UNIVERSITATEA BUCURETI FACULTATEA DE BIOLOGIE Sec ia Biochimie

Lucrare de Licen Relatiile filogenetice bazate pe analiza ADNmt la specile de salmonide din Romania

Coordonator: Lector Dr. Georgescu Sergiu-Emil

Student: Mitroi Daniel-Nicolae

BUCURETI
1

2011
CUPRINS

Introducere................................................................................................... CAPITOL I:................................................................................................7 1.Caracterizarea familiei i ncadrarea taxonomic a salmonidelor..... 2.Caraterizarea speciilor de salmonide.......................................................
a)Pstrvul indigen (comun) - Salmo trutta fario L............................................ b)Pstrvul fntnel - Salvelinus fontinalis M.......................................................... c)Pstrvul de mare - Salmo trutta labrax P........................................................... d)Pstrvul curcubeu - Oncorhynchus mykiss M.................................................. e)Lipanul - Thymallus thymallus L........................................................................ f)Lostria - Hucho Hucho L....................................................................................

CAPITOL II:............................................................................................23 1.Markeri moleculari la salmonide..............................................................

a)ADNmt la salmonide........................................................................................ b)Filogenia moleculara a salmonidelor pe baza markerilor mitocondriali..........

2.Tehnica PCR-RFLP...................................................................................
a)PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION )..................................................... b)Tehnica PCR-RFLP

CAPITOL III: Materiale i metode........................................................43 1. Recoltarea probelor de esut la salmonide 2. Extracia ADN la salmonide 3. Desemnarea de primeri specifici pentru amplificarea secvenelor ARN de interes filogenetic 4. Determinarea temperaturii de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient 5. Amplificarea genelor ARNr16S, ARNr12S i ARNt la salmonide 6. Secvenierea ADN
2

7. Construirea arborilor filogenetici CAPITOL IV: REZULTATE I DISCUII ..............................................67 1.Optimizarea protocoalelor PCR pentru genele mitocondriale ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt 2.Diferen ele dintre specii in urma secven ieri i comparri cu baza de date GenBank 3.Construirea arborilor filogenetici pe baza secvenelor obinute CAPITOL V: PARTEA PRACTICA.........................................................96 1. Determinarea temperaturii optime de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient de temperatur 2.Amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la salmonide 3.Tehnica PCR-RFLP 4.Rezultate i discuii
a)Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop b)Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea unei regiuni extinse din genomul mitocondrial n vederea realizrii tehnicii PCR-RFLP c) Analiza produilor de restricie ai regiunii mitocondriale extinse de la salmonide

CONCLUZII..............................................................................................110 BIBLIOGRAFIE

Introducere
Salmonidele reprezint un grup heterogen de peti reunii ntr-o singur familie, Salmonidae, cu 66 de specii. Sunt specii raspndite n emisfera nordic i care au fost introduse n foarte multe ri pentru pescuit sportiv i acvacultur. Majoritatea speciilor prefer n general apele reci, limpezi, cu fund pietros i bine oxigenate, n special din zona montan. Excepie face Salmo trutta labrax, specie endemic bazinului Pontic, ntlnit n Marea Neagr i Marea Azov i care i desfaoar ciclul trofic n mediul marin. Indivizii acestei specii se reproduc n ruri, cautnd o ap ct mai bogat n oxigen. Importana salmonidelor se manifest att la nivel comercial, ct i social. Unele specii de salmonide sunt crescute n condiii intensive n pstrvrii, pentru consum alimentar i sunt de asemenea, foarte cutate pentru pescuit sportiv. n cteva ri din Europa (de exemplu, Suedia, Danemarca, Germania, Elveia, Irlanda, Frana, Spania) speciile de salmonide prin importana pe care o prezint pentru pescuitul sportiv susin o parte nsemnat a turismului n regiunile n care se gsesc. Dintre speciile de salmonide, pstrvul n special, este important pentru dezvoltarea turismului n regiuni unde industria este mai puin dezvoltat, i astfel, oportunitile de angajare ale locuitorilor din zonele respective sunt mult mai sczute (de exemplu, n Vestul Irlandei sau n regiunea Galicia din Spania). Romnia este una dintre rile europene cu un important potenial salmonicol natural i cu bune perspective n dezvoltarea creterii intensive a salmonidelor. n fauna rii noastre sunt prezente la ora actual 6 specii de salmonide: Salmo trutta fario (pstrvul indigen), Salmo trutta labrax (pstrvul de Marea Neagr), Salvellinus fontinallis (fntnelul), Hucho hucho (lostria), Thymallus thymallus (lipanul) i Onchorynchus mykiss (pstrvul curcubeu). La aceste specii se aduag reprezentani ai genului Coregonus (speciile Coregonus albula ladogensis i Coregonus lavaraetus maraenoides) care au fost introdui expeimental n anumite lacuri din Romnia, dar despre care nu exist date privind adaptarea i dezvoltarea. Se pare c la ora actual cea mai rspndit specie din mediul natural este Salmo trutta fario L. (pstrvul indigen), iar cele mai reduse populaii sunt cele de lostri (Hucho hucho L.) i coregon (ambele specii). n cazul lostriei, degradarea arealelor i pescuitul au determinat o diminuare a efectivelor pn la limita supravieuirii. Din acest motiv, habitatul acestei specii este protejat atat la nivel european (Directiva nr. 92/43 EEC adoptata la 21 mai 1992), ct i n ara noastr (Legea nr. 462 din 18 iulie 2001). Alturi de lostri, pstrvul de Marea
4

Neagr (Salmo trutta labrax), sub-endemit pontic, inclus n Lista Roie a Rezervaiei Biosferei Delta Dunrii (Oel 2007) este o alt specie periclitat din Romnia, cu potenial real pentru dezvoltarea salmoniculturii. Pescuitul excesiv, construirea barajelor, poluarea i ali factori antropici care au determinat reducerea efectivelor de salmonide din mediul natural au impus adoptarea unor soluii de tipul dezvoltrii salmoniculturii intensive. n plus, pstrvul ca i aliment de consum este perceput ca bun pentru sntatea omului pentru c este srac n calorii, bogat n proteine, vitamine, fier, fosfor i lecitin. Acesta reprezint unul dintre motivele pentru care creterea salmonidelor n sistem intensiv a cunoscut o mare dezvoltare. Prima ncercare de a reproduce artificial aceste specii dateaz nc de al mijlocul secolul al XIV-lea, dar cei mai muli autori atribuie dezvoltarea fertilizrii artificiale la salmonide lui Stephan Ludwing Jacobi (17111784). Descoperirile acestuia au fost utilizate n 1842, n Frana, de Remy i Gehin care au obinut prin reproducere artificial indivizi de pstrv curcubeu pentru repopularea afluenilor rului Moselle. n 1848, Academia Francez a obinut susinerea guvernului francez pentru construirea primei pstrvrii n Huningue (Alsacia) (Blanco, 1995). n Statele Unite, prima pstrvrie a fost inagurat n Maine, n 1871, iar n Japonia primul experiment de reproducere artificial a salmonidelor a avut loc n 1876, folosindu-se aproximativ 17 000 de icre recoltate din fluviul Nakagawa. n Romnia creterea salmonidelor a nceput prin nfiinarea unor iazuri i eletee, la nceput pentru a asigura pete proaspt i uor accesibil. Primele pstrvrii din ara noastr dateaz din 1890 Valea Putnei, 1902 Barnar i Tarcu (Bucovina i Moldova); 1928 Gudea, Fini (Transilvania). Salmonicultura modern a avut cretere exploziv ncepnd cu anii 80 ai secolului trecut, n special n Marea Britanie i Danemarca. Obinerea i creterea salmonidelor n condiii intensive necesit ape reci, bogate n oxigen i cu un nivel foarte sczut de poluani, departe de marile centre urbane. Dei, salmonidele sunt specii cu originea n emisfera nordic, aproximativ 40% din producia salmonicol provine din ri din emisfera sudic, unde aceste specii au fost introduse cu succes. Chile i Norvegia sunt lideri la producia de somon i pstrv, deinnd aproximativ 76% din totalul pieei. Ali productori importani sunt Marea Britanie, Canada, Turcia, Danemarca, Statele Unite, Frana, Spania, Japonia. Somonul de Atlantic (Salmo salar) este specia cel mai frecvent utilizat n acvacultura salmonidelor, urmat de pstrvul curcubeu (Oncorhynchus mykiss) (Fig. 1).
5

Figura 1. Principalele specii de salmonide utilizate n acvacultur. Cifrele sunt exprimate n tone. (Surs: FAO global databases: Aquaculture production 2005).

n Romnia, Regia Naional a Pdurilor gestioneaz 43 de pstrvrii. La acestea se adaug un numr important de pstrvrii din sectorul privat. La ora actual, speciile folosite n creterea intensiv la noi n ar sunt : pstrvul indigen (Salmo trutta fario L.), pstrvul fntnel (Salvelinus fontinalis M), pstrvul curcubeu (Oncorhynchus mykiss W.) i lostria (Hucho hucho L.). Dintre acestea, pstrvul curcubeu se preteaz cel mai bine la creterea intensiv. Pstrvul fntnel este o specie care preteaz la creterea intensiv, dar prezint o sensibilitate mai mare la boli, necesitnd densiti de cretere mai sczute. Pstrvul indigen se crete n special pentru repopularea apelor de munte. Exist o practic destul de periculoas pentru viitorul conservrii genofondului salmonicol din mediul natural: pentru a compensa declinul populaional i suporta presiunea pescuitului sportiv se practic repopularea apelor de munte cu exemplare din specii neadaptate i hibrizi care nu sunt caracteristice bazinului hidrografic respectiv. Lund n consideraie acest fapt, se impune evaluarea distribuiei i caracterizarea variabilitii genetice a salmonidelor din Romnia.

Pn n prezent n Romnia, nu s-a efectuat un studiu unitar al salmonidelor din punct de vedere genetic, studiu absolut necesar pentru identificarea speciilor autohtone, alohtone sau hibride de salmonide.

CAPITOL I: 1. Caracterizarea familiei i ncadrarea taxonomica a salmonidelor

n ciuda importanei salmonidelor, istoria lor evolutiv a constituit pentru o lung perioad de timp un subiect de disput. Studiile filogenetice anterioare la nivel de gen i specie au oferit informaii importante despre relaiile existente ntre reprezentanii familiei Salmonidae, dar mai ramn nc destule ntrebri, n special viznd speciile genurilor Oncorhynchus i Salvelinus. Speciile de salmonide actuale provin din trei mari linii: Coregoninae, Thymallinae i Salmoninae. n general este acceptat faptul c toate cele trei linii formeaz un grup monofiletic. Familia Salmonidae a aprut n Eocenul Mijlociu, reprezentativ fiind specia Eosalmo driftwoodensis. Aceast specie fosil era destul de asemntoare cu specia de lipan actual i posed o serie de caractere comune liniile actuale Salmoninae, Coregoninae i Thymallinae. Astfel, Eosalmo driftwoodensis reprezint un salmonid arhaic i constituie un stadiu foarte important n evoluia familiei. Cea mai veche fosil aparinnd genului Salvelinus dateaz de acum 10 milioane de ani. Urmtoarele specii fosile identificate dateaz din Miocenul Superior (acum aproximativ 7 milioane de ani). O parte dintre aceste specii fosile par a fi foarte apropiate de genul Oncorhynchus actual, susinnd ipoteza conform creia genul Oncorhynchus a aprut nainte de Pliocen. De asemenea, segregarea dintre Oncorhynchus i Salmo s-a petrecut naintea acestei ere geologice. Speciaia la nivelul genului Oncorhynchus a fost examinat de o perioad ndelungat i cu toate acestea, nici la ora actual nu s-a formulat o concluzie cu privire la interrelaiile existente ntre membrii acestui gen. La fel de controversat este i originea salmonidelor n ap dulce, respectiv ap srat, existnd susintori ai ambelor ipoteze. Originea n ap dulce a salmonidelor este susinut de
7

faptul ca speciile de salmonide mai primitive, cum ar fi Thymalinae sau Coregoninae, care au aprut naintea Salmoninaelor, sunt i la ora actual specii rezidente de ap dulce. Tchernavin (1939) a sugerat c salmonidele ancestrale erau peti de dimensiuni mici, viu colorai care triau n ape curgtore sau lacuri reci din emisfera nordic. Folosind cursurile de ap dulce, aceti peti s-au rspndit pe o arie extins. Diversitatea ecologic a regiunilor n care s-au rspndit a favorizat formarea numeroaselor specii (Neave, 1958). Salmonidele prezint urmtoarea clasificare taxonomic: ncrengtura Supraclasa Clasa Subclasa Supraordinul Ordinul Familia Subfamilia - Vertebrate - Pisces - Osteichthyes - Actinopterygii - Teleostei - Salmoniformes - Salmonidae - Coregoninae - Salmoninae - Thymalinae Salmonidele aparin clasei Osteichtyes, subclasa Actinopterygii, subdiviziunea Teleostei. Ordinul Salmoniformes are o singura familie Salmonidae i cuprinde 3 subfamilii: i. Corenidae - cu 10 specii i 3 genuri. ii. Salmonide - cu 25 specii, cuprinse n 5 genuri. iii. Thymallidae - cuprinde 4 specii ntr-un singur gen. Iniial, filogenia salmonidelor a fost stabilit n urma unor studii de morfologie extern sau dup caracterele anatomice. n ciuda numrului mare de studii de filogenie clasic, relaiile filogenetice ntre anumite specii ale acestui grup de peti au rmas neclarificate. Cele 66 de specii de salmonide sunt reunite ntr-o singura familie Salmonidae, ce cuprinde trei subfamilii Coregoninae, Thymallinae i Salmoninae. Cea mai numeroas dintre aceastea, subfamilia Salmoninae include 5 genuri Hucho, Salmo, Oncorhynchus, Brachymystax i Salvelinus, cu o larg distribuie n emisfera nordic.
8

Putem, deci afirma relaiile filogenetice ntre speciile de salmonide sunt complexe i destul de dificil de stabilit. Phillips & Oakley (1997) au considerat c motivele pentru care precizarea filogeniei salmonidelor este dificil sunt urmtoarele: (1) aceti peti au suferit o radiaie adaptativ rapid consecutiv tetraploidizrii acum 50-100 milioane de ani; (2) hibridizarea i introgresia reprezint fenomene comune n cadrul acestui grup de peti; (3) prin recolonizarea lacurilor rezultate din glaciaie n ultimii 10000 de ani a rezultat acumularea unor ecotipuri sau morfotipuri simpatrice (care ocup acelai areal sau ale cror areale se suprapun) cu diferite grade de izolare reproductiv n apele din emisfera nordic. Studiile filogenetice anterioare la nivel de gen i specie au oferit informaii importante despre relaiile existente ntre reprezentanii familiei Salmonidae, dar mai rmn nc destule ntrebri, n special viznd speciile genului Oncorhynchus i Salvelinus. Speciile de salmonide din Romnia au fost carcaterizate din punct de vedere taxonomic prin metode clasice (analize biometrice i morfologice) de Bnrescu et al., 1964. Totui, analiza taxonomic a ajuns n impas datorit imposibilitii de a determina morfometric diferenele dintre speciile de peti apropiate i se impune o caracterizare filogenetic a speciilor utiliznd criterii moleculare. innd seama de importana economic i stiinific a acestor specii, este absolut necesar realizarea la salmonide a unor studii de filogenie molecular bazate pe analiza ADN, lund n considerare i datele clasice de filogenie i sistematic de nalt valoare stiinific.

2. Caracterizarea speciilor de salmonide

a) Pstrvul indigen (comun) - Salmo trutta fario L.
Este specia nativ cu cea mai mare raspndire n Europa. A fost introdus i n India, Australia, America de Nord i de Sud, Madagascar. Pstrvul comun este un pete foarte polimorfic, prezentnd mai multe subspecii, care reprezint de fapt populaii cu distribuie geografic i comportament distinct. Este un salmonid stenotermal, care prefer apele limpezi, reci (1216 C) i puternic oxigenate. Nu suport mari variaii de temperatur. Reproducerea are loc la sfritul toamnei sau nceputul iernii cnd migreaz n amonte i i depune icrele pe un teren cu pietri fin. Puietul eclozeaz n perioada 15 martie - 15 aprilie. n Romnia este ntlnit n mai toate cursurile de ap din zona montan, populeaz lacurile naturale i artificiale, inclusiv unele lacuri alpine din Munii Fgra, Parng i
9

Retezat. Dup adaptarea la creterea n sistem intensiv a fost realizat cel mai amplu program de populare i repopulare a apelor de munte cu aceasta specie.

Denumiri: engleza - Brown trout; franceza - Truite commune; germana Bachforelle; denumiri populare pastrav, pastrug, patat. Raspandire: Specia nativa cu cea mai raspandire in Europa ( Belgia, Danemarca, Finlanda, Germania, Franta, Olanda, Elvetia, Ucraina, Suedia). Dupa adaptarea la cresterea in sistem intensiv, in perioada 1965 1980 a fost realizat cel mai amplu program de populare si repopulare a apelor de munte cu aceasta specie. Dimensiuni: lungime 25 - 50 cm; greutate 0,200 - 5 kg; varsta 2 - 10 ani, viteza de deplasare 2 - 3 m/s; dimensiunea admisa pentru retinere la pescuitul sportiv 20 cm. Descriere: corp fusiform, turtit lateral, capul lipsit de solzi, inotatoarea codala scobita iar celelalte usor rotunjite, maxilar puternic cu numerosi dinti curbati in interior, masculi ajunsi la maturitate sexuala au maxilarul inferior mai lung si curbat in sus (caracteristici ce se accentueaza in perioada de imperechere) linia laterala slab pronuntata. Coloritul este spectaculos in special in perioada imperecherii, spatele brun cu tente maslinii, pe lateral si abdomen alb murdar, la exemplarele mature (mascul) apare culoarea galben metalizat imediat sub linia laterala pana la abdomen. Spatele si partea superioara a capului este presarata cu puncte negre, din zona liniei laterale spre abdomen apar puncte rosii inconjurate de inele albe (asa numitele stelute). Exemplarele tinere pana la varsta de un an au pe flancuri pete cenusii de forma ovala si transversale. Coloratia variaza in raport de mediu inconjurator, in apele adanci, cu vegetatie submersa si maluri impadurite, culorile devin mai inchise. Morfologie : Linia laterala 110 125 solzi; numar de radii ale inotatoarelor : dorsala 8-11, anala 3-10, codala 18-20; numar de vertebre 56-59.
10

 Hrana: Specie rapitoare, prefera locurile in care poate sta la panda (maluri scobite, bolovani, bulboane, cascade, arbori cazuti) isi paraseste locul in perioada boistii sau cand apele devin tulburi mai mult timp. Hrana este variata de la larve de insecte care traiesc in apa si sub pietre (corobetii, latausii) pana la insectele care zboara la suprafata apei. Odata cu inaintarea in varsta consuma pesti de talie mica (boisteni, zglavoace) inclusive puiet de pastrav. Reproducerea: Atinge varsta maturitatii sexuale la 2 ani masculi si 3 ani femelele. Imperecherea are loc in perioada octombrie noiembrie, momentul coincide cu inceputul desprinderii frunzelor de arin. Coloritul se accentueaza, dimorfismul sexual este usor vizibil, pastravii urca catre izvoare (pot trece obstacole si de 1 m inaltime) sau la confluenta unor paraie principale. Femela sapa o scobitura intr-o zona cu pietris fin in care depune icrele, acestea sunt stropite cu lapti de la unul sau mai multi masculi, dupa care femela acopera icrele cu un strat subtire de pietris prin miscari ale cozii, depunerea icrelor poate dura mai multe zile si in locuri diferite. Icrele sunt de culoare galben-portocaliu, diametrul intre 2-4 mm, numarul acestora variaza in raport de greutatea corporala a exemplarului in general intre 2000 - 4000 icre/kg corp, numarul icrelor este puternic influentat de cantitate si calitate hranei.Perioada de incubatie a icrelor variaza in raport de numarul grade-zile acumulate respectiv 330 - 380 sau 140 180 zile, puietul eclozeaza in perioada 15 martie - 15 aprilie, momentul coincide cu infrunzirea arinului, dimensiunea frunzelor de 1-2 cm.

b) Pstrvul fntnel - Salvelinus fontinalis M.

11

Pstrvul fntnel este originar din zona de coast atlantic a Americi de Nord. A fost introdus n Europa, India, America de Sud, Australia, Japonia, Rusia, etc. n Romnia a fost introdus iniial n Moldova n jurul anului 1906 (Decei, 2001) i a populat apoi i cteva ruri din Transilvania. La momentul actual efectivele din liber sunt foarte reduse, specia fiind crescut n pstravrii pentru consum. Reproducerea are loc n general n lunile octombrie i noiembrie. Femelele pot produce ntre 2500 - 5000 icre/kg corp, n funcie de mrimea i vrsta fiecreia. n funcie de temperatura apei, ecloziunea puietului are loc dup 2-3 luni. Pstrvul fntnel atinge maturitatea la 2-3 ani i media de via este de 6 ani. Denumiri: engleza Brook trout; franceza Saumon de fontaine; germana Bachsaibling; denumiri populare pastrav. Dimensiuni: lungime 20 - 40 cm; greutate 0,200 - 5 kg; varsta 4 - 10 ani; dimensiunea admisa pentru retinere la pescuitul sportiv 20 cm. Descriere: Gura lunga, se intinde pana in spatele ochiului, marginile aripioarelor drepte, inotatoarea codala usor scobita. Dinti prezenti atat pe maxilare, prevomer si limba. Coloritul este deosebit, verde-masliniu cu dungi serpuitoare intunecate in zona dorsala, flancurile pot fi argintii, galben-auriu spre portocaliu, abdomenul cenusiu-albicios. Corpul este presarat pe flancuri cu puncte galbene si rosiatice inconjurate de albastru . Aripioarele pectorale, ventrale si anala, au o tenta rosiatica, marginea acestora se termina in doua linii prima gri-negricios iar ultima de culoarea alba. Morfologie: Linia laterala 200 230 solzi; numar de radii ale inotatoarelor : dorsala 9-10, anala 8-14; numar de vertebre 58-62. Hrana: Consuma larve de insecte care traiesc in apa si sub pietre sau insecte de la suprafata apei. Odata cu inaintarea in varsta consuma pesti de talie mica inclusiv puiet de pastrav. Reproducerea: Atinge varsta maturitatii sexuale la 2 ani masculi si 3 ani femelele. Imperecherea are loc in perioada octombrie noiembrie. Icrele sunt de culoare galbenportocaliu, diametrul intre 3-4 mm. Perioada de incubatie a icrelor variaza in raport de numarul grade-zile acumulate respectiv 350 - 400, puietul eclozeaza in luna martie.

12

c)Pstrvul de mare - Salmo trutta labrax P.

Reprezint o specie marin, endemic bazinului Pontic, ntlnit n Marea Neagr i Azov. Prefer zona de coast i rurile mari limitrofe. Specia a fost semnalata n Caucaz, Crimea, Asia Mica, sudul Ucrainei, Turcia, Bulgaria. n Romnia au fost nregistrate apariii sporadice n zona litoralului romnesc i pe Dunre, fr s urce prea mult n amonte. Actualmente specia se captureaz ntr-un numr mic de exemplare pe litoralul Mrii Negre, de la Sfntu Gheorghe spre sud i sporadic n Dunre i n zona Razim-Sinoie. Atinge vrsta maturitii sexuale la 3-4 ani. n cazul speciei Salmo trutta labrax se poate vorbi despre o migraie de reproducere din Marea Neagr n fluvii care are loc primvara (la sfaritul lunii aprilie) cu o posibil ntoarcere n mare dup depunerea icrelor i o deplasare a subadulilor din mediul marin n cel dulcicol. nc de la semnalare, pstrvul de Marea Neagr a fost rar i nu a reprezentat niciodat vreo importan economic pentru pescuitul romnesc. Literatura de specialitate semnaleaz aceast specie la noi n ar n Marea Neagr (habitat de hrnire i cretere), pe braele i n lacurile din delt i pe Dunre pn n dreptul Km 700 (Bnrescu 1964, Svetovidov 1964, Oel 2007).

