P. 1
ti HPLC Si GC[1]

ti HPLC Si GC[1]

|Views: 905|Likes:
Published by Bernadette Teleky

More info:

Published by: Bernadette Teleky on Jun 12, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/20/2013

pdf

text

original

METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC) HPLC este cea mai extinsă metodă cromatografică utilizată pentru

analiza analiţilor compuşi biologic activi, fiecare clasă a acestora fiind testată separat. Spre deosebire de tehnica LC-MS, nu oferă o certitudine 100% cu privire la identificarea analiţilor. Principiul cromatografiei lichide Spre deosebire de cromatografia de gaze în care faza mobilă joacă doar rolul de “cărăuş” în transportul componenţilor prin coloană, în cazul cromatografiei de lichide, faza mobilă participă alături de faza staţionară la procesul de separare prin interacţiuni selective mult mai complexe (Gocan, 2002). Cromatografia lichidă se subclasifică după tipul suportului, în cromatografie cu fază normală (NP-HPLC) şi inversă (RP-HPLC). Sistemele NP-HPLC utilizează o fază staţionară polară (silicagel, alumină, celuloză, Ca(OH)2, MgCO3 ), o fază mobilă nepolară (eter de petrol, hexan puri sau în amestec cu acetonă 1-15%), separarea având la bază adsorbţia diferită a componentelor amestecului pe faza staţionară. Se adresează probelor preponderent nepolare, ordinea de eluţie (caracterizată de timpul de retenţie, tR, al probei pe coloană, exprimat în minute) a componentelor amestecului fiind : tR componente nepolare < tR componente polare În sistemele RP-HPLC, faza staţionară devine nepolară prin legare chimică de octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca fază mobilă se folosesc amestecuri de solvenţi polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, apă), iar procesul de separare are la bază repartiţia componentelor amestecului între faza staţionară şi eluent. Este indicat în cazul probelor preponderent polare, ordinea de eluţie fiind: tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997). În prezent, peste 60% din totalul separărilor se realizează prin cromatografia cu fază inversă. Popularitatea acestei tehnici rezidă în faptul că prezintă o universalitate în separarea unor compuşi nepolari, polari şi ionici, incluzând un larg domeniu de mase moleculare şi faptul că optimizarea separărilor se realizează relativ uşor (Gocan, 2002).

După mecanismul de separare, cromatografia poate fi: de absorbţie, de repartiţie lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterică (gel-cromatografia) sau de afinitate (interacţiuni hidrofobe, separări chirale). Principalele tipuri de tehnici cromatografice, în funcţie de mecanism, fază staţionară şi mobilă sunt redate în tabelul 1. Tabel 1 Principalele tipuri de tehnici cromatografice
Mecanism 1. Adsorbţie* (CA) 2.Repartiţie LL (CR) 3.Schimb ionic (CSI) 4. Excluziune sterică *** 5.Afinitate** şi Cromatografia gazoasă Interacţiuni hidrofobe 1. Adsorbţie 2. Repartiţie
*** **

Faza staţionară S1, NP-HPLC Si-C8,Si-C18,RPHPLC Schimbători de ioni2 Geluri3(CES) Geluri şi

Faza mobilă Solvenţi preponderent nepolari Solvenţi preponderent polari Soluţii acizi-baze Soluţii tampon4 Soluţii tampon4

Cromatografia de lichide

Hidroxilapatită Oţel sau răşini (GSC) Ar, He, N2 + H2 Uleiuri(GLC) Ar, He, N2 + H2

* Efectuată pe hârtie (CH), strat subţire (CSS), coloană deschisă (CC) şi coloană închisă (HPLC) ** Efectuată pe strat subţire (CSS) sau pe coloană deschisă (CC) şi închisă de oţel (HPLC) *** Efectuată pe coloană deschisă sau închisă de sticlă la presiuni joase (LPLC- Low pressure liquid chromatography)
1 2 3

Vezi faze staţionare răşini schimbătoare de ioni de tip Amberlit, Doriex geluri de tip Sephadex (G50, G100, G200), Sephacryl, cu pori controlaţi

Sursa: Socaciu, 1997 Părţile componente ale unui cromatograf de lichide de înaltă performanţă sunt: pompele ataşate la un rezervor de unde preiau eluentul (faza mobilă), un injector manual sau un autosampler, cuptorul termostatat în interiorul căruia se află coloana cromatografică de separare, degazorul, controller-ul, detectorul şi instrumentul de înregistrare a semnalului furnizat de detector (fig.1).

1. . La ieşirea din coloană. a componenţilor amestecului de separat de-a lungul coloanei.Fig. Maximele înregistrate deasupra liniei de bază în cromatogramă poartă numele de picuri şi au forma distribuţiei normale Gauss (Socaciu. Schema generală a unui HPLC Coloana cromatografică este componenta cea mai importantă a cromatografului. 2). cu viteze diferite. sau cu un computer. 1997). detectorul preia continuu fluxul de solvent conţinând componentele separate şi transformă semnalul chimic în semnal electric. împreună cu substanţa lichidă de analizat este pompat în coloana ce conţine faza staţionară. Are loc migrarea. Aria corespunzătoare unui semnal cromatografic este proporţională cu concentraţia substanţei pe care acesta o determină şi această arie se poate măsura cu un integrator. Eluentul. înregistrat sub forma unei cromatograme (fig. deoarece aici este sediul procesului de separare.

