Cromatografia si electroforeza

I. N oiu n i teoretice
1. Cromatografia
C rom atografia reprezint o tehnic d e separare a componentelor unui amestec, ntre dou faze:
una m obil i alta staionar, ca urmare a deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare i a antrenrii
compo-nentelor am estecului n m icare, cu viteze diferite, ocupnd astfel poziii diferite de-a lungul fazei
staionare. n acest mod componentele sunt separate i apoi identificate.
n funcie de natura fazelor se disting urm toarele tipuri de cromatografie:
Faza mobila
lichid
lichid
gaz
gaz

F aza staion ara

lichid
solid
solid
lichid

Denumire
lichid - lichid (LL)
lichid - solid (LS)
gaz - solid (GS)
gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se mpart n:

- metode bazate pe afinitatea diferit a com ponenilor (repartiie de faz, adsorbie, absorbie,
schimb ionic, afinitate);
- m etode bazate pe m rim ea diferit a com ponenilor (excluziune sferic).
Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe
coloan, cromatografia pe hrtie, cromatografia n strat subire, gaz crom atografia .
C rom atografia pe coloan C oloanele crom atografice sunt confecionate din sticl. P entru o
bun rezoluie se folosesc coloane lungi dar n condiiile n care se dorete separarea unei cantiti m ari de
substane se folosesc coloane cu un diam etru m ai m are.
n interiorul coloanei se introduce faza staionar ce trebuie, ntr-o prim etap, echilibrat cu
solventul de lucru.
Amestecul ce urm eaz a fi separat se pipeteaz n partea superioara a tubului.
S e conecteaz rezervorul cu solvent (faza m obil) la coloan i se ateapt pn ce are loc
separarea.
D atorit deplasrii fazei m obile de-a lungul celei staionare are loc antrenarea com pon entelor din
amestec ntr-o m icare descendent, n lungul coloanei astfel nct n tim p vo r ocupa poziii diferite.
F raciile sunt colectate n tuburi i apoi analizate.

Figura 4.1. C ro m ato grafie p e co lo an .

Cromatografia pe hrtie - reprezint una din cele mai simple metode de analiz. n aceast
m etod faza fix este reprezentat de o suprafa de hrtie special sau hrtie de filtru, iar faza m obil
(eluentul) de un lichid ce se deplaseaz de-a lungul fazei fixe datorit forelor de adeziune i forelor
gravitaionale. S e m parte n: crom atografie pe hrtie vertical (ascendent sau descendent) i orizontal
(Pfeiffer). n figura 4.2 se poate urm ri diferena dintre aceste m etode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hrtie vertical ascen d en t i d escend en t

Identificarea com puilor izolai n timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor,
fie calculnd tim pul de reinere al fiecrui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distana fa
de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notat cu X j) i distana pe care a migrat eluentul
(notat cu Y ):
Rj

Xj
Y

T im pul de reinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei m obile, natura substanei,
temperatur; se gsete tabelat pentru diferite substraturi, elueni i substane, de regul pentru
temperaturi de 200C.

2. Electroforeza
R eprezint m etoda de separare bazat pe migrarea sub influena cm pului electric a substanelor
ncrcate cu sarcin electric.
Eletroforeza poate fi folosit att n scop analitic (separarea com ponenilor i dozarea lor),
preparativ (obinerea unor com poneni n stare pur) dar i ca metod de studiu a proprietilor
superficiale ale unor celule sau organite celulare.
O particul ncrcata electric, cnd este dizolvat sau suspendat ntr-un mediu lichid, sub
influena unui cmp electric uniform, atinge o vitez constant de m igrare. S peciile ncrcate pozitiv se
vor ndrepta ctre catod, iar speciile ncrcate negativ ctre anod. V iteza de migrare a ambelor specii va fi
determinat de forele care acioneaz asupra lor. A ceste forte sunt:
- fora de atracie electroforetic: F1 Q E
- fora de frecare S tokes: F2 6 r v
- fora de frnare electroforetic: F3 Q r E
- fora F4 datorata efectului de relaxare
Im ediat dup aplicarea cm pului electric, sum a vectorial a acestor patru forte este egal cu zero
i viteza electroforetic devine constant (figura 4.3). Neglijnd efectul de relaxare i innd cont de
direciile celor trei forte se obine viteza electroforetic:
v

unde:

E
6

- = perm itivitatea absolut a m ediului

- = potenialul electrocinetic
- E = intensitatea cmpului electric
- = coeficientul de vscozitate
M obilitatea electroforetic se definete ca raportul dintre vitez i intensitatea cmpului electric:

v
E

Datorit ncrcrii electrice nete de la suprafaa particulelor biologice, n acest regiune se

organizeaz, se structureaz, un strat dublu electric alctuit dintr-o zon compact de grosime (a) i una
difuz, n care pentru sim plitate, suprafaa de dem arcare a particulei fa de mediu este considerat plan
(figura 4.3).
Cnd particula este pus n m icare de ctre cm pul electric aplicat, aceasta antreneaz o dat cu

ea un strat de lichid mai gros dect cel compact, notat cu (b). Planul care se afl la distana ba de
particul se num ete plan hidrodinamic de alunecare, iar potenialul n acest plan se num ete potenial

electrocinetic (). V aloarea potenialului electro -cinetic se poate determ ina indirect pe baza m surrii
m obilittii electroforetice a particulei n cmp electric.

