Tehnici Cromatografice

METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notie curs 13-14

Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 1

C13+C14

9 Tehnici cromatografice................................................................................................................................ 2
9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separrilor cromatografice....................................... 4
9.2 Constanta de distribuie, profilul izotermelor de distribuie n cromatografie............................................... 5
9.3 Distribuia benzilor cromatografice. Lrgirea benzilor cromatografice ........................................................ 6
9.4 Informaii ce se pot obine dintr-o cromatogram........................................................................................ 7
9.5 Overview pentru parametrii specifici separrilor cromatografici.................................................................. 9
9.6 Teorii n separrile cromatografice............................................................................................................ 13
9.6.1 Teoria talerelor ................................................................................................................................. 13
9.6.2 Teoria cinetic i variabile cinetice care afecteaz lrgirea benzilor............................................... 14
10 Cromatografia n strat subire (thin layer chromatography, TLC)....................................................... 16
10.1 Adorbeni folosii n TLC.................................................................................................................... 16
10.2 Mecanismul separrii ........................................................................................................................ 18
10.3 Cromatoplci pentru tehnica TLC i aplicarea probelor.................................................................... 20
10.4 Dezvoltarea cromatogramei i detecia (localizarea) analiilor pe cromatoplac.............................. 21
10.5 Caracteristici ale cromatoplcilor din TLC ........................................................................................ 22
10.5.1 Factorul de ratardare (retenie, R
f
) .......................................................................................... 22
10.5.2 Factorul de capacitate ............................................................................................................. 22
10.5.3 nlimea unui taler cromatografic ........................................................................................... 23
10.6 Aplicaii ale cromatografiei n strat subire ........................................................................................ 23
11 Tehnici cromatografice instrumentale ................................................................................................... 25
11.1 Cromatografia de lichide pe coloan instrumental.......................................................................... 25
11.1.1 Clasificare ...................................................................................................................................... 25
11.1.2 Aparatura utilizat n cromatografia de lichide............................................................................... 26
11.1.3 Faze mobile i staionare, polaritate .............................................................................................. 27
11.2 Cromatografia ionic (IC)...................................................................................................................... 28
11.2.1 Schimbtorii de ioni........................................................................................................................ 28
11.2.2 Precursori polimerici ai rinilor schimbtoare de ioni................................................................... 29
11.2.3 Mecanisme de separare................................................................................................................. 30
11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecie n cromatografia ionic............................................ 31
11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie.............................................................. 32
11.2.4.2 Supresorul electrochimic ...................................................................................................... 33
11.3 Cromatografia de gaze.......................................................................................................................... 35
11.3.1 Aspecte teoretice ........................................................................................................................... 35
11.3.2 Sistemul gaz cromatografic............................................................................................................ 36
11.3.3 Faza mobil folosit n cromatografia de gaz ................................................................................ 37
11.3.4 Faze staionare folosit n cromatografia de gaz........................................................................... 37
11.3.5 Detectori folosii n cromatografia de gaz....................................................................................... 39
11.3.6 Aplicaii ale cromatografiei de gaz ................................................................................................. 40




9 Tehnici cromatografice
Chimia reprezint instrumentul major folosit n investigarea sistemelor chimice. Prin mijloacele sale
va permite obinerea informaiilor referitoare la materie, incluznd compoziia, structura,
proprietile fizice i reactivitatea acesteia. Separarea amestecurilor (complexe) n componente
este aplicat n toate domeniile chimiei, precum i n tiinele nrudite cu aceasta. n prezent
tehnicile moderne de separare, cum ar fi cromatografia i electroforeza, sunt folosite n domenii n
care principalii compui studiai sunt de natur (bio)organic, cromatografia fiind folosit mai ales
n chimia organic, iar electroforeza n biochimie i biotehnologie. Separarea eficient a
compuilor chimici similari este posibil doar prin folosirea unor pai repetai de separare i care,
n acord cu distribuia lui Craig, sunt potrivii n termeni practici numai pentru etapele preparative.
Botanistul rus Mikhail Semanovich Tswett este considerat printele cromatografiei, prin
studiul fenomenului de absorbie n coloane cu umplutur, dezvoltat n jurul anilor 1900. La acea
perioad, folosind o coloan mpachetat, cercettorul a reuit s separe extracte din pigmenii
frunzelor, precum clorofila i xantofil spiriloxantina. ntr-o lucrare scris n limba rus, cercettorul
descrie paii experimentali parcuri la separarea carotenului (zon galben roie), a xantofilului
(zon galben) (carotinoida oxigenat la C
40
) i a clorofilului (zon verde) pe o coloan umplut cu
inulin (C
6
H
10
O
5
-H
2
O, o polizaharid solubil, alctuit din grupri fructoz, ce apare n diferite
plante ca rezerv de hran), folosind ligroin ca solvent (un amestec de hidrocarburi cu p.f. 70-120
C). Observarea unor zone colorate pe coloan l-a condus pe cercettorul rus la ideea de a
denumi tehnica dezvoltat prin cuvntul cromatografie (grecescul chroma pentru culoare i
graphein pentru scriere). n 1906, Tswett a prezentat o descriere amnunit a metodei
cromatografice dar ceea ce a uimit ulterior cercettorii din domeniul cromatografie a fost, n
special, contrastul ntre simplitatea aparaturii folosite i rezultatele obinute.
Un pas important ce a introdus cromatografia ntr-o perioad de dezvoltare extraordinar a fost
nregistrat n 1931 cnd Kuhn (laureat al premiului Nobel n 1938) i Lederer au separat n scop
preparativ carotenul din morcovi (morcovi roii) n dou hidrocarburi alfa i beta caroten (C
40
H
56
),
prin adsorbie pe o coloan umplut cu oxid de aluminiu. Aproape n aceeai perioad, Winterstein
a separat pe o coloan cu umplutur de CaCO
3
(cu diametru de 7 cm) dou xantofile, violaxantina
(pigment xantofilic de culoare portocalie care protejeaz plantele de eventualele distrugeri foto-
oxidative) i luteina (carotenoid natural cu aciune antioxidant).
n orice caz, istoric vorbind, evoluiile nregistrate n domeniul cromatografiei pot fi enumerate
dup cum urmeaz:
1903 Tswett: Fenomenul de adsorbie n coloan cu umplutur
1931 Kuhn, Lederer Winterstein: Primele separri semnificative din punct de vedere preparativ
1937 Tiselius: Electroforeza soluiilor libere ntr-un tub
1938 Izmailov, Shraibee: Cromatografia n strat subire (thin layer chromatography, TLC)
1941 Martin, Synge: Cromatografia de repartiie (liquid chromatography, LC)
1944 Cnodsen, Gordon, Martin: Cromatografia pe hrtie (planar chromatography, PC)



1948 Tiselius: Electroforeza
1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange chromatography, IEC)
1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)
1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (capilar gaz chromatography, CGC)
1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea
1966 Piel: Cromatografia de lichide de nalt performan (high performance (pressure) liquid
chromatography, HPLC)
1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography, SFC)
1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetic
Bazele teoretice riguroase i progresul nregistrat n domeniul electronicii au permis elaborarea
unor procedee de nalt performan n instalaii automate de reglare, msurare, nregistrare a
semnalelor i prelucrare a datelor iar n tehnica cromatografic, aceste evoluii au permis
ndeplinirea unei mai veche dorine a chimitilor analiti, aceea de a realiza un aparat care s
permit o programare n urma creia dup introducerea probei de analizat, aparatul s furnizeze
ntr-un timp foarte scurt rezultatul exact al ntregii analize.
Cromatografia include o variat i important grup de metode ce permit separarea unor
compui asemntori din amestecuri complexe. Cromatografia a evoluat progresiv de la o metoda
de separare i purificare de laborator la o tehnica de separare i analiza chimic cu o arie de
aplicare universal. Analiza chimic cromatografic este un domeniu recent al analizei
instrumentale care include metode de separare i analiz a componenilor unui amestec complex
dintr-o prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un
numr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre o faza staionar (aflat de obicei ntr-un tub
numit coloan) i o faza mobil care se deplaseaz prin golurile primei faze.
Principiul cromatografiei se bazeaz pe trecerea constituienilor de separat prin cele dou faze
nemiscibile, faza staionar i faza mobil. Pentru aceasta proba este dizolvat n faza mobil,
care poate fi un lichid, gaz sau faz supercritic, i ulterior transportat de-a lungul fazei staionare
care poate fi ntr-o coloan sau pe o suprafa solid.
Funcie de felul n care se dezvolt cromatograma se face distincie ntre cromatogramele
interne i cromatogramele externe. n cromatogramele interne diferii constitueni ai probei se
deplaseaz pe distane diferite n acelai interval de timp iar la sfritul separrii acetia nc se
afl n stratul de separare ceea ce nseamn c, de fapt, acetia sunt detectai direct n stratul de
separare. Acest tip de cromatografie este folosit n tehnicile planare precum cromatografia pe
hrtie i cromatografia n strat subire. n aceste situaii faza staionar este situat pe un suport
planar i faza mobil se deplaseaz de-a lungul fazei staionare prin fore capilare sau prin
influena gravitaiei. Cromatogramele externe se obin n cromatografia pe coloan. n acest caz
toi constituenii traverseaz aceeai rut prin stratul de separare i, datorit interaciilor specifice
cu faza staionar, apar la sfritul coloanei la timpi diferii.



Faza mobil, denumit i eluent, poate provoca migrarea cu viteze diferite a unui numr mare
de componeni ai unui amestec de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii poate
fi introdus sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a
probei (de exemplu o micro-sering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul
coloanei.
Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite.
Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar
(nu orice molecul poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta
provoac o aa-numit migrare difereniat cnd moleculele migreaz n grupuri, n fiecare grup
existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la
prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare)
dintre componenii ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din
coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau
cu concentraia soluiei de component n faza mobil. Dispozitivul sesizeaz trecerea fiecreia din
substanele ce formeaz iniial proba iar prin reprezentarea grafic a semnalului detectorului n
funcie de timp se va obine cromatograma.
9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separrilor cromatografice
n funcie de natura fazelor i a echilibrelor implicate la transferul solutului (analitului) ntre faze se
disting tipurile de cromatografie prezentate n Tabelul 9.1.
Tabelul 9.1: Clasificare funcie de natura fazelor implicate n procesele cromatografice.
Clasificare general Metoda specific Faza staionar Tipul de echilibru
Lichid-lichid sau partiie Lichid adsorbit pe un
solid
Partiie/repartiie/distribuie
ntre lichide nemiscibile
Faz cu lichid legat Specii organice legate la
o suprafa solid
ntre lichid i suprafaa
legat
Lichid solid sau
adsorbie
Solid Adsorbie
Schimb ionic Rini schimbtoare de
ioni
Schimb ionic
Cromatografia de
lichide (faza mobil
lichid)
Excluziunea mrimii Lichid n interstiiile unui
polimer solid
Gaz lichid Lichid adsorbit pe un
solid
ntre gaz i lichid
Faz cu gaz legat Specii organice legate la
o suprafa solid
ntre lichid i suprafaa
legat
Cromatografie de gaz
(faza mobil gaz)
Gaz solid Solid Adsorbie
Cromatografia cu fluide
supercritice
Specii organice legate la
o suprafa solid
ntre fluidul supercritic i
suprafaa legat