2. . care implică o singură fază mobilă. SPE (extracţie în fază solidă) sau SFE (extracţie cu fluide supercritice). În aceste situaţii se apelează la eluţia cu gradient. 2002). separarea în condiţii izocratice. în care se modifică faza mobilă în timp. după un anumit program. urmată de analiza propriu-zisă. Tehnici de extracţie Tehnica HPLC presupune o etapă de prelucrare a probei în care se realizează extracţia şi curăţarea matricei. trei sau chiar patru solvenţi. în care analitii vor fi separaţi şi cuantificaţi. este imposibilă.Absorbanta/Absorbance (mAU) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 10 15 20 25 30 Timp de retentie/Retention time (min) Fig. cât mai ales ca proprietăţi diferite ale acestora. Acest lucru se realizează prin amestecarea a doi. Cromatograma unui amestec de compuşi analizaţi prin tehnica HPLC În cazul unor amestecuri complexe. Pentru extracţia analiţilor de interes din matrice se folosesc tehnicile LLE (extracţie lichid-lichid). pentru a obţine un gradient de un anumit profil (Gocan. atât ca număr de componenţi.

În acest sens. . C8. interacţiuni dipol-dipol. eluarea compuşilor reţinuţi pe cartuş. extracţia în fază solidă SPE are unele avantaje: este mai rapidă. C2. în urma căreia analitul de interes este separat de ceilalţi componenţi ai matricei din prima fază şi extras în cea de-a doua fază lichidă. pentru a asigura o extracţie completă. în timp ce restul compuşilor vor fi îndepărtaţi. aplicarea probei prin care analiţii de interes vor fi reţinuţi selectiv pe cartuş. se va ţine seama de proprietăţile termodinamice ale solventului şi solvatului: polaritate. Metodologia LLE constă în amestecarea a două faze nemiscibile (de obicei una organică şi una apoasă). secundare şi terţiare). spălarea cartuşului cu solvenţi care să îndepărteze compuşii nedoriţi adsorbiţi la încărcarea probei. Alternanţa pH-ului are un efect dramatic asupra solubilităţii compuşilor ionizabili. Utilizarea cartuşelor SPE implică patru paşi: condiţionarea umpluturii cartuşului.schimbător de ioni . ciclohexil şi copolimerul stiren-divinilbenzen . Grupările schimbătoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbătoare (aminele cuaternare) sau slab schimbătoare (aminele primare. fenil. precum şi de observaţiile analistului din practica experimentală.grupările funcţionale utilizate sunt C18.Primele două sunt cel mai frecvent folosite.nepolar . Există patru mecanisme generale de extracţie întâlnite în tehnica SPE: . Întrucât SFE necesită echipament specializat. se obţin extracte mai curate şi necesită cantităţi de solvenţi mai reduse.grupările funcţionale utilizate sunt: cianopropil. diol şi aminopropil . O importanţă deosebită prezintă alegerea solventului utilizat în extracţia analitului. Comparativ cu LLE. nu şi-a găsit aplicaţii foarte largi. utilizând un solvent care va distruge interacţiunile analit-pat adsorbant. Procedeul se repetă de regulă de 2-3 ori. mai reproductibilă. calităţi donoare sau acceptoare de H+. Grupările schimbătoare de cationi pot fi puternic schimbătoare (derivaţii acidului sulfonic) sau slab schimbătoare (derivaţii acidului carboxilic). Se ştie că compuşii ionizaţi sunt mult mai solubili in solvenţi polari (în special soluţii apoase) decât compuşii neionizaţi (Fedeniuk şi Shand. 1998).coloanele schimbătoare de ioni se împart în coloane schimbătoare de anioni şi cationi.polar .

având capacitatea de a reţine atât analiţi polari cât şi nepolari. s-a încercat folosirea unor cartuşe SPE cu amestec de faze. particulele PGC se caracterizau printr-o distribuţie omogenă. S-a încercat deasemenea crearea unui tip de cartuş SPE care utiliza carbonul grafitic poros (PGC).interacţiunile de tip covalent depind de structura chimică a analitului. Un exemplu ar fi utilizarea derivaţilor boratului pentru extracţia compuşilor cu două grupări vecine hidroxil. prezentau avantajul utilizării unui singur cartuş pentru mai mulţi analiţi cu proprietăţi chimice diferite.-covalent . Principiul extracţiei SPE se bazează pe teoria cromatografiei. Alegerea variantei de extracţie a analiţilor se va face ţinând cont de natura şi particularităţile matricei. Acestea. În acest caz. în unele cazuri ireversibilă. care combinau grupările nepolare cu cele schimbătoare de ioni (Oka şi col. s-a revenit la cartuşele SPE cu o singură fază. dar capacitatea lor de adsorbţie era mai redusă. Utilizarea mai multor cartuşe SPE cu structuri ale umpluturii diferite a fost aplicată cu succes în pregătirea probei. dar timpul de analiză a fost mult mai mare. principala problemă era aceea că adsorbţia compuşilor era foarte puternică. particulele umpluturii nefiind distribuite omogen. . Deşi erau multifuncţionale. datorită faptului că extracţiile nu erau reproductibile. structura chimică a analiţilor fiind diferită. 1987).. Cartuşele SPE cu o singură grupare funcţională prezintă dezavantajul că nu pot fi folosite pentru analiza multireziduală. De aceea. Dar.

ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi. În cromatografia lichidă nu există un detector universal şi de înaltă sensibilitate. 2002). Există posibilitatea creşterii selectivităţii şi sensibilităţii detecţiei prin tehnicile de derivatizare pre. electrochimici şi spectrometrul de masă. în schimb detectorii din cromatografia lichidă acoperă un număr mult mai mare de substanţe. Sunt foarte sensibili la variaţii de temperatură şi nu sunt recomandaţi pentru eluţia cu gradient (Gocan. Detectorii sunt selectivi.Detectori utilizaţi în cromatografía lichidă Pentru cromatografia de lichide au fost create două tipuri de detectori care sunt astăzi folosiţi în mod curent:  Detectorii bazaţi pe proprietatea componentului sunt sensibili la unele proprietăţi chimice ori fizice.  Detectorii bazaţi pe proprietatea de volum funcţionează prin măsurarea unor proprietăţi fizice ale componentului în efluent în comparaţie cu eluentul. Se pot atinge sensibilităţi remarcabile. Astfel de detectori se bazează pe măsurarea indicelui de refracţie. selectivitate bună şi permit eluţia cu gradient. Caracteristicile detectorului cromatografic ideal: • răspuns independent de compoziţia fazei mobile. ei nu răspund la toate moleculele existente într-un amestec. temperatură • sensibilitate mare • selectivitate • răspuns rapid • zgomot de fond scăzut • non-destructiv pentru probă • domeniu dinamic liniar mare .şi post-coloană. debit. a constantei dielectrice şi a conductivităţii. Din această categorie fac parte detectorii spectrofotometrici de absorbţie UV-Vis. de fluorescenţă. aşa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacără (FID) din cadrul cromatografiei gazoase.

Pentru domeniul vizibil (350-800nm) s-a introdus lampa de tungsten. Există situaţii în care amestecul de separat este complicat şi timpul de retenţie nu este suficient pentru a caracteriza fiecare component. Pentru a se utiliza un asemenea detector. 2002). Prezintă avantajele: poate fi aleasă lungimea de undă optimă (adică corespunzătoare absorbanţei maxime). din întreg domeniul UV. Astfel. fapt ce conduce la erori de interpretare datorită suprapunerii semnalelor. iar eluentul să fie transparent în domeniul spectral respectiv (Gocan. este necesar ca componentele de analizat să manifeste absorbanţe suficient de mari în domeniul spectral la care funcţionează detectorul. putând fi selectată continuu. Acest tip de detector poate fi utilizat şi ca un spectrofotometru pentru înregistrarea spectrului unui anumit component ce urmează a fi identificat prin compararea acestui spectru cu cel din biblioteca de date. Spectrometrul de masă (MS) este detectorul care permite identificarea prin compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare cu spectrele etalon din biblioteca de spectre. este universal recunoscut că cea mai bună metodă de identificare şi caracterizare a fiecărui component separat prin cromatografie constă în înregistrarea spectrului său de masă. fără a fi necesară repetarea separării. Exista mai multe tipuri de detectori UV-Vis şi-anume: • detectori cu o singură lungime de undă. • detectori cu serie de fotodiode. poate fi aleasă absorbanţa cea mai bună în raport cu eluentul sau cu compuşii care interferă. la intervale de timp de microsecunde. având o energie înaltă de emisie la 254nm.• stabilitate într-un timp îndelungat de operare Detectorii ce au la bază absorbţia în ultraviolet (UV)-vizibil (Vis) sunt cei mai populari detectori utilizaţi în cromatografia de lichide şi sunt practic insensibili la variaţii de debit şi temperatură. care au sursă spectrală continuă de înaltă energie stabilă reprezentată de lampa cu deuteriu (190-400nm). Prezintă un zgomot de fond redus. . care folosesc ca sursă de lumină UV o lampă de mercur la presiune joasă. Unele substanţe organice au timpi de retenţie identici. care prezintă facilitatea că întreg domeniul spectral este înregistrat continuu. • spectrometre cu lungime de undă variabilă. dar componentul trebuie să aibă o absorbanţă acceptabilă la această lungime de undă. iar datele stocate pot fi folosite în diferite moduri şi la date ulterioare.

supuşi acţiunii unui câmp magnetic perpendicular pe direcţia lor de deplasare. 1974). Analizatorul de ioni separă ionii proveniţi din camera de ionizare în funcţie de raportul dintre masa şi sarcina acestora (m/z). Fig. . fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre în ioni pozitivi (alături de alte particule negative sau neutre). 3. Sursa de ioni constituie partea cea mai importantă a unui spectrometru de masă. În figura 3 este redată schema de principiu a unui spectrometru de masă. la care se adaugă sistemul de introducere a probei şi înregistratorul. Schema de principiu a unui spectrometru de masă Spectrometrele de masă sunt alcătuite din trei componente de bază: sursa de ioni sau camera de ionizare analizatorul de ioni detectorul sau colectorul de ioni.Spectrometrul de masă se bazează pe principiul că ionii de diferite greutăţi (indiferent de modul lor de formare) după accelerarea într-un câmp electric. vor fi deviaţi mai mult sau mai puţin în funcţie de masa şi sarcina lor (Oprean. 1974). Ionii cu aceeaşi valoare m/z formează în colector un curent slab care este trimis spre amplificator şi apoi înregistrat (Oprean.

pornind de la analize simple ca un înlocuitor al tradiţionalului UV şi ajungând la analize calitative şi cantitative foarte exacte. sistemele LC-MS au suferit transformări semnificative. având utilizări atât calitative cât şi cantitative: identificarea compuşilor necunoscuţi. în timp ce spectrometrul de masa operează sub un vid de 10-6 torr. Interfaţa asigură trecerea analiţilor din soluţie în stare de vapori. care este pompat prin coloană cu un debit de ordinul ml/min.org/wiki/Shimadzu_Scientific). Principalele interfeţe utilizate în cuplarea unui LC cu un MS sunt:  cu introducerea directă a efluentului  curgere continuă cu bombardament atomic rapid .majoritatea analiţilor separaţi prin HPLC sunt nevolatili şi/sau nestabili termic şi prin urmare nu pot fi supuşi ionizării electronice sau chimice.faza mobilă este un lichid. este imposibilă trecerea directă a eluentului din coloana HPLC în sursa spectrometrului şi rolul interfeţei este de a îndepărta faza mobilă. determinarea compoziţiei izotopice moleculare. . 2003). Aceste sisteme şi-au găsit largi aplicaţii în analiza alimentară. Astfel. Pe parcursul anilor.wikipedia. a mediului şi în criminalistică. farmaceutică. Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de masă s-a obţinut un instrument de analiză performant capabil să separe.METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (LC-MS) LC-MS este o tehnică cu multe aplicaţii datorită sensitivităţii şi specificităţii sale foarte ridicate. să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe. adesea conţinând proporţii semnificative de apă. determinarea structurii în funcţie de fragmentare şi cuantificarea compuşilor din diferite probe (http://en. A fost necesară dezvoltarea unor metode alternative de ionizare (Ardrey. Pentru utilizarea spectrometrului de masă ca detector în cromatografia de lichide. problema principală este realizarea unei interfeţe eficiente care să soluţioneze două incompatibilităţi majore: .

