METODE DE LABORATOR

UTILIZATE IN
COMPARTIMENTUL DE
BIOCHIMIE CLINICA

Prof. Dr. Crăciun Alexandra

I. SPECTROFOTOMETRIA
II. ELECTROFOREZA
III. TURBIDIMETRIA/
NEFELOMETRIA
 I.
SPECTROFOTOMETRIA
 I. Spectrofotometria
Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu
măsurarea cantitativă a proprietăților de reflexie sau de transmisie
ale unui material (substanță dintr-o soluție) în funcție de lungimea de
undă cu care interacționează.

Energia luminoasă realizează modificări structurale ale substanțelor

chimice prin absorbirea unei anumite cantități de energie.

Metodele optice sunt folosite la determinarea structurii chimice, sau la

dozarea unor substanțe dintr-o soluție.
 Radiația electromagnetică

Lungime de undă ()

Termenul de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care
este utilizată radiația electromagnetică din spectrul:
ultraviolet (UV)
vizibil (VIS) - COLORIMETRIA
infraroșu (IR)
 Metode spectrofotometrice

 Absorbția luminii:
Totală: negru
Parțială: colorat
Nulă: alb

 Transmisia luminii:
Parțială: colorat și transparent
Totală: incolor și transparent
Spectrofotometrul
Componentele unui
spectrofotometru
Absorbanța luminii și culoarea soluțiilor

LUNGIMI DE UNDĂ CULOAREA CULOAREA

pentru absorbtia luminii ABSORBITĂ SOLUȚIEI
380-430 Violet Galben
430-475 Albastru Portocaliu
475-495 Albastru verzui Roșu-Portocaliu
495-505 Verde albăstriu Portocaliu-Roșu
505-555 Verde Roșu
555-575 Galben verzui Violet-Roșu
575-600 Galben Violet
600-650 Portocaliu Albastru
650-780 Roșu Verde
 Blankul

 Spectrofotometrele compară lumina transmisă prin probe

cu lumina transmisă prin blank.
 Cuva cu blank, are același conținut ca și cuva cu probă
cu excepția analitului de măsurat
 Determinarea colorimetrică

 Determinări cantitative ale unei substanțe

(analit) dintr-o soluție care, prin reacția cu
anumiți reactivi chimici, se transformă într-un
produs de reacție colorat.

 Intensitatea culorii este proporțională cu

cantitatea analitului prezent în soluție.
 Domeniul de linearitate

 = domeniul liniar- se referă la

domeniul concentrațiilor pentru care
metoda prezintă o proporționalitate
între concentrație și absorbanță.

 Dacă concentrația
analitului este prea mică
sau prea mare,
spectrofotometrul nu
poate citi absorbanța cu
exactitate.
 Metode de evaluare a reacțiilor chimice

 Punct final (Endpoint)

Analiți: Alb, Glu, Col, TG, TP, TBil/Dbil,
UA, Ca, MG, Fe, Hb, RF, CO2

 Cinetic (Kinetic)
Enzime: ALT, AST, ALP, CK,
AMY, LIP, GGT, LDH, …
 Forma curbei de reacţie
exemple: GLU, COL, TG, PROT, AC. Uric
ABS

Absorbanţa creşte,
după care atinge un
platou şi se
stabilizează

TIMP

Adăugare probă Adăugare reactiv

 Forma curbei de reacţie
exemplu: Fier seric
ABS După adăugarea R2,
absorbanţa se
schimbă aproape
instantaneu

Cu R1 absorbanţa
rămâne la un
anumit nivel

TIMP

Adăugare Adăugare Adăugare reactiv R2

probă reactiv R1
 Forma curbei de reacţie
exemple: BIL, HDL
ABS
După adăugarea R2,
absorbanţa creste şi
atinge un platou

Cu R1
absorbanţa
rămâne
neschimbată

TIMP

Adăugare Adăugare Adăugare reactiv R2

probă reactiv R1
 Ce se poate măsura?

