METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC) HPLC este cea mai extins metod cromatografic utilizat pentru

analiza analiilor compui biologic activi, fiecare clas a acestora fiind testat separat. Spre deosebire de tehnica LC-MS, nu ofer o certitudine 100% cu privire la identificarea analiilor. Principiul cromatografiei lichide Spre deosebire de cromatografia de gaze n care faza mobil joac doar rolul de cru n transportul componenilor prin coloan, n cazul cromatografiei de lichide, faza mobil particip alturi de faza staionar la procesul de separare prin interaciuni selective mult mai complexe (Gocan, 2002). Cromatografia lichid se subclasific dup tipul suportului, n cromatografie cu faz normal (NP-HPLC) i invers (RP-HPLC). Sistemele NP-HPLC utilizeaz o faz staionar polar (silicagel, alumin, celuloz, Ca(OH)2, MgCO3 ), o faz mobil nepolar (eter de petrol, hexan puri sau n amestec cu aceton 1-15%), separarea avnd la baz adsorbia diferit a componentelor amestecului pe faza staionar. Se adreseaz probelor preponderent nepolare, ordinea de eluie (caracterizat de timpul de retenie, tR, al probei pe coloan, exprimat n minute) a componentelor amestecului fiind : tR componente nepolare < tR componente polare n sistemele RP-HPLC, faza staionar devine nepolar prin legare chimic de octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca faz mobil se folosesc amestecuri de solveni polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, ap), iar procesul de separare are la baz repartiia componentelor amestecului ntre faza staionar i eluent. Este indicat n cazul probelor preponderent polare, ordinea de eluie fiind: tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997). n prezent, peste 60% din totalul separrilor se realizeaz prin cromatografia cu faz invers. Popularitatea acestei tehnici rezid n faptul c prezint o universalitate n separarea unor compui nepolari, polari i ionici, incluznd un larg domeniu de mase moleculare i faptul c optimizarea separrilor se realizeaz relativ uor (Gocan, 2002).

Dup mecanismul de separare, cromatografia poate fi: de absorbie, de repartiie lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune steric (gel-cromatografia) sau de afinitate (interaciuni hidrofobe, separri chirale). Principalele tipuri de tehnici cromatografice, n funcie de mecanism, faz staionar i mobil sunt redate n tabelul 1. Tabel 1 Principalele tipuri de tehnici cromatografice
Mecanism 1. Adsorbie* (CA) 2.Repartiie LL (CR) 3.Schimb ionic (CSI) 4. Excluziune steric *** 5.Afinitate** i Cromatografia gazoas Interaciuni hidrofobe 1. Adsorbie 2. Repartiie
*** **

Faza staionar S1, NP-HPLC Si-C8,Si-C18,RPHPLC Schimbtori de ioni2 Geluri3(CES) Geluri i

Faza mobil Solveni preponderent nepolari Solveni preponderent polari Soluii acizi-baze Soluii tampon4 Soluii tampon4

Cromatografia de lichide

Hidroxilapatit Oel sau rini (GSC) Ar, He, N2 + H2 Uleiuri(GLC) Ar, He, N2 + H2

* Efectuat pe hrtie (CH), strat subire (CSS), coloan deschis (CC) i coloan nchis (HPLC) ** Efectuat pe strat subire (CSS) sau pe coloan deschis (CC) i nchis de oel (HPLC) *** Efectuat pe coloan deschis sau nchis de sticl la presiuni joase (LPLC- Low pressure liquid chromatography)
1 2 3

Vezi faze staionare rini schimbtoare de ioni de tip Amberlit, Doriex geluri de tip Sephadex (G50, G100, G200), Sephacryl, cu pori controlai

Sursa: Socaciu, 1997 Prile componente ale unui cromatograf de lichide de nalt performan sunt: pompele ataate la un rezervor de unde preiau eluentul (faza mobil), un injector manual sau un autosampler, cuptorul termostatat n interiorul cruia se afl coloana cromatografic de separare, degazorul, controller-ul, detectorul i instrumentul de nregistrare a semnalului furnizat de detector (fig.1).

Fig. 1. Schema general a unui HPLC

Coloana cromatografic este componenta cea mai important a cromatografului, deoarece aici este sediul procesului de separare. Eluentul, mpreun cu substana lichid de analizat este pompat n coloana ce conine faza staionar. Are loc migrarea, cu viteze diferite, a componenilor amestecului de separat de-a lungul coloanei. La ieirea din coloan, detectorul preia continuu fluxul de solvent coninnd componentele separate i transform semnalul chimic n semnal electric, nregistrat sub forma unei cromatograme (fig. 2). Aria corespunztoare unui semnal cromatografic este proporional cu concentraia substanei pe care acesta o determin i aceast arie se poate msura cu un integrator, sau cu un computer. Maximele nregistrate deasupra liniei de baz n cromatogram poart numele de picuri i au forma distribuiei normale Gauss (Socaciu, 1997).

Absorbanta/Absorbance (mAU)

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0 10 15 20 25 30

Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 2. Cromatograma unui amestec de compui analizai prin tehnica HPLC

n cazul unor amestecuri complexe, att ca numr de componeni, ct mai ales ca proprieti diferite ale acestora, separarea n condiii izocratice, care implic o singur faz mobil, este imposibil. n aceste situaii se apeleaz la eluia cu gradient, n care se modific faza mobil n timp, dup un anumit program. Acest lucru se realizeaz prin amestecarea a doi, trei sau chiar patru solveni, pentru a obine un gradient de un anumit profil (Gocan, 2002). Tehnici de extracie

Tehnica HPLC presupune o etap de prelucrare a probei n care se realizeaz extracia i curarea matricei, urmat de analiza propriu-zis, n care analitii vor fi separai i cuantificai. Pentru extracia analiilor de interes din matrice se folosesc tehnicile LLE (extracie lichid-lichid), SPE (extracie n faz solid) sau SFE (extracie cu fluide supercritice).

