FIZIOLOGIA BACTERIILOR. METABOLISMUL MICROBIAN.

NUTRIIA I RESPIRAIA BACTERIILOR

Fiziologia bacterian studiaz viaa i activitile bacteriilor nutriia, respiraia, creterea i
multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor.

Metabolismul bacterian reprezint ansamblul de reacii biochimice care au loc n

celula vie.

Catabolism reacii chimice de descompunere a substanelor complexe n elemente

simple, nsoit de degajarea energiei (metabolism energetic)

Anabolism reacii chimice de sintez a substanelor complexe din elemente simple,

necesit energie (metabolism constructiv, de sintez)

Particularitile metabolismului bacterian:

Este un metabolism necompartimentat , toate procesele metabolice se desfoar intr-o

singur celul

Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci metabolice (bacteriile se adapteaz

rapid la condiiile mediului)

Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)

Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de

precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism)
n toate reaciile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele
Enzimele bacteriene. Caractere generale:

Substane proteice

Active n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9)

Specificitate de substrat i de aciune (reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip de

reacie)

Specificitatea este determinat de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul

de pe substrat

Nu se modific n cursul reaciei

Clasificarea enzimelor

Constitutive (permanente)

Inductive (adaptive), se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza)

Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei

catalizate

Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)

Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze,

izomeraze, ligaze)

Dup impactul asupra ma/o

Enzime metabolice

Enzime de patogenitate, responsabile de modificri patologice ale esuturilor, celulelor

ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, etc.

Importana practic a studierii enzimelor

Rol n identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea

biochimic specific a bacteriilor)

Unele substane chimice, antibiotice interfereaz cu activitatea unor enzime, inhibnd

creterea bacteriilor (tratament)

Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de

producerea leziunilor n esutul gazdei)

Aplicarea industrial a enzimelor

^ NUTRIIA BACTERIAN

Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare
pentru metabolism.

Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv.

Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa MCP pentru a fi antrenate n

metabolismul celulei. Se obin dinalimente prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau
dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelular (la bacteriile G- n spaiul periplasmic)
Nutrienii servesc n calitate de material de construcie i surs de energie pentru sinteza
compuilor i meninerea vieii bacteriei.
^ Transportul transmembranar
1. Difuzie simpl (conform gradientului de concentraie, fr utilizarea energiei): O2, CO2,
acizi grai, nutrieni liposolubili
2. Difuzie facilitat (conform gradientului de concentraie) permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice
- permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de concentraie, necesit energie). Particip
permeazele i alte proteine de transport specifice. Nutrienii nu suport modificri.
4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar;
necesit energie

Substanele care au ptruns n citoplasm sunt descompuse de ctre enzimele

bacteriene conform cilor metabolice proprii fiecrei specii bacteriene (ex.: EmbdenMeyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine
energie i precursori care vor fi antrenai n biosintez (anabolism).

Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

^ Necesitile nutritive ale bacteriilor

Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante; S, P, Fe, Ca, Mg,

K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo.

Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali.
- Necesiti specifice. Bacteriile auxotrofe solicit suplimentar compui organici preformai
(factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice,
vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii.
Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon

Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene)

Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai,
alcooli, etc)

Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei
organice)

Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndule prejudicii

Bacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie
sau moarte.

Surse de azot

AA sau acizi nucleici

Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic

Surse de substane minerale:

S - din AA, sulfuri, sulfai;

P - din fosfai;

K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale;

Zn, Cu, Mn, Mo din ap

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie

Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint)

Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxidoreducere. Ele necesit un substratdonor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor
de hidrogen. n transfer particip transportori intermediari de electroni (lanul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)

Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o substan anorganic

Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o substan organic (glucoza,

lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe
Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de
H:

Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de
transport al electronilor asociat MCP. Produs final H2O sau H2O2 .

Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S).

Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul,
sulfura (n prezena O H2O2).

Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant

extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a
substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de
la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, fermentare
alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2,
dar fr intervenia acestuia.

^ Conservarea energiei

O parte din energia eliberat se pierde sub form de cldur sau poate fi utilizat direct
sub form de energie electro-chimic (fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor,
transport transmembranar) sau stocat n compui chimici macroergici bogai n
energie: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativ sau fosforilare la
substrat),fosfoenol-piruvat, acetilfosfat i acetil-CoA.

n procesele de respiraie se elimin mai mult energie dect din fermentaie (n

glicoliz dintr-un mol de glucoz - 38 moli ATP, prin fermentaie - 2 moli ATP). n
procese de fermentare se formeaz deeuri rejetate de ctre celul.

Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon

Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2)

Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org)

Bacterii chemoautotrofe

Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)

^ CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR

Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca

rezultat al proceselor de sintez

Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum

Diviziune binar

Inmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)

Autoreproducere (virusuri)

Spori (micete)

Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune

Faza C replicarea ADN

Faza G de laten, segregarea cromozomilor

Faza D de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea
intervin in momentul cnd celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG).

Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez

maxim)

Creterea bacteriilor in laborator cultivare. Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din
medii naturale (prelevate patologice, alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:

Identificarea mi/o (scop de diagnostic)

Testarea sensibilitii lor fa de antibiotice

Obinerea unor produi de biosintez (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni

steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor,
probioticelor...

Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate.

Condiiile (principiile) de cultivare

Surs nutritiv adecvat

Surs de energie

Ap

Temperatura potrivit

pH adecvat

Concentraie optim a oxigenului i a CO2

Presiune osmotic adecvat

Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. In raport cu
temperatura optim deosebim:

Bacterii psichrofile t optim 10-20 grade C. Cresc i la 0 gr C.

Bacterii mezofile optimum 30-37 grade C (limite 15-45 gr C)

Bacterii termofile optimum 50-60 grade C (pn la 95 grC)

Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 gr C)

pH

Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5

Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)

Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotic

Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu

izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene

Bacterii halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni

(Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul

Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob

Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin

energia prin respiraie sau fermentaie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)

Bacterii strict anaerobe cresc doar in absena O2. Obin energia prin fermentaie sau
uneori respiraie anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-,

sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, superoxid
dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Bacteroides

Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin
fermentaie, posed peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)

Bacterii facultativ anaerobe cresc in orice condiii, obin energia prin respiraie sau
fermentaie

Mediile de cultur soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizicochimice necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea)
bacteriilor, testarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene.
Cerinele fa de mediile de cultur

S asigure necesitile nutritive i energetice ale bacteriilor

Umiditate optimal

pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)

Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10)

S fie izotonice (0,5% NaCl)

S fie sterile i transparente

^ CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR

Dup provenien

Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser,
lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia
lor chimic precis nu poate fi controlat

Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu

exactitate

Semisintetice

Dup consisten

Medii lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor

lor (antibiotice, enzime, toxine)

Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge
roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri este utilizat
pentru izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n pant) pentru acumularea
culturilor pure

Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii

biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie

A. Medii uzuale (universale, simple)

Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)

Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)

Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)

Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)

Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min
B. Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea
mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser
coagulat corinebacterii, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice
particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin
- stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)
Mediile de imbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru imbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).

Etap premergtoare insmnrii pe medii selective.

Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )

Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella

Bulion cu selenit Shigella, Salmonella

Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae

Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi

III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene in baza

activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem:
Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
^ Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor zaharolitice
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
^ Studierea proprietilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de
Bi)
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae (colonii
negre)
^ Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Studierea proprietilor hemolitice

Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat)
In cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar
^ Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
^ Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii
mediului din rou in galben.
In pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), in coloan-glucoza (fermentare).
Producerea H2S innegrirea mediului
Medii DD pentru identificarea final a culturii pure
- irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite
glucide i indicator.
Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)

Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori

IV. Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, LoewensteinJensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi)
V. Medii de transport destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi
examinat ulterior.
Menine in via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor.

Mediul cu glicerin 30%

Soluie tampon-fosfat

Soluie NaCl 3%

Mediul Cary-Blair

Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru
anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii

(inoculum) se introduce intr-un mediu de cultur (insmnare, inoculare), care
ulterior va fi incubat in termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).

In timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur

bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore

Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii)

Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite

Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n

cultur pur, care va fi studiat ulterior.

Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor

In mediu lichid
- Turbiditate uniform
- Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia)

Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus

anthracis)

In mediu solid formarea coloniilor

Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de
celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid

Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util in identificare)

^ Caracteristica coloniilor
Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc
Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc
Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat
Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc
Densitate opac, transparent, etc
Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid

^ Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase
Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas
Caracterele de cultur ale bacteriilor reprezint exigenele nutritive (medii, temperatur, pH,
aerare, etc), timpul apariiei culturii i manifestarea creterii pe medii lichide i solide
Dinamica multiplicrii bacteriilor in culturi
In funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

Culturi discontinue/periodice

Culturi continue

Culturi sincrone

Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de

culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic
Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue
I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc
in dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei,
condiiile mediului, etc
^ II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba
evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile
pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore
III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii
rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor
toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru
identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore
^ IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv
Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i imbogit
cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz in chemostate sau turbidostate,
cultura aflndu-se permanent in faza exponenial. Se utilizeaz in microbiologia industrial.
In intestin culturi continue.
Culturi sincrone culturi in care bacteriile se divid in acelai timp
^ EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Examenul bacteriologic const in inocularea (insmnarea) prelevatelor pe medii de cultur
pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate la
sensibilitate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate.
Examenul bacteriologic const din cteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea)
probelor biologice pn la remiterea rezultatelor.
^ Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului)