1. Absorbanţa într-un singur punct (A)

2. Diferenţa de absorbanţă dintre 2 puncte (DA)

3. Rata de creştere/scadere a absorbanţei (DA/Dt)

 Măsurarea absorbanţei într-un singur punct
exemple: GLU, COL, TG, PROT

ABS A

Se citeşte
absorbanţa într-un
singur punct, la un
singur moment de
timp, de obicei
punctul final
(endpoint)

TIMP
Măsurarea diferenţei de absorbanţă dintre două puncte
exemplu: Fe

A doua măsurare
se face de obicei la
punctul final (A2)
ABS

A2

Se calculează
Prima măsurare se diferenţa:
face de obicei A = A2-A1
inainte de
adăugarea R2 (A1)

A,

TIMP
 Măsurarea ratei de creştere sau scădere a absorbanţei
exemple: ALP, AMYL, GGT, AST, ALT, CREA, UREE (teste cinetice)

ABS
Se fac măsurători într-un
interval dintre două
puncte, la scurt timp
după adăugarea
reactivilor
Se calculează
 tg() =At

TIMP
 Calibrarea

Prin calibrare, valorile măsurate (A, DA, sau DA/DT) se

corelează cu valori de concentraţie.

Se folosesc cel puţin 2 calibratori de concentraţii cunoscute.

De obicei, primul calibrator are concentraţia zero.
 C0 şi Ccal sunt cunoscute
A0 şi Acal se determină prin calibrare
Ax se măsoară

Relaţia dintre A şi C este o funcție liniară, deci poate fi caracterizată

prin ecuaţia unei drepte de forma y= ax+b

unde y - este valoarea măsurată Ax

x - este concentraţia, Cx
a - este factorul de pantă a dreptei
b - este valoarea A0 măsurată la conc zero C0
Un mod şi mai simplu de deducere a ecuaţiei de
calcul: pe baza similarităţii triunghiurilor

Absorbanţa, A, sau A/t măsurată

Acal

Ax

A0
C0 Cx Ccal CONCENTRAŢIA
SURSE DE INTERFERENŢĂ ÎN REACŢIILE
BIOCHIMICE
Interferenţă
 Surse de interferenţă

Exogene Endogene

Medicamente Lipemie

Aditivi Hemoliză

Efectul de matrice Bilirubinemie

Paraproteinemie
Surse exogene: Medicamente

 Medicamentele, fiind biologic

active, reacţionează cu componentele
reactivilor sau cu substanțele de
analizat.
Ex: acidul ascorbic – efect negativ
asupra determinării glucozei cu
glucozo-oxidaza

 Metaboliții medicamentelor, de
asemenea, provoacă interferențe,
fiind uneori chiar mai reactivi decât
compusul original.
 Surse exogene: Aditivi

Materialele adăugate la probă

ca anticoagulanţi, conservanţi
sau stabilizatori, pot interfera cu
determinarea multor analiţi.

Exemple:
– Fluorurile interferă cu determinarea multor enzime
– Agenţii chelatori interferă cu determinarea cationilor
de metal
 Surse exogene: efectul de matrice

MATR
IX
EFFEC
T
Efectul de matrice are importanţă foarte
mare pentru acurateţea rezultatelor!
Un studiu efectuat în 977 laboratoare, pe 37
sisteme specifice instrument/reactiv a arătat
că
cca. 70% dintre determinări au fost
influenţate de efectele de matrice.

Se poate demonstra o diferenţă semnificativă

(eroare sistematică proporţională) între
rezultatele obţinute din aceleaşi probe,
în urma calibrării
cu standard în soluţie apoasă
respectiv un calibrator pe bază de ser.
Surse endogene: lipemia

Particule lipidice circulante, respectiv VLDL și

chilomicronii, cauzează:
 turbiditate din cauza împrăştierii razelor de lumină

 schimbări ale volumului probei prin dislocarea

soluţiiei apoase.

Exemple:
 Efectul dispersiei luminii de către lipemie poate

interfera cu analizele de glucoză, bilirubină,

proteine ​totale, fosfor și acid uric. De asemenea,
dispersia luminii poate afecta profund testele
turbidimetrice nefelometrice.
 Alterarea volumului poate duce la rezultate fals

scăzute la determinarea natremiei.