Primele dou sunt cel mai frecvent folosite. ntruct SFE necesit echipament specializat, nu i-a gsit aplicaii foarte largi. O importan deosebit prezint alegerea solventului utilizat n extracia analitului. n acest sens, se va ine seama de proprietile termodinamice ale solventului i solvatului: polaritate, interaciuni dipol-dipol, caliti donoare sau acceptoare de H+, precum i de observaiile analistului din practica experimental. Alternana pH-ului are un efect dramatic asupra solubilitii compuilor ionizabili. Se tie c compuii ionizai sunt mult mai solubili in solveni polari (n special soluii apoase) dect compuii neionizai (Fedeniuk i Shand, 1998). Metodologia LLE const n amestecarea a dou faze nemiscibile (de obicei una organic i una apoas), n urma creia analitul de interes este separat de ceilali componeni ai matricei din prima faz i extras n cea de-a doua faz lichid. Procedeul se repet de regul de 2-3 ori, pentru a asigura o extracie complet. Comparativ cu LLE, extracia n faz solid SPE are unele avantaje: este mai rapid, mai reproductibil, se obin extracte mai curate i necesit cantiti de solveni mai reduse. Utilizarea cartuelor SPE implic patru pai: condiionarea umpluturii cartuului; aplicarea probei prin care analiii de interes vor fi reinui selectiv pe cartu, n timp ce restul compuilor vor fi ndeprtai; splarea cartuului cu solveni care s ndeprteze compuii nedorii adsorbii la ncrcarea probei; eluarea compuilor reinui pe cartu, utiliznd un solvent care va distruge interaciunile analit-pat adsorbant. Exist patru mecanisme generale de extracie ntlnite n tehnica SPE: - nepolar - gruprile funcionale utilizate sunt C18, C8, C2, fenil, ciclohexil i copolimerul stiren-divinilbenzen - polar - gruprile funcionale utilizate sunt: cianopropil, diol i aminopropil - schimbtor de ioni - coloanele schimbtoare de ioni se mpart n coloane schimbtoare de anioni i cationi. Gruprile schimbtoare de cationi pot fi puternic schimbtoare (derivaii acidului sulfonic) sau slab schimbtoare (derivaii acidului carboxilic). Gruprile schimbtoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbtoare (aminele cuaternare) sau slab schimbtoare (aminele primare, secundare i teriare).

-covalent - interaciunile de tip covalent depind de structura chimic a analitului. Un exemplu ar fi utilizarea derivailor boratului pentru extracia compuilor cu dou grupri vecine hidroxil. Cartuele SPE cu o singur grupare funcional prezint dezavantajul c nu pot fi folosite pentru analiza multirezidual, structura chimic a analiilor fiind diferit. Utilizarea mai multor cartue SPE cu structuri ale umpluturii diferite a fost aplicat cu succes n pregtirea probei, dar timpul de analiz a fost mult mai mare. De aceea, s-a ncercat folosirea unor cartue SPE cu amestec de faze, care combinau gruprile nepolare cu cele schimbtoare de ioni (Oka i col., 1987). Acestea, prezentau avantajul utilizrii unui singur cartu pentru mai muli analii cu proprieti chimice diferite. Dar, datorit faptului c extraciile nu erau reproductibile, particulele umpluturii nefiind distribuite omogen, s-a revenit la cartuele SPE cu o singur faz. S-a ncercat deasemenea crearea unui tip de cartu SPE care utiliza carbonul grafitic poros (PGC). n acest caz, particulele PGC se caracterizau printr-o distribuie omogen, dar capacitatea lor de adsorbie era mai redus. Dei erau multifuncionale, avnd capacitatea de a reine att analii polari ct i nepolari, principala problem era aceea c adsorbia compuilor era foarte puternic, n unele cazuri ireversibil. Principiul extraciei SPE se bazeaz pe teoria cromatografiei. Alegerea variantei de extracie a analiilor se va face innd cont de natura i particularitile matricei.

Detectori utilizai n cromatografa lichid

Pentru cromatografia de lichide au fost create dou tipuri de detectori care sunt astzi folosii n mod curent:

Detectorii bazai pe proprietatea componentului sunt sensibili la unele

proprieti chimice ori fizice. Din aceast categorie fac parte detectorii spectrofotometrici de absorbie UV-Vis, de fluorescen, electrochimici i spectrometrul de mas. Se pot atinge sensibiliti remarcabile, selectivitate bun i permit eluia cu gradient.