9.2 Constanta de distribuie, profilul izotermelor de distribuie n cromatografie
n separrile cromatografice sunt implicate faza staionar (f
S
), faza mobil (f
M
) sau eluent i solutul
(soluii) sau analiii dizolvai. Procesul de separare cromatografic n orice tehnic cromatografic
se realizeaz prin echilibre interfazice sucesive. Orice proces de separare cromatografic este
caracterizat de de o constant sau un coeficient de distribuie (partiie/repartiie) notat K
D
,
M S D
C C K =
unde C
S
si C
M
denot concentraiile solutului n faza staionar, respectiv, mobil. Valoarea
coeficientului de partiie nu poate fi dedus direct din cromatogram.
Adeseori constanta de distribuie este referit ca i izoterm de distribuie care caracterizeaz
echilibrele interfazice i arat modul n care variaz coeficientul global de distribuie (raportul
concentraiei solutului n cele dou faze) la echilibru. Idealitatea ntr-o separare cromatografic se
atribuie din izotermele de distribuie valabile. Izotermele de distribuie caracterizeaz procesul de
separare i descriu modul n care coeficientul de distribuie K
D
(C
S
/C
M
) variaz la echilibru. n
contextul prezentat, o izoterm este o funcie care raporteaz concentraiile unui sistem
multicomponent ntre dou faze la temperatur constant. Izotermele de distribuie pot fi liniare i
neliniare care la rndul lor pot fi concave i convexe.
Izotermele liniare
Dac distribuia solutului este determinat pe criterii statistice, atunci K
D
va avea intotdeauna
valoare unitar. Valoare unitar nseamn c fracia total a solutului n fiecare din faze va fi egal
cu fracia de volum a sistemului ocupat de acea faz. O astfel de izoterm poart numele de
izoterm liniar. Constanta de distribuie arat c exist proporionalitate ntre concentraiile
solutului n cele dou faze care are drept consecin faptul c va avea loc strbaterea coloanei cu
o vitez dependent de concentraie. Valoarea acestei constante va depinde doar de proprietile
substanei dizolvate i de cuplul de faze folosit. Izoterme liniare se ntlnesc n cromatografia de
repartiie i n unele situaii n cromatografia de adsorbie.
Izotermele neliniare
Exist situaii cnd coeficientul K
D
este diferit de valoarea 1. n cazul izotermelor neliniare
coeficientul de distribuie este influenat de concentraia solutului n faza mobil. Pentru sistemele
n care solutul are afinitate mare pentru faza staionar, K
D
poate avea valori mari, n timp ce
pentru sistemele n care solutul prefer faza mobil, K
D
ia valori foarte mici (ctre 0). Izotermele
neliniare se ntlnesc n primul rnd n cromatografia de adsorbie n faz lichid sau gazoas i n
cromatografia ionic. Izotermele liniare sau neliniare se reprezint grafic ca n Figura 9.1.

Concentratia in faza mobila
A
B
C

Figura 9.1: Tipuri de izoterme pentru distribuia unei
specii ntre dou faze.



Atunci cnd un analit este eluat din coloana cromatografic profilul concentraiei sale ca o
funcie de distana strbtut prin coloan se prezint ca n Figura 9.2. Picurile, de obicei, sunt
simetrice i urmeaz forma unei funcii de distribuie tip Gaussian. Izoterma de tip B e cunoscut
ca i izoterm codat iar cea de tip C ca izoterm frontal. Chiar i pentru un analit cu o
izoterm neliniar, profilul picului nu va fi deformat cu severitate, dac analitul a ptruns numai pe
o distan mic n coloan.
A B
Distanta Distanta
C
Distanta
Figura 9.2: Picuri
distorsionate. Profilul
concentraiei unui analit de-
a lungul coloanei funcie de
distana parcurs de la
intarea n coloan. A, profil
pentru K
D
constant. B, profil
pentru izoterma de tip B. C,
profil pentru izoterma de tip
C.
Poziia i forma izotermelor ofer indicaii asupra eficienei procesului de separare. Poziia
poate indica ordinea n care componenii se distribuie de-a lungul coloanei cromatografice sau o
prsesc. Izotermele ndeprtate dau indicaii asupra unei separri eficiente n timp ce izotermele
apropiate reflect o eventual suprapunere.
9.3 Distribuia benzilor cromatografice. Lrgirea benzilor cromatografice
Fenomenul de lire a picurilor este un proces inevitabil n cromatografie. Un astfel de fenomen
este de nedorit atunci cnd se are n vedere separarea unor picuri multiple. Picurile oblice sunt
nedorite de asemeni mai ales datorit faptului c picurile asimetrice sufer procesul de lrgire ntr-
un timp mai redus dect cele simetrice. Cu ct izoterma este mai convex (concav), cu att
efectul va fi mai pronunat i mai duntor. Examinarea picurilor dintr-o cromatogram reliefeaz
similariti cu o curb de distribuie Gaussian care se obine atunci cnd valorile replicate ale unei
msurtori sunt reprezentate ca o funcie de frecvena apariiei lor.
n separrile cromatografice o parte din moleculele analitului traverseaz rapid coloana datorit
includerii lor accidentale, pentru o perioad mai mare de timp, n faza mobil. Alte molecule pot
ntrzia deoarece sunt incorporate n faza staionar pentru o perioad de timp mai mare dect
valoarea medie. Consecina acestor procese individuale ntmpltoare o constituie apariia unei
distribuii simetrice a vitezelor n jurul valorilor medii, care reprezint comportamentul majoritii
moleculelor analitului. Lrgimea unei benzi crete la deplasarea prin coloan deoarece, pentru ca
dispersia s aib loc, este nevoie de mai mult timp. n aceste condiii, limea benzii este legat
direct de timpul de reziden n coloan i este invers raportat la viteza de deplasare a fazei
mobile.
Distribuia benzilor cromatografice se aseamn cu distribuia descris de o funcie din teoria
probabilitilor. De fapt, dup cum variaz n (crete), distribuia binomial tinde spre o distribuie
Gaussian ca cea prezentat n Figura 9.3.



C
max
w
1/2
2
0,607C
max
0,5C
max
w
Figura 9.3: Diverse metode de a determina
deviaia standard din curba Gaussiana:
w
1/2
=2,354; w=4.
n termeni care sunt apropriai operaiilor cromatografice, expresia Gaussian care coreleaz
concentraia i volumul picului este de forma:
( )
( )
=
2
V V 0,5
exp
2
1
C
E
2 1

unde V
E
este volumul de eluie al analitului i este dispersia picului. Determinarea dispersiei
picului reprezint o metod de determinare a numrului talerelor teoretice (N) dintr-o coloan sau
nlimea (H) echivalent unui taler teoretic (heigh equivalent to a theoretical plate - HETP).
Relaia de calcul a numrului talerelor este
2
E
V
N
=
HETP se calculeaz mprind lungimea coloanei la numrul de talere. O expresie alternativ
pentru H este dat de relaia
L
H
2
=
unde L este distana parcurs de un pic iar este deviaia standard a dispersiei picului n uniti de
lungime. Figura 9.3 prezint metode comune de a determina din distribuia Gaussian. n
termeni practici, n mod convenabil i probabil cel mai exact, este evaluat din W
1/2
care
reprezint limea la jumtatea nlimii picului (aplicarea tangentelor duse prin punctele de
inflexiune poate fi subiectiv uneori).
9.4 Informaii ce se pot obine dintr-o cromatogram
Detectorul transform diferena unei proprieti fizice dintre component i eluent n semnal electric
care este proporional cu concentraia componenilor din probe.



0
0
Timp
t
R
t
M
W
Figura 9.4: Profilul unei cromatograme obinut prin
reprezentarea grafic a dependenei semnalului
nregistrat funcie de timpul de nregistrare a
cromatogramei.
Numrul de picuri d informaii asupra numrului componenilor din amestec. Identificarea
componenilor se poate face n funcie de parametri de reinere (timp de reinere, t
R
, vitez de
eluie a anlitului, v).
Profilul picului cromatografic este caracterizat de parametri cantitativi i parametri calitativi.
Parametrii cantitativi includ nlimea picului (h) i aria picului cromatografic (A) iar parametrii
calitativi fac referire la timpii de retenie, volumele de retenie.
Timpul de retenie poate fi teoretic (t
R
= L/v unde L este lungimea coloanei i v este viteza de
eluie a unui component) i practic.
Timpul de retenie practic se estimeaz prin cronometrare (timpul scurs din momentul
introducerii probei n aparat pn n momentul apariiei picului corespunztor componenilor.
Timpul mort, t
M
, este timpul necesar eluentului sau unui component nereinut de faza staionar
s ajung la detector.
Timpul de reinere aparent t
R
reprezint timpul necesar componenilor s ajung la detector; se
msoar din momentul introducerii probei n aparat pn n momentul apariiei picului
cromatogramei. Depinde de condiiile de lucru.
Timpul de reinere corectat t
R
0
reprezint timpul de permanen al molecule de solut n coloana
cromatografic un parametru calitativ; n funcie de el se pot face identificri ale componenilor
din amestec prin compararea cu timpii de reinere ai unor standarde.
t
R
0
=t
R
- t
M

Ali parametri specifici separrilor cromatografice includ eficiena i selectivitatea coloanelor
cromatografice care se determin n funcie de:
N numrul talerelor teoretice
H - nlimea unui taler teoretic
factorul de selectivitate
Parametrii precum N i H se pot calcula din caracteristicile unui singur pic cromatografic.
Conceptele aferente parametrilor N i H sunt bine explicate i justificate dac n mod imaginar
coloana cromatografic se mparte ntr-un numr egal de segmente (talere teoretice conform
Figurii 9.5), n fiecare taler stabilindu-se un echilibru de distribuie interfazic.



L
H

Figura 9.5: Tratarea ipotetic a unei coloane.
Parametrii N i H sunt direct legai de eficiena coloanei i de selectivitatea umpluturii
acesteia.
Numrul de talere
Cu ct avem mai multe talere cu att vor avea loc mai multe echilibre de distribuie interfazic i
coloana va fi mai eficient
N = L/H
Numrul de talere se poate obine din profilul unui pic cromatografic. Picul se aseamn cu o
curb Gauss (a se vedea i Figura 9.3).
2
R
t
N
= sau
2
w
t
16 N
R
=
nlimea talerului teoretic
H are semnificaia unei lungimi din coloan, pe care se realizeaz echilibrul complet al
componenilor n cele dou faze. Este analog cu un taler de distilare fracionat.
N, H sunt mrimi caracteristice dispersiei zonelor cromatografice. O dispersie redus conduce
la picuri nguste (coloana este eficient), n timp ce o dispersie mare duce la picuri late (coloana
este ineficient).
Estimarea lui H se poate face din:
- teoria talerelor teoretice: H = L/N
- din teoria cinetic: u C
u
B
A H + + =
unde:
A, B, C constante
u viteza liniar de deplasare a fazei mobile sau eluentului
A contribuia difuziei turbulente
B contribuia difuziei moleculare longitudinale
C contribuia transferului de mas ntre faze
9.5 Overview pentru parametrii specifici separrilor cromatografici
Coeficientul de partiie
stationara faza mobila faza
A A



M
S
D
C
C
K =
unde: C
S
concentraia molar a analitului n faza staionar i C
M
concentraia analitului n faza
mobil. Ideal, coeficientul de partiie este constant peste un domeniu larg de concentraii (C
S
este
direct proporional cu C
M
). Cromatografia n care se aplic ecuaia anterioar poart numele de
cromatografie liniar.

Timpul de retenie
Timpul de retenie este parametrul calitativ care red timpul necesar dup efectuarea injeciei
pentru ca picul analitului s ajung la detector (t
R
). Adeseori proba sau faza mobil conin specii
care nu sunt reinute de coloan. Timpul mort (aferent noiunii de void volume) reprezint timpul
necesar speciilor nereinute de coloan s ajung la detector (t
M
). Analiii migreaz cu viteza liniar
medie v
R
t
L
v =
iar moleculele fazei mobile (analiii nereinui de coloan) se deplaseaz cu viteza liniar medie u
M
t
L
u =
n ambele expresii L denot lungimea coloanei.