1.Prescrierea investigaiei (in funcie de datele examenului clinic i paraclinic). In ordonan

se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul,
data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.
2.Prelevarea probelor

Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de
eliminare ale agentului patogen) i momentul prelevrii

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni:

Secreii rino-faringiene, bronice

Sput

Puroi

Exsudate, transsudate

Snge

LCR

Urin, secreii genitale

Mase fecale, bil, suc duodenal

Bioptate, punctate

Material cadaveric, etc

Materiale de examinat din mediul extern:

Ap

Alimente

Sol

Aer

Lavaje

Vectori, etc

-Modul de prelevare (recoltare)

In recipiente sterile

Respectnd regulile de autoprotecie

La debutul bolii

Pn la administrarea antibioticelor

Cantitate suficient
Transportarea

Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup

necesitate

In ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

In fia de insoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura

prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)

^ EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE

Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului,

etc) - orientare in diagnostic

Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare,

omogenizare, centrifugare, etc)

Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...)

prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE

Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un
produs patologic. O colonie separat constituie o cultur pur.

^ Tehnici utilizate:

Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (insmnare in striuri
paralele, insmnare in cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii).

Metoda diluiilor logaritmice a inoculului in geloz topit i rcit la 50 gradeC (10-1,

10-2,...), apoi turnate in cutii Petri sau eprubete.
Incubare in termostat la 37 grade C, 18-24 h (in funcie de TG).
Metode speciale de izolare in culturi pure:

A bacteriilor sporulate: inclzirea prealabil a prelevatului 80 grade C 20 min

A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea

ulterioar cu o baz

A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: imbogirea prealabil a florei

patogene utiliznd medii de imbogire

A bacteriilor cu virulen inalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de

laborator sensibile

II etap ACUMULAREA CULTURII PURE

Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc)

Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea puritii

culturii

Repicarea coloniilor suspecte pe geloz in pant (inclinat) pentru acumularea culturii

pure

Termostat, 37 grade C, 18-24 ore

III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE

Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)

Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei
culturi pentru a o include intr-o familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele:

Morfologice

Tinctoriale

De cultur

Biochimice

Antigenice (seroidentificarea)

De patogenitate

Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)

Sensibilitatea la antibiotice

^ STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR

Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc)
Activitatea proteolitic

Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat,

peptonizarea laptelui, etc)

Evidenierea enzimelor ce intervin in degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,

desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3,
indol, etc
^ Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fier de culoare neagr in mediile multitest
Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru imbibat cu acetat de Pb
deasupra BP in care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb innegrete hrtia)
^ Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) benzi de hrtie imbibate cu acid
oxalic. In prezena indolului indicatorul vireaz in roz.

Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz in albastru.

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)
(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz)
^ Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator)
Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu
reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
^ Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac in jurul
coloniilor
Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac in jurul coloniilor (precipitarea
acizilor grai)
Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar in jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 grade C, 18-24 h
^ Identificarea rapid
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material)
Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un
mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian
testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor
particulari.
Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat
^ IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA
RSPUNSULUI

Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a

gsi asemnri.

Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium

diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la .....

^ EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene,

neclostridiene)
Condiia principal cultivare in absena oxigenului
1.Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat 100 grade C, 20 min, rcit, acoperit
cu vazelin; insmnarea in geloz in coloan)
2. Crearea condiiilor de anaerobioz

Metoda fizic utilizarea anaerostatului

Metoda chimic in exicator se introduc substane ce fixeaz oxigenul

(pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor

Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor

Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (in seringi, utiliznd medii speciale)
I etap IMBOGIREA ANAEROBILOR

Insmnarea prelevatului in 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat

Inclzirea unui tub la 80 grade C, 20 min distrugerea florei nesporogene

Incubarea la 37 grade C, 24-48 h (va avea loc inmulirea anaerobilor)

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de

ficat, etc

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (insmnarea a 0,1 ml din
mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea in
anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

Metoda Weinberg diluii succesive ale culturii in geloz glucozat lichefiat i

aspirarea in tuburi lungi i inguste, inchise ermetic. Incubarea in termostat, 24 h

III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE

Studierea macroscopic a coloniilor

Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte

Repicarea in mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure

Incubarea in termostat, 24 h

IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram)

Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz)