în nucleu a unui subset de proteine, care conțin
semnale de localizare nucleară.

Importinele sunt proteine citosolice solubile, care se leagă atât la SLN de pe

proteina care urmează să fie transportată cât și la proteinele NPC, dintre care
unele organizează fibrilele care se extind în citoplasmă. Aceste fibrile, precum și
multe dintre proteinele NPC din zona centrală a complexului, care contribuie la
bariera de difuzie, includ un număr mare de secvenţe repetitive cu fenilalanină și
glicină fiind, prin urmare, numite „FG repetitive”.

Secvențele FG repetitive servesc ca situri obligatorii de legare pentru

importine. Complexele importină-încărcătură se deplasează de-a lungul căii de
transport prin legare repetată, disociere și apoi re-legarea la următoarea secvență
FG. În acest fel, complexele sar de la o proteină a NPC la alta, pentru a traversa
interiorul încâlcit al complexului por.

Odată ajuns complexul în interiorul nucleului, importinele disociază de

încărcătura lor și se reîntorc singure în citoplasmă. Transportatorii nucleari de
import nu se leagă mereu direct de proteinele nucleare, ci pot avea nevoie de
proteine adiţionale, adaptoare.
 Subiectul 103
Exportul nuclear

Exportul din nucleu funcționează asemănător importului nuclear, doar că în

sens invers.

Exportul nuclear al moleculelor mari, cum ar fi subunitățile ribozomale și

ARN de diverse tipuri, are loc prin NPC și depinde, de asemenea, de un sistem de
transport selectiv.

Sistemul de transport se bazează pe semnale de export nuclear din

secvenţa proteinelor care urmează să fie exportate, precum și pe transportorii
complementari de export nuclear (exportine). Acești cărăuși se leagă atât de
semnalul de export, cât și de proteinele NPC, pentru a ghida încărcătura către
citosol.

Mulți transportori de export nuclear sunt înrudiţi structural cu importinele,

fiind codificați de membri ai aceleiași familii de gene de transport nuclear.
 Subiectul 104
Nucleolul: rol, compoziţie biochimică şi organizare, evidenţiere la MO,
ultrastructură

Nucleolul este un corpuscul intranuclear, interfazic, vital.

ROL:

- biogeneza ribozomilor
- controlul ciclului celular si al diviziunii celulare
- pregatirea mitozei
- in transferul ARNm SI ARNt in citoplasma- nucleolul reprezinta o statie
intermediara pentru ARNm si ARNt in drumul lor catre citoplasma
- in absenta nucleolului, nu se sintetizeaza proteine si celula nu se divide; de
asemenea, nu se formeaza ribozomi => ARNm si ARNt nu trec din nucleu in
citoplasma, fiind blocata sinteza proteica

DIMENSIUNI:

- 0,5 - 2microni (dimensiuni mari in celulele cu nucleu voluminous si sinteza

proteica intensa)

FORMA:

- rotund-oval
- !!! nu prezinta invelis

LOCALIZARE:

- este pozitionat central sau excentric, in functie de destinatia functionala

NUMAR:

- in medie, exista 2 nucleoli/nucleu, pentru a putea fi transmis 1/set haploid

- numarul variaza intre 1 si 10
 - !!! este prezent in toate celulele, insa frecvent nu este observat din cauza
faptului ca planul de sectiune nu il cuprinde

COMPOZITIE CHIMICA:

- ADN, ARN si proteine, care se gasesc, in functie de tipul celular si de

momentul functional, in proportii aproximative:
 ARN nucleolar-reprezentat de diferite stadii de maturare ale
ARNr ( ribozomal) 7%
 ADN nucleolar 3%
 proteine histonice(bazice) si non histonice(acide) 90%
 mici cantitati de Ca,Mg,Zn

MO(structura):

 HE => corpuscul bazofil

 coloratie Feulgen => individualizarea unui corpuscul cromatinian
(ADN colorat in rosu) atasat nucleolului = cromatina asociata
nucleolului

ME(ultrastructura):

- se observa o zonă electronodensă, neregulată, cu structură fibrilogranulară

- ultrastructural are 4 componente:
1. pars fibrosa = retea filamentara de ARN
2. pars granulosa = granule formate din preribozomi
3. pars cromosoma = fibre de ADN
4. pars amorpha = proteine omogene

Mai actual: - zona densa fibrilara, aflata in jurul centrului fibrilar, contine proteine
implicate in clivajul preARNr si asamblarea post-transcriere a preribozomilor

- zona granulara

- centru fibrilar (NOR) ce prezinta ARNpolimeraze I si II, factori de

transcriere si nucleolina (naveta nucleu - citoplasma)
 Subiectul 108
Cromatina: definiţie, clasificare, împachetare

Cromatina este complexul format de ADN cu proteine histonice şi

nonhistonice. Este forma de existenta a materialului genetic in interfaza. In timpul
diviziunii se condenseaza si se structureaza in formatiuni numite cromozomi.

Cromatina si spatiile intercromatiniene alcatuiesc impreuna nucleoplasma.

Cromatina contine:

- 30% ADN
- 40% proteine histonice
- 25% proteine nonhistonice
- 5% ARN

Clasificarea cromatinei:

 Eucromatina - aspect electronoclar la ME/ palid colorata in MO,

- reprezinta de fapt niste cromozomi decondensati
- prezinta fibre cromatidiene nespiralizate / despiralizate
=> este activa genetic, ADN-ul component fiind fie in
curs de replicare, fie in curs de transcriere
 Heterocromatina - aspect electronodens la ME/intens colorata la MO
- reprezinta de fapt niste segmente unde
cromozomii raman condensati, ADN-ul de aici fiind
in stare inactiva, deci nefiind implicat in replicare/
transcriptie
o Constitutiva
o Facultativa
 Subiectul 109
Fibra de cromatină. Histone, caractere generale, roluri

Molecula de ADN desfasurata are 2 m. Pentru a putea fi cuprinsa in spatiul

nuclear, molecula sufera procese de impachetare + compactare + plicaturare.

Filamentul de ADN are o grosime de 2nm.

TEORIA UNINEMEI: intr-un cromozom exista o singura molecula de ADN

Deci, impachetarea ADN in cromozom presupune o micsorare de 10.000 de

ori a lungimii sale. Pentru a se impacheta convenabil, ADN are nevoie de niste
proteine bazice, cu masa moleculara mica = histone. Histonele interactioneaza cu
anionii fosfat din catenele ADN, formand nucleozomii.

1. Filamentul dublu catenar de ADN (d=2nm)

2. NUCLEOZOM => fibra nucleozomala (d=10nm):
- alcatuit dintr-un miez octameric = miezul nucleozomului, format din
4 perechi de proteine histonice (H2A, H2B, H3, H4) si un segment de
ADN lung de 146 de perechi de baze care este infasurat de 1 tur si ¾
ori in jurul octamerului
- nucleozomul = unitatea de repetare, care va forma un lant cu aspect
de margele insirate pe ata
- constitutia acestui lant necesita ADN linker intre 2 nucleozomi si
histona H1
3. SOLENOID:
- reprezinta condensarea atei cu nucleozomi
- este o rasucire sub forma de solenoid a fibrei de cromatina
- sunt 6 nucleozomi/pas de spirala
- aceasta structura este stabilizata de histona H4
- se formeaza fibra de 30 nm
 4. BUCLA:
- fibra de 30 nm formeaza bucle (domenii) in jurul unui schelet proteic
=> fibra de 300 nm
- Buclele + scheletul proteic se plicatureaza din nou => fibra de 700 nm
din cromatida la inceputul profazei

Proteine histonice:

- sunt bazice
- sunt caracteristice numai eucariotelor
- sunt sintetizate in citoplasma si ajung in nucleu prin pori, prin transport
active
- in functie de continutul de Lys si Arg, exista 5 tipuri de histone:
 H1 (are specificitate de specie si are urmatoarele roluri: organizarea si
functionarea cromatinei, mentinerea stucturii cromatinei, inhibarea
trasncrierii genelor, spiralizarea cromozomilor)
 H2A
 H2B
 H3
 H4 (nu au specificitate de specie si au rol in formarea nucleozomilor)
- se leaga de gruparile fosfat din ADN

Proteine nonhistonice:

- sunt acide
- sunt sintetizate in citoplasma
- se gasesc in nucleoplasma, nucleol si citoplasma
- au rol in reglarea activitatii genelor si in diferentierea genica
- exemple de non-histone: ADN polimeraza, ARN polimeraza, in principal
enzime ce intervin in acetilare, metilare, fosforilarea nucleoproteinelor
- au rol in replicare, recombinare, reparare ADN, transcriere ARNm,
impachetarea si mentinerea structurii cromozomilor