Relaia de legtur ntre timpul de retenie i coeficienii de partiie
Pentru a raporta timpul de retenie al unei specii la coeficientul su de partiie se poate exprima
viteza de migrare ca o fracie din viteza fazei mobile
mobila faza in analit de petrecuta timp de fractia u v =
Aceast fracie, n orice caz, este egal cu numrul mediu de moli de analit n faz mobil, n orice
moment, raportat la numrul total de moli de analit din coloan
analit de totali moli
mobila faza in analit de moli
u v =
Numrul total de moli de analit n faza mobil este egal cu concentraia molar C
M
a analitului n
faza mobil nmulit cu volumul su, V
M
. Similar, numrul total de moli de analit n faza staionar
este egal cu concentraia molar C
S
a analitului n faza staionar nmulit cu volumul su, V
S
.
M S M M S S S S M M
M M
V / KV 1
1
u
V C / V C 1
1
u
V C V C
V C
u v
+
=
+
=
+
=

Factorul de capacitate. Viteza de migrare a solutului/analitului
Factorul de capacitate k
A
este un parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de
migrare a analiilor prin coloan. Funcie de tipul cromatografiei implicate, de adsorbie, de schimb
ionic, de excluziune steric, factorul a fost denumit coeficient de adsorbie, de distribuie ionic,



respectiv de difuziune. Pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate k
A
se definete prin
relaia:
M
S A '
A
V
V K
k =
unde K
A
reprezint coeficientul de partiie al speciei A. Substituind ecuaia anterioar n ecuaia
pentru v se obine
'
A
k 1
1
u v
+
=
'
A M R k 1
1
t
L
t
L
+
=
M
M R '
A
t
t t
k

=
Factorul de capacitate se poate estima din parametrii t
R
i t
M
care se deduc uor dintr-o
cromatogram. Un factor de capacitate mare indic o reinere mai puternic n coloan a unui
component. Factorii de capacitate ar trebui s fie cuprini ntre 1 i 5. Dac este <1 compuii se
elueaz mult prea repede i determinarea timpului de retenie cu acuratee este dificil. Dac este
cuprins ntre 20 i 30 timpii de retenie sunt mult prea mari.

Factorul de selectivitate. Viteze de migrare difereniate
Factorul de separare (selectivitate) pentru o anumit coloan de separare descrie diferenele ce
apar ntre vitezele de migrare specifice componenilor, fiind raportul dintre factorii de capacitate k
B

i k
A
,
ai componenilor B (eluie ndelungat, mai puternic reinut) i A (eluie rapid, foarte puin
reinut) aflai n amestec. Acest factor trebuie s fie ntotdeauna mai mare dect 1.
Factorul este definit prin raportul dintre coeficientul de partiie dintre componenta mai puternic
reinut (B) i coeficientul de partiie pentru specia mai puin reinut sau mai rapid eluat (A).
A
B
K
K
=
Se poate obine o relaie de legtur ntre factorii de selectivitate ai analiilor i factorii lor de
capacitate:
'
A
'
B
k
k
=
Se poate obine expresia care permite determinarea factorului de selectivitate dintr-o
cromatogram experimental
M R(A)
M R(B)
t t
t t
=

Rezoluia coloanelor



Obiectivul major al cromatografiei este acela de a separa analiii n benzi distincte (diferite).
Calitatea separrii depinde de extinderea cu care are lor deplasarea centrului benzii unui analit i
de gradul de dispesie al benzii. Rezoluia este termenul cel mai adesea utilizat pentru a descrie
calitatea separrii cromatografice. Rezoluia unei coloane furnizeaz o msur cantitativ a
capacitii sale de a separa doi analii. Prin msurarea volumelor picurilor de eluie (timpilor) i a
limii benzilor se pot calcula valori ce exprima n mod cantitativ gradul de rezoluie. Expresia
comun utilizat este:
( )
( )
2 1
R R
2 1
1 2
w w
t t 2
w w
V V 2
R
1 2
+
=
+
= sau
( ) ( ) [ ]
B A
A
R
B
R
B A B A
S
W W
t t 2
W W
Z 2
/2 W /2 W
Z
R
+
=
+
=
+
=
unde R este rezolutia, V
1
si V
2
sunt volumele de eluent folosite pentru eluia a doi analii adiaceni,
iar W
1
si W
2
sunt limile picurilor la baz, determinate prin trasarea tangentelor la punctele de
inflexiune ale picurilor (Figura 9.6) (Z = t
R2
t
R1
).
Rezoluia n separarea cromatografic este rezultatul a 2 efecte opuse: echilibru, sau efecte
termodinamice care cauzeaz deplasarea benzilor, i efecte cinetice care cauzeaz suprapunerea
benzilor. Optimizarea acestor efecte competitive este o art n cromatografie.

W
2
W
1
V
2
V
1

Figura 9.6: Rezoluia la separarea a doi analii printr-
o coloan cromatografic.
Semnificaia termenului R este ilustrat n Figura 9.7 care conine cromatograme pentru
speciile A i B pe coloane cu rezoluii diferite.

Figura 9.7: Separri la patru rezoluii diferite.



Din Figura 9.7 este evident c o rezoluie de 1,5 d o separare complet pentru doi
componeni (eventual doar 3% suprapunere pentru analiii separai), n timp ce o rezoluie de 0,75
d o rezolvare parial iar una de 0,5 conduce la fenomenul de anvelopare (o singur band
observabil). La o rezoluie de 1, zona A conine 4% din B i zona B conine o cantitate egal din
A. Rezoluia unei faze staionare date poate fi mbuntit prin lungirea unei coloane i implicit
prin creterea numrului de talere. O consecin a creterii numrului de talere o poate constitui n
schimb creterea timpului necesar separrii.
Cum ar trebui s funcioneze un cromatograf pentru a optimiza aceste efecte? Un bun punct de
plecare ar fi dac se pornete de la aspectele de echilibru ale fazei mobile, fazei stationare i
analitului. De exemplu, printr-o simpl schimbare n compoziia fazei mobile, se poate obine o
cretere semnificativ a rezoluiei.
Extinderea pn la care un analist poate interveni n controlul cinetic al rezoluiei depinde n
mare msura de ct de mult este implicat acesta n prepararea umpluturii coloanei cromatografice.
Productorul de coloane va avea grij n mod evident de mrimea particulelor din cadrul fazei
staionare i de modul n care acestea umplu coloana, permeabilitatea umpluturii cu afinitate la
elueni, i oricare alte probleme care ar influena eficiena coloanei. Chimistul analist va trebui de
obicei s accepte tipul de coloane care sunt disponibile.
9.6 Teorii n separrile cromatografice
Teoria cinetic a cromatografiei explic n termeni cantitativi forma picurilor cromatografice i
efectele unor variabile asupra formei acestora. Parametrii cantitativi care descriu eficiena coloanei
sunt nlimea talerului H i numrul talerelor teoretice, N. Cei 2 parametri sunt legai prin relaia:
H
L
N=
unde L este lungimea (n cm de obicei) umpluturii coloanei.
Eficiena coloanelor cromatografice crete odat cu creterea numrului talerelor i odat cu
scderea nlimii talerului. Eficiena, n termeni de numr de talere, poate varia de la cteva sute
la cteva sute de mii, n timp ce, nlimea unui taler poate varia de la cteva zeci la o mie m, sau
chiar dimensiuni mai mici.
9.6.1 Teoria talerelor
Teoria talerelor nu reprezint o teorie cromatografic propriu-zis, ea este mai mult o adaptare
analogic pentru procesul cromatografic. Iniial, teoria a fost dezvoltat de ctre Martin si Synge
care au observat legturile dintre comportamentul la eluia printr-o coloan obinuit n condiii de
neechilibru i o coloan ipotetic subdivizat ntr-un numr de nivele care opereaz n condiii de
echilibru. Se consider un sistem ca cel prezentat n Figura 9.8 care este format dintr-un numr de
celule unitare (talere) care conin faza mobil i faza staionar.



0 1 2 3 n
faza mobila
faza stationara
Figura 9.8: Unitate cromatografic teoretic.
Fiecare compartiment cuprinde fazele mobil i
staionar. n unitate este permis atingerea
echilibrului n fiecare compartiment, deplasarea
ctre dreapta a fazei mobile dintr-un
compartiment n altul, reechilibrare, o alta
deplasare dintr-un compartiment n altul i aa
mai departe. Procesul de echilibrare urmat de o
deplasare ctre dreapta poart numele de
transfer.
Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul crora coninutul fazei mobile
din talerul 0 este transferat n talerul 1, ulterior 2, n timp ce coninutul corespunztor fazei
staionare rmne stabil. Se poate considera o molecul care se afl n talerul 0. Dup echilibrare,
faza mobil din talerul 0 este transferat n talerul 1 cu o probabilitate p. n alte cuvinte, se poate
spune c un transfer va permite deplasarea moleculei printr-un numr de p talere astfel nct,
numrul etapei (M) n care molecula se afl cu cea mai mare probabilitate dup un numr de r
transferuri va fi dat de relaia M = rp. Pentru un numr mare de molecule, talerul M este talerul n
care concentraia moleculelor va fi maxim.
Dei la nivel experimental modelul teoretic al talerelor conduce la rezultate n deplin acord cu
cele experimentale, exist de multe ori foarte multe limitri. Cea mai important problem o
constituie faptul c aceast teorie are capacitate redus de a prezice valori reale. Teoria talerelor
poate oferi o relaie de legtur credibil ntre lrgimea benzii i lungimea acesteia, dar nu poate
furniza o modalitate de prezicere a mrimii dispersiei (n alte cuvinte nlimea talerului). De
asemeni nu pot fi prezise efectele modificrii unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea
particulei, ntruct nu se ine cont de aceti factori. Probabil cel mai mare avantaj deriv din
simplitatea abordrii.
9.6.2 Teoria cinetic i variabile cinetice care afecteaz lrgirea benzilor
Efectul de lrgire n cromatografie apare datorit unor cauze precum:
1) echilibrul de distribuie al solutului ntre faze nu se stabilete instantaneu n toate punctele
coloanei
2) apar modificri n structura solidelor din faza staionar datorit diferenelor dintre faza
mobil i faza staionar
3) curgerea fazei mobil are loc n mod ntmpltor prin canale de lungimi diferite i direcii
diferite antrennd moleculele de solut cu viteze diferite (proprii cromatogramelor ideale)
4) faza staionar solid reine o parte din faza mobil care rmne fixat n micropori,
participnd n final la procesul de separare
5) distribuia fazei staionare lichide sub form de filme neuniforme n jurul granulelor de
suport (solid inert).
Lrgirea benzilor este o consencin a vitezei finite la care intervin cteva procese cu transfer
de mas n timpul migrrii unei specii de-a lungul unei coloane. Unele din aceste viteze sunt
controlabile prin ajustarea variabilelor experimentale, permind astfel mbuntiri n separare.



Eficiena unei coloane cromatografice poate fi aproximat de expresia
H = B/u + C
s
u +C
M
u
unde H este nlimea talerului n cm i u reprezint viteza liniar a fazei mobile n cm s
-1
. B, C
S
i
C
M
sunt coeficieni care sunt legai de proprietile analitului. Ecuaia anterioar este cunoscut
sub numele de ecuaia lui Van Deemter. Figura 9.9 arat variaia termenilor din ecuaia lui Van
Deemter funcie de viteza fazei mobile. Curba care d numrul de talere este nsumare efectelor
din Figur. Viteza optim exist acolo unde nlimea talerului este minim i eficiena la separare
este maxim.
Dou variabile importante care afecteaz eficiena coloanei i care pot fi controlate includ
diametrul particulelor umpluturii i diametrul coloanei. La fazele mobile gazoase viteza difuziei
longitudinale poate fi redus considerabil prin scderea temperaturii i a coeficientului de difuzie
D
M
. Consecina este o scdere a nlimii talerului la scderea temperaturii. n cromatografia de
lichide efectul nu este considerabil deoarce difuzia este suficient de lent pentru ca termenul
difuziei longitudinale s aib efect sczut asupra relaiei.

Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s
-1
H
C
S
u
C
M
u
B/u
Figura 9.9: Contribuiile coeficienilor
transferului de mas la nlimea
talerelor, H.