Figura 4.3. F o rele ce acio n eaz asu p ra un ei p articu le n crcate cu sarcin electric suspendat ntr-u n m ed iu lichid . D istribu ia
ionilor n stratu l du blu electric d e la su p rafaa u n ei p articule scu fu nd ate ntr-un electrolit.

Metoda microscopic de electroforez - acest metod este singura tehnic disponibil pentru
determinarea vitezei electroforetice a particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine, microorganisme,
particule coloidale, etc. S e bazeaz pe observarea direct, la m icroscop a m igrrii particulelor suspendate
ntr-o soluie tam pon adecvat ca urm are a aplicrii unui cmp electric creat de un curent continuu.
P entru aceast tehnic este necesar o celul electroforetic (figura 4.4), prevzut cu doi
electrozi, un sistem de um plere i golire, ce se poate introduce n cm pul unui m icroscop. C elula poate fi
plan sau cilindric (capilar).

Figura 4.4. E lectro fo reza m icro sco p ic: cu va electro fo retic fo lo sit i im agin ea
o b servat la m icro sco p p revzu t cu m icro m etru o cu lar.

Electroforeza la joas tensiune E ste o m etod ce permite separarea proteinelor plasmatice.

Dispozitivul experimental folosit este prezentat n figura 4.5.
C a suport al electrolitului (al soluiei tam pon) se folosete att hrtie special pentru electroforez
(de tip Whatman) ct i m em brane de celuloz. D intre avantajele utilizrii m em branelor de celuloz
amintim, n primul rnd: rezoluia m ult m ai bun i un tim p de m igrare m ai m ic.

Figura 4.5. E lectro fo reza la jo as tensiune dispozitiv experimental.

D up separarea proteinelor urm eaz un procedeu de fixare i colorare. n primul rnd, mediul
suport este fixat prin introducere n etanol, m etanol sau acid, ori prin nclzire fcnd astfel proteinele
insolubile.
B enzile sunt colorate cu ajutorul unor colorani specifici proteinelor (albastru de brom fenol), se
spal n m ai m ulte bi cu acid acetic 2% i sunt trecute prin vapori de am oniac pentru regenerarea
colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza m ed iu l sup o rt du p p ro ced eele d e fixare i co lo rare.

D up aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor densitom etre prin reflexie, transm isie
sau com binate, ce perm it trasarea spectrelor caracteristice probelor oferind totodat cantitatea n g/100ml.
Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului um an este prezentat n figura 4.7.

Figura 4.7. E lectro fo reza p e u n m ed iu sup o rt acetat d e celu lo z a seru lu i u m an .

E ste cunoscut faptul c scderea album inelor survine de regul n toate disproteinem iile, fiind
ns m ai accentuat n cazul unui deficit n aportul de proteine, n deficitul de sintez (ciroz hepatic),
sau n pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).

C reterea 1, 2 globulinelor se nsoete de regul de o cretere a fibrinogenului i a

glicoproteinelor i de o accelerare a V S H -ului. O cretere m arcat a 2 globulinelor se ntlnete n
sindromul nefrotic.
M odificrile globulinelor au o im portan m ai redus, dar creterea globulinelor indic
prezena unor inflam aii cronice, sau sugereaz o proliferare reactiv sau tum oral a im unocitelor
productoare de im unoglobuline. S cderea globulinelor survine n sindrom ul nefrotic, m alnutriie.
T oate aceste m odificri au ca rezultat form e diferite ale spectrlor electroforegram elor analizate
(figura 4.8).

Figura 4.8. T ip u ri d e d isp ro tein em ie: (A ) In flam aie acu t, (B ) In flam aie cro n ic, (C ) S in d rom n efro tic, (D ) E ntero p atie
exu d ativ, (E ) C iro z h ep atic, (F ) M ielo m m u ltip lu , (G ) H ip o gam aglo b u lin em ie.

Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezint o m etod de separare a particulelor cu

puncte izoelectrice diferite ntr-un gradient de pH sub aciunea unui cm p electric om o gen.
Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde valorii pH-ului la care sarcina
electrica net este nul.
Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana n care se realizeaz un gradient natural de
pH prin utilizarea unor amfolii transportori cu urm toarele proprieti: bun capacitate de tamponare i
bun conductivitate la punctul izoelectric, mas molecular mic, solubilitate bun la punctul izoelectric,
absorbie mic a luminii peste 260nm, nu reacioneaz chim ic cu com ponenii am estecului ce urm eaz a fi
descompus.
C ei m ai utilizai sunt acizii poliam inopolicarboxilici avnd m asa m olecular ntre 300-1000D i
puncte izoelectrice situate n domeniul de pH=3-10.