Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr.

4, Decembrie 2006

45

Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear - cteva aplicaii n cercetarea medical

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Some Applications in Medical Research Lorena Ivona tefan*
Spitalul Clinic de Urgen Craiova Secia Laborator Analize Medicale, Departament Biochimie

Rezumat
Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear este o metod de analiz folosit n principal la determinarea structurii compuilor chimici n stare pur (dup o izolare prealabil). Avantajul principal al spectroscopiei RMN l reprezint faptul c pune n eviden un profil global al probei. Posibilitatea de a obine un profil chimic global al probei dovedete c aceast metod poate deveni un instrument important pentru stabilirea diagnosticului medical. Aceast metod poate fi folosit pentru caracterizarea fluidelor biologice, a strii esuturilor i pentru a investiga efectele toxice ale preparatelor medicamentoase n organele int. Fenomenul fizic central al spectroscopiei de rezonan magnetic nuclear: absorbia i emisia de energie de ctre nuclee ce au numr cuantic de spin semintreg (conin numr impar fie de protoni, fie de neutroni) i, care se comport ca dipoli magnetici atunci cnd sunt plasai ntr-un cmp magnetic exterior, nuclee ca cele de 1 H, 31P, 19F sau 13C. n acest referat gsim cteva dintre aplicaiile metodei spectroscopiei de rezonan magnetic nuclear n domeniul cercetrii medicale. Cuvinte cheie: spectroscopia de rezonan magnetic nuclear, fluide biologice, compui organici.

Abstract
Magnetic resonance spectroscopy is one of the most powerful technique for structure elucidation of a mixtures compounds. The possibility of obtaining a global chemical profile of the sample proves that this method might represent an eligible technique for screening tests and also an important tool for medical diagnosis. This method can be used to characterize biological fluids, the tissue state and to investigate toxic effects of medical preparations in the target organs. The central physical phenomena of nuclear magnetic resonance spectroscopy : is the absorbtion and emission of energy due to the property of some atomic nuclei, which have the spin number equal to (odd number of proton and/or neutrons) to behave like microscopic bar Adresa pentru coresponden: Craiovia Nou Bl.8, Ap.32, Craiova, Dolj, 1100. Telefon mobil : 0726/314845, E-mail: stefan_lorena@k.ro sau lorenaivona@yahoo.com. Adresa serviciu: Spitalul Clinic de Urgen Craiova, Secia Laborator Analize Medicale, B-dul 1 Mai, Nr. 60, Craiova, Dolj 1100.
*

46

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr. 4, Decembrie 2006

magnets if we apply an external magnetic field, atomic nuclei like 1H, 31 P, 19F or some applications of nuclear magnetic resonance spectroscopy in medical research. disease.

13C.

In this paper we found

Keywords: Nuclear magnetic resonance spectroscopy, biological fluids, organic compounds, cancer

Spectroscopia de rezonan magnetic a protonului, ca tehnic biofizic de investigaie, combin perimetre de interes care altur cercettori din domeniile biochimiei, fiziologiei i investigaiei clinice, ceea ce i confer o larg aplicativitate i implicit un interes interdisciplinar. Introdus n 1946 de ctre Bloch i Purcell, metoda de investigaie prin spectroscopie de rezonan magnetic nuclear reprezint n momentul actual una dintre cele mai noi i destul de puin exploatate metode de explorare a fluidelor biologice, configurnd totodat un teren tiinific promitor sub aspectul posibilitilor de valorificare a descoperirilor n domeniul medicinii i n spe n cel al dezordinilor metabolice majore ce nsoesc anumite boli1. Potenialul clinic i al aplicaiilor medicale sunt o achiziie de dat recent a studiilor de spectroscopie RMN de nalt rezoluie. Nu mai departe de 1957, Erick Odebland, un cercettor suedez fiziolog i ginecolog, a folosit pentru prima dat spectroscopia RMN a protonului n studiul fluidelor biologice umane1. Spectrele realizate de el pe un aparat de 21 MHz pe fluide biologice, precum saliva, laptele uman, film lacrimal, mucus cervical i snge, erau relativ neinformative, dar au constituit punctul de plecare al unui departament pentru studii medicale folosind RMN1. n anii 1970 introducerea transformatei Fourier n spectroscopie mpreun cu tehnicile avansate (puterea cmpului, secvenele de puls, calculatorul) a permis folosirea RMN pentru determinarea i identificarea diferitelor specii chimice n sistemele biologice1. n 1979, Ohsaka i colaboratorii au prezentat spectre de rezonan magnetic a protonului pentru fluidele corpului uman i au ncercat un serodiagnostic al cancerului4. Spectrele