10 Cromatografia n strat subire (thin layer chromatography, TLC)
Acest tip de cromatografie are drept scop separarea i concentrarea cantitilor mici de substan
din amestecuri complexe. Bazele tehniciii TLC au fost puse de Izmailov i Schreider (1939) care
au folosit extracte de plante medicinale, iar ca suport Al
2
O
3
. Zece ani mai trziu Mainhard i Hall
au folosit aceast tehnic pentru separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca
liant amidonul iar ca suport solid lamele de microscop. Mai trziu Kelles (1951) folosete ca suport
silicagelul, iar ca liant ipsosul. Cromatografia n strat subire este mai rapid, are o rezoluie mai
bun i este mai sensibil dect cromatografia pe hrtie.
n termeni teoretici, tipurile de faze staionare i mobile, aplicaiile cromatografiei pe hrtie i
cromatografiei n strat subire sunt aproape identice. Tehnica TLC adeseori este folosit ca mijloc
de determinare a condiiilor optime pentru efectuarea separrilor prin tehnica cromatografiei de
lichide pe coloan. Avantajele utilizrii acestei tehnici sunt constituite din viteza mare i costurile
sczute pentru efectuarea unor experimente exploratorii. Unii cercettori susin ideea c tehnica
TLC ar trebui s precead analiza pe coloan.
Tehnica TLC a devenit o metod de rutin n industriua farmaceutic mai ales n scopul
monitorizrii puritii produilor. i-a gsit aplicaii i n laboratoarele clinice dar i n laboratoarele
biologice i biochimice. Deoarece particulele fazei staionare sunt similare celor folosite n
cromatografia de adsorbie, de partiie cu faze normale sau inversate, de schimb ionic i de
excluziune pe baza mrimii, tehnica TLC se consider c se aseamn foarte mult cu tehnica
cromatografiei de lichide de nalt performan. Chiar i fazele mobile se aseamn cu cele
folosite n cromatografia de lichide.

10.1 Adorbeni folosii n TLC
Adsorbenii folosii n tehnica TLC trebuie s ndeplineasc o serie de condiii cum ar fi:
S nu reacioneze cu substana de separat, cu solvenii sau cu reactivii folosii pentru
vizualizarea spoturilor.
S fie rezisteni la temperaturi nalte.
S aib o supraf activ i specific.
S aib o granulaie ct mai fin i un numr mare de pori cu diametru mic i controlat (de
aceeai dimensiune). Cu ct dimensiunea porilor este mai mic cu att viteza de deplasare
este mai mic.
Ca adsorbeni se folosesc geluri de silice cum ar fi silicagel G care este un silicagel cu liant
(ipsos), silicagel cu indicator de fluorescen, adsorbeni anorganici de tipul aluminei (Al
2
O
3
).
Alumina, funcie de modul de preparare i activare se poate gsi n formele:
a) care este o form activ utilizat n TLC
b) care este o form compact, reactiv care se obine din alumin nclzit la 1000
o
C.



S-a studiat structura poroas a Al
2
O
3
i s-a constatat c posed un sistem regulat de micropori
cilindrici cu diametru de 2,7 la care se adaug micropori neregulai cu diametru normal mai
mare. Al
2
O
3
conine cantiti diferite de ap fie sub form grupelor OH superficiale sau ca ap
adsorbit. S-a presupus c interaciile la suprafaa aluminei sunt n general de natura
electrostatic. Centrele active de pe suprafaa aluminei sunt centre acide, bazice sau cu transfer
de sarcin. Dup natura gruprlor funcionale superficiale pe care le prezint alumina exist trei
tipuri de faz staionar:
Al
OH
Al
OH
O

a) Alumin acid
Al
Al O
O

b) Alumin neutr obinut prin dehidroxilare
Al
O
-
Na
+
Al
O
-
Na
+
O

c) Alumin bazic
Activitatea de adsorbie a aluminei poate fi controlat prin modificarea coninutului de ap. Prin
nclzire la 360
o
C timp de 5 h alumina este total lipsit de ap (gradul I de acionare exprimat n
procente de 0%). Hitratnd aceasta la diverse temperaturi i cu un anumit coninut de ap se
poate obine alumin grad II (3% grade de activiytate), alumin grad III (6%), grad IV (10%) i grad
V (15%).
Silicagelul e adsorbentul cu cea mai larg utilizare. Este produsul de policondensare a cidului
orto-silicic. Pe suprafaa silicagelului n afara grupelor silanolice tip OH se pot forma i alte grupri,
prin dehidroxilare.
Si
OH
O
Si
OH
Si
O
Si
O

a) legturi siloxanice obinute prin
dehidroxilarea unei anumite cantiti din
aceste grupri.
Si
O
O
Si
O
H H
O
H H

b) grupe silanolice hidratate ce pot apare ntr-
o anumit proporie chiar dup uscare. Se
prefer aceast form pentru compuii
polari deoarece are suprafa de contact
mare.
Si
OH
Si O
-
+ H
+

Si
OH
O Si
OH
Si H
3
C
CH
3
CH
3
H
N Si
CH
3
CH
3
CH
3
+ Si
O
O Si
O
Si Si H
3
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C
Si
O
O Si
O
Si
H
3
C CH
3




Gruprile silanolice se pot manifesta i ca schimbtori de ioni. Constanta de disociere, K~10
10
, comparativ
cu a fenolilor. Pentru remedierea acestor deficiene s-au propus mai multe metode dintre care blocarea
centrilor de adsorbie cu Pd sau Ag, adsorbia continu a unor compui puernic adsorbabili care s reduc
dispersia fr a afecta selectivitatea, silanizarea suprafeelor (tratarea cu hexametilen disiloxan sau dimetil
diclor silan).
Si O
H
Si O
H
Si O
H
Si O
H
Si Si
Si Si
O
O

c) la temperaturi mai mari de 400
o
C se poate
produce o sintetizare a particulelor
adiacente conducnd la micorarea
suprafeei specifice.
Pe lng modificarea polaritii se poate modifica i suprafaa specific. Viteza de distribuie va
fi lent. Unii autori au artat c exist 3 tipuri fundamentale de grupri OH superficiale:
a) grupe OH legate
b) grupe OH reactive
c) grupe OH libere
Tria relativ ca centre de adsorbie a acestor grupe OH este n ordinea a<b<c. Silicagelul are
o structur poroas. Mrind pH-ul soluiei de gel ntre 4 -10 se obin diferite soluii avnd suprafee
specifice cuprinse ntre 200-800 m
2
/g. Moleculele adsorbite joac rol de donori de e- stabilind
legtura de H.
Crbunii pot avea suprafa nepolar (grafitul coloidal). Suprafaa polar etse obinut prin
supunerea crbunelui la un proces redox. n acest caz se va comporta ca un oxid metalic.
Suporturile de natur organic includ: celuloza, celuloza modificat, derivai de celuloz.
Adsorbenii cel mai des folosii sunt cei modificai chimic sau cei specifici (se prepar n
prezena compusului respectiv i apoi se extrage din suport cu soluii saline). Cei de nalt
eficien pot fi:
a) Total poroi cu diametrul particulei de 5 m. Au o sensibilitate i selectivitate ridicate.
b) Cu miez compact cu suprafa cu porozitate controlat. Confer o suprafa de contact mai
mare, o sensibilitate i selectivitate mai mari.
10.2 Mecanismul separrii
Mecanismul separrii prin TLC se bazeaz n principiu pe distribuirea componenilor unui amestec
complex ntre dou faze dintre care o faz staionar (f
s
) solid sau lichid i alta o faz mobil (f
m
)
care strbate faza staionar. Funcie de natura fazei staionare se ntlnesc:
TLC de adsorbie (faza staionar S i faza mobil L)
TLC de repartiie (faza staionar L i faza mobil L)
TLC de schimb ionic.



Componenii amestecului sunt antrenai de faza mobil i trecui peste faza staionar. Viteza
de migrare va fi diferit i va depinde de modul n care componenii se distribuie n cele dou faze
(viteza de migrare a componentului sau eluentului). Dac unul din componenii amestecului este
mai puternic adsorbit de faza staionar el va rmne mai mult timp mobilizat n aceast faz, deci
va rmne mult n urma frontului de solvent. Dac componentul migreaz mai repede acest
comportament este un indiciu c moleculele lui sunt mai strns legate de faza mobil i la echilibru
aceasta conine un numr mai mare din moleculele solutului dect faza staionar. Un rol important
n separare l joac mrimea suprafeei adsorbentului, separarea fiind cu att mai bun cu ct
suprafaa specific e mai mare. n cromatografia n strat subire granulaia adsorbentului e fin,
mai mic de 60 m, adsorbentul este ntins sub forma unei pelicule subiri i omogene (grosime de
240 250 m), care are ca efect micorarea accentuat a spaiilor interstiiale neeficace i deci
conduce la creterea eficienei metodei.
Procedeul de adsorbie n faza staionar din faza mobil poate fi descris de izotermele de
adsorbie. n cazul separrii a 2 compui A i B, din care A este mai puternic reinut de faza
staionar i B mai puternic reinut de faza mobil, sunt posibile n urma separrii situaiile
prezentate n Figura 10.1.
Concentratia in faza mobila (C
M
)
A
B
C
M C
S
A
B
A
B

Figura 10.1.a: Izoterme de distribuie liniare
ideale.
M
)
A
B
C
M C
S
A
B
A
B

Figura 10.1.b: Izoterme de distribuie
neliniare neideale (fenomene nsoite di
difuzia zonelor).

M
)
A
B
C
M C
S
A
B
A
B

Figura 10.1.c: Izoterme de distribuie
neliniare neideale (fenomene nsoite di
difuzia zonelor).



Tratarea riguros matematic a acestor procese nu e posibil dac pe lng procesul de
repartiie-adsorbie are loc procesul secundar de transport de mas, difuziune, adsorbie-desorbie,
fenomene care se influeneaz i se condiioneaz reciproc.
a) izoterma liniar ideal: este o linie dreapt mai mult sau mai puin nclinat, dup cum
componentul mai mult sau mai puin reinut de faza staionar. Echilibrul se stabilete
instantaneu, fenomenul de difuzie lipsete iar forma zonelor de separare a celor doi
componeni e perfect determinat i simetric. Concentraia componenilor substanelor n
interiorul fiecrei zone e repartizat uniform.
b) izoterma adsorbiei neideale este aproximativ liniar. Echilibru de adsorbie se stabilete relativ
ncet. Substanele difuzeaz i ca atare petele cromatografice au margini difuze. Repartizarea
substanelor n interiorul petei e neuniform.
c) izoterme curbe concave sau convexe: substanele difer mult, petele apar cu cozi i exist
condiii necorespunztoare pentru separare. Pot apare aceste situaii din cauza faptului c
adsorbanii sau solvenii de migrare nu au fost bine alei sau datorit faptului ca nivelul
concentraiilor celor dou substane e mult prea mare i depete capacitatea de adsorbie a
fazei staionare. Repartizarea componenilor de-a lungul cromatogramei se face funcie de
solubilitatea solutului n cele dou faze lichide i va depinde de o serie de factori structurali i
polaritate. Faza mobil d legturi intermoleculare (legturi de hidrogen) dac n cealalt faz
exist substane care conine grupri capabile s formeze astfel de legturi (grupri OH).
Exemple de adsorbeni ce posed aceste legturi includ silicagelul i alumina (valorile R
f
cresc
odat cu creterea triei legturii de hidrogen ntre substan i solvent i valorile R
f
scad
odat cu creterea energiei legturii de hidrogen ntre substane i adsorbent ). Mai pot apare
legturi polare, multipolare, legturi donor-acceptor.
10.3 Cromatoplci pentru tehnica TLC i aplicarea probelor
Tehnica TLC const n obinerea unui strat subire de adsorbent pe o plac de sticl sau alt suport.
Dimensiunile sunt diferite. Plcile pot fi i achiziionate. Mrimile acestor plci variaz de la 520,
1020 i 2020. Plcile comerciale pot fi convenionale i de nalt performan. La plcile
convenionale grosimea stratului este de 200 250 m cu dimensiuni ale particulelor de 20 m. La
plcile de nalt performan grosimea stratului este de 100 m cu dimensiuni ale particulelor de 5
m sau chiar mai mici. Cromatoplcile de nalt performan dau separri mai bune n timp mai
scurt. O plac convenional poate da pn la 2000 talere pe o distan de 12 cm ntr-un timp de
25 minute. Pentru cromatoplcile de nalt performan se pot obine pn la 4000 talere pe o
distan de 3 cm ntr-un timp de pn la 10 minute. Dezavantajul cromatoplcilor de nalt
performan sufer de dezavantajul de a avea capaciti reduse ale probelor.
Aplicarea probelor n tehnica TLC este cel mai critic aspect. Pe cromatoplci se traseaz o linie
de start imaginar la circa 2 cm de unul din capete. Soluia de analizat (de concentraie 0,01
0,1%) se aplic cu o micropipet (1 10 l sau 1 - 10 g). Diametrul petei aplicate nu trebuie s



