UNIVERSITATEA TEHNIC

,,GHEORGHE ASACHIdin IASI

coala Doctoral a Facultii de
Inginerie Chimic i Protecia Mediului

EXTRACIA I CARACTERIZAREA UNOR COMPUI BIOACTIVI

DIN MATERIALE VEGETALE UTILIZAI N DOMENIU
FARMACEUTIC SAU COSMETIC
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific:

Doctorand:

Prof. univ. dr. ing. Popa Ionel Marcel

ing. Draganescu Dan

- IAI, 2014 -

Activitatea experimental din cadrul stagiului de doctorat i finalizarea acestei teze sau efectuat n cadrul Proiectului POS-CCE 210/2010, Plantele liberiene, resurse regenerabile
strategice pentru economia european, acronim BASTEURES, desfurat n cadrul
Institutului de Cercetare-Dezvoltare-Inovare n tiine Tehnice i Naturale al Universitii
Aurel Vlaicu din Arad, finanat din fonduri structurale de ctre Comunitatea European i
Guvernul Romniei n perioada 2010-2013.

Proiect cofinanat de UNIUNEA EUROPEAN prin Fondul European de

Dezvoltare Regional Programul Operaional Sectorial Creterea Competitivitii
Economice
Investii n viitorul dumneavoastr
Proiect POS-CCE, Axa 2, Operaiunea .2.1.2.
Plante liberiene resurse regenerabile strategice pentru economia european
Contract nr. 210/2010
Valoarea proiectului: 6.842.915 RON
Termen de finalizare: 20 Iulie 2013
Valoarea contribuiei comunitare: 4.979.998,34 RON
Valoarea contribuiei Guvernului Romniei: 1.019.999,66 RON
Beneficiarul proiectului: UNIVERSITATEA AUREL VLAICU ARAD
INSTITUTUL DE CERCETARE DEZVOLTARE
INOVARE N TIINE TEHNICE I NATURALE
AL UAV

Mulumiri
Cu deosebit respect i profund recunotin i adresez sincere mulumiri domnului
Prof. dr. ing. Marcel Ionel Popa pentru rolul avut n formarea mea ca i cercettor. De
asemenea, doresc s i mulumesc pentru efortul depus, profesionalismul, exigena, rbdarea
i ncurajrile acordate pe ntreaga perioad de desfurare a studiilor doctorale.
Adresez alese gnduri de mulumire doamnei Dr. ing. Doina Hricu pentru sfaturile
utile, ndrumrile tiinifice, sprijinul i ncurajrile oferite.
Sincere mulumiri doamnei Dr. ing. Cecilia Srghie pentru sprijinul i ncrederea
acordat, precum i pentru rbdarea i atenia acordate analizei acestei lucrri i pentru
sugestiile formulate.
Mulumesc membrilor comisiei, domnului Prof. dr. ing. Marcel Popa i doamnei Prof.
dr. farm. Lenua Profire pentru rbdarea i efortul depus n evaluarea i formularea
sugestiilor cu privire la teza de doctorat.
Mulumiri colaboratorilor i colegilor care n mod direct sau indirect m-au ajutat i
m-au ncurajat.
Mulumiri familiei i prietenilor care m-au susinut pe parcursul elaborrii tezei de
doctorat.

CUPRINS
PARTEA I. Stadiul actul al cercetrilor n domeniul abordat
CAPITOLUL I. LIGNANII DIN SEMINELE DE IN I EFECTELE LOR ASUPRA
SNTII............................................................................................................................... 3
I.1. Inul ................................................................................................................................... 3
I.2. Lignanii din seminele de in ............................................................................................. 7
I.3. Biosintez i biodisponibilitate ...................................................................................... 10
I.4. Metabolism i efecte fiziologice .................................................................................... 12
I.5. Efectele terapeutice a lignanilor din semine de in ........................................................ 15
I.5.1. Cancer de prostat ................................................................................................... 17
I.5.2. Cancer de sn .......................................................................................................... 18
I.5.3. Cancer ovarian i endometrial ................................................................................ 20
I.5.4. Boli cardiovasculare................................................................................................ 21
I.5.5. Osteoporoz ............................................................................................................ 24
I.5.6. Diabet zaharat ......................................................................................................... 27
I.5.7. Sindrom metabolic .................................................................................................. 29
I.5.8. Alte beneficii ........................................................................................................... 31
I.5.9. Activitate antioxidant ............................................................................................ 33
I.5.10. Capacitate animicrobian ...................................................................................... 35
I.6. Metode de extracie i caracterizare a lignanilor ........................................................... 37
PARTEA II. Contribuii originale
CAPITOLUL II. EXTRACIA I CARACTERIZAREA LIGNANILOR I A
COMPUILOR FENOLICI ..................................................................................................... 51
II.1. Materiale i metode ...................................................................................................... 51
II.1.1. Materiale ................................................................................................................ 51
II.1.2. Precondiionarea materialului vegetal ................................................................... 52
II.1.3. Metode de extracie a lignanilor i a compuilor fenolici din materialul vegetal
rezultat n urma presrii la rece a seminelor de in .......................................................... 54
II.1.3.1. Extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic (E1; E2) ....................... 54
II.1.3.2. Extracia n intalaia Soxhlet cu alcool etilic (ESx) ......................................... 54
II.1.3.3. Extracia asistat cu ultrasunete (US) .............................................................. 54
II.1.3.4. Extracia n instalaia Soxhlet cu aceton (EA) ................................................ 55
II.1.3.5. Extracia n mediu alcalin (EBA) ..................................................................... 55
II.1.4. Hidroliza bazic, acid sau enzimatic a extractelor brute obinute din material
vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor de in. ............................................. 55
II.1.4.1. Scindarea compuilor fenolici sub aciunea pH-ului ....................................... 56
II.1.4.2. Hidroliza bazic (US1) ..................................................................................... 56
II.1.4.3. Hidroliza acid (US2; EBHA) ........................................................................... 56
II.1.4.4. Hidroliza enzimatic ........................................................................................ 56
II.1.5. Determinarea coninutului total de polifenoli ........................................................ 57
II.1.6. Determinarea capacitii antioxidante .................................................................. 57
II.1.7. Determinarea maximelor de absorpie UV-VIS .................................................... 58

II.1.8. Separarea i identificarea lignanilor precum si a unor compui fenolici ............... 61