Detectorii bazai pe proprietatea de volum funcioneaz prin msurarea unor

proprieti fizice ale componentului n efluent n comparaie cu eluentul. Astfel de detectori se bazeaz pe msurarea indicelui de refracie, a constantei dielectrice i a conductivitii. Sunt foarte sensibili la variaii de temperatur i nu sunt recomandai pentru eluia cu gradient (Gocan, 2002). Exist posibilitatea creterii selectivitii i sensibilitii deteciei prin tehnicile de derivatizare pre- i post-coloan. Detectorii sunt selectivi, ei nu rspund la toate moleculele existente ntr-un amestec, ci numai la anumite molecule sau clase de compui. n cromatografia lichid nu exist un detector universal i de nalt sensibilitate, aa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacr (FID) din cadrul cromatografiei gazoase, n schimb detectorii din cromatografia lichid acoper un numr mult mai mare de substane. Caracteristicile detectorului cromatografic ideal: rspuns independent de compoziia fazei mobile, debit, temperatur sensibilitate mare selectivitate rspuns rapid zgomot de fond sczut non-destructiv pentru prob domeniu dinamic liniar mare

 stabilitate ntr-un timp ndelungat de operare Detectorii ce au la baz absorbia n ultraviolet (UV)-vizibil (Vis) sunt cei mai populari detectori utilizai n cromatografia de lichide i sunt practic insensibili la variaii de debit i temperatur. Pentru a se utiliza un asemenea detector, este necesar ca componentele de analizat s manifeste absorbane suficient de mari n domeniul spectral la care funcioneaz detectorul, iar eluentul s fie transparent n domeniul spectral respectiv (Gocan, 2002). Exista mai multe tipuri de detectori UV-Vis i-anume: detectori cu o singur lungime de und, care folosesc ca surs de lumin UV o lamp de mercur la presiune joas, avnd o energie nalt de emisie la 254nm. Prezint un zgomot de fond redus, dar componentul trebuie s aib o absorban acceptabil la aceast lungime de und.

spectrometre cu lungime de und variabil, care au surs spectral continu de nalt energie stabil reprezentat de lampa cu deuteriu (190-400nm). Pentru domeniul vizibil (350-800nm) s-a introdus lampa de tungsten. Prezint avantajele: poate fi aleas lungimea de und optim (adic corespunztoare absorbanei maxime), poate fi aleas absorbana cea mai bun n raport cu eluentul sau cu compuii care interfer, putnd fi selectat continuu, din ntreg domeniul UV. Acest tip de detector poate fi utilizat i ca un spectrofotometru pentru nregistrarea spectrului unui anumit component ce urmeaz a fi identificat prin compararea acestui spectru cu cel din biblioteca de date.

detectori cu serie de fotodiode, care prezint facilitatea c ntreg domeniul spectral este nregistrat continuu, la intervale de timp de microsecunde, iar datele stocate pot fi folosite n diferite moduri i la date ulterioare, fr a fi necesar repetarea separrii. Exist situaii n care amestecul de separat este complicat i timpul de retenie nu este suficient pentru a caracteriza fiecare component. Unele substane organice au timpi de retenie identici, fapt ce conduce la erori de interpretare datorit suprapunerii semnalelor. Astfel, este universal recunoscut c cea mai bun metod de identificare i caracterizare a fiecrui component separat prin cromatografie const n nregistrarea spectrului su de mas. Spectrometrul de mas (MS) este detectorul care permite identificarea prin compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare cu spectrele etalon din biblioteca de spectre.

Spectrometrul de mas se bazeaz pe principiul c ionii de diferite greuti (indiferent de modul lor de formare) dup accelerarea ntr-un cmp electric, supui aciunii unui cmp magnetic perpendicular pe direcia lor de deplasare, vor fi deviai mai mult sau mai puin n funcie de masa i sarcina lor (Oprean, 1974). n figura 3 este redat schema de principiu a unui spectrometru de mas.

Fig. 3. Schema de principiu a unui spectrometru de mas

Spectrometrele de mas sunt alctuite din trei componente de baz: sursa de ioni sau camera de ionizare analizatorul de ioni detectorul sau colectorul de ioni, la care se adaug sistemul de introducere a probei i nregistratorul. Sursa de ioni constituie partea cea mai important a unui spectrometru de mas, fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre n ioni pozitivi (alturi de alte particule negative sau neutre). Analizatorul de ioni separ ionii provenii din camera de ionizare n funcie de raportul dintre masa i sarcina acestora (m/z). Ionii cu aceeai valoare m/z formeaz n colector un curent slab care este trimis spre amplificator i apoi nregistrat (Oprean, 1974).

METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MAS (LC-MS)

LC-MS este o tehnic cu multe aplicaii datorit sensitivitii i specificitii sale foarte ridicate, avnd utilizri att calitative ct i cantitative: identificarea compuilor necunoscui, determinarea compoziiei izotopice moleculare, determinarea structurii n funcie de fragmentare i cuantificarea compuilor din diferite probe (http://en.wikipedia.org/wiki/Shimadzu_Scientific). Pe parcursul anilor, sistemele LC-MS au suferit transformri semnificative, pornind de la analize simple ca un nlocuitor al tradiionalului UV i ajungnd la analize calitative i cantitative foarte exacte. Aceste sisteme i-au gsit largi aplicaii n analiza alimentar, farmaceutic, a mediului i n criminalistic. Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de mas s-a obinut un instrument de analiz performant capabil s separe, s identifice i s cuantifice componenii din cele mai complexe probe. Pentru utilizarea spectrometrului de mas ca detector n cromatografia de lichide, problema principal este realizarea unei interfee eficiente care s soluioneze dou incompatibiliti majore: - faza mobil este un lichid, adesea coninnd proporii semnificative de ap, care este pompat prin coloan cu un debit de ordinul ml/min, n timp ce spectrometrul de masa opereaz sub un vid de 10-6 torr. Astfel, este imposibil trecerea direct a eluentului din coloana HPLC n sursa spectrometrului i rolul interfeei este de a ndeprta faza mobil. Interfaa asigur trecerea analiilor din soluie n stare de vapori. - majoritatea analiilor separai prin HPLC sunt nevolatili i/sau nestabili termic i prin urmare nu pot fi supui ionizrii electronice sau chimice. A fost necesar dezvoltarea unor metode alternative de ionizare (Ardrey, 2003). Principalele interfee utilizate n cuplarea unui LC cu un MS sunt: cu introducerea direct a efluentului curgere continu cu bombardament atomic rapid

 cu band transportoare cu pulverizare la temperatur (thermospray) cu electropulverizare (electrospray) cu pulverizarea efluentului ntr-un curent de gaz la cald combinat cu o ionizare chimic la presiunea atmosferic (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea atmosferic (APPI) (Gocan, 2002). Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de mas