depeasc 3 mm n diametru (pentru a obine eficiena cea mai bun la separare). Pentru
depunerea succesiv a unei soluii diluate este necesar uscarea petei de fiecare dat, pentru a
obine zone nguste concentrate. Aplicarea manual se realizeaz prin folosirea unei capilare sau
a unei seringi hipodermice. Exist i sisteme automate care cresc precizia i acurateea la
aplicarea probei (Skoog). Folosirea capilarelor din platin-iridiu permite aplicarea unor spoturi cu
volume de 100 200 nL (Kellner).
10.4 Dezvoltarea cromatogramei i detecia (localizarea) analiilor pe cromatoplac
Pentru separri se folosesc cromatoplaci activate. Activarea cromatoplcilor se face nainte de
utilizare prin introducerea n etuv la o temperatur n jur de 100
0
C, timp de 45 minute 1 or.
Dup pregtirea probelor placa se usuc i se supune migrrii n camere cromatografice speciale,
nchise etan. Linia de start de pe plac trebuie s fie cu cel puin 0,75 1 cm deasupra nivelului
lichidului din camera cromatografic nchis etan i saturat n vapori n mediul de deasupra
solventului. Se las s se irige placa (frontul solventului s ajung la 2 cm de partea superioar),
se ndeprteaz cromatoplaca din camera cromatografic, se usuc i se identific substanele
separate.
Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) dup realizarea separrii se pot folosi att reactivi
anorganici ct i organici. Metodele cel mai des aplicate implic spray-ere cu o soluie de iod sau
acid sulfuric, ambele reacionnd cu o serie de compui organici. Se poate folosi i ninhidrina. O
alt metod de detecie const n ncorporarea unui material fluorescent n faza staionar. Dup
dezvoltarea cromatogramei, cromatoplaca se examineaz sub lumin UV. Componenii probei
atenueaz fluorescena astfel c toat cromatoplaca are fluorescen cu excepia spoturilor unde
exist analiii separai.
Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate n orice caz dup cum urmeaz:
a) folosirea caracteristicilor de luminiscen a analitului (fenomenul de fluorescen pentru
compui organici i fenomenul de fosforescen pentru compui anorganici)
b) impregnarea stratului fazei staionare cu o substan indicatoare fluorescent (ca substane
indicatori se pot folosi derivaii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B)
c) spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO
3
, KMnO
4
, H
2
SO
4
). Apar spoturi negre la
oxidarea compyilor organici
d) spray-ere cu soluii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH
2
(Figura
10.2), clorura de Fe(III) pentru fenoli, ftalatul de anilin pentru zaharurile reductoare, sau
reactivi de formare a complecilor pentru vizualizarea ionilor metalici.
C
C
O
O
C
OH
OH
ninhidrina
R-NH
2
C
C
C
O
O
N
O
O
produs albastru colorat
Figura 10.2: Formarea produsului
colorat n albastru din reacia
dintre ninhidrin i gruprile NH
2
.



10.5 Caracteristici ale cromatoplcilor din TLC
10.5.1 Factorul de ratardare (retenie, R
f
)
Factorul de retardare, R
f
se determin prin raportul dintre distana parcurs de analit de la linia de
baz i distana parcurs de solvent de la linia de baz.
M
R
f
d
d
R =
Deoarece spoturile nu sunt simetrice, distana se msoar pn la poziia de intensitate maxim
(Figura 10.3).
Linia de start
Frontul solventului
Proba 2
Proba 1
W
W
A W
B
d
R
d
M
R
f
= d
R
/d
M

Figura 10.3: Cromatogram obinut prin tehnica TLC.
10.5.2 Factorul de capacitate
Factorii d
R
(distana parcurs de analit de la linia de start) i d
M
(distana parcurs de solvent de la
linia de start) pot fi raportai la t
R
(timpul necesar solventului s parcurg o anumit distan) i t
M

(timpul necesar solutului/analitului s parcurg o anumit distan).
Timpul petrecut de analit/solut n faza mobil este egal cu distana parcurs mprit la viteza
liniar a solventului, u.
u
d
t
R
M
=
Solutul nu ajunge la acest punct pn cnd faza mobil nu parcurge distana d
M
.
u
d
t
M
R
=
Factorul de capacitate se noteaz cu k i este dat de relaia:
R
R M
d
d d
k

=
Factorul de capacitate poate fi exprimat i prin intermediul factorilor R
f
.
f
f
M
R
M
R
R
R 1
d
d
d
d
1
k

=
=



Factorii de capacitate astfel obinui pot fi folosii pentru dezvolatrea cromatografiei pe coloan.
10.5.3 nlimea unui taler cromatografic
nlimi ale talerelor pot fi obinute pentru anumite tipuri de cromatoplci din tehnica TLC. Numrul
de talere teoretice se poate calcula cu relaia
2
R
W
d
16 N

=
nlimea unui taler se calculeaz cu relaia:
N
d
H
R
=
unde d
R
i W sunt cele definite n Figura 10.3.
10.6 Aplicaii ale cromatografiei n strat subire
Tehnica TLC se folosete att la determinri calitative (R
f
metoda comparrii valorilor R
f
) ct i
determinri cantitative (prin metode gravimetrice, volumetrice sau spectrofotometrice n VIZ i UV).
Datele de la o singur cromatogram, n mod uzual, nu furnizeaz informaii suficiente pentru a
permite identificarea unor specii prezente ntr-un amestec din cauza variabilitii factorului R
f
cu
mrimea probei, numrul de talere i condiiile de la migrare.
Cei mai importani factori care determin mrimea factorului R
f
includ grosimea fazei
staionare, umiditatea fazelor mobil i staionar, temperatura, gradul de saturare a camerei
cromatografice n vaporii fazei mobile, mrimea probei. Aceste variabile nu pot fi controlate dar pot
fi parial ameliorate prin folosirea unui factor de retenie relativ (R
rel
) determinat pentru analitul i n
raport cu o substan standard, st:
f(st)
f(i)
rel
R
R
standard substanta o de parcursa distanta
analit de parcursa distanta
R = =
Pentru identificarea spoturilor evideniate la dezvoltarea cromatogramei se poate folosi metoda
comparrii factorului R
f
cu acela al unor substane pure (standarde).
Identificarea se poate realiza i prin tehnica prelevrii exacte a spotului evideniat pentru un
analit. Prelevarea se poate realiza cu o spatul, aducerea componentei prelevate ntr-o eprubet,
dizolvarea analitului cu un solvent potrivit, separarea de faza staionar insolubil prin centrifugare
i analiz prin spectrometrie de mas, rezonan magnetic nuclear sau spectroscopie n
infrarou.
Comparativ cu tehnica cromatografiei de lichide de nalt performan, tehnica TLC are cteva
puncte slabe cum ar fi:



a) Viteza solventului nu este constant, poate fi modificat prin mrimea particulelor fazei
staionare i tipul solventului folosit. Scderea vitezei de migrare poate duce la lrgirea
spoturilor.
b) Compoziia solventului se poate modifica n timpul separrii datorit unor echilibre induse de
faza staionar. Acest fapt conduce la factori de capacitate care sunt greu de reprodus i
implicit la separri nereproductibile.



11 Tehnici cromatografice instrumentale
11.1 Cromatografia de lichide pe coloan instrumental
Reprezint tehnic ce se caracterizeaz prin:
a) folosirea coloanelor lungi i nguste umplute cu particule mici;
b) separri de nalt eficien realizate ntr-un timp scurt;
c) operarea la presiune ridicat;
d) detecia continu a componen ilor separati cu posibilitate de automatizare a procesului de
separare;
e) precizia determinrilor cantitative;
f) capacitatea de a separa specii nevolatile sau instabile termic.
Cromatografia de lichide pe coloan de nalt performan (HPLC): necesit crearea unor condiii
optime de transport a fazei lichide sub presiune; necesit asigurarea atingerii rapide a echilibrelor
de distribuie i a deteciei optime pentru componenii separai.
11.1.1 Clasificare
Metodele cromatografiei de lichide sunt complementare i principalele metode utilizate n
cromatografia de lichide precum i ntreptrunderea acestora n vederea utilizrii lor n practic
sunt prezentate n Figura 11.1.
Adsorbtie
Partitie
Schimb ionic
Partitie
normala
Partitie cu faze
inversate
Permeatie prin gel Filtrare prin gel
Excluziune
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Polari neionici
Nepolari
Ionici
Insolubili in apa Solubili in apa
Cresterea polaritatii

Figura 11.1: Aplicaiile cromatografiei de lichide.

Tehnica cromatografiei de lichide poate cuprinde prin urmare tehnici precum:
- cromatografia de adsorbie (cromatografia L-S bazat pe mecanisme de adsorbie);



- cromatografia prin schimb ionic (CSI sau IC bazat pe mecanisme de schimb);
- cromatografia de excludere difuzie (cromatografia prin penetraie prin gel i filtrare pe gel);
- cromatografia de repartiie (cromatografia L-L bazat pe mecanisme de repartiie);
- alte metode: cromatografia de afinitate sau schimb de liganzi i cromatografia perechilor ionice.
Metodele cromatografiei de lichide pot fi utilizate funcie de scopul urmrit:
- Pentru moleculele cu greutate molecular mare se folosete cromatografia de excludere
difuzie;
- Pentru compuii ionici cu greutatemolecular mic se folosee n mod curent CSI.
- Pentru speciile neionice, dar puin polare se folosete cromatografia de repartiie.
11.1.2 Aparatura utilizat n cromatografia de lichide
Dup cum se observ n Figura 11.2 sistemul cromatografului de lichide este compus din 4
componente de baz.
Rezervoare faz
mobil
Valv
partiionare
solvent
Pomp
Detector
C
o
l
o
a
n
Pre-coloan
Amortizare
pulsuri
Injector,
tip 6 ci

Figura 11.2: Prezentarea schematica a
unui cromatograf de lichide (HPLC) modern.
1. coloana cromatografic n care se desfoar procesul de separare al componenilor.
2. dispozitive de introducere a probei care poate fi dependent de tipul de analiz efectuat: calitativ
sau cantitativ.
3. sistem de alimentare cu faz mobil care con ine circuitul de solvent care transport faza
mobil prin coloana cromatografic. Acest sistem de alimentare include:
a. rezervoare cu faz mobil de aceeai polaritate sau polariti diferite;
b. dispozitive de reglare a vitezei de curgere;
c. dispozitive de monitorizare a presiunii debitului;
d. dispozitiv de purificare;
e. precoloane de amestecare aezate n faa coloanei cromatografice.
4. detectori cu sau fr sistem de nregistrare (reprezint sistemul de identificare i dozare a
componenilor din amestec).
Sistemul este astfel construit nct s permit transmiterea fazei mobile corespunztoare
pentru o eluie continu sau o eluie n gradient. Faza mobil curge printr-o camer de
preamestecare plasat ntre pomp i rezervoare pentru a compensa schimbrile fcute n faz.