Unul dintre rolurile interfeţei LC-MS este acela de a îndepărta faza mobilă. Compoziţia şi parametrii fazei mobile (punct de fierbere. cu bandă transportoare  cu pulverizare la temperatură (thermospray)  cu electropulverizare (electrospray)  cu pulverizarea efluentului într-un curent de gaz la cald combinată cu o ionizare chimică la presiunea atmosferică (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea atmosferică (APPI) (Gocan. Pe măsură ce componenţii amestecului sunt eluaţi din coloană. Drept urmare. Consecinţa este reducerea performanţei detectorului. ei sunt trecuţi în spectrometrul de masă. Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de masă După extracţie şi purificare. tensiune superficială. vor migra cu viteze diferite de-a lungul coloanei. Tampoanele sunt folosite în cromatografia lichidă pentru a controla gradul de ionizare al analitului şi implicit simetria semnalului şi reproductibilitatea retenţiei. Alegerea fazei mobile are o mare importanţă în obţinerea unor bune separări. Cele mai des utilizate sunt cele anorganice. 2002). conductivitate) pot afecta funcţionarea diferitelor interfeţe. pentru a nu da naştere la un fond spectral semnificativ ce ar putea îngreuna interpretarea datelor (Ardrey. De mare importanţă este degazeificarea fazei mobile pentru a preveni formarea de bule în cadrul interfeţei LC-MS. lucru ce duce la depunerea nedorită a moleculelor de tampon în interfaţă şi sursa ionică a spectrometrului. 2003). proba de analizat este preluată din dispozitivul de introducere a probei de către faza mobilă şi introdusă în coloana cromatografică ce conţine faza staţionară. datorită distribuţiei diferenţiate între cele două faze. nevolatile cum ar fi fosfatul de potasiu sau sodiu. . Solvenţii trebuie să fie de puritate înaltă. sunt de preferat metodele care implică utilizarea tampoanelor volatile. cum ar fi acetatul de amoniu. Aici are loc separarea componenţilor care.

Ionii descriu o traiectorie circulară a cărei rază e proporţională cu masa lor. În spectrometria de masă pot fi studiate numai particule gazoase. Prin varierea continuă fie a câmpului magnetic. În cazul când schimbarea configuraţiei electronice are lor prin emisie de electroni. Pentru a împiedica ciocnirile între particulele pozitive pe de o parte. fie prin radiaţie. în timp ce schimbarea configuraţiei prin câştig de electroni duce la formarea de ioni moleculari negativi (M-). Moleculele pot ceda surplusul de energie fie prin schimbarea configuraţiei lor electronice. întreaga incintă a camerei de ionizare. unde va fi bombardat de un flux de electroni a căror energie e cuprinsă între 10-100 eV. M . În urma ciocnirii moleculelor cu electronii.→ MProcesul de formare al ionilor moleculari pozitivi este de aproximativ 104 ori mai probabil.e. După detectareamplificare. molecula se fragmentează în ioni pozitivi. radicali şi molecule neutre simple. Dacă energia fluxului de electroni depăşeşte cu mult energia necesară ionizării (potenţialul de ionizare). iar ionii pozitivi sunt acceleraţi de-a lungul tubului analizorului de ioni aflat în câmp magnetic.→ M+ M +e. se realizează treptat condiţiile ca ionii de toate mărimile m/z să focalizeze şi să ajungă la detector. Fasciculul molecular gazos este trimis în camera de ionizare. . curentul de ioni este înregistrat de către înregistrator. 1974). negativi. sau între acestea şi moleculele neionizate pe de altă parte. fie a potenţialului accelerator. Radicalii şi moleculele neutre formate sub impactul electronic sunt evacuaţi de către pompele de vid. se formează ioni moleculari pozitivi (M+). care furnizează astfel spectrul de masă (Oprean. se formează specii moleculare cu energie mărită. separarea acestora în funcţie de raportul dintre masă şi sarcină (m/z) precum şi înregistrarea lor. a sistemului de separare şi a colectorului e menţinută sub un vid de 10-6 torr.Spectrometria de masă este o metodă ce permite obţinerea ionilor.

care ajung la detector în cea mai mare cantitate. Aceste linii se numesc linii izotopice sau picuri izotopice. iar intensităţile relative a celorlalte picuri se determină în raport cu picul de bază. Majoritatea atomilor au mai mulţi izotopi. Intensitatea procentuală relativă se consideră de 100% pentru picul de bază. Cunoaşterea intensităţii procentuale relative permite cunoaşterea abundenţei procentuale relative pentru fiecare specie de ioni din spectrul de masă. ceea ce determină apariţia de linii la valori mai mari decât cea corespunzătoare ionului molecular. 4. Acesta poate fi identic cu picul molecular sau poate fi un pic generat prin fragmentarea ionului molecular. În figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din spectrul de masă al unui compus organic. linia de la valoarea m/z cea mai mare corespunde ionului molecular. adică semnalul generat de ion apare sub forma unei linii numite şi pic. Cel mai înalt pic din spectrul de masă se numeşte pic de bază (linie de bază) şi corespunde ionilor cu viaţă lungă. Tipuri de linii în spectrul de masă al unui compus organic Dacă o moleculă conţine doar atomi formaţi dintr-un singur izotop de abundenţă naturală de 100%. Fig. .Spectrele de masă sunt spectre de linii.