Dup extracie i purificare, proba de analizat este preluat din dispozitivul de introducere a probei de ctre faza mobil i introdus n coloana cromatografic ce conine faza staionar. Aici are loc separarea componenilor care, datorit distribuiei difereniate ntre cele dou faze, vor migra cu viteze diferite de-a lungul coloanei. Pe msur ce componenii amestecului sunt eluai din coloan, ei sunt trecui n spectrometrul de mas. Alegerea fazei mobile are o mare importan n obinerea unor bune separri. Tampoanele sunt folosite n cromatografia lichid pentru a controla gradul de ionizare al analitului i implicit simetria semnalului i reproductibilitatea reteniei. Cele mai des utilizate sunt cele anorganice, nevolatile cum ar fi fosfatul de potasiu sau sodiu. Unul dintre rolurile interfeei LC-MS este acela de a ndeprta faza mobil, lucru ce duce la depunerea nedorit a moleculelor de tampon n interfa i sursa ionic a spectrometrului. Consecina este reducerea performanei detectorului. Drept urmare, sunt de preferat metodele care implic utilizarea tampoanelor volatile, cum ar fi acetatul de amoniu. Compoziia i parametrii fazei mobile (punct de fierbere, tensiune superficial, conductivitate) pot afecta funcionarea diferitelor interfee. De mare importan este degazeificarea fazei mobile pentru a preveni formarea de bule n cadrul interfeei LC-MS. Solvenii trebuie s fie de puritate nalt, pentru a nu da natere la un fond spectral semnificativ ce ar putea ngreuna interpretarea datelor (Ardrey, 2003).

Spectrometria de mas este o metod ce permite obinerea ionilor, separarea acestora n funcie de raportul dintre mas i sarcin (m/z) precum i nregistrarea lor. n spectrometria de mas pot fi studiate numai particule gazoase. Fasciculul molecular gazos este trimis n camera de ionizare, unde va fi bombardat de un flux de electroni a cror energie e cuprins ntre 10-100 eV. n urma ciocnirii moleculelor cu electronii, se formeaz specii moleculare cu energie mrit. Moleculele pot ceda surplusul de energie fie prin schimbarea configuraiei lor electronice, fie prin radiaie. n cazul cnd schimbarea configuraiei electronice are lor prin emisie de electroni, se formeaz ioni moleculari pozitivi (M+), n timp ce schimbarea configuraiei prin ctig de electroni duce la formarea de ioni moleculari negativi (M-). M - e- M+ M +e- MProcesul de formare al ionilor moleculari pozitivi este de aproximativ 104 ori mai probabil. Dac energia fluxului de electroni depete cu mult energia necesar ionizrii (potenialul de ionizare), molecula se fragmenteaz n ioni pozitivi, negativi, radicali i molecule neutre simple. Pentru a mpiedica ciocnirile ntre particulele pozitive pe de o parte, sau ntre acestea i moleculele neionizate pe de alt parte, ntreaga incint a camerei de ionizare, a sistemului de separare i a colectorului e meninut sub un vid de 10-6 torr. Radicalii i moleculele neutre formate sub impactul electronic sunt evacuai de ctre pompele de vid, iar ionii pozitivi sunt accelerai de-a lungul tubului analizorului de ioni aflat n cmp magnetic. Ionii descriu o traiectorie circular a crei raz e proporional cu masa lor. Prin varierea continu fie a cmpului magnetic, fie a potenialului accelerator, se realizeaz treptat condiiile ca ionii de toate mrimile m/z s focalizeze i s ajung la detector. Dup detectareamplificare, curentul de ioni este nregistrat de ctre nregistrator, care furnizeaz astfel spectrul de mas (Oprean, 1974).

Spectrele de mas sunt spectre de linii, adic semnalul generat de ion apare sub forma unei linii numite i pic. n figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din spectrul de mas al unui compus organic.

Fig. 4. Tipuri de linii n spectrul de mas al unui compus organic

Dac o molecul conine doar atomi formai dintr-un singur izotop de abunden natural de 100%, linia de la valoarea m/z cea mai mare corespunde ionului molecular. Majoritatea atomilor au mai muli izotopi, ceea ce determin apariia de linii la valori mai mari dect cea corespunztoare ionului molecular. Aceste linii se numesc linii izotopice sau picuri izotopice. Cel mai nalt pic din spectrul de mas se numete pic de baz (linie de baz) i corespunde ionilor cu via lung, care ajung la detector n cea mai mare cantitate. Acesta poate fi identic cu picul molecular sau poate fi un pic generat prin fragmentarea ionului molecular. Intensitatea procentual relativ se consider de 100% pentru picul de baz, iar intensitile relative a celorlalte picuri se determin n raport cu picul de baz. Cunoaterea intensitii procentuale relative permite cunoaterea abundenei procentuale relative pentru fiecare specie de ioni din spectrul de mas.