Pompa pulseaz faza mobil din camera de amestecare n coloana cromatografic i apoi o
mpinge spre detector. Viteza de curgere a fazei mobile trebuie s se menin constant i
reproductibil. Componenii situai n coloan ajung direct la detector care transform diferena
unor proprieti dintre componeni i faza mobil n semnal electric, semnal care este amplificat i
nregistrat sub forma unor cromatograme care se analizeaz calitativ i cantitativ.
n cromatografia de lichide se folosesc coloane confecionate din metale (Al, Cu), oel
inoxidabil, materiale plastice de o anumit duritate. Diametrul poate varia ntre 2 10 cm.
Lungimea coloanei este de la 20 pn la 100 cm. Uneori este nevoie s se lege n serie mai multe
coloane pentru a asigura eficiena presiunii de separare. n HPLC coloanele trebuie s reziste la
presiuni ridicate, ceea ce impune entaiezri la capete prin racorduri corespunztoare.
Dimensiunile coloanei variaz n funcie de granulaia umpluturii. Diametrul n HPLC poate fi de la
1 la 4 cm i lungimea ntre 10 25 cm.
Detectorii folosii n cromatografia de lichide asigur detecia componenilor analizai dar ridic
probleme mai grele. Condiiile care se impun pentru detectori includ:
- s prezinte sensibilitate ridicat (10
-11
10
-13
g component mL
-1
);
- s dea rspuns liniar n funcie de concentraie;
- s prezinte vitez mare de rspuns i s semnaleze prezena tuturor componenilor;
- s fie nedestructiv;
- s nu fie influenat de modificarea compoziiei fazei mobile; deoarece nici un detector nu
ndeplinete aceste condiii, se recomand utilizarea simultan a mai multor detectori.
Se pot folosi detectori refractometri (bazai pe unghiuri de refracie), indicatori fotometrici,
indicatori bazai pe msurarea cldurii de absorbie i bazai pe msurarea conductibilitii termice.
11.1.3 Faze mobile i staionare, polaritate
Faza mobil poate fi un singur solvent de compoziie constant n coloana cromatografic
(cromatografia izocratic) sau un amestec de solveni de polaritate diferit n cromatografia cu
gradieni.
Condiiile pe care faza mobil trebuie s le ndeplineasc includ:
- s prezinte puritate nalt;
- vscozitate sczut;
- punct de fierbere ntre 20 50
0
C;
- reactivitate chimic sczut;
- compatibilitate cu detectorii utilizai;
- inflamabilitatea i toxicitatea ridicat s fie strict monitorizate.
n cromatografia de lichide trebuie s se in seama de polaritatea celor 3 componeni care
particip n procesul de separare: solut faz mobil faz staionar. Polaritatea solutului i a
fazei mobile se aleg apropiate i net diferite de a fazei staionare.



a) polariti asemntoare pentru (solut, faz staionar) i diferite de ale fazei mobile: viteze mici
de deplasare, timp mare de separare.
b) polariti asemntoare pentru (solut, faz mobil) i diferite de ale fazei staionare: timp foarte
scurt de separare.
n cazul cromatografiei cu faze normale
Faza staionar este polar (silicai sau particule de silicagel sau lichide polare precum etilen
glicol) iar faza mobil este relativ nepolar (hexanul, izopropil eterul).
Dac se consider un amestec de analii A, B, C, polaritatea compuilor A > B > C, cu creterea
polaritii fazei mobile, timpul de reinere se micoreaz i ordinea de eluie este: C > B > A. De
fapt componentul cel mai puin polar iese primul din coloan.
n cazul cromatografiei cu faze inverse
Faza staionar este nepolar (hidrocarburi, coloane C8 i C18) i faza mobil este polar. Dac
se consider amestecul de analii A, B, C, polaritatea compuilor A > B > C, ordinea de eluie este:
A > B > C.
11.2 Cromatografia ionic (IC)
Analiza amestecurile de anioni, cationi sau compui polari a impus necesitatea utilizrii
cromatografiei ionice, lucru dificil sau imposibil de realizat eficient prin celelalte variante ale
cromatografiei de lichide. Aceasta variant a cromatografiei de lichide de nalt presiune se
bazeaz pe utilizarea coloanelor cu schimbtori de ioni respectiv a materialelor rezistente la
agresivitatea acizilor, bazelor sau srurilor substane a caror soluii apoase servesc drept elueni.
Dintre toate elementele unui sistem cromatografic faza staionar reprezint elementul cheie
deoarece determin mecanismul de separare care este operativ. Mecanismul de separare, n
schimb, dicteaz alegerea fazei mobile i adeseori care metode de detecie ar putea fi aplicate n
mod corespunztor. Pentru a nelege importana fazei staionare n procesul cromatografic este
necesar s se cunoasc unele aspecte privind compoziia sa i, n acelai timp, este util s se
cunoasc cum se prepar o faz staionar.
11.2.1 Schimbtorii de ioni
Schimbtorii de ioni reprezint cea mai utilizat faz staionar n cromatografia de ioni. Un
schimbator de ioni cuprinde n compoziia sa urmtoarele trei elemente importante: o matrice
insolubil care poate fi de natur organic sau anorganic, locaii ionice fixe care sunt fie ataate,
fie parte integrant din matricea insolubil i, n asociere cu aceste locaii fixe, o cantitate
echivalent de ioni de sarcin opus, fa de cei din locaiile fixe.
Gruprile ataate mai sunt cunoscute i sub denumirea de grupri funcionale iar ionii asociai
mai sunt numii i contraioni. Contraionii sunt mobili n interiorul schimbtorului de ioni i dein
proprietatea important c au capacitatea de a fi nlocuii cu ali ioni de aceeai sarcin atunci



cnd sunt plasai ntr-o soluie care conine asemenea ioni. Aceast ultim proprietate este cea
care furnizeaz acestor materiale numele lor.
Pe lng aceast proprietate fundamental, schimbtorii de ioni, pentru a putea fi utilizai n
cromatografia ionic, ar trebui s prezinte i urmtoarele proprieti:
1. Proprietatea de a schimba ionii rapid.
2. Stabilitate chimic ridicat ntr-un domeniu larg de pH.
3. Rezisten mecanic ridicat i rezisten la ocuri osmotice.
4. Rezisten la deformare atunci cnd sunt mpachetate n coloana i supuse la curgerea fazei
mobile.
Drept matrice pe care se ancoreaz locaiile ionice ale schimbtorilor de ioni se utilizeaz o
gam larg de materiale. n cromatografia ionic modern cele mai utilizate materiale includ silicea
i o serie de polimeri organici care au la baz stirenul. Excelenta stabilitate chimic a rinilor
schimbtoare de ioni de tip organic le furnizeaz un avantaj clar n faa celor pe baz de silice cu
sensibilitate ridicat la variaii de pH.
11.2.2 Precursori polimerici ai rinilor schimbtoare de ioni
n cromatografia ionic faza staionar este o rin polimeric interlegat (Figura 11.3), de obicei
de forma divinil benzen interlegat cu polistiren, cu grupri funcionale ionice ataate covalent.
Rinile schimbtoare de ioni pot fi mprite n patru categorii: schimbtori cationici puternic acizi,
schimbtori cationici slab acizi, schimbtori anionici puternic bazici, schimbtori anionici slab
bazici.
stiren
divinil benzen

Figura 11.3: Structuri ale stirenului, divinil-benzenului i un copolimer modificat de stiren-divinil-benzen
pentru a fi folosit ca rin schimbtoare de ioni. Site-ul pentru schimb este de obicei n poziia para i nu
este neaprat necesar s fie legat la toate unitile de stiren. R- poate fi SO
3
-
H
+
, COO
-
H
+
, -NH
3
+
OH
-
sau
N(CH
3
)
3
+
OH
-
.
Locaie pentru
schimb ionic Interlegtur



Cel mai uzual mod de preparare a unei rini schimbtoare de ioni este acela n care mai nti
se prepar un polimer neutru pe baz de stiren, pentru ca mai apoi acesta s fie modificat chimic
pentru a introduce gruprile cu funciuni ionice. n mod alternativ, monomerii care conin funciunea
ionic necesar pot fi polimerizai printr-o interlegtur potrivit pentru a obine un schimbtor de
ioni, dar materialele obinute pe aceast cale nu sunt utilizate n mod obinuit n cromatografia
ionic. Exist dou ci principale pentru obinerea precursorilor polistirenici folosii n cadrul
majoritii rinilor schimbtoare de ioni. Din prima se obin produi ce sunt cunoscui drept
polimeri de tip gel, iar din cea de-a doua cale se obin materiale macroporoase. Diferena
structural dintre cele dou tipuri de polimeri are implicaii importante n privina schimbtorului de
ioni, n special n ceea ce perivete viteza de schimb ionic, mai ales atunci cnd acetia au
dimensiuni mari.
11.2.3 Mecanisme de separare
Schimbtorii de ioni sunt materiale solide - derivai ai unor polimeri reticulai (poroi), obinui prin
legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcionale aa cum sunt
reprezentate schematizat n Tabelul 11.1. Granulele de rin se solvateaz cu apa tinznd spre
un volum- limit maxim. Prin spaiile dintre catenele unui cationit pot ptrunde prin difuziune n faza
lichid doar molecule neutre sau cationi, anionii fiind exclui.
Ptrunderea n granule a ionilor de semn contrar este ngreunat i de efectul Donnan de
membran, care apare pe suprafaa granulei i provoac o selectivitate a acesteia la ptrunderea
ionului, n funcie de dimensiunile acestuia. Un alt mecanism util n cazul substanelor neionice sau
a celor ionice dar cu gruparea ionic identic dar cu geometria moleculei diferit este difuzia prin
granule. Analog stau lucrurile ntr-un anionit, cu deosebirea c de ast dat sunt exclui cationii.
Tabel 11.1: Tipuri de schimbtori de ioni.
Tip Grupare funcional Exemple
Schimbtori cationici puternic acizi Acid sulfonic -SO
3
-

-CH
2
CH
2
SO
3
-

Schimbtori cationici slab acizi Acid carboxilic -COO
-

-CH
2
COO
-

Schimbtori anionici puternic bazici Amine cuaternare -CH
2
N(CH
3
)
3
+

-CH
2
CH
2
N(CH
2
CH
3
)
3
+

Schimbtori anionici slab bazici Amine -NH
3
+

-CH
2
CH
2
NH(CH
2
CH
3
)
2
+

De exemplu, prin introducerea unui amestec de Na
+
i K
+
pe o coloana umplut cu un cationit
acetia vor fi fixai pe rin, elibernd o cantitate echivalent de ioni hidroniu.
R-H + Na
+
R-Na + H
+

R-H + K
+
R-K + H
+

Pompnd un eluent prin coloana, (HCl diluat), ionii H
+
din acid, fiind n concentraie mai mare,
vor deplasa ionii fixai, prin echilibre ionice similare spre o poriune inferioar iar acetia se vor
putea fixa din nou, puin mai jos, pe alte centre de schimb din coloan.



R-Na + H
+
R-H + Na
+

R-K + H
+
R-H + K
+

Repetarea procesului duce la migrarea ionilor prin coloan, ns, datorit afinitii sporite a
gruprilor funcionale tip -SO
3
-
pentru K
+
fa de Na
+
, primul grup de ioni (sau prima zona) care va
iei din coloan va fi cel format din ionii de sodiu i abia dup un timp va iesi grupul coninnd ionii
de potasiu, asigurnd separarea celor doi ioni. Similar sunt separate i amestecuri mai complicate,
uneori fiind necesare coloane mai lungi.
Deoarece creterea diametrului granulelor conduce la apariia unor zone mai largi i separri
mai de durat, iar granulele se deformeaza mecanic n timp, rina se aplic sub form de pelicul
subire pe un miez de sticl sferic, eficacitatea separrii i fiabilitatea coloanelor crescnd foarte
mult. Fazele mobile n IC sunt simple de obicei soluii apoase diluate de acizi sau baze. Uneori
poate fi necesar adugarea de metanol pentru a facilita dizolvarea moleculelor puin ionizate n
ap. Pentru separarea cationilor se utilizeaz ca faze staionare cationii (schimbtori de cationi) i
drept elueni, soluii de acizi, iar pentru separarea bazelor se folosesc anionii (schimbtori de
anioni) i ca elueni soluii de baze, de exemplu, o soluie de bicarbonat de sodiu.
11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecie n cromatografia ionic
Monitorizarea conductivitii prezint o serie de caracteristici care ofer acestei proprieti
posibilitatea s fie folosit ca mijloc de detecie. Conductivitatea este o proprietate universal a
soluiilor ionice, reprezentnd de fapt proprietate proporional cu concentraia componenilor.
Deoarece fazele mobile folosite n cromatografia cu schimbtori de ioni sunt ionice (de aceea
de multe ori aceste faze prezint o conductivitate ridicat) detectorul de conductivitate folosit n
aceast metod este un detector al unei proprieti comune. n acest tip de detecie,
conductivitatea de fond a eluentului folosit n cromatografia cu schimb ionic este intensificat, dar
celula de conductivitate este transformat dintr-un detector al unei proprieti comune ntr-un
detector de proprietate al unui solut.
Acest fundament teoretic a fost exploatat i desvrit prin adugarea unei a doua coloane de
schimb ionic ntre separator i celula de conductivitate care transport ionii eluentului, sau care
modific conductivitatea acestora la valori mai mici, n timp ce conductivitatea eluailor este
intensificat. Procedura a devenit cunoscut sub numele de supresia eluentului i a fost raportat
pentru prima dat n anul 1975 de ctre Small i colaboratorii si. Mai trziu, a aprut posibilitatea
cuplrii directe a coloanei schimbtoare de ioni cu detectorul de conductivitate i metoda a fost
cunoscut sub numele de cromatografia ionic cu o singur coloan. innd cont de aceast
procedur de lucru, detectorii conductometrici pot fi inclui n dou mari categorii tip detectori
conductometrici cu supresie i detectori conductometrici fr supresie.



