REZUMAT

Studiile filogenetice au drept scop reconstruirea istoriei evolutive a organismelor

vii. Termenul de filogenie (phylogenèse) provenit de la cuvintele grecesti «phulon» -
rasă si «genetikos», genesis – origine a fost introdus de către Haeckel în 1860, care l-a
definit ca fiind «istoria dezvoltării paleontologice a organismelor prin analogie cu istoria
dezvoltării individuale». Mult timp, construcţia arborilor filogenetici s-a bazat pe folosirea
caracterelor morfologice, anatomice şi paleontologice. Primul arbore filogenetic al
vertebratelor stabilit de Zuckerkandl şi Pauling (1960) folosind date moleculare este
aproape identic cu cel obţinut utilizând caracterele clasice.
O dată cu evoluţia tehnicilor de biologie moleculară şi cu punerea la punct a
tehnicii de secvenţializare de către Sanger (Sanger and colab., 1977) s-a produs o
adevărată revoluţie privind utilizarea secventelor ADN în filogenie deoarece s-a
considerat ca acizii nucleici sunt mult mai informativi decât proteinele.
Analiza secvenţelor nucleotidice ale perechilor de gene omoloage furnizează
informaţii mai complete decât secvenţele în aminoacizi ale proteinelor corespunzătoare,
datorită degenerescenţei codului genetic. De asemenea, ca urmare a utilizării pe scară
largă a tehnicii de amplificare PCR, materialul genetic poate fi foarte uşor multiplicat şi
secvenţializat. Introducerea acestor noi tehnici poate fi considerată etapa cheie care a
determinat o dezvoltare fulminantă a studiilor de filogenie moleculară.
Producerea, publicarea si introducerea unui număr mare de secvenţe genetice în
bazele de date internaţionale au dus la dezvoltarea bioinformaticii aplicate acestui
domeniu materializata printr-o ofertă largă de programe necesare alinierii si analizei
secventelor si construii arborilor filogenetici.

Capitolul I - Familia Cyprinidae – încadrare sistematică, distribuţie geografică,

caractere morfologice
Peştii sunt un grup foarte divers de vertebrate a căror organizare în ordine, familii
şi genuri a fost realizată tradiţional prin studii morfologice de-a lungul unui secol.
Termenul de “peşte” este utilizat pentru a defini cordatele, care nu sunt
tetrapode. Spre deosebire de păsări şi mamifere, peştii nu formează o singura cladă, ci
un grup de taxoni parafiletic, care include: Myxini, Cephalaspidomorphi,
Chondrichthyes, Actinopterygii, Sarcopterygii.

1
 Rezum at

I.1. Relaţii filogenetice la ciprinide: implicaţii biogeografice şi de clasificare

Subclasa Actinopterigya grupeaza peşti ale căror înotătoare perechi sunt
adaptate la înot. Ele au baza lată (tip euribazal), nu sunt cărnoase şi nu prezinta
proeminente de tip peduncul. Radiile sunt aşezate uniseriat şi au dispoziţie radiară.
Subclasa cuprinde majoritatea peştilor actuali care au fost grupaţi în trei supraordine:
Chondrostei, Holostei, Teleostei. Supraordinul Teleostei conţine cei mai evoluaţi peşti,
având scheletul complet osificat. Corpul este acoperit cu solzi cicloizi şi ctenoizi,
înotătoarea caudală este homocercă, iar vezica înotătoare este necompartimentată.
Acest supraordin cuprinde 90% din peştii actuali.
Peştii din familia Cyprinidae (Vertebrata: Osteichthyes: Teleostei) au corpul de
forma variabilă, acoperit cu solzi cicloizi, rar nud cu linia laterală completă sau
incompletă. Înotatoarele dorsală şi anală de lungime variabilă prezinta fiecare cate 2- 4
radii simple. Marginea fălcilor superioare este formată exclusiv din intermaxilare. Oasele
gurii sunt fără dinţi. Oasele faringiene bine dezvoltate, falciforme, sunt prevăzute cu
dinţi dispuşi pe 1-3 rânduri, de formă variabilă. Gura este lipsită de mustăţi sau cu cel
mult două perechi de mustăţi. Înotatoarele ventrale au 2 radii simple şi 5-8 radii divizate.
Înotatoarele pectorale au o radie simplă şi 13-17 radii divizate. Înotatoarea caudală este
întotdeauna scobită. Vezica cu aer este prezentă la toate speciile. La unele genuri est-
asiatice înrudite cu Gobio aceasta este redusă şi învelită într-o capsulă osoasă.

I.2.Date generale privind clasificarea ciprinidelor

Cyprinidae este cea mai mare familie de peşti de apă dulce şi este raspandită în
întreaga lume cu excepţia Australiei şi Americii de sud (Nelson 1994). Cuprinzând 2010
specii şi 210 genuri răspândite într-o varietate largă de habitate, Cyprinidae reprezintă
un grup excelent pentru studii biologice. În prezent, Cyprinidae sunt crescute si in
sistem intensiv (acvacultura) în scopul utilizării lor în studii genetice şi fiziologice. Totuşi,
relaţiile dintre principalele linii filogenetice ale Cyprinidae rămân încă insuficient
cunoscute şi chiar monofilia întregii familii este uneori pusă la îndoială (Howes,1991).
În ultimii ani, eforturile au fost îndreptate în scopul clarificării relaţiilor dintre
Cyprinidae, prin tehnici moleculare (Briolay şi colab. 1998; Gilles şi colab. 1998, 2001;
Zardoya şi Doadrio 1999, Mayden, R.L. and colab., 2007). Gilles şi colab (2001) au
analizat regiunea de control a genei ADN ribozomal 16S şi gena pentru citocromul b de
la ciprinide europene şi au sugerat urmatoarea încadrare: Rasborinae în poziţie bazală,
urmat succesiv de Cyprininae, Tincinae, Acheilognathinae, Gobioninae şi Leuciscinae.

2
 Rezum at

Chuna şi colab (2002) au analizat relaţiile filogenetice ale ciprinidelor eurastiatice şi

americane folosind secvenţele citocromului b şi au identificat 5 mari linii: 1) Leuciscinele
europene şi Phoxinusul nord-american; 2) Gobioniniele europene şi genul
Pseudorasbora; 3) grupuri asiatice (cultrine, acheilognathine, gobionine, xenocyprinine);
4) genul Abbottina, Sinocyclocheilus, Acrossocheilus; 5) cypirinine, barbine, labeonine.

I.3 Caractere morfologice şi distribuţia geografică a ciprinidelor studiate

Peştii din familia Cyprinidae (Vertebrata: Osteichthyes: Teleostei) au corpul de
formă variabilă, acoperit cu solzi cicloizi, rar nud cu linia laterală completă sau
incompletă. Înotătoarele dorsală şi anală au lungime foarte variabilă cu 2- 4 radii simple.
Marginea fălcilor superioare este formată exclusiv din intermaxilare. Oasele gurii sunt
fără dinţi. Oasele faringiene bine dezvoltate, falciforme, sunt prevăzute cu dinţi dispuşi
pe 1-3 rânduri, de formă foarte variabilă. Gura este lipsita de mustăţi sau cu cel mult
două perechi de mustăţi. Înotătoarele ventrale au 2 radii simple şi 5-8 radii divizate.
Înotatoarele pectorale au o radie simplă şi 13-17 divizate. Înotătoarea caudală este
întotdeauna scobită. Vezica cu aer este prezentă la toate speciile şi la unele genuri est-
asiatice înrudite cu Gobio este redusă şi învelită într-o capsulă osoasă. Familia
Cyprinidae cuprinde peste 200 genuri grupate în zece subfamilii imprecis delimitate, cu
circa 2000 specii. În subregiunea euromediteraneana trăiesc 33 de genuri, dintre care
doar 20 sunt prezente în bazinul Dunării.
În continuare au fost descrise numai speciile de ciprinide studiate: Rutilus rutilus,
Gobio gobio, Phoxinus phoxinus, Barbus meridionalis, Cyprinus carpio, Carassius
auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Carassius carassius, Leuciscus cephalus,
Leuciscus borysthenicus celensis, Tinca tinca, Abramis brama, Abramis bjoerka,
Phoxinus phoxinus, Scardinius erytrophthalmus şi ciprinide de origine asiatică:
Aristichthys nobilis, Hypophtalmychthys molitrix, Ctenopharingodon idella.

Capitolul II - Evoluţie şi filogenie moleculară

O simplă analiză a fiinţelor vii relevă existenţa a numeroase puncte comune în
ceea ce priveşte organizarea anatomică, fiziologică şi biochimică a organismelor lor.
Încă din Antichitate omul a fost tentat sa ordoneze natura în funcţie de asemănările şi
diferenţele pe care le-a observat la organismele din lumea vegetală şi animală, dând
naştere la diferite clasificări ale speciilor. Chiar dacă unele specii se aseamană mai mult
şi altele mai puţin, unitatea lumii vii nu a fost niciodata pusă în discuţie. Mai mult,

3
 Rezum at

această unitate a fost întărită odată cu descoperirea, în secolul al XIX-lea, a celulei -

unitatea vie a tuturor organismelor şi apoi a moleculei de ADN - suportul eredităţii
comun în întreaga lume vie.
Fenomenul evoluţiei permite explicarea acestor asemănări prin existenţa de
corelaţii genealogice între toate formele de viaţă. Astfel, organismele se aseamănă,
deoarece ele deţin caractere moştenite de la un ancestru comun. Toate fiinţele vii
funcţionează pe aceleaşi baze moleculare (ADN, ARN, proteine) folosind acelaşi cod
genetic. Diferenţele dintre specii şi variaţiile între indivizi în cadrul aceleiaşi specii sunt
în esenţă datorate diferenţelor din secvenţa genelor şi din structura cromozomilor,
diferenţe provocate de mutaţii şi rearanjamente cromozomiale ocazionale. Aceste
evenimente aleatoare, care determină apariţia de indivizi ale căror gene sunt uşor
diferite de cele ale părinţilor lor sunt destul de rare dar în acelaşi timp suficiente pentru
a determina variabilitatea, care reprezintă sursa evoluţiei (Buican D., 1997).

II.1. Filogenie şi clasificare filogenetică

Filogenia reprezintă studiul formării şi evoluţiei organismelor vii în vederea
stabilirii gradului de înrudire al acestora. Filogeneza este termenul cel mai folosit pentru
a descrie genealogia unei specii, a unui grup de specii, dar şi pentru a defini un nivel
intraspecific şi genealogia dintre populaţii şi indivizi.
Clasificarea filogenetică este un sistem de ierarhizare a fiinţelor vii. Aceasta tinde
să înlocuiască clasificarea tradiţională bazându-se numai pe rapoartele de apropiere
evolutivă dintre specii.
Metodele filogenetice pot fi utilizate pentru: i) studiul evoluţiei familiilor de gene
(Zhang & Nei 1996, Johnston et al. 1998a, 1998b); ii) evaluarea ratelor de evoluţie
dintre diferite linii (Kocher et al. 1989, Pamilo & O’Neill 1997); iii) datarea unor
evenimente din istorie (Cann et al. 1987, Klicka & Zink 1997); iv) studiul coevoluţiei
relaţiilor gazdă-parazit (Hafner et al.1994, Page et al. 1998); v) clarificarea surselor
maladiilor epidemice (Zhu et al. 1998, Taubenberger et al. 1997).
Filogenia moleculară presupune utilizarea macromoleculelor biologice pentru a
obţine informaţii asupra istoriei evolutive a fiinţelor şi asupra legăturilor lor de înrudire,
adică filogenia lor.
Macromoleculele biologice cum sunt ADN, ARN sau proteinele sunt compuşi
fundamentali pentru toate fiinţele. Aceste molecule polimerice sunt formate din
înlănţuirea unor unităţi moleculare a căror succesiune constituie secvenţa primară.

4
 Rezum at

Astfel, structura ADN poate fi considerată ca un text scris într-un alfabet cu patru litere:
adenina (A), timina (T), guanina (G) şi citozina (C) în funcţie de baza azotată care intră
în structura nucleotidelor componente. Proteinele pot fi privite ca un text scris într-un
alfabet de 20 de litere care sunt cei 20 de aminoacizi din structura lanţului polipeptidic.
Înrudirea fiinţelor analizate este astfel reflectată de similitudinea secvenţelor
primare. Secvenţele primare ale acizilor nucleici şi proteinelor au fost accesibile după
secvenţializarea proteinelor şi după punerea la punct a metodei de amplificare PCR şi a
secvenţializării acizilor nucleici. Consecinţa implementării acestor tehnici a constituit-o
remanierea viziunii tradiţionale asupra clasificării organismelor. În ciuda problemelor pe
care le-a avut, filogenia moleculară a permis stimularea ştiinţelor taxonomice şi o mai
bună înţelegere a evoluţiei anumitor caractere morfologice ale organismelor. De altfel,
filogenia moleculară poate fi asociată şi cu domenii cum sunt medicina legală sau
testarea genetică.

II.2. Ce molecule pot fi utilizate?

Diferitele regiuni din structura ADN şi a proteinelor codificate din acestea nu
evoluează toate cu aceeaşi viteză. De fapt, anumite gene suferă constrângeri evolutive
puternice deoarece ele asigură funcţii foarte importante în organismele lor. În acest
context, un număr foarte redus de mutaţii la nivelul lor limitează drastic şansele de
supravieţuire a purtătorilor lor. Alte regiuni, cum sunt genele care codifică pentru
proteinele sistemului imunitar evoluează cu viteze importante şi constituie marker care
permit studierea relaţiilor evolutive la scară redusă. Spre deosebire de acestea, studiile
relaţiilor dintre toate organismele vii folosesc markeri de tip ARNr 12S şi 16S
(procariote) sau 18S şi 28S (eucariote). Aceste molecule de ARN intră în structura
ribozomilor, organite responsabile de procesul de traducere a ARNm în proteine a căror
funcţie este esenţială vieţii. Ameliorarea metodelor de secvenţializare permite creşterea
numărului de markeri disponibili pentru a realiza studii de filogenie moleculară. Astfel,
genoamele mitocondriilor şi cloroplastelor conţin mai mult de o duzina de gene care pot
fi utilizate pentru a studia relaţiile dintre animale şi plante. Mai recent, creşterea
numărului de date despre structura genoamelor şi transcriptoamelor care sunt complet
disponibile a făcut posibilă studierea ansamblului genelor a căror omologie poate fi
verificată.

5
 Rezum at

II.3. Bioinformatica în slujba filogeniei moleculare

Bioinformatica corespunde abordării “in silico” a biologiei tradiţionale, adică
utilizarea de programe informatice pentru a analiza datele de biologie moleculară.
Mijloacele informatice sunt în mod normal folosite pentru stocarea şi gestiunea datelor,
dar şi pentru interpretarea acestor date.
Pentru analiza datelor experimentale reprezentate de secvenţele biologice, acest
aport informatic priveşte în principal trei aspecte: i) compilarea şi organizarea datelor
pentru crearea de baze de date generalizate şi specializate; ii) analize sistematice pe
care trebuie sa le efectuăm utilizând secvenţele în scopul identificării şi caracterizării
funcţionalităţii sau a unui element biologic interesant (identificarea unui ORF – open
reading frame), identificarea de similitudini între secvenţele identificate şi cele din
bazele de date; iii) elaborarea de strategii pentru a obţine informaţii suplimentare.
Principalele etape în abordarea bioinformatica: I. Achiziţia de date; II. Arhivarea;
III. Analiza secvenţelor şi structurilor; IV. Interpretarea biologică; V. Predicţia
funcţională; VI. Analiza secvenţelor; VII. Bazele de date.
Studiile de bioinformatică au recurs la trei metode complementare: 1. Metode
comparative; 2. Metode statistice; 3. Modelare.

II.3.1. Baze de date în biologie

Există un mare număr de baze de date de interes biologic. Într-o manieră
generală, se pot diferenţia baze de date generale şi baze de date specializate. Primele
baze de date au apărut in anii 1980 sub coordonarea unor importante organisme
fondatoare. Astfel, in Europa, EMBO (European Moleculary Biology Organisation) a
creat o bancă de secvenţe de acizi nucleici numita EMBL (European Moleculary
BiologyLibrary). În USA, NCBI (National Center for Biotechnology Information) a creat
GenBank tot pentru secvenţele de acizi nucleici. În acelaşi timp au fost create şi bănci
de date pentru proteine PIR-NBRT şi SWISSPROT (baza de date privind structura
proteinelor creată în 1986 de Amos Bairoch (1993, 1994) de la Swiss Institute of
Bioinformatics şi European Bioinformatics Institute.