13

Figura 2. Harta rspndirii actuale a pstrvului de mare (Salmo trutta labrax, Pallas 1820) pe teritoriul Romniei.

Alturi de lostri, pstrvul de Marea Neagr (Salmo trutta labrax, Pallas 1811), sub-endemit pontic inclus n Lista Roie a Rezervaiei Biosferei Delta Dunrii (Oel 2000; Oel 2007), este o specie periclitat de salmonide din ara noastr cu potenial real pentru dezvoltarea salmoniculturii, care necesit evaluarea strii stocului i adoptarea de msuri urgente de conservare. In figura 2 prezentm harta rspndirii actuale a pstrvului de Marea Neagr pe teritoriul Romniei. Harta a fost realizat corobornd informaiile din toate publicaiile existente (Antipa, 1909; Bnrescu, 1964; Cruu, 1962; Kottelat, 2007; Oel, 2000; Popescu-Gorj, 1956; Radu, S. 2008 a,b), observaiile proprii de la coasta mrii Negre i complexul Razim Sinoie, ca i semnalri i observaii ale unor pescari profesioniti i pescari sportivi. Denumiri: engleza Black Sea salmon; rusa Chernomorskii lososi; turca Denizalabaligi, Denizalasi ; germana Schwarzes Meer-Forelle; denumiri populare pastrav de mare. Dimensiuni: obisnuit 20 30 cm, maxim 110 cm; greutate 4 - 25 kg; varsta 4 - 15 ani; Descriere: Corp fusiform, marginile aripioarelor drepte, inotatoarea codala scobita. Coloritul este argintiu-cenusiu, mai inchis la culoare in zona dorsala. Corpul este presarat in zona dorsala si usor pe flancuri cu puncte negre, acestea sunt prezente si pe dorsala. Abdomenul de culoare alba. Codala are marginile cenusiu spre negru. Unele exemplare tinere au pe laturi si pete rosii sub forma de X. Prezinta dinti pe falci, palatine si limba. Intre dorsala si caudala, prezinta o inotatoare adipoasa mai slab dezvoltata decat la celelalte specii de salmonide. Nu coabiteaza cu alte specii de salmonide cu care s-ar putea confunda, iar fata de speciile din alte familii se diferentiaza in primul rand prin prezenta inotatoarei adipoase. Morfologie: Linia laterala 112 122 solzi; numar de radii ale inotatoarelor : dorsala 9-10, anala 8-10; numar de vertebre 57-60 ; numar de spini branhiali 16-19. Hrana: Juvenil consuma larve de insecte care traiesc in apa, crustacee si alte nevertebrate acvatice. La exemplarele capturate in Dunare si in meleaua Sacalin, in tractul digestiv s-au identificat guvizi. Odata cu inaintarea in varsta consuma pesti de talie mica. Reproducerea: Atinge varsta maturitatii sexuale la 4 ani masculi si 3 ani femelele. Imperecherea are loc in perioada octombrie decembrie. In aria rezervatiei Delta Dunarii
14

exemplarele subadulte (20-35 cm) se captureaza tot timpul anului in apropiere de tarmul marii la talienele marine si inclusiv in Dunare, la vintire si ave, iar exemplarele adulte (peste 2 kg si cu gonadele dezvolate) se captureaza, foarte rar, pe Dunare primavara. Pe alti afluenti ai Marii Negre s-a constatat ca reproducerea are loc primavara, spre deosebire de pastravul de mare (Salmo trutta trutta) din nord-vestul Europei (coastele atlantice) si Marea Baltica, la care reproducerea are loc in rauri in perioada octombrie ianuarie. In cazul speciei Salmo labrax se poate vorbi despre o migratie de reproducere din Marea Neagra in fluvii, care are loc primavara (la sfarsitul lunii aprilie si inceputul lunii mai) cu o posibila intoarcere in mare dupa depunerea icrelor si o deplasare a subadultilor din mediul marin in cel dulcicol, care este posibil sa stationeze mai mult in acesta din urma, chiar si 2-4 ani. In cursul superior al Nistrului si Niprului se mentioneaza existenta unor populatii numai dulcicole.

d)Pstrvul curcubeu - Oncorhynchus mykiss M.

Pstrvul curcubeu i are originea n zona nord-estic a Pacificului. Datorit adaptabilitii, a fost introdus n Europa, Asia, America de Sud, Africa, etc. Specia se preteaz cel mai bine pentru creterea n sistem intensiv pentru consum. n ceea ce privete reproducerea artificial, n decursul anilor aceast specie a fost ncruciat selectiv rezultnd un numr destul de mare de varieti de O. mykiss, diferena principal ntre acestea fiind sezonul de depunere a icrelor. Majoritatea se reproduc n perioada ianuarie - mai, dar exist cazuri n care reproducerea are loc n decembrie sau chiar
15

mai devreme. n Romnia a fost introdus n Moldova, Maramure, Banat i Transilvania n jurul anului 1965 (Decei, 2001). n prezent efectivele din liber sunt foarte reduse, ajungnd n ru accidental, din pstrvrii Denumiri: engleza Rainbow trout; franceza Truite arc-en-ciel; germana Fohre; denumiri populare pastrav curcubeu. Dimensiuni: lungime 20 - 80 cm; greutate 0,2 - 20 kg; varsta 2 - 10 ani; Descriere: Fata de indigen capul mai mic; gura se intinde pana in spatele ochiului; inotatoarea codala usor scobita in tinerete; solzi mai mari decat la indigen. Coloritul este verde-cenusiu, uneori spatele cu tente albastrui, argintiu sub linia laterala, albicios pe abdomen. In lungul liniei laterale are o un amestec de culori similare curcubeului, caracteristica care ia dat si numele. Flancurile, spatele si inotatoarea codala, sunt presarate cu puncte mici negre. Morfologie: Linia laterala 130 150 solzi; spini dorsali 3-4, radii pectorale 8 -10 ; numar de vertebre 60-66. Hrana: Consuma larve de insecte care traiesc in apa si sub pietre sau insecte de la suprafata apei. Odata cu inaintarea in varsta consuma si pesti de talie mica. Reproducerea: Atinge varsta maturitatii sexuale la 2 ani masculi si 3 ani femelele. Imperecherea are loc in perioada martie-aprilie. Icrele sunt de culoare galben-portocaliu, diametrul intre 3-6 mm, numarul acestora variaza intre 1000 - 4000 icre/kg corp. Perioada de incubatie a icrelor variaza in raport de numarul grade-zile acumulate respectiv 330 - 400. e)Lipanul - Thymallus thymallus L. Este originar din Europa i n Romnia specia este bine reprezentat n apele noastre. Este singurul salmonid autohton nealterat din punct de vedere genetic deoarece nu s-au facut importuri de material biologic pentru aceasta specie. Ocup partea inferioar a apelor de munte, unde apele sunt mai adnci, mai linitite i cu albia pietroas. Populaiile de lipan din ara noastr sunt mprite n zona de nord-est (Neam-Suceava); zona de curbur (BuzuCovasna); sud (Arge-Prahova); vest (Mure-Alba).

16

 Denumiri: engleza Grayling; franceza Ombre comun; germana Asche; denumiri populare lipean, cimbrisor, aramiu. Dimensiuni: lungime 15 - 40 cm; greutate 0,1 2 kg; varsta 2 - 10 ani dimensiunea admisa pentru retinere la pescuitul sportiv 25 cm. Descriere: Corp alungit, usor turtit, solzi mari dispusi in forma hexagonala. Inotatoarea dorsala inalta, presarata cu puncte negre inconjurate de un inel subtire de culoare alba; inotatoarea caudala scobita. La exemplarele adulte punctele negre sunt concentrate pe flancuri spre zona capului. Culoarea este argintie, iar in perioada boistii extremitatile inotatoarelor se coloreaza intr-o noanta rosiatica. Morfologie: Linia laterala 80 90 solzi; dorsala 12-17radii, spini anali 3 - 10; numar de vertebre 57-61. Hrana: Consuma larve de insecte care traiesc in apa si sub pietre sau insecte de la suprafata apei. Fata de celelalte salmonide accidental consuma si pesti de talie mica. Reproducerea: Atinge varsta maturitatii sexuale la 2 ani masculi si 3 ani femelele. Imperecherea are loc in perioada aprilie mai. Icrele sunt de culoare galbena, diametrul intre 23 mm, numarul acestora variaza intre 10000-13000 icre/kg corp, inconjurate de un mucus lipicios. Perioada de incubatie a icrelor intre 180-230 grade-zile. In perioada imperecherii exemplarele mature migreaza spre izvoare, uneori locurile de boiste se suprapun cu cele ale pastravului.

f)Lostria - Hucho Hucho L.

17

Este o specie endemic bazinului dunrean care se ntlnete majoritar n regiunea superioar a Dunrii, dar i n majoritatea afluenilor si mari. Lostria triete n ape curgtoare repezi i migreaz n amonte pe distane mici n sezonul de mperechere. Poate depi la maturitate lungimea de 1 m. La noi lostria era raspandit n trecut n Dunre, Olt, Mure, Lotru, Jiu, Arge i Cerna i foarte probabil n Criul Repede, Buzu, Moldova i Timi. Azi se mai gsete n rul Bistria, de la Iacobeni pn la Broteni, i n Vieu, de la confluena rului Vaser pan la confluena Vieului cu Tisa. Exemplare mari se gsesc n poriunea de frontier a rului Tisa i n lacul Bicaz. n acest an lostria a fost reintrodus n Mure i n lacul Vidraru. Datorit faptului c specia a fost aproape disprut la noi n ar este foarte greu s se realizeze o hart cu distribuia acesteia pe regiuni. Putem doar s ne punem sperana c programele de repopulare vor avea succesul scontat i c aceast specie de salmonid va putea fi reintegrat n fauna piscicol a Romniei. Denumiri straine: franceza - Huchon; germana - Huchon; engleza - Huck; ceha Hlavatka; polona - Glovacica; rusa - Dunaiskii losos; denumiri populare - lostuca, lostruta, bala. Raspandire: fiind o specie caracteristica (endemica) bazinului dunarean se afla numai in regiunea superioara a Dunarii si in majoritatea afluentilor mari ai sai, deci in Germania, in Austria, in fosta Cehoslovacia, in Polonia, in Iugoslavia, in Ucraina (TisaCeremus).Altitudinea raurilor in care este cantonata variaza de la 67 m (Sava) la 1007 m (Lina) in Iugoslavia. La noi era raspandita in trecut in Dunare, Olt, Mures, Lotru, Jiu, Arges si Cerna si foarte probabil in Crisul Repede, Buzau, Strei, Moldova, Timis si Raul Doamnei. Existenta de odinioara a ei in unele rauri este atestata de toponimii locale pastrate pana astazi,
18

ca : Galautas pe Mures (de la galoca, in maghiara = lostrita) si "Sforul Puici" pe Cerna.Azi se mai gaseste in raul Bistrita, de la Iacobeni pana la Brosteni, si in Viseu, de la confluenta raului Vaser pana la confluenta Viseului cu Tisa. Exemplare mari se gasesc in portiunea de frontiera a raului Tisa si in lacul Bicaz, unde s-a adaptat intru totul conditiilor existente aici. Descriere: Are spatele cenusiu-verzui-galbui, variind dupa locul in care traieste. Flancurile ii sunt cenusii-argintii, iar abdomenul si partea inferioara a capului alb presarat cu minuscule puncte cenusii. Flancurile si spatele sunt presarate cu numeroase puncte mici negre, care la unele exemplare inainteaza pe opercule, pana in dreptul ochilor. Aripioarele sunt de culoare rosietica-verzuie, codala este scobita, nodalca bine dezvoltata si de culoare bruna-rosietica. Coloratia generala a exemplarelor tinere este cenusiu-verzuie si alb-murdara. Cu cat inainteaza in varsta cu atat coloratia se schimba, pentru ca la exemplarele batrane, mai lungi de 75-80 cm, sa devina ruginie cu irizatii metalice. Are corpul fusiform, aproape cilindric, acoperit cu solzi mici usor cazatori, protejat de un strat abundent de mucus. Capul este turtit, dorsoventral, cu gura mare, taiata pana indaratul ochilor si prevazuta cu dinti puternici pe margini si pe limba, incovoiati inauntru. Femela nu se poate deosebi de mascul decat in epoca boistei, cand are abdomenul plin si orificiul genital umflat. Locul de trai, hrana: Habiteaza din partea mijlocie pana in cea inferioara a zonei lipanului, in apa adanca alternand cu suvoaie puternice. Are predilectie pentru locatiile umbrite de sub podurile de peste rau. Mai putin exigenta fata de limpiditatea apei si oxigenul dizolvat, accepta si o temperatura a apei mai ridicata in timpul verii (peste 200), cu conditia ca debitul sa fie suficient de mare. In timpul iernii se retrage in balti, la apa adanca. In tinerete isi duce viata la apa mica sau in preajma varsarii afluentilor. Specie rapitoare prin excelenta, lostrita se hraneste in stadiul de puiet cu larve de insecte din apa, insecte adulte din mediul exterior si puieti de scobar, clean, moioaga, iar in stadiul de adult cu pestisori vii sau soareci si broaste, pe lista preferintelor culinare insiruindu-se in ordine : zglavoaca, obletele, moioaga, pastravul, cleanul, boisteanul etc. O lostrita pescuita in lacul Arges la doi ani de la lansare avea in stomac trei zglavoace ; alta pescuita pe Bistrita, la podul Barnar, avea aranjati ca in cutiile cu sardele noua obleti ; alta avea un pastrav de 29 cm si un clean de 22 cm greutatea ei fiind de 6,800 kg. Un exemplar prins pe Galu, pe Bistrita, in 1962, avea in stomac o moioaga de 25 cm. Lostrita adulta consuma anual in jur de 4-6 kg peste pentru crestere cu 1 kg greutate corporala. Lostritele din crescatorii pot fi hranite si cu pesti morti, insa proaspeti. Deseurile de abator nu le consuma cu placere, putand rabda de foane un timp indelungat. In
19

pastravaria Racatau - Cluj, au fost hranite timp de 14 ani cu deseuri de abator, ajungand insa, la varsta de 13 ani, la numai 3,5 kg greutate, in timp ce cele din Somesul Cald au inregistrat greutatea de 4,2 kg dupa numai 6 ani. Cresterea: Creste mult mai repede decat celelalte specii de pastrav cu 600 - 1500 g la varsta de 3 ani ; 50-60 cm cu 1,5-3,3 kg la varsta de 4 ani, 65-80 cm cu 3,5-5,5 kg la varsta de 5 ani si 80-85 cm cu 4,5-6,5 kg la varsta de 6 ani. Greutatea medie in kilograme a lostritei pe categorii de lungime, rezulta in urma masurarii a 46 exemplare din raul Bistrita, a 20 exemplare din raul Viseu si a 23 exemplare din lacul Bicaz, este urmatoarea: Tabel 1: Cresterile lostritei din mediul natural.
Lungime (cm) Greutate (Kg) Bistrita Viseu Bicaz 20-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 114

0,130 0,150 0,350

0,300 0,500

0,800 0,850

1,200 2,000 2,000

2,250 2,500 3,700

4,400 4,500 5,000

5,800 8,000

8,400 -

12,000 13,600

In Iezerul Ighiel, lostrita a inregistrat la 4,5 ani lungimea de 60 cm si greutatea de 1,650 kg, iar la varsta de 6,5 ani 81 cm cu 4,250 kg. In lacul Vidraru, la varsta de 3 ani a avut lungimea de 50 cm si greutatea 1,500 kg si 51 cm cu 3,200 kg (septembrie 1979). Din datele de mai sus rezulta ca lostritele din Viseu au o crestere mai rapida decat cele din Bistrita, iar cele din lacul Bicaz inregistreaza, la aceeasi medie de lungime, cele mai mari greutati. Exemplarul cel mai mare prins in ultimii ani a avut greutatea de 16 kg si a fost braconat pe Tisa, in primavara anului 1959. Reproducerea: Lostrita devine matura sexual la varsta de 5 ani (masculul) si la 6 ani (femela), la o lungime obisnuita de 65-70 cm. In cazuri exceptionale si indeosebi in mediul natural depune icre si la varsta de 5 ani. In pastravarii, primele icre se obtin abia la varsta de 7 ani. Numarul de icre depuse de o femela variaza intre 2 100 si 3 250 bucati/kg corp (masuratori facute pe 7 femele intre 60 si 88 cm lungime si 1,8-6,6 kg greutate). Exemplarele care depasesc greutatea de 6 kg dau, de obicei, icre mai putine la kg/corp. Icrele sunt de culoare galben-portocaliu, mai mici decat cele de pastrav (4-5 mm). Boistea are loc spre mijlocul lunii aprilie, cand temperatura apei atinge 7-100C. Femela, insotita de 2-3 masculi, urca la gura afluentilor unde, intr-o gropita lunga de 50-60 cm sapata in pietris, depune icrele
20

care sunt stropite cu laptii unui singur mascul, acoperindu-le apoi cu un strat subtire de pietris fin. Perioada corespunde cu boistea lipanului sau la cateva zile dupa aceasta si dureaza numai 3-4 zile. In crescatorii, icrele se recolteaza in jurul datei de 15 mai. Cand primavara este foarte rece si apa in bazine, in luna mai, nu depaseste temperatura de 6-70C, femelele nu mai depun icrele. Puietii ies din icre dupa acumularea a 250-300 grade-zile, respectiv dupa scurgerea a circa 25-35 zile de la depunere. Diverse: In apele noastre, in afara marelui ei dusman - omul, lostrita sufera in urma atacului unui parazit (Bazanites huchonis), care se fixeaza sub operculi - si uneori de pe urma mucegaiurilor (Saprolegnia si Aclya), care ataca indeosebi masculii raniti in luptele ce se dau pentru cucerirea femelei. Omul este insa marele ei dusman, atat prin interventia directa pe care o are micsorandu-i numarul prin braconare, cat si prin activitatile pe care le desfasoara. Exploatarile masive de paduri facute pana nu demult i-au schimbat conditiile normale de trai, provocand incalzirea apei, variatia mare de debit soldata cu viituri catastrofale si zapoare nimicitoare. Plutaritul efectuat pe rauri si indeosebi in viiturile din ultimul timp pe Bistrita, au rascolit tot fundul albiei iar lipsa locurilor de adapost a dus la scaderea efectivelor. Poluarea Viseului de la Baia Borsa si a Bistritei de la industriile din Vatra Dornei si cele de la exploatarea miniera Lesu Ursului, precum si exploatarea de sulf din Calimani alaturi de poluarea cu sulf a paraului Negra Sarului sunt cauze majore care, alaturi de braconaj, ameninta specia in ultimul ei refugiu natural. Masuri pentru redresarea situatiei s-au luat de catre cei carora li s-a incredintat gospodarirea acestei specii. Astazi, lostrita este crescuta pe cale artificiala in doua pastravarii (Sapanta - Maramures si Ceahlau), in scopul producerii puietului necesar repopularii apelor de munte din care a disparut in trecut. Actiunile de populare intreprinse in scopul raspandirii speciei si in alte rauri din tara unele s-au soldat cu esecuri, altele cu rezultate pozitive. Incercarea de populare a Lotrului, facuta cu alevini in anul 1961, a esuat, iar cea de introducere a speciei in lacul Vidra, in anii 1973-1974, nu a dat rezultate, datorita probabil, altitudinii ridicate a lacului (peste 1200 m). Din Mures, cele 9 lostrite adulte si cei 32 puieti de o vara introdusi in noiembrie 1962 au fost braconati in totalitate pana in anul 1967. In Crisul Repede, cele 1 200 exemplare de puieti de 6 luni si respectiv 18 luni, au fost braconate intens, ramanand in bulboanele mari de la Bratca in jos doar cateva exemplare. Exemplarele introduse in intervalul 1962-1965 in Somesul Cald, desi a trecut peste tavalugul lucrarilor hidrotehnice, au reusit sa supravietuiasca in lacul de la Gilau
21

si foarte probabil si in cel de la Tarnita. Despre existenta lostritei introdusa in portiunea inferioara a Raului Mare - retezat nu se mai stie nimic, grija pentru protectia ei incetand odata cu inceperea lucrarilor hidrotehnice din acest bazin. In Iezer Ighiel, situat la altitudinea de 916 m, cele 10 lostrite introduse s-au dezvoltat foarte bine, desi lacul nu are alimentare si evacuare de suprafata. Un exemplar pescuit la varsta de 6,5 ani avea dimensiunea de 81 cm, cu 4,3 kg greutate. Din lacul Arges, unde a fost introduse in anul 1968 si unde numai la 3 ani inregistrase 50 cm cu 1,5 kg, a disparut odata cu golirea lacului la 24.01.1975. Rezultatele de pana acum vin sa confirme posibilitatea introducerii lostritei in unele rauri si indeosebi in lacurile de acumulare situate la altitudini sub 1000 m, cum sunt cele de pe Somesul Cald, Arges, Cerna, Valea Iadului, etc. In acest an lostrita a fost reintrodusa in Mures si lacul Vidraru si introdusa in lacul Belis de pe Somesul Cald.

CAPITOL II Markeri moleculari la salmonide

a) ADNmt la salmonide Dezvoltarea markerilor ADN a avut un impact puternic asupra geneticii animalelor. Tehnologiile bazate pe markeri ADN au revolutionat modul in care sunt conduse cercetarile asupra pestilor, si implicit asupra salmonidelor. Dezvoltarea geneticii moleculare, de la folosirea pe scara larga a alozimelor incepand cu deceniul sapte al secolului trecut pana la proiectul genomului uman si alte realizari la fel de spectaculoase au pus bazele acestei discipline cu un larg domeniu de actiune. Markerii moleculari au permis progrese rapide in studiile asupra variabilitatii genetice si incrucisarilor selective, determinarii paternitatii, identificarii speciilor, populatiilor si subpopulatiilor.
22

Metodele de identificare a stocurilor de salmonide si a variabilitatii genetice din cadrul populatiilor au fost imbunatatite pe masura inregistrarii unor noi progrese in domeniul markerilor moleculari. Descrierea morfologica si analiza morfometrica au fost primele unelte folosite pentru a defini speciile de salmonide, dar tehnicile de biochimie si biologie moleculara si-au gasit rapid locul in astfel de studii, inlaturand dubiile legate de o clasificare corecta, mai ales ca la pesti apare frecvent fenomenul hibridizarii interspecifice. De la publicarea secventei complete a genomului mitocondrial uman (ADNmt) de catre Aderson et al., (1981), organizarea genomului mitocondrial la o serie de organisme eucariote a fost bine caracterizata (Wolstenholme, 1992). La pesti ADNmt este o molecula mica (~16,5 kpb), dublu catenara, circulara. La ora actuala sunt diponibile in intregime secventele de ADNmt de la 67 de specii de pesti (NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/ 7898.html). Datorita recombinarii relativ scazute de la nivelul ADNmt si modului de mostenire exclusiv pe linie materna, ADNmt reprezinta un marker valoros cu un real potential de utilizare in studii de genetica a populatiilor si filogenie. Salmonidele sunt pesti cu importanta comerciala mare si cresterea intensiva in conditii de acvacultura a devenit o preocupare insemnata in multe tari din Europa. Ca urmare, este importanta cunoasterea caracteristicilor ADNmt pentru identificarea stocurilor si pentru derularea eficienta a unor programe de conservare si management eficiente, cat si in studiul variabilitati genetice a populatiilor (Phillips & Oakley, 1997). In cadrul familiei Salmonidae, secventa completa a ADNmt este cunoscuta si disponibila in bancile de date pentru urmatoarele specii: O. mykiss (Zardoya et al., 1995), Salmo salar (Hurst et al., 1999), S. alpinus (Doiron et al., 1999), C. lavaraetus (Miya & Nishida, 2000) si S. fontinalis (Doiron et al., 2002). Similar organizarii de la vertebrate, genomul mitocondrial al pestilor contine 37 de gene, dintre care 13 gene ce codifica pentru proteine, 22 de gene pentru ARNt si 2 gene pentru ARNr corespunzatoare transcriptilor 12S si 16S (Figura 1). De exemplu, in cazul speciei S. salar pozitia si orientarea genelor mitocondriale si a regiunii de control este similara organizarii observate la alte specii de pesti sau vertebrate superioare. Cu toate ca organizarea genomului mitocondrial la vertebrate este destul de conservata, la unele specii au fost descrise anumite rearanjamente ale genelor (Kumazawa et al., 1996). In ceea ce priveste marimea exprimata in perechi de baze (pb) a genomului mitocondrial, aceasta este uniforma la speciile de pesti analizate, diferentele fiind doar de cateva zeci de pb intre speciile de salmonide (de
23

exemplu, la O. mykiss 16 642 pb - Zardoya et al., 1995 -, la S. salar 16 665 pb - Hurst et al., 1999, la S. alpinus 16 659 pb - Doiron et al., 1999, la C. lavaraetus 16 737 bp - Miya & Nishida, 2000, etc.).