2002):  Ionizare electronică (electron ionization. se vor produce predominant ionii [M+H] + . Tehnici de ionizare Producerea ionilor în spectrometrul de masă se poate realiza în mai multe moduri (Gocan. Deasemenea. în care se introduc în metodă numai fragmentele de masă ale compuşilor urmăriţi şi numai acele fragmente sunt detectate de MS. spectrul de masă mai conţine şi alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare. Acest spectru este sărac în informaţii. interferenţele matriceale sunt mai mici şi poate confirma identificarea unui compus dacă raţia ionilor obţinută este comparabilă cu cea dată de standardele de referinţă. EI)  Ionizare chimică (chemical ionization. Spectrometrul de masă poate fi utilizat în două moduri:  modul “scan” (scanare completă). din acest motiv fiind nevoie de o a doua etapă de analiză MS (Gocan.Pe lângă linia ionului molecular şi a liniilor izotopice. este indicat să se efectueze mai întâi analiza în modul “scan” pentru a determina timpii de retenţie şi amprentele spectrale ale analiţilor de interes. CI) . în care se monitorizează toţi ionii dintr-un anumit interval al fragmentelor de masă. Avantajele modului “sim” sunt: limita de detecţie e mai joasă.  modul “sim” (monitorizarea ionului selectat). Tehnica are sensibilitate redusă şi se foloseşte la determinarea compuşilor necunoscuţi a unei probe. Cromatograful de lichide poate fi deasemenea cuplat cu două sau multiple stadii de analiză de masă (LC-MS/MS respectiv LC-(MS)n ). Acest mod de operare poate fi foarte folositor la identificarea unor substanţe necunoscute şi anume în cazul în care s-a utilizat o ionizare blândă. 2002). când se realizează dezvoltarea unei metode în laborator. Fragmentarea ionului molecular în spectrul de masă se face după anumite reguli specifice fiecărei clase de compuşi.

producând aducţi protonaţi (M+1)+ prin procedeul cu ion pozitiv şi (M-1). Tehnica se aplică moleculelor foarte polare. Prin pulverizarea termică. În cazul interfeţei care utilizează pulverizarea termică. producând un jet supersonic de vapori încărcaţi. fără a afecta integritatea probelor. suprafaţa câmpului pe o picătură creşte până are loc evaporarea finală a unui ion.doc). înalt încărcate electric şi odată cu evaporarea solventului. Aceşti ioni moleculari sunt formaţi prin ataşamentul unor ioni mic moleculari la macromoleculele studiate ori prin sustragerea unui ion (http://www. Spectrele de masă obţinute prin ionizare TSP sunt simple. De aceea. ESI)  Pulverizare termică (thermospray. Soluţia este transformată în picături foarte fine (spray). Ionizarea thermospray se produce când un component într-o soluţie salină este vaporizat. FAB)  Ionizare prin desorbţie asistată laser din matrice (matrix assisted laser desorption ionization. Ionizarea electronică şi chimică poate fi aplicată numai probelor în fază gazoasă. ionizarea probei poate fi obţinută fără a se recurge la folosirea unui filament. Ionizarea electrospray constă în trecerea la presiunea atmosferică şi debit foarte mic a unei soluţii a compusului de analizat printr-o capilară expusă unui câmp electric foarte puternic (3-6 kV). polimerilor şi proteinelor. MALDI).prin procedeul cu ion negativ. APCI)  Ionizare prin bombardament cu atomi rapizi (fast atom bombardment. Cromatografia de lichide este folosită la analiza unor compuşi polari şi nevolatili şi prin urmare necesită alte moduri de ionizare. Ionizarea ESI este o metodă blândă de producere a ionilor. Pulverizare electronică (electrospray ionization.icmpp. Pe măsură ce solventul se evaporă şi raza picăturii se micşorează.ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD. sunt produşi ioni moleculari cvasistabili care nu sunt fragmentaţi în timpul analizei. încărcarea electrică este transferată moleculei de analizat. aceste tehnici de ionizare sunt utilizate cu precădere în cromatografia de gaze. În urma ionizării. TSP)  Ionizare chimică la presiune atmosferică (atmospheric-pressure chemical ionization. tot eluentul este introdus prin intermediul acesteia în masa spectrometrului. Temperatura joacă un rol .

Pentru a nu se diminua performanţa tehnicii FAB. datorită energiei termice mari utilizată la generarea de ioni. proba dizolvată într-o matrice lichidă (glicerina) este bombardată cu un fascicul de atomi (Xe) de energie foarte înaltă. APCI poate ioniza compuşi relativ nepolari. de preferinţă post-coloană. cu mase de până la 500000 dalton (Ardrey. fapt ce ar conduce la creşterea fundalului spectral (Ardrey. APCI nu produce ioni cu sarcini multiple şi nu este potrivită pentru analiza compuşilor cu mase moleculare mari cum ar fi proteinele. 2002). pentru a produce un ion ţintă care poate fi transmis către analizorul de masă. Spectrele obţinute prin APCI sunt similare cu cele obţinute prin pulverizarea electronică prin metoda ioni pozitivi când rezultă ionii [M+H]+. Ionizarea MALDI se realizează prin impactul fotonilor de energie ridicată asupra probei plasate într-o matrice organică solidă. Ionizarea APCI este o tehnică în care fluxul de eluent provenit din coloana cromatografică este dispersat în picături mici datorită temperaturii şi a unui gaz nebulizator. Matricea se adaugă la eluentul HPLC. Ionizarea are loc la impactul atomilor cu matricea din care sunt expulzaţi ionii compusului de analizat. pentru a nu influenţa procesul de separare. METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC-MS) . nestabile termic. 2002). 2003). Mecanismul de formare al ionilor implică un transfer de sarcină speciilor între un ion reactiv şi o moleculă ţintă.important şi de aceea trebuie riguros controlată şi menţinută la parametri optimi de funcţionare a interfeţei (Gocan. Totuşi. în timp ce prin metoda ioni negativi sunt produşi ionii [M-H] -. conţinutul matricei din faza mobilă nu trebuie să depăşească procentul de 5%. Se aplică moleculelor polare. În tehnica de ionizare FAB. Spre deosebire de pulverizarea electronică. 2003). cu un domeniu al maselor moleculare de la 100 la 2000 dalton (Gocan.