II.3.1.1. Baze de date generale

Ultimii 20 de ani s-au caracterizat printr-o explozie a studiilor secvenţelor ADN la
diferite specii datorită progresului tehnologic şi a proiectelor de secvenţiere a genomelor
diferitelor specii de plante şi animale. Cele mai mari baze de date care conţin informaţii

6
 Rezum at

generale sunt Genbank, EMBL sau DDBJ care sunt proiecte internaţionale şi lideri în
domeniu:
EMBL (European Molecular Biology Library) deţinută de European Bioinformatics
Institute din Cambridge, UK (Stoesser et al. 2003)
GenBank deţinută de National Center for Biotechnology Information din
Maryland, USA (Benson et al. 2003);
DDBJ (DNA Databank of Japan) deţinută de National Institute of Genetics din
Mishima, Japonia (Miyazaki et al., 2003).
II.3.1.2. Baze de date specializate
II.3.1.3. Difuzia şi utilizarea băncilor de date
II.3.1.4. Interogarea bazelor de date
Există mai multe sisteme adaptate diferitelor tipuri de baze de date (EMBL,
GenBank, etc) care permit interogarea simultana a mai multor criterii simple. Pentru a
simplifica si sintetiza modalitatile de acces prin diferite programe informatice identificăm
patru categorii de comenzi posibile care să permita un acces usor: i) selecţia -
comanda care permite constituirea de liste de secvenţe care corespund sub-
ansamblelor băncilor. ii) definirea – comanda care permite caracterizarea cu mai multa
precizie a criteriilor de selecţie folosite. iii) informaţia – comanda care permite editarea
unei părţi a informaţiei în corelaţie cu secvenţele selecţionate; iv) gestiunea – conţine
comenzi care permit modificarea, extracţia sau suprimarea din lista de secvenţe deja
selectionate.

II.4. Arborii filogenetici

Arborii filogenetici sunt reprezentări
grafice care definesc relaţiile de înrudire
dintre entităţi care se presupune ca au
un ancestru comun. Arborii filogenetici
sunt constituiţi din noduri (interne şi
externe) şi ramuri. Aceştia pot avea sau
nu rădăcină în funcţie de posibilitatea de
a identifica strămoşul comun al tuturor
ramurilor. Fiecare dintre nodurile
Figura.1. Componentele unui arbore arborelui reprezintă un stramoş comun
filogenetic pentru descendenţii săi. O cladă este

7
reprezentată de un grup taxonomic care cuprinde un sinugur ancestru comun şi toţi
descendenţi acestuia. Nodurile externe reprezintă unităţiile taxonomice operationale –
OTU (Operational Taxonomic Unit), iar ramurile definesc relaţiile dintre taxe în termen
de descendenţă (fig.1). Nodurile interne reprezintă ancestorii ipotetici pentru fiecare
taxa.
Există mai multe tipuri de arbori (dendograme) conform metodelor după care au
fost construiţi: i) fenograma – o dendogramă obţinută prin metode de distanţă unde
relaţiile dintre taxoni exprimă gradele de similitudine globală; ii) cladograma – o
dendogramă exprimând relaţiile filogenetice dintre taxoni şi construita plecand de la
analiza cladistică; iii) filograma – o cladogramă dată de lungimea braţelor şi
proporţională cu numărul de schimbări evolutive.

II.4.1. Etape în construcţia unui arbore

Realizarea unei filogenii are cel puţin două aplicaţii majore: i) reconstruirea
istoriei evolutive a taxonilor, caracterelor şi genelor; ii) analiza caracterelor şi a vitezei
de evoluţie;
Arborii filogenetici sunt structurile de bază necesare pentru a înţelege clar
diferenţele dintre şi între specii, şi de a analiza statistic aceste diferenţe. Bioinformatica
utilizează metode informatice pentru studiul si analiza informatiilor biologice. În ultimii
ani bioinformatica a dezvoltat diferite metode informatice pentru: i) studiul structurii,
funcţiei şi evoluţiei genoamelor, genelor si proteinelor; ii) managementul şi analiza
informaţiei biologice furnizată de experimente genomice; iii) construirea de arbori
filogenetici (de evoluţie) care sa identifice filiatia speciilor si dezvoltarea lor de-a lungul
vremurilor.

II.5. Metode de aliniere a secvenţelor

În termeni bioinformatici alinierea secvenţelor reprezintă maniera de aranjare
(dispunere) a componentelor (nucleotide, aminoacizi) din structura ADN, ARN sau
secvenţele primare ale proteinelor pentru a identifica zonele de concordanţă care traduc
similitudinile sau deosebirile de natură istorică. Secvenţele aliniate sunt tradiţional
reprezentate sub forma liniilor unei matrici. Spaţiile libere sunt astfel dispuse încât să
permită alinierea caracterelor comune pe coloane succesive.
Alinierile sunt necesare pentru: i) identificarea situsurilor funcţionale; ii) predicţia
structurii secundare sau terţiare şi funcţiei sau funcţiilor unei proteine; iii) stabilirea unei

8
 Rezum at

filogenii. Dacă două secvenţe dintr-o aliniere au un strămoş comun, diferenţele sunt
interpretate ca fiind mutaţii punctiforme sau ca locuri de inserţie sau deleţie. Dacă mai
multe secvenţe sunt aliniate, pe ultima linie se va situa secvenţa consens.

II.5.1.Scoruri şi matrice de comparaţie

Cea mai mare parte a alinierilor de secvenţe biologice şi în particular alinierea
secvenţelor de proteine şi acizi nucleici încearcă optimizarea scorului de aliniere. Acest
scor este corelat cu proporţia de similitudine dintre secvenţele comparate.
Secvenţele de ADN se compun din caractere discontinue care pot avea 5 stări
diferite: adenină, guanină, citozină, timină, o inserţie sau deleţie. Situsurile care au
aceleaşi stări în fiecare secvenţă se numesc situsuri conservate. O schimbare de stare
într-un situs se numeşte substituţie.

II.5.2. Algoritmi de programare dinamică

Fiind dat sistemul de scor acesta va garanta obţinerea unui aliniament optimal.
Ipoteza de lucru este aceea ca evoluţia este extrem de ponderată (parcimonioasă).
Pentru identificarea aliniamentului optim se va căuta calea care va permite trecerea de
la o secvenţa la alta cu un minim de modificări. Se definesc două tipuri de scoruri în
funcţie de algoritmii utilizaţi: i) scorul de omologie care reprezintă valoarea scorului
diminuată cu numărul diferenţelor observate între două secvenţe; ii) scorul de distanţa
care reprezintă valoarea scorului amplificată cu numărul de diferenţe observate între
două secvenţe.
În funcţie de complexitate se diferenţiază două tipuri de aliniamente:
a) Aliniamentul format din perechi care constă în alinierea a două secvenţe
şi care poate fi realizat graţie unui altgoritm de complexitate polinomiala. În acesată
situaţie se poate realiza un aliniament: i) global (propus prima dată de Needleman si
Wunsch, 1970) când se face pe toată lungimea celor două secvenţe (FASTA).
Secvenţele vor fi aliniate pe toată lungimea (de la primul la ultimul rest). Acest tip de
aliniere este folosit când secvenţele au aproximativ aceeaşi lungime; ii) semi-global
caracterizat prin lipsa penalităţilor pentru discontinuităţile situate la extremităţi. Este
folosit când o secvenţă este mai scurtă decât cealaltă şi când analizăm suprapuneri la
extremităţi; iii) local (cunoscut ca algoritmul Smith şi Waterman, 1981) când se
compară o parte dintr-o secvenţă cu o parte din alta (BLAST). Algoritmul doreşte

9
 Rezum at

identificarea celor mai conservate sub-regiuni între două secvenţe şi numai acestea
sunt aliniate.
b) Alinierea multiplă este o aliniere globală şi constă în alinierea a mai mult de
două secvenţe şi necesită timp de calcul şi un spaţiu de stocare exponenţial în funcţie
de marimea datelor.
Aliniamentele secvenţiale pot fi realizate într-o largă varietate de formate de
fişiere care depind de programul folosit: FASTA, GenBank, etc. Cu toate acestea în
laboratoarele de cercetare, utilizarea specifică a anumitor programe poate reduce
alegerea formatului.

II.5.3. Convertirea datelor de aliniere în arbore filogenetic

Alinierea secvenţelor de acizi nucleici sau proteine prin diferite metode a
evidenţiat ca nicio metodă de aliniere nu este perfectă. De asemenea, au fost realizate
teste comparative cu date „artificiale” pornind de la arbori reali, cunoscuţi, în scopul
identificării unor metode particulare mai bune decât altele (Felsenstein 1989, 2004) care
nu au condus la obţinerea supremaţiei unei metode asupra alteia.
Cel mai simplu mod de a converti informaţia de secvenţă într-o distanţă este
construirea unei matrice aşa cum am explicat mai sus. Distanţa de evoluţie este
calculată din numărul de diferente (nucleotide sau aminoacizi) existente între perechile
de secvenţe şi este folosită pentru a stabili lungimea braţelor unui arbore filogenetic. Cel
mai utilizat şi popular pachet de programe utilizat pentru aceste demnersuri este
Clustal. Clustal este in primul rând un program care permite realizarea de alinieri
multiple de secvente de proteine si acizi nucleici care nu contin motive repetitive
interne. Clustal este uzual folosit în combinatie cu programul NJ-blot, un program
simplu care permite construirea arborilor prin metoda Neighbor Joining. Un important
avantaj al folosirii cuplate a programelor Clustal şi NJ-blot este că acestea nu folosesc
resurse uriaşe din memoria calculatorului şi pot fi rulate pe un PC mic sau Macintosh cu
capacitate medie de procesare.

II.6. Metode de reconstrucţie-generalităţi

În primul rând este important de evidenţiat că metodele de reconstrucţie
filogenetică nu pot furniza un rezultat corect decât dacă secvenţele sunt corect aliniate.
În principiu, toate metodele se bazează pe următoarele ipoteze: i) nu există transfer
lateral sau de recombinare; ii) secvenţele sunt omologe sau dacă nu, testarea se

10
 Rezum at

realizează în cunoştinţă de cauza; iii) eşantionarea este efectuată corect; iv) poziţiile
evoluează independent unele de altele.
Dacă se porneşte de la un aliniament optimal, există mai multe metode de
reconstrucţie pe care le putem diviza schematic în metode bazate pe distanţe şi metode
bazate pe analiza de caractere.
I. Metode bazate pe distanţe care demarează prin calcularea distanţelor de
editare aşa cum am explicat anterior, apoi utilizarea matricei triangulare de distanţă
pentru a reconstrui un arbore. În acest context, este importantă: i) alegerea unei bune
metode de calcul a distanţelor; ii) alegerea unei bune metode de reconstrucţie a
arborelui.
II. Metode bazate pe analiza de caractere – care lucrează direct cu secvenţele
aliniate şi încearcă să identifice un scenariu evolutiv care minimizează numărul total de
substituţii necesare pentru a trece de la o secvenţă la alta parcurgând arborele
filogenetic. Aceste metode au avantajul de a face apel la secvenţe ancestrale.
Dintre metodele bazate pe analiza de caractere cele mai utilizate sunt
parcinomia (parcinomy) şi probabilitatea maxima (maximum likelihood). Ambele
metode prezintă atât avantaje cât şi dezavantaje.
1. Probabilitatea maxima este adesea considerată ca fiind „cea mai bună
metodă” care ar putea conduce la construcţia unui arbore adevărat. Din păcate
calculele sunt extrem de lungi şi din acest motiv este destul de rar folosită pentru
evaluarea filogeniilor când se utilizeaza mai mult de o sută de secvenţe, mai ales cu
opţiunea G (aranjament global/global rearangements).
2. Parcinomia reprezintă pentru majoritatea utilizatorilor „metoda” folosită prin
excelenţă, deoarece este relativ rapidă ca timp de calcul şi poate fi aplicată pentru un
număr mare de date. De asemenea se poate realiza o analiză de încărcare (boostrap)
în timp rezonabil.

II.6.1. Metode bazate pe distanţă (fenetice)

Metodele fenetice propun construirea arborilor plecând de la asemănările
observate între fiecare pereche de unităţi evolutive. Vorbim de o asemanare globală
stabilită de numărul maxim de observaţii disponibile. Pentru metodele fenetice,
asemanarea globală între două unităţi este cu atât mai importantă, cu cât legăturile lor
parentale sunt mai limitate. Principalele etape in analiza secvenţelor prin aceste metode
sunt: calculul distanţelor şi utilizarea acestora in construirea arborilor filogenetici.

11
 Rezum at

Numeroase metode au fost dezvoltate pentru a construi un arbore filogenetic

plecând de la o matrice de distanţă. Dintre acestea cele mai cunoscute sunt UPGMA si
cel mai apropiat vecin/Neighbor Joining (NJ)

UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means)

Este o metodă aglomerativă sau o metodă de clusterizare (clustering method)
folosită în bioinformatică pentru crearea de arbori filogenetici şi care se bazează pe
regruparea secvenţelor celor mai apropiate. UPGMA se bazează pe asumarea unei rate
constate a evoluţiei susţinută de ipoteza ceasului molecular. Aceasta susţine că
distanţele sunt ultrametrice şi deci ele evoluează cu o viteză constantă. Dat fiind că
această ipoteză este rareori confirmată, metoda UPGMA nu este practic utilizată în
studiul filogenetic.

Cel mai apropiat vecin - Neighbor Joining (NJ)

Este metoda de distanţă cel mai adesea utilizată, care se bazeaza pe criteriul
minimei evoluţii în construcţia arborilor filogenetici (Saitou and Nei, 1987). Principala
calitate a NJ comparativ cu celelalte metode este eficienţa computaţională. Neighbour-
Joining este un algoritm polinomial care se bazează pe acelaşi principiu ca şi metodele
de analiza de grup (cluster analysis). Ca şi metoda UPGMA, această metodă se
bazează pe măsurarea distanţelor genetice pentru a construi un arbore filogenetic.
Singura diferenţă a metodei NJ este ca aceasta ţine cont de diferenţele de viteza
evolutivă între diferite ramuri ale arborelui filogenetic. Această metodă furnizează un
arbore nepolarizat (fără rădăcină). Metoda este utilizată atât pentru acizi nucleici, cât şi
pentru proteine.

Avantaje şi dezavantaje ale metodelor de distanţă

Metodele de distanţă sunt singurele disponibile pentru a analiza anumite tipuri de
date, de exemplu cele imunologice. Acestea sunt metode rapide şi permit analiza unui
număr mare de date şi testarea unui număr de ipoteze alternative. De asemenea ele
permit integrarea modelelor, care evaluează schimbările evolutive pe care alte
modalităţi de analiză nu le asigură.
Dezavantajele constau în pierderea unei părţi din informaţie la trecerea de la
matricea bazată pe caractere la cea bazată pe calculul distantelor. De asemenea,

12
 Rezum at

metodele de distanţă nu permit combinarea unor caractere diferite în aceeaşi matrice

(ex. caractere morfologice şi secvenţe de ADN).

II.6.2. Metode bazate pe caractere

Medodele bazate pe caractere sunt fundamentate pe principiul cladistic care a
fost elaborat de entomologul german Willi Hennig (1913-1976). Cladistica este o
metoda de clasificare (Wiley E.O. and colab., 1991) pentru care speciile din acelaşi
taxon au un ancestru comun, mult mai recent decât cel pe care îl au în comun cu alte
specii. Într-o astfel de clasificare, toţi taxoni trebuie sa fie monofiletici. Studiul relaţiilor
filogenetice se bazează pe un tip particular de caractere, pe care le numim caractere
derivate comune.
Categorii de caractere
Ansamblul caracterelor comune luate în consideraţie pentru analiza mai multor
specii, pot fi împărţite în 3 categorii: i) omologe derivate; ii) omoloage ancestrale; iii)
analoge.
Grupuri monofiletice, parafiletice şi polifiletice (fig.2)

Un grup monofiletic cuprinde toţi descendenţii unui ancestru comun, inclusiv
stramoşul.