lor constau n semnale ascuite pentru metabolii cu mas molecular mic, cu un semnal evident al lactatului ca un criteriu de diagnostic al cancerului4. Acesta a fost urmat de un studiu de rezonan magnetic pentru probe biologice provenite de la pacieni diabetici si cu insuficien renal 8. Au fost observate schimbri clare n concentraia unor metabolii8. Cel mai puternic cmp magnetic folosit n aceste studii i care din punct de vedere comercial este utilizabil a atins deja frecvena de 800 MHz, iar temperatura maxim la care se poate realiza o analiz a probei n dispozitive specializate este de aproximativ 2000C, folosind sisteme laser de nclzire, iar cea mai mare presiune la care se poate realiza o astfel de determinare este de 10 000 atmosfere. Toate aceste performane tehnice nu fac dect s certifice c ne aflm n faa unui domeniu de cercetare a crui dezvoltare este un argument n favoarea extinderii aplicaiilor metodei1. Tipuri de fluide biologice investigate prin tehnica spectroscopiei de rezonan magnetic nuclear a protonului Pe lng studiul urinii, care este unul dintre cele mai uor de manipulat fluide biologice datorit coninutului proteic sczut, precum i datorit faptului c reflect capacitatea funcional a rinichilor de a excreta substane de origine endogen sau exogen, extinderea studiilor asupra celorlalte fluide biologice dimensioneaz o sfer de aplicativitate n continu extindere a metodei8. Lichidul cefalorahidian Compoziia chimic a acestei probe biologice reflect starea metabolic a sistemului

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr. 4, Decembrie 2006

47

nervos central. Concentraia n proteine a acestui lichid este foarte sczut, ceea ce faciliteaz folosirea acestei metode i elimin procedeele suplimentare de supresie tehnic a semnalului proteinelor. Concentraiile determinate folosind metoda de spectroscopie de rezonan magnetic a protonului pentru principalii metabolii prezeni n lichidul cefalorahidian (lactat, alanin, glutamin, citrat, creatin, creatinin, glucoz, inozitol, piruvat i acetat) au fost comparate cu rezultatele determinrilor biologice clasice i s-a observat o concordan apreciabil a rezultatelor. Alterrile prezente n concentraiile acestor compui au fost folosite n scop clinic n interpretarea dezordinilor metabolice, terapiei medicamentoase sau infeciilor sistemului nervos central. De exemplu, spectroscopia de rezonan magnetic a protonului a evideniat modificri n cazul meningitei sau encefalopatiei portale datorate consumului exagerat de acetaminofen10. Prezena n lichidul cefalorahidian a unor metabolii specifici celulelor tumorale d posibilitatea identificrii tipului de cancer, furniznd informaii adjuvante pentru diagnostic, n condiiile imposibilitii de a decela prin practici imagistice tipul de afectare malign 10. Umoarea apoas Constituenii umorii apoase reflect procesele secretorii de la nivelul corpului ciliar, precum i procesele metabolice ce au loc la nivelul globului ocular. Informaiile cantitative i calitative privitoare la prezena i concentraia diferiilor metabolii, precum i cele privitoare la compuii adiaceni sunt utilizate n scopul decelrii patogenezei dezordinilor acestor structuri. Din cauza dificultilor de recoltare ale acestui fluid biologic (sunt necesari aproximativ 0,3 ml), msurtorile de tip multicomponent sunt relativ dificile. Au fost identificai prin RMN urmtorii compui: alanin, valin, glutamin, histidin si tirozin, dintre aminoacizi, precum i lactat, glucoz, citrat, creatinin i acid ascorbic3. Din cauza studiilor relativ recen-