II.1.9. Determinarea cantitativ a lignanilor precum i a unor compui fenolici ............. 61
II.2. Rezultate i discuii ....................................................................................................... 61
II.2.1. Degradarea acidului ferulic sub aciunea pH-ului ................................................. 61
II.2.2. Hidroliza enzimatic a extractului brut obinut din materialul vegetal ................. 62
II.2.3. Determinarea coninutului total de polifenoli ........................................................ 67
II.2.4. Determinarea capacitii antioxidante ................................................................... 69
II.2.5. Separarea i identificarea lignanilor precum i a unor compui fenolici ............... 70
II.2.6. Determinarea cantitativ a lignanilor precum si a unor compui fenolici ............. 74
II.2.7. Concluzii ................................................................................................................ 80
CAPITOLUL III. UTILIZAREA SUBSTANELOR BIOLOGIC ACTIVE DIN
MATERIALE VEGETALE N DOMENIU FARMACEUTIC .............................................. 82
III.1. Materiale i metode ..................................................................................................... 82
III.1.1. Materiale............................................................................................................... 82
III.1.2. Prepararea i obinerea complexului polimerc Xa-Cs .......................................... 83
III.1.3. Studiul morfologic al complexului polimeric de Xa-Cs ...................................... 83
III.1.4. Obinerea substanelor biologic active n vederea nglobrii lor n suportul
polimeric Xa Cs ............................................................................................................. 84
III.1.4.1. Extracia asistat cu ultrasunete (proba US 4) ............................................... 84
III.1.4.1.1. Separarea NaCl din extractul neutralizat ................................................. 84
III.1.4.2. Extracia subtanelor biologic active n prezena clorurii de metilen (Proba US
4 L-L) ............................................................................................................................ 84
III.1.4.3. Extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic a substanelor biologic
active (proba EA7) ........................................................................................................ 85
III.1.5. Analiza HPLC / TOF-MS n vederea identificrii coninutului de lignani din
extracte ............................................................................................................................. 85
III.1.6. Analiza HPLC DAD a extractelor, obinute n condiii diferite, n vederea
determinrii i dozrii lignanilor ...................................................................................... 85
III.1.7. nglobarea i cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la
extracia asistat cu ultrasunete ........................................................................................ 86
III.1.8. nglobarea i cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la
extracia n prezena clorurii de metilen ........................................................................... 86
III.1.9. nglobarera si cinetica eliberarii substanelor biologic active provenite de la
extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic ..................................................... 87
III.2. Rezultate i discuii ..................................................................................................... 87
III.2.1. Prepararea i obinerea complexului polimerc Xa-Cs .......................................... 87
III.2.2. Studiul morfologic al complexului polimeric de Xa-Cs ...................................... 88
III.2.3. Analiza HPLC / TOF-MS n vederea identificrii coninutului de lignani din
extractele supuse nglobrii n suportul polimeric Xa Cs ............................................. 88
III.2.4. Analiza HPLC DAD a extractelor, obinute n condiii diferite, n vederea
determinrii i dozrii lignanilor ...................................................................................... 89
III.2.5. Obinerea substanelor biologic active din produsul rezultat n urma presrii la
rece a seminelor de in n vederea nglobrii lor n suportul polimeric Xa Cs .............. 92
III.2.5.1. Extracia asistat cu ultrasunete (proba US 4) ............................................... 92

III.2.5.1.1. Separarea NaCl din extractul neutralizat ................................................. 92

III.2.5.2. Extracia subtanelor biologic active n prezena clorurii de metilen (Proba US
4 L-L) ............................................................................................................................ 93
III.2.5.3. Extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic a substanelor biologic
active (proba EA7) ........................................................................................................ 93
III.2.6. nglobarea i cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la
extracia asistat cu ultrasunete (proba US-4) .................................................................. 93
III.2.7. Cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la extracia n
prezena clorurii de metilen (proba US-4 L-L) ................................................................ 95
III.2.8. Cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la extracia extracia
hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic (proba EA7) ............................................... 96
III.2.9. Concluzii .............................................................................................................. 99
CAPITOLUL IV. FORMULAREA UNUI PRODUS CU APLICAII POTENIALE N
MEDICIN. CARACTERIZARE I TESTARE IN VIVO................................................... 100
IV.1. Materiale i metode ................................................................................................... 101
IV.1.1. Materiale ............................................................................................................ 101
IV.1.2. Extracia lignanilor i a compuilor fenolici din materialului vegetal ............... 101
IV.1.3. Formularea cremei cu coninut de compui fenolici .......................................... 101
IV.1.4. Instrumente i condiii de analiz....................................................................... 102
IV.1.4.1. Analiza HPLC TOF/MS a lignanilor i compuilor fenolici din extractul
utilizat n crem ........................................................................................................... 102
IV.1.4.2. Caracterizarea uleiului din semine de in folosit n crem prin GS MS ... 102
IV.1.5. Determinarea coninutului total de polifenoli a extractului liofilizat precum i a
formulrii ........................................................................................................................ 103
IV.1.6. Determinarea activitii antioxidante a extractului liofilizat precum i a formulrii
........................................................................................................................................ 103
IV.1.7. Proprietile reologice ale formulrii cu coninut de compui fenolici .............. 103
IV.1.8. Testarea in vitro/in vivo a formulrii cu coninut de compui fenolici .............. 104
IV.1.8.1. Evaluarea caracteristicilor biologice a extractului utilizat n crem ............ 104
IV.1.8.1.1. Izolarea i cultivarea celulelor ............................................................... 105
IV.1.8.1.2. Evaluarea viabilitii celulare prin tehnica MTS ................................... 105
IV.1.8.2. Animalele de laborator ................................................................................. 106
IV.1.8.3. Studii in vitro de difuzie transdermal ......................................................... 106
IV.1.8.4. Testarea in vivo a activitii de vindecare a rnilor ...................................... 107
IV.1.8.5. Msurarea contraciei rnilor ....................................................................... 107
IV.1.8.6. Evaluarea histologic a esuturilor ............................................................... 108
IV.2. Rezultate i discuii ................................................................................................... 108
IV.2.1. Analiza cromatografic ...................................................................................... 108
IV.2.1.1. Analiza HPLC TOF/MS a lignanilor i compuilor fenolici din extractul
utilizat .......................................................................................................................... 108
IV.2.1.2. Caracterizarea uleiului din semine de in folosit n crem prin GS MS ... 110
IV.2.2. Determinarea coninutului total de polifenoli a extractului liofilizat precum i a
formulrii ........................................................................................................................ 112

IV.2.3. Determinarea activitii antioxidante a extractului liofilizat precum i a formulrii

........................................................................................................................................ 112
IV.2.4. Proprietile reologice ale formulrii cu coninut de compui fenolici .............. 114
IV.2.5. Testarea in vitro/in vivo a formulrii cu coninut de compui fenolici .............. 118
IV.2.5.1. Evaluarea biocompatibilitii extractului liofilizat obinut din materialul
vegetal ......................................................................................................................... 118
IV.2.5.2. Studii in vitro de difuzie transdermal ......................................................... 120
IV.2.5.3. Testarea in vivo a activitii de vindecare a rnilor ...................................... 120
IV.2.5.4. Msurarea contraciei rnilor ....................................................................... 122
IV.2.5.5. Evaluarea histologic a esuturilor ............................................................... 122
IV.2.6. Concluzii ............................................................................................................ 124
CAPITOLUL V. EVALUAREA ACTIVITII ANTIDIABETICE A EXTRACTULUI DIN
MATERIAL VEGETAL ASUPRA DIABETULUI ZAHARAT INDUS PRIN
STREPTOZOTOCIN LA OBOLANI............................................................................... 125
V.1. Materiale i metode .................................................................................................... 126
V.1.1. Materiale .............................................................................................................. 126
V.1.2 Animalele de laborator ......................................................................................... 126
V.1.3. Inducerea diabetului zaharat (DZ) ....................................................................... 126
V.1.4. Modelul i protocolul experimental .................................................................... 127
V.1.5. Monitorizarea parametrilor clinici....................................................................... 128
V.1.6. Evaluarea parametriilor biochimici ..................................................................... 128
V.1.7. Studiul histopatologic .......................................................................................... 129
V.2. Rezultate i discuii .................................................................................................... 130
V.2.1. Monitorizarea parametrilor clinici....................................................................... 130
V.2.2. Evaluarea parametriilor biochimici ..................................................................... 132
V.2.2.1. Evaluarea glicemiei postprandiale................................................................. 133
V.2.2.2. Evaluarea hemoglobinei glicozilate .............................................................. 133
V.2.2.3. Evaluarea parametriilor biochimici ai profilului lipidic ................................ 134
V.2.2.4. Evaluarea parametriilor biochimici ai funiei hepatice ................................. 135
V.2.2.5. Evaluarea parametriilor biochimici ai funiei renale ..................................... 135
V.2.3. Studiul histopatologic .......................................................................................... 136
V.2.4. Concluzii ............................................................................................................. 141
CAPITOLUL VI. CONCLUZII GENERALE ....................................................................... 143
BIBLIOGRAFIE SELECTIV ............................................................................................. 145
ACTIVITATEA TIINIFIC N DECURSUL DESFURRII STUDIILOR DE
DOCTORAT..................................................................................................................... 180
Rezumatul tezei de doctorat prezint succint rezultatele originale, concluziile generale
i bibliografia selectiv i activitatea tiinific. La redactarea rezumatului s-au pstrat
aceleai notaii pentru capitole, subcapitole, figuri i tabele utilizate n cadrul tezei de
doctorat.