Grupul parafiletic cuprinde o parte din descendenţii ancestrului comun, dar nu
totalitatea acestora.

Un grup polifiletic cuprinde linii independente care conţin caractere
asemănătoare datorită evoluţiei convergente.

Figura 2. Tipuri de clade

II.7. Fiabilitatea arborilor filogenetici

Metoda cea mai utilizată pentru testarea fiabilităţii arborilor este metoda
bootstrap. Metoda a fost introdusă de Efron în 1979 (Efron and Gong, 1983, Diaconis
and Efron,1983) pentru a obţine estimările erorilor prin reasamblarea seturilor de date

13
 Rezum at

pentru a furniza o distribuţie pentru care ipotezele trebuiesc testate. Curând, după
introducerea acestei metode Penny şi colab (1982, 1985) pun în discuţie aplicarea ei în
filogenie, iar Felsenstein (1985) propune bootstrapping, ca metodă de obţinere a
limitelor de acurateţe a arborilor filogenetici. Din 1985 metoda a devenit foarte utilizată
pentru construirea arborilor filogenetici. Pachetele software de programe filogenetice, ca
PHYLIP (Felsenstein) şi PAUP (Swofford, 2003) au încorporaţi altgoritmi de calcul
bootstrap. De obicei, arborii filogenetici sunt prezentaţi cu anumite valori asociate
nodurilor. Aceste valori se numesc valori bootstrap, procent bootstrap (BP) sau mai rar
întâlnit valori p-bootstrap şi reprezintă raportul procentual dintre numărul arborilor şi
numărul de replicate la nivelul fiecărei clade.

Capitolul III - Markeri moleculari mitocondriali

Marker molecular poate fi considerata orice moleculă care indică existenţa unui
proces fizic sau chimic. Termenul are un număr mare de utilizări. Markerii moleculari
sunt utilizaţi în biologia moleculară şi biotehnologie pentru a desemna, identifica si
localiza o secvenţă particulară de ADN.
Secvenţele de ADN mitocondrial (ADNmt) reprezintă o sursă genetică importantă
pentru studiile de evoluţie pentru că prezintă următoarele avantaje: i) au o rată rapidă
de evoluţie comparativ cu genomul nuclear; ii) rata mutaţiilor este mai mare decât cea a
ADN nuclear deoarece ADNmt nu are sisteme de reparare; iii) acumularea mutaţiilor se
face rapid şi acestea sunt stabile. Cele mai frecvente sunt substituţiile la situsuri
sinonime şi mutaţiile punctiforme.

III.1. Genomul mitocondrial

Structural, majoritatea genoamelor mitocondriale conţin 37 de gene, dintre care
13 sunt implicate în procesul de fosforilare oxidativă. În cazul vertebratelor ordinea
genelor este foarte bine conservată (Brown and colab.,1985; Boore and colab.,1999).
Genoamele mitocondriale ale vertebratelor au aproximativ 16kpb şi sunt extrem de
compacte, lipsite de introni şi puţini spaţiatori intergenici (dacă aceştia există). Singura
secvenţă semnificativă necodificatoare este regiunea de control, care este implicată în
reglarea transcrierii şi replicării (Calyton and colab.,1982; Shadel and Clayton,
1997),fiind de obicei mai mica de 5% din marimea totală a genomului.

14
 Rezum at

III.2. Markeri mitocondriali utilizaţi

Patru gene mitocondriale au fost utilizate pentru determinarea relaţiilor de
înrudire dintre cele 18 specii de ciprinide şi 2 specii de cobitide alese ca grup de
comparaţie: citb, ARN16S, cox1 şi cox2. Toţi arbori filogenetici au fost construiţi prin
trei metode diferite: maximum parsimony, maximum likelihood şi neighbor-joining.
Genele cit b, ARN16S şi cox1 sunt cele mai utilizate pentru stabilirea relaţiilor de
evoluţie dintre diferite specii de peşti. In acest sens putem exemplifica cu urmatoarele
studii: i) stabilirea relaţiilor filogenetice dintre specii de peşti din familia Goodeidae a
utilizat genele cox1 şi ARN16S (Webb 1998); ii) studiul relaţiilor evolutive dintre specii
de peşti din ordinul Perciformes a avut la baza genele ARN12S şi 16S (Okazaki M. and
colab., 2001); iii) analiza relaţiilor filogenetice dintre diferite specii de peşti din familia
Cyprinidae s-a realizat pe baza secvenţelor din gena citb (Durand J.D. and colab,
2002), etc. Pentru gena cox2 nu am găsit date în literatură privind utilizarea acestei
gene în studiul relaţiilor de filogenie la peşti, cu toate că gena ar putea fi un indicator
filogenetic bun. Exista studii de evoluţie care au utilizat gena cox2 pentru a stabili
relaţiile de înrudire dintre diferite specii de alge roşii (G. C. Zuccarello and colab., 2002).

Capitolul IV - Materiale şi Metode

IV.1. Material biologic
Speciile de ciprinide, care au fost luate in studiu pentru această lucrare au fost:
Carassius auratus Gibelio (caras), Carassius auratus auratus (caras auriu), Carassius
carassius (caracudă), Cyprinus carpio (crap), Hypophtalmycthys molitrix (sânger, crap
argintiu), Arysthycthys nobilis (novac, crap argintiu nobil), Ctenopharyngodon idella
(crap alb chinezesc), Leuciscus cephalus (clean), Leuciscus borysthenicus celensis
(clean de Comana), Barbus barbus (mreana albă), Barbus meridionalis (mreana
vânată), Abramis brama (plătică), Abramis bjoërka (batca), Tinca tinca (lin), Rutilus
rutilus (babuşca), Phoxinus phoxinus (boiştean), Gobio gobio (porcuşor), Scardinius
erytrophtalmus (roşioară). Speciile folosite ca grup de comparaţie au aparţinut familiei
cobitide: Cobitis danubialis (zvârluga) şi Misgurnus fossilis (ţipar de apă dulce). Speciile
de peşti analizate au fost obtinute prin bunavointa colegilor de la: USAMV, Bucureşti,
Facultatea de Zootehnie, Disciplina Piscicultura; Institutul National Delta Dunării,
Tulcea; Aquafarm SRL, Braşov; Centru de Cercetare Piscicolă, Nucet. Pentru fiecare
specie luată în studiu s-au analizat un număr de 10 indivizi.

15
 Rezum at

IV.2. Cariotipare
Cariotipul poate fi un indice taxonomic folositor pentru speciile din aceeaşi
familie, fie in ceea ce priveste numărul de cromozomi (2n), fie ca număr şi morfologie a
braţelor cromozomale (NF) care pot fi considerate caractere conservative (Benazzi
1973).
Tehnica de cariotipare a fost realizată pentru următoarele specii de ciprinide:
Abramis bjoerka, Scardinius erythrophtalmus şi Barbus barbus.
Pentru obţinerea secvenţelor nucleotidice au fost utilizate următoarele
tehnici de biologie moleculară: 1) izolare ADN genomic din ţesut animal; 2)
amplificarea ADN prin PCR; 3) clonare moleculară a produşilor PCR, izolare şi
purificare ADN plasmidial; 4) secvenţiere ADN; 5) introducere secvente in bazele
de data GENOME DATA BASE; 6) prelucrare statistică şi aliniere secvenţe; 7)
construcţie arbori filogenetici.

IV.3. Izolare ADN genomic din ţesut animal

ADN genomic de la diferite specii de din familia Cyprinidae a fost izolat din ţesut
hepatic, muscular şi icre cu Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega. Cercetările
au fost realizate pe urmatoarele specii de ciprinide de la noi din ţară: Carasius auratus
auratus (carasul auriu), Carassius auratus gibelio (caras), Carassius carassius
(caracudă), Cyprinus carpio (crap), Leuciscus cephalus (clean), Leuciscus
borysthenicus celensis (cleanul de Comana), Barbus meridionalis (mreana vânătă),
Phoxinus phoxinus (boistean), Scardinus erytrophtalmus (rosioara), Abramis brama
(platica), Abramis bjoerka (batca), Tinca tinca (lin), Gobio gobio (porcuşor), Rutilus
rutilus (babuşca)
În lucrare au fost analizate şi următoarele specii de ciprinide asiatice aclimatizate
la noi în ţară: Aristichthys nobilis (novac, crap argintiu nobil), Hypophtalmychthys
molitrix (sânger, crap argintiu), Ctenopharingodon idellus (crap alb chinezesc).Toate
speciile sunt peşti de apă dulce din râuri, lacuri şi bălţi. Speciile cu origine asiatică cresc
în fermele de acvacultură de la noi din tara încă din anul 1960.
Ca grup de comparaţie pentru aceste specii de ciprinide (outgroup) s-au ales
două specii de cobitide: Cobitis danubialis (zvârluga) şi Misgurnus fossilis (ţipar de apă
dulce) de la care s-a izolat ADN prin aceeaşi metodă.

16
 Rezum at

IV.4. Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi concentraţiei ADN total

Verificarea spectrofotometrică a purităţii ADN se bazează pe absorbţia
diferenţiată a diferitelor tipuri de molecule la diverse lungimi de undă. ADN mono- sau
dublucatenar prezintă maximum de absorbţie la λ=260nm, proteinele au maximum de
absorbţie la λ=280nm (absorbanţa la λ=260nm se datorează nucleelor aromatice sau
dublelor legaturi conjugate ale unor aminoacizi precum Tyr, Phe, Trp), polizaharidele
înregistrează acest maxim la valori λ=230nm, iar oligonucleotidele care pot proveni din
fragmentarea ADN la λ=220 nm. Verificararea purităţii ADN şi stabilirea concentraţiei
sale s-a efectuat prin citire la spectrofotometru Lambda 25 UV/VIS Spectrometer,
Perkin-Elmer, în cuve de cuarţ de 30µl.

IV.5. Amplificarea ADN total prin PCR – prezentare generala

În cadrul studiilor efectuate pentru lucrarea de doctorat am realizat reacţiile PCR
pentru amplificarea genei mitocondriale citb b şi amplificarea unor fragmente din genele
mitocondriale: cox1, cox2 şi ARN16S pentru toate speciile de peşti luate în studiu.
Pentru a amplifica întreaga genă mitocondrială a citb s-au desemnat două seturi
de primeri: a) un set cu care am amplificat prima jumătate din genă, 660pb (GluF-
primer sens/CytbR- primer antisens, tabel 1); b) un alt set cu care am amplificat a doua
jumătate de genă, 521pb (CytbF- primer sens/ ThrR –primer antisens, tabel 1).
Amplificarea unui fragment de 274pb din gena cox1 s-a realizat prin desemnarea
primeriilor: Cox1F- sens/ Cox1R – antisens, tabel 1.
Fragmentul de 302pb din gena cox2 a fost amplificat cu primerii: Cox2F –sens si
Cox2 –antisens, tabel 1.
Pentru amplificarea unui fragment de 574pb din gena ARN16S am desemnat
primerii: 16S-F-sens/ 16S-R, antisens, tabel 1.

IV.6.Verificarea electroforetică a produşilor obţinuţi prin reacţia PCR

Electroforeza în gel de agaroză constituie o metodă standard pentru separarea,
purificarea şi identificarea moleculelor de ADN. Electroforeza s-a realizat în sistem
submers pe placă orizontală utilizându-se două tipuri de agaroză în funcţie de finalitatea
demersului urmărit: agaroza standard pentru vizualizarea ampliconilor şi agaroza LMP
« Low melting point » pentru purificarea produşilor amplificaţi, care nu au putut fi izolaţi
direct în urma amplificării.

17
 Rezum at

Tabel 1. Secvenţă primeri

Denumire Secvenţa primer Dimensiune Temperatura
primer fragment de hibidizare
amplificat in utilizată în
0
pb (perechi C
de baze)
Cox1-F 5`-AGCCTTTGTGCATTGATTCCC-3` 274 55
Cox1-R 5`-AGAGCAAATCGCCGCTTCCGA-3`

Cox2-F 5`-AGGACACCAATGATACTGAAG-3` 302 55

Cox2-R 5`-GTTTAAAGTCTCGTAACAGGC-3`

16S-F 5`-AGAGTGGGAAGAGCTCCGGGT-3` 574 55

16S-R 5`-CCGAACACAAACGGCTCAAG -3`

Glu-F 5'-GAAGAACCACCGTTGTTATTCAA-3' 660 50

Cytb-R 5'-TCTTTATATGAGAARTANGGGTG-3'

Cytb-F 5'-CACGARACRGGRTCNAAYAA-3' 521 50

Thr-R 5'-ACCTCCRATCTYCGGATTACA-3'

IV.7. Purificarea produşilor PCR

Purificarea produşilor PCR este necesară deoarece după amplificarea ADN în
amestecul de reacţie se întâlnesc diverşi contaminanţi (săruri, amestec de primeri,
ARN, exces de dNTP), precum şi produşi de amplificare nespecifică. Purificarea s-a
realizat cu cu kitul Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega.

IV.8. Clonare moleculară

Tehnica de clonare moleculară presupune multiplicarea unei secvenţe cunoscute
de ADN şi obţinerea de copii multiple ale aceleiaşi gene in vivo folosind un sistem de
vectori de clonare. Clonarea este frecvent utilizată pentru amplificarea oricărei secvenţe
ADN mai mari sau mai mici: gene, fragmente de gene, secvente promotoare, secvente
necodificatoare, oligonucleotidele sintetizate chimic şi ADN fragmentat aleator.
În cazul moleculelor de ARN 16S am folosit pentru clonare sistemul p-GEM® –T
easy Vector II, Promega care conţine vectorul liniarizat şi la capetele acestuia sunt
prezente timinele. Fragmentele ADN utilizaţi în tehnica de clonare moleculară au
prezentat la capete adenine. În acest mod a fost realizată compatibilitatea vectorului cu
produşii PCR.

18
 Rezum at

IV.9. Secventierea fragmentelor de ADN amplificate

Tehnica folosită se bazează pe metoda Sanger, utilizând 2’, 3’-dideoxinucleotide
marcate fluorescent (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit, Applied Biosystems).
Fragmentele obtinute sunt purificate prin precipitare cu etanol, separate prin
electroforeză capilară cu rezoluţie mare şi detectate prin excitare laser (Analizor genetic
automat, ABI Prism 310, Applied Biosystems). Datele sunt prelucrate automat cu
ajutorul programului «ABI Prism DNA Sequencing Analysis V 3.4.1».
Toate fragmentele ADN obţinute de la speciile de peşti luate în studiu au fost supuse
tehnicii de secvenţializare.

IV.10. Introducerea secvenţelor noi în baza de date GenBank

Baza de date GenBank este una dintre cele mai importante baze de date de acizi
nucleici din lume. Pentru a verifica dacă o secvenţă nucleotidică dintr-o genă se
gaseşte sau nu în baza de date, în primul rând trebuie să transformăm secvenţa într-un
format recunoscut de baza de date (ex.FASTA). De la diagrama (electroferograma)
iniţială obţinută cu ajutorul aparatului de secvenţiere până la obţinerea secvenţei
nucleotidice complete şi corecte se urmăresc câteva etape.
Secvenţa generată de analizorul ABI PRISM 3130 în format <.ab1> se verifica
nucleotidă cu nucleotidă cu ajutorul programului BioEdit. Secvenţa nucleotidică
corectată se copiază într-un fişier text (.txt) şi se salvează în format FASTA. Pentru un
fragment de genă sau genă se va verifica în acelaşi mod, atât secvenţa sens, cât şi
secvenţa antisens.
Pentru a introduce o secvenţă genică nouă în baza de date se accesează
GenBank Sequence Submission (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), introducându-se într-o
primă etapă numărul de nucleotide al secvenţei, iar în pagina nou afişată se vor
completa toate câmpurile solicitate (adresă instituţie, mail, autorii, date despre
secvenţă, etc.).