te de identificare a compoziiei umorii apoase exist nc dificulti n ceea ce privete corelaiile cu patologia clinic3. Bila Bila reprezint un fluid excretoriu i secretoriu al ficatului, reprezentnd, asemeni plasmei, un fluid biologic deosebit de complex. Un spectru de rezonan protonic reprezint dezavantajul c prezint semnale de intensitate sczut datorate prezenei metaboliilor n cantiti mici1. Semnalele acestor compui sunt prezente pe fondul semnalelor determinate de prezena n cantitate mare a structurilor formate din fosfolipide, colesterol i acizi biliari1. Unul dintre artificii este acela de prelucrare a probei, care s confere posibilitatea de a crete concentraia acestor compui i implicit de a uura determinarea lor4. S-a realizat identificarea pe un model xenobiotic pe oareci a excreiei biliare a p-aminofenolului, fiind numeroase alte cercetri n studiu, avnd drept scop obinerea de informaii privitoare la capacitatea metabolic a ficatului, precum i a identificrii insuficienei hepatice4. Plasma sanguin Dintre toate fluidele biologice, plasma este unul dintre cele mai complexe amestecuri chimice, coninnd lipoproteine, proteine, glicoproteine, cationi si anioni, toate nsumnd cel puin 20 de compui identificabili prin spectroscopie de rezonan magnetic9. Rezonana magnetic a protonului genereaz un spectru de semnale dominat de anvelopa rezonanelor macromoleculelor proteice, crora li se adaug semnalele nguste generate de molecule de dimensiuni mici9. Acest spectru dificil de interpretat poate fi simplificat prin folosirea secvenelor spin-echo, care acioneaz asemntor unui filtru de mobilitate, ndeprtnd semnalele macromoleculelor, care sunt molecule ce se mobilizeaz cu dificultate din cauza mrimii lor, lsnd astfel spre detecie semnalele nguste

48

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr. 4, Decembrie 2006

ale moleculelor de dimensiuni mici9. Regiunea aromatic a spectrelor plasmei nu conine rezonane cu valori comparabile semnal-zgomot, iar regiunea compuilor alifatici conine semnale determinate de prezena lipoproteinelor, glicoproteinelor, a unor aminoacizi (alanin, valin, glutamin, treonin, leucin), lactatului, glucozei, creatinei, creatininei i acidului citric9. Contribuia macromoleculelor din compoziia plasmei la obinerea spectrului este relativ mic, pentru c proteinele plasmatice au dimensiuni mari, sunt globulare i se deplaseaz prin rotaie lent n soluie2. Cu excepia celor ale lipoproteinelor i a unor glicoproteine, semnalele produse sunt de intensitate joas sau cel mult medie. Semnalele puternice din regiunea 0.8-1.3 ppm a deplasrilor chimice au fost n mod iniial atribuite componentelor lipidice ale lipoproteinelor 2. Au fost, de asemenea, semnalate modificri caracteristice ale acestor semnale n plasma diferitelor specii animale2. Relativ recent a fost raportat banda de rezonan a moleculelor lipidice ca fiind cuprins ntre 0.8 i 1.2 ppm, delimitarea fiind realizat prin compararea semnalelor din plasma pacienilor cu cancer cu a subiecilor normali, n cazul primilor identificndu-se semnale bine individualizate datorate lipoproteinelor, determinare ulterior infirmat prin nereproductibilitatea determinrii n cazul pacienilor cu boal canceroas5. Bell si colaboratorii si au artat ulterior c semnalele datorate lipidelor includ contribuia diferitelor tipuri de lipoproteine 2. Folosind experimente cu serii de impulsuri de tip single puls sau spin echo a fost posibil determinarea contribuiilor diferitelor componente ale moleculelor lipidice, precum VLDL, LDL, HDL i ale chilomicronilor n cadrul semnalului compact al lipidelor plasmatice2. Proteinele i colesterolul din compoziia lipoproteinelor furnizeaz semnale de intensitate mic i cel mult medie, fiind de asemenea molecule cu mobilitate sczut2. Concluzia celor mai multe studii a fost