Pe lng linia ionului molecular i a liniilor izotopice, spectrul de mas mai conine i alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare. Fragmentarea ionului molecular n spectrul de mas se face dup anumite reguli specifice fiecrei clase de compui. Spectrometrul de mas poate fi utilizat n dou moduri: modul scan (scanare complet), n care se monitorizeaz toi ionii dintr-un anumit interval al fragmentelor de mas. Tehnica are sensibilitate redus i se folosete la determinarea compuilor necunoscui a unei probe. Deasemenea, cnd se realizeaz dezvoltarea unei metode n laborator, este indicat s se efectueze mai nti analiza n modul scan pentru a determina timpii de retenie i amprentele spectrale ale analiilor de interes. modul sim (monitorizarea ionului selectat), n care se introduc n metod numai fragmentele de mas ale compuilor urmrii i numai acele fragmente sunt detectate de MS. Avantajele modului sim sunt: limita de detecie e mai joas, interferenele matriceale sunt mai mici i poate confirma identificarea unui compus dac raia ionilor obinut este comparabil cu cea dat de standardele de referin. Cromatograful de lichide poate fi deasemenea cuplat cu dou sau multiple stadii de analiz de mas (LC-MS/MS respectiv LC-(MS)n ). Acest mod de operare poate fi foarte folositor la identificarea unor substane necunoscute i anume n cazul n care s-a utilizat o ionizare blnd, se vor produce predominant ionii [M+H]
+

. Acest spectru este srac n informaii, din acest motiv fiind nevoie de o a doua

etap de analiz MS (Gocan, 2002). Tehnici de ionizare

Producerea ionilor n spectrometrul de mas se poate realiza n mai multe moduri (Gocan, 2002): Ionizare electronic (electron ionization, EI) Ionizare chimic (chemical ionization, CI)

 Pulverizare electronic (electrospray ionization, ESI) Pulverizare termic (thermospray, TSP) Ionizare chimic la presiune atmosferic (atmospheric-pressure chemical ionization, APCI) Ionizare prin bombardament cu atomi rapizi (fast atom bombardment, FAB) Ionizare prin desorbie asistat laser din matrice (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI). Ionizarea electronic i chimic poate fi aplicat numai probelor n faz gazoas. De aceea, aceste tehnici de ionizare sunt utilizate cu precdere n cromatografia de gaze. Cromatografia de lichide este folosit la analiza unor compui polari i nevolatili i prin urmare necesit alte moduri de ionizare. Ionizarea electrospray const n trecerea la presiunea atmosferic i debit foarte mic a unei soluii a compusului de analizat printr-o capilar expus unui cmp electric foarte puternic (3-6 kV). Soluia este transformat n picturi foarte fine (spray), nalt ncrcate electric i odat cu evaporarea solventului, ncrcarea electric este transferat moleculei de analizat. Tehnica se aplic moleculelor foarte polare, polimerilor i proteinelor. Ionizarea ESI este o metod blnd de producere a ionilor, fr a afecta integritatea probelor. n urma ionizrii, sunt produi ioni moleculari cvasistabili care nu sunt fragmentai n timpul analizei. Aceti ioni moleculari sunt formai prin ataamentul unor ioni mic moleculari la macromoleculele studiate ori prin sustragerea unui ion (http://www.icmpp.ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD.doc). n cazul interfeei care utilizeaz pulverizarea termic, tot eluentul este introdus prin intermediul acesteia n masa spectrometrului. Prin pulverizarea termic, ionizarea probei poate fi obinut fr a se recurge la folosirea unui filament. Ionizarea thermospray se produce cnd un component ntr-o soluie salin este vaporizat, producnd un jet supersonic de vapori ncrcai. Pe msur ce solventul se evapor i raza picturii se micoreaz, suprafaa cmpului pe o pictur crete pn are loc evaporarea final a unui ion. Spectrele de mas obinute prin ionizare TSP sunt simple, producnd aduci protonai (M+1)+ prin procedeul cu ion pozitiv i (M-1)- prin procedeul cu ion negativ. Temperatura joac un rol

important i de aceea trebuie riguros controlat i meninut la parametri optimi de funcionare a interfeei (Gocan, 2002). Ionizarea APCI este o tehnic n care fluxul de eluent provenit din coloana cromatografic este dispersat n picturi mici datorit temperaturii i a unui gaz nebulizator. Mecanismul de formare al ionilor implic un transfer de sarcin speciilor ntre un ion reactiv i o molecul int, pentru a produce un ion int care poate fi transmis ctre analizorul de mas. Spectrele obinute prin APCI sunt similare cu cele obinute prin pulverizarea electronic prin metoda ioni pozitivi cnd rezult ionii [M+H]+, n timp ce prin metoda ioni negativi sunt produi ionii [M-H] -. Spre deosebire de pulverizarea electronic, APCI nu produce ioni cu sarcini multiple i nu este potrivit pentru analiza compuilor cu mase moleculare mari cum ar fi proteinele. Totui, datorit energiei termice mari utilizat la generarea de ioni, APCI poate ioniza compui relativ nepolari, cu un domeniu al maselor moleculare de la 100 la 2000 dalton (Gocan, 2002). n tehnica de ionizare FAB, proba dizolvat ntr-o matrice lichid (glicerina) este bombardat cu un fascicul de atomi (Xe) de energie foarte nalt. Ionizarea are loc la impactul atomilor cu matricea din care sunt expulzai ionii compusului de analizat. Matricea se adaug la eluentul HPLC, de preferin post-coloan, pentru a nu influena procesul de separare. Pentru a nu se diminua performana tehnicii FAB, coninutul matricei din faza mobil nu trebuie s depeasc procentul de 5%, fapt ce ar conduce la creterea fundalului spectral (Ardrey, 2003). Ionizarea MALDI se realizeaz prin impactul fotonilor de energie ridicat asupra probei plasate ntr-o matrice organic solid. Se aplic moleculelor polare, nestabile termic, cu mase de pn la 500000 dalton (Ardrey, 2003).

METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MAS (GC-MS)

Dac gaz cromatografia era la nceput aplicat doar analizelor compuilor volatili, studiile ulterioare au revoluionat chimia separrilor. n prezent, GC poate fi utilizat att pentru probe gazoase, ct i pentru soluii lichide i solide volatile. Dac proba analizat este nevolatil, se pot folosi tehnicile de derivatizare sau piroliz GC (Grob i Barry, 2004). Tehnica cromatografiei gazoase cuplat cu spectrometria de mas se bazeaz pe natura i distribuia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea componenilor probei cu electroni de o anumit energie. Spectrometria de mas este cea mai performant i sigur tehnic de identificare a compuilor, ntruct face posibil compararea numerelor de mas obinute cu numerele de mas a unor compui cunoscui, din librria de spectre. Datorit acestui fapt, toate metodele bazate pe cromatografie fr utilizarea MS, trebuie confirmate prin spectrometrie de mas, prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE (Gentili i col., 2005). Principiul cromatografiei gazoase Ca principiu de funcionare, cromatografia gazoas realizeaz separarea substanelor volatile pe baza adsorbiei sau repartiiei lor ntr-o faz staionar (solid sau lichid) i o faz mobil gazoas ( un gaz sau un amestec de gaze). n funcie de natura fazei staionare, gaz cromatografia se poate diviza n cromatografie gaz-solid (GSC) i cromatografie gaz-lichid (LGC). n primul caz, faza staionar introdus n coloana cromatografic este adsorbant sau suport polar activ, iar n al doilea caz suportul este legat chimic de o pelicul de lichid nepolar cu tensiune de vapori mic, nevolatil la temperatura de lucru. Faza mobil este constituit din gaze inerte (H 2 , N 2 , He, Ar, CO 2 ) care nu sunt reinute de faza staionar. Faza mobil se deplaseaz de-a lungul coloanei prin porii fazei staionare. Dac la captul superior al coloanei se introduce amestecul de separat n stare de vapori, fiecare component al amestecului va fi transportat difereniat de gaz, meninndu-se un echilibru ntre cantitatea reinut n faza staionar i cantitatea din faza mobil. Dintr-un amestec de substane, fiecare component va fi separat la

timpi de retenie (t R ) diferii. Efluentul care prsete coloana este analizat de un detector care permite trasarea cromatogramei: variaia concentraiei fiecrui component eliminat din coloan n funcie de timpul de retenie pe coloan sau variaia concentraiei n funcie de volumul efluentului. Separarea se poate face n sistem izoterm i izobar (temperatura, debitul fazei mobile i presiunea n coloan sunt constante) sau n sistem de gradient (variaz unul sau doi dintre parametri, de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului purttor). Separarea compuilor este realizat att de stratul activ al coloanei, ct i de programarea temperaturii (separarea compuilor condensai n capul coloanei pe baza punctelor de fierbere). ntre factorii care pot influena capacitatea separrii se numr: numrul de talere teoretice din stratul cromatografic, factorul de separare i volumul de retenie a componentelor (Socaciu, 2000). Un cromatograf de gaze conine urmtoarele componente principale: butelia cu gazul transportor, injectorul, coloana de separare situat ntr-un cuptor termostatat, detectorul i nregistratorul. n figura 5 este redat schema de principiu a unui gaz cromatograf.

Fig. 5. Schema de principiu a unui gaz cromatograf

Coloanele cromatografice sunt foarte diverse, cu lungimi, diametre, compoziii diferite, n funcie de natura componenilor de separat. Se disting dou tipuri de coloane: coloane cu umplutur ce conin suporturi solide i care pot fi