Dacă la capătul superior al coloanei se introduce amestecul de separat în stare de vapori. He. N 2 . studiile ulterioare au revoluţionat chimia separărilor.. toate metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS. Tehnica cromatografiei gazoase cuplată cu spectrometria de masă se bazează pe natura şi distribuţia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea componenţilor probei cu electroni de o anumită energie. prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE (Gentili şi col. cromatografia gazoasă realizează separarea substanţelor volatile pe baza adsorbţiei sau repartiţiei lor într-o fază staţionară (solidă sau lichidă) şi o fază mobilă gazoasă ( un gaz sau un amestec de gaze). Dacă proba analizată este nevolatilă. din librăria de spectre. cât şi pentru soluţii lichide şi solide volatile. se pot folosi tehnicile de derivatizare sau piroliză GC (Grob şi Barry. CO 2 ) care nu sunt reţinute de faza staţionară. menţinându-se un echilibru între cantitatea reţinută în faza staţionară şi cantitatea din faza mobilă. Spectrometria de masă este cea mai performantă şi sigură tehnică de identificare a compuşilor. În funcţie de natura fazei staţionare. În prezent. nevolatil la temperatura de lucru. fiecare component va fi separat la . Ar. 2004). gaz cromatografia se poate diviza în cromatografie gaz-solid (GSC) şi cromatografie gaz-lichid (LGC). trebuie confirmate prin spectrometrie de masă. Dintr-un amestec de substanţe. întrucât face posibilă compararea numerelor de masă obţinute cu numerele de masă a unor compuşi cunoscuţi. iar în al doilea caz suportul este legat chimic de o peliculă de lichid nepolar cu tensiune de vapori mică. Datorită acestui fapt. Faza mobilă se deplasează de-a lungul coloanei prin porii fazei staţionare. Principiul cromatografiei gazoase Ca principiu de funcţionare. GC poate fi utilizată atât pentru probe gazoase. fiecare component al amestecului va fi transportat diferenţiat de gaz. În primul caz. faza staţionară introdusă în coloana cromatografică este adsorbant sau suport polar activ. Faza mobilă este constituită din gaze inerte (H 2 .Dacă gaz cromatografia era la început aplicată doar analizelor compuşilor volatili. 2005).

în funcţie de natura componenţilor de separat. detectorul şi înregistratorul. În figura 5 este redată schema de principiu a unui gaz cromatograf. Se disting două tipuri de coloane: coloane cu umplutură ce conţin suporturi solide şi care pot fi . coloana de separare situată într-un cuptor termostatat. debitul fazei mobile şi presiunea în coloană sunt constante) sau în sistem de gradient (variază unul sau doi dintre parametri. Schema de principiu a unui gaz cromatograf Coloanele cromatografice sunt foarte diverse. Un cromatograf de gaze conţine următoarele componente principale: butelia cu gazul transportor. Între factorii care pot influenţa capacitatea separării se numără: numărul de talere teoretice din stratul cromatografic. cu lungimi. Fig. factorul de separare şi volumul de retenţie a componentelor (Socaciu. Separarea se poate face în sistem izoterm şi izobar (temperatura. compoziţii diferite. 2000). de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului purtător). cât şi de programarea temperaturii (separarea compuşilor condensaţi în capul coloanei pe baza punctelor de fierbere).timpi de retenţie (t R ) diferiţi. Efluentul care părăseşte coloana este analizat de un detector care permite trasarea cromatogramei: variaţia concentraţiei fiecărui component eliminat din coloană în funcţie de timpul de retenţie pe coloană sau variaţia concentraţiei în funcţie de volumul efluentului. Separarea compuşilor este realizată atât de stratul activ al coloanei. injectorul. diametre. 5.