IV.11. Alinierea secvenţelor şi construirea de arbori filogenetici

Programul folosit pentru crearea arborilor filogenetici a fost PAUP* 4.0 (Sworfford
2000). Programul utilizează fişierele create de Clustal X pentru a construi arborii
filogenetici. Un program de aliniere caută un aranjament care să maximizeze scorul net.
Pentru aliniamentele de acizii nucleici, de obicei pentru potrivirea resturilor nucleotidice

19
 Rezum at

se obţine scorul 1 şi pentru nepotrivire scorul 0. Aceste scoruri sunt determinate de

însuşi programul de aliniere.
Aliniamentele multiple sunt considerate mult mai complexe. Programul ClustalX
este unul dintre cele mai bune instrumente pentru crearea de aliniamente multiple
(www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html). ClustalX ca orice alt program
recunoaşte datele de un anumit format. Cel mai des folosit este formatul FASTA.
Acesta este recunoscut deoarece prima linie începe cu caracterul “>”, urmat de un
cuvânt pe care Clustal îl va utiliza ca numele secvenţei în aliniament.
ClustalX crează aliniamente multiple în trei etape: i) aliniază individual fiecare
secvenţă cu celelalte secvenţe într-o serie de aliniamente perechi; ii) utilizează acest
set de aliniamente perechi pentru a crea un arbore ghid; iii) utilizează acest arbore ghid
pentru a crea aliniament multiplu.

Capitolul V - Evaluarea caracterelor morfometrice şi a cariotipului la ciprinidele

studiate
Speciile de ciprinide luate în studiu sunt foarte diversificate din punct de vedere
al caracterelor morfometrice, indivizii analizaţi provenind din populaţii diferite şi din
bazine acvatice diferite.
Cariotipurile ciprinidelor diploide sunt caracterizate prin cromozomi relativ mici cu
poziţiile centromerelor variind gradual din plan median până aproape terminal.
Majoritatea ciprinidelor analizate prezintă un cariotipuri asemnatoare bogate în
cromozomi m şi sm (Scardinius erythrophthalmus, Abramis bjoerka) care confirma
inrudirea speciilor in timp ce la Barbus barbus cariotipul speciei este foarte diferit in
concordanta cu pozitia evolutiva indepartata a acestuia.

Capitolul VI - Relaţii filogenetice la ciprinide bazate pe genele mitocondriale cox1

şi cox2
Produşii de amplificare obţinuţi pentru fiecare din cele doua gene (cox 1, cox 2)
au fost supuşi separării electroforetice împreună cu markeri de masă moleculară şi
analizaţi ulterior. Pentru gena cox1 au fost obţinute fragmente de aproximativ 302pb de
la speciile: Carassius auratus auratus, Hypophtalmycthys molitrix, Arysthycthys nobilis,
Ctenopharyngodon idella, Leuciscus cephalus, Leuciscus borysthenicus celensis,
Barbus meridionalis, Tinca tinca, Rutilus rutilus, Misgurnus fossilis, iar pentru gena cox2
de aproximativ 270pb de la speciile: Carassius auratus Gibelio, Carassius auratus

20
 Rezum at

auratus, Carassius carassius, Hypophtalmycthys molitrix, Arysthycthys nobilis,

Leuciscus borysthenicus celensis, Barbus meridionalis, Abramis brama, Tinca tinca,
Rutilus rutilus, Gobio gobio, Scardinius erytrophtalmus, Cobitis danubialis.
Toate secvenţele nucleotidice pentru gena cox1 obţinute au fost comparate cu
secvenţele nucleotidice din GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov.url/ GenBank). Omologia
dintre secvenţele obţinute şi cele din GenBank a fost mai mare de 85%, indicând relaţii
de filogenie apropiate între aceste specii.
Secvenţele nucleotidice provenite de la speciile Tinca tinca, Leuciscus
borysthenicus celensis şi Rutilus rutilus au fost introduse în baza de date
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov.url/ GenBank) pentru prima data şi au primit
numerele de acces: EF112527, EU652849 şi EU652851.
Aliniamentele obţinute au fost utilizate pentru construirea de arbori filogenetici
folosind programul PAUP 4.0
Secvenţele nucleotidice obţinute pentru gena cox2 de la speciile de ciprinide
luate in studiu au fost analizate în două aliniamente diferite. În primul aliniament au fost
incluse speciile: Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis, Rutilus rutilus,
Scardinius erytrophtalmus, Abramis brama, Leuciscus borysthenicus celensis, Gobio
gobio, Tinca tinca, Cyprinus carpio, Barbus barbus, Cobitis danubialis. În al doilea
aliniament pe lângă speciile enumerate mai sus au mai fost introduse alte patru specii:
Carassius carassius, Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Barbus
meridionalis.
Secvenţele obţinute pentru gena cox2 au fost comparate cu secvenţele
nucleotidice din GenBank. Omologia dintre secvenţele obţinute şi secvenţele din
GenBank a fost mai mare de 85%.
Secvenţa nucleotidică provenită de la specia Scardinius erythrophthalmus
a fost introdusă, pentru prima data, în baza de date GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov.url/ GenBank) şi a primit numărul de acces: EF112529.
Prin introducerea în aliniament a speciilor: Carassius carassius, Carassius
auratus gibelio, Carassius auratus auratus şi Barbus barbus s-a modificat semnificativ
indentitatea de secvenţă a fragmentelor din gena cox2. Aceasta a scăzut de la 66.88%
la 56.74%. Aliniamentele obţinute au fost utilizate pentru construirea de arbori
filogenetici cu programul PAUP 4.0.

21
 Rezum at

Concluzii
Topologia arborilor filogenetici obţinuţi pe baza secventelor din gena cox1
(exemplu arborele NJ, fig.3A) pentru un număr de zece specii de ciprinide (Carassius
auratus auratus, Rutilus rutilus, Barbus meridionalis, Tinca tinca, Hypophthalmichthys
molitrix, Arischthys nobilis, Ctenopharyngodon idella, Leuciscus borysthenicus celensis,
Leuciscus cephalus) este asemănătoare cu topologia arborilor filogenetici găsiţi în
literatura de specialitate.

Misgurnus fossilis

Carassius auratus auratus

0
Rutilus rutilus

Barbus meridionalis

100.0
Tinca tinca

Barbus barbus

Arischthys nobilis
62.5

Hypophthalmichthys molitrix
55.3

Cyprinus carpio

Ctenopharyngodon idella

Leuciscus borysthenicus celens

84.2

A B Leuciscus cephalus

Figura 3. Arbore filogenetic construit prin metoda Neighbor-joining pe baza secveneţelor nucleotidice din
gena mitocondrială cox1 pentru zece specii de ciprinide (A) şi pentru douăsprezece specii de ciprinide
(B). Numerele indicate la nivelul nodurilor reprezinta valori bootstrap mai mari de 50%. Misgurnus fossilis
a fost folosit ca outgrop. Speciile a căror poziţionare este incorectă sunt subliniate (B).

Includerea a două secvenţe din gena cox1 de la specii de ciprinide (Cyprinus

carpio şi Barbus barbus) alături de celelalte secvenţe de la cele zece specii de ciprinide
a condus la obţinerea unor arbori filogenetici (exemplu arborele NJ, fig.3B) a căror
topologie este parţial în contradicţie cu literatura de specialitate. De exemplu,
încadrarea speciilor Barbus meridionalis şi Cyprinus carpio în grupul leuciscinelor.
Relaţiile de înrudire dintre speciile de ciprinide (Hypophthalmichthys molitrix,
Arischthys nobilis, Rutilus rutilus, Scardinius erytrophtalmus, Abramis brama, Leuciscus
borysthenicus celensis, Gobio gobio, Tinca tinca, Cyprinus carpio, Carassius carassius,
Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Barbus barbus, Barbus
meridionalis) identificate pe baza datelor moleculare din gena cox2 obtinute de noi sunt

22
 Rezum at

în conformitate cu datele din literatură in ceea ce priveste numai componenţa grupurilor

de ciprinine şi leuciscine. Astfel :
• In grupul ciprininelor din această analiză au fost incluse speciile: Cyprinus
carpio şi Barbus barbus,
• In grupul leuciscinelor din această analiză au fost incluse speciile :
Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis, Rutilus rutilus, Scardinius
erytrophtalmus, Abramis brama, Leuciscus borysthenicus celensis, Gobio
gobio, Tinca tinca.
In analiza filogenetică efectuata de noi, includerea a trei secvenţe nucleotidice
din gena cox2 de la speciile de Carassius şi de la specia Barbus meridionalis a
determinat creşterea gradului de variabilitate a secvenţelor şi scăderea probabilităţii
corectitudinii arborilor rezultaţi. De exemplu, specia Barbus meridionalis este poziţionată
în grupul leuciscinelor alături de specia Gobio gobio, deşi ar fi trebuit să se regăsească
în grupul ciprininelor alături de Barbus barbus.
Aceste rezultate evidenţiază faptul că genele cox1 şi cox2 nu sunt indicatori
filogenetici foarte buni pentru studiul relaţiilor de înrudire dintre ciprinide. În literatură, nu
există arborii filogenetici ai ciprinidelor construiţi pe baza secvenţelor nucleotidice din
genele cox1 şi cox2.

Capitolul VII - Relaţii filogenetice la ciprinide bazate pe gena mitocondrială

ARN16S
În genomul mitocondrial de la peşti există două gene care codifică pentru două
subunităţi ale ARN ribosomal 12S şi 16S. Gena care codifică pentru ARN ribozomal
16S are 1681pb în genomul mitocondrial de la crap (Chang Y.S., 1994), iar gena care
codifică pentru ARN ribozomal 12S, 951pb.

VII.1. Analiza fragmentelor din gena ARN16S după electroforeză în gel de agaroză
Primerii desemnaţi pentru gena ARN 16S au condus la amplificarea unui fragment
de 570 bp la speciile: Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus,
Hypophtalmycthys molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Barbus barbus,
Tinca tinca, Rutilus rutilus, Gobio gobio, Scardinius erytrophtalmus, Phoxinus phoxinus,
Misgurnus fossilis.

23
 Rezum at

VII.2. Alinierea secvenţelor de ADN mitochondrial obţinute

Secvenţele din gena mitocondrială pentru ARN 16S obţinute de la speciile de
peşti: Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Hypophtalmycthys molitrix,
Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Barbus barbus, Tinca tinca, Rutilus rutilus,
Gobio gobio, Scardinius erytrophtalmus, Phoxinus phoxinus şi Misgurnus fossilis, au
fost comparate cu cele existente în GenBank si s-a obtinut o identitate de secventa mai
mare de 80%. Aceste omologii de secvenţă mari sustin relaţiile de înrudire apropiată
între specii. Astfel, între secvenţa nucleotidică obţinută pentru specia Barbus barbus şi
secvenţa nucleotidică din GenBank (număr de acces: AP009047) pentru specia
Carassius sp. există o omologie de 87%, iar între secvenţa nucleotidică obţinută a
speciei Ariscthys nobilis şi secvenţa nucleotidică din GenBank (număr de acces:
EU343733) a speciei Hypophthalmichthys molitrix de 99%.
Secvenţele au fost aliniate între ele cu programul CLUSTAL X pentru construirea
de arbori filogenetici. Secvenţele nucleotidice provenite de la speciile: Misgurnus
fossilis, Gobio gobio şi Scardinius erythrophthalmus au fost introduse pentru
prima data în baza de date GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov.url/ GenBank) şi au
primit numerele de acces: EF372634, EF112528 si EF372635.

VII.3. Arbori filogenetici construiti pe baza secventellor nucleotiice din gena

ARN16S
Aliniamentul secvenţelor nucleotidice din gena pentru ARN16S de la speciile de
ciprinide: Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Hypophtalmycthys
molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Barbus barbus, Tinca tinca, Rutilus
rutilus, Gobio gobio, Scardinius erytrophtalmus, Phoxinus phoxinus şi Misgurnus fossilis
a fost utilizat pentru construirea arborilor filogenetici NJ, MP si ML (exemplu, fig.4).
Au fost aliniate un total 626 de caractere din gena ARN16S pentru doisprezece specii
de ciprinide, dintre care 276 au fost constante, 69 caractere variabile şi 281 caractere
informative parsimony. Divergenţa de secvenţă a variat de la 1.356 (intre Misgurnus
fossilis si Ariscthys nobilis) până la 0.032 (între Rutilus rutilus şi Scardinius
erytrophtalmus). Media raportului Ts/Tv dintre toate perechile secvenţe a fost de 1.963.
Compoziţia in nucleotide a fragmentelor din gena ARN 16S secvenţiate de la cele 11
ciprinide a fost per ansamblu: A = 35,06%; C = 21,50%; G = 19,84%; T = 23,60%. Cel
mai bun arbore obţinut prin metoda maximum likelihood cu modelul HKY+Γ a avut
scorul: -lnL=3177.52660, parametrul α=0.608 si kappa=4.03.

24
 Rezum at

Misgurnus fossilis

Carassius auratus auratus

Carassius auratus gibelio

Ciprinine
0
Barbus barbus

Phoxinus phoxinus

Tinca tinca

100.0
Leuciscus cephalus

Gobio gobio

Scardinius erytrophtalmus

67.7

Rutilus rutilus

Ariscthys nobilis

100.0

Hypophthalmichthys molitrix

Figura 4. Arbore filogenetic construit prin metoda Neighbor-joining pe baza secveneţelor nucleotidice din
gena mitocondrială ARN16S. Numerele indicate la nivelul nodurilor reprezinta valori bootstrap mai mari
de 50%. Misgurnus fossilis a fost folosit ca outgrop.

VII.4. Concluzii
Analiza filogenetică bazată pe secvenţa nucleotidica a genei mitocondriale
ARN16S de la speciile de ciprinide: Carassius auratus gibelio, Carassius auratus
auratus, Hypophtalmycthys molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Barbus
barbus, Tinca tinca, Rutilus rutilus, Gobio gobio, Scardinius erytrophtalmus şi Phoxinus
phoxinus a evidenţiat împărţirea în două grupuri a acestor specii: ciprinine şi leuciscine.
Grupul ciprinelor formează o cladă sperată în arborii obtinuti prin metodele NJ (fig.4) şi
ML şi cuprinde speciile: Carassius auratus auratus, Carassius auratus gibelio şi Barbus
barbus. Grupul leuciscinelor în arborii NJ şi ML cuprinde speciile: Hypophtalmycthys
molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Tinca tinca, Rutilus rutilus, Gobio
gobio, Scardinius erytrophtalmus şi Phoxinus phoxinus.

25
 Rezum at

Arborele construit de noi prin metoda Maximum Parsimony nu este în acord cu

datele din literatură deoarece grupul ciprininelor nu este un grup ci este inclus în grupul
leuciscinelor .
Poziţia speciei Phoxinus phoxinus, în arborele filogenetic construit prin metoda
ML, este în aceeaşi cladă cu Scardinius erytrophtalmus, rezultatele fiind în acord cu
datele recente din literatura (Sasaki et al., 2007)

Capitolul VIII - Relaţii filogenetice la ciprinide bazate pe gena mitocondrială citb

Dintre genele genomului mitocondrial care codifica pentru proteine, citocromul b
(cyt b) s-a dovedit a fi unul dintre cei mai buni markeri filogenetici utilizati pentru
rezolvarea problemelor taxonomice intre diferite genuri, specii, clase de pesti. Gena
pentru cit b de 1140pb codifică pentru o proteină funcţionala conservată şi este
informativă filogenetic atat în studii inter- cât si intraspecifice (Chang Y.S., 1994).
Gena care codifică pentru citocromul b are o mărime de 1140pb, pentru care s-au
desemnat doua perechi de primeri (tabel 1) pentru a amplifica două fragmente ADN din
genă: o pereche de primeri (Glu-F/Cyt b-R, tabel 1) a fost folosită pentru a amplifica un
fragment de 660pb, reprezentând prima jumătate de genă, iar o alta pereche de primeri
(Cyt b-F/Th-R, tabel 1) a fost folosită pentru a amplifica un fragment de 550pb,
reprezentând a doua jumătate de genă. Cele doua seturi de primeri au fost folosite
pentru a amplifica gena care codfica pentru citocromul b la speciile: Cyprinus carpio,
Hypophtalmycthys molitrix, Arysthycthys nobilis, Ctenopharyngodon idella, Barbus
meridionalis, Phoxinus phoxinus, Gobio gobio, Carassius auratus auratus, Carassius
carassius, Leuciscus cephalus, Leuciscus borysthenicus celensis, Abramis brama,
Abramis bjoërka, Tinca tinca, Scardinius erytrophtalmus, Cobitis danubialis, Misgurnus
fossilis .