11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie
Detectorii conductometrici se utilizeaz cu precdere n cromatografia pe schimbtori de ioni i
sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt detectori specifici i sunt
suficient de sensibili (500 pg 1 ng). Detectorii conductometrici sunt sisteme caracterizate de
sensibilitate ridicat, stabilitate, flexibilitate, acuratee i reproductibilitate, i de capacitate mare de
a furniza date de ncredere. Detectorii conductometrici ofer posibilitatea unei cuantificri a
anionilor, cationilor, metalelor i acizilor organici aflai n diferite probe, n concentraii mai mici de
ordinul prilor per bilion (ppb). Noile micro-procesoare, bazate pe circuite electrice, mbuntesc
sensibilitatea deteciei analitului prin reducerea zgomotului de fond.
De obicei, la ieirea din coloana cromatografic ionii nu pot fi detectai suficient de sensibil pe
cale conductometric n mod direct, deoarece au concentraii coborte i sunt coninui n eluentul
format dintr-un electrolit cu o concentraie comparabil sau chiar mai mare. Pentru mbuntirea
performanelor s-a recurs la supresorul ionic care a fost realizat pentru prima dat n 1975 de un
grup de cercettori americani (H. Small i colab.). Iniial sistemul a constat dintr-o coloan-
supresor, plasat n continuarea celei de separare, cu rolul de a transforma eluentul (un acid sau o
baz tare) n ap.
De exemplu, pentru eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor este umplut cu o rin
schimbtoare de anioni cu formula general R-OH, caracterizat de capacitate de schimb mare.
Coloana de separare poate fi redat ca RH i coloana de supresie ca ROH. Eluentul care conine
acid clorhidric diluat de exemplu, la ieirea din coloana de separare va ptrunde n coloana
supresor unde se va petrece reacia:
R-OH + (H
+
+ Cl
-
) R-Cl + H
2
O
Reacie prin care acidul utilizat drept eluent este trecut n ap care este un neelectrolit.
ntre timp, srurile se transform n hidroxizii corespunztori:
R-OH + (Na
+
+ Cl
-
) R-Cl + (Na
+
+ OH
-
)
R-OH + (K
+
+ Cl
-
) R-Cl + (K
+
+ OH
-
)
Apa fiind practic neionizat va permite detecia sensibil a hidroxizilor total ionizai ce au aprut
din zonele formate iniial din cele dou sruri. Deoarece i eluentul este format din ioni care
conduc curentul, nainte de supresor semnalul va fi mai slab.
Dac se urmrete separarea a doi anioni, de exemplu Cl
-
i Br
-
, eluentul ar putea fi, nu un
acid ci o baz diluat, de exemplu NaOH, sau NaHCO
3
. n acest caz separarea se va realiza pe
coloane de anionii i eluentul ar fi de exemplu NaOH. La ieirea din coloana de separare avem n
eluentul folosit zonele separate ale srurilor anionilor supui analizei, adic NaCl i NaBr.
Supresorul utilizat n acest caz va fi format dintr-o rin de forma R-H n exces pe care se va
petrece reacia:

R-H + (Na
+
+ OH
-
) R-Na + H
2
O



11.2.4.2 Supresorul electrochimic
n prezent, supresorul electrochimic (sau autosupresorul) din cromatografele ionice recente a
nlocuit coloana cu schimbtori de ioni cu membrane schimbtoare de ioni. n plus, procesul de
schimb ionic n cromatografele moderne este accelerat prin electrodializ. n acest fel s-a mrit
viteza procesului i s-a micorat volumul mort. Mai mult, a crescut durata de funcionare a
detectorului.
n aceste tipuri de detectori, n general, celula detectorului este localizat ntr-o incint special
de reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului de fluctuaiile externe de
temperatur. Un schimbtor de cldur unic, nclzete faza mobil i proba nainte ca acestea s
ajung n celula detectorului. Aceste dou trsturi furnizeaz stabilitatea liniei de baz (se elimin
influena curentului indus de temperatur care este ntlnit la alte tipuri de detectoare).
n Figura 11.4 se prezint schematic, procesul de mbuntire a raportului semnal-zgomot
pentru un sistem de analiz formal. n acest exemplu, sistemul de supresie cu autoregenerare,
nlocuiete ionii de sodiu (i ali cationi) din eluent i i transport odat cu ionii hidroniu din apa
folosit ca regenerant. Ionii hidroniu se combin cu ionii hidroxid rezultai din eluent i formeaz
apa, care are o conductivitatea mult mai mic dect a hidroxidului de sodiu folosit ca eluent.
Conductivitatea analitului este intensificat deoarece anionii analitului se asociaz cu ionii hidroniu
care sunt mult mai conductivi.

Reziduuri
H
2
O
HF, HCl, H
2
SO
4
, n H
2
O
NaF, NaCl, Na
2
SO
4
, n H
2
O
Coloana
analitic
Sistem de
supresie cu
regenerare
Eluent (NaOH) Prob (F
-
, Cl
-
, SO
4
2-

F
-

Cl
-

SO
4
2-
S
Separare prin supresie
F
-
Cl
-
SO
4
2-

Separare fr supresie
Tim
S
T
Ionii
interfereni

Figura 11.4: Reprezentarea schematic a procesului de mbuntirea a raportului semnal-zgomot
Aceste procese convertesc n mod efectiv un detector de conductivitate dintr-un detector al
unei proprieti comune, ntr-un detector de proprietate specific capabil s detecteze concentraii
extrem de joase (ppb) ale ionilor cu specificitate deosebit. Pentru sistemele de supresie cu auto
regenerare se cunosc dou tipuri de sisteme: sisteme anionice de supresie cu auto-regenerare
(analiza anionilor) i sisteme cationice de supresie cu auto-regenerare (analiza cationilor). n
funcie de sistemul de operare, supresorii pot fi inclui n trei categorii: supresori care opereaz n
modul ciclic, supresori care opereaz n modul extern i supresori n modul chimic.



Chimismul din sistemul de supresie cu auto-regenerare anionic este ilustrat n Figura 11.5.
Exemplul este dat pentru situaia n care ca eluent se folosete hidroxidul de sodiu, dar n calitate
de eluent pot fi folosite i amestecurile carbonat/bicarbonat de sodiu sau acid boric/tetraborat. n
acest sistem, apa este folosit ca agent de regenerare care sufer procesul de electroliz cu
formare de oxigen n stare gazoas i ioni de hidroniu n camera anodic, i cu formare de
hidrogen gazos i ioni hidroxil n camera catodic. Ionii hidroxil formai la catod sunt nlturai din
camera eluentului printr-un proces de excluziune. Membranele schimbtoare de cationi permit
transportul ionilor hidroniu de la camera anodic n camera eluentului unde se produce
neutralizarea hidroxidului din eluent, n timp ce ionii de sodiu din eluent sunt transportai de-a
lungul membranei n camera catodului, meninnd bilanul de sarcini. Rezultatul acestui proces este
mbuntirea semnificativ a raportului semnal-zgomot datorit a trei factori:
1) conductivitatea de fond a eluentului descrete dup cum eluentul este supus procesului de
supresie la o conductivitate medie, mai mic n valoare, corespunztoare apei;
2) conductivitatea analitului crete prin asocierea cu ionii hidroniu din camera eluentului, i
3) contorizarea picurilor corespunztoare interferenilor este nlturat.
Analit
Na
+
OH
-
eluent
Anod
- +
Membran schimbtoare
de cationi
Membran
schimbtoare de cationi
H
2
O H
2
O
Analit i H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
+
+ OH
-
=H
2
O
H
2
O i O
2

H
+
+ O
2

H
+
Na
+

OH
-

Spre detector
H
2
+ OH
-

Na
+
OH
-
i H
2

Reziduuri Reziduuri
Catod

Figura 11.5: Autosupresia ntr-un sistem de supresie cu auto-regenerare anionic.
Chimismul sistemului de supresie cu auto-regenerare cationic este prezentat n Figura 11.6.
i n aceste sisteme, ca agent de regenerare se folosete apa care sufer procesul de electroliz
cu formare de hidrogen n stare gazoas i ioni hidroxil n camera catodic i oxigen gazos i ioni
hidroniu n camera anodic. Ionii hidroniu generai la anod sunt nlturai din camera eluentului prin
acelai proces de excluziune ntlnit i n cazul celuilalt tip de sistem. Membranele schimbtoare de
anioni permit ionilor hidroxil s fie transportai din camera catodului n camera eluentului cu
neutralizarea ionilor hidroniu n eluent, n timp ce ali ioni ai eluentului (MSA
-
) sunt transportai de-a
lungul membranei n camera anodic cu meninerea bilanului de sarcin. Rspunsul va fi puternic



mbuntit prin asocierea cationilor analitului cu ionii hidroxil caracterizai de conductiviti ridicate
ca valoare.

Analit
Na
+
OH
-
eluent
Anod
Catod
- +
Membran schimbtoare de
anioni
Membran schimbtoare de
anioni
H
2
O H
2
O
Analit i H
2
O
H
2
O
H
2
O
MSA
-

H
+
MSA
-
i O
2

H
+
+ O
2

H
+

OH
-

Spre detector
H
2
+ OH
-

H
2
O i H
2

Reziduuri Reziduuri
H
+
+ OH
-
=H
2
O
MSA
-
H
+

Figura 11.6: Autosupresia ntr-un sistem de supresie cu auto-regenerare cationic.
11.3 Cromatografia de gaze
11.3.1 Aspecte teoretice
Baza separrilor cromatografice n faz gazoas o constituie distribuie componenilor ntre dou
faze. Funcie de natura fazei staionare (f
S
) se ntlnesc:
- cromatografia GS (CGS, cromatografia gaz-solid) cnd faz staionar este un solid
(separarea este bazat pe mecanismul de adsorbie);
- cromatografia GL (CGL, cromatografia gaz-lichid) cnd faza staionar este un lichid depus
pe un suport inert (separarea este bazat pe un mecanism de repartiie).
Principiile cromatografiei n faz gazoas includ:
- reinerea specific a componenilor pe coloan are loc datorit presiunilor diferite de vapori
ale componenilor de analizat;
- desorbia componenilor din faza staionar n faza mobil are loc cu att mai rapid cu ct
volatilitatea lor este mai mare.
Avantajele cromatografiei de gaze fa de a altor metode de separare includ:
- vscozitatea redus a fazei mobile permite folosirea coloanelor lungi, ridicnd astfel
eficiena procesului de separare,
- vscozitatea redus a fazei mobile conduce la stabilirea rapid a echilibrelor de distribuie,
- atingerea rapid a echilibrelor are ca efect o rezisten mic la transferul de mas ceea ce
face posibil o vitez mare de flux,