separarea este mai performantă. site moleculare. Pentru a elimina proprietăţile absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau acoperirea suportului cu polivinilpirolidonă (PVP). analiza se realizează la temperaturi mai mari decât în GLC. Coloanele capilare sunt net superioare celor cu umplutură.dioxipropionitril (cel mai polar). silicat de Mg. Umplutura coloanelor clasice depinde de tipul cromatografiei. pământul de diatomee. pentru a opune rezistenţă cât mai mică amestecului de separat. polietilenă microporoasă. În alegerea fazei staţionare trebuie să se ţină seama de tipul substanţelor de separat (polaritate. etc. ca fază staţionară sau pot fi tapetaţi cu o fază staţionară. zeoliţi. sticlă. Numărul de talere teoretice este proporţional cu lungimea coloanei. Suportul impregnat cu lichid este încălzit într-un curent de gaz inert la o temperatură apropiată de cea de separare. . în care pereţii interiori pot fi folosiţi ca atare. pudra de teflon. cu teflon sau argintare. Diametrul interior influenţează viteza optimă a gazului transportor. de capacitatea de adsorbţie pe suport.). iar suporturile mai puţin poroase sunt: bile de sticlă. astfel în GSC se folosesc faze staţionare active: cărbune activ. larga lor utilizare datorându-se eficienţei ridicate de separare a acestora. S-a făcut o scală de selectivitate a lichidelor staţionare care începe cu squalenul (nepolar) şi se încheie cu β. Faza staţionară în GLC este constituită dintr-un suport inactiv. Cu cât diametrul coloanei este mai mic. Al. Înălţimea unui taler teoretic este proporţională cu diametrul particulelor. Este important ca particulele să aibă dimensiuni apropiate. de interacţiunile chimice posibile cu faza staţionară sau faza mobilă. Întrucât energiile de absorbţie sunt mai mari decât energiile de disociere. deci pentru separări optime se folosesc coloane lungi. legături de hidrogen. capacitatea de lucru a coloanei şi cantitatea maximă de material separat. Diametrul interior al coloanelor este de 2-500mm pentru coloanele clasice şi <1mm pentru coloanele capilare. alumină.analitice sau preparative în funcţie de lungime şi coloane capilare construite dintrun tub de oţel moale sau Cu. grafit. produsele Brique C 22 . poros (suprafaţa specifică de 1-10 m 2 /g) impregnat 5-20% cu un lichid. Faza staţionară astfel constituită este repartizată uniform ca peliculă subţire pe pereţii coloanei. silicagel. celita. sticlă poroasă. β’. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau P.

Injectarea probei poate fi făcută cu sau fără splitare. Diametrul interior este de 0. realizânduse aproximativ 10000 talere teoretice.Umplerea coloanei se face sub vid. care are practic semnificaţia unei diluţii. de separare a componenţilor şi de evaluare calitativă şi cantitativă a componenţilor separaţi. ci printr-o cameră de injectare a cărei formă şi volum influenţează mult separarea. Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale în care faza staţionară nu este fixată pe suport. În calculul concentraţiilor componenţilor determinaţi se va ţine seama de raportul de splitare. creşte înălţimea unui taler şi picurile devin asimetrice şi cu lăţime mare. Analiza cantitativă se face prin integrarea picurilor şi calculul ariilor acestora. iar lungimea de 20-50m.25-0. o parte va fi direcţionată în exteriorul cromatografului. Pentru compuşii mai volatili decât solventul este obligatoriu să se lucreze cu splitare: o parte din extractul de injectat va intra în coloană. Pentru a exprima în valori absolute cantitatea fiecărei componente din amestec. Analiza unei probe implică etapele de pregătire a probei. Când coloanele sunt supraîncărcate. toată cantitatea injectată intră în coloana cromatografică. Proba nu se introduce direct în coloană. permiţând evaporarea probei. se reduce numărul de talere teoretice. Acest procent este proporţional cu ponderea fiecărei componente în amestec. În cel de-al doilea caz. Practic se realizează o peliculă foarte subţire prin evaporarea fazei staţionare lichide. . fiind repartizată uniform pe pereţii interiori ai coloanei.5mm. Această cameră are o temperatură mai mare decât coloana. 2000). Volumul probei trebuie să fie cât mai mic. iar condiţionarea ei constă în încălzire sub curent de gaz purtător la temperatură înaltă pentru a îndepărta impurităţile volatile. trebuie determinată concentraţia totală a substanţelor în amestec şi apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculează concentraţia fiecărei componente (Socaciu. exprimate ca procent din totalul picurilor. Analiza calitativă presupune identificarea fiecărui pic din cromatogramă.

Detectorul trebuie să deosebească o proprietate oarecare a componentului de analizat faţă de gazul purtător. eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen şi este aprins la capătul unei duze din oţel inoxidabil. Există detectori universali. presiune. Apariţia în flacără a unui compus organic măreşte intensitatea . La ieşirea din coloană. Cele mai importante tipuri de detectori sunt: 1. Creând un câmp electric între duză şi un electrod colector aşezat deasupra flăcării. Caracteristicile detectorului: • sensibilitate cât mai mare pentru a putea detecta chiar şi urmele de componenţi şi pentru a nu fi necesară încărcarea coloanei cu cantităţi mult prea mari de probă • viteză de răspuns cât mai mare • liniaritate: sensibilitatea detectorului să rămână constantă într-un domeniu larg de concentraţii • limită de sensibilitate ( concentraţia minimă de substanţă în eluent pentru care se obţine un pic) cât mai joasă • stabilitate: linia de fond şi reproductibilitatea să fie cât mai puţin afectate de condiţiile de lucru (temperatură. 1981). făcând parte din categoria detectorilor universali. este nedestructiv. sensibili la un număr mare de componenţi şi specifici.Detectori utilizaţi în cromatografía gazoasă Detectorul pune în evidenţă componentele separate pe coloana cromatografică.. Detectorul de conductibilitate termică (DCT) a fost primul care a apărut. 2. sensibili numai la anumiţi componenţi (la anumite grupări funcţionale sau legături chimice). Se mai numeşte şi catarometru. putând fi utilizat şi în cromatografia preparativă. sub forma unor semnale electrice care pot fi înregistrate. debit. Principiul de funcţionare se bazează pe diferenţa de conductibilitate termică dintre component şi eluent. se stabileşte un curent slab (10-14 A) între cei doi electrozi prin flacără. Principiul de funcţionare constă în măsurarea conductibilităţii electrice a unei flăcări de hidrogen în prezenţa unui compus organic. etc) (Liteanu şi col. Detectorul cu flacără de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai mult folosit în GC.