VIII.1. Analiza si purificarea electroforetica a ampliconilor din gena cit b

Dupa reactia PCR, ADN amplificat de la speciile analizate a fost supus unei
electroforeze orizontale în sistem submers în gel de agaroză 2%. După migrare, s-au
obţinut benzi cu greutăţi moleculare diferite, care au corespuns fragmentelor desemnate
pentru amplificare din gena mitocondrială analizată.

26
 Rezum at

VIII.2. Secventierea ampliconilor purificati

Secvenţele nucleotidice pentru gena mitocondrială cit b au fost obtinute pentru
fiecare dintre speciile Hypophthalmichthys molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus
borysthenicus celensis, Ctenopharyngodon idella, Leuciscus cephalus, Carassius
carassius, Carassius auratus auratus, Cyprinus carpio, Abramis bjoerka, Abramis
brama, Scardinius erytrophtalmus, Phoxinus phoxinus, Tinca tinca, Barbus meridionalis,
Gobio gobio Misgurnus fossilis, Cobitis danubialis.

VIII.3. Alinierea secvenţelor de ADN mitochondrial obţinute

Secvenţele directă şi inversă corespunzătoare celor două fragmente au fost
analizate cu ajutorul programului Sequencing Analysis Software şi prelucrate manual
prin suprapunere cu programul BioEdit pentru identificarea secvenţei corecte. În urma
acestor prelucrări s-au obţinut cele două fragmente cit 1, respectiv cit 2 care prezentau
o regiune comuna de aproximativ 20-30 nucleotide. Această regiune nucleotidică a fost
eliminată din structura unuia dintre fragmente pentru a obţine secvenţa finală. Secvenţa
nucleotidică completă a genei citb obtinuta de noi a fost comparată prin programului
BLAST cu secvenţele din Genbank pentru fiecare specie.
Secvenţele au fost aliniate între ele cu programul CLUSTAL X pentru construirea
de arbori filogenetici. Secvenţele nucleotidice din gena cit b provenite de la
speciile: Barbus barbus, Gobio gobio, Scardinius erythrophthalmus, Abramis
bjoerka, Tinca tinca, Phoxinus phoxinus au fost introduse în baza de date
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov.url/ GenBank) şi au primit numerele de acces:
EF137862, EF173619, EF105295, EF137863, DQ841176, EF094550.

VIII.4. Arbori filogenetici construiţi pe baza secvenţelor nucleotidice din gena citb
Arborii filogenetici obţinuţi au fost construiţi prin trei metode diferite: Neighbor-
Joining- NJ, Maximum Parsimony- MP (folosind opţiunea search heuristic) şi Maximum
Likelihood- ML (modelul HKY+Γ) pentru toţi cei patru markeri moleculari (cox1, cox2,
ARN16S şi citb). Pentru verificarea veridicităţii arborilor a fost utilizata metoda
bootstrap. Datorită numărului mare de date de analizat, programul PAUP v.4.0 beta 10
nu a permis aplicarea acestei metode pentru arborii construiţi prin Maximum Likelihood.
Speciile de cobitide desemnate ca grup de comparaţie au fost Misgurnus fossilis şi
Cobitis danubialis, cobitidele fiind specii apropiate de ciprinide.

27
 Rezum at

Aliniamentul secvenţelor nucleotidice din gena citb de la speciile de ciprinide:

Hypophthalmichthys molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus borysthenicus celensis,
Ctenopharyngodon idella, Leuciscus cephalus, Carassius carassius, Carassius auratus
auratus, Cyprinus carpio, Abramis bjoerka, Abramis brama, Scardinius erytrophtalmus,
Phoxinus phoxinus, Tinca tinca, Barbus meridionalis, Gobio gobio, Misgurnus fossilis,
Cobitis danubialis a fost utilizat pentru construirea arborilor filogenetici NJ (fig. 5), MP şi
ML
Au fost aliniate un total 1209 de caractere din gena citb pentru saptesprezece
specii de ciprinide, dintre care 714 au fost constante, 113 caractere variabile şi 382
caractere informative parsimony. Divergenţa de secvenţă a variat de la 30% (intre
Scardinius erytrophtalmus si Misgurnus fossilis), până la 6% (între Arysthycthys nobilis
si Misgurnus fossilis). Media raportului Ts/Tv dintre toate perechile de secvenţe a fost
de 4.282. Compoziţia de nucleotide a fragmentelor din gena citb secvenţiate de la cele
17 ciprinide a fost per ansamblu: A =27,67%; C=28,08%; G=14,72%; T=29,51%. Cel
mai bun arbore obţinut prin metoda maximum likelihood cu modelul HKY+Γ a avut
scorul: -lnL=7554,40, parametrul α=0,236 si kappa=8,46.

Misgurnus fossilis
Cobitidae
Cobitis danubialis

Tinca tinca
Tincinae
0 Hypophthalmichthys molitrix
100.0
Arysthycthys nobilis
Hypophthalmichthyinae
52.0
Barbus meridionalis
100.0
Barbinae
100.0
Gobio gobio
96.2
Gobioninae
Leuciscus cephalus

99.9
Leuciscus celensis
98.8
Ctenopharyngodon idella

Phoxinus phoxinus
99.6
87.2 Scardinius erytrophtalmus
Leuciscicinae
98.0
Abramis bjoerka
100.0
Abramis brama

Cyprinus carpio

71.6
Carassius carassius
Cyprininae
100.0
Carassius auratus auratus

Figura 5. Arbore filogenetic construit prin metoda Neighbor-joining pe baza secveneţelor nucleotidice din
gena mitocondrială citb. Numerele indicate la nivelul nodurilor reprezinta valori bootstrap mai mari de
50%. Misgurnus fossilis si Cobitis danubialis au fost folosite ca outgroup.
28
 Rezum at

VIII.5. Concluzii
Speciile de ciprinide analizate pe baza secvenţelor din gena cit b s-au grupat în 5
subfamilii distincte în toţi arborii construiţi de noi: Barbinae (Barbus meridionalis),
Cyprininae (Carassius sp., Cyprinus carpio), Leuciscinae (Leuciscus sp., Phoxinus
phoxinus, Ctenopharyngodon idella, Abramis sp., Scardinius erytrophtalmus, Tinca
tinca), Hypophthalmichthyinae (Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis),
Gobioninae (Gobio gobio).
În acest studiu, speciile de ciprinide care au aparţinut aceluiaşi gen s-au ramificat
din acelaşi nod filogenetic (de exemplu Carassius, Abramis).
Specia Tinca tinca se desprinde ca linie parafiletică din grupul leuciscinelor.
Arborele filogenetic construit prin metoda ML pe baza secvenţelor din gena cit b are
topologia cea a arboriilor din literatura de specialitate.

CONCLUZII GENERALE
Speciile de ciprinide luate în studiu sunt foarte diversificate din punct de vedere
al caracterelor morfometrice, indivizii analizaţi provenind din populaţii diferite şi din
bazine acvatice diferite.
Cariotip
Cariotipurile ciprinidelor diploide sunt caracterizate prin cromozomi relativ mici cu
poziţiile centromerelor variind gradual din plan median până aproape terminal.
Majoritatea ciprinidelor analizate prezintă un cariotipuri asemnatoare bogate în
cromozomi m şi sm (Scardinius erythrophthalmus, Abramis bjoerka) care confirma
inrudirea speciilor in timp ce la Barbus barbus cariotipul speciei este foarte diferit in
concordanta cu pozitia evolutiva indepartata a acestuia.

Cox 1 si cox2
Topologia arborilor filogenetici obţinuţi pe baza secventelor din gena cox1 pentru
un număr de zece specii de ciprinide (Carassius auratus auratus, Rutilus rutilus, Barbus
meridionalis, Tinca tinca, Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis,
Ctenopharyngodon idella, Leuciscus borysthenicus celensis, Leuciscus cephalus) este
asemănătoare cu topologia arborilor filogenetici prezentati în literatura de specialitate.
Includerea a două secvenţe din gena cox1 de la specii de ciprinide (Cyprinus
carpio şi Barbus barbus) alături de secvenţele primelor 10 specii de ciprinide a condus

29
 Rezum at

la obţinerea unor arbori filogenetici a căror topologie este, parţial, în contradicţie cu

datele din literatura de specialitate deoarece speciile Barbus meridionalis şi Cyprinus
carpio trec in grupul leuciscinelor.
Relaţiile de înrudire dintre speciile de ciprinide (Hypophthalmichthys molitrix,
Arischthys nobilis, Rutilus rutilus, Scardinius erytrophtalmus, Abramis brama, Leuciscus
borysthenicus celensis, Gobio gobio, Tinca tinca, Cyprinus carpio, Carassius carassius,
Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Barbus barbus, Barbus
meridionalis) identificate pe baza datelor moleculare din gena cox2 obtinute de noi sunt
în conformitate cu datele din literatură in ceea ce priveste numai componenţa grupurilor
de ciprinine şi leuciscine. Astfel :
• In grupul ciprininelor din această analiză au fost incluse speciile: Cyprinus
carpio şi Barbus barbus,
• In grupul leuciscinelor din această analiză au fost incluse speciile :
Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis, Rutilus rutilus, Scardinius
erytrophtalmus, Abramis brama, Leuciscus borysthenicus celensis, Gobio
gobio, Tinca tinca.
In analiza filogenetică efectuata de noi, includerea a trei secvenţe nucleotidice
din gena cox2 de la speciile de Carassius şi de la specia Barbus meridionalis a
determinat creşterea gradului de variabilitate a secvenţelor şi scăderea probabilităţii
corectitudinii arborilor rezultaţi. Astfel, specia Barbus meridionalis este poziţionată în
grupul leuciscinelor alături de specia Gobio gobio, deşi ar fi trebuit să se regăsească în
grupul ciprininelor alături de Barbus barbus. Aceste rezultate evidenţiază faptul că
genele cox1 şi cox2 nu sunt indicatori filogenetici foarte buni pentru studiul relaţiilor de
înrudire dintre ciprinide.

ARN 16S
Analiza filogenetică bazată pe secvenţa nucleotidica a genei mitocondriale
ARN16S de la speciile de ciprinide analizate a evidenţiat împărţirea acestora în două
grupuri: ciprinine şi leuciscine. In arborii obtinuti prin metodele NJ si ML grupul ciprinelor
formează o cladă sperată formata din 4 specii (Carassius auratus auratus, Carassius
auratus gibelio şi Barbus barbus) iar grupul leuciscinelor 8 specii (Hypophtalmycthys
molitrix, Arysthycthys nobilis, Leuciscus cephalus, Tinca tinca, Rutilus rutilus, Gobio
gobio, Scardinius erytrophtalmus şi Phoxinus phoxinus).

30
 Rezum at

Poziţia speciei Phoxinus phoxinus, în arborele filogenetic construit prin metoda

ML, este în aceeaşi cladă cu Scardinius erytrophtalmus, rezultatele fiind în acord cu
datele recente din literatura.
Arborii filogenetici construiti de noi prin metoda Maximum Parsimony nu este în
acord cu datele din literatură deoarece grupul ciprininelor este inclus în leuciscine.

Cit b
Specii le de ciprinide analizate pe baza secvenţelor din gena cit b s-au grupat în
5 subfamilii distincte în toţi arbori construiţi de noi: Barbinae (Barbus meridionalis),
Cyprininae (Carassius sp., Cyprinus carpio), Leuciscinae (Leuciscus sp., Phoxinus
phoxinus, Ctenopharyngodon idella, Abramis sp., Scardinius erytrophtalmus, Tinca
tinca), Hypophthalmichthyinae (Hypophthalmichthys molitrix, Arischthys nobilis),
Gobioninae (Gobio gobio).
În acest studiu, speciile de ciprinide care au aparţinut aceluiaşi gen s-au ramificat
din acelaşi nod filogenetic (de exemplu Carassius, Abramis).
Specia Tinca tinca se desprinde ca linie parafiletică din grupul leuciscinelor.
Arborele filogenetic construit prin metoda ML pe baza secvenţelor din gena cit b
are topologia cea a arboriilor din literatura de specialitate.

Au fost introduse în băncile de date internaţionale (www.ncbi.nlm.nih.gov.url/

GenBank) un număr de unsprezece gene mitocondriale cu următoarele numere de
acces: EF112527 (gena cox1 de la specia Tinca tinca), EF112529 (gena cox2 de la
specia Scardinius erythrophthalmus), EF372634 (gena ARN16S de la specia Misgurnus
fossilis), EF112528 (gena ARN16S de la specia Gobio gobio), EF372635 (gena
ARN16S de la specia Scardinius erythrophthalmus), EF137862 (gena citb de la specia
Barbus barbus), EF173619 (gena citb de la specia Gobio gobio), EF105295 (gena citb
de la specia Scardinius erythrophthalmus), EF137863 (gena citb de la specia Abramis
bjoerka), DQ841176 (gena citb de la specia Tinca tinca), EF094550 (gena citb de la
specia Phoxinus phoxinus).