aceea c identificarea semnalului spectroscopic al lipoproteinelor nu poate fi considerat un marker al bolii canceroase, dar ne poate furniza informaii structurale i clinice importante despre lipoproteine 2. Semnalele cuprinse n intervalul 2.042.08 ppm au fost atribuite regiunii glicoproteinelor plasmatice cu mare mobilitate. Aceste semnale sunt generate n special de protonii din gruprile N-acetil sau din carbohidraii N-acetilai (N-acetil glucozamin, acid N-acetilneuraminic), crora li se asociaz proteinele de faz acut plasmatice i glicoproteine, precum transferina. Intensitatea acestor semnale a fost determinat ca fiind crescut n cazul unor afectri care presupun o cretere a proteinelor de faz acut, precum cancerul, strile infecioase sau sarcina, traumatismele 2. Multe din moleculele cu greutate mic sunt constitueni care particip la realizarea semnalului produs de plasm, iar dintre cei mai importani am putea enumera: aminoacizii, glucoza, acetatul, citratul, creatina, creatinina i lactatul1. S-a putut realiza o bun corelaie ntre studiile clasice biochimice i cele de spectroscopie de rezonan magnetic a protonului, incluznd detecia acestor metabolii n stri patologice diverse, precum supradozrile medicamentoase, insuficiena renal, hepatic, diabet cu cetoacidoz, sau pentru monitorizarea intrrilor i ieirilor micilor molecule ale plasmei n cazul procedeelor de dializ9. Datorit numeroilor compui care sunt n mod natural legai de macromolecule plasmatice, identificarea lor poate fi de multe ori ngreunat i, de aceea se impune din ce n ce mai des folosirea agenilor disruptivi sau procedeelor de extracie, ceea ce d posibilitatea att a identificrii i msurrii lor corecte, ct i crearea premizelor pentru studii de legare plasmatic sau a celor care delimiteaz design-ul metabolic al unui anumit medicament 5.

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr. 4, Decembrie 2006

49

Alte fluide biologice Spectroscopia de rezonan magnetic a protonului a fost folosit ca tehnic de investigare si a altor numeroase fluide biologice, incluznd plasma seminal, sudoarea, lichidul amniotic, saliva. Identificarea acestor semnale a fost realizabil doar prin folosirea tehnicilor bidimensionale1. Plasma seminal, mediul de transport al spermatozoizilor, conine un numr foarte mare de metabolii n concentraii milimolare. Cele mai nalte semnale din aceast prob sunt datorate prezenei glicerofosfocolinei, fosfocolinei, citratului, lactatului i aminoacizilor 1. Schimbrile intervenite n prezena sau concentraia acestor metabolii pot reprezenta un marker foarte important al disfunciilor legate de infertilitate sau de mobilitatea spermatozoizilor. Astfel, a fost identificat reducerea intensitii semnalului produs de colin la pacienii vasectomizai1. Aplicarea spectroscopiei de rezonan magnetic la studiul altor fluide biologice, precum lichidul amniotic, sudoarea, lichidul sinovial, a constat mai ales n ncercarea de a identifica componentele endogene ale acestor probe, pentru a deschide perspectiva unor ulterioare aplicaii in studiul diferitelor patologii 5.

Folosirea metodei Spectroscopiei de Rezonan Magnetic Nuclear n studiul cancerului

Unul dintre cele mai importante motive pentru care s-a ncurajat dezvoltarea acestei ramuri de cercetare biologic a fost perspectiva deosebit de promitoare a folosirii metodei n clinica medical. Prin aceast metod se crea n sfrit posibilitatea de a detecta schimbrile chimice de la locul afeciunii, precum i monitorizarea reflectrii lor n fluidele biologice. Cnd simptomele unui pacient sugereaz dezvoltarea unei mase tumorale, ceea ce este

foarte important, este posibilitatea de a decela caracterul benign sau malign al afeciunii, metoda imagisticii de rezonan magnetic nuclear fiind considerat una dintre tehnicile cele mai performante n decelarea tumorilor, avnd limit de rezoluie de civa milimetri6. Pentru folosirea spectroscopiei RMN este necesar cunoaterea topografiei malignitii pentru ca spectrul s fie generat de zona incriminat 6. Ca i metod non-invaziv, spectroscopia RMN este capabil s investigheze compoziia chimic a unei mase tumorale, cu dificulti uneori n decelarea caracterului malign sau benign al leziunii 6. O mare parte dintre celulele tumorale conin o cantitate mai mare de fosfocreatinin, care poate fi detectat printr-un spectru de 31P. Capacitatea secretorie a celulelor tumorale este diferit, n funcie de gradul lor de specificitate. Intensitile masive ale spectrelor fosfodiesterilor, fosfailor anorganici, fosfomonoesterilor, nucleozide trifosfate, sunt cele care au determinat considerarea acestor compui ca posibili martori ai metabolismului celulei maligne 6. O alt important aplicativitate a metodei poate fi considerat aceea a posibilitii stadializrii prin metoda spectroscopiei 31P-RMN, care furnizeaz date importante cu privire la dezvoltarea tumorii primitive i a posibilei metastazri7. Ciclul de via tumoral a fost caracterizat din punct de vedere al semnalelor compuilor chimici celulari astfel: semnalele compuilor macroergici fosfatidici sunt predominante n stadiile iniiale de dezvoltare tumoral, scad aproximativ 1 sptmn, cnd devin predominante cele ale mono- i di-esterilor, pentru ca spectrul s evolueze ulterior spre unul caracteristic esutului necrotic7. n timpul dezvoltrii tumorale fosfocreatinina, care este un compus ce stocheaz energie, are valori crescute, n timp ce valoarea ATP-ului rmne constant, pn la consumul ei total, care genereaz creteri mai mult sau mai puin stoechiometrice