Surse endogene: hemoliza

Hemoliza in vitro apare în timpul recoltării, transportului şi

manipulării probei:
Venostază; aspirare, ejectare sau agitare cu forţă
excesivă; păstrare prelungită a sângelui integral;
contaminare cu detergenti, apă sau alcool; încălzire sau
răcire excesivă; viteză excesivă la centrifugare

Interferenţe prin 3 mecanisme diferite:

Hemoglobina interferă cu determinarea
spectrofotometrică, datorită propriei sale culori – în acest
caz gradul de interferenţă depinde de lungimea de undă
folosită.
Hemoglobina sau celealte substanţe eliberate pot afecta
unele reacţii chimice (ex. diazotarea bilirubinei,
activitatea lipazei serice, activitatea creatinkinazei)
Componentele celulare eliberate se adaugă la substanţa
măsurată din ser, ducând la valori fals crescute ale LDH,
Mg, K.
Surse endogene: bilirubina

Mai multe mecanisme de acţiune:

 Prin abilitatea de a reacţiona cu componentele

reactivilor. (ex. influenţă negativă asupra
determinării creatininei, interferenţă cu metodele
care folosesc peroxidaza – Glucoză, Trigliceride,
Acid uric)

 Bilirubina pote afecta citirea spectrofotometrică

prin proprietăţile sale spectrale (absoarbanţă
puternică între 400-540 nm)
Surse endogene: paraproteinemia

Paraproteinele (cantităţi mari de

lanţuri de imunoglobuline în sânge)
apar în anumite boli (ex. mielom
multiplu) şi pot să mărească
viscozitatea sângelui ducând la
probleme în pipetarea exactă a
volumelor.

De asemenea, imunoglobulinele se pot

complexa cu unele enzime, prelungind
timpul de circulaţie a acestora în
sânge, şi ca urmare pot duce la valori
fals crescute în determinările de CK,
LDH, amilază.
 Interferenţe datorate limitelor detectorului

 Limitări ale instrumentului de măsurare

La absorbanţe mari ale probei, numai o cantitate din ce în ce mai mică de lumină
transmisă ajunge la detectorul spectrofotometrului, fiind mai dificilă detectarea
acesteia. Deci atunci când se măsoară nivelurile ridicate de analit, va exista o
eroare spectrofotometrică mai mare, în special la instrumentele cu sensibilitate
scăzută. Pentru a minimiza această eroare, se foloseşte un blank de probă și/sau
diluarea probei.

 Limitări datorate modului de calcul al absorbanţei

În spectrofotometrie, concentrația de cromogen și absorbanță sunt direct
proporționale una cu alta. Însă absorbanța este doar o valoare calculată, legată
logaritmic de procentul de lumină transmisă (T), cantitatea care se măsoară de fapt.
Ca urmare, la ambele capete ale scarei de absorbanţă, mici schimbări de procente
T vor avea ca rezultat schimbări disproporționat de mari în valoarea calculată a
absorbanţei, conducând la erori de analiză crescute.
Pentru a minimiza acest tip de eroare, trebuie să se asigure că măsurătorile se fac la
absorbanță între 0.1 și 1.1 ori de câte ori este posibil.
 Exemple pentru interferenţa medicamentelor
Medicamente care duc
Analit Medicamente care duc la valori crescute sau fals+ la valori scăzute sau
fals negative

Altopurinol, Azathioprine, Carbamazepine, Isoniazid

Cephaloridine, Chlorpropamide, Clindamycin, Oxalates, Phosphate,
Fosfatază
Erythromycin, Estrogens, Imipramine, Methyldopa, Propranolol,
alcalină
Nitrofurantoin. Novobiocin, Phenothiazines, Rifampin, Vitamin D
Sulfonamides, Tetracycline, Tolbutamide

Acetazolamide, AIIopurinol, PAS, Anabolic steroids

Amphotericine B, Ascorbic acid, Azathioprine,
Barbiturates, Caffeine,
Carbamazepine, Chloroquine, Chlorpropamide,
Citrate, Protein,
Clindamycin, Diazepam, Erythromycin, Ethambutol,
Salicylates (large
Bilirubină Flourazepam, Gentamicin, Imipramine, Indomethacin,
amounts),
Isoniazid, Levodopa, Menadione, Mercaptopurine,
Sodium chloride,
Methotrexate, Nitrofurans, Novobiocin, Primaquine,
Penicillin, Urea
Propylthiouracil, Pyrazinamide, Sulfonamides,
Tetracyclines, Tolbutamide
 Medicamente care duc la valori crescute sau fals Medicamente care duc la valori
Analit
+ scăzute sau fals negative