31
 Rezum at

Bibliografie

1. Agolin Mikaël, 2003, Des organismes à l’inférence phylogénétique: Méthodes et

techniques en systématique moléculaire Université Pierre & Marie Curie, Paris VI.
2. Aldrich John, 1997, R. A. Fisher and the Making of MaximumLikelihood 1912 – 1922, Statistical Science, Vol. 12, No. 3,
162-176.
3. Arai R.,1982, A chromosome study on two Cyprinid Fishes, Acrossocheilus labiatus and Pseudorasbora pumila pumila,
with notes on Eurasian Cyprinids and their karyotypes. Bull. Natn. Sci. Mus., Tokyo Ser. A 8: 131–152.
4. Archie JW, 1989a, A randomization test for phylogenetic information in systematic data. Systematic Zoology 38: 239-252.
5. Archie JW, 1989b, Homoplasy excess ratios: new indices for measuring levels of homoplasy in phylogenetic systematics
and a critique of the consistency index. Systematic Zoology 38: 253-269.
6. Arratia, G., 1999, Mesozoic fishes 2_systematics and fossil record, In: Arratia, G, Schultze, HP Eds. Verlag, Munchen,
Germany, pp 265-334.
7. Ascunce M S; Hasson E; Mulligan C J; Mudry M D, 2007, Mitochondrial sequence diversity of the southernmost extant
New World monkey, Alouatta caraya, Molecular phylogenetics and evolution; 43(1):202-15.
8. Ausubel M.Frederick, Brent Roger, Kingston E. Robert, Moore D. David, Seidman J.G., Smith A. John, Struhl Kevin, Short
protocols in molecular biology, fifth editiond, 2002, ed. John Wiley and Sons Inc., pp.1-29.
9. Avise JC, Arnold J, Ball RM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA and Saunders NC, 1987, Intraspecific
phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Ann Rev Ecol Syst 18: 489-522.
10. Babcock, G. T., and M. Wikstrom, 1992 02 activation and the conservation of energy in cell respiration. Nature (London)
356:301-309.
11. Babcock, C. S. and Asmussen, M. A., 1996, Effects of differential selection in the sexes on cytonuclear polymorphism and
disequilibria. Genetics, 144: 839–853.
12. Bairoch A., 1993, The PROSITE dictionary of sites and patterns in proteins, its current status. Nucleic Acids Res., 21,
3097-3103.
13. Bairoch A. and Boeckmann B., 1993, The SWISS-PROT protein sequence data bank, recent developments. Nucleic
Acids Res., 21, 3093-3096.
14. Bairoch A. and Boeckmann B., 1994, The SWISS-PROT protein sequence data bank: current status. Nucleic Acids Res.,
22, 3578-3580.
15. Barry G.Hall, 2004, Phylogenetic Trees Made Easy, A How-To Manual, second edition, edit. SINAUER.
16. Bănărescu, P., 1964, – „Pisces - Osteichthyes (peşti ganoizi şi osoşi)”, Fauna R. P. R., vol. XIII, Editura Academiei R. P.
R., Bucureşti.
17. Banarescu, P., Coad, B.W., 1991, Cyprinids of Eurasia, In: WinWeld, I.J., Nelson, J.S. (Eds.), Cyprinid Fishes:
Systematics, Biology and Exploitation Chapman & Hall, London, pp. 127–155.
18. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., and Wheeler D.L., 2003, GenBank, Nucleic Acids Research,
31:23-7.
19. Boore J.-L., Daehler L.L. and Brown W.M., 1999, Complete sequence, gene arragement and genetic code of
mitochondrial DNA from the cephalochordate Branchiostoma floridae (“Amphioxus”). Molecular Biology and Evolution 16(3): 410-
418.
20. Boore, J.L., 1999, Animal mithocondrial genomes. Nucleic acids Res. 27:1767-1780.
21. Brown, W.M., M..George, Jr., and A.C. Wilson, 1979, Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proceedings of the
National Academy of Science. 76(4):1967-1971.
22. Benoit Nabholz, Sylvain Glemin, and Nicolas Galtier, 2008, Strong Variations of Mitochondrial Mutation Rate across
Mammals—the Longevity Hypothesis, Mol. Biol. Evol. 25(1):120–130.
23. Berg, L.S., 1940, Classification of fishes, both recent and fossil, Tr. Zool. Inst. Akad. Nauk. SSSR, 5(2): 87–517.
24. Berra, TM, 2001, Freshwater fish distribution, Academic Press, London
25. Berrebi P., Kottelat M., Skelton P., 1996, Systematics of Barbus: state of the art and heuristic comments. Folia Zool 45, 5-
12.
26. Briggs, JC, 1979, Ostariophysan zoogeography: an alternative hypothesis, Copeia: 111-118.
27. Briolay Jerome, Nicolas Galtier, R. Miguel Brito and Yvette Bouvet, 1998, Molecular Phylogeny of Cyprinidae Inferred
from cytochrome b DNA Sequences Molecular Phylogenetics and Evolution, 9,1, pp. 100–108.
28. Brito, M., Briolay, J., Galtier, N., Bouvet, Y., Coelho, M.M., 1997. Phylogenetic relationships within genus Leuciscus
(Pisces, Cyprinidae) in Portuguese freshwaters, based on mitochondrial DNA cytochrome b sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 8,
435–442.
29. Broughton RE, Gold JR. 2000. Phylogenetic relationships in the North American cyprinid genus Cyprinella
(Actinopterygii: Cyprinidae) based on sequences of the mitochondrial ND2 and ND4L genes. Copeia 2000: 1-10.
30. Broughton, R. E., Milam, J. E. and Bruce A.R., 2001, The Complete Sequence of the Zebrafish (Danio rerio) Mitochondrial
Genome and Evolutionary Patterns in Vertebrate Mitochondrial DNA, Genome Research 11:1958–1967.
31. Brown, W. M., 1985, The mitochondrial genome of animals. In Molecular evolutionary genetics (ed. R.J. MacIntyre), pp.
95–130. Plenum, New York.
32. Buican, D., 1997, L'Évolution et les théories évolutionnistes, Masson.
33. Calcagnotto, D., Schaefer, S.A., DeSalle, R., 2005, Relationships among characiform fishes inferred from analysis of
nuclear and mitochondrial gene sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 35, 135–153.
34. Calhoun, M. W., J. W. Thomas, J. J. Hill, J. P. Hosler, J. P. Shapleigh, M. M. J. Tecklenburg, S. Ferguson-Miller, G. T.
Babcock, J. 0. Alben, and R.B. Gennis, 1993, Identity of the axial ligand of the high-spin heme in cytochrome oxidase: spectroscopic
characterization of mutants in the bo-type oxidase of Escherichia coli and the aa3-type oxidase of Rhodobacter sphaeroides,
Biochemistry 32:10905-10911.
35. Cann RL, Stoneking M & Wilson AC (1987) Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325: 31-36.
36. Cantarore, P., M. Robertim G. Pesole, A. Ludovico, F. Milella, M.N. Gadaleta and C. Saccone, 1994, Evolutionary
analysis of cytochrome b sequences in some Perciformes: evidence for a slower rate of evolution than in mammals. Journal of
Molecular Evolution 39:589-597.
37. Cao, Y, Kim, K, Ha, J, Hasegawa, M., 1999, Model dependence of the phylogenetic inference: relationship among
carnivores, perissodactyls and cetartiodactyls as inferred from mitochondrial genome sequences, Genes Genet Syst 74: 211-217.
38. Capaldi RA, 1990, Structure and function of cytochrome c oxidase. Annu Rev Biochem 58:569–586.
39. Carpenter, J. M., 1992, Random cladistics. Cladistics 8,147–153.
40. Carpenter, J. M., 1996, Uninformative Bootstrapping. Cladistics 12, 177–181.
32
 Rezum at

41. Carrez C., 1990, Des structures aux bases de données. Dunod informatique, Paris.
42. Cavender, T.M., and Coburn, M.M., 1992, Phylogenetic relationships of North American Cyprinidae. In Systematics,
historical ecology and north American freshwater fishes, Edited by R.L. Mayden. Stanford University Press, Stanford, Calif. pp. 293–
327.
43. Cavender, T., Coburn, M., 1992, Phylogenetic relationships of North American Cyprinidae,: Stanford University Press,
293-327.
44. Cech T.R., Bass B.L., 1986, Biological catalysis by RNA. Annu. Rev. Biochem. 55:599-630.
45. Chang,Y.S., Huang,F.L. and Lo,T.B., 1994, The complete nucleotide sequence and gene organization of carp (Cyprinus
carpio) mitochondrial genome, J. Mol. Evol. 38 (2), 138-155.
46. Chen Q. K., Hertz G. Z. and Stormo G.D., 1995, MATRIX SEARCH 1.0; A computer program that scans DNA sequences
for transcriptional elements using a database of weight matrices. Comput. Appl. Biosci., 11, 563-566.
47. Chen, X., Yue, P., Lin, R., 1984, Major groups within the family Cyprinidae and their phylogenetic relationships, Acta
Zootaxonomica Sinica (in Chinese), 9(4): 424-440.
48. Chen, X.-L. 1987, Studies on the phylogenetic relationships of chinese leuciscine fishes (Pisces: Cypriniformes). Acta
Zootaxonomica Sinica 12: 427–439.
49. Chen, Y.Y., 1998. Fauna Sinica, Osteichthys: Cypriniformes (Part II). Science Press, Beijing.
50. Chien-Hsien Kuo, Shong Huang and Sin-Che Lee, 2003,Phylogeny of hagfish based on the mitochondrial 16S rRNA
gene, Molecular Phylogenetics and Evolution 28 (3), p. 448-457.
51. Clayton, D.A. 1982. Replication of animal mitochondrial DNA. Cell 28: 693–705.
52. Collares-Pereira Maria João, M.I. Próspero, R.I. Biléu and E.M. Rodrigues,1998, Leuciscus (Pisces, Cyprinidae)
karyotypes: Transect of Portuguese populations Genet. Mol. Biol. vol. 21(1).
53. Cook E. Charles, Austin J.J. and Disney L.H, 2004, A mitochondrial 12S and 16SrRNA phylogeny of critical genera of
Phoridae (Diptera) and related families of Aschiza, Zootaxa 593: 1-11.
54. Craven G.R., Davies J., Davis K., Kahan L., Nomura M. (ed), Ribosomes Structure, Function and Genetics. University
Park Press, Baltimore. pgs. 3-22
55. Craciun Nicolae, Biologia reproducerii la cleanul de balta (Leuciscus borysthenicus ssp. celesticus) de la Comana,
Analele Știinţifice ale Institutului Delta Dunării Tulcea, 1996, 130-151.
56. Croteau, D.L. and Bohr, V.A., 1997, Repair of oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells. J.
Biol. Chem. 272: 25409–25412.
57. Cummings, M.P., S.P. Otto and J. Wakeley, 1995, Sampling properties of DNA Sequence data in phylogenetic analysis.
Molecular Biological Evolution. 12(5):814-822.
58. Cunha C., Mesqiuta N., Dowling T. E., Gilles A. and Coelho M. M., 2002, Phylogenetic relationships of Eurasian and
American cyprinids using cytochrome b sequences. J. Fish Biol. 61, 929-944.
59. Curole, J.P., Kocher, T.D., 1999, Mitogenomics: digging deeper with complete mitochondrial genomes. Trends Ecol. Evol.
14, 394– 398.
60. David K. Simon, Jennifer Friedman, Xandra O. Breakefield, Joseph Jankovic, Mitchell F. Brin, John Provias, Susan B.
Bressman, Michael E. Charness, Daniel Tarsy, Donald R. Johns, Mark A. Tarnopolsky, 2003, A heteroplasmic mitochondrial
complex I gene mutation in adult-onset dystonia, Neurogenetics 4:199–205.
61. Darwin, C. (1997, éd. or. 1859) L'Origine des espèces, Flammarion.
62. Dayhoff M.O., Schwartz R. M. and Orcutt B.C., 1978, A model of evolutionary change in proteins. Atlas of Protein
Structure, 5, Suppl. 3, 345-352.
63. Dimmick, WW, Larson, A., 1996, A molecular and morphological perspective on the phylogenetic relationships of the
otophysan fishes, Mol Phylogenet Evol 6: 120-133.
64. Doadrio Ignacio, Domínguez Omar, Phylogenetic relationships within the fish family Goodeidae based on cytochrome b
sequence data, Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 31, Issue 2, May 2004, Pages 416-430
65. Doadrio, I. and Perdices, A., 2005, Phylogenetic relationships among the Ibero-African cobitids (Cobitis, Cobitidae) based
on cytochrome b sequence data. Mol. Phylogenet. Evol. 37, 484–493.
66. Dowling, T. E., Tibbets, C. A., Minckley, W. L. & Smith, G. R., 2002, Evolutionary relationships of the plagopterins
(Teleostei: Cyprinidae) from cytochrome b sequences. Copeia 665–678.
67. Durand J.D., Templeton A.R., Guinand B., Imsirido A., Bouvet Y., 1999, Nested clade and phylogeographic analyses of
the chub, Leuciscus cephalus (Teleostei, Cyprinidae) in Greece: implicationsfor Balkan Peninsula biogeography. Mol. Phylogenet.
Evol. 13, 566–580.
68. Durand J.D., Unlu E., Doadrio I., Pipoyan S., Templeton A.R., 2000, Origin, radiation, dispersion and allopatric
hybridisation in the chub, Leuciscus cephalus. Proc. R. Soc. Lond. B 267, 1687–1697.
69. Durand J.D, C.S. Tsigenopoulos, E. Ünlü, P Berrebi, 2002, Phylogeny and Biogeography of the Family Cyprinidae in the
Middle East Inferred from Cytochorme b DNA – Evolutionary Significance of This Region, Mol. Phylogenet. Evol. 22, 1, p. 91-100.
70. Durand J.D., Bianco P.G., Laroche J., Gilles A., 2003. Insight into the origin of endemic Mediterranean ichthyofauna:
phylogeography of Chondrostoma genus (Teleostei, Cyprinidae). J. Hered. 94, 315–328.
71. Duxbury, AC, Duxbury, AB, 1997, An introduction to the world's oceans, fifth edn.Wm C BrownDubuque, IA.
72. Echabe, I., Haltia, T., Freire, E., Gofii, F.M. and Arrondo, J.L.R., 1995, Biochemistry 34, 13565-13569.
73. Economidis P.S. and Banarescu P.M., 1991, The distribution and origins of freshwater fishes in the Balkan peinsula,
especially in Grecee. Int. Rev. Ges. Hydrobiol. 76, 257-283.
74. Engelman, D., T. Steitz, and A. Goldman, 1986, Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of
membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15:321-35.
75. Esposti, M.D., S. De Vries, M. Crimi, A. Ghelli, T. Patarnello, amd A. Meyer, 1993, Mitochodrial cytochrome b: evolution
and structure of the protein. Biochimica et Biophysica Acta. 1143: 242-271.
76. Etzold T. and Argos P., 1993, SRS - an indexing and retrieval tool for flat file data libraries. Comput. Appl. Biosci., 9, 49-
57.
77. Farris JS, 1989a, The retention index and homoplasy excess. Systematic Zoology 38: 406-407.
78. Farris JS, 1989b, The retention index and the rescaled consistency index. Cladistics 5: 417-419.
79. Farris, J. S., Albert, V. A., Källersjö, M., Lipscomb, D. and Kluge, A. G.,1996, Parsimony jackknifing outperforms neighbor-
joining, Cladistics 12, 99–124.
80. Felner P., 1974, Structure of the 16S and 23S ribosomal RNAs In: Nomura M., Tissières A., Lengyel P. (ed.), Ribosomes.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. pgs. 169-191.
81. Felstenstein J., 1989, PHYLIP – Phylogeny Inference Package (Version 3.20). Cladistics, 5, 164-166.
82. Felsenstein J., 2004, Inferring Phylogenies, Sinauer Associates, Sunderland, MA.
83. Felsenstein J.,1985, Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap, Evolution 39, 783–791.