50

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 5, Nr. 4, Decembrie 2006

ale P anorganic7. Necroza tumorii duce la scderea semnalului fosfocreatininei precum i a adenin nucleotidelor 7. Spectroscopia de rezonan magnetic a protonului are avantajul unei sensibiliti cu un ordin de mrime superior celei a fosforului, precum i acela al prezenei numeroilor compui hidrogenai de interes clinic major 1. Prin metode speciale se elimin iniial semnalul produs de muchi sau de esutul gras, iar omogenitatea cmpului magnetic trebuie s fie calibrat foarte exact pentru a putea fi decelate semnalele compuilor cu mase moleculare mici7. A fost remarcat semnificaia creterii semnalului lactatului pentru metabolismul accentuat al celulei tumorale, precum i modificri n diferite proporii ale semnalelor datorate diferiilor compui, specifice anumitor tipuri de tumori6. Un alt aspect deosebit de important const n monitorizarea rspunsului la tratament antitumoral7. Rspunsul celulei tumorale la radioterapie depinde de concentraia de oxigen intracelular, care genereaz radicali liberi de oxigen, cei care reprezint cauza deteriorrii celulare. Scderea progresiv a compuilor macroergici este un aspect care nsoete scderea oxigenrii n celulele agresate de terapie. Din pcate, dimensiunea redus a micrometastazelor le face nedetectabile prin aceast metod 7. n concluzie, metoda spectroscopiei de rezonan magnetic este o metod important i promitoare pentru monitorizarea tumorilor n diferite stadii ale terapiei, fiind n acelai timp o metod clinic complet neinvaziv care d posibilitatea diferenierii maselor tumorale maligne de cele benigne, dnd uneori i posibilitatea predictibilitii eficienei terapiei aplicate sau posibilitii de rspuns pozitiv la radioterapie n cazul coninutului bogat n oxigen al ce-

lulelor tumorale7.

Bibliografie
Bell J.D., Brown C.C., Sadler P.J. - NMR studies of body fluids - NMR Biomed., 1989; 2: 246-256. 2. Bell J.D., Sadler P.J., Macleod A et al. 1H NMR studies of human blood plasma: assignment of resonances for lipoproteins FEBS Lett., 1997; 219:239-243. 3. Brown J.C.C., Sadler P.J., Spalton D.J. et al. Analysis of human aqueous humour by high resolution 1H NMR spectroscopy Exp.Eye Res, 1986; 42: 357-362. 4. De Certaines J.D., Bovee W.M.M.J., Podo F., Magnetic Resonance Spectroscopy in Biology and Medicine - Pergamon Press, Oxford, 1992: 437-477. 5. De Certaines J.D. Magnetic Resonance Spectroscopy of bodyfluids: a new tool in clinical biology Singapore: World Scientific Publishing , 1989: 114-1138. 6. Fossel E.T., Carr J.M., McDonagh J. - Detection of malignant tumours: water suppressed 1H NMR spectroscopy of plasma - N. Engl. J. Med., 1986; 315:1369-1376. 7. Griffiths J.R., - NMRS in the Cancer Clinic New York: Annals of The New York Academy of Sciences , 1992; 508: 176-199. 8. Nicholson J.K., Flynn M.P., Sadler P.J., et al. Proton-nuclear-magnetic-resonance of serum, plasma and urine from fasting normal and diabetic subjects J.Biochem., 1984; 217: 365375. 9. Nicholson J.K., Foxall P.J.D., Spraul M. 750 MHz 1H and 1H - 13C NMR spectroscopy of human blood plasma Analyical Chemistry, 1995; 67: 793-811. 10. Petroff O.A.C., Yu R.K., Ogino T., - High resolution proton nuclear magnetic resonance studies of human cerebrospinal fluid J.Neurochem, 1986; 47: 1270-1276. 1.