Figura 1: Organizarea genomului mitocondrial la Salmo salar. Sunt indicate enzimele de restrictie folosite pentru clonare in studiul efectuat de Hurst et al., 1999. Numerele reprezinta lungimea in perechi de baze (pb) cu originea stabilita arbitrar la capatul 5 al regiunii D-loop. Genele pentru ARNt sunt denumite cu o singura litera pentru aminoacidul respectiv (de exemplu, K pentru lisina). Regiunea de control (D-loop) Intre genele ARNtPro si ARNtPhe ale vertebratelor se gasesete o regiune necodificatoare care variaza ca lungime (Wolstenholme, 1992). Regiunea mitocondriala de control (D-Loop) reprezinta regiunea reglatoare bine conservata a genomului mitocondrial al vertebratelor, implicata in initierea replicarii ADN pe catena H, si contine secvente promotoare pentru transcriptia ARN (Clayton, 1982, 1984; Saccone et al., 1991). La mamifere si amfibieni s-a constatat ca aceasta secventa contine semnale necesare initierii replicarii catenei grele (heavy
24

 H) si a fost desemnata ca regiune de control pentru transcrierea ambelor catene mitocondriale, grea (heavy H) si usoara (light L) (Shadel & Clayton, 1997). In cazul salmonidelor, regiunea D-loop este asemanatoare ca lungime la speciile studiate si contine 986 pb la O. tshawytscha, 1006 pb la S. salar, 1003 pb la O. mykiss, 964 pb la S. fontinalis, 998 pb la S. alpinus si 1076 pb la C. lavaretus. Zarodya et al., 1995 au propus la O. mykiss o structura stabila de tipul stem-loop pentru acesta regiune, constand din 11 nucleotide pereche in regiunea stem si o bucla de 17 nucleotide. La S. salar a fost propusa o structura secundara asemanatoare, regiunea stem fiind alcatuita din 12 nucleotide pereche, iar regiunea loop din 13 nucleotide. Secventa 5GCCGG- 3 este conservata in cazul vertebrtatelor, fiind identificata atat la om, cat si la si la unele specii de salmonide la baza regiunii stem (Figura 2). Secventa structurii stem este conservata la vertebrate, in timp ce secventa structurii loop prezinta o mai mare variabilitate. In cazul mamiferelor, prin secventierea regiunii loop s-a observat ca aceasta prezinta o secventa bogata in timin necesara initierii replicarii catenei L.

Figura 2: Structura secundara pentru originea replicarii catenei L la 6 specii de salmonide. Secventele asociate cu tranzitia intre sinteza ARN si sinteza ADN sunt subliniate.
25

In cazul mai multor specii de salmonide, structura loop a regiunii de control este bogata in citozin. Astfel, se pare ca initierea replicarii catenei L nu este conditionata de prezenta timinei, cum s-a crezut initial, ci de prezenta unui lant polipirimidinic. Cateva regiuni ale genei D-loop prezinta un anumit grad de variatie intre populatiile aceleiasi specii, dar variabilitatea nu este uniforma si regiunea de control mitocondriala prezinta anumite regiuni bine conservate in seria vertebratelor (Brown et al., 1985). Gena mitocondriala D-loop a fost selectata ca marker pentru diverse studii de filogenie mitocondriala deoarece este considerata cea mai variabila zona mitocondriala in ceea ce priveste rata de substitutie si marimea zonelor variabile ( Meyer, 1993). De asemenea, o variabilitate ampla a zonei D-loop a fost evidentiata la S. trutta din diferite regiuni din Europa (Bernatchez et al., 1992; Bernatchez & Osinov, 1995; Osinov & Bernatchez, 1996; Apostolidis et al., 1997). Genele care codifica pentru proteinele implicate in fosforilarea oxidativa Genomul mitocondrial la salmonide, similar celorlalte vertebrate, conine 13 gene care codifica pentru subunitati proteice implicate n procesul de fosforilare oxidativa. La eucariote, fosforilarea oxidativa se desfasoara la nivelul cristelor mitocondriale si foloseste energia rezultata prin oxidarea nutrientilor pentru a produce in final ATP. In timpul fosforilarii oxidative, electronii sunt transferati in timpul unor reactii redox de la donorii de electroni la acceptorii de electroni, de exemplu O2. In timpul proceselor redox are loc eliberarea de energie, care este folosita pentru sinteza ATP. La eucariote, reactiile redox sunt realizate de o serie de complexe proteice mitocondriale interconectate ce formeaza lantul transportor de electroni. Genele care codifica pentru molecule implicate in functionarea lantului transportor de electroni din mitocondrie sunt urmatoarele: genele pentru 7 subunitati ale NADH dehidrogenazei (complexul I NADH/ ubiquinona) NADH I, NADH II, NADH III, NADH IV L , NADH IV, NADH V si NADH VI, gena pentru citocrom b (complexul III coenzima Q-citocrom c reductaza/ citocrom b), genele pentru cele trei subunitati ale complexului citocrom c oxidazei (CO) (complexul IV) CO I, CO II si CO III si genele pentru cele doua subunitati ale ATP sintazei (ATP 6 si ATP 8). Genele mitocondriale pentru NADH dehidrogenaza codifica 7 subunitati ale acestei enzime (numite si NADH: quinon oxidoreductaza) localizate in membrana mitocondriala interna care catalizeaza transferul electronilor de la NADH la coenzima Q. NADH
26

dehidrogenaza este cea mai mare dintre moleculele complexelor respiratorii. Prezinta o structura in forma de L cu un domeniu membranar lung (la mamifere, aproximativ 60 de helixuri trans-membranare) si un domeniu periferic hidrofil, ce contine o serie de centri redox si un situs de legare pentru NADH. Gena mitocondriala pentru citocrom b codifica pentru proteina citocrom b/b6, principala componenta a complexului respirator III. Proteina b/b6 este o proteina integrala de membrana de aproximativ 400 de aminoacizi cu 8 segmente transmembranare. Gena mitocondriala cyt b codifica pentru o proteina transmembranara conservata si informativa din punct de vedere filogenetic pentru studii inter si intra-specifice (Meyer, 1993). Genele mitocondriale CO I, CO II si CO III codifica pentru trei subunitati ale citocrom C oxidazei (complexul IV). Citocrom C oxidaza este o metaloproteina transmembranara complexa, de mari dimensiuni, localizata la nivelul membranei mitocondriale, care catalizeza transferul de electroni de la citocromul c redus la oxigenul molecular in timpul respiratiei celulare. Este alcatuita din cateva grupari prostetice si 8 subunitati proteice, dintre care 3 sunt codificate de gene mitocondriale si restul de gene nucleare. Complexul citocrom oxidazei C contine contine doua grupari hem, citocrom a si citocrom a3 si doua centre coninnd ioni de cupru (CuA si CuB). Cele trei subunitai mari (I, II si III) ale enzimei, catalizate de genele mitocondriale, formeaza situsul catalitic al enzimei deoarece ele poarta grupari hem i centrii redox Cu2+. Genele pentru ATP sintaza codifica subunitatile 6 si 8 ale enzimei ATP sintaza ce catalizeaza reactia de sinteza a ATP din ADP si pirofosfat utilizand energia generata de miscarea protonilor din spatiul intermembranar in matricea mitocondriala. ATP sintazele joaca un rol crucial in aproape toate organismele, forma de energie utilizata de celule fiind preponderent ATP. Din cele 13 gene, 12 sunt codificate de catena H, si numai una , NADH VI, este codificata de catena L. In general, la diferite specii de salmonide se intalneste o mare omolgie a secventelor nucleotidice si a secventelor aminoacizilor (Tabel 3). Codonii START sunt in majoritatea cazurilor ATG, exceptie facand codonul START al genei CO1, care este GTG. Acest codon de initiere atipic a fost descris in cazul genei CO1, la mai multe specii de pesti (Zardoya et al., 1995). La S. salar, opt dintre secventele genelor ce codifica pentru proteine prezinta codonul STOP TAA si doua codonul STOP TAG. Restul genelor (CO2, NADH IV, cyt b) nu prezinta
27

un codon STOP complet, ci un singur rest de timina, similar cazurilor ntlnite la om si la Xenopus. La acestea s-a demonstrat ca transcriptul acestor gene contine un codon STOP complet TAA care este creat post-transcriptional prin poliadenilare. Zardoya et al., 1995 au sugerat ca un fenomen similar celui mentionat anterior este intalnit si la speciile de salmonide care contin in genomul lor mitocondrial un codon STOP incomplet TAA. Tabel 3: Procentul de nucleotide (Nt) si aminoacizi (AA) cu secvente identice la diverse specii de salmonide.

Genele pentru ARNr 12S si 16S ARNr este o molecula ancestrala si totodata un marker important folosit drept ceas molecular al evolutiei. Diferitele tipuri sunt prezente in nucleu, citoplasma si organite. Este conservat structural si functional chiar si la specii foarte indepartate filogenetic, suferind modificari minore si reprezentand o sursa de informatii pentru tot spectrul evolutiv. ARNr reprezinta componenta centrala a ribozomilor, sediul sintezei proteice. ARNr ofera mecanismul pentru decodarea ARNm in aminoacizi si interactioneaza cu moleculele de ARNt in timpul translatiei, posedand activitate peptidil transferazica. Speciile diferite de ARNr sunt caracterizate de prin coeficientul de sedimentare (Tabel 4). La salmonide (de exemplu, S. salar, O. tschawytscha) genele pentru ARNr sunt localizate intre genele pentru ARNtPhe si ARNtLeu (UUR) si sunt separate de gena pentru ARNtVal (Figura 3).
28

Figura 3: Organizarea genelor mitocondriale pentru ARNr la salmonide. Aliniamentul genelor ribozomale de la diferite specii de salmonide a aratat ca identitatea secventelor nucleotodice prezinta valori ridicate, ceea ce confirma faptul ca aceste gene sunt foarte conservate la aceste specii (Tabel 3). In schimb, aliniamentul cu genele similare de la alte specii de pesti si mamifere a relevat un anumit patern al segmentelor conservate ce alterneaza cu secvente variabile. Tabel 4. Speciile de ARNr.
Tip Marime Subunitate a mare 50 S(5S, 23S) 60S (5S, 5,8S, 28S) Subunitate a mica

procariot

70S

30S (16S)

eucariot

80S

40S (18S)

O caracteristica interesanta a genelor pentru ARNr 16S la diverse specii de salmonide este prezenta unor cadre deschise de citire (ORF Opening Reading Frame) scurte (Fig. 4). Atunci cand secventele de ARNr 16S de la salmonide au fost folosite intr-un program de traducere a acizilor nucleici, au fost identificate cateva peptide de marimi diferite. Singurele ORF selectate erau cele care codificau pentru minim de 24 de aminoacizi, se gaseau in aproximativ aceeasi pozitie a genei ARNr 16S si prezentau o mare omologie a secventei la cele sase specii de salmonide luate in studiu. Secventa peptidica respectiva prezinta o identitate de 97,8% a aminoacizilor la diferite specii de salmonide. Un ORF similar a fost identificat in pozitia 1223 1377 a catenei H a ARNr 16S la O.tschawytscha. Totusi, peptida codificata de acest ORF prezinta o omologie mai scazuta a secventei aminoacizilor la diferite specii de salmonide si este alcatuita din 49 (S. salar), respectiv 60 (O. mykiss) aminoacizi.
29

Figura 4: Secvena peptidei codificate de ORF n gena pentru ARNr 16S la ase specii de salmonide. Numerele corespund poziiei ocupate n gena ARNr 16S (Wilhelm et al., 2003). Descoperirea acestei secvente bine conservate de 24 de aminoacizi codificate de gena ARNr 16S a nascut intrebari legate de rolul fiziologic al acesteia, intrebari sustinute si de descoperirile relativ recente de la om. Niikura et al., 2002 au identificat o peptida similara celei de la salmonide de 24 de aminoacizi, numita humanina, un factor ce protejeaza neuronii de apoptoza in boala Alzheimer familiala. Aceasta peptida este codificata de gena mitocondriala ARNr 16S si ORF a fost identificat in acest caz intre pozitiile 963 si 1037 ale genei pentru ARNr 16S. Un ORF similar a fost localizat in gena mitocondriala pentru ARNr 16S de la salmonide (Figura 3). Astfel este posibil ca aceste peptide sa aiba un rol functional la salmonide. Descoperirea peptidei conservate de 24 de aminoacizi demonstreaza inca o data caracterul versatil al genelor care codifica pentru ARNr ilustrat de localizarea nucleara, localizarea citoplasmatica, rolul in dezvoltarea celulelor liniei germinale si activitatea chaperon-like. Genele pentru ARNt Genomul mitocondrial al vertebratelor contine 22 de gene pentru ARNt. ARNt este o molecula mica (de obicei, de 74 95 nucleotide) care transfera aminoacizii in timpul translatiei la nivelul polipeptidului in crestere la situsul ribozomal al sintezei proteice. ARNt prezinta o structura secundara (sub forma de frunza de trifoi) si o structura tertiara (sub forma literei L care permite intercatiunea optima cu situsurile ribozomale implicate in translatie).

30

Figura 5. Structura teriar a ARNt (www3.interscience.wiley.com). Molecula de ARNt prezinta in structura ei 4 brate (acceptor, DHU, pesudouridinei si anticodon) si 3 bucle (DHU, pseudouridinei si anticodon). Uneori, prezinta o bucla variabila. Sinteza ARNt are loc in doua etape. Initial are loc sinteza moleculei de ARNt cu exceptia bratului acceptor, acelasi pentru toate moleculule de ARNt, care este adaugat ulterior. Bratul acceptor reprezinta situsul unde un aminoacid specific este atasat de amino-acil-tRNA sintaza. Regiunea anticodon contine trei nucleotide complementare codonului de pe ARNm. Fiecare molecula de ARNt poate fi atasata unui singur aminoacid, dar datorita degenerarii codului genetic, molecule de ARNt cu secven anticodon diferit pot transporta acelasi aminoacid.

31

Figura 6. Structura secundar a ARNt (www3.interscience.wiley.com). Genele pentru ARNt se gasesc intr-un numar diferit in genomul diferitelor organisme (620 de gene pentru ARNt la C. elegans, 275 la S. cerevisiae). La om exista 497 de gene nucleare, 22 de gene ribozomale si 324 pseudogene pentru ARNt. Similar organizarii de la alte vertebrate, genomul mitocondrial de salmonide contine 22 de gene pentru ARNt, dispuse intre genele pentru ARNr si cele pentru proteine. La O. tshawytscha, 14 dintre aceste gene sunt codificate de catena H si 8 sunt codificate de catena L, similar altor specii de salmonide. Toate cele 22 de gene pentru ARNt prezinta o structura secundara sub forma de frunza de trifoi si plierea in acest tip de structura secundara necesita formarea legaturilor GU (Wolstenholme, 1992). La S. salar, genele ARNt prezinta o lungime cuprinsa intre 68 pb si 75 pb si exceptand ARNt pentru Ser (AGY), toate celelalte gene pentru ARNt prezinta structura secundara tipica inalnita la seria vertebratelor. La diverse specii de salmonide (S. salar, O. mykiss, S. alpinus, S. fontinalis, C. lavaretus), secventa ARNtMet este bine conservata. Bucla DHU de la ARNtMet este conservata in seria vertebratelor, avand o secventa similara cu cea intalnita la speciile de salmonide mentionate anterior. Similar, bucla DHU de la ARNt Leu prezinta o secventa inalt conservata la vertebrate si similara cu cea de la O. mykiss, S. salar si alte specii de salmonide. Se considera ca motivul
32

pentru care aceasta secventa este atat de conservata este pentru ca este absolut necesara transcrierii genelor ARNr si ARNt (Shadel & Clayton, 1997). Caracteristicile ADNmt Cele doua tipuri de ADN, nuclear si mitocondrial, prezente in celulele vertebratelor, au o origine si o evolutie diferita. ADNmt deriva din materialul ereditar al bacteriilor ca si consecinta a incorporarii acestor microorganisme in precursorul celulelor eucariote (teoria endosimbiotica). ADN mitocondrial prezinta o serie de caracteristici: mostenirea pe linie materna: acest fapt faciliteaza monitorizarea transmiterii diferitelor caractere de-a lungul unor linii evolutive, incepand din stadii timpurii ale evolutiei. In cazul n care unul dintre indivizii luati in studiu nu este disponibil cu o proba biologica, orice proba care provine de al genitorul matern este valabila si poate fi utilizata cu succes. nivel crescut de variatie a secventei nucleotidice: ADNmt prezinta un nivel ridicat de variabilitate si o rata crescuta a mutatiilor comparative cu ADN nuclear, in ciuda faptului ca nu codifica pentru sinteza unui numar mare de proteine. Studiile de la vertebrate au aratat ca divergenta de secventa se acumuleaza mai rapid in ADNmt decat in cel nuclear (Brown, 1985). Acest fenomen a fost atribuit unei rate a mutatiilor mai rapida in ADN mitocondrial care poate fi rezultatul lipsei mecanismelor de reparare in timpul replicarii. De exemplu, numarul mare de polimorfisme intalnite la nivelul a doua regiuni hipervariabile din regiunea de control mitocondrial permite discriminarea intre diferiti indivizi sau diferite probe biologice. rata de evolutie rapida: ADNmt prezinta o rata de evolutie mult mai rapida decat genomul nuclear, fapt ce i confera o mai buna rezolutie in studii de filogenie la specii foarte apropiate. lipsa de recombinare: o alta caracteristica a ADNmt, general acceptata ca un avantaj real pentru studii de genetica populationala, este lipsa de recombinare. Majoritatea animalelor prezinta un tip de reproducere sexuata. In acest tip de reproducere genele sunt transmise de la ambii genitori dupa recombinarea prin crossing-over si segregarea independenta a cromozomilor in timpul meiozei. Procesul de recombinare lipseste in cazul genelor mitocondriale deoarece genomul mitocondrial este transmis uniparental. genom compact: aceasta caracteristica permite analiza mai usoara a genomului mitocondrial comparativ cu cel nuclear. Genomul mitocondrial este mai mic, uniform ca
33

marime (15 18 kb la peti) si astfel, poate fi mai usor de manipulat. In plus, posibilitatea de a obtine ADNmt din probe biologice foarte mici sau chiar de degradate este mai mare decat in cazul ADN nuclear, deoarece moleculele de ADNmt se gasesesc in mii de copii/celula, in timp ce ADN nuclear prezinta doar doua copii/celula. Toate aceste proprietati recomanda ADNmt ca fiind un marker foarte util in studii moleculare la pesti, putnd fi folosit la: - discriminarea intre specii diferite de salmonide si identificarea hibrizilor; - determinarea relatiilor filogenetice si filogeografice la salmonide. ADN mitocondrial contine informatia genetica care permite cercetatorilor sa deduca relatiile intre speciile inrudite si istoria unei specii. - studii de caracterizare genetica a populatiilor; - programe de acvacultura de exemplu, in identificarea stocurilor de salmonide.

b)Filogenia moleculara a salmonidelor pe baza markerilor mitocondriali

Stabilirea relatiilor filogenetice pe baza caracterelor moleculare a cunoscut un real progres o data cu aparitia tehnicilor moleculare moderne. Reconstructia profilului filogenetic utilizand markeri nucleari este dificil de realizat, datorita recombinarii meiotice si modului de mostenire diploid al ADN nuclear. Datorita avantajelor pe care le prezinta (mostenirea pe linie materna, rata de evolutie rapida, un nivel de variabilitate si o rata a mutatiilor crescuta), markerii mitocondriali sunt folositi cu succes in studiile de sistematica la diferite nivele taxonomice. Astfel, ADNmt este ideal pentru studii filogenetice si filogeografice (Brown et al., 1979). De remarcat ca nu toate genele sunt indicatori filogenetici, ci numai cele care prezinta un grad crescut de conservare evolutiva. Zardoya et al. (1995) au studiat posibilitatea ca genele CytB si COX sa fie mai bine conservate datorita faptului ca ele codifica pentru centre redox active, in timp ce genele mitocondriale NADH si ATP-aza codifica pentru subunitati reglatoare. Cu toate acestea, secventa ATP8 este puternic conservata la Salmo salar, prezentand o identitate de 96% a secventei nucleotidice si 100% a secventei de aminoacizi comparativ cu cea de la O. mykiss (Hurst, 1999). Studiile evolutive bazate pe analiza ARNr au determinat un real progres in cazul metodelor de filogenie, deoarece ARNr poseda cateva avantaje care l fac un bun ceas
34

molecular. Este o molecula veche, prezenta la toate speciile vii, este inalt conservata ca structura si functie, chiar si la specii indepartate din punct de vedere filogenetic, se schimba destul de putin astfel incat poate sa ofere informatie pentru tot spectrul evolutiv. De asemanea, pana acum, nu a existat nici o dovada de transfer de gene pe orizontala a ARNr intre diferite specii. Filogenia salmonidelor a fost obiectul unui numar considerabil de studii, dar relatiile filogenetice intre anumite specii acestui grup de pesti au ramas neclarificate. Cele 66 de specii de salmonide sunt reunite intr-o singura familie Salmonidae, ce cuprinde trei subfamilii Coregoninae, Thymallinae si Salmoninae. Cea mai numeroasa dintre aceastea, subfamilia Salmoninae include 5 genuri Hucho, Salmo, Oncorhynchus, Brachymystax si Salvelinus, cu o larga distributie in emisfera nordica. Desi au fost efectuate studii bazate pe caractere morfologice (Norden, 1961; Kendall & Behnke, 1984; Dorofeyeva, 1989; Stearley, 1992), toate au propus relatii diferite intre genurile familiei Salmonidae (Figura 7). In ciuda importantei salmonidelor, istoria lor evolutiva a constituit pentru o lunga perioada un subiect de disputa (de ex., Domanico et al., 1997; McKay et al., 1996; Norden, 1961; Oakley & Phillips, 1999; Phillips& Oakley, 1997; Phillips & Pleyte, 1991; Utter et al., 1973; Utter & Allendorf, 1994). Studiile filogenetice anterioare la nivel de gen si specie au oferit informatii importante despre relatiile existente intre reprezentantii familiei Salmonidae, dar mai raman inca destule intrebari, in special vizand speciile genului Oncorhynchus si Salvelinus.