INTRODUCERE
Plantele reprezint surse inepuizabile de substane biologic active cu o importan
deosebit asupra regnului animal. ntrebuinarea lor s-a evideniat nc din cele mai vechi
timpuri, iniial n alimentaie i mai apoi la tratarea diferitelor afeciuni, ns far a se cunoate
noiuni despre compoziia lor chimic sau a mecanismelor de aciune. Planta de in a fost
cultivat nc din antichitate, fiind ntrebuinat pentru producerea de fibre i hran. n ultimii
ani s-a evideniat un interes sporit pentru seminele de in datorit unor studii care
concluzioneaz c folosirea lor n alimentaie aduce un aport de beneficii asupra sntii.
Aceast supoziie a fost ntrit ulterior n urma identificrii diferiilor compui chimici care
au fost asociai cu efectele pozitive n prevenia i tratarea unor boli. Lignanii din seminele de
in au evideniat efecte benefice asupra unor boli cronice, cum ar fi scderea riscului pentru
diferite tipuri de cancer (prostat, colon, piele), efecte pozitive asupra bolilor cardiovasculare,
a fertilitii, a funcionrii tiroidei, reducerea simptomelor menopausale i ale glicemiei
postprandiale, efect antioxidant i potenial antiinflamator, etc.
Pornind de la aceste considerente, obiectivele principale a tezei de doctorat au fost
extracia i caracterizarea acestor substane biologic active din materialul vegetal rezultat n
urma presrii la rece a seminelor de in din soiul autohton Cosmin i utilizarea lor n
domeniu farmaceutic sau cosmetic.
Teza de doctorat intitulat EXTRACIA I CARACTERIZAREA UNOR
COMPUI BIOACTIVI DIN MATERIALE VEGETALE UTILIZAI N DOMENIU
FARMACEUTIC SAU COSMETIC este alctuit din dou pri i structurat n ase
capitole.
Partea I cuprinde un capitol dedicat studiului de literatur (Capitolul I), n care este
prezentat stadiul actual al cunoaterii n ceea ce privete inul, lignanii din seminele de in i
efectele lor asupra sntii, precum i metodele de extracie i caracterizare utilizate.
Partea a II-a reprezint contribuii proprii privind extracia i caracterizarea lignanilor
i a unor compui fenolici din materialul vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor
de in i utilizarea acestor compui n domeniu farmaceutic sau cosmetic i este structurat n
cinci capitole. Capitolul II cuprinde metodele utilizate n vederea extraciei i caracterizrii
lignanilor i a unor compui fenolici. Capitolul III prezint utilizarea substanelor biologic
active din materialul vegetal n domeniu farmaceutic prin nglobare n matricea polimeric de
Xa-Cs, precum i cinetica de eliberare a lor. n Capitolul IV s-a urmrit formularea unui
produs pe baz de lignani i compui fenolici cu aplicaii poteniale n medicin,
1

caracterizarea produsului i testarea in vivo. n Capitolul V s-a evaluat activitatea

antidiabetic a extractului provenit din materialul vegetal rezultat n urma presrii la rece a
seminelor de in asupra diabetului zaharat indus prin streptozotocin la obolani. Teza se
ncheie cu prezentarea concluziilor generale asupra rezultatelor obinute (Capitolul VI) i n
final menionarea referinelor bibliografice. Lucrarea se extinde pe 182 de pagini i cuprinde
74 de figuri, 27 de tabele i 373 de referine bibliografice.
Rezultatele obinute din activitatea de cercetare ntreprins n decursul desfurrii
studiilor de doctorat au fost diseminate prin 3 articole publicate, 1 articol n curs de evaluare
i 1 articol n curs de finalizare n reviste cotate ISI i comunicate la 10 manifestri tiinifice
naionale i internaionale.

PARTEA II. Contribuii originale

CAPITOLUL II. EXTRACIA I CARACTERIZAREA LIGNANILOR I A
COMPUILOR FENOLICI
n vederea standardizrii procesului optim de extracie s-a realizat i urmat schema
general de extracie redat n Figura 5.
Material vegetal
obinut n urma presrii
la rece a seminelor de
in

Mcinare

Uscare

Extracie n Soxhlet cu
solvent organic nepolar

Extracia substanelor
lipofile

Solvent organic polar

Extracie SDG i a
oligomerilor si

Filtrare i concentrare

Liofilizare extract pentru

utilizri ulterioare

NaOH 2M

Hidroliz bazic

Hidroliz enzimatic

HCl 2M

Hidroliz acid

NaOH / HCl
2M

Reactiv FolinCiocalteu

Inactivare enzime

Neutralizare

Determinarea
coninutului total de
polifenoli

Cuantificare

HPLC- DAD/TOFMS

Figura 5. Schema general de extracie a lignanilor din materialul vegetal rezultat n urma
operaiei de presare la rece a seminelor de in.
3

Extracia substanelor lipofile sau degresarea materialului vegetal s-a realizat cu

ajutorul unei instalaii Soxhlet, solventul utilizat fiind hexanul. Temperatura de extracie a fost
de 60C timp de 10 ore. Extractul obinut a fost concentrat sub vacuum la temperatura de
40C pentru eliminarea solventului i recuperarea uleiului brut.
Alegerea metodei de extracie a lignanilor depinde de structura lor molecular.
Lignanii cu o polaritate mai sczut pot fi extrai cu solveni organici nepolari, de exemplu
hexanul, iar pe de alt parte lignanii precum SECO, care au o polaritate mai ridicat, pot fi
extrai cu solveni polari precum soluiile apoase de metanol sau etanol1. Metodele de
extracie a lignanilor i a compuilor fenolici din materialul vegetal rezultat n urma presrii la
rece a seminelor de in au fost:
-

extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic(E1; E2);

extracia n intalaia Soxhlet cu alcool etilic (ESx);

extracia asistat cu ultrasunete (US);

extracia n instalaia Soxhlet cu aceton (EA);

extracia n mediu alcalin (EBA).

n ceea ce privete separarea lignanilor prezeni n materialul vegetal provenit n urma

presrii la rece a seminelor de in, n timpul extraciei alcoolice s-a realizat totodat i
tratament alcalin pentru eliberarea compusului SDG din matricea vegetal. De asemenea,
hidroliza bazic a fost realizat i asupra extractelor brute n vederea ruperii legaturii SDGHMG i eliberarea SDG-ului. n vederea obinerii oligomerilor SDG-ului s-a realizat o etap
de hidroliza acid a extractelor brute. Scindarea legturilor glicozidice a SDG i transformarea
la forma sa agliconic de SECO s-a mai efectuat i pe cale enzimatic.
II.2.2. Hidroliza enzimatic a extractului brut obinut din materialul vegetal
Evoluia hidrolizei enzimatice a fost urmrit cromatografic prin HPLC DAD pentru
fiecare dintre enzimele utilizate, i anume

-glucuronidaz, sulfataz, lacaz, lignin

peroxidaz, Bakezyme Concreate, Panamore Golden, VERON292, VERON393,

Gluzyme10000 BG i Fungamyl2500 SG, i comparat mai apoi cu profilul cromatografic
al extractului brut provenit din material vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor
de in. Totodat, evoluia hidrolizei enzimatice a fost comparat i cu profilul cromatografic al
extractului hidrolizat, cu HCl 2M, provenit din material vegetal rezultat n urma presrii la
rece a seminelor de in, care mai apoi a fost neutralizat cu soluie de NaOH pn la pH neutru,
evideniindu-se o separare a oligomerilor SDG-ului. Profilul cromatografic al hidrolizei
4

enzimatice pentru fiecare dintre enzimele utilizate comparativ cu profilul cromatografic al

extractului brut i cel al extractului hidrolizat cu HCl este redat n Figurile 12 23.
uV
70000

uV
70000

60000

60000

50000

50000

40000

40000

30000

30000

20000

20000

10000

10000

0
0.0

0
2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5 min

min

Figura 12. Profilul cromatografic al extractului

brut.

Figura 13. Profilul cromatografic al extractului

hidrolizat cu HCl.

uV
70000

uV
70000

60000

60000

50000

50000

40000

40000

30000

30000

20000

20000

10000

10000

0
0.0

0
2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

min

0.0

Figura 14. Profilul cromatografic al hidrolizei

enzimatice cu -glucuronidaz () comparativ cu
extractul brut () i hidrolizat cu HCl ().

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

uV
70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

47.5

min

Figura 17. Profilul cromatografic al hidrolizei

enzimatice cu lacaz () comparativ cu extractul
brut () i hidrolizat cu HCl ().

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

min

Figura 23. Profilul cromatografic al hidrolizei

enzimatice cu Fungamyl2500 SG () comparativ
cu extractul brut () i hidrolizat cu HCl ().
II.2.3. Determinarea coninutului total de polifenoli
Concentraia total de polifenoli a fost determinat n raport cu un etalon, n acest caz
acidul galic. Coninutul n polifenoli totali s-a exprimat ulterior n g echivaleni acid galic

(GAE) / L. Coninutul total de polifenoli al extractelor realizate dup metodele mentionate

mai sus sunt prezentate n Tabelul 7.
Tabel 7. Coninutul total de polifenoli.
Extract

Absorban extract,
765 nm

Coninutul total de
polifenoli al extractelor,
g/mL

E1
E2
ESx
US

0,166
0,159
0,106
0,115

398
379
238
262

Coninutul total de
polifenoli al extractelor,
mg / 100 g material
vegetal
796
758
357
197

US1
US2
EA
EBA
EBHA

0,132
0,112
0,048
0,155
0,136

307
254
84
368
318

230
191
126
552
477

E1, E2 extracte realizate dup metoda I; ESx extract realizat dup metoda II; US extract realizat
dup metoda III; US1 reprezint extractul US supus hidrolizei bazice; US2 reprezint extractul US supus
hidrolizei acide; EA extract realizat dup metoda IV; EBA extract realizat dup metoda V; EBHA reprezint
extractul EBA supus hidrolizei acide.

II.2.4. Determinarea capacitii antioxidante

Dup cum se poate observa n Figura 26, inhibarea aproape complet a reactivului
DPPH se obine n cazul acidului ascorbic. n ceea ce privete extractul liofilizat din semine
de in s-a atins un procent de inhibiie a radicalul DPPH de aproximativ 35% la o concentraie
de 1 mg/mL. Activitatea antioxidant a probelor a fost exprimat ca IC50, cantitatea
echivalent de prob care neutralizeaz 50 % din radical. Datele sunt prezentate n Tabelul 8.
Tabel 8. Activitatea antioxidant exprimat
ca IC50 a acidului ascorbic i a extractului
liofiliziat.
Proba
Acid ascorbic
Extract liofilizat din
semine de in

IC50, mg/mL
0,117 0,005
1,092 0,02

Figura 26. Procentul de inhibiie al

radicalului DPPH sub aciunea acidului
ascorbic i a extractului liofilizat.
II.2.5. Separarea i identificarea lignanilor precum i a unor compui fenolici
Identificarea acestor compui din extract a fost efectuat utiliznd compui standard de
structur cunoscut, stabilit prin msurtori de spectroscopice de mas i comparate cu datele
6

din literatur2. Cromatogramele standardelor de lignani i compui fenolici sunt prezentate n

Figura 27A i B. Spectrele de mas obinute n urma analizelor n mod negativ au constat n
mod principal din molecule deprotonate [MH] i sunt prezentate, pentru compuii studiai,
n Figurile 28 35. Cromatograma extractului, lignanii precum i compuii fenolici
identificai, sunt prezentai n Figura 36.

Figura 27. Profilul cromatografic al standardelor A: 1-SDG; 2-LARI; 3-SECO; 4MATA; 5-PINO i B: 6-acid galic; 7-acid p-cumaric; 8-acid t-ferulic.

Figura 28. Spectrul de mas pentru SDG.

Figura 35. Spectrul de mas pentru acid tferulic.

2 3 4

56

Figura 36. Cromatograma extractului hidroalcoolic i a

compuilor fenolici identificai: 1-acid galic; 2-acid p-cumaric;
3-acid t-ferulic; 4-SDG; 5-LARI; 6-SECO; 7-MATA; 8-PINO.
II.2.6. Determinarea cantitativ a lignanilor precum si a unor compui fenolici
n vederea determinrii concentraiei lignanilor precum i a polifenolilor prezeni n
extractele vegetale s-au utilizat standarde analitice de puritate 99% i s-au trasat drepte de
etalonare pentru fiecare compus fenolic. n vederea obinerii unui extract cu un coninut ct
7

mai ridicat de lignani s-au efectuat o serie de extracii la o temperatur de 60 C, temperatur

stabilit anterior ca fiind optim, variindu-se cantitatea de material vegetal, timpul de extracie
i raportul de solveni. Variantele de extracie sunt prezentate n Tabelul 11.
Tabel 11. Parametrii de extracie.
Proba
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Cantitate material
vegetal
( g %)
5
10
15
5
10
15
5
10
15
5
10
15

Timp
( h)

Raport solveni
C2H5OH : H2O

4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5

70:30
70:30
70:30
80:20
80:20
80:20
70:30
70:30
70:30
80:20
80:20
80:20

Concentraia cea mai ridicat de lignani s-a gasit n probele 1 i 7, de unde reiese c
cel mai bun raport de solveni pentru extracie este de 70/30 (v/v) C2H6O/H2O iar cantitatea
cea mai eficient de material vegetal fiind de 5/100 (g/mL). Probele cu concentraia cea mai
ridicat de lignani sunt redate n Tabelul 18.
Tabel 18. Probele cu cea mai ridicat concentraie de lignani.
Proba

SDG din
extracte
brute
(g/100g
material
vegetal)

1
7

2337,8
2945,8

SDG din
extracte
hidrolizate
HCl
(g/100g
material
vegetal)
8109,2
5537

LARI
(g/100g
material
vegetal)

SECO
(g/100g
material
vegetal)

MATA
(g/100g
material
vegetal)

PINO
(g/100g
material
vegetal)

2655,4
3043,6

92032
92502

3446
3236

50148
52604,32

CAPITOLUL III. UTILIZAREA SUBSTANELOR BIOLOGIC ACTIVE DIN

MATERIALE VEGETALE N DOMENIU FARMACEUTIC
Polimerii naturali utilizai n acest studiu pentru nglobarea lignanilor provenii de la
extracia din materialul vegetal rezultat n urma procesului de presare la rece a seminelor de
in au fost chitosanul (Cs) i Xantanul (Xa), care au o solubilitate ridicat, sunt biodegradabili,
biocompatibili i pot oferi noi direcii de utilizare, aplicare i furnizare de compui bioactivi.
III.1.4. Obinerea substanelor biologic active n vederea nglobrii lor n
suportul polimeric Xa Cs
n vederea obinerii extractului optim pentru nglobare n matricea polimeric pe baz
de Xa-Cs s-au realizat mai multe extracte, prin metode diferite, dup cum urmeaz:
III.1.4.1. Extracia asistat cu ultrasunete (proba US 4);
III.1.4.2. Extracia subtanelor biologic active n prezena clorurii de metilen
(Proba US 4 L-L);
III.1.4.3. Extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic a substanelor
biologic active (proba EA7).

III.1.7. nglobarea i cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de

la extracia asistat cu ultrasunete
nglobarea extractului cu coninut de lignani s-a efectuat prin dizolvarea a 0,5 g de
produs liofilizat n 5 mL ap peste care s-a adugat 0,1164 g complex Xa-Cs. Absorbia
soluiei cu coninut de lignani n complexul Xa-Cs a fost complet n h. Complexul astfel
obinut a fost liofizat i apoi trecut sub form de pastile cu diametru de 12 mm i grosimea de
1-2 mm. Pastilarea s-a realizat prin comprimarea a 300 mg de compus ntr-o matri cu
diametru de 12 mm, la o presiune de 2 tone, timp de 1 minut, utiliznd o pres de laborator.
Cinetica de eliberare s-a urmrit prin determinarea coninutului total de polifenoli, efectuat
spectrofotometric la lungimea de und de 280 nm, ct i a coninutului de SECO, determinat
prin analize HPLC DAD. Cinetica de eliberare a compuilor biologici activi din probe s-a
efectuat ntr-o baie termostat la 37 oC, cu o agitare de 150 rot/min. Eliberarea substanelor
bioactive a avut loc n 20 mL soluie de HCl pH 2.0 sau de tampon fosfat pH 7.4, valori ale
pH-ului ntlnite n tractul gastro-intestinal.

III.1.8. nglobarea i cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de

la extracia n prezena clorurii de metilen
nglobarea extractului cu coninut de lignani s-a efectuat prin dizolvarea a 0,16 g de
produs liofilizat n 5 mL ap peste care s-a adugat 0,22 g complex Xa-Cs. Absorbia soluiei
cu coninut de lignani n complexul Xa-Cs a fost complet n h. Complexul astfel obinut a
fost liofizat. Pastilarea s-a realizat prin comprimarea a 200 mg de compus dup metoda
descris anterior n Capitolul III.1.7. Cinetica de eliberare, precum i determinarea
coninutului de lignani i a celui de polifenoli totali s-a urmrit n conformitate cu Capitolul
III.1.7.
III.1.9. nglobarera si cinetica eliberarii substanelor biologic active provenite de
la extracia hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic
nglobarea extractului cu coninut de lignani s-a efectuat prin dizolvarea a 1,1597 g de
produs liofilizat n 14 mL alcool etilic:ap 4:3, (v/v) peste care s-a adugat 0,2501 g complex
Xa-Cs. Absorbia soluiei cu coninut de lignani n complexul Xa-Cs a fost complet n h.
Complexul astfel obinut a fost liofizat. Pastilarea s-a realizat prin comprimarea a 600 mg de
compus dup metoda descris anterior n Capitolul III.1.7. Cinetica de eliberare, precum i
determinarea coninutului de lignani i a celui de polifenoli totali s-a urmrit dup cum s-a
menionat anterior n Capitolul III.1.7.

III.2.1. Prepararea i obinerea complexului polimerc Xa-Cs

n procesul de preparare a suportului polimeric de Xa-Cs, se obin iniial perle sub
form gel (Figura 37), care au fost liofilizate, obinndu-se astfel un material cu o structur
fibrilar poroas (Figura 38), care a permis ncarcarea acestuia, prin umflare, cu extractele
obinute.

Figura 37. Perle de Xa-Cs la

sfiritul procesului de sintez.

Figura 38. Particule compozite de

Xa-Cs dup procesul de liofilizare.
10

III.2.2. Studiul morfologic al complexului polimeric de Xa-Cs

Micrografiile electronice SEM a complexului Xa-Cs obinut sunt prezentate n Figura
39.

(a)
(b)
Figura 39. Micrografiile electronice SEM pentru: (a) suprafaa complexului polimeric de
Xa-CS i (b) seciunea transversal a complexului polimeric de Xa-CS.
III.2.3. Analiza HPLC / TOF-MS n vederea identificrii i determinrii
coninutului de lignani din extractele supuse nglobrii n suportul polimeric Xa Cs
Spectrele de mas obinute n urma analizelor n mod negativ au constat n mod
principal din molecule deprotonate [MH] i sunt prezentate, n funcie de compusul
analizat, anterior n Capitolul II.2.5. Spectrele de mas obinute au fost utilizate la
identificarea lignanilor din extractele menionate mai sus (Figura 41).
x10 2
1

DAD1 - A:Sig=280,8

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5

SECO
LARI

0.4
0.3
0.2

MATA

0.1
0
0

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Response Units (%) vs. Acquisition Time (min)

Figura 41. Cromatograma extractului US 4 supus nglobrii n care s-au identificat lignanii
LARI, SECO i MATA.

11

III.2.8. Cinetica eliberrii substanelor biologic active provenite de la extracia

hidroalcoolic pe plit cu agitare magnetic (proba EA7)
Pastilele utilizate n studiu au avut o cantitate de SECO de 2749 g i un coninut total
de polifenoli de 6047 g, pentru cea utilizat la eliberarea n mediu acid, respectiv 2791 g de
SECO i un coninut total de polifenoli de 6140 g pentru cea utilizat la eliberarea n mediu
bazic. n Figurile 51 i 52 sunt prezentate curbele cinetice de eliberare a SECO, respectiv a
polifenolilor n mediu acid (pH 2.0) i n mediu bazic (pH 7.4).

Figura 51. Cinetica de eliberare a SECO din

Figura 52. Cinetica de eliberare a polifenolilor

proba EA-7.

din proba EA-7 (=280 nm).

Datele cinetice de la eliberare au fost n concordan cu un modelul cinetic care

descrie mecanismul de eliberare a SECO din complexul Xa-Cs. n acest studiu, exponentul de
difuzie n i constanta caracteristic k au fost evaluate din panta i intersecia graficului
ln(Mt/Mp) funcie de ln(t), prezentat n Figurile 53 i 54.

Figura 53. Reprezentarea grafic a ln(Mt/Mp)

Figura 54. Reprezentarea grafic a ln(Mt/Mp)

funcie de ln(t) la pH 2.0.

funcie de ln(t) la pH 7.4.

Procesul de eliberare a SECO nglobat n complexul polimeric Xa-Cs, att n mediu

acid ct i n mediu bazic arat o difuzie de tip Fickian, aadar acest produs poate fi incadrat
n categoria sistemelor cu eliberare controlat.
12

CAPITOLUL

IV.

FORMULAREA

UNUI

PRODUS

CU

APLICAII

POTENIALE N MEDICIN. CARACTERIZARE I TESTARE IN VIVO.

n cadrul studiului s-a preparat o crem cu coninut de compui fenolici provenii prin
extracie din materialul vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor de in, alturi de
alte ingrediente.
IV.1.3. Formularea cremei cu coninut de compui fenolici
n vederea determinrii eficacitii n tratarea ranilor a produselor cu coninut de
lignani i compui fenolici s-a realizat o formulare cosmetic avnd n compoziia sa extract
liofilizat din semine de in, dup cum este prezentat n Tabelul 20.
Tabel 20. Compoziia formulrii cu coninut de lignani i compui fenolici.
Faza
A
B

Ingredient
Cear de albine
Ulei de in
Extract liofilizat din semine de in
Borax
Ap bidistilat

Cantitate, g
18
61
4
1
20

IV.1.4.1. Analiza HPLC TOF/MS a lignanilor i compuilor fenolici din

extractul utilizat n crem
Identificarea i separarea cromatografic lignanilor precum si a unor compui fenolici
s-a realizat dup metoda menionat anterior n Capitolul II.1.8. n Figura 57 este prezentat
cromatograma extractului analizat din punct de vedere al coninutului de lignani i compui
fenolici i folosit ulterior n crem.

Figura 57. Profilul cromatografic al extractului hidrolizat utilizat n crem.

13

Lignanii i compuii fenolici identificai att n soluii standard ct i n extractul

utilizat n crem sunt sumarizai n Tabelul 21.
Tabel 21. Analiza HPLC/TOF-MS a compuilor standard i a extractului utilizat n
crem.
Compus

SDG
SECO
LARI
MATA
PINO
acid t-ferulic
GAE
acid p-coumaric

Ion de confirmare
Ion al
a compusului
produsului din
standard, m/z
extract, m/z
685,41
361,26
359,25
357,23
357,14
193,05
169,01
163,04

685,26
361,16
359,16
357,23
357,14
193,05
169,01
163,04

Timp de
retenie,
min.
21,97
26,2
25,7
29,3
32,78
21,44
3,32
19,92

Concentraie
(mg/100 g
material
vegetal)
9,3
110,8
4,9
6,9
22,9
4,8
4,6
5,2

IV.2.1.2. Caracterizarea uleiului din semine de in folosit n crem prin GS MS

n Figura 58 este prezentat cromatograma i compui identificai n uleiul de in ca
rezultat al monitorizrii celor de interes, n funcie de ordinea eluiei: acid palmitic, acid oleic,
acid linoleic i acid linolenic. Determinarea cantitativ a compuilor identificai n uleiul de in
este prezentat n Tabelul 22.
Tabel 22. Compuii identificai n uleiul de
in.
Compusul
identificat

Figura 58. Compuii identificai n uleiul de in

n funcie de ordinea eluiei: acid palmitic, acid
oleic, acid linoleic, acid linolenic

14

acid
palmitic
acid oleic
acid
linoleic
acid
linolenic

Compoziie
analizat,
%
10,4 0,2

Literatur
(Hosseinian,
2004)
7,0

19,3 0,07
17,3 0,01

16,1
14,7

51 0,1

58,5

IV.2.2. Determinarea coninutului total de polifenoli a extractului liofilizat

precum i a formulrii
Coninutul total de polifenoli al probelor este prezentat n Tabelul 23.
Tabel 23. Coninutul total de polifenoli al extractului liofiliziat i a probelor de crem.
Prob
Extract liofilizat
Crem n prima zi

Coninut total de polifenoli,

mg GAE/g
350 0,02
221,6 0,006

Crem dup 30 de zile

219,6 0,008

IV.2.3. Determinarea activitii antioxidante a extractului liofilizat precum i a

formulrii
Dup cum se poate observa n Figura 59, activitatea antioxidant a celor trei probe
(acid ascorbic, extract liofilizat i crem) a crescut odat cu creterea concentraiilor. Valorile
IC50 au fost calculate prin regresie liniar din curba doz rspuns ntre procentele de
inhibiie i concentraiile fiecror probe, i prezentate n Tabelul 24.
Tabel

24.

Activitatea

antioxidant

exprimat ca IC50 a acidului ascorbic, a

extractului liofiliziat i a probelor de crem.
Proba
Acid ascorbic
Extract liofilizat din
semine de in
Crem n prima zi
Crem dup 30 de zile

IC50, mg/mL
0,117 0,005
1,092 0,02
1,767 0,004
2,838 0,01

Figura 59. Procentul de inhibiie al radicalului

DPPH sub aciunea acidului ascorbic, a
extractului liofiliziat i a probelor de crem.
IV.2.4. Proprietile reologice ale formulrii cu coninut de compui fenolici
Msurtorile reologice au fost efectuate pentru a obine informaii cu privire la
proprietile structurale ale cremei. Pentru a obine date despre comportamentul vscoelastic a
cremei s-a realizat att testul oscilator ct i testul de rotaie, precum i masurturi de
ntindere a cremei, proprietate care contribuie la percepia senzorial a produsului3. Dup cum
se poate observa n Figura 60A structurile stabile dezvolt deformaii mici att la 25 C ct i
la 37 C. Baleiajele de frecven au permis aprecierea comportamentului pe termen lung,
15

stabilitatea la repaus i rezistena la separare a cremelor4. Pentru ambele temperaturi i

ntreaga gam de frecvene o structur fin a fost evideniat, avnd o valoare G mai ridicat
ca G(Figura 60B).

Figura 60. Testul de tensiune (A) i baleiajul de frecven (B) pentru crem la 25 i 37 C.
Testul de temperatur (realizat la o frecven constant

= 10 rad/s i o amplitudine

constant n domeniul vscoelastic liniar) evideniaz fluidizarea cremei n jurul temperaturii

fiziologice precum i stabilitatea structural chiar i pentru temperaturi mai ridicate (Figura
61A). Un test de timp oscilatoriu efectuat la o frecven constant = 10 rad / s precum i la
o amplitudine constant n intervalul domeniului vscoelastic linear (Figura 61B) a
demonstrat c att la 25 C ct i la 37 C crema este stabil n timp fr a suferi nici o
destructurare.

Figura 61. Testul de temperatur (A) i testul de timp (B) pentru crem.
Curbele de curgere au evideniat o vscozitate foarte dezvoltat, compatibil cu
modelul Carreau-Yasuda (Figura 62).

16

Figura 62. Curbele de curgere pentru crem.

IV.2.5. Testarea in vitro/in vivo a formulrii cu coninut de compui fenolici
IV.2.5.1. Evaluarea biocompatibilitii extractului liofilizat obinut din materialul
vegetal
Evaluarea viabilitii celulare s-a realizat prin tehnica MTS, metod colorimetric de
determinare a numrului de celule viabile. Rezultatele obinute prin tehnica MTS raportate la
controlul pozitiv (celule fr material) sunt prezentate n Figura 63.

Figura 63. Activitatea mitocondrial msurat prin metoda MTS.

Aceast metod de evideniere a structurii i morfologiei celulare este important
pentru a putea observa dac celulele proliferate sunt distribuite n ntreaga structur a
materialelor sau doar n anumite regiuni. Dup cum este prezentat n Figura 64, se observ c
celulele sunt distribuite n toat masa extractului liofilizat, ntinse peste pori, evideniind o
morfologie similar cu a celulelor normale.

17

Figura 64. Vizualizarea celulelor viabile prin microscopie optic la 0, respectiv, 24 h dup
incubare (A, B- control pozitiv; C, D- celule incubate cu extract liofilizat).
IV.2.5.2. Studii in vitro de difuzie transdermal
Studiile de difuzie transdermal au fost realizate pe piele abdominal provenit de la
sobolani Wistar. Profilul de difuzie prin piele de obolan a compuilor bioactivi funcie de
timp n decursul a 24 de ore este redat n Figura 65.

Figura 65. Profilul de difuziei in vitro a compuilor fenolici din crem.

IV.2.5.3. Testarea in vivo a activitii de vindecare a rnilor
Vindecarea rnilor este o procedur complex, care include inflamaie, formarea de
esut granular, reepitelizare i formarea matricei5. Efectul de vindecarea rnilor, n funcie de
tratamentul aplicat, poate fi observat n Figura 66.

18

Figura 66. Efectul de vindecarea rnilor cutanate la ziua 1, 10 i 20 pentru control negativ
(N), control (C) i tratament (T).
La grupul netratat, rnile au persistat chiar i dup 20 de zile, prezentnd suprafee de
culoare roie fr acoperiri epidermice. Evaluarea macroscopic a leziunilor epidermice
pentru grupul tratat cu crema cu coninut de compui polifenolici a demonstrat eficacitatea
tratamentului; s-a evideniat o reducere mai rapid a diamentrului rnilor fa de controlul
negativ, similar cu cel tratat cu crema control. Potenialul cicatrizant al cremei cu extract din
semine de in poate fi atribuit prezenei radicalilor liberi i speciilor de oxigen reactive,
contribuind la contracia plgii, formarea de vase capilare i de fibroblaste6, 5.
IV.2.5.4. Msurarea contraciei rnilor
Evoluia rnilor cutanate precum i eficacitatea tratamentului cu crema cu extract din
semine de in au fost urmrite la intervale regulate (ziua 1, 10 i 20) prin metoda msurrii
diametrului, pn cnd continuitatea pielii a fost restabilit. Evoluia contraciei este
prezentat n Tabelul 25.
Tabel 25. Contracia rnii n procente (%), a cremei cu extract liofilizat asupra capacitii de
vindecare a obolanilor experimentali.
Grup
N
C
T

Ziua 1
8,91 0,4
9,05 0,23
9,15 0,18

Ziua 10
35,51 0,84
66,08 0,36
67,93 0,29

19

Ziua 20
49,17 0,45
100
100

IV.2.5.5. Evaluarea histologic a esuturilor

n ceea ce privete rezultatele histologice obinute n urma experimentrii in vivo
(Figura 67A i B), la grupa netratat n a 10-a zi dup operaie, rana format a evideniat
necroza fibrinoida, exudat leucocitar i infiltrat limfoplasmocitar inflamator. n a 20-a zi,
regiunea plagii a fost acoperit cu un strat epidermic subire. La grupul unde a fost aplicat
crema control n a 10-a zi s-a evideniat ulceraie profund, limitat la suprafa, cu depozite
fibrinoleucocitare i esut de granulaie la baz cu infiltrat limfoplasmocitar inflamator cronic.
Ulceraia a fost redus n comparaie cu grupul netratat. n a 20-a zi, zona urmrit a scos n
eviden o cicatrizare fibroas subepidermic. La lotul unde s-a aplicat tratamentul cu crema
cu extract din in n a 10-a zi, la fel ca i la grupul tratat cu crema control, s-a evideniat
ulceraie superficial cu depozite fibrinoleucocitare semnificative. n a 20-a zi epitelizarea a
fost complet cu esut fibros matur fr urme de colagen. n concluzie, crema cu extract
liofilizat are un efect favorabil asupra ndeprtarii semnelor histologice ale leziunilor tisulare
create experimental.

Figura 67. Evaluarea histopatologic n ziua 1, 10 i 20 pentru control negativ (N), control (C) i
tratament (T).
Influena pozitiv asupra formrii de esut fibros precum i dispariia colagenizrii
sugereaz c preparatul cu coninut de extract liofilizat din materialul vegetal rezultat n urma
presrii la rece a seminelor de in ar putea fi un bun candidat pentru repararea i regenerarea
pielii n condiii de siguran.

20

CAPITOLUL

V.

EVALUAREA

ACTIVITII

ANTIDIABETICE

EXTRACTULUI DIN MATERIAL VEGETAL ASUPRA DIABETULUI ZAHARAT

INDUS PRIN STREPTOZOTOCIN LA OBOLANI.
Scopul acesui studiu a fost de a determina activitatea antidiabetic a extractului
liofilizat, cu coninut ridicat de lignani, provenit din material vegetal rezultat n urma operaiei
de presare la rece a seminelor de in.
n experiment au fost utilizai 30 de obolani, femele, din rasa Wistar, cu o mas
medie de 240 15 g, provenii din unitatea de cretere a animalelor de laborator din cadrul
Intitutului Cantacuzino Bucureti. Animalele au fost adpostite n condiii standard de mediu,
respectiv, temperatur (22 3 C), umiditate (60 5%) intr-un ciclu lumin / ntuneric de 12
h. Pe decursul experimentului, obolanii au avut o dient standard, constnd n pelete i ap la
discreie.
V.1.3. Inducerea diabetului zaharat (DZ)
n vederea evalurii activitii antidiabetice a extractului obinut din materialul vegetal
rezultat n urma operaiei de presare la rece a seminelor de in s-a optat pentru un model de
diabet zaharat indus cu streptozotocin (STZ), conform tehnicii descrise n literatura de
specialitate, cu mici modificri7.
V.1.4. Modelul i protocolul experimental
n urma cntririi (masa corporal iniial) i a determinrii concentraiei de glucoz
din snge, obolanii diabetici au fost repartizai pe loturi a cte 10, n funcie de masa
corporal i indicele glicemic. Studiul a mai inclus un lot control, compus dintr-un efectiv de
10 obolani, care au fost injectai i.p. doar cu tampon citrat. Extractul liofilizat a fost
administrat ntr-o cantitate de 0,5 g, prin gavaj oral, o dat pe zi.
Studiul a fost condus dup urmtorul protocol de lucru:
Lot martor (M) 10 obolani, diet standard;
Lot control (DZ) 10 obolani diabetici, diet standard;
Lot DZ sub tratament (DZ T) 10 obolani diabetici, diet standard i extract
liofilizat (0,5 g/zi, administrat oral prin gavaj).
Experimentul s-a desfurat pe o perioad de 60 de zile. Glicemia postparandial a fost
msurat n zilele 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 i 60 de la inducerea diabetului.

21

V.2.1. Monitorizarea parametrilor clinici

n decursul studiului a fost monitorizate att modificarile survenite asupra masei
corporale a obolanilor ct i consumul de hran i de ap. Este cunoscut faptul c n anumite
faze evolutive ale diabetului are loc o scdere inexplicabil a masei corporale, fapt confirmat
i de rezultatele acestui studiu, dup cum se poate observa n Figura 68.

Figura 68. Monitorizarea masei corporale la obolanii din loturile de studiu.

La obolanii diabetici cantitatea de hran i ap consumat a fost aproximativ dubl
fa de cea a obolanilor din lotul martor, iar la obolanii diabetici sub tratament cantitatea de
ap i hran consumat a variat ntre cea a loturilor mai sus menionate (Figura 69 i 70).

Figura 69. Monitorizarea consumului de ap

Figura 70. Monitorizarea consumului de

mediu timp de 24 de ore raportat per kg corp

hran mediu timp de 24 de ore raportat per kg

la obolanii din loturile de studiu.

corp la obolanii din loturile de studiu.

V.2.2. Evaluarea parametriilor biochimici

Efectele extractului liofilizat asupra diabetului au fost evaluate i din punct de vedere a
parametriilor biochimici, urmrindu-se nivelurile glicemiei postprandiale i a hemoglobinei
22

glicozilate precum i modificrile survenite asupra profilului lipidic, asupra funciilor hepatice
i asupra funciilor renale.
V.2.2.1. Evaluarea glicemiei postprandiale
n vederea evalurii efectului extractului liofilizat asupra indicelui glicemic al
obolanilor din loturile de studiu, monitorizarea glicemiei postprandiale s-a realizat pe tot
decursul studiului, recurgndu-se la masuratari la diferite intervale de timp (Figura 71).

Figura 71. Monitorizarea glicemiei postprandiale la obolanii din loturile de studiu.

V.2.2.2. Evaluarea hemoglobinei glicozilate
La sfritul studiului, tratamentul cu extract liofilizat nu a evideniat o reducere
seminificativ a procentului de hemoglobin glicozilat, avnd o valoare de 11,60,4 %.
Totui, o diferen minor n nivelurile de hemoglobin glicozilat s-a putut observa ntre
lotul cu diabet aflat sub tratament i lotul cu diabet, care a prezentat un procent al
hemoglobinei glicozilate de 12,350,3 %. Lotul martor a prezentat la sfrsitul perioadei de
studiu un procent al hemoglobinei glicozilate de 3,840,1 %.
V.2.2.3. Evaluarea parametriilor biochimici ai profilului lipidic
Evaluarea profilului lipidic al obolanilor supui testrii s-a realizat prin determinarea
colesterolului total, LDL colesterolului, HDL colesterolului i trigliceridelor.
Rezultatele parametriilor biochimici ai profilului lipidic, obinute n urma studiului
sunt prezentate n Tabelul 26.

23

Tabel 26. Valorile parametriilor biochimici ai profilului lipidic.

Lot
M
DZ
DZ T

Colesterol
total, mg/dL
62,5 3,53
145,5 4,95
93 2,83

LDL,
mg/dL
43 4,24
67,5 3,54
63,5 2,12

HDL,
mg/dL
59 1,41
59,5 4,95
49,5 3,53

Trigliceride,
mg/dL
100,5 14,85
235 14,14
148,5 4,95

V.2.2.4. Evaluarea parametriilor biochimici ai funciei hepatice

Determinarea integritii celulare a ficatului obolanilor inclui n studiu a fost
monitorizat

prin

determinarea

activitii

enzimelor

hepatice,

anume

alaninaminotransferazei (ALT) i aspartataminotransferazei (AST). Nivelul ALT la obolanii

diabetici n urma perioadei de studiu a fost de 176,5 4,95 iar la cei diabetici aflai sub
tratament de 233,5 3,53 Ul/L, fa de obolanii martor care au prezentat un nivel de 44,5
3,54 Ul/L. Nivelul AST la obolanii diabetici n urma perioadei de studiu a fost de 378,5
17,68 iar la cei diabetici aflai sub tratament de 374 16,97 Ul/L, fa de obolanii martor
care au prezentat un nivel de 94,5 4,95 Ul/L.
V.2.2.5. Evaluarea parametriilor biochimici ai funciei renale
n urma analizei datelor obinute se evideniaz faptul c extractul liofilizat prezint
efecte benefice asupra funciei renale. Rezultatele evalurii funciei renale, n urma
determinrii nivelurilor serice de uree, acid uric i creatinin, sunt raportate n Tabelul 27.
Tabel 27. Valorile parametriilor biochimici ai funciei renale. Valorile sunt exprimate
ca medie, fiind calculat i deviaia standard.
Lot
M
DZ
DZ T

Uree seric,
mg/dL
53,5 2,12
75 1,41
58 4,24

Azot ureic,
mg/dL
25,17 0,24
34,97 0,76
27,02 1,97

Acid uric,
mg/dL
1,05 0,35
2,05 0,5
0,7 0,57

Creatinin,
mg/dL
0,175 0,05
0,13 0,07
0,095 0,02

V.2.3. Studiul histopatologic

n vederea identificrii modificrilor morfologice survenite asupra esuturilor n urma
inducerii diabetului i a administrrii extractului liofilizat s-a realizat un studiu histopatologic
pe fragmente de esut pancreatic, splenic, hepatic, renal. Examenul anatomopatologic al
fragmentelor de ficat, pancreas, rinichi i splin recoltate de la lotul M au evideniat un aspect
histologic normal(Figura 72A, B, C i D).

24

Figura 72. Evaluarea histopatologic lot M: A ficat; B pancreas; C rinichi; D splin

(HE, x100; x200; x400).
Examenul anatomopatologic al fragmentelor de ficat de la lotul DZ a evideniat o
ncrctur sczut cu glicogen a hepatocitelor (Figura 73A). Pancreasul a prezentat o
congestie a vaselor interstitiale, un numr redus de insule Langerhans, iar celulele beta
centrale au prezentat citoplasm vacuolizat. S-a mai observat prezena unui infiltrat redus cu
limfocite i mastocite la nivelul septelor vasculo-conjunctive interlobulare (Figura 73B). n
cazul rinichilor s-a observat prezena unui infiltrat de celule inflamatoare (neutrofile,
limfocite, plasmocite) focal, ce se extinde sub forma unei benzi slab delimitate de la nivelul
corticalei, pn la nivelul bazinetului renal. Tubii colectori prezint lumenul obliterat de
acumulari de neutrofile. n regiunea infiltrat, s-a observat dilacerarea sau absena structurilor
renale. Bazinetul renal apare dilatat, iar n regiunea subiacent epiteliului tranziional s-a
observat un infiltrat moderat cu limfocite. S-au mai evideniat hemoragii fine n corticala
25

renal, mrirea spaiului de filtrare i atrofia de compresiune a glomerulilor renali, dilatarea

tubilor colectori (Figura 73C). Splina a prezentat un aspect histologic normal(Figura 73D). In
urma analizei histopatologice a esuturilor s-a evideniat nefrit supurativ i hidronefroz.
A

Figura 73. Evaluarea histopatologic lot DZ: A ficat; B pancreas; C rinichi (x40; x100;
x400); D splin (HE, x100; x200; x400).
n cazul fragmentelor de ficat provenite de la lotul DZ T examenul
anatomopatologic a evideniat o ncrctur sczut cu glicogen a hepatocitelor(Figura 74A).
Pancreasul a prezentat un numr redus de insule Langerhans atrofiate. Insule Langerhans slab
delimitate, iar celulele beta centrale au prezentat vacuolizri ale citoplasmei. S-a observat un
infiltrat format din limfocite i mastocite la nivelul septelor vasculo-conjunctive
interlobulare(Figura 74B). Rinichi au evideniat un numr redus de tubi colectori, prezentnd
de asemenea distrofie balonizant a epiteliului(Figura 74C). Splina a prezentat un aspect
histologic normal(Figura 74D).
26

Figura 74. Evaluarea histopatologic lot DZ T: A ficat; B pancreas; C rinichi; D

splin (HE, x100; x200; x400).
n urma studiului histopatologic nu s-a evideniat nici o diferen semnificativ n
cazul fragmentelor de ficat provenite de la lotul DZ T comparativ cu cele provenite de la
lotul DZ. De asemenea, nu s-a observat diferene semnificative asupra esuturilor pancreatice
provenite de la lotul DZ T comparativ cu cele provenite de la lotul DZ. Din punct de vedere