Acetone, Alkaline antacids, PAS, Amphotericin B,

Ascorbic acid, Bacitracin, Ethacrynic acid,
Furosemide, Gentamicin, Hydantoins, Indomethacin,
Chloramphenicol, Dextrose infusions,
Uree / BUN Kanamycin, Methicillin, Methyldopa, Mithramycin,
Phenothiazines
Nalidixic acid, Nitrofurantoin, Polymyxin B,
Propranolol, Salicylates, Sulfonamides, Tetracyclines,
Thiazide diuretics, Vancomycin
Acetazolamide, Aspirin,
Alkaline antacids, Estrogens, Potassium,
Corticosteroids, Gentamicin,
Calciu Proge~tins, Sodium, Thiazide diuretics,
Hepadn, insulin, Methicillin, Oxalate,
Urea, Vitamin D
Sulfadiazine
PAS, Ascorbic acid, Bile salts,
Aminopyrine, Anabolic agents, Aspirin,
Chlortetracycline,
Chlorpromazine, Clofibrate, Iodides,
Colesterol Colchicine, Estrogens, Glucose,
Penicillamine, Phenothiazines, Salicylates,
Heparin, Kanamycin, Nicotinic acid,
Thiouracil, Urea
Phenformin
Albumin, Amphotericin B, Ascorbic acid,
Creatinină Barbiturates, Clofibrate, Colistin, Glucose, Viomycin
 Medicamente care duc la
Medicamente care duc la valori crescute sau
Analit valori scăzute sau fals
fals pozitive
negative
Anabolic steroids, Clofibrate,
Acetaminophen, Acetazolamide, PAS, Caffeine, Cyproheptadine,
Diphenylhydantoin, Estrogens, Furosemide, Guanethidine, Isoniazid, MAO
Glucoză
Imipramine, Nalidixic acid, Nitrofurantoin, inhibitors,
Tetracycline, Thiabendazole Nitrazepam, Propranolol,
Reserpine
Dextran, Pyrazinamide,
Proteine totale Bilirubin, Clofibrate, Lipemia, Tolbutamide
Salicylates

Ampicillin, Ascorbic acid, Cephalothin, Chloroquine,

Clindamycin, Cloxacillin, Diphenylhydantoin,
Erythromycin, Ethambutol, Gentamicin,
GOT
Indomethacin, Isoniazid, Methotrexate, Nalidixic
acid, Nitrofurantoin, Propranolol, Suffamethazole,
Tetracycline, Tolbutamide

Cardiotonic glycosides, Clindamycin, Codeine,

Desipramine, Erythromycin, Ethionamide,
GPT Flurazeparn, Gentamicin, Indomethacin,
Isoniazid, Methyldopa, Morphine, Phenothiazines,
Propranolol, Pyrazinamide, Tetracycline
 Medicamente care duc
Medicamente care duc la valori crescute sau
Analit la valori scăzute sau
fals +
fals negative

Acetazolamide, Acetaminophen, Aminophylline,

Acetohexamide,
Ampicilin, Ascorbic acid, Aspirin, Coffee,
AIIopurinol,
Acid uric Ethambutol, Gentamicin, Levodopa,
Anticoagulants,
Mercaptopurine, Methicillin, Methotrexate,
Mannitol, Phynylbutazone
Penicillin, Pyrazinamide, Spiranolactone

Dichlorphenamide,
Sodiu Calcium, Copper, Iron, Methyldopa, Protein
Furosemide, Heparin

Acetazolamide,
Amiloride, Calcium, Cephaloridine, Copper, Amphotericin B,
Potasiu Iron, Isoniazid, Mannitol, Methicillin Carbanexolone,
Tetracyclines Furosemide, Polymyxin B,
Salicyiates,