Sursa de ionizare constă din tritiu sau Ni63 radiocactiv. stabilitate pe termen lung. 5. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la bază ionizarea fotonică a moleculelor probei şi măsurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector cuplat cu un electrometru. Azotul se utilizează ca gaz purtător şi produce prin iradiere electroni şi ioni pozitivi: N2 →N2 + +eDatorită mobilităţii ridicate a electronilor liberi. cu mase diferite.→[moleculă neutră] Detectorul ECD are avantajul selectivităţii şi sensibilităţii foarte ridicate. . nu are loc recombinarea lor cu ionii pozitivi. Procesele se desfăşoară în sursa de ionizare a spectrometrului. ionii formaţi prin iradiere vor fi colectaţi. cum ar fi compuşii conţinând halogeni. Spectrometrul de masă (MS): în urma ionizării în vid a moleculelor substanţei de analizat. Mulţi compuşi de interes biologic prezintă proprietatea de a capta electroni sau posilitatea de a fi derivatizaţi cu compuşi care au această proprietate. simplitate în operare şi întreţinere. Ionii formaţi sunt separaţi în funcţie de masa lor în analizorul de masă şi apoi sunt detectaţi şi înregistraţi. 3. 4. Detectorul cu captură de electroni (ECD) prezintă o mare sensibilitate pentru compuşii capabili de captură de electroni. Reprezentarea abundenţei lor (concentraţiei relative) în funcţie de masă constituie spectrul de masă. Prezenţa unor molecule cu afinitate ridicată pentru captarea electronilor liberi favorizează formarea ionilor negativi: [component] + e. Prin aplicarea unui câmp electric între electrozii camerei de ionizare. are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni caracteristici.→[component]Ionii negativi se recombină cu ionii pozitivi mult mai uşor decât electronii liberi: N2 + + [component]. răspuns al semnalului rapid.curentului datorită ionizării acestuia în funcţie de natura şi concentraţia componentului respectiv. Acest curent va fi amplificat şi apoi înregistrat. Ionizarea moleculelor poate avea loc în două modalităţi: prin impact electronic (EI) şi ionizare chimică (CI). Detectorul FID are o sensibilitate înaltă.

Această tehnică este ionizarea chimică. Fragmentele de molecule neutre şi de ioni formaţi nu se vor ciocni între ei. Primul ion care se formează în urma impactului este aşa-numitul ion molecular. Întrucât electronii la 70eV au energie suficientă pentru a rupe orice legatură din moleculă. În consecinţă. a devenit necesară utilizarea unei tehnici de ionizare mai blânde. Gazul reactiv poate să înlocuiască gazul purtător în GC-MS şi poate fi introdus direct în sursă. stabilitatea ionului molecular este aşa de redusă (el se va fragmenta mai departe) încât. Electronii proveniţi de la un filament încălzit sunt focalizaţi în timp ce străbat camera şi colectaţi de un electrod având un potenţial de 70V. Acesta îi conferă fiecărui electron o energie de 70eV. Spectrele de masă cu ionizare chimică sunt produse prin reacţii ionmoleculare între moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) şi o presiune ridicată (0. Spectrul de masă obţinut în asemenea condiţii va fi reproductibil şi caracteristic pentru compusul respectiv. Dacă în camera de ionizare se introduce o substanţă într-o cantitate suficientă ca presiunea să crească la 10-5torr. ciocnirile dintre electroni şi moleculele compusului respectiv determină fragmentarea acestora. fiind posibilă aşadar îndepărtarea lor din camera de ionizare şi colectarea ionilor de mase diferite în detector. introdusă în anul 1966. Întrucât concentraţia gazului reactiv este cu câteva ordine de mărime peste concentraţia . Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei şi la obţinerea unui amestec complex de ioni a căror masă si abundenţă relativă se poate utiliza pentru identificarea calitativă a compuşilor respectivi. abundenţa sa relativă va fi foarte mică şi identificarea de cele mai multe ori imposibilă. prin fragmentare se vor forma toţi ionii posibili. prin care să se obţină informaţii despre masa moleculară. care are mare importanţă în identificarea substanţei deoarece are aceeaşi masă cu masa moleculară a compusului respectiv. Din cauza presiunii scăzute din camera de ionizare. Din păcate însă. de 10-8 torr.Ionizarea prin impact electronic În camera de ionizare se realizează un vid înaintat. cu puţine efecte asupra rezoluţiei cromatografice.2-2 torr) a plasmei de ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau izobutan). ci numai cu pereţii camerei. numai o moleculă din aproximativ 10 6 va realiza ciocnirea şi ionizarea.

dar în practică se utilizează reprezentarea fiecărui pic sub forma unei linii.php). Celei mai înalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100. obţinându-se concentraţia diverselor fragmente ionice ca valori de abundenţă relativă (Gocan. realizându-se ionizarea probei. iar restul sunt exprimate ca procente faţă de aceasta. http://www. fasciculul de electroni ionizează gazul reactiv cu puţine molecule ale probei ionizate direct. dar s-au dezvoltat şi cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai mică.scritube. Deoarece sursa este operată la presiune înaltă comparativ cu sursa EI. abundenţa ionului molecular faţă de alte fragmente rezultate va fi mare şi mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu. Separarea ionilor formaţi are loc în analizorul de masă. 1990. Majoritatea tehnicilor de ionizare chimică lucrează cu ioni pozitivi. Ciucanu.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182. Spectrele de masă pot fi înregistrate sub formă de picuri cu maxime (forma originală a spectrului). reacţiile ion-molecule sunt favorizate. . 1998. ionizarea chimică prezintă dezavantajul că oferă rezultate mai puţin reproductibile şi nu este posibilă alcătuirea unei librării de spectre care să fie folosită în scopuri de identificare.3. Comparativ cu ionizarea prin EI.probei. Aceste reacţii au loc cu energie mică în comparaţie cu impactul direct cu electroni. tipurile cele mai uzuale fiind cele magnetice şi cu cuadrupol descrise în capitolul 3.3.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->