35

Figura 7: Relatii filogenetice la salmonide propuse pe baza caracterelor morfologice. (A) Norden (1961); (B) Kendall & Behnke (1984); (C) Dorofeyeva(1989); (D) Stearley & Smith (1993).

Studiile filogenetice in cadrul familiei Salmoninae bazate pe ADN mitocondrial (ADNmt) au fost initiate de Berg si Ferris care au examinat relatiile filogenetice intre membrii apartinand urmatoarelor genuri Salvelinus, Salmo si Onchorhyncus. Studiile ulterioare
36

(Thomas et al., 1986; Gyllensten et al., 1987; Ginatulina et al., 1988; Thomas et al., 1989; Grewe et al, 1990; Shedlock et al., 1992; Phillips et al., 1995; Kitano et al., 1997; Ohara et al., 1997) s-au axat pe stabilirea relatiilor filogenetice utilizand markeri mitocondriali la speciile apartinand unui singur gen din cele mentionate anterior, celelalte trei fiind utilizate ca outgrup. Shedko (2001) a analizat relatiile filogenetice existente intre speciile familiei Salmoninae pe baza secventelor genei citocrom b de la 9 specii de salmonide. Arborii filogenetici pe baza haplotipurilor genei cyt b au fost generati prin diferite metode: UPGMA (unweighted pairgroup method with rithmetic mean), NJ (neighbor-joining), ML (maximum likelihood) si MP (maximum parsimony). Gena mitocondriala pentru citocrom b este considerata un marker molecular util in studii de genetica la pesti, nu numai la nivel intra- si interspecific, dar si nivel de familii sau chiar taxoni superiori. Oakley & Phillips (1999) au ales un marker nuclear in studiul sistematicii genurilor Salmo si Oncorhynchus, si anume intronul genei pentru hormonul de crestere (GH). Secventa in cauza a fost aleasa pentru o analiza filogenetica luand in considerare rata de evolutie a acesteia si studii anterioare care au sugerat ca intronii genei GH au o rata de evolutie care ii fac compatibili pentru studii intergenerice si interspecifice la salmonide (McKay et al., 1996; Domanico et al., 1997). Crespi et al., 2003 au dedus relatiile filogenetice existente intre 30 de specii de salmonide pe baza secventelor a 16 gene mitocondriale si 9 gene nucleare. Fiecare gena a fost analizata separat prin metodele ML si MP si ulterior toate datele au fost combinate si analizate impreuna. Surprinzator, arborii filogenetici cu cea mai buna rezolutie au fost obtinuti din datele nucleare, in timp ce ADNmt a perturbat semnalul filogenetic, aparent ca rezultat al saturarii, hibridizarii, selectiei sau a combinatiei in diferite proportii a acestor fenomene. Relatiile filogenetice deduse din combinarea datelor mitocondriale si nucleare au fost urmatoarele: (1) Hucho hucho si Brachymystax lenok formeaza un grup inrudit cu Salmo, Salvelinus, Oncorhynchus si Hucho perry; (2) speciile genului Salmo formeaza un grup inrudit cu cladele genurilor Oncorhynchus si Salvelinus; (3) Oncorhynchus masou formeaza un grup monofiletic cu O. mykiss si O. clarki, si aceste trei specii impreuna formeaza o clada inrudita cu celelelate 5 specii ale genului Oncorhyncus (Figura 8).

37

Figura 5: Arbori filogenetici rezultati prin metodele Maximum Parcimony si Bayesian prin combinarea datelor mitocondriale (A) si tuturor datelor (nucleare si mitocondriale) (E). Speciile de salmonide din Romania au fost carcaterizate din punct de vedere taxonomic prin metode clasice (analize biometrice si morfologice) de Banarescu et al., 1964, astfel incat Fauna Romaniei Pisces Osteichthyes este si astazi o carte de referinta. Totusi, analiza taxonomica a ajuns in impas datorita imposibilitatii de a determina morfometric diferentele dintre speciile de pesti apropiate si se impune o caracterizare filogenetica a speciilor utilizand criterii moleculare. Tinand seama de importanta economica si stiintifica a acestor specii, este
38

absolut necesara realizarea unor studii de filogenie moleculara bazate pe analiza ADN la salmonide, luand in considerare si datele clasice de filogenie si sistematica de inalta valoare stiintific.

Tehnica PCR-RFLP

a)PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION )

Reacia de polimerizare n lan (PCR) reprezint o tehnic de biologie molecular prin care se realizeaz amplificarea anumitor fragmente din molecula de ADN. Tehnica este utilizat pentru amplificarea unei pri bine definite dintr-o caten ADN. Spre deosebire de procesul de replicare din organsimele vii, prin PCR se pot copia numai fragmente scurte de ADN, de obicei pn la 7-8 kb. Prin anumite metode se pot copia i fragmente mari, pn la 40 kb, ceea ce reprezint totui mult mai puin fa de mrimea ADN genomic. Prin aceast tehnic se produc un numr enorm de copii a unor secvene de ADN (gene) fr a se apela la clonare (Vlaic A. i colab., 1997). Tehnica PCR necesit cteva componente de baz. Aceste componente sunt: matria ADN, care conine regiunea care urmeaz s fie amplificat, oligonucleotide complementare sau primeri, care marcheaz nceputul i sfritul regiunii ce urmez a fi amplificat, ADN polimeraza stabil termic, care realizeaz amplificarea propriu-zis, nucleotidele cu ajutorul crora ADN polimeraza sintetizeaz noul fragment de ADN, tamponul de reacie care confer un mediu chimic corespunztor pentru desfurarea reaciei. Reacia PCR const ntr-o serie de 20-35 cicluri. Fiecare ciclu este alctuit din trei pai: 1) dublul helix de ADN trebuie nclzit la 94-96C pentru separarea catenelor. Acest pas se numete denaturare. n timpul acestui proces sunt rupte legturile de H care unesc cele dou catene ADN. nainte de primul ciclu, ADN este de obicei denaturat pentru un timp mai extins pentru a fi siguri c dublele catene ADN s-au separat complet i acum se afl n stare monocatenar. 2) dup separarea catenelor, temperatura scade pentru a permite primerilor s se ataeze la monocatena ADN. Acest pas se numete hibridizare. Temperatura la care se desfoar acest pas depinde de primeri i este de obicei cu 5C mai sczut fa de temperatura lor de
39

melting (45-68 C). O temperatur de hibridizare eronat poate determina nelegarea primerilor la catena ADN sau legarea la ntmplare a primerilor. 3) n final, ADN polimeraza trebuie s completeze catena lips. Acest pas se numete elongare sau extensie i ncepe la locul de anelare a primerului i se desfoar de-a lungul catenei ADN. Temperatura de elongare depinde de ADN polimeraz i de lungimea fragmentului ADN amplificat. Majoritatea ADN polimerazelor utilizate provin din organisme termofile i funcioneaz optim la 70-80C. Amplificarea este aproximativ exponenial, realizndu-se dup 3 cicluri 2 copii, dup 10 cicluri 256 copii, iar dup 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenei supuse amplificrii. (Vlaic A. i colab.,1997).

b)Tehnica PCR-RFLP
Principiul metodei n cazul salmonidelor tehnica PCR-RFLP este utilizat cu succes n realizarea unei diferenieri interspecifice pe baze moleculare. Astfel, este amplificat prin tehnica PCR o regiune ampl (aproximativ 2300 pb) de la nivelul genomului mitocondrial, iar ampliconii obinui sunt digerai cu ajutorul unor enzime de restricie specifice. Amprenta fragmentelor rezultate n urma digestiei difer de la o specie la alta furniznd astfel o metod molecular eficient de difereniere ntre speciile de salmonide. Tehnica PCR-RFLP se bazeaz pe compararea profilelor de restricie rezultate n urma digestiei ADN obinut prin amplificare cu endonucleaze de restricie. Eventualele mutaii care apar la nivelul secvenei ADN pot crea sau modifica un situs de restricie avnd drept rezultat obinerea de fragmente de restricie diferite. Enzimele de restricie au fost descoperite n urma studierii fenomenului de rezisten bacterian la atacul bacteriofagilor, determinat de sinteza unor enzime de restricie cu rol n degradarea materialului genetic fagic i protejarea celui propriu. Descoperirea, purificarea i caracterizarea unui numr foarte mare de astfel de enzime a impus adoptarea unei nomenclaturi universale. Astfel, pentru denumirea lor se folosete un cod de trei litere, n format italic, prima liter semnificnd genul, iar celelalte dou specia bacterian de la care a fost izolat enzima. (ex: Eco Escherichia coli). n unele cazuri, o a patra liter, n format normal, va indica tulpina bacterian. Dac o anumit tulpin bacterian are mai mult de un sistem de restricie-modificare, acestea se vor identifica prin numere romane.
40

Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice, scurte, recunoaterea fiind urmat de legare i apoi clivare, fie la nivelul situsului, fie la o distan oarecare de acesta. Sistemele de restricie-modificare (pot ndeplini i funcia de metilare) au fost mprite n trei categorii: I, II i III. Categoriile I i III constau n enzime care au att funcii de restricie ct i funcii de metilare. Ambele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate, de ADN dublu catenar. Enzimele din categoria I cliveaz ADN ntr-o manier situs-nespecific, iar cele din categoria III taie la nivelul unor situsuri specifice situate la o distan de 25-27 nucleotide de secvena de recunoatere. n categoria II sunt incluse toate enzimele cu capacitate de restricie-modificare care acioneaz exact la nivelul situsurilor de recunoatere pe care le scindeaz sau modific. Experimental, se recomand ca pentru o anumit secven ADN s se identifice posibilele situsuri de restricie caracteristice genotipului normal. Ulterior se verific dac mutaiile pe care dorim s le identificm afecteaz vreunul dintre aceste situsuri. Acestea pot modifica un situs de restricie deja existent sau pot genera un situs nou. n abordarea modern, tehnica RFLP se realizeaz prin amplificarea zonei de interes prin reacie PCR i digestia cu enzime de restricie a ampliconilor obinui. Ea poate fi folosit pentru genotipare individual, identificarea de polimorfisme normale i patologice i identificarea profilelor de restricie ale microorganismelor.

CAPITOL III: Materiale i metode

41

1. Recoltarea probelor de esut la salmonide

1. Se recolteaz o poriune mic de esut, preferbail din notatoarea caudal sau adipoas,

cu ajutorul unor foarfece sau unui bisturiu curate. Persoana care colecteaz probele trebuie sa aib minile curate, far mucus sau solzi i foarfecele/ bisturiul trebuie s fie bine cltite ntre dou colectri successive. Mrimea poriunii de nottoare trebuie s fie de aproximativ 5 cm 2 (aproximativ jumtate din dimensiunea unei unghii), pentru extragerea ADN din nottoare fiind necesare aproximativ 50 mg de esut. Dac nottoarea este prea mic, se recolteaz o poriune din nottoarea pelvic. Probele pot fi recoltate din esut proaspt sau ngheat. 2. Fiecare prob de nottoare va fi stocat separat n criotuburi sau tuburi Eppendorf de 1,5 ml ce conin aproximativ 1 ml de etanol de concentraie superioar (80- 96%). Este important ca ntreaga poriune de esut s fie complet imersat n alcool i s nu fie expus contactului cu aerul (criotubul trebuie nchis etan). Expunerea la aer poate afecta calitatea ADN ce urmeaz sa fie extras din esut. Etanolul permite pstrarea esutului la temperatura camerei i nu este necesar ca recipientul cu proba sa fie refrigerat. 3. Fiecare criotub se eticheteaz corespunztor pentru o identificare ulterioar uoar a probelor. Informaiile coninute pe fiecare etichet se refer la: specia de la care s-a colectat proba, localitatea, numrul probei, data colectrii probei. 4. Depozitarea probelor: probele trebuie ferite de variaii extreme de temperatur, n Pentru extracia ADN cu bune rezultate se pot utiliza i probe reprezentnd esut muscular scheletic sau ficat. Aceste esuturi dup recoltare sunt depozitate la -80C, ulterior fiind folosite pentru extracia ADN. special dac sunt stocate n etanol, pentru a evita afectarea calitii ADN.

2. Extracia ADN la salmonide

Izolarea ADN genomic se realizeaz avnd la baz un proces de extracie n trei etape. n prima etap are loc liza celulelor i a nucleelor acestora ntr-o soluie coninnd detergent i EDTA. Eliminarea ARN din extractul de acizi nucleici se realizeaz cu ajutorul unei soluii de RNA-az. n etapa urmtoare sunt precipitate proteinele folosind un amestec de solveni organici, n timp ce ADN genomic cu mas molecular mare rmne n soluie. n final, ADN genomic este concentrat i desalifiat prin precipitare cu etanol absolut. Peletul de ADN precipitat este splat cu etanol rece 70%, apoi dup o etap de centrifugare, urmat de
42

ndeprtarea etanolului, peletul de ADN este uscat i resuspendat n ap ultrapur sau tampon TE (Tris EDTA). Reactivi i aparatur - Fragmente de nottoare. - EDTA 0,2 M, N-lauroylsarcozinat de sodiu 5%. - Pronaz 20 mg/ml, RNA-az 2 mg/ml. - Fenol, cloroform, alcool izoamilic, etanol absolut i 70%, ap ultrapur. - Tuburi de centrifug sterile de 1,5 ml.
- Agitator REAX Top (Heidolph). - Microcentrifug MiniSpin (Eppendorf). - Termobloc TDB 120 (Biosan).

Mod de lucru Ziua I

1.

ntr-un tub Eppi de 2 ml se adaug 340 l EDTA (etilen diamin-

tetraacetic acid, tetra sodic x 2 H2O) 0,2 M, 800 l sarcosyl 0,5% (n ap) i 25l pronaz 20 mg x ml-1. 2. 3. Ziua II 1. 2. Se adaug 10 l de RNA-az n fiecare tub, se amestec i se incubeaz Se adaug 400 l fenol (pH = 8) n fiecare tub. Se agit puternic fiecare la 37C timp de o or. tub aproximativ 20 secunde i apoi mult mai uor timp de 10 minute (prin inversia repetat a tubului sau prin vortexare la vitez mic). 3. 4. 5. 6. Se adaug 400 l cloroform:alcool izoamilic (24:1) n fiecare tub. Se Se centrifugheaz tuburile la 13400 rpm timp de 3 minute. Cu o pipet automat, se ndeprteaz cu atenie stratul apos superior i Se repet paii 6, 7, 8 pe faza superioar nou transferat. agit puternic timp de 20 secunde, apoi mult mai uor timp de 10 minute. Se adaug esut n fiecare tub (50 mg nottoare sau 100 mg muchi Se amestec uor i se incubeaz peste noapte, 15-16 ore la 37C. scheletic).

se transfer ntr-un nou tub.

43

7. 8.
9.

Se adaug dou volume de etanol 100% rece peste faza apoas Se centrifugheaz 3 minute la 13400 rpm i apoi se arunc etanolul prin ntr-un interval de maxim 15 minute se decanteaz cu atenie etanolul.

transferat n tub. Se amestac prin inversia rapid a tubului de 5-6 ori. inversia tubului. Se adaug 1 ml de etanol 70% i se spal pentru cel puin o or prin agitare uoar. 10. 11. Se centrifugheaz 3 minute la 13400 rpm i apoi se decanteaz etanolul ADN se usuc la 37C timp de 10-15 minute i se resuspend n ap 70% adugat, ndeprtnd excesul prin nclinarea tubului. PCR. Se las cel puin 24 de ore pentru dizolvare complet la 4C. Puritatea i concentraia probelor ADN se verific spectrofotometric cu ajutorul spectrofotometrului BioRad. Raportul optim A260/ A280 este cuprins ntre 1,8 i 2. Dac raportul nregistreaz valori sub 1.8, soluia ADN este contaminat cu proteine, iar dac valoarea acestuia depaete 2.0, cantitatea de ARN din proba este peste limita admis i va interfera cu operaiile ulterioare. n cazul excesului de ARN se pot constata amplificri nespecifice sau hibridizri ntre ARN-primeri i ARN-ADN. Atunci cnd apare contaminarea se repet paii specifici de purificare pn se obine o valoare care s fie cuprins n domeniul optim. Integritatea ADN a fost verificat prin electroforez n gel de agaroz 1%.

3. Desemnarea de primeri specifici pentru amplificarea secvenelor ARN de interes filogenetic

Fragmentul ADN care urmez s fie amplificat este desemnat prin selectarea primerilor. Primerii reprezint oligocatene scurte, artificiale de ADN, nu mai lungi de 50 pb (de obicei de 18-25 nucleotide), care marcheaz nceputul i sfritul fragmentului ADN de amplificat. Primerii aneleaz (ader) la catena ADN la aceste puncte de nceput i de sfrit, unde ADN Polimeraza se leag i ncepe sinteza unei noi catene ADN. Alegerea lungimii i temperaturii de melting a primerilor (Tm) depinde de un numr de factori. Temperatura de melting a primerilor este definit ca tempertura sub care primerul va anela la catena ADN i deasupra creia primerul va disocia de catena ADN. Temperatura de melting crete cu lungimea primerului. Primerii care sunt prea scuri vor anela n cteva
44

poziii de-a lungul catenei de ADN ceea ce va determina generarea de copii nespecifice. Pe de alt parte, lungimea unui primer este limitat de temperatura de melting. O temperatur de melting prea mare, de exemplu, de aproximativ 80C, poate cauza probleme deoarece ADN Polimeraza este mai puin activ la astfel de temperaturi. Lungimea optim a unui primer este de obicei de 18-25 nucleotide, cu o temperatur optim ntre 50 C i 75 C. Uneori sunt folosii primeri degenerai. Acetia reprezint de fapt un amestec de primeri similari, dar nu identici. Acest tip de primeri este potrivit dac se dorete amplificarea aceleiai gene de la organisme diferite, deorece aceste gene sunt similare, dar nu identice. Folosirea primerilor degenerai poate reduce specificiatatea amplificrii PCR. Problema poate parial rezolvat prin folosirea tehnicii touchdown PCR. Din cauza considerentelor menionate, desemnarea primerilor reprezint un process precis, de care depinde cantitatea de produs obinut: Coninutul de GC nu trebuie s fie ntre 40-60%. Temperatura de melting calculat pentru ambii primeri utilizai n reacie nu trebuie s difere cu maxim 5C i temperatura de melting a produsului de amplificare nu trebuie sa difere de cea a primerilor cu maxim 10 C. Temperatura de anelare este de obicei cu 5 C mai mic fa de Tm calculat. Trebuie evitat formarea dimerilor de primeri. Captul 3' este foarte sensibil i nu trebuie s fie complementar cu orice alt regiune a altui primer folosit n recaie. La ora actual exist programe care sunt de un real folos n desemnarea primerilor. Desemnarea primerilor specifici pentru amplificarea secvenelor genice ARNr16S, ARNr12S i ARNt la speciile de salmonide analizate s-a realizat cu ajutorul programului Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), urmrind urmtoarele etape: 1.secvena de interes a fost descrcat din baza de date NCBI (National Center for Biotechnology Information) i salvat n format fasta. 2.secvena a fost introdus n programul Primer3 i se pstreaz setrile recomandate. Se selecteaz <Pick left primer> pentru desemnarea primerului sens, respectiv <Pick right primer> pentru primerul antisens. Pentru alegerea primerilor se selecteaz comanda <Pick Primers>. 3.Secvenele primerului sens, respectiv antisens generate de programul Primer3 vor fi prezentate ntr-o fereastr nou.
45

n noul format generat de Primer3 dup selectarea comenzii <Pick Primers> se regsesc urmtoarele informaii: secvena primerilor sens i antisens, situsul de legare a primerilor, temperatura de melting i procentul GC al primerilor, lungimea produslui PCR amplificat cu primerii respectivi (Figura 1).

Figura 1. Secvenele primerilor generate de programul Primer3. 4.Secvenele primerilor vor fi introduse pentru verificarea identitii ntr-un program din baza de date GenBank: BLAST. BLAST parcurge secvenele din banca de date, oprindu-se la fiecare liter din secvena bncii, care are coresponden cu secvena dat. BLAST ncearc sa realizeze un aliniament local, fr s insereze spaii n aceste secvene. Rezultatul obinut prin analiza BLAST este redat n cteva secunde sub forma unui tabel n care sunt afiate toate procentajele de identiti obinute. n cazul n care secvena cutat se regsete n baza de date, rezultatul afiat de ctre aplicaia BLAST l reprezint genele cu identitile de secven afiate n ordine descresctoare

4. Determinarea temperaturii de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient
Tehnica PCR necesit cteva componente de baz. Aceste componente sunt: Catena ADN, care conine regiunea din fragmentul ADN care urmeaz s fie amplificat;
46

Doi primeri, care marcheaz nceputul i sfritul regiunii ce urmez a ADN Polimeraza stabil termic, care copiaz regiunea ce urmeaz a fi Nucleotide (amestec echimolecular din cele patru tipuri de

fi amplificat; amplificat; deoxinucleotide) cu ajutorul crora ADN Polimeraza construiete noua caten de ADN; Buffer (tampon), care confer un mediu chimic corespunztor pentru ADN Polimeraz. Pentru optimizarea acestor reacii de amplificare am realizat, pentru fiecare dintre genele ARNr16S, ARNr12S i ARNt la speciile analizate, reacii de PCR n gradient de temperatur. n cazul acestui tip de reacie, ADN matri este supus concomitent unor temperaturi diferite de hibridizare a primerilor n scopul stabilirii temperaturii optime care s permit eliminarea amplificrilor parazite i realizarea cu un randament maxim a reaciei PCR. Totodat, n decursul unei astfel de reacii de optimizare, pot fi variate i intervalele de timp n care sunt parcurse treptele de temperatur, ct i numrul de cicluri de amplificare. Materiale i metode -Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaz s fie analizate. -Reactivi PCR: HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; -Reactivi pentru electroforez:

amestec de deoxi-nucleotide 10 mM din fiecare; clorur de magneziu 25 mM; tampon PCR 10X care conine 100 mM TRISpolimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; primeri sens i antisens pentru genele analizate. tampon de electroforez: TAE 1X TRIS 0,040 M, Acid acetic 0,040 M, tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X; soluie de bromur de etidium 10 g/ml; marker de mas molecular 100 bp (Promega);
47

EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X care este apoi diluat;

agaroz.

-Tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT. -Surs de curent PowerPac Basic (Bio-Rad). -Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat). -Termociclor iCycler (BioRad). -Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). -Microcentrifug MiniSpin (Eppendorf). -Agitator REAX Top (Heidolph). Mod de lucru: S-a realizat determinarea temperaturii de anelare specifice fiecrei perechi de primeri desemnate pentru amplificarea genelor ARNr16S, ARNr12S i ARNt prin PCR n gradient de temperatur. Pentru prepararea amestecului PCR se vor utiliza reactivii din Tabelul 1: - se amestec componentele de reacie; - vortexare i centrifugare; - se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de PCR de 0,2 l pentru fiecare prob analizat ; - se adaug 5 l ADN, diluat corespunztor (cantitatea optim de ADN trebuie s fie de aproximativ 50 - 100 ng/reacie); - vortexare i centrifugare ; - tuburile se aeaz n aparatul de PCR. Tabel 1: Componentele amestecului PCR. Component PCR Buffer 10X MgCl2 25 mM dNTP 10 mM Primer forward (20 pmoli/L) Primer reverse (20 M) AmpliTaq Gold Polimeraza (5 U /L) Apa PCR

Volum (l) 2,5 1,5 2 0,5 0,5 0,2 12,8

Pentru realizarea reactiei PCR n gradient de temperatur s-a programat aparatul de PCR dup programul prezentat n Tabelul 2 pentru genele ARNr 16S i ARNr 12S.
48

Tabel 2: Schema reaciei PCR n gradient de temperatur pentru genele ARNr 16S i ARNr 12S. Specia O. mykiss (ARNr 16S, ARNr 12S) Specia S. trutta (ARNr 16S, ARNr 12S) APARAT DE PCR Palm Cycler (Corbett) APARAT DE PCR iCycler (BioRad) Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Timpii i temperaturile de incubare Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Denaturare 30 secunde 95oC 35 de cicluri Anelare 40 secunde 51 60 oC Extensie Extinder 1 i final 4oC e minut 20 minute 30 72oC 1 ciclu Timpii i temperaturile de incubare 40 de cicluri Denaturare Anelare 30 secunde 95oC 30 secunde 50 60 oC Extensie Extinder e 1 minut 72oC final 10 minute 72oC 1 ciclu 4oC

secunde 72oC Timpii i temperaturile de incubare

Specia S. fontinali s (ARNr 16S, ARNr 12S) Specia T. thymallu s (ARNr 16S)

APARAT DE PCR Palm Cycler (Corbett) Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu 35 de cicluri Denaturare Anelare 30 secunde 95oC 40 secunde 51 60 oC Extensie Extindere final 4oC minute 72oC 1 ciclu Timpii i temperaturile de incubare APARAT DE PCR Palm Cycler (Corbett) Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu 35 de cicluri Denaturare Anelare 30 secunde 95oC 30 secunde 51 60 oC Extensie Extindere 1 minut 72oC final 10 minute 72oC 1 ciclu
49

1 minut i 20 30 secunde 72oC

4oC

Reacia PCR n grdaient de temperatur n cazul genelor pentru ARNt s-a realizat dup urmtorul program PCR (Tabelul 3). Tabel 3: Schema reaciei PCR n gradient de temperatur pentru genele ARNt. Specia O. mykiss APARAT Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu (ARNt Thr); DE PCR S. trutta Palm (ARNt Thr/ Cycler Pro); (Corbett) S. fontinalis (ARNt Thr) Timpii i temperaturile de incubare 40 de cicluri Denaturar Anelare Extindere e 30 secunde 95oC 30 secunde 50 60 oC 1 minut 72oC Extensie final 10 minute 72oC 1 ciclu 4oC

La terminarea reaciei PCR se efectueaz o electroforez n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare. Iniial se prepar gelul de agaroz astfel: - se izoleaz tvia aparatului de electroforez cu band adeziv; - se prepar un volum de 40 ml de agaroz 2% n tampon TAE 1X; - dup dizolvarea complet a agarozei la cald se adaug 2,3 l bromur de etidium 0,5 g/ml; - se monteaz pieptenul i apoi se toarn gelul n tvia de electroforez; - se las aproximativ 40 de minute la temperatura camerei pentru a se solidifica, iar gelul se introduce n tancul de electroforez. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete electroforeza. Migrarea se desfoar la 80V constant i la temperatura camerei, timp de 40 de minute. La finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz pe un transiluminator UV. n funcie de profilul electroforetic obinut s-a ales temperatura de hibridizare optim pentru a permite analiza genelor luate n studiu (Tabel 4).
Tabel 4: Temperatura optim de hibridizare pentru primerii ARNr 12S, ARNr 16S i ARNt.

50

Specie

O. mykiss

S. trutta

S. fontinalis

T. thymallus

Primer Om ARNr12S F Om ARNr12S R Om ARNr16S F Om ARNr16S R Om Thr F Om Thr R St ARNr12S F St ARNr12S R St ARNr16S F St ARNr16S R St tThr/Pro F St tThr/Pro R Sf ARNr12S F Sf ARNr12S R Sf ARNr16S F Sf ARNr16S R Sf Thr F Sf Thr R Tt ARNr16S F Tt ARNr16S R

Tm (C) 58 56 59 58 56 59 58 56 59 56

5. Amplificarea genelor ARNr16S, ARNr12S i ARNt la salmonide

Pentru analiza genelor ARNr16S, ARNr12S i ARNt i stabilirea relaiilor filogenetice existente ntre speciile de salmonide din Romnia se realizeaz mai nti o reacie de amplificare prin metoda PCR a ADN extras anterior. Secvenele primerilor utilizai pentru amplificarea fragmentelor genice de interes sunt prezentate n Tabelul 5.
Tabel 5: Secvenele primerilor Specie Primer Om ARNr12S F Om ARNr12S R Om ARNr16S F Om ARNr16S R Om Thr F Om Thr R St ARNr12S F St ARNr12S R St ARNr16S F St ARNr16S R St tThr/Pro F St tThr/Pro R Sf ARNr12S F Sf ARNr12S R Secven 5-CACCTCCCTTACACCGAGAA-3 5- GCCGAGTTCCTCTTCCT-3 5-TGTGAGGATGCCCTTAATCC-3 5-TTACGACTTGCCTCCCCTTT-3 5-TTATCGGACAAGTCGCCTCT-3 5-GGGAGTTAAGGGTGGGAGTT-3 5-CTAGAAAGTCCCGCGAGC-3 5-TTTCACAGCGTGGTTCGT-3 5-CACCTCCCTTACACCGAGAA-3 5-GCCGAGTTCCTTCTCTTCCT-3 5-TGGCTGGGCTGAGAATAAAG-3 5-TTGGGTTAGCAAGGTACAACAA-3 5-TGTGAGGATGCCCTTAATCC-3 5-TTCTCGGTGTAAGGGAGGTG-3 51

O. mykiss

S. trutta

S. fontinalis

T. thymallus

Sf ARNr16S F Sf ARNr16S R Sf Thr F Sf Thr R Tt ARNr16S F Tt ARNr16S R

5-CCTCGCCTGTTTACCAAAAA-3 5-GCTTAGGCCTTTCGCAATTA-3 5-ATCATTATCGGCCAAGTTGC-3 5-GAATCTTAGCTTTGGGAGTTAAGG-3 5-TACGAAAGGACCGGAAAGAA-3 5-GCTTAGGCCTTTCGCAATTA-3

Dup amplificare, pentru a putea fi vizualizate, fragmentele obinute sunt supuse unei elecroforeze n gel de agaroz 2%. Estimarea mrimii fragmentelor amplificate se face prin migrarea concomitent a unui marker de mas molecular 100 pb (100 bp DNA LadderPromega). Reactivi i aparatur Reactivi PCR: Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaz s fie analizate.

o amestec de deoxi-nucleotide, 10 mM din fiecare; o clorur de magneziu 25 mM; o tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; o ADN polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; o ap ultrapur;
o

primeri (Tabel 4) 20 M; o Reactivi pentru electroforez: tampon de electroforez: TAE 1X TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA

0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X care este apoi diluat; o tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X;
o

soluie de bromur de etidium 0,5 g/ml;

o marker de mas molecular 100 pb (DNA Ladder 100 bp Promega); o agaroz.

-

Tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT i surs de curent PowerPac Basic (Bio-Rad). Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat). Plit cu nclzire i agitare magnetic MR 3001 (Heidolph). Standard de mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size
52

Standard.

Formamid deionizat. Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Analizator genetic automat ABI Prism 310 (Applied Microcentrifug MiniSpin (Eppendorf). Agitator REAX Top (Heidolph). Termobloc TDB 120 (Biosan).

Biosystems).
-

Mod de lucru Pentru fiecare exemplar analizat au fost reacia PCR a fost realizat n modul urmtor:
-

se adaug reactivii din Tabelul 6 pentru a obine amestecul de reacie; vortexare i centrifugare; se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de PCR de 0,2 ml se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor (~80 ng/l) de la fiecare vortexare i centrifugare; tuburile se aeaz n aparatul de PCR.
Volum (l) 2,5 1,5 2 0,2 0,5 0,5 12,8 20

pentru fiecare animal testat;

-

exemplar; -

Tabel 6: Componentele i volumele amestecului de PCR. Componente Tampon PCR Clorur de magneziu Amestec de nucleotide ADN polimeraz AmpliTaq Gold Primer F Primer R Ap ultrapur Volum total

Tabel 7: Schema reaciei PCR pentru genele ARNr 16S i ARNr 12S. Specia O. mykiss APARAT DE PCR Etapa iniial Denaturare Timpii i temperaturile de incubare 40 de cicluri Anelare Extensie Extindere final

53

(ARNr 16S, ARNr 12S)

GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem)

10 min. 95oC 1 ciclu

30 secunde 95oC

30 secunde 12S; 56 oC ARNr 16S;

1 minut

10 minute 72oC 1 ciclu

4oC

58 oC ARNr 72oC

Specia S. trutta (ARNr 16S, ARNr 12S) APARAT DE PCR GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) Etapa iniial 10 min. 95 C 1 ciclu
o

Timpii i temperaturile de incubare Denaturare 30 secunde 95 C

o

35 de cicluri Anelare 40 secunde

o

Extensie Extindere final 4oC

1 minut i 30 20 minute 72 C 1 ciclu

o

58 C ARNr secunde 12S; 56 oC ARNr 16S; 72oC

Timpii i temperaturile de incubare APARAT Specia S. fontina lis (ARNr 16S, ARNr 12S) Specia T. thymall us (ARNr 16S) APARAT DE PCR GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) 54 Etapa iniial 10 min. 95 C 1 ciclu
o

DE PCR Etapa GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) Timpii i temperaturile de incubare Denaturare 30 secunde 95 C
o

iniial 10 min. 95oC 1 ciclu

Denaturare 30 secunde 95oC

35 de cicluri Anelare 40 secunde 12S; 56 oC ARNr 16S;

Extensie final 1 minut i 30 20 minute 72oC 1 ciclu 72oC Extindere 4oC

58 oC ARNr secunde

35 de cicluri Anelare 30 secunde 56 C

o

Extensie Extindere 1 minut 72 C

o

final 10 minute 72 C 1 ciclu

o

4oC

Tabel 8: Schema reaciei PCR n gradient de temperatur pentru genele ARNt. Specia Timpii i temperaturile de incubare O. mykiss APARAT Etapa iniial 10 min. 95 C 1 ciclu
o

(ARNt Thr); DE PCR S. trutta Palm (ARNt Pro); S. fontinalis (ARNt Thr) Thr/ Cycler (Corbett)

Denaturare 30 secunde 95 C
o

40 de cicluri Anelare 30 secunde 59 C

o

Extensie Extindere 1 minut 72 C

o

final 10 minute 72 C 1 ciclu

o

4oC

Pentru realizarea reaciei PCR:

- se programeaz aparatul de PCR la parametrii indicai n Tabelul 7, 8.

- amplificare PCR;
- produii obinui sunt pstrai la 2 - 6C pn la analiz.

Produii obinui sunt supui unei electroforeze orizontale, n gel de agaroz 2%, n sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea gelului se va face n lumin UV.

6. Secvenierea ADN
Secvenierea ADN reprezint procesul prin care este determinat ordinea nucleotidelor ntr-un fragment ADN. Metoda de secveniere dideoxy sau enzimatic, original dezvolatat de Sanger i colaboratorii si, utilizeaz ADN polimeraza pentru a sintetiza o copie complementar unei singure catene din proba de ADN. n afar de monocatena ADN i ADN Polimeraza, n amestecul de reacie se adaug un primer care se leag specific la catena ADN, cele patru deoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) n proporii egale, patru dideoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) marcate fluorescent. Dideoxinucleotidele sunt nuclotide sintetice crora le lipsete gruparea OH de la nivelul atomului C3. Raportul ddNTP/dNTP din fiecare reacie este ajustat astfel nct fiecare nucleotid s participe la reacie. Elonagarea catenei ADN se va produce pn cnd ADN Polimeraza va insera aleator o dideoxinucleotid n locul unei deoxinucleotide. Extensia
55

catenei este stopat deoarece lipsete gruparea C3-OH pentru ataarea urmtorarei nucleotide. n final, rezult un amestec de fragmente cu captul 5` determinat de primer i captul 3`terminat cu o ddNTP. Fragmentele rezultate vor diferi n final n lungime doar la nivelul unei perechi de baze, astfel nct fiecare fragment va corespunde, la nivelul ultimei nucleotide, fiecarei nucleotide din fragmentul iniial. Tehnica de secveniere ADN este bazat pe tehnica electroforetic cu gel de poliacrilamid denaturant de rezoluie mare. Aceste geluri, numite de secveniere sunt capabile de a diferenia o monocaten oligonucleotidic Fragmentele rezultate sunt separate n funcie de dimensiuni de la cel mai lung la cel mai scurt. Rezoluia este att de bun nct se pot difrenia de pn la 800 baze de o singur deoxinucleotid. Fragmentele genice obinute prin PCR au fost secveniate pentru a permite analiza genelor ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt. Iniial, ampliconii rezultai prin PCR pentru genele ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt au fost purficai. Dac nu exist benzi sumplimentare care s denote amplificri nespecifice purificarea ampliconilor se realizeaz direct din produsul PCR utliznd kitul Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega). Purificarea direct a ADN 1. Se transfer produii PCR n tuburi Eppendorf de 1,5 mL. 2. Se adug 100 L Direct Purification Buffer ; 3. Se vortexeaz i se centrifugheaz (short spin); 4. Se adaug 1 ml de rin ce a fost incubat n prealabil 10 minute la 37C peste amestecul respectiv i se amestec bine 20 30 de secunde prin vortexare rapid. 5. Se pregtete o coloan Wizard pentru fiecare amplicon. 6. Se pipeteaz amestecul rin-ADN n coloan i apoi aceasta se conecteaz la pompa de vid. 7. Se ndeprteaz pompa de vid i se spal coloana cu 2 ml izopropanol 80 %. Se reconecteaz coloana la vid. 8. Se usuc rina prin meninerea la vid timp de 30 de secunde. Coloana se ndeprteaz i se transfer ntr-un tub de centrifug nou. 9. Se centrifugheaz 2 minute la 10000g pentru a ndeprta orice urm de izopropanol.

56

10. Coloana se transfer ntr-un alt tub de centrifug curat, se adaug 50 l ap PCR i se incubeaz 1 minut la temperatura camerei.
11. Se centrifugheaz 20 de secunde la 10000g pentru a elua fragmentele de ADN. ADN

purificat poate fi pstrat la 4 0C sau la 20 0C (pentru un timp mai ndelungat). n cazul n care apar amplificri nespecifice, purificarea produilor PCR se face din gel de agroz LMP (Low Melting Point). n acest sens produii obinui sunt supui unei electroforeze orizontale, n gel de agaroz LMP 2%, n sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea fragmentelor ADN n gel se realizeaz pe un transiluminator UV. Benzile obinute pentru fiecare reacie n parte vor fi decupate cu ajutorul unui bisturiu steril, ntr-un timp ct mai scurt pentru a minimiza perioada de expunere a ADN la lumin UV. Banda izolat se transfer ntr-un tub de centrifug de 1,5 ml i se incubeaz la 70C pna la topirea complet a agarozei. Se adaug 1 ml de rin ce a fost incubat n prealabil 10 minute la 37C peste agaroza topit i se amestec bine timp de 20 de secunde prin inversare tub. n continuare se urmeaz paii 5-11 din protocolul de mai sus. Calitatea si concentraia ADN-ului dup reacia PCR i purificare a fost evaluat prin determinarea DO la 260/280 nm utliznd spectrofotometrul SmartSpec (BioRad). Fragmentele PCR purificate i cuantificate spectrofotometric au fost supuse secvenierii folosindu-se kitul DNA Sequencing kit BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready Reaction v3.1 (Applied Biosystems). Secvenierea preusupune trei etape: i) amplificarea PCR a ampliconilor cu un singur primer (sens saiu antisens), ii) purificarea produilor obinui n urma PCR de secveniere, iii) ncrcarea i rularea probelor pe secveniator ABI PRISM 3130 Genetic Analzer (Applied Biosystems). Amestecul reaciei PCR secveniere are urmtoarele componente: Ready Reaction Premix BigDye Sequencing Buffer Primer Ap PCR Volum final 2,5 X 5X 3,2 pmoli 1X 4 2 1,6 Pn la 20 L 20

la care se adaug proba de ADN diluat corespunzator. Cantitatea optim de ADN pentru reacia PCR de secvenere se stabliete n conformitate cu lungimea fragmentului amplificat. (Tabelul 12).
Tabelul 12: Cantitatea ADN pentru reactia PCR 57

Produs PCR 100-200 pb 200-500 pb 500-1000 pb 1000-2000 pb

ADN (ng) 1-3 3-10 5-20 10-40

Pentru realizarea reaciilor PCR se programeaz aparatul de PCR (GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystem) dup urmtorul program: Denaturare iniial 1 ciclu 96oC- 1min Denaturare 96oC sec 25 de cicluri Anelare Extensie sec min

- 10 50 oC - 5 60 oC - 4 4oC

Produii PCR obinui au fost precipitai folosind kit-ul de purificare BigDye X-Terminator (Applied Biosystems). Purificarea produilor de extensie - metoda de precipitare cu BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Byosistems) 1. Peste produii PCR care n prealabil au fost vortexai se adaug 90 L soluie SAM. 2. Se adaug 20 L soluie XTeminator. nainte de adugarea soluiei XTerminator este necesar vortexarea acesteia cel puin 10 secunde sau pn cnd soluia devine omogen. 3. Se vortexeaz tuburile 30 minute la 2000 rpm. 4. Se centrifugheaz tuburile timp de 2 minute la 2000 rpm. 5. Supernatantul se transfer n placa PCR.
6. Se pun probele n analizorul genetic automat ABI PRISM 3130.

Secvenele nucleotidice obinute pentru ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt au fost aliniate cu ajutorul programului BioEdit, corectate manual i comparate prin programul BLAST cu secvenele existente n bncile de date.

58

7. Construirea arborilor filogenetici

Estimarea relaiilor filogenetice pornind de la informaia coninut n secvenele ADN se bazeaz pe definirea acelei succesiuni de etape (algoritmi) prin care se poate construi cel mai bun arbore filogenetic. Un arbore filogenetic constituie reprezentarea grafic a filogeniei unui grup de oragnisme. Pentru obinerea arboilor filogenetici se respect urmtoarea succesiune de etape: -

obinerea secvenelor ADN pentru analiz; compararea secvenelor obinute cu cele din bncile de date; alinierea secvenelor; selectarea metodelor filogenetice; construirea arborilor i evaluarea acestor (Figura 13).

Secvene

BLAST

Aliniamente multiple

Da

Similaritate mare?

Nu

Da

Similaritate care poate fi recunoscut?

Nu

Metode Maximum parsimony

Metode de distan

Metode Maxium likelyhood

How well does data support prediction? Figura 13. Etapele unei analize filogenetice (D.W.Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Press, 2004) 59

Alinierea secvenelor Baza fundamentala a unui arbore filogenetic este realizarea unui aliniament multiplu coninnd secvenele de interes. Prin alinierea secvenelor se confirm c toate secvenele sunt omologe. Alnierea secvenelor se poate realiza manual (folosind un editor text), automat (cu ajutorul unui software specializat) sau combinat. Secvenele obinute pentru ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt la speciile de salmonide analizate au fost aliniate cu programul ClustalX. Pentru alinierea propriu-zis a secvenelor de interes cu programul ClustalX se realizeaz paii urmtori: 1. se aleg secvenele care au acelai sens de citire (forward sau reverse), 2. secvenele sunt trecute fie individual, fie impreuna ntr-un format care s fie recunoscut de programul de aliniere. ClustalX recunoate datele n format FASTA. 3. se definesc parametrii pentru aliniere (gap penalty). O pereche de secvene poate fi aliniat astfel nct s maximizm numarul de resturi nucleotidice care sunt comune, prin introducerea de spaii (gap) la una dintre secvene. Biologic, aceste gap se presupun a reprezenta inserii sau deleii care se produc atunci cnd secvenele sunt divergente dintr-un ancestor comun. Daca inserm prea multe spaii aliniamentul poate deveni fr neles, este necesar s restrngem numrul de spaii introduse astfel nct aliniamentul sa aib sens din punct de vedere biologic. De aceea, este utilizat un sistem de notare astfel nct resturile nucleotidice verificate sa obtina un scor pozitiv si spatiile (gap) sa obtina un scor negativ sau gap penalty (penalizarea discontinuitatilor). ClustalX creaz aliniamente multiple n trei etape: i) aliniaza individual fiecare secvena cu celellalte secvene ntr-o serie de aliniamente perechi; ii) utilizeaz acest set de aliniamente perechi pentru a crea un arbore ghid; iii) utilizeaz acest arbore ghid pentru a crea aliniament multiplu. Alegerea metodelor de construcie arborilor n general se utilizeaz dou categorii de metode pentru construirea arborilor filogenetici: metode de distan (fenetice). metode de caractere (cladistice).

Metodele de distan (fenetice) propun construirea arborilor plecnd de la asemnrile observate ntre fiecare pereche de uniti evolutive i se bazeaz pe calculul unei matrice de distan obinut comparnd secvenele dou cte dou i calculnd numarul total
60

de diferene pentru toate cuplurile posibile. Se construieste apoi un arbore filogenetic ale carui ramuri sunt cat mai apropiate de numerele continute de matricea de distanta. Cele mai utilizate metode de distanta sunt reprezentate de NJ (Neighbor Joing method), UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means) si presupun construirea arborelui filogenetic prin succesiunea de pasi urmatoare: alinierematrice de distantaarbore filogenetic. Cea mai simpla metod de a msura distana dintre dou secvene este de a alinia secvenele i de a numra numrul de diferene dintre acestea. Gradul de divergen se numeste distan Hamming (d). Pentru un aliniament cu lungimea N i n situsuri, la nivelul cruia exist diferene d = n/N. Distana observat (D) dintre dou secvene este: D = 1 S, unde S = M/L. Similitudinea (S) dintre dou secvene reprezint raportul dintre numarul de situsuri sinonime (M ) i lungimea secvenei (L). Distana evolutiv dintre dou secvene este egal cu numrul de substituii care sunt produse pe dou linii evolutive plecnd de la un ancestor comun. Diferenele observate nu sunt egale cu distana genetic, aceasta implicnd mutaii care nu pot fi observate direct. Convergena, reversia i schimbrile multiple sunt cel mai adesea ascunse observaiei. Pentru a ine cont de ele, numeroase modele au fost dezvoltate pentru a corecta distanele observate. Jukes i Cantor (1969) au propus o formul corectiv: D = -3/4 ln(1- 4/3p). Este un model simplu care presupune c substituiile sunt echiprobabile ( = , unde este probabilitatea de tranziie, este probabilitatea de transversie). n realitate, rata tranziiilor este mai mare dect cea a transversiilor. Modelul Kimura (K2P) ine cont de proporia dintre numrul de tranziii () i transversii (). Tranziiile sunt mult mai numeroase dect transversiile. Formula corectiv propus este: dxy = -1/2 ln(1- 2P -Q) + 1/4 ln (1- 2Q), unde P = proporia de tranziii si Q = proporia de transversii. UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means) este o metoda de clusterizare (cluster method) folosita n bioinformatic pentru creare de arbori filogenetici printr-un algoritm de nsumare secvenial. Metoda se bazeaz pe regruparea secvenelor celor mai apropiate. n matricea de distan cele dou uniti taxonomice operaionale avnd distana cea mai mic sunt adunate ntr-un nou cluster compus, care va fi considerat n continuare ca o singur unitate operaional. Este creat o nou matrice, n care distanele celorlalte uniti taxonomice operaionale ale clusterului sunt calculate. Procesul se repet

61

pn cand ramn doar dou OTU. Acestea sunt nsumate i rdcina este amplasat la jumtatea distanei calculate dintre cele doua sume. UPGMA este o metod simpl, dezvoltat original pentru construirea fenogramelor taxonomice. Metoda se bazeaz pe asumarea unei rate constate a evolutiei sustinuta de ipoteza ceasului molecular si anume, distantele sunt ultrametrice si deci ele evolueaza cu o viteza constanta. Obtinerea de date ultrametrice este foarte improbabila, chiar daca rata substitutiei ar fi perfect constanta. Metoda NJ (Neighbor Joing) este cea mai utilizata metoda de distanta, utilizand criteriul minimei evolutiei in constructia arborilor filogenetici. Ca si UPGMA, metoda NJ se bazeaza pe masurarea distantelor genetice pentru construirea unui arbore filogenetic, dar diferenta intre cele doua metode consta in faptul ca NJ tine cont de diferentele de viteza evolutiva intre diferitele ramuri ale arborelui filogenetic. Metoda NJ este mai eficienta decat celelate metode de distanta, utilizand un altgoritm polinominal ca si metodele de clusterizare. Metoda NJ nu utilizeaza ipoteza orologiului molecular, ci algoritmul utilizat in acest caz realizeza calculul lungimii bratelor arborelui, astfel incat distantele deduse ale arborelui sa corespunda cu cele mai apropiate distante masurate intre secvente. Aceasta modalitate de calcul este ilustrata si de denumirea metodei Neighbor Joing cel mai apropiat vecin. NJ genereaza arbori filogenetici fara radacina prin reunirea nodurilor care sunt apropiate unele de altele. Metodele de distanta prezinta avantajul ca sunt metode rapide si permit analiza unui numar mare de date si testarea unui numar mare de ipoteze alternative. Dezavantajul acestor metode consta in pierderea unei parti de informatie la trecerea de al matricea bazata pe caractere la matrice bazata pe calculul distantelor. De asemenea, nu permit combinarea unor caractere diferite in aceeasi matrice (de ex. caractere morfologice si secvente ADN). Metodele de caractere (cladistice) Metoda MP ( Maximum Parcimony) este o metoda cladistica bazate pe parcimonie. Principiul parcimoniei postuleaza ca pentru un grup de specii, filogenia verosimila este cea care necesita cel mai mic numar de schimbari evolutive. Arborele filogenetic al speciilor este conceput implicand un numar minim de evenimente evolutive. Lungimea arborelui L este egala cu suma numarului de modificari I pentru fiecare situs k.