- timpul de analiz este foarte scurt, aparatura relativ simpl se preteaz la analize calitative,
cantitative, pe lng separarea componenilor,
- se aplic n domenii variate i la o gam larg de produse exceptnd produii labili din
punct de vedere termic i cei nevolatili.
11.3.2 Sistemul gaz cromatografic
Schema de principiu a unui cromatograf de gaze este prezentat n Figura 11.7.
Coloan
Septum Bloc injector Blocul detector
Faza
mobil
Debit-metru
Control debit
Regulator presiune
Cuptor
Figura 11.7: Schema de principiu a unui
cromatograf de gaze.
Componentele majore ale instrumentului cuprind:
- butelia ce conine gazul purttor (faza mobil) sub presiune (150 atm)
- reductor de presiune i sistem pentru reglarea i msurarea debitului
- bloc injector (sistemul de injecie)
- coloana cromatografic-reprezint sediul proceselor de separare; poate fi confecionat din
metal, sticl, poate fi dreapt, sau forma literei U sau sub form de spiral
- cuptor (sistemul de termostatare a coloanei sau programare a rampelor de temperatur)
- blocul detector cu amplificator amplific semnalul dat de detector
Gazul purttor (eluentul) este eliberat dintr-o butelie ce ine gazul sub presiune. Ulterior este
trecut printr-o serie de dispozitive de purificare, de reglare de presiune i de msurare a ei.
Eluentul ajunge apoi n dispozitivul de introducere a probei, pe care o preia i o transport n
evaporator (probele sunt vaporizate) i apoi n coloana cromatografic. Dispozitivele pentru
introducerea probei constau n microseringi i valve de injecie. Valvele de injecie au avantajul c
asigur trecerea continu a gazului purttor (fazei mobile) prin coloan. Cantitatea de prob
injectat variaz de la cteva g la cteva mg.
Coloana este partea cea mai important a unui cromatograf i reprezint sediul procesului de
separare, componenii sunt introdui simultan, parcurg coloana cu viteze diferite (timpi diferii) i o
prsesc separat. Coloana de separare este confecionat din tuburi metalice (Cu, Al, oel
inoxidabil), tuburi de sticl sau, mai nou, coloane capilare. Dup alte criterii de clasificare coloanele
din gaz cromatografie se mpart n coloane umplute i coloane tubulare deschise sau coloane
capilare. Lungimea coloanelor umplute poate fi de pn la civa cm n timp ce lungimea
coloanelor capilare poate ajunge pn la 50 m.



Componenii separai de coloan ajung la detector, acesta transformnd diferena unei
proprieti dintre eluent i component n semnal electric. Acest semnal este amplificat i nregistrat
sub form unei cromatograme, care se interpreteaz din punct de vedere calitativ (identificarea
componenilor) i cantitativ (determinarea lor).
11.3.3 Faza mobil folosit n cromatografia de gaz
Eluentul sau gazul purttor are rolul de a antrena i de a transporta componentele amestecului de-
a lungul coloanei cromatografice. Acesta trebuie s ndeplineasc o serie de caracteristici precum:
- s fie inert (s nu reacioneze cu componenii probei sau cu faza staionar
- s efectueze separarea fr s afecteze viteza de desfurare a analizei
- alegerea gazului purttor se face n funcie de sensibilitatea detectorului, n funcie de
eficiena separrii i de posibilitile de interaciune cu solutul sau faza staionar; de
exemplu la detectorul de conductivitate termic se aleg ca elueni gaze care au o
conductivitate termic mult diferit de a componenilor ce se separ
- deoarece impuritile din faza mobil pot induce modificri asupra fazei staionare, ntre
sistemul de alimentare cu gaz i instrument, se folosesc de obicei filtre sub forma sitelor
moleculare
- pentru a se obine rezultate reproductibile debitul fazei mobile n timpul analizei trebuie
meninut constant.
11.3.4 Faze staionare folosit n cromatografia de gaz
Fazele staionare folosite n cromatografia de gaz pot fi: polare (polietilenglicoli), nepolare
(cauciucuri siliconice), intermediare, cu puni de hidrogen sau specifice (separarea amestecurilor
racemice). Fazele staionare sunt lichide sau solide.
Fazele staionare solide au rolul de a furniza un suport pentru faza mobil. Faza staionar solid
trebuie: s fie poroas, s fie inert i s nu recioneze cu componenii probei, s prezinte (la
suport) suprafee mari, s aib rezisten mecanic i termic ridicat.
Suportul solid este format din particule mici, sferice i uniforme. Prima umplutur utilizat
pentru o coloan cromatografic a fost constituit din pmnturi diatomice provenite din scheletele
unor plante monocelulare. Chromosorb P, W, G reprezint faze staionare prelucrate n flux de
Na
2
CO
3
dup calcinare.
O problem des ntlnit n GC a constituit-o adsorbia fizic a speciilor de analii polari sau
polarizabili, precum alcooli sau hidrocarburi aromatice, la suprafaa silicailor umpluturii coloanei
sau a pereilor coloanei. Adsorbia rezult n picuri deformate. S-a artat c adsorbia este o
consecin a gruprilor silanolice care se formeaz pe suprafaa silicailor prin reacie cu
umiditatea. O suprafa de silice hidrolizat apare n forma



Si
OH
O
Si
OH
O
Si
O
OH

Gruparea SiOH de la suprafaa suportului are afinitate foarte ridicat pentru molecule organice
polare i tind s le rein prin adsorbie. Materialele suport pot fi dezactivate prin silanizare cu
dimetilclororsilan (DMCS).
Si OH + Si Cl
CH
3
CH
3
Cl Si O Si
CH
3
CH
3
Cl
+ HCl

Dup splare cu alcool, al doilea Cl este nlocuit de o grupare metoxi.
Si O Si
CH
3
CH
3
Cl Si O Si
CH
3
CH
3
OCH
3
+ CH
3
OH
+ HCl

Suprafeele silanizate nc mai pot prezenta adsorbie rezidual care deriv din impuritile
oxizilor metalici din elementele diatomice. Impuritile pot fi nlturate prin splare cu acid.
Fazele staionare lichide se realizeaz folosind un lichid ales n funcie de natura amestecului
care trebuie separat. Se pot folosi faze: solide, lichide, nepolare, polare. Proprietile fazelor lichide
imobilizate ntr-o coloan gaz-lichid cromatografic includ: 1) volatilitate sczut (ideal, punctul de
fierbere al lichidului ar trebui s fie cu cel puin 100
o
C mai mare dect temperatura maxim de
operare a coloanei), 2) stabilitate termic, 3) nereactivitate chimic.
Fazele staionare lichide sunt formate din lichide nevolatile avnd o compoziie chimic foarte
variat (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numrul acestora a fost restrns la cele
care pot, prin sinteza, s formeze un film grefat pe partea intern a coloanei, preferai fiind
polisiloxanii i polietilenglicolii fiecare ntr-o varietate care sa permit modificarea polaritii
acestora.
Pentru a avea un timp rezonabil de reziden n coloan, o specie trebuie s prezinte un
anumit grad de compatibilitate (solubilitate) cu faza staionar. Polaritatea este efectul cmpului
electric n imediata vecintate a unei molecule i este msurat de momentul de dipol al speciei.
Fazele staionare polare conin grupri funcionale precum CN, -CO, i OH. Fazele staionare tip
hidrocarburi i dialchil siloxanii sunt nepolare n timp ce fazele poliesterice sunt foarte polare.
Analiii polari includ alcooli, acizi, amine, speciile de polaritate medie includ eterii, cetonele i
aldehidele. Hidrocarburile saturate sunt nepolare. n general polaritatea fazei staionare trebuie s
se potriveasc cu cea a componenilor probei. Cnd potrivirea este bun, ordinea eluiei este
determinat de punctele de fierbere ale eluenilor.
Materialul de plecare n obinerea fazelor staionare este polidimetilsiloxanului a crui structur
este:
Si R
R
R
O Si
R
R
O
Si
R
R n




Parte din polidimetilsiloxani au gruparea R de tip CH
3
i conduc la un lichid relativ nepolar. n
alte cazuri, o parte din gruprile metil sunt nlocuite de grupri funcionale precum fenil (-C
6
H
5
),
cianopropil (-C
3
H
6
CN) i trifluoropropil (-C
3
H
6
CF
3
), ceea ce duce la creterea polaritii lichidelor.
Carbowax este un polietilen glicol cu structura HO-CH
2
-CH
2
-(O-CH
2
-CH
2
)
n
-OH cu utilizri n
separarea speciilor polare.
11.3.5 Detectori folosii n cromatografia de gaz
Se clasific n:
- universali: dau rspuns pentru un numr foarte mare de componeni
- specifici: sunt aplicabili doar la anumii componeni cu anumite grupri funcionale.
Cei mai importani detectori sunt:
- detectori de conductibilitate termic - catarometru
- detectori de ionizare n flacr
- detectori de ionizare cu radiaii (detector cu captur de e
-
utilizai n analiza pesticidelor).
Catarometrul este un detector universal, sensibilitate 10
-5
g component/s (ceilali detectori pot
atinge sensibilitate de pn la 10
-15
g component/s). Este nespecific, nedestructiv i se poate cupla
cu alte instrumente cum ar fi spectrometrele de mas sau spectrofotometrele utilizate n infrarou.
Principiul de funcionare se bazeaz pe msurarea diferenei de conductibilitate termic dintre
component i eluent. Un fir metalic nclzit pierde cldura cu o vitez dependent de natura lui i a
gazului ce l nconjoar. Catarometru se compune din 2 celule de conductibilitate (una de msur
i una una de referin) i 2 rezistene (una fix i una variabil) legate n punte Winstone. n celule
sunt montate fire de Pt sau W. Prin cele 2 celule circul iniial doar gazul purttor (eluentul). Se
aplic un curent continuu de civa voli ce alimenteaz puntea. Cele 2 fire sunt nclzite la o
temperatur mai ridicat cu circa 80
o
C fa de pereii detectorului. Pentru aceasta este necesar un
curent de cteva sute de miliamperi. Cele dou rezistene fiind egale, instrumentul de msur va
indica linia de zero. n momentul n care din coloan iese un component (analit) el va prelua de la
fir o alt cantitate de cldur. Puntea se dezechilibreaz. Circuitul electronic este astfel conceput
nct s marcheze reechilibrarea punii, apoi printr-un semnal electric este amplificat i apoi
nregistrat sub forma unei cromatograme. Cele mai utilizate faze mobile n cazul catarometrului
sunt gazele cu mase mici cum ar fi hidrogenul i heliul.
Detectorii de ionizare au la baz un principiu de funcionare care se bazeaz pe creterea
curentului produs cnd substanele eluate care i traverseaz sunt ionizate. Aceti detectori sunt
ideali pentru coloanele capilare i satisfctoare pentru coloanele cu umplutur. Sunt detectori
foarte sensibili, volumul mort este foarte mic, rspunsul fiind aproape instantaneu. Sunt suficient
de stabili la fluctuaiile de vitez ale fluxului de gaz i la fluctuaiile de temperatur. Dau un rspuns
liniar n funcie de concentraie.



11.3.6 Aplicaii ale cromatografiei de gaz
Utilizat n separarea i analiza hidrocarburilor, acizilor i a esterilor, n aplicaii biomedicale.
Cuplat cu spectrometria de mas gaz cromatografia este utilizat n diagnosticarea i evoluia
tratamentelor unor boli. Se pot separa metabolii biologici volatili din urin, ser, plasm, fluid
cerebro spinal. Metoda poate fi utilizat i n studiul unor medicamente n plasm, urin, saliv, n
omogenat de ficat, n esuturi. Este utilizat i n studiul unor esene: de exemplu: cromatograma
poate fi asimilat cu amprenta buchetului unor vinuri, a componenilor unor parfumuri, esena de
ceai, cafea. Cromatografia gaz solid i-a gsit o mare aplicabilitate n separarea gazelor
permanente, a hidrocarburilor cu mas molecular mic, a izotopilor precum i a unor compui
foarte polari.

Tehnici Cromatografice

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tehnici Cromatografice

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA

Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notie curs 13-14

S-ar putea să vă placă și