analitice sau preparative n funcie de lungime i coloane capilare construite dintrun tub de oel moale sau Cu, Al, sticl, n care pereii interiori pot fi folosii ca atare, ca faz staionar sau pot fi tapetai cu o faz staionar. Coloanele capilare sunt net superioare celor cu umplutur, larga lor utilizare datorndu-se eficienei ridicate de separare a acestora. Numrul de talere teoretice este proporional cu lungimea coloanei, deci pentru separri optime se folosesc coloane lungi. Diametrul interior al coloanelor este de 2-500mm pentru coloanele clasice i <1mm pentru coloanele capilare. Diametrul interior influeneaz viteza optim a gazului transportor, capacitatea de lucru a coloanei i cantitatea maxim de material separat. Cu ct diametrul coloanei este mai mic, separarea este mai performant. Umplutura coloanelor clasice depinde de tipul cromatografiei, astfel n GSC se folosesc faze staionare active: crbune activ, silicagel, alumin, site moleculare, zeolii, sticl poroas, silicat de Mg. ntruct energiile de absorbie sunt mai mari dect energiile de disociere, analiza se realizeaz la temperaturi mai mari dect n GLC. Faza staionar n GLC este constituit dintr-un suport inactiv, poros (suprafaa specific de 1-10 m 2 /g) impregnat 5-20% cu un lichid. Faza staionar astfel constituit este repartizat uniform ca pelicul subire pe pereii coloanei, pentru a opune rezisten ct mai mic amestecului de separat. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau P, celita, pmntul de diatomee, produsele Brique C 22 , iar suporturile mai puin poroase sunt: bile de sticl, pudra de teflon, grafit, polietilen microporoas. nlimea unui taler teoretic este proporional cu diametrul particulelor. Este important ca particulele s aib dimensiuni apropiate. Pentru a elimina proprietile absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau acoperirea suportului cu polivinilpirolidon (PVP), cu teflon sau argintare. n alegerea fazei staionare trebuie s se in seama de tipul substanelor de separat (polaritate, legturi de hidrogen, etc.), de interaciunile chimice posibile cu faza staionar sau faza mobil, de capacitatea de adsorbie pe suport. S-a fcut o scal de selectivitate a lichidelor staionare care ncepe cu squalenul (nepolar) i se ncheie cu , - dioxipropionitril (cel mai polar). Suportul impregnat cu lichid este nclzit ntr-un curent de gaz inert la o temperatur apropiat de cea de separare.

Umplerea coloanei se face sub vid, iar condiionarea ei const n nclzire sub curent de gaz purttor la temperatur nalt pentru a ndeprta impuritile volatile. Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale n care faza staionar nu este fixat pe suport, fiind repartizat uniform pe pereii interiori ai coloanei. Practic se realizeaz o pelicul foarte subire prin evaporarea fazei staionare lichide. Diametrul interior este de 0.25-0.5mm, iar lungimea de 20-50m, realiznduse aproximativ 10000 talere teoretice. Proba nu se introduce direct n coloan, ci printr-o camer de injectare a crei form i volum influeneaz mult separarea. Aceast camer are o temperatur mai mare dect coloana, permind evaporarea probei. Volumul probei trebuie s fie ct mai mic. Cnd coloanele sunt suprancrcate, se reduce numrul de talere teoretice, crete nlimea unui taler i picurile devin asimetrice i cu lime mare. Injectarea probei poate fi fcut cu sau fr splitare. n cel de-al doilea caz, toat cantitatea injectat intr n coloana cromatografic. Pentru compuii mai volatili dect solventul este obligatoriu s se lucreze cu splitare: o parte din extractul de injectat va intra n coloan, o parte va fi direcionat n exteriorul cromatografului. n calculul concentraiilor componenilor determinai se va ine seama de raportul de splitare, care are practic semnificaia unei diluii. Analiza unei probe implic etapele de pregtire a probei, de separare a componenilor i de evaluare calitativ i cantitativ a componenilor separai. Analiza calitativ presupune identificarea fiecrui pic din cromatogram. Analiza cantitativ se face prin integrarea picurilor i calculul ariilor acestora, exprimate ca procent din totalul picurilor. Acest procent este proporional cu ponderea fiecrei componente n amestec. Pentru a exprima n valori absolute cantitatea fiecrei componente din amestec, trebuie determinat concentraia total a substanelor n amestec i apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculeaz concentraia fiecrei componente (Socaciu, 2000).

Detectori utilizai n cromatografa gazoas Detectorul pune n eviden componentele separate pe coloana

cromatografic, sub forma unor semnale electrice care pot fi nregistrate. Detectorul trebuie s deosebeasc o proprietate oarecare a componentului de analizat fa de gazul purttor. Exist detectori universali, sensibili la un numr mare de componeni i specifici, sensibili numai la anumii componeni (la anumite grupri funcionale sau legturi chimice). Caracteristicile detectorului: sensibilitate ct mai mare pentru a putea detecta chiar i urmele de componeni i pentru a nu fi necesar ncrcarea coloanei cu cantiti mult prea mari de prob vitez de rspuns ct mai mare liniaritate: sensibilitatea detectorului s rmn constant ntr-un domeniu larg de concentraii limit de sensibilitate ( concentraia minim de substan n eluent pentru care se obine un pic) ct mai joas stabilitate: linia de fond i reproductibilitatea s fie ct mai puin afectate de condiiile de lucru (temperatur, debit, presiune, etc) (Liteanu i col., 1981). Cele mai importante tipuri de detectori sunt: 1. Detectorul de conductibilitate termic (DCT) a fost primul care a aprut, fcnd parte din categoria detectorilor universali. Se mai numete i catarometru, este nedestructiv, putnd fi utilizat i n cromatografia preparativ. Principiul de funcionare se bazeaz pe diferena de conductibilitate termic dintre component i eluent. 2. Detectorul cu flacr de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai mult folosit n GC. Principiul de funcionare const n msurarea conductibilitii electrice a unei flcri de hidrogen n prezena unui compus organic. La ieirea din coloan, eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen i este aprins la captul unei duze din oel inoxidabil. Crend un cmp electric ntre duz i un electrod colector aezat deasupra flcrii, se stabilete un curent slab (10-14 A) ntre cei doi electrozi prin flacr. Apariia n flacr a unui compus organic mrete intensitatea