L = li

; i=1
62

Etapele de analiza prin metoda MP sunt urmatoarele:

i. identificarea situsurilor informative; ii. deducerea tuturor topologiilor arborilor posibili pentru secventele de date; iii. calculul numarului minim de substitutii pentru fiecare situs informativ; iv. calculul sumei de modificari pentru fiecare arbore; v. alegerea topologiei arborelui care necesita cele mai putine modificari. Metoda MP deduce arborele (sau arborii) cu cel mai mic numar de pasi necesari pentru a produce variatii ale secvenetei observate. MP prezinta o serie de avantaje: tine cont de tipurile de caractere, nu reduce informatia la un numar unic (o distanta), incerca sa furnizeze informatie despre secventele ancestrale si evalueaza arbori diferiti. Comparativ cu metodele de distanta este foarte lenta. De asemenea, prezinta dezavantajul de a nu utiliza decat partial informatia (situsuri informative), nu coreceteaza substitutiile multiple si nu calculeaza lungimea bratelor. Metoda ML (Maximum Likelyhood) sau metoda probabilitatii maxime este o alternativa la metoda MP. ML este o metoda statistica utilizata pentru a deduce parametrii distributiei de probabilitate a unui anumit esantion. Din moment ce fiecare situs evolueaza independent, arborele este calculat separat pentru fiecare situs. Probabilitatae maxima este calculata pentru probabilitatea fiecarui rest dintr-un aliniament, pe baza unui model al procesului de substitutie. Prin metoda ML se incearca reconstruirea unei filogenii folosind un model explicit de evolutie. Metoda este cel mai eficienta cand este folosita pentru a testa sau a optimiza un arbore deja existent. ML prezinta o serie de avantaje:

cea mai fiabila dintre celelate metode filogenetice, ceea care conduce la comparativ cu parcimonia, ea este mai consistenta si mai putin sensibila la permite aplicarea a diferitelor modele evolutive (ex. modelul Kimura care tine

rezultatul cel mai apropiat de arborele evolutiv real. efectele atractiei bratelor lungi. cont de diferentele intre tranzitii si transversii) si de a estima lungimea bratelor in functie de scimbarea evolutie. Principalul dezavantaj este ca cere o mare putere de calcul si mult timp, fiind cea mai lenta dintre toate metodele filogenetice. Data fiind varietatea mare de metode care pot fi folosite in programele de filogenie este dificil pentru un biolog sa stabileasca care este cea mai buna metoda de analiza aunui set de
63

date. Lucrarile publicate pe teme de filogenie propun folosirea unor algoritmi diferiti si a unor seturi de date diferite pentru obtinerea unor concluzii valabile. In unele cazuri, metode diferite actioneaza sinergic. De exemplu, metoda NJ produce un singur arbore care este utilizat pentru a valida un arbore construit prin metodele MP sau ML. Folosind metode alternative putem sa obtinem indicatii despre robustetea concluziilor rezultate. Principalul criteriu prin care se evalueaza acuratetea unui arbore filogenetic vizeaza consistenta, eficienta si robustetea. Evaluarea acuratetei se refera fie la o metoda filogenetica anume (de ex, UPGMA), fie la un aumit arbore.

Construirea i evaluarea arborilor filogenetici Cel mai adesea termenul de filogenie este identificat cu un arbore filogenetic. Un arbore filogenetic este o reprezentare grafica a filogeniei unui grup de organisme, format din noduri si ramuri. Nodurile externe reprezinta unitati taxonomice operationale (OTU). Exista mai multe tipuri de arbori (dendograme):
-

fenograma o dendograma obtinuta prin metodele de distanta unde relatiile dintre taxoni exprima gradele de similitudine globala. cladograma o dendograma exprimand relatiile filogenetice dintre taxoni si construita plecand de la analiza cladistica. filograma o cladograma data de lungimea bratelor si proportionala cu numarul de schimbari evolutive. Majoritatea metodelor filogenetice produc arbori fara radacina. Utilizarea unui

outgroup (grup de comparatie)- grup ales din exteriorul grupului studiat duce la construirea unui arbore cu radacina. In cazul arborilor elaborati pe baza metodei fenetice, lungimea ramurilor reprezinta distanta genetica dintre taxoni, iar pentru cei elaborati prin metoda cladistica (cladograme) acestea se raporteaza la evenimentele evolutive (caractere derivate) care au avut loc pentru fiecare linie. Testarea fiabilitatii arborilor se face prin analiza bootstrap. Analiza bootstrap este o abordare folosita de obicei pentru a masura robustetea topologiei unui arbore. Bootstrap testeaza fiabilitatea ramurilor interne. Fiecare replicare boostrap produce o noua aliniere artificialacare este utilizata pentru a construi un arbore artificial. Pentru
64

fiecare ramura interna se calculeaza procentajul de arbori artificiali care contin aceasta ramificare. Consideram in general ca ramurile definite printr-o valoare de incarcare > 50% sunt fiabile. Sunt necesare 1000 de replicari de incarcare pentru ca aceasta metoda sa fie statistic valabila. Analiza bootstrap poate fi aplicata arborilor filogenetici construiti prin metodele Neighbor Joining, Maximum Parsimony si UPGMA. Fiecare set de date bootstrap este analizat din punct de vedere filogenetic. Construirea arborilor filogenetici pe baza secvenelor pentru ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt la salmonide a fost realizat prin metodele UPGMA, NJ, MP i ML cu programul PHYLIP (Phylogenetic inference package) v 3.68.

CAPITOL IV REZULTATE I DISCUII

1. Optimizarea protocoalelor PCR pentru genele mitocondriale ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt Iniial s-a determinat temperatura de hibridizare optim pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient de temperatur. Ampliconii au fost verificai prin electroforez n gel de agaroz 2%, obinndu-se urmtoarele profile electroforetice: pentru gena ARNr 16S Figurile 1 - 7, pentru gena ARNr 12S - Figurile 8 12 i pentru gena ARNt Pro/Thr - Figurile 1315.

Figura 1: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-4 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi: 150C; 2 50,9C; 352,4C; 454,6C.
65

Figura 2: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-4 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 57,7C; 2 59,9C; 3 61,3C; 4 62C.

Figura 3: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 60C; 2 59,1C; 3 57,4C; 4 56,6C; 5 - 55,9 C.

Figura 4: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario. M - Marker de
66

mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 55,1C; 2 53,6C; 3 52,7C; 4 51,9C; 5 - 51C.

Figura 5: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 60C; 2 59,1C; 3 57,4C; 4 56,6C; 5- 55,9 C.

Figura 6: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 55,1C; 2 53,6C; 3 52,7C; 4 51,9C; 5 - 51C.

Figura 7: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 16S la Thymallus thymallus. M - Marker
67

de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 59,1C; 2 58,3C; 3 55,9C; 4 55,1C; 5 - 54,4C; 6 - 53,6 C; 7 - 51,9 C.

Figura 8: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 12S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 62C; 2 61,3C; 3 59,9C; 4 57,7C; 5- 54,6C; 6- 52,4 C; 7- 50,9 C.

Figura 9 Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 60C; 2 59,1C; 3 58,3C; 4 57,4C; 5- 56,6C.

Figura 10: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario. M - Marker de

68

mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 55,9C; 2 55,1C; 3 54,4C; 4 52,7C; 5- 51,9C.

Figura 11:Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 12S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 60C; 2 59,1C; 3 58,3C; 4 57,4C; 5- 56,6C.

Figura 12: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNr 12S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 55,9C; 2 55,1C; 3 54,4C; 4 52,7C; 5- 51,9C.

Figura 13: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNtPro/Thr la Oncorhynchus mykiss. M - Marker
69

de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 52,7C; 3 55,1C; 4 57,4C; 5- 59,1C; 6- 60 C.

Figura 14: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNtPro/Thr la Salmo trutta fario. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 52,7C; 3 55,1C; 4 57,4C; 5- 59,1C; 6- 60 C.

Figura 15: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru gena ARNtPro/Thr la Salvelinus fontinalis. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 52,7C; 3 55,1C; 4 57,4C; 5- 59,1C; 6- 60 C. n final a fost optimizat protocolul de amplificare pentru genele codificatoare pentru ARNr 16S, ARNr 12S, respectiv ARNtPro/Thr i au fost alese temperaturile optime pentru hibridizarea primerilor. n urma reaciei de amplificare au fost obinute fragmentele prezentate n Figurile 16 23, pentru cele patru specii de salmonide analizate. Fragmentele au fost vizualizate prin electroforez n gel de agaroz 2%.

70

Figura 16: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-4 Fragmente de 942 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario; 5 - Fragment de 942 pb amplificat pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta labrax; 6- Martor negativ.

Figura 17: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNr 12S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-4 Fragmente de 776 pb amplificate pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario; 5 - Fragment de 776 pb amplificat pentru ARNr 12S la Salmo trutta labrax.

Figura 18: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente de 940 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss; 7 - Martor negativ.
71

Figura 19: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente de 842 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss.

Figura 20: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente de 819 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis; 7 - Martor negativ.

Figura 21: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru ARNr 12S. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-6: Fragmente de 925 pb amplificate pentru ARNr 12S la Salvelinus fontinalis; 7- Martor negativ.

72

Figura 22: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR pentru gena ARNtPro/Thr. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1-2: Fragmente de 205 pb amplificate pentru gena ARNtPro/Thr la Oncorhynchus mykiss; 3-4: Fragmente de 222 pb pentru gena ARNtPro/Thr la Salvelinus fontinalis; 5-6: Fragmente de 223 pb pentru gena ARNtPro la Salmo trutta fario; 7- Martor negativ.

Figura 23: Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR la Thymallus thymallus. M - Marker de mas molecular 100 bp; 1- Fragment de 942 pb amplificat pentru gena ARNr 16S; 2 - Fragment de 842 pb amplificat pentru gena ARNr 12S; 3- Fragment de 205 pb amplificat pentru gena ARNtPro/Thr; 4 - Martor negativ.

2. Diferen ele dintre specii in urma secven ieri i comparri cu baza de date GenBank
Fragmentele obinute pentru ARNr 16S la speciile de salmonide din Romnia au fost secveniate i comparate cu secvene similare din baza de date GenBank. Iniial, secvenele au fost analizate i corectate manual cu ajutorul programului BioEdit. Alinierea secvenelor a fost realizat cu programul ClustalX. Pentru reprezentanii speciei Salmo trutta fario (pstrv indigen), provenind din diferite bazine hidrografice, secvenele obinute pentru ARNr 16S au fost aliniate cu o secven similar din GenBank (NC_01007). Secvena genei pentru ARNr 16S din baza de date GenBank aleas pentru alinierea i compararea cu secvenele obinute de noi la pstrvul
73

indigen, provine de la specia Salmo trutta trutta (pstrv de mare). A fost aleas aceast secven, deoarece pentru Salmo trutta fario nu exist n bazele de date secvena integral a genelor mitocondriale pentru ARNr 16S, ARNr 12S i ARNtPro/Thr. Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 16S (NC_010007), n cazul reprezentanilor de pstrv indigen din Romnia au fost identificate urmtoarele polimorfisme: 301 A>G, 360 C>T, 454 T>C, 479 A>G, 587 A>G, 655 G>A (Figura 7). Numerele indic poziia din gena ARNr 16S din GenBank la nivelul creia se nregistreaz polimorfismele menionate. Acestea sunt mutaii silenioase, cu frecven aleatoare i care se pare c nu afecteaz funcia ARNr 16S, ci au rol evolutiv. n ceea ce privete secvenele pentru ARNr 16S provenind de la indivizi de pstrv indigen din Romnia, a fost identificat un singur poilmorfism intraspecific 265 G>A n cazul probei de pstrv indigen din rul Cerna. Confirmarea acestui polimorfism la un numr mai mare de indivizi ar putea constitui un marker pentru diferenierea populaiilor de pstrv indigen din rul Cerna de celelalte populaii de pstrv indigen din fauna rii noastre. Astfel, n cazul indivizilor analizai s-au identificat dou haplotipuri mitocondriale n cazul genei pentru ARNr 16S - S. t. fario 16S H1 (pstrv indigen rul Dmbovia/ pstrv indigen rul Nera) i S. t. fario 16S H2 (pstrv indigen rul Cerna). Secvenele obinute pentru ARNr 16S de la Salmo trutta labrax au fost aliniate cu secvena similar din GenBank pentru Salmo trutta truta (NC_010007). Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 16S (NC_01007), n cazul indivizilor de pstrv de Marea Neagr (Salmo trutta labarx) au fost identificate urmtoarele polimorfisme: 614 A>G, 728 A>G. Aceste polimorfisme se nregistreaz n poziii nucleotidice distincte ale genei mitocondriale pentru ARNr 16S, comparativ cu polimorfismele nregistrate la Salmo trutta fario. n cazul secvenei obinute la Salmo trutta labrax, se observ o variaie nucleotidic mai redus comparativ cu secvenele de la Salmo trutta fario, raportate la secvena omoloag din GenBank pentru Salmo trutta trutta. Se pare c ntre pstrvul de Marea Neagr (Salmo trutta labrax) i pstrvul de mare (Salmo trutta trutta) din nord-vestul Europei (coastele atlantice) i Marea Baltic, exist o nrudire strns. Aceast nrudire este demonstrat att de similaritatea mare a secvenelor nucleotidice analizate de noi, dar i de comportamentul asemntor al celor dou specii. Att Salmo trutta labarx, ct i Salmo trutta trutta, sunt

74

specii care i desfor ciclul de hrnire i cretere n mare, de unde ntreprind o migraie de reproducere n ruri. n cazul speciei Oncorhynchus mykiss, probele biologice au provenit din diferite pstrvrii din Romnia. Dintre toate speciile de salmonide din ara noastr, pstrvul curcubeu se preteaz cel mai bine la creterea intensiv. n Romnia aceast, specie se crete exclusiv n pstrvrii pentru consum alimentar. n cazul probelor de pstrv curcubeu analizate de noi, secvenele nucleotidice obinute pentru ARNr 16S au fost aliniate cu secvena similar din GenBank (L29771) cu ajutorul programului Clustal X. Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 16S (L29771), n cazul pstrvilor curcubeu din Romnia au fost identificate mai multe tipuri de mutaii punctiforme, de tipul tranziii (nlocuirea unei purine/pirimidine cu o alt purin/pirimidin), transversii (nlocuirea unei purine cu o pirimidin sau invers), inserii (Tabel 1). Tabel 1: Polimorfisme identificate n secvena nucleotidic a genei pentru ARNr 16S la specia Oncorhynchus mykiss. Prob O_mykiss_ Damb O_mykiss_ Gilau O_mykiss_I10 O_mykiss_KH Polimorfism 148 G>A 188 G>A Inserie 542 A 543 148 G>A 188 G>A Inserie 542 A 543 148 G>A Inserie 542 A 543 795 G>A 72 C>T 115 G>A 148 G>A Inserie 542 A 543 Haplotip H1 H1 H2 H3

Au fost identificate n total trei haplotipuri mitocondriale la probele de pstrv curcubeu analizate. Probele O_mykiss_ Damb i O_mykiss_Gilau prezint acelai haplotip, n timp ce probele O_mykiss_I10 i O_mykiss_KH prezint haplotipuri mitocondriale distincte pentru secvena genic ARNr 16S analizat.

75

Existena polimorfismelor intraspecifice i a mai multor haplotipuri mitocondriale ale secvenei genei pentru ARNr 16S la O. mykiss poate fi explicat de faptul c, n decursul anilor, aceast specie a fost ncruciat selectiv la nivel mondial prin reproducere artificial, rezultnd un numr destul de mare de varieti de O. mykiss, care au fost introduse i n pstrvriile din Romnia. n cazul probelor de lipan analizate de noi, secvena obinut pentru un fragment din gena pentru ARNr 16S a fost aliniat cu o secven similar din GenBank (FJ853655) cu ajutorul programului ClustalX . Exemplarele de lipan luate n studiu provin din rul Cerna. Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 16S din baza de date a NCBI, n cazul secvenei de Thymallus thymallus analizate de noi au fost identificate urmtoarele polimorfisme: G>A, C>T, aflate n poziia 166, respectiv 673 a genei mitocondriale pentru ARNr 16S. Acestea sunt mutaii silenioase, cu frecven aleatoare i care, se pare c nu afecteaz funcia ARNr 16S. Numrul relativ sczut de variaii nucleotidice, indic un grad de conservare ridicat a secvenei genei ARNr 16S la Thymallus thymallus. La Salvelinus fontinalis, secvenele obinute pentru un fragment din gena mitocondrial care codific pentru ARNr 16S au fost aliniate i comparate cu secvena similar din GenBank (NC_000860). Aliniamentul realizat cu programul ClustalX, arat c ntre secvenele nucleotidice provenid de la indivizii de pstrv fntnel din Romnia i secvena omoloag din GenBank nu exist variaii. Probele de pstrv fntnel analizate provin din bazine hidrografice distincte: rul Bratia (bazin Arge), rul Gilu (bazin Lotru) i ferma RNP Brdior (jud. Vlcea). Se pare, astfel, c gena mitocondrial pentru ARNr 16S nu poate fi utilizat ca marker molecular pentru diferenierea populaiilor de Salvelinus fontinalis, geografic distincte i izolate reproductiv. Secvenele obinute pentru ARNr 12S la reprezentani ai speciei Salmo trutta fario (pstrv indigen), din diferite bazine hidrografice au fost aliniate i comparate cu o secven similar din GenBank (NC_01007). Secvena cu numrul de acces NC_10007 provine de la specia Salmo trutta trutta (pstrv de mare), specie care se gsete n nord vestul Europei. Comparativ cu secvena pentru ARNr 12S din GenBank, n cazul secvenelor obinute pentru un fragment din aceast gen mitocondrial la pstrvul indigen au fost identificate trei

76

polimorfisme: 27 C>T, 28 A>C, 387 T>C. Polimorfismele identificate reprezint mutaii punctiforme (tranziii) cu rol evolutiv. Numrul de variaii nucleotidice n cazul genei ARNr 12S de la Salmo trutta fario este mai redus comparativ cu cel pentru gena ARNr 16S analizat anterior la aceeai specie, indicnd c aceast gen este mai bine conservat ntre reprezenanii genului Salmo. Secvenele obinute pentru ARNr 12S de la Salmo trutta labrax au fost aliniate cu secvena similar din GenBank pentru Salmo trutta truta (NC_010007) i a fost identificat un polimorfism n G>A n poziia. Numrul polimorfismelor identificate la nivelul fragmentului genei ARNr 12S analizat la Salmo trutta labrax este mai redus dect la Salmo trutta fario, raportndu-ne la secvena omoloag din baza de date pentru Salmo trutta trutta. Datele obinute pentru cele dou specii de salmonide din Romnia, pstrvul indigen i pstrvul de Marea Neagr, n ceea ce privete variaia secvenei nucleotidice pentru gena ARNr 12S, sunt n concordan cu datele prezentate anterior pentru gena ARNr 16S, i confirm nrudirea mai strns ntre pstrvul de Marea Neagr (Salmo trutta labarx) i pstrvul de mare (Salmo trutta trutta) din nord-vestul Europei. Secvenele obinute pentru un fragment din gena ARNr 12S, au fost corectate i analizate cu programul BioEdit i au fost aliniate secvena similar din GenBank (DQ288268). Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 12S (DQ288268), n cazul reprezentanilor de pstrv curcubeu din Romnia au fost identificate urmtoarele variaii ale secvenei nucleotidice (Tabel 2). Tabel 2: Polimorfisme identificate n secvena nucleotidic a genei pentru ARNr 12S la specia Oncorhynchus mykiss. Prob O_mykiss_ Damb O_mykiss_ Gilau O_mykiss_I10 O_mykiss_KH Polimorfism 373A>G 373A>G 373A>G 437A>G 309A310 373A>G Haplotip H1 H1 H2 H3

Similar cu secvenele analizate pentru ARNr 16S au fost identificate n total trei haplotipuri mitocondriale la probele de pstrv curcubeu analizate. Probele O_mykiss_ Damb i O_mykiss_Gilau prezint acelai haplotip, n timp ce probele O_mykiss_I10 i
77

O_mykiss_KH prezint haplotipuri mitocondriale distincte pentru secvena genic ARNr 12S analizat. Existena mai multor haplotipuri mitocondriale la O. mykiss, att pentru gena ARNr 16S, ct i pentru ARNr12S, este explicabil, lund n considerare c aceast specie a fost ncruciat selectiv, la ora actual fiind prezente n pstrvrii un numr destul de mare de varieti de O. mykiss. n cazul probelor de lipan analizate de noi, secvena obinut pentru un fragment din gena pentru ARNr 12S a fost aliniat cu o secven similar din GenBank (FJ853655) cu ajutorul programului ClustalX. Comparativ cu secvena genei pentru ARNr 12S din baza de date NCBI, n cazul secvenei de Thymallus thymallus analizate de noi au fost identificate urmtoarele polimorfisme: 314 A>G, 502G>A. Numrul de variaii nucleotidice existente ntre secvena genei mitocondriale pentru ARNr 12S de la specia de lipan din Romnia (rul Cerna) i secvena omoloag din GenBank este acelai ca n cazul genei pentru ARNr 16S. Acestea polimorfisme reprezint mutaii silenioase, cu frecven aleatoare i care, se pare c nu afecteaz funcia genelor, ci au rol evolutiv. Numrul relativ sczut de variaii nucleotidice, indic un grad de conservare ridicat a secvenei genelor mitocondriale care codific pentru ARNr la Thymallus thymallus. La Salvelinus fontinalis, secvenele obinute pentru un fragment din gena mitocondrial care codific pentru ARNr 12S au fost aliniate i comparate cu secvena similar din GenBank (NC_000860). Aliniamentul realizat cu programul ClustalX, arat c ntre secvenele nucleotidice provenid de la indivizii de pstrv fntnel din Romnia, din diferite bazine hidrografice- rul Bratia (bazin Arge), rul Gilu (bazin Lotru) i din cresctorii (ferma RNP Brdior, jud. Vlcea) i secvena omoloag din GenBank nu exist variaii, situaie ntlnit i n cazul genei pentru ARNr 16S analizate anterior. Astfel, ambele gene mitocondriale care codific pentru ARNr nu prezint polimorfisme interspecifice i nu pot fi utilizate ca marker pentru diferenierea ntre populaiile de pstrv fntnel, izolate reproductiv. Secvenele pentru ARNtPro/Thr obinute la speciile de salmonide din Romnia, au fost alniate cu secvenele similare din GenBank i s-a observat c aceast regiune din genomul mitocondrial este o regiune conservat la speciile analizate. La speciile de salmonide, s-a identificat o singur diferen faa de sevenele din baza de date, constnd n deleia unui rest de T.