33
 Rezum at

84. Felsenstein, J. and kishino, H., 1993, Is there something wrong with the bootstrap on phylogenies? A reply to Hillis and
Bull. Systematic Biology 42, 193–200.
85. Fink SV, Fink WL, 1981, Interrelationships of the ostariophysan fishes, Zool J Linn Soc. 72: 297-353.
86. Finnerty JR., Block BA, 1995, Evolution of cytochrome b in the Scombroidei (Teleostei): molecular insights into billfish
(Istiophoridae and Xiphiidae) relationships. Fisheries Bulletin. 93(1):78-96.
87. Fisher, R. A., 1912, On an absolute criterion for fitting frequency curves. Messenger of Mathematics, 41, 155-160, [CP1
in Bennet, 1971, vol. 1].
88. Fliss M.S., Usadel H., Caballero O.L., Wu L., Buta M.R., Eleff S.M., Jen J., and Sidransky D., 2000, Facile detection of
mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids. Science 287: 2017–2019.
89. Geller, J. B., Carlton, J. T. and Powers, D. A.,1993, Interspecific and intrapopulation variation in mitochondrial ribosomal
DNA sequences of Mytilus spp. (Bivalvia: Mollusca). Mol. Mar. Biol. Biotech. 2, 44-50.
90. Gerdine F. O. Sanson and Marcelo R. S. Briones, 2000, Typing of Candida glabrata in Clinical Isolates by Comparative
Sequence Analysis of the Cytochrome c Oxidase Subunit 2 Gene Distinguishes Two Clusters of Strains Associated with
Geographical Sequence Polymorphisms, J Clin Microbiol. 38(1): 227–235.
91. Gilles Andre , Guillaume Lecointre, Eric Faure, Remi Chappaz and Guy Brun, 1998, Mitochondrial Phylogeny of the
European Cyprinids: Implications for Their Systematics, Reticulate Evolution, and Colonization Time, Molecular Phylogenetics and
Evolution 10, 1, pp. 132–143.
92. Gilles A.; Lecointre G.; Miquelis A.; Loerstcher M.; Chappaz R.; Brun G., 2001, Partial Combination Applied to Phylogeny
of European Cyprinids Using the Mitochondrial Control Region, Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 19, Number 1, pp.
22-33.
93. Gillooly JF, Allen AP, West GB, Brown JH, 2005, The rate of DNA evolution: effects of body size and temperature on the
molecular clock. Proc Natl Acad Sci USA. 102:140–145.
94. Ghosh D., 1993, Status of the transcription factors database (TFD). Nucleic Acids Res., 21, 3117-3118.
95. Golubstov A.F. & Krysanov E.Y., 1993, Karyological study of some cyprinid species from Ethiopia. The ploidy differences
between large and small Barbus of Africa. J. Fish Biol. 42, 445-455.
96. Gorgan Lucian, 2005, Raport de Cercetare “Stabilirea citogenetica a gradului de inrudire si a intervalului de variabilitate a
unor parametri biochimici la specii apartinind familiei cyprinidae”, Revista de Politica tiinţei şi Scientometrie ISSN- 1582-1218,
Numar Special, pag. 34-38.
97. Gosline, W.A., 1978, Unbranched dorsal-fin rays and subfamily classification of the fish family Cyprinidae, Occas. Pap.
Mus. Zool. Univ. Mich. 684: 1–21.
98. Gosline, WA, 1980, Evolution of some structural systems with reference to the interrelationships of modern lower
teleostean fish groups, Jpn J Ichthyol 27: 1-28.
99. Gould S. J., 2002, The structure of evolutionary theory, Harvard University Press (anglophone).
100. Graur Dan, Wen-Hsiung Li, 2000, Fundamentals of molecular evolution, second edition, p. 165-182.
101. Gray, M.W., Burger, G., and Lang, B.F. 1999. Mitochondrial evolution. Science 283: 1476–1481.
102. Green, D.R. and Reed, J.C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science 281: 1309–1312.
103. Greenwood, PH, Rosen, DE, Weitzman, SH, Myers, GS, 1966, Phyletic studies of teleostean fishes, with a provisional
classification of living forms, Bull. Am. Mus. Nat. Hist. 131: 339 - 456.
104. Guegan J.F.,Rab P., Machordom A., and Doadrio I., 1995, New evidence of hexaploidy in `large` African Barbus with
some considerations on the origin of hexaploidz. J. Mol. Evol., 47, 192 -198.
105. Guindon, S., Gascuel, O., 2003, A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum
likelihood. Syst. Biol. 52, 696–704.
106. Gunther, A., 1868, Catalogue of the fishes in the British Museum,Vol. 7. pp. 1–512.
107. Gutell, R.R., B. Weiser, C.R. Woese, and H.F. Noller. 1985. Comparative anatomy of 16S-like ribosomal RNA. Progress
In Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 32:155-216.
108. Gutell, R.R and G.E. Fox. 1988. A compilation of large subunit rRNA sequences presented in a structural format. Nucleic
Acid Research. 16S:r175-r269.
109. Hafner MS, Sudman PD, Villablanca FX, Spradling TA, Demastes JW and Nadler SA, 1994, Disparate rates of molecular
evolution in cospeciating hosts and parasites. Science 265: 1087-1090.
110. Haltia T, Puustinen A, Finel M, 1988, The Paracoccus denitrificans cytochrome aa3 has a third subunit. Eur J Biochem.
172(3):543–546.
111. Hauswirthw W. and P. J. Laipis,1982, Mitochondrial DNA polymorphism in a maternal lineage of Holstein cows. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79: 4686-4690.
112. Häunfling B., Brandl R., 1998, Genetic and morphological variation in a common European cyprinid, Leuciscus cephalus
within and across central European drainages. J. Fish Biol. 52, 706–715.
113. Häunfling B. and R. Brandl, 2000, Phylogenetics of European cyprinids: insights from allozymes. J. Fish Biol. 57, 265-276.
114. He C., Ge L, Zhou Z, X Mu Y, Liu W, Gao X, and Liu ZJ., 2008, Sequence and organization of the complete mitochondrial
genome of spotted halibut (Verasper variegatus) and barfin flounder (Verasper moseri). DNA Sequence, 19:246-255.
115. Hebert, P.D.N., Penton, E. H., Burns, J. M., Janzen,D. H. and Hallwachs, W. 2004a, Ten species in one: DNA barcoding
reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101,14812 –14817.
116. Hebert, P. D. N., Stoeckle, M. Y., Zemlak, T. S. & Francis, C. M. 2004b, Identification of birds through DNA barcodes.
PLoS Biol. 2, 1657–1663.
117. Hellmer, A., I. Voiculescu and W. Schempp. 1991, Replication banding studies in two cyprinid fishes. Chromosoma,
100:524-531.
118. Hendy M.D., Penny D., 1982, Branch and bound algorithms to determine minimal evolutionary trees. Math. Biosci.
59:277-290.
119. Henikoff S. and Henikoff J. G., 1992, Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
10915-10919.
120. Hensel, K., 1970, Review of the classification and of the opinions on the evolution of the Cyprinoidei (Eventognathi) with
an annotated list of genera and subgenera described since 1921, Annot. Zool. Bot. 57: 1–45.
121. Henning W., 1966, Phylogenetic systematics, University of Illinois Press, Urbana.
122. Hill, B. C., 1993, The sequence of electron carriers in the reaction of cytochrome c oxidase with oxygen. J. Bioenerg.
Biomembr. 25:115-120.
123. Hillis, D.M. and M.T. Dixon, 1991, Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review
of Biology. 66(4):411-453.
124. Hillis, D. M. And Bull, J. J., 1993, An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic
analysis. Systematic Biology 42, 182–192.

34
 Rezum at

125. Hogg, I. D. and Hebert, P. D. N. 2004 Biological identification of springtails (Collembola: Hexapoda) from the Canadian
Arctic, using mitochondrial DNA barcodes. Can. J. Zool. 82, 749–754.
126. Horovitz, I. and A. Meyer, 1995, Systematics of New World monkeys (Platyrrhini, Primates) based on 16S mitochondrial
DNA sequences: a comparative analysis of different weighting methods in cladistic analysis. Molecular Phylogenetics Evolution.
4(4):448-456.
127. Howes, G. J. 1987, The phylogenetic position of the Yugoslavian cyprinid fish genus Aulopyges Heckel, 1841, with an
appraisal of the genus Barbus, Cuvier & Cloquet 1816 and the subfamily Cyprininae. Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool) 52: 165–196.
128. Howes, G. J., 1991, Systematics and biogeography: An overview, in Cyprinid Fishes Systematics, Biology and
Exploitation (eds. Winfield, I., Nelson, J.), New York: Chapman & Hall, 1-54.
129. Huanzhang Liu and Yiyu Chen, 2003, Phylogeny of the East Asian cyprinids inferred from sequences of the mitochondrial
DNA control region, Can. J. Zool. 81: 1938–1946.
130. Inafuku, J., M. Nabeyama, Y. Kikuma, J. Saitoh, S. Kubota & S. Kohno, 2000.Chromosomal location and nucleotid
sequences of 5S ribosomal DNA of two cyprinid species (Osteichthyes,Pisces). Chrom. Res. 8: 193–199.
131. Inoue, JG, Miya, M, Aoyama, J, Ishikawa, S, Tsukamoto, K, Nishida, M., 2001a, Complete mitochondrial DNA sequence
of the Japanese eel Anguilla japonica, Fish Sci 67: 118-125.
132. Inoue, JG, Miya, M, Tsukamoto, K, Nishida, M, 2001b, A mitogenomic perspective on the basal teleostean phylogeny:
resolving higher-level relationships with longer DNA sequences, Mol. Phylogen. Evol. 20: 275-285.
133. Irwin, D.M., Kocher, T.D., and Wilson, A.C., 1991, Evolution of the cytochrome b gene of mammals. J. Mol. Evol. 32: 128–
144.
134. Jeanmougin F., Thompson JD, Gouy M., Higgins DG and Gibson TJ, 1998, Multiple sequence alignment with clustal X.
Trends Biochem. Sci., 23, 403-405.
135. Jin L., Nei M., 1990, Limitations of the evolutionary parsimony method of phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 7:82-102.
136. Johnson, GD, Patterson, C., 1996, Interrelationships of fishes, In: Stiasney, MLJ, Parenti, LR, Johnson, GD Eds
Academic Press, London, pp 251-332.
137. Johnson KP and Sorenson MD, 1998a, Comparing molecular evolution in two mitochondrial protein coding genes
(cytochrome b and ND2) in the dabbling ducks (tribe Anatini). Mol Phyl Evol 10: 82-94.
138. Johnston CM, Shimeld SM and Sharpe PT, 1998b, Molecular evolution of the ZFY and ZNF6 gene families. Mol Biol Evol
15: 129-137.
139. Juraj Holčik, 1989, The freshwater Fishes of Europe, vol1/2, General Introduction to Fishes Acinpenseiformes, edit.
AULA-Verlag Wiesbaden.
140. Kenji Saitoh, Masaki Miya, Jun G. Inoue, Naoya B. Ishiguro and Mutsumi B. Nishida, 2003, Mitochondrial Genomics of
Ostariophysan Fishes: Perspectives on Phylogeny and Biogeography, Journal of Molecular Evolution, 10.1007/s00239-002-2417-y
141. Ketmaier, V., Cobolli, M., De Matthaeis, E., Bianco, P.G., 1998. Allozymic variability and biogeographic relationships in
two Leuciscus species complexes (Cyprinidae) from southern Europe, with the rehabilitation of the genus Telestes Bonaparte. It. J.
Zool. 65, 41–48.
142. Ketmaier, V., Bianco, P.G., Cobolli, M., De Matthaeis, E., 2003. Genetic differentiation and biogeography in southern
European populations of the genus Scardinius (Pisces, Cyprinidae) based on allozyme data. Zool. Scr. 32, 13–22.
143. Kikuma, Y., J. Inafuku, S. Kubota & S. Kohno, 2000. Banding karyotype and 5S ribosomal DNA loci in the Japanese
bitterling, Rhodeus ocellatus (Cyprinidae). Chrom. Sci. 3: 101–103.
144. Kimura M.,1980, A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of
nucleotide sequences. J Mol Evol 16: 111-120.
145. Kishino, H, Hasegawa, M., 1989, Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from
DNA sequence data, and the branching order in Hominoidea, J Mol Evol 29: 170-179.
146. Klicka J and Zink RM, 1997, The importance of recent Ice Ages in speciation: A failed paradigm. Science 277: 1666-1669.
147. Kluge AG, Farris JS, 1969, Quantitative phyletics and the evolution of anurans. Systematic Zoology 18: 1-32.
148. Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, Edwards SV, Pääbo S, Villablanca FX and Wilson AC, 1989, Dynamics of
mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proc Natl Acad Sci USA 86: 6196-
6200.
149. Konrad OCALEWICZ, Malgorzata JANKUN and Alicja BOROÑ, 2004, Karyotypic characterization of bream, Abramis
brama (Pisces, Cyprinidae) Folia Zool. 53(3):329 –334.
150. Kujoth Gregory C. Christiaan Leeuwenburgh and Tomas A. Prolla, 2006, Mitochondrial DNA Mutations and Apoptosis in
Mammalian Aging, Cancer Research 66, 7386-7389.
151. Land, A.H. and A.G. Doig, 1960, An automatic method for solving discrete programming problems, Econometrica 28,
497–520.
152. Lauder, G. V., and Liem, K. F. 1983. The evolution and interrelationships of the actinopterygian fishes. Bull. Mus. Com.
Zool., 150: 95-197.
153. Lê, HLV, Lecointre, G, Perasso, R., 1993, A 28S rRNA-based phylogeny of the gnathostomes: first steps in the analysis of
conflict and congruence with morphologically based cladograms, Mol Phylogen Evol 2: 31-51.
154. Lee GY, Jang SI, Yun MJ, 1986, Karyotypes of nine species in the family Cyprinidae fishes from Korea. Korean Journal of
Limnology 19: 59-69.
155. Lecointre, G, Nelson, G., 1996, Interrelationships of fishes, In: Stiasney, MLJ, Parenti, LR, Johnson, GD Eds Academic
Press, London, pp 193-207.
156. Li, Z.-Y., Chen, Y.-R. and J.-X. Yang and X.-Y. Chen,1998, Fishes of genus *Sikukia* (Teleostei, Cypriniformes,
Cyprinidae) in Lancangjiang river system (Cypriniformes: Cyprinidae). Zool. Res.453-457.
157. Lightowlers R. N., P. F. Chinnery, D. M. Turnbull and N. Howell, 1997, Mammalian mitochondrial genetics: heredity,
heteroplasmy and disease. Trends in Genetics 13, 450-455.
158. Liu H., Chen Y., 2003, Phylogeny of the East Asian cyprinids inferred from sequences of the mitochondrial DNA control
region. Can. J.Zool. 81, 1938–1946.
159. Levan, A., K. Fredga and A.A. Sandberg, 1964, Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52:
201–220.
160. Lydeard, C, M.C. Wooten, and A. Meyer 1995. Cytochrome b sequence variation and a molecular phylogeny of the live-
bearing fish genus Gambusia (Cyprinodontiformes: Poeciliidae) Canadian Journal of Zoology./Journal of Canadian Zoology. 73(2):
213-227.
161. Lydeard,C. and Roe,K.J. 1997. The phylogenetic utility of the mitochondrial cytochrome b gene for inferring relationships
among actinopterygian fishes. In: Kocher, T. and Stepian, C. (Eds.); Molecular Systematics of Fishes; Academic Press, Burlington,
MA.

35
 Rezum at

162. Martin A.P., G.J.P. Naylor, and S.R. Palumbi, 1992, Rates of mitochondrial DNA evolution in sharks are slow compared
with mammals. Nature.357 (6374):153-155.
163. Martin, A.P. and Palumbi, S.R., 1993, Body size, metabolic rate, generation time, and the molecular clock. Proc. Nat.
Acad. Sci. 90: 4087–4091.
164. Mayden, R.L., Tang, K.L., Conway, K.W., Freyhof, J., Chamberlain, S., Haskins, M., Schneider, L., Sudkamp, M., Wood,
R.M., Agnew, M., Bufalino, A., Sulaiman, Z., Miya, M., Saitoh, K., He, S., 2007. Phylogenetic relationships of Danio within the order
Cypriniformes: a framework for comparative and evolutionary studies of a model species. J. Exp. Zool., B Mol. Dev. Evol. 308B (5),
642–654.
165. Mazik, E. J., A. T. Toktosunov and S. M. Gnidenko, 1986, Comparative karyological analysis of the daces (Leuciscus,
Cypriniformes, Cyprinidae) from the Northern Tien-Shan. Zool. Zh., 65:1350 -1355.
166. Meyer A. 1993, Evolution of mitochondrial DNA in fishes. In: Biochemistry andMolecular Biology of Fishes vol 2.,
Elsevier, Amsterdamn, 1-38.
167. Michikawa, Y., Mazzuccheli, F., Bresolin, n., scarlato, G., and Attardi, G. 1999. Aging-dependente large accumulation of
point mutations in the human mtDNA control region for replication. Science 286:774-779.
168. Mikkelsen, N.T., C. Schander and E. Willasse, 2007, Local scale DNA barcoding of bivalves (Mollusca): a case study,
Zoologica Scripta. 36 (5): 455-463.
169. Milinkovitch, M. C., Orti, G. and Meyer, A., 1993, Revised phylogeny of whales suggested by mitochondrial ribosomal
DNA sequences. Nature, Lond. 361, 346-348.
170. Mindell D.P., R.L. Honeycutt. 1990. Ribosomal RNA in vertebrates: evolution and phylogenetic applications. Annual
Review of Ecology and Systematics. 21:541-56.
171. MITOMAP: A Human Mithocondrial Genome Database. 2000. Centre for Molecular Medicine, Emory University, Atlanta,
GA.http:// www.gen.emory.edu/mitomap.html.
172. Miya, M, Nishida, M., 1999, Organization of the mitochondrial genome of a deep-sea fish, Gonostoma gracile (Teleostei:
Stomiiformes): first example of transfer RNA gene rearrangements in bony fishes, Mar Biotechnol 1: 416-426.
173. Miyazaki S.,Sugawara H., Gojobori T., and Tateno Y., 2003, DNA databank of Japan (DDBJ) in XML. Nucleic Acids
Research, 31:13-16.
174. Myers G.S., 1960, Preface to any future classification of the cyprinid fishes of the genus Barbus. Standford Ichthyol. Bull.
7, 212-215.
175. Naylor, G. J. P., Collins, T. M., Brown, W. M., 1995, Hydrophobicity and phylogeny. Nature, 373 (6515): 565-566.
176. Naylor, G. J. P., and W. M. Brown, 1998, Amphioxus mitochondrial DNA, chordate phylogeny, and the limits of inference
based on comparisons of sequences. Syst. Biol. 47:61–76.
177. Needleman S. B. and Wunch C. D., 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid
sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 48, 443-453.
178. Nelson, JS, 1994, Fishes of the world, third edn.John Wiley & SonsNew York.
179. Noller, H.F., 1980, Structure and topography of ribosomal RNA. In Ribosomes: Structure, Function, and Genetics
(Chambliss, G. et al., eds), pp. 3–22, University Park Press.
180. Novacek, MJ, Marshall, LG, 1976, Early biogeographic history of ostariophysan fishes, Copeia: 1-12.
181. Nuttal, G. H. F.,1904 Blood Immunity and Blood Relationship. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
182. Oellermann L. K., and Skelton P.H., 1990, Hexaploidy in yellow-fish species (Barbus, Pisces, Cyprinidae) from southern
Africa. J. Fish. Biol. 37, 105-115.
183. Ohno S, 1970, Evolution by Gene Duplication. Springer-Verlag: New York.
184. Okazaki M, Naruse K, Shima A, Arai R. 2001. Phylogenetic relationships of bitterlings based on mitochondrial 12S
ribosomal DNA sequences. Journal of Fish Biology 58: 89-106.
185. Olsen G.J. (1991) Systematic underestimation of tree branch lengths by Lake's operator metrics: an effect of position-
dependent substitution rates. Mol. Biol. Evol. 8:592-608.
186. Oris I. Sanjur, Jose A. Carmona and Ignacio Doadriob, 2003, Evolutionary and biogeographical patterns within Iberian
populations of the genus Squalius inferred from molecular data, Molecular Phylogenetics and Evolution 29: 20–30.
187. Ortí, G., P. Petry, J.I.R. Porto, M. Jegu, and A. Meyer. 1996. Patterns of nucleotide change in mitochondrial ribosomal
RNA genes and the phylogeny of piranhas. Journal of Molecular Evolution. 42(2):169-182.
188. Ortí, G., 1997, Molecular systematics of fishes, In: Kocher, TD, Stepien, CA Eds. Academic Press, San Diego, pp 219-
243.
189. Oţel Vasile, 2007, Atlasul peştilor din Rezervaţia biosferrei Delta Dunării, Edit. Centrul de Informare Tehnologica Delta
Dunarii, Tulcea
190. Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J.K., Markowitz, S.D., Trush, M.A., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B.,
1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours. Nat. Genet. 20: 291–293.
191. Posada D. and Buckley T.R., 2004, Model selection and model averaging in phylogenetics: advantages of the AIC and
Bayesian approaches over likelihood ratio tests. Syst. Biol.53, 793-808.
192. Prochaska LJ, Fink PS., 1987, On the role of subunit III in proton translocation in cytochrome c oxidase. J Bioenerg
Biomembr, 19(2):143–166.
193. Ràb, P. 1991. The karyotype of the cyprinid fish, Pseudaspius leptocephalus. Japan. J. Ichthyol., 38: 329-331.
194. Ràb, P. and M. J. Collares-Pereira, 1995, Chromosomes of European cyprinid fishes (Cyprinidae, Cypriniformes): a
review. Folia Zoologica, 44:193-214.
195. Rab Petr, Annie Machordom, Anabel Perdices and Jean-Francois Guegan, 1995, Karyotypes of three `small` Barbus
species (Cyprinidae) from Republic of Guinea (Western Africa) with a review on karyology of African small Barbus, Caryologia, Vol.
48, N. 3-4: 299-307.
196. Ràb, P., Y. Karakousis, M. Ràbovà and P. S. Economidis. 1996, Banded karyotype of the cyprinid fish Leuciscus
borysthenicus. Ichthyol. Res., 43 (4): 463-468.
197. Rasmussen A-S, Arnason U., 1999, Molecular studies suggest that cartilaginous fishes have a terminal position in the
piscine tree. Proc Natl Acad Sci USA 96:2177-2182.
198. Regan, C.T., 1911, The classification of the teleostean fishes of the order Ostariophysi. 1. Cyprinoidei, Nat. Hist. Mag.
8(8): 13–32.
199. Rosen, DE, Greenwood, PH, 1970, Origin of Weberian apparatus and the relationships of the ostariophysan and
gonorynchiform fishes, Am Mus Novit 2428: 1-25.
200. Rosen, DE , 1973, Interrelationships of higher euteleostean fishes, Zool J Linn Soc 53: 373-395.
201. Saitoh K., Sado T., Mayden R.L., Hanzawa N., Nakamura K.,Nishiba M. and Miya M., 2006, Mitogenomic evolution and
Interrelationships of the Cypriniformes (Actynopterygii: Ostariophysi): The first evidence towards resolution of higher-level
relationships of the world’s largest fresh-water fish clade based on 59 whole mitogenome sequences. J. Mol.Evol., 63, 826-841.