curentului datorit ionizrii acestuia n funcie de natura i concentraia componentului respectiv. Acest curent va fi amplificat i apoi nregistrat. Detectorul FID are o sensibilitate nalt, stabilitate pe termen lung, rspuns al semnalului rapid, simplitate n operare i ntreinere. 3. Detectorul cu captur de electroni (ECD) prezint o mare sensibilitate pentru compuii capabili de captur de electroni, cum ar fi compuii coninnd halogeni. Muli compui de interes biologic prezint proprietatea de a capta electroni sau posilitatea de a fi derivatizai cu compui care au aceast proprietate. Sursa de ionizare const din tritiu sau Ni63 radiocactiv. Azotul se utilizeaz ca gaz purttor i produce prin iradiere electroni i ioni pozitivi: N2 N2 + +eDatorit mobilitii ridicate a electronilor liberi, nu are loc recombinarea lor cu ionii pozitivi. Prin aplicarea unui cmp electric ntre electrozii camerei de ionizare, ionii formai prin iradiere vor fi colectai. Prezena unor molecule cu afinitate ridicat pentru captarea electronilor liberi favorizeaz formarea ionilor negativi: [component] + e- [component]Ionii negativi se recombin cu ionii pozitivi mult mai uor dect electronii liberi: N2 + + [component]- [molecul neutr] Detectorul ECD are avantajul selectivitii i sensibilitii foarte ridicate. 4. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la baz ionizarea fotonic a moleculelor probei i msurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector cuplat cu un electrometru. 5. Spectrometrul de mas (MS): n urma ionizrii n vid a moleculelor substanei de analizat, are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni caracteristici, cu mase diferite. Procesele se desfoar n sursa de ionizare a spectrometrului. Ionii formai sunt separai n funcie de masa lor n analizorul de mas i apoi sunt detectai i nregistrai. Reprezentarea abundenei lor (concentraiei relative) n funcie de mas constituie spectrul de mas. Ionizarea moleculelor poate avea loc n dou modaliti: prin impact electronic (EI) i ionizare chimic (CI).

Ionizarea prin impact electronic n camera de ionizare se realizeaz un vid naintat, de 10-8 torr. Electronii provenii de la un filament nclzit sunt focalizai n timp ce strbat camera i colectai de un electrod avnd un potenial de 70V. Acesta i confer fiecrui electron o energie de 70eV. Dac n camera de ionizare se introduce o substan ntr-o cantitate suficient ca presiunea s creasc la 10-5torr, ciocnirile dintre electroni i moleculele compusului respectiv determin fragmentarea acestora. ntruct electronii la 70eV au energie suficient pentru a rupe orice legatur din molecul, prin fragmentare se vor forma toi ionii posibili. Din cauza presiunii sczute din camera de ionizare, numai o molecul din aproximativ 10 6 va realiza ciocnirea i ionizarea. Fragmentele de molecule neutre i de ioni formai nu se vor ciocni ntre ei, ci numai cu pereii camerei, fiind posibil aadar ndeprtarea lor din camera de ionizare i colectarea ionilor de mase diferite n detector. Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei i la obinerea unui amestec complex de ioni a cror mas si abunden relativ se poate utiliza pentru identificarea calitativ a compuilor respectivi. Spectrul de mas obinut n asemenea condiii va fi reproductibil i caracteristic pentru compusul respectiv. Primul ion care se formeaz n urma impactului este aa-numitul ion molecular, care are mare importan n identificarea substanei deoarece are aceeai mas cu masa molecular a compusului respectiv. Din pcate ns, stabilitatea ionului molecular este aa de redus (el se va fragmenta mai departe) nct, abundena sa relativ va fi foarte mic i identificarea de cele mai multe ori imposibil. n consecin, a devenit necesar utilizarea unei tehnici de ionizare mai blnde, prin care s se obin informaii despre masa molecular. Aceast tehnic este ionizarea chimic, introdus n anul 1966. Spectrele de mas cu ionizare chimic sunt produse prin reacii ionmoleculare ntre moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) i o presiune ridicat (0.2-2 torr) a plasmei de ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau izobutan). Gazul reactiv poate s nlocuiasc gazul purttor n GC-MS i poate fi introdus direct n surs, cu puine efecte asupra rezoluiei cromatografice. ntruct concentraia gazului reactiv este cu cteva ordine de mrime peste concentraia

probei, fasciculul de electroni ionizeaz gazul reactiv cu puine molecule ale probei ionizate direct. Deoarece sursa este operat la presiune nalt comparativ cu sursa EI, reaciile ion-molecule sunt favorizate, realizndu-se ionizarea probei. Aceste reacii au loc cu energie mic n comparaie cu impactul direct cu electroni, abundena ionului molecular fa de alte fragmente rezultate va fi mare i mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu. Majoritatea tehnicilor de ionizare chimic lucreaz cu ioni pozitivi, dar s-au dezvoltat i cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai mic. Comparativ cu ionizarea prin EI, ionizarea chimic prezint dezavantajul c ofer rezultate mai puin reproductibile i nu este posibil alctuirea unei librrii de spectre care s fie folosit n scopuri de identificare. Separarea ionilor formai are loc n analizorul de mas, tipurile cele mai uzuale fiind cele magnetice i cu cuadrupol descrise n capitolul 3.3.3. Spectrele de mas pot fi nregistrate sub form de picuri cu maxime (forma original a spectrului), dar n practic se utilizeaz reprezentarea fiecrui pic sub forma unei linii. Celei mai nalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100, iar restul sunt exprimate ca procente fa de aceasta, obinndu-se concentraia diverselor fragmente ionice ca valori de abunden relativ (Gocan, 1998; Ciucanu, 1990; http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182.php).