78

Secvenele obinute pentru fragmentele genelor ARNr 16S, ARNr 12S i ARNtPro/Thr au fost utilizate pentru stabilirea relaiilor filogenetice la speciile de salmonide din Romnia cu folosind programul PHYLIP 3.68. n cazul genei mitocondriale, ARNr 16S, la cele 5 specii de salmonide din Romnia au fost analizate 864 de situsuri nucleotidice, avnd compoziia n baze azotate prezentat n Tabelul 3. Tabel 3: Compoziia n nucleotide a fragmentului amplificat pentru gena ARNr 16S la speciile de salmonide din Romnia.
Secven S_t_fario H1 Lungime (pb) 864 G+C 45,37% A+T 54,63% Compoziie nucleotide A 303 (35,07%) C 214 (24,77%) G 178 (20,60%) T 169 (19,56%) A 304 ( 35,19%) C 214 (24,77%) G 177 (20,49%) T 169 (19,56%) A 303 (35,07%) C 214 (24,77%) G 178 (20,60%) T 169 (19,56%) A 302 (34,99%) C 219 (25,38%) G 179 (20,74%) T 163 (18,89%) A 302 (34,99%) C 219 (25,38%) G 179 (20,74%) T 163 (18,89%) A 300 (34,76%) C 219 (25,38%) G 178 (20,63%) T 166 (19,24%) A 315 (36,50%) C 214 (24,83%) G 174 (20,19%) T 159 (18,45%) A 308 (35,77%) C 208 (24,16%) G 178 (20,67%) T 167 (19,40%)

S_t_fario H2

864

45,25%

54,75%

S_t_labrax

864

45,37%

54,63%

O_mykiss H1

863

46,12%

53,88%

O_mykiss H2

863

46,12%

53,88%

O_mykiss H3

863

46,00%

54,00%

S_fontinalis

862

45,01%

54,99%

T_thymallus

861

44,83%

55,17%

Secvenele nucleotidice obinute pentru un fragment din gena mitocondrial ARNr 16S la salmonidele din Romnia au fost aliniate cu programul ClustalW . Din cele 864 de situsuri nucleotidice, 690 sunt situsuri identice. Dintre polimorfismele interspecifice nregistrate la
79

nivelul sevenei genei ARNr 16S, 75 sunt tranziii i 97 sunt transversii, raportul Ts/Tv de 0,8 Dintre cele 864 situsuri nucleotidice analizate, urmtoarele 81 de situsuri sunt informative din punct de vedere parcimonic.

3.Construirea arborilor filogenetici pe baza secven elor ob inute

Secvenele pentru gena ARNr 16S au fost utilizate pentru construirea de arbori filogenetici prin diferite metode filogenetice. Stabilirea relaiilor filogenetice la speciile de salmonide provenind din diferite bazine hidrografice din Romnia cu ajutorul metodelor de distan (NJ Neigbour Joining i UPGMA) s-a realizat utiliznd diferite aplicaii ale programului Phylip 3.68. Pe baza matricei de distan generate de DnaDist, utiliznd ca model de substituie Kimura2, au fost construii arborii filogenetici prin metodele NJ (Figura 24) i UPGMA . Arborii rezultai au fost reprezentai sub forma unei filograme, respectiv arbore radial fr rdcin.

Figura 24: Filogram construit prin metoda NJ pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 16S la speciile de salmonide din Romnia. Model de substituie Kimura2. Valoare de bootstrap: 1000 replicri. Utiliznd programul Phylip 3.68 au fost construii arbori filogenetici pe baza metodelor de caractere ML (Maximum Likelihood) i MP (Maximum Parcimony) (Figurile 25-26), folosind ca valoare de bootstrap 1000 de replicri. Valorile de bootstrap obinute prezint
80

valori >50, ceea ce indic o fiabilitate bun a arborilor obinui. Cea mai mic valoare de bootstrap n cazul metodei ML este de 55,8, iar n cazul metodei MP de 58,8.

Figura 25: Relaiile filogenetice la speciile de salmonide din Romnia pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 16S obinute prin metoda ML.

Figura 26: Relaiile filogenetice la speciile de salmonide din Romnia pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 16S obinute prin metoda MP.
81

Dei, reprezentrile grafice ale arborilor filogenetici sunt diferite, relaiile filogenetice ilustrate sunt aceleai. La baza arborilor obinui se afl specia Thymallus thymallus. n acest caz datele moleculare reprezentate de secvena genei mitocondriale ARNr 16S confirmnd datele de filogenie clasic care afirm c subfamilia Thymallinae (reprezentant Thymallus thymallus) a aprut naintea subfamiliei Salmoninae, care cuprinde genurile Salmo, Oncorhynchus, Hucho, Brachymystax i Salvelinus. Salmo_trutta_fario_H1 i Salmo_trutta_fario_H2 ocup poziii echivalente, fiind vorba, de fapt, de haplotipuri mitocondriale ale aceleiai specii. Aceast specie prezint cea mai mare apropiere filogenetic de Salmo trutta labrax, specie care aparine aceluiai gen, Salmo. Reprezentanii genului Salmo formeaz o clad distinct, nrudit cu clusterul format de Salvelinus/Oncorhynchus. Dei, datele de filogenie clasic susin c genurile Salmo i Onchorhynchus sunt direct nrudite, anumite date de filogenie molecular afirm c ntre genurile Salvelinus i Oncorhynchus exist o apropiere filogenetic mai mare. Oakley & Phillips (1999), au stabilit relaiile filogenetice la 18 specii de salmonide utiliznd un marker molecular nuclear (intronii genelor GH1 i GH2). Relaiile de filogenie clasic ntre Oncorhynchus i Salmo au fost susinute de analiza MP, dar nu i de ML. n concluzie, relaiile filogenetice ntre Salmo i Oncorhynchus ca taxoni direct nrudii sunt controversate, aceiai autori propunnd ipoteza c Oncorhynchus i Salvelinus, sunt mai apropiate din punct de vedere filogenetic dect Oncorhynchus i Salmo. Crespi et al., (2003) au realizat un studiu complex de filogenie la 30 de specii de salmonide, utiliznd ca markeri filogenetici 16 gene mitocondriale i 9 gene nucleare. Printre concluziile acestui studiu se numr i faptul c (a) Salmo reprezint un grup nrudit cu grupul (Oncorhynchus, Salvelnius), (b) Salvelinus este taxonul cel mai apropiat din punct de vedere filogenetic de Oncorhynchus. Concluziile anterioare au fost bine susinute de valorile de bootstrap obinute i de analiza de tip bayesian. nrudirea ntre Salvelinus i Oncorhynchus a fost susinut de analiza genelor GH1C, VIT i ND3 i de datele nucleare combinate. n cazul analizei noastre bazate pe secvena ARNr 16S, interpunerea speciei Salvelinus fontinalis ntre reprezentanii genului Salmo-Salmo trutta fario i Salmo trutta labrax, i Oncorhynchus mykiss este susinut att de analiza de tip MP, ct i de analiza de tip ML.
82

Haplotipurile mitocondriale ale Oncorhynchus mykiss formeaz o clad separat, O_mykiss_H2 i O_mykiss_H3 fiind mai apropiate ntre ele dect cu O_mykiss_H1. Acest fapt confirm faptul c exist mai multe varieti ale acestei specii n pstrvriile din Romnia. n cazul construirii arborilor de distan prin metoda NJ, apar diferene n ceea ce privete poziia ocupat de Salvelinus fontinalis, n funcie de modelul de substituie ales. n cazul n care alegem ca model de substituie LogDet, topologia arborelui obinut prin NJ este similar cu cea a arborilor obinui prin MP i ML (Figura 27). Distana de tip LogDet calculeaz frecvena cu care apar diferenele dintre cele patru nucleotide ntre liniile analizate. Se opteaz pentru parametrul LogDet cnd frecvena bazelor n cazul speciilor analizate nu este constant. n cazul n care am optat n construirea matricei de distan pentru celelalte modele de substituie oferite de aplicaia DnaDist (F84, Jukes-Cantor, Kimura2), topologia arborilor rezultai este identic i prezint specia Salvelinus fontinalis, formnd un grup monofiletic cu speciile genului Salmo, distinct de grupul format de specia Oncorhynchus mykiss.

Figura 27: Relaiile filogenetice la speciile de salmonide din Romnia pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 16S obinute prin metoda NJ-model de substituie LogDet.
83

n cazul genei mitocondriale, ARNr 12S, la cele 5 specii de salmonide din Romnia au fost analizate 861 de situsuri nucleotidice, avnd compoziia n baze azotate prezentat n tabelul 4. Tabel 4: Compoziia n nucleotide a fragmentului amplificat pentru gena ARNr 12S la speciile de salmonide din Romnia.
Secven S_t_fario Lungime (pb) 860 G+C 51,16% A+T 48,84% Compoziie nucleotide A 252 (29,30%) C 247 (28,72%) G 193 (22,44%) T 168 (19,53%) A 254 (29,53%) C 246 (28,60%) G 192 (22,33%) T 168 (19,53%) A 256 (29,77%) C 245 (28,49%) G 192 (22,33%) T 167 (19,42%)

S_t_labrax

860

50,93%

49,07%

O_mykiss H1

860

50,81%

49,19%

O_mykiss H2

860

50,93%

49,07%

O_mykiss H3

861

50,75%

49,25%

S_fontinalis

861

50,47%

49,53%

T_thymallus

859

50,76%

49,24%

A 255 (29,65%) C 245 (28,49%) G 193 (22,44%) T 167 (19,42%) A 258 (29,97%) C 245 (28,46%) G 192 (22,30%) T 166 (19,28%) A 256 ( 29,77%) C 241 (28,02%) G 193 (22,44%) T 170 (19,77%) A 250 (29,10%) C 240 (27,94%) G 196 (22,82%) T 173 (20,14%)

Secvenele nucleotidice obinute pentru un fragment din gena mitocondrial ARNr 12S la salmonidele din Romnia au fost aliniate cu programul ClustalW. Din cele 861 de situsuri nucleotidice, 833 sunt situsuri identice. Dintre polimorfismele interspecifice nregistrate la nivelul sevenei genei ARNr 12S, 20 sunt tranziii i 7 sunt transversii, raportul Ts/Tv fiind de 2,85.
84

Dintre cele 861 situsuri nucleotidice analizate 32 de situsuri sunt informative din punct de vedere parcimonic. Procentul de situsuri nucleotidice variabile este mult mai mare n cazul secvenelor pentru ARNr 16S (20,1%) comparativ cu procentul situsurilor variabile n cazul secvenelor pentru ARNr 12S (3,3%). O diferen semnificativ se pstreaz i pentru situsurile informative din punct de vedere parcimonic ( Pi) la cele dou tipuri de fragmente analizate9,38% situsuri Pi n cazul ARNr 16S vs. 3,7% situsuri Pi n cazul ARNr 12S. Secvenele pentru ARNr 12S au fost utilizate pentru construirea de arbori filogenetici prin diferite metode filogenetice. Pe baza matricei de distan generate de DnaDist au fost construii arborii filogenetici prin metodele NJ (Figura 28) i UPGMA . Indiferent de modelul de substituie ales (F84, K2P, JC, LogDet) pentru generarea matricei de distan, au fost obinui arbori filogenetici similari, deci n cazul secvenelor obinute pentru ARNr 12S, modelul de substituie ales nu influeneaz topologia arborilor. Arborii rezultai prin metodele de distan au fost reprezentai sub forma unei filograme, respectiv arbore radial fr rdcin.

85

Figura 28: Filogram construit prin metoda NJ pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 12S la speciile de salmonide din Romnia. Model de substituie: Kimura 2P. Valoare de bootstrap: 1000 de replicri. Cu ajutorul programului Phylip 3.68 au fost construii arbori filogenetici pe baza metodelor de caractere ML i MP (Figurile 29-30), utiliznd ca valoare de bootstrap 1000 de replicri. Valorile de bootstrap obinute prezint valori >50, ceea ce indic o fiabilitate bun a arborilor obinui.

Figura 29: Relaiile filogenetice la speciile de salmonide din Romnia pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 12S obinute prin metoda MP.

86

Figura 30: Relaiile filogenetice la speciile de salmonide din Romnia pe baza secvenei genei mitocondriale ARNr 12S obinute prin metoda ML. Arborii rezultai folosind ca marker filogenetic un fragment din gena mitocondrial pentru ARNr 12S la salmonidele din Romnia ilustreaz relaiile filogenetice la aceste specii. Similar anailzei filogenetice bazate pe ARNr 16S, specia Thymallus thymallus ocup o poziie bazal, ca ancestor al celorlate specii de salmonide. Speciile Salmo trutta fario i Salmo trutta labrax formeaz o clad distinct de cea reprezentat de Salvelinus fontinalis/ Oncorhynchus mykiss. Salvelinus fontinalis apare ca fiind mai apropiat din punct de vedere filogenetic de genul Oncorhynchus dect de genul Salmo. Pentru fragmentul din gena ARNtPro/Thr la cele 5 specii au fost analizate 149 de situsuri nucleotidice, avnd compoziia n baze azotate prezentat n tabelul 5. Tabel 5: Compoziia n nucleotide a fragmentului ARNt de la speciile de salmonide din Romnia.
Secven S_t_fario Lungime (pb) 149 G+C 52,35% A+T 47,65% Compoziie nucleotide A 40 (26.85%) C 41 (27.52%) G 37 (24.83%) T 31 (20.81%) 87

S_t_labrax

149

52,35%

47,65%

O_mykiss

149

54,36%

45,64%

S_fontinalis

149

53,02%

46,98%

T_thymallus

149

53,02%

46,98%

A 40 (26.85%) C 41 (27.52%) G 37 (24.83%) T 31 (20.81%) A 39 (26.17%) C 45 (30.20%) G 36 (24.16%) T 29 (19.46%) A 39 (26.17%) C 42 (28.19%) G 37 (24.83%) T 31 (20.81%) A 41 (27.52%) C 42 (28.19%) G 37 (24.83%) T 29 (19.46%)

Secvenele nucleotidice obinute pentru un fragment din gena mitocondrial ARNtPro/Thr au fost aliniate cu programul ClustalW. Din cele 149 de situsuri nucleotidice, 141 sunt situsuri identice. Dintre polimorfismele interspecifice nregistrate la nivelul sevenei genei ARNt, 6 sunt tranziii i 2 sunt transversii, raportul Ts/ Tv fiind 3. Dintre cele 149 de situsuri nucleotidice analizate, 8 sunt informative din punct de vedere parcimonic. Utiliznd ca marker filogenetic gena mitocondrial pentru ARNtPro/Thr, au fost construii arbori filogenetici prin metodele de distan NJ i UPGMA i prin metodele de caractere ML i MP. Pe baza matricei de distan generate de DnaDist (program Phylip 3.68) au fost construii arborii filogenetici prin metodele NJ (Figura 31) i UPGMA. Indiferent de modelul de substituie ales (F84, K2P, JC, LogDet) pentru generarea matricei de distan, au fost obinui arbori filogenetici similari, deci topolgia arborilor rezultai folosind ca marker filogenetic ARNtPro/Thr nu este influenat de modelul de substituie ales. Arborii rezultai prin metodele de distan au fost reprezentai sub forma unei filograme, respectiv arbore radial fr rdcin.

88

Figura 31: Filogram construit prin metoda NJ pe baza secvenei genei mitocondriale ARNtPro/Thr la speciile de salmonide din Romnia. Model de substituie: Kimura 2P. Valoare de bootstrap: 1000 de replicri. Cu ajutorul programului Phylip 3.68 au fost construii arbori filogenetici pe baza metodelor de caractere MP i ML (Figurile 32-33), utiliznd ca valoare de bootstrap 1000 de replicri.

89

Figura 32: Cladogram rezultat prin metoda MP pe baza secvenei genei mitocondriale ARNtPro/Thr la speciile de salmonide din Romnia.

Figura 33: Cladogram rezultat prin metoda ML pe baza secvenei genei mitocondriale ARNtPro/Thr la speciile de salmonide din Romnia. Indiferent de tipul de metod folosit, arborii rezultai indic aceleai relaii filogenetice la speciile de salmonide din ara noastr. Diferit, de relaiile filogenetice stabilite utiliznd ca markeri filogenetici genele mitocondriale ARNr 16S i ARNr 12S, n cazul ARNt specia
90

Salvelinus fontinalis, formeaz un grup monofiletic cu speciile Salmo trutta fario i Salmo trutta labrax, i nu cu Oncorhyncus mykiss, aa cum s-a stabilit anterior. Lungimea redus a fragmentului ARNtPro/Thr de 149 de nucleotide comparativ cu 864 i 861 de nucleotide pentru ARNr 16S i ARNr 12S, poate constitui un impediment n analiza filogenetic molecular i astfel se explic incongruena datelor obinute. Datele mitocondriale pentru cele trei fragmente genice ARNr 16S, ARNr 12S i ARNt (n total 1873 de situsri nucleotidice) au fost analizate mpreun pentru stabilirea relaiilor filogenetice la speciile de salmonide din Romnia i au fost construii arbori filogenetici prin metodele NJ, UPGMA, MP i ML (Figurile 34-37). Arborii rezultai prin metodele de distan au prezentat aceeai topologie indiferent de modelul de substituie ales pentru construirea matricei de distan, deci putem afirma c n cazul datelor mitocondriale combinate modelul de substituie ales nu influeneaz semnificativ relaiile filogenetice rezultate. Indiferent de metoda aleas, arborii au ilustrat relaii filogenetice similare i au prezentat o fiabilitate bun, cu valori de bootstrap >50.

Figura 34: Cladogram rezultat prin metoda NJ utiliznd datele mitocondriale reunite (ARNr 16S, ARNr 12S, ARNtPro/Thr) la speciile de salmonide din Romnia. Model de substituie K2P. Valoare de bootstrap - 1000 replicri.

91

Figura 35: Arbore filogenetic de tip radial, fr rdcin, construit prin metoda UPGMA pe baza secvenei genei mitocondriale ARNtPro/Thr la speciile de salmonide din Romnia.

Figura 36: Cladogram rezultat prin metoda MP utiliznd datele mitocondriale reunite (ARNr 16S, ARNr 12S, ARNtPro/Thr) la speciile de salmonide din Romnia.

92

Figura 37: Cladogram rezultat prin metoda ML utiliznd datele mitocondriale reunite (ARNr 16S, ARNr 12S, ARNtPro/Thr) la speciile de salmonide din Romnia. Relaiile filogenetice existente ntre speciile de salmonide din Romnia stabilite pe baza datelor mitocondriale reunite (ARNr 16S, ARNr 12S, ARNtPro/Thr) arat c: Thymallus thymallus reprezint ancestorul celorlalte specii de salmonide analizate, fiind specia cea mai primitiv i care a sta la originea formrii celorlate specii de salmonide. Speciile autohtone aparinnd genului Salmo Salmo trutta fario i Salmo trutta labrax sunt strns nrudite formeaz o clad distinct de grupul Salvelinus fontinalis/ Oncorhynchus mykiss. Salvelinus fontinalis este cea mai apropiat din punct de vedere filogenetic de Oncorhynchus mykiss, cu care formeaz un grup monofiletic, contrazicnd astfel ipoteza filogeneiei clasice c Salmo i Oncorhynchus sunt specii surori. Pentru stabilirea unor relaii filogenetice mai complexe, markerii filogenetici ARNr 16S i ARNr 12S au fost analizai pe lng speciile de salmonide din Romnia i la alte specii de salmonide, pentru acestea utiliznd secvene nucleotidice din GenBank.

93

CAPITOL V: Partea practica

1. Determinarea temperaturii optime de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient de temperatur
Pentru optimizarea reaciilor de amplificare am realizat, pentru fiecare dintre regiunile D-loop la speciile analizate, reacii de PCR n gradient de temperatur. n cazul acestui tip de reacie, ADN matri este supus concomitent unor temperaturi diferite de hibridizare a primerilor n scopul stabilirii temperaturii optime care s permit eliminarea amplificrilor parazite i realizarea cu un randament maxim a reaciei PCR. Totodat, n decursul unei astfel de reacii de optimizare, pot fi variate i intervalele de timp n care sunt parcurse treptele de temperatur, ct i numrul de cicluri de amplificare. Reactivi i aparatur: Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaz s fie analizate. Reactivi PCR:

amestec de deoxi-nucleotide 10 mM din fiecare; clorur de magneziu 25 mM; tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; primeri sens i antisens. tampon de electroforez: TAE 1X TRIS 0,040 M, Acid acetic 0,040 M, EDTA tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X; soluie de bromur de etidium 10 g/ml; marker de mas molecular 100 bp (Promega); agaroz.

- Reactivi pentru electroforez: 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X care este apoi diluat;

Tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT. Surs de curent PowerPac Basic (Bio-Rad).

- Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat). - Termociclor iCycler (BioRad).