36
 Rezum at

202. Saitou N and Nei M., 1987, The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Bio.
Evol., 4, 406-425.
203. Sanderson,M. J., 1989, Confidence limits on phylogenies: The bootstrap revisited. Cladistics 5, 113–129.
204. Sanderson, M. J., 1995, Objections to bootstrapping phylogenies: A critique. Systematic Biology 44, 299–320.
205. Sanger F., Nicklen S. et Coulson A. R., 1977, DNA sequencing with chain-terminating terminators. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74 : 5463-5467.
206. Saraste, M. 1999. Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science 283:1488-1493.
207. Sasaki T., Kartavtsev Yuri P., Chiba Satoru N., Takayuki Uematsu, Sviridov V. V. and Hanzawa N., 2007, Genetic
divergence and phylogenetic independence of far eastern species in subfamily Leuciscinae (Pisces: Cyprinidae) inferred from
mitochondrial DNA analyses, Genes Genet. Syst. 82, 329-340.
208. Schatz G., 1996, The protein import system of mitochondria. J. Biol. Chem. 271: 31763–31766.
209. Schmidt T.R., J.P. Bielawski and J.R. Gold, 1998, Molecular phylogenetics and evolution of the cytochrome b gene in the
cyprinid genus Lythrurus (Actinopterygii: Cypriniformes). Copiea. 1998(1):14-22.
210. Schwartz R. M. and Dayhoff M. O.,1979, Matrices for detecting distant relationships. Atlas of Protein Structure, 5, Suppl.
3, 353-358.
211. Snedecor George W & Cochran William G. Statistical Methods. The Iowa State University Press 6th Edn Reprint 1968**
(1967).
212. Sergei Izrailev, Antony R. Crofts, Edward A. Berry, and Klaus Schulten, 1999, Steered molecular dynamics simulation of
the Rieske subunit motion in the cytochrome bc1 complex.. Biophysical Journal, 77:1753-1768.
213. Shadel G.S. and Clayton D.A., 1997, Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Annu. Rev. Biochem. 66: 409–435.
214. Shunping He, Liu Huanzhang, Chen Yiyu, Masayuki Kuwahara, Tsuneo Nakajima and Zhong Yang, 2004, Molecular
phylogenetic relationships of Eastern Asian Cyprinidae (Pisces: Cypriniformes) inferred from cytochrome b sequences, Science in
China Ser. C Life Sciences 47 (2), 130-138.
215. Shunping He, Richard L. Mayden, Xuzheng Wang, Wei Wang, Kevin L. Tang, Wei-Jen Chen and Yiyu Chen, 2007,
Molecular phylogenetics of the family Cyprinidae (Actinopterygii: Cypriniformes) as evidenced by sequence variation in the first
intron of S7 ribosomal protein-coding gene: Further evidence from a nuclear gene of the systematic chaos in the family, Molecular
Phylogenetics and Evolution, Article in Press.
216. Sibley C. G., Ahlquist J. E. and Monroe B.L., 1988, A classification of the living birds ol the world based on DNA/DNA
hybridization studies. Auk 105:409-423.
217. Smith T.F. and Waterman M.S., 1981, Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol., 147, 195-197.
218. Sofradzija A., 1977, Caryology and cytotaxonomy of the Leuciscus species from the waters in Bosnia and Herzegovina.
Godisnjak Biol. Inst. Univ. Sarajevo, 30:113-211. (In Serbo-Croatian).
219. Soltis DE, Soltis PS (1999). Polyploidy: recurrent formation and genome evolution. Trends Ecol Evol 14: 348–352.
220. Song, C.B., T.J. Near, and L.M. Page, 1998, Phylogenetic Relations among percid fishes as inferred from mitochondrial
cytochrome b DNA sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution. 10(3):343-353.
221. Stoesser G., Baker W., van den Broek, A., Garcia-Pastor, M., Kantz, C., Kulikova, T., Leinonen, R., Lin, Q., Lombard V.,
Lopez, R., Mancuso, R., Nardone., R., Stoehr, P., Tuli, M., A., Tzouvara K. and Vaughan, R., 2003, The EMBL Nucleotide
Sequence Database: Major new developments. Nucleic Acids Research, 31: 17-22.
222. Susin, S.A., Lorenzo, H.K., Zamzami, N., Marzo, I., Snow, B.E.,Brothers, G.M., Mangion, J., Jacotet, E., Constantini, P.,
Loeffler, M., et al. 1999, Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 397: 441–446.
223. Swofford DL, 1993, PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony. Illinois Natural History Survey, Champaign, Illinois.
224. Swofford D.L., Olsen G.J., 1990, Phylogeny reconstruction In: Hillis D.M., Moritz C. (eds) Molecular systematics. Sinauer
Associates, Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts, U.S.A. pgs. 411-501.
225. Swofford, D.L. 2003. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other methods), Version 4.0b10. Sinauer
Associates, Sunderland, MA.
226. Takai, A. and Y. Ojima, 1999, Constitutive heterochromachin distribution in the chromosomes of pomacentrid fishes
(Perciformes). Cytologia 64: 87–91.
227. Takeshi Sasaki, Yuri P. Kartavtsev, Satoru N. Chiba, Takayuki Uematsu, Vladimir V. Sviridov and Naoto Hanzawa, 2007,
Genetic divergence and phylogenetic independence of far Eastern species in subfamily Leuciscinae (Pisces:Cyprinidae) inferred
from mitochondrial DNA analyses, Genes Genet. Syst. 82, 329-340.
228. Tajima F, 1989, Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123: 585-
595.
229. Tajima Fumito, 1993, Unbiased estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences Mol. Biol. and Evol.,
10, 677-688.
230. Taubenberger JK, Reid AH, Krafft AE, Bijwaard KE and Fanning TG, 1997, Initial genetic characterisation of the ‘Spanish’
influenza virus. Science 275: 1793-1796.
231. Thieman J.W. and Palladino M.A., Introduction to Biotechnology, 2004, ed. Benjammin Cummings 1301 Sansome street,
San Francisco, pp.108-111.
232. Tsingenopoulos, C.S., Berrebi, P., 2000. Molecular phylogeny of North Mediterranean freshwater barbs (genus Barbus:
Cyprinidae) inferred from cytochrome b sequences: biogeographic and systematic implications. Mol. Phylogenet. Evol. 14, 165–179.
233. Tsigenopoulos C.S., P. Ràb, D. Naran and P. Berrebi, 2002, Multiple origins of polyploidy in the phylogeny of southern
African barbs (Cyprinidae) as inferred from mtDNA markers, Heredity 88, 466–473.
234. Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, Tomizaki T, Yamaguchi H, Shinzawa-Itoh K, Nakashima R, Yaono R, Yoshikawa S
(1996), The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science 272:1136–1144.
235. Ueda, T. and J. Kobayashi, 1990. Karyotype differentiation of Atlantic salmon, Salmo salar; especially the sequential
karyotype change. La Kromosomo 58: 1967.
236. Ueda T., Naoi H. and Arai R., 2001, Flexibility on the karyotype evolution in bitterlings (Pisces, Cyprinidae), Genetica 111:
423–432.
237. Vater, L. and W.M Brown, 1993, Rates and patterns of base change in the small subunit ribosomal RNA gene. Genetics.
134:597-608.
238. Voelker G.; Edwards S. V., 1998, Can Weighting Improve Bushy Trees? Models of Cytochrome b Evolution and the
Molecular Systematics of Pipits and Wagtails (Aves: Motacillidae),Systematic Biology, Volume 47, Number 4, pp. 589-603.
239. Vujosevic M., Zizkovic S., Rimsa D., Jurisic S. and Cakic P., 1983, The chromosomes of 9 fish from Dunav basin in
Yugoslavia. Acta Biol. Jug.-Ichthyol. 15: 29-40.
240. Wallace D.C.,1999, Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283: 1482–1488.
241. Wallace DC. 2005. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for
evolutionary medicine. Annu Rev Genet. 39:359–407.

37
 Rezum at

242. Ward, R.D., Zemlak, T.S., Innes, B.H., Last, P.R., and P.D.N. Hebert, 2005, DNA barcoding Australia's fish species Phil.
Trans. R. Soc. B. 360 (1462) 1847 - 1857.
243. Webb, S.A., 1998, A Phylogenetic Analysis of the Goodeidae (Teleostei, Cyprinodontiformes). University of Michigan,
Ann. Arbor. pp. 225.
244. Wiley, E.O., D. Siegel-Causey, D.R. Brooks and V.A. Funk, 1991, The Complete Cladist; A Primer of Phylogenetic
Procedures Special Publication No. 19, Museum of Natural History, The University of Kansas, Lawrence, Kansas.
245. Wiley, E.O., G. D. Johnson and W.W. Dimmick, 1998, The phylogenetic relationships of Lampridiform fishes (Teleosteoi:
Acanthomorpha), based on a total evidence analysis of morphological and molecular data. Molecular Phylogenetics and Evolution.
10(3):417-425.
246. Wilson A.C. and Sarich V.M., 1969, A molecular time scale for human evolution. PNAS Vol.63 (No.4), pp.1088-1093.
247. Wilson, A. C., 1985 The molecular basis of evolution. Sci. Am. 253(4): 164–173.
248. Winfield I., and Nelson J., 1991, ‘‘Cyprinid Fishes: Systematic biology and exploitation,’’ Chapman and Hall, New York.
249. Wolf U., Ritter H., Atkin N., & Ohno S., 1969, Polyploidization in the fish Cyprinidae, order Cypriniformes. I. DNA content
and chromosome sets in various species of Cyprinidae, Hum. Genet. 7, 240-244.
250. Woese C.R., Fox G.E., 1977a, Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5088-5090.
251. Woese C.R., Fox G.E., 1977b, The concept of cellular evolution, J. Mol. Evol.
10: 1-6.
252. Woese C.R., 1987, Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221-271.
253. Xuzhen Wang, Junbing Li, Shunping He, 2007, Molecular evidence for the monophyly of East Asian groups of Cyprinidae
(Teleostei: Cypriniformes) derived from the nuclear recombination activating gene 2 sequences, Molecular Phylogenetics and
Evolution 42, 157–170.
254. Yang, Z., 1997, PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood, CABIOS 13: 555-556.
255. YOU Feng, LIU Jing, ZHANG Peijun, XIANG Jianhai, 2005, Preliminary study on mitochondrial 16S rRNA gene
sequences and phylogeny of flatfishes (Pleuronectiformes), Chinese Joumal of Oceanology and Limnology Vol. 23 No. 3, 335-339.
256. Zardoya, R. and A. Meyer, 1996, Phylogenetic performace of mitochondrial protein coding genes in resolving
relationships among vertebrates. Molecular Biologyand Evolution. 13(7):933-942.
257. Zardoya, R. and A. Meyer. 1997. Molecular phylogenetic information on the identity of the closest living relative(s) of land
vertebrates. Naturwissenschaften. 84(9):389-397.
258. Zardoya R., and Doadrio I.,1998, Phylogenetic relationships of Iberian cyprinids: Systematic and biogeographical
implications, Proc. R. Soc. Lond. B 265: 1365–1372.
259. Zardoya, R., Doadrio, I., 1999, Molecular evidence on the evolutionary patterns of European Cyprinids. J. Mol. Evol. 49,
227–237.
260. Zardoya, R., Economidis, P.S., Doadrio, I., 1999, Phylogenetic relationships of greek Cyprinidae: Molecular evidence for
at least two origins of the greek Cyprinid fauna. Mol. Phylogenet. Evol. 13,122–131.
261. Zarowiecki M.Z., Huyse T., Littlewood D.T., 2007, Making the most of mitochondrial genomes- markers for phylogeny,
molecular ecology and barcodes in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea), Int J Parasitol., 37(12): 1401-18.
262. Zhang J and Nei M, 1996, Evolution of antennapedia-class homeobox genes. Genetics 142: 295-303.
263. Zharkikh, A. and Li, W.-H., 1992a, Statistical properties of bootstrap estimation of phylogenetic variability from nucleotide
sequences. I. Four taxa with a molecular clock. Molecular Biology and Evolution 9, 1119–1147.
264. Zharkikh, A. and Li, W.-H.,1992b, Statistical properties of bootstrap estimation of phylogenetic variability from nucleotide
sequences. II. Four taxa without a molecular clock. J. Molecular Evolution 35, 356–366
265. Zhu T, Korber BT, Nahmias AJ, Hooper E, Sharp PM and Ho DD, 1998, An African HIV-1 sequence from 1959 and
implications for the origin of the epidemic. Nature 391: 594-597
266. Zuckerkandl E. and Pauling L.,1965, Molecules as documents of evolutionary history. J. Theoret. Biol. 8, 357-366.

Pagini web uitilizate

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html
www.barcodes.org

38