Insulin, Phenothiazine,
Fosfor Methicillin, Tetracyclines
Promethazine
Bibliografie
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC3453568/pdf/
12291_2008_Article_BF02867865.pdf
INTERFERENCES IN CLINICAL CHEMISTRY
ANALYSIS
K. S. S. Saibaba, M. Vijaya Bhaskar et al. - Indian Journal of
Clinical Biochemistry, 1998, 13(2), 55-62

 http://www.westgard.com/lesson27.htm
INTERFERENCE AND RECOVERY EXPERIMENTS
II. ELECTROFOREZA
II. ELECTROFOREZA
Principiul metodei:

Migrarea diferenţiată a particulelor unui amestec (soluție, ser)

aplicat pe un suport semisolid (gel agaroză, acetat de
celuloză, hârtie), conectat la un câmp electric continuu.

Migrarea particulelor în câmpul electric depinde de sarcina

electrică a particulelor şi de masa lor moleculară (mărimea
particulei).
 Electroforeza

 Aplicații clinice
 proteine serice, urinare
 imunoglobuline
 hemoglobina
 izoenzime
 lipoproteine
 pH izoelectric

 pH – ul soluției de migrare joacă un rol important în preluarea sarcinilor

electrice. În cazul proteinelor, migrarea are lor în soluție tampon
alcalină, ce determină proteinelor o încărcare electronegativă.
 În migrarea particulelor spre polul pozitiv (anod), acestea se vor separa
în funcție de încărcarea lor electrică și mărimea lor.
 Migrarea unei particule se oprește în momentul când aceasta va atinge
punctul în care care sarcina ei globală este nulă, respectiv forma
amfionică (structuri chimice care, în cadrul aceleași molecule, conțin
ambele tipuri de sarcini și are sarcina totală=0)
 O proteină se află în formă amfionică la pH-ul său izoelectric.
 Prin electroforeza serului, în condiţiile amintite mai sus, se obţin cinci sau
șase fracţiuni: albumina, α1-, α2-, β- si γ- globuline

Varsta Albumina (%) Alfa 1(%) Alfa 2 (%) Beta (%) Gama (%) A/G

< 1 an 40-65 2-5 6.6-13.5 8.5-14 10-21 1.16-2.23

1 – 16 ani 50-65 2-5 6-15 8.5-15 10-22 1.06-2.48

> 16 ani 52 – 68 2-5 6,6-13,5 8,5 -14 11 – 21 1.39-2.23

Valori de referinta – sunt dependente de varstă

O proteină într-o soluţie care are un pH inferior punctului sau
izoelectric se va comporta ca o bază şi va accepta protonii H+.
Ea va deveni astfel încărcată pozitiv. În mediu acid:

O proteină într-o soluţie care are un pH superior punctului său

izoelectric se va comporta ca un acid şi va ceda protonii H+.
Ea va deveni astfel încărcată negativ. În mediu bazic:
Electroforegrama proteinelor serice =
Proteinograma


 Etapele electroforezei

– pregătirea probei
– pregătirea/tratarea suportului semisolid
– aplicare
– migrare
– colorare
– decolorare
– uscare
 Migrarea

 Toate proteinele au o sarcină electrică.

 Probele sunt plasate pe un suport special (de exemplu, un
gel, hârtie sau acetat de celuloză), pe care se aplică un
curent electric. Particulele de proteine vor migra în funcție
de puterea lor ionică formând benzi.
 Moleculele pozitive migrează spre un electrod negativ
(catod) și moleculele încărcate negativ migrează către un
electrod pozitiv (anod).
 Evaluarea se efectuează cu un instrument numit
densitometru ce măsoară/ evaluează aceste benzi.
 Reactivii necesari

1. Suportul
Alegerea suportului este in funcție de materialul supus separării
– hârtie: substanțe cu greutate moleculară mică (aminoacizi, peptide,
pirimidine și nucleotide)

– acetat de celuloză: în laboratoarele clinice

(proteine serice, hemoglobină, lipoproteine)

– gel de agaroză
 Reactivii necesari

2. Soluția tampon
 Tăria ionică a soluției tampon este factorul decisiv în
separarea ionică

 Când pH-ul tamponului este alcalin pH> 7 toate proteinele

cu sarcini negative migrează de la electrodul negativ
(catod) la electrodul pozitiv (anod)
 Reactivii necesari

2. Colorantul
 Este utilizat pentru vizualizarea moleculelor separate.
 Frecvent: – roșu Ponseau
–albastru de bromofenol
– albastru de metil timol
 Reactivii necesari

3. Decolorant
Conţine: acid citric 2,5%
Acționează doar pe zona unde nu s-au produs legături
chimice, decolorând restul foliei.

4. Transparentizant
transparentizează folia
 Aparate

 Sisteme manuale – toate etapele se executa manual

 Semiautomate – citirea se face separat (densitometru, scanner)

 Automate – toate etapele se efectuează automat
 Părțile componente

 cameră de migrare (electrozi de grafit, sau Pt)

 stabilizator de tensiune
 aplicator
 băi (colorare, decolorare, transparentizare)
 uscător
 cititor
 Tipărire curba Levey -Jennings
Acuratețe, precizie, deviație standard
III. TURBIDIMETRIA/
NEFELOMETRIA
 III. TURBIDIMETRIA
Turbiditatea este opacitatea sau lipsa de transparență a unei
soluții, provocată de particule foarte fine, care nu pot fi
observate cu ochiul liber și care, aflate în stare de suspensie în
lichid, difuzează și reflectă.
Prin turbidimetrie se înțeleg metode de măsurare a turbidității,
ca metodă de analiză pentru determinarea concentrației unui
component dintr-o soluție, prin adăugarea unui reactiv.
Măsurarea turbidității, numită turbidimetrie, este o metodă de
analiză ce constă în măsurarea concentrației unei emulsii,
comparându-i transparența cu un preparat etalon.
IV. Imunonefelometrie
Principiul metodei:
Nefelometria se bazează pe măsurarea
intensității luminoase difuzate printr-un mediu
neomogen.

Este o metodă de analiză folosită pentru

determinarea concentrației unui suspensii, utilizând
intensitatea opalescenței, cu ajutorul luminii difuzate
lateral de particulele aflate în suspensie.
 Efect Tyndall

 Efectul de difuzie laterală a luminii printr-o

suspensie se numește efect Tyndall. De
obicei intensitatea difuzată se percepe la un
unghi de 90 grade fata de intensitatea
luminii incidente. Raportul dintre Io si It este
efectul Tyndall, si are aplicabilitate in
determinarea suspensiilor mai diluate.

 Se măsoară intensitatea luminii difuzate

datorat particulelor insolubile, rezultate în
urma reacției dintre proteinele specifice
solubile din probă, cu antiserul specific
acestora.

 Intensitatea luminii este direct proporțională

cu concentrația proteinelor. Concentrațiile
sunt calculate în mod automat prin
interpolare la curba de calibrare existentă pe
cardul kitului sau de pe curba de calibrare.
Proteine speciale determinate prin turbidimetrie –
imunoturbidimetrie-nefelometrie

IgA IgM CER C3 KAP

Lant usor K

IgG ALB AT3 C4 LAM

HS CRP PAB ASO C1IN bCRP
breast cancer
prealbumiin C1 Inactivator
resistance protein

TRF CRP A1AT mALB

D-dimer A1 Antitrypsin U-microalbumin

APOA1 HPT APOB BMG

heptoglobin
RF B2 Microglobulin

HbA1c AG UsCRP

Acid Glycoprotein
Tehnologia Imunonefelometriei cu timp fixat

Curba Heidelberger:
Când cantitatea de anticorp este definită
și nu se schimbă pe parcurs, are loc
începerea reacției de precipitare prin
formarea de complexe imune de tip Ag-
Ac până la precipitarea completă.

La o cantitate în exces a antigenului se

modifică alura curbei. De obicei,
cantitatea de lumină împrăștiată este
proporțională cu cantitatea de precipitat
format.
 Imunonefelometria imbunătățită
cu particule latex

Această metodă utilizează particule (Ac legați pe suprafața unor bile de

polistiren/latex), crescând astfel semnificativ sensibilitatea față de testele
convenționale, și permițând determinarea proteinelor ce se află în
concentrație scăzută.