94

- Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). - Microcentrifug MiniSpin (Eppendorf). Mod de lucru: S-a realizat determinarea temperaturii de hibridizare specifice fiecrei perechi de primeri desemnate pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop i pentru amplificarea unei regiuni mitocondriale extinse prin PCR n gradient de temperatur. - se amestec componentele de reacie (Tabel 1); vortexare i centrifugare; - se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de PCR de 0,2 l pentru fiecare prob analizat; - se adaug 5 l ADN, diluat corespunztor; vortexare i centrifugare; - tuburile se aeaz n aparatul de PCR.
Tabel 1. Componentele amestecului PCR. Component PCR Buffer 10X MgCl2 25 mM dNTP 10 mM Primer forward Primer reverse AmpliTaq Gold Polimeraza Ap PCR

Volum (l) 2,5 1,5 2 0,5 0,5 0,2 12,8

Pentru realizarea reactiei PCR n gradient de temperatur s-a programat aparatul de PCR respectnd parametri prezentai n Tabelele 2 i 3. La terminarea reaciei PCR se efectueaz o electroforez n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare. Iniial se prepar gelul de agaroz astfel: - se izoleaz tvia aparatului de electroforez cu band adeziv; - se prepar un volum de 40 ml de agaroz 2% n tampon TAE 1X; - dup dizolvarea complet a agarozei la cald se adaug 2,3 l bromur de etidium; - se monteaz pieptenul i apoi se toarn gelul n tvia de electroforez; - se las aproximativ 40 de minute la temperatura camerei pentru a se solidifica, iar gelul se introduce n tancul de electroforez. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
95

electroforeza. Migrarea se desfoar la 80V constant i la temperatura camerei, timp de 40 de minute. La finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz pe un transiluminator UV. n funcie de profilul electroforetic obinut s-a ales temperatura de hibridizare optim pentru a permite analiza genelor luate n studiu.
Tabel 2. Schema reaciei PCR n gradient de temperatur pentru amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la mai multe specii de salmonide. Specia Timpii i temperaturile de incubare O. mykiss Aparat de PCR iCycler (BioRad) Specia S. trutta Aparat de PCR Palm Cycler Specia S. fontinalis Palm Cycler Specia T. thymallu s Palm Cycler (Corbett) (Corbett) Aparat de PCR (Corbett) Aparat de PCR Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Timpii i temperaturile de incubare Etapa iniial 10 min. 95 C 1 ciclu Timpii i temperaturile de incubare Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Denaturare 30 secunde 95oC 40 Cicluri Anelare 30 secunde 51 61 oC Extindere 1 minut 72oC Extensie final 10 min. 72oC 1 ciclu 4oC
o

Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Denaturare 30 secunde 95oC

40 Cicluri Anelare 30 secunde 51 61 oC

Extensie Extindere 1 minut 72oC final 10 min. 72oC 1 ciclu 4oC

Timpii i temperaturile de incubare 40 Cicluri Denaturare 30 secunde 95oC Anelare 40 secunde 51 61 oC Extindere 90 secunde 72oC Extensie final 20 min. 72oC 1 ciclu 40 Cicluri Anelare 40 secunde 51 61 C
o

4oC

Extensie Extindere 90 secunde 72 C

o

Denaturare 30 secunde 95 C
o

final 20 min. 72 C 1 ciclu

o

4oC

Tabel 3. Schema reaciei PCR n gradient de temperatur pentru amplificarea unei regiuni mitocondriale extinse la mai multe specii de salmonide. Timpii i temperaturile de incubare Specia Etapa iniial 45 de cicluri Denaturare Anelare Extindere Extensie final Etapa final 96

Salmo trutta

Salmo trutta labrax Salvelinus fontinalis Hucho hucho

Onchorhyncus mykiss Thymallus thymallus

10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu

30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC

45 secunde 51-62oC 45 secunde 51-62oC 45 secunde 51-62oC 45 secunde 51-62oC 45 secunde 51-62oC 45 secunde 51-62oC

2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC

20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu

4oC 4oC 4oC 4oC 4oC

2.Amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la salmonide

Pentru analiza regiunii D-loop mitocondriale i stabilirea relaiilor filogenetice existente ntre speciile de salmonide din Romnia se realizeaz mai nti o reacie de amplificare prin metoda PCR a ADN extras anterior. Dup amplificare fragmentele obinute sunt supuse unei elecroforeze n gel de agaroz 2%. Estimarea mrimii fragmentelor amplificate se face prin migrarea concomitent a unui marker de mas molecular. Reactivi i aparatur: Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaz s fie analizate. Reactivi PCR:

o amestec de deoxi-nucleotide, 10 mM din fiecare; o clorur de magneziu 25 mM; o tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; o ADN polimeraz AmpliTaq Gold; o ap ultrapur;
o

primeri sens i antisens; - Reactivi pentru electroforez:

97

o tampon de electroforez: TAE 1X TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X care este apoi diluat; o tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X;
o

soluie de bromur de etidium 0,5 g/ml;

o marker de mas molecular DNA Ladder 100 bp (Promega); o agaroz. - Tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT i surs de curent PowerPac Basic (Bio-Rad). - Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat). - Plit cu nclzire i agitare magnetic MR 3001 (Heidolph). - Formamid deionizat. - Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). - Analizator genetic automat ABI Prism 3130 (Applied Biosystems). - Microcentrifug MiniSpin (Eppendorf). - Agitator REAX Top (Heidolph). - Termobloc TDB 120 (Biosan). Mod de lucru Pentru fiecare exemplar analizat reacia PCR a fost realizat n modul urmtor:
-

se adaug reactivii prezentai n Tabelul 4 pentru a obine amestecul de reacie; vortexare i centrifugare; se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de PCR; se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor de la fiecare exemplar; vortexare i centrifugare; tuburile se aeaz n aparatul de PCR. se programeaz aparatul de PCR la parametrii indicai n Tabelul 5. amplificare PCR; produii obinui sunt pstrai la 2 - 6C pn la analiz.

Pentru realizarea reaciei PCR: -

Produii obinui sunt supui unei electroforeze orizontale, n gel de agaroz 2%, n sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea gelului se va face n lumin UV.
Tabel 4. Componentele i volumele amestecului de PCR. 98

Componente Tampon PCR Clorur de magneziu Amestec de nucleotide ADN polimeraz AmpliTaq Gold Primer F Primer R Ap ultrapur Volum total 2,5 1,5 2 0,2 0,5

Volum (l)

0,5 12,8 20

Tabel 5. Schema reaciei PCR pentru amplificarea regiunii D-Loop la salmonide. Specia Aparat de Timpii i temperaturile de incubare PCR O. mykiss Etapa 40 Cicluri Extensie iniial Denaturare final Anelare Extindere GeneAmp PCR System 9700 Specia S. trutta Aparat de PCR GeneAmp PCR System 9700 Specia S. fontinalis Aparat de PCR GeneAmp PCR System 9700 Specia T. thymallus Aparat de PCR GeneAmp PCR System 9700 10 min. 95oC 1 ciclu Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu 30 secunde 95oC 30 secunde 58oC 1 minut 72oC 10 min. 72oC 1 ciclu Extensie final 4oC 4oC

Timpii i temperaturile de incubare Denaturare 30 secunde 95oC 40 Cicluri Anelare 40 secunde 57oC Extindere 1 minut i 20 min. 30 secunde 72oC 72oC 1 ciclu

Timpii i temperaturile de incubare Denaturare 30 secunde 95oC 40 Cicluri Anelare 40 secunde 56oC Extindere 1 minut i 30 secunde 72oC Extensie final 20 min. 72oC 1 ciclu Extensie final 10 min. 72oC 1 ciclu 4oC

4oC

Timpii i temperaturile de incubare Denaturare 30 secunde 95oC 40 Cicluri Anelare 30 secunde 58oC Extindere 1 minut 72oC

3.Tehnica PCR-RFLP

99

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la exemplare de salmonide provenind din specii diferite. Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l; v) ap ultrapur; vi) primer sens, 20 M i primer antisens, 20 M; vii) aparat PCR; viii) minicentrifug; ix) agitator. Reactivi pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie: 60 mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH 7,5; ii) albumin seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie Hinf I 10 U/l; iv) minicentrifug; v) agitator; vi) termobloc. Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez TAE 1X TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepar ca soluie 10X i este diluat nainte de folosire; ii) tamponul probei care conine albastru de bromfenol 0,3% i glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas molecular; v) agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii) surs de curent; viii) transiluminator UV; ix) plit cu nclzire i agitare magnetic. Mod de lucru Amplificarea prin PCR 1. Reactivii prezentai n tabelul 6 se adaug ntr-un tub de minicentrifug pentru a obine amestecul de reacie. Se agit i se centrifugheaz uor. 2. Se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de centrifug de 200 l pentru fiecare exemplar testat. 3. Se adaug 5 l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor (circa 50 ng/reacie). Se agit i se centrifugheaz uor. 4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR i acesta este setat n conformitate cu programul prezentat n tabelul 7.
Tabel 6. Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR. Componente Tampon PCR 10X MgCl2 dNTP ADN polimeraz Primer sens Volum (l) 2,5 1,5 2 0,1 0,2 100

Primer antisens Ap ultrapur Volum total Tabel 7. Etapele reaciei PCR.

0,2 13,5 20

Timpii i temperaturile de incubare Specia Salmo trutta Etapa iniial 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 10 min. 95oC 1 ciclu 45 de cicluri Denaturare 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC 30 secunde 95oC Anelare 45 secunde 56oC 45 secunde 56oC 45 secunde 53oC 45 secunde 56oC 45 secunde 56oC 45 secunde 58oC Extindere 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC 2 minute 72oC Extensie final 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu 20 minute 72oC 1 ciclu Etapa final 4oC 4oC 4oC 4oC 4oC 4oC

Salmo trutta labrax Salvelinus fontinalis Hucho hucho

Onchorhyncus mykiss Thymallus thymallus

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz pentru vizualizarea produilor de amplificare. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul la sursa de curent i se pornete electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei, timp de 4050 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV. Reacia de restricie 1. Se adaug reactivii prezentai n Tabelul 8 ntr-un tub de minicentrifug pentru a obine amestecul de restricie. Se agit i se centrifugheaz. 2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore.
101

Tabel 8. Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie. Componente Volum (l) Tampon de restricie 10X BSA acetilat Produs PCR Hinf I Ap ultrapur Volum total 2 0,5 15 1,5 1 20

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de restricie Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de agaroz pentru vizualizarea produilor. Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul la sursa de curent i se pornete electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei, timp de 4060 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor. La finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.

4. Rezultate i discu ii a)Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop
Iniial s-a determinat temperatura de hibridizare optim pentru fiecare set de primeri prin PCR n gradient de temperatur. Ampliconii au fost verificai prin electroforez n gel de agaroz 2%, obinndu-se profile electroforetice din Figurile 1-4. n final a fost optimizat protocolul de amplificare pentru regiunea mitocondrial Dloop la speciile de salmonide analizate i au fost alese temperaturile optime pentru hibridizarea primerilor.

102

Figura 1. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial D-loop la Thymallus thymallus. M Marker de mas molecular 100 bp; 1-6 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 59,1C; 2 58,3C; 3 55,9C; 4 55,1C; 5 - 54,4C; 6 - 53,6 C.

Figura 2. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial D-loop la Salmo trutta fario. M Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 60C; 2 59,1C; 3 58,3C; 4 57,4C; 5- 56,6C.

Figura 3. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial D-loop la Salvelinus fontinalis. M Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 55,9C; 2 55,1C; 3 54,4C; 4 52,7C; 5- 51,9C.

103

Figura 4. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial D-loop la Oncorhynchus mykiss. M Marker de mas molecular 100 bp; 1-5 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 52,7C; 3 55,1C; 4 57,4C; 5- 59,1C.

b)Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea unei regiuni extinse din genomul mitocondrial n vederea realizrii tehnicii PCR-RFLP
A fost optimizat protocolul de amplificare pentru regiunea mitocondrial extins la speciile de salmonide analizate i au fost alese temperaturile optime pentru hibridizarea primerilor.

Figura 5. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Oncorhynchus mykiss. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

104

Figura 6. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Thymallus thymallus. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

Figura 7. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Hucho hucho. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

Figura 8. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Salmo trutta labrax. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

105

Figura 9. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Salvelinus fontinalis. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

Figura 10. Electroforez n gel de agaroz 2% pentru evidenierea produilor reaciei PCR n gradient de temperatur pentru regiunea mitocondrial extins la Salmo trutta. M Marker de mas molecular 1 Kb; 1-7 Fragmente obinute la urmtoarele temperaturi de hibridizare: 1 51C; 2 51,9C; 3 53,3C; 4 55,2C; 5 58,1C; 6 60,1C; 7 61,4C.

c) Analiza produilor de restricie ai regiunii mitocondriale extinse de la salmonide

Scopul nostru a fost implementarea unei metode simple i eficiente care s fie utilizat pentru a detecta cu precizie exemplarele aparinnd diferitelor specii de salmonide din Romnia. Identificarea s-a realizat prin amplificarea cu ajutorul tehnicii PCR a unei regiuni mitocondriale extinse (care cuprinde regiunea D-loop, dar i gena codificatoare pentru citocrom b i ARNt) cu primeri specifici, urmat de digestia ampliconilor cu enzima de restricie Hinf I (Figurile 11-12).

106

Figura 11 . Electroforez n gel de agaroz 2,5% pentru evidenierea produilor reaciei de restricie cu Hinf I pentru regiunea mitocondrial extins la 3 specii de salmonide. M Marker de mas molecular 100 pb; 1, 2 Salvelinus fontinalis, 3, 4 Hucho hucho, 5, 6 Thymallus thymallus.

Figura 12. Electroforez n gel de agaroz 2,5% pentru evidenierea produilor reaciei de restricie cu Hinf I pentru regiunea mitocondrial extins la 3 specii de salmonide. M Marker de mas molecular 100 pb; 1, 2 Salmo trutta labrax, 3, 4 Salmo trutta, 5, 6 Onchorhyncus mykiss.

n urma analizei Figurilor 11 i 12 se observ c scindarea ampliconilor cu endonucleaza de restricie Hinf I, urmat de analiza produilor rezultai n gel de agaroz poate identifica diferenele dintre diferitele specii de salmonide. Tehnica pus astfel la punct poate fi utilizat cu succes n identificarea molecular a diferitelor specii de salmonide i poate fi testat i pentru analize moleculare ale hibrizilor dintre diferite specii. Detectarea acestor hibrizi n mediul natural ar reprezenta o realizare major n susinerea eforturilor de conservare a fondului salmonicol.

107

CONCLUZII
Prin extragerea AND mt i amplificarea genelor ce codific pentru ARN ribozomal 16 S,12 S i ARN de transfer s-au putut secven ia,iar in urma alinieri secven elor proprii cu secvee similare din GenBank s-au observat diferenele in succesiunea de nucleotide.Secvenele s-au aliniat cu ajutorul programului ClustalX iar cu ajutorul metodelor de distan(fenetice) NJ i UPMGA i a metodelor de caractere(cladistice) MP i ML s-au realizat construirea arborilor filogenetici. Optimizarea protocolului PCR pentru regiunea D-Loop a fost realizat tot in vederea secvenieri i alcatuirea unor arbori filogenetici. Cu ajutorul tehnici PCR-RFLP prin amplificarea unei regiuni mitocondriale extinse(tRNA Glu_cyt b_tRNA Thr_D-Loop_tRNA Phe) i scindarea ampliconilor cu endonucleaze de restricie i analiza fragmentelor rezultate n gel de agaroz se poate identifica diferenele dintre specii rezultate n urma unor mutai la nivelul situsurilor de restricie.Pe baza profilelor de restriie se creaz o amprent specific unei anumite specii. n urma experimentelor realizate pe baza ADN mitocondrial s-au putut evidenia relaile de filogenie dintre cele 6 speci de salmonide prezente pe teritoriul Romaniei.

BIBLIOGRAFIE
Anderson S, Bankier A.T, Barrell B.G, De Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J, Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F, Schreier P.H., Smith AJ, Staden R., Young IR (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457-465. Antipa, G. 1909. Fauna Ichtiologic a Romniei. Inst. Arte Grafice Carol Gbl, Bucureti: 200-209. Apostolidis A. P., Loukovitis D., Tsigenopoulos C. S. (2007) Genetic characterization of brown trout ( Salmo trutta ) populations from the Southern Balkans using mtDNA sequencing and RFLP analysis. Hydrobiologia, Springer. Bnrescu, P. (1964) Fauna Republicii Populare Romne. Piscies-Osteichthyes (Peti ganoizi i osoi) Volumul XIII. Ed. Academiei R.P.R., Bucureti: 263-264.
108

Bernatchez, L. & Danzmann, R.G. (1993). Congruence in control-region sequence and restriction site variation in mitochondrial DNA of brook charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution 10, 1002-1014. Bernatchez, L. & Osinov, A. (1995). Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most eastern native range based on mitochondrial DNA and nuclear gene variation. Molecular Ecology 4, 285-297. Blanco C. 1995. La trucha cra industrial. Editorial Mundi prensa, Espana, 1503 Brown, G., Gadaleta, G., Pepe, G., Saccone, C., Sbisa, E. 1986. Structural conservation and variation in the D-loop containing region of vertebrate mitochondrial DNA. J. Mol. Biol. 192:503-511; Brown, W. M., George M., Wilson A.C., 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA, Proc. Natl. Acad. Sci., 76/4, 1967-1971. Cruu, S. 1962. Tratat de Ichtiologie. Ed. Academiei Republicii Populare Romne: 385-391. Clayton D.A. (1984) Transcription of the mammalian mitochondrial genome. Ann Rev Bioch 53:573-594. Clayton, D. A. (1982). Replication of animal DNA. Cell 28: 693-705. Crespi, B.J., Fulton M.J. 2004. Molecular systematics of Salmonidae: combined nuclear data yields a robust phylogeny, Mol. Phylogenet. Evol., 31 (2004) 658679; Doiron S., Blier P.U., Bernatchez L. (1999) - NCBI Access N AF154851. Doiron S., Blier P.U., Bernatchez L. (2002) - NCBI Access N NC000860. Domanico, M. J., Phillips, R. B., Oakley, T. H. (1997). Phylogenetic analysis of the Pacific salmon (genus Oncorhynchus) using nuclear and mitochondrial DNA sequences. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 54: 18651872. Dorofeyeva, E. A. 1989. The basic principles of classification and phylogeny of the salmonid fishes (Salmoniformes: Salmonoidei: Salmonidae). In Biology and Phylogeny of Fishes (V. M. Korovinoi, Ed.), pp. 516. USSR Academy of Sciences, Proceedings of the Zoological Institute 201, St. Petersburg; Ginatulina, L.K., Shedko, S.V., Miroshnichenko, I.L., and Ginatulin, A.A., Divergence of Mitochondrial DNA Sequences in Pacific Salmonids, Zh. Evolyuts. Biokhim.Fiziol., 1988, vol. 24, no. 4, pp. 477482;

109

Ginatulina, L.K., Shedko, S.V., Miroshnichenko, I.L., and Ginatulin, A.A., Divergence of Mitochondrial DNA Sequences in Pacific Salmonids, Zh. Evolyuts. Biokhim.Fiziol., 1988, vol. 24, no. 4, pp. 477482. Grewe, P.M., Billington, N., and Hebert, P.D.N., Phylogenetic Relationships among Members of Salvelinus Inferred from Mitochondrial DNA Divergence, Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1990, vol. 47, pp. 984991; Gyllensten, U. and Wilson, A.C., Mitochondrial DNA of Salmonids: Inter-and Intraspecific Variability Detected with Restriction Enzymes, in Population Genetics and Fishery Management, Seattle: Univ. Wash. Press, 1987, pp. 301318; Hurst C.D., Bartlett S.E., Davidson W.S., Bruce I.J., (1999) - The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA of the Atlantic salmon, Salmo salar. Gene 239: 237-242. Kendall, A.W.,Jr., Behnke, R.J. 1984. Salmonidae: Development and relationships. In Ontogeny and Systematics of Fishes (H. G.Moser, Ed.), pp. 142149. Am. Soc. of Icthyol. Herpetol. Spec.Publ. 1. Kitano, T., Matsuoka, N., and Saitou, N., Phylogenetic Relationship of the Genus Oncorhynchus Species Inferred from Nuclear and Mitochondrial Markers, Genes Genet. Syst. 1997, vol. 72, pp. 2534; Kottelat, M., Freyhof J. 2007. Handbook of European freshwater fishes. Kottelat, Cornol, Switzerland, Freyhof, Berlin, Germany: 429-430. Kumazawa, Y., Ota, H., Nishida, M., Ozawa, T., 1996. Gene rearrangements in snake mitochondrial genomes: highly concerted evolution of control-region-like sequences duplicated and inserted into a tRNA gene cluster. Mol. Biol. Evol. 13, 12421254. Meyer, A. and A.C. Wilson. 1990. Origin of tetrapods inferred from their mitochondrial DNA affiliation to lungfish. J. Mol. Evol. 31: 359-364; Meyer, A., Dolven, S.I., 1992. Molecules, fossils, and the origin of tetrapods. J. Mol. Evol. 35 (2), 102113, Review; Miya M., Nishida M. (2000) - Use of Mitogenomic Information in Teleostean Molecular Phylogenetics: A Tree-Based Exploration under the Maximum- Parsimony Optimality Criterion. Mol Phylogenet Evol 17: 437-455 McKay, S. J., Devlin, R. H., Smith, M. J. (1996). Phylogeny of Pacific salmon and trout based on growth hormone type-2 (GH2) and mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 3 (ND3) DNA sequences. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 53: 11651176.
110

Neave F. 1958. The origin and speciation of Oncorhynchus. Trans R. Soc. Can. 551:2539. Norden, A. 1961. Comparative osteology of representative salmonid fishes, with particular reference to the grayling (Thymallus arcticus) and its phylogeny. J. Fish. Res. Board Can. 8: 679791. Oakley T. H., Phillips R.B. Phylogeny of Salmonine Fishes Based on Growth Hormone Introns: Atlantic (Salmo) and Pacific (Oncorhynchus) Salmon Are Not Sister Taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution Vol. 11, No. 3, April, pp. 381393, 1999. Ohara, I., Sawano, K., and Okazaki, T., Mitochondrial DNA Sequence Analysis of the Masu SalmonPhylogeny in the Genus Oncorhynchus, Mol. Phylogenet. Evol., 1997, vol. 7, pp. 7178. Oel V. 2007. Atlasul pestilor din Rezervaia Biosferei Delta Dunrii. Centrul de Informare Tehnologic Delta Dunrii, Tulcea: 145 147. Oel, V. 2000. Lista Roie a speciilor de plante i animale din Rezervaia Biosferei Delta Dunrii Romnia. Fundaia Aves: 84. Phillips RB, Oakley TH (1997)- Phylogenetic relationships among the Salmonidae based on nuclear DNA and mitochondrial DNA sequences. In: KOCHER T, STEPIEN C. Molecular Systematics of Fishes. San Diego: Academic Press. pp:145-162. Phillips, R.B., Sajdak, S.L., and Domanico, M.J., Relationships among Chars Based on DNA Sequences, Nordic J. Fresh. Res., 1995, vol. 71, pp. 378391. Popescu-Gorj, A., Dumitriu, M. 1956. Somonul Mrii Negre (Salmo trutta labrax Pall) migrator n Dunre i blile inundabile.Bul. Inst. Cerc. Pisc., 15, 4, 31-37. Radu, Ghe., Radu, E. 2008a. Atlas al principalelor specii de peti din Marea Neagr. Editura Virom, Constana: 50-51. Radu, Ghe., Radu, E. 2008b. Determinator al principalelor specii de peti din Marea Neagr. Editura Virom, Constana: 85-86. Saccone, C., Attimonelli, M., and Sbisa, E. (1987). Structural elements highly preserved during the evolution of the D-loop containing region in vertebrate mitochondrial DNA. J. Mol. Evol. 26: 205-211; Shadel GS, Clayton DA (1997) - Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Ann Rev Biochem 66: 409-435

111

Shedlock, A.M., Parker, J.D., Crispin, D.A., Evolution of the Salmonid Mitochondrial Control Region, Mol. Phylogenet. Evol., 1992, vol. 1, pp. 179192. Stearley, R.F. 1992. Historical ecology of Salmoninae, with specia reference to Oncorhynchus. In Systematics, Historical Ecology, and North American Freshwater Fishes (R. L. Mayden, Ed.), Stanford Univ. Press, Stanford, CA. Svetovidov, A.N. 1964. Petii din Marea Neagr (rus). Izdatelstvo Naulea, Moskva i Leningrad: 143-146. Thomas, W.K., Beckenbach, A.T. 1989. Variation in Salmonid Mitochondrial DNA: Evolutionary Constrains and Mechanisms of Substitution, J. Mol. Evol., vol. 29, p. 233245; Thomas, W.K., Withler, R.E., and Beckenbach, A.T., Mitochondrial DNA Analysis of Pacific Salmonid Evolution, Can. J. Zool., 1986, vol. 64, pp. 10581064; Utter F., Allendorf F. 1994. Phylogenetic relationships among species of Oncorhynchus: a consensus view. Conserv Biol, 8:864867; Vlaic, A., 1997, Inginerie genetic. Realizri, sperane i neliniti. Ed. Promedia Plus, Cluj-Napoca; Wolstenholme D.R. (1992) Animal mitochondrial DNA: structure and evolution. Int Rev Cytol 141:173-216. Zardoya R., Garrido-Pertierra A., Bautista J.M. (1995) - The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA genome of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. J Mol Evol 41: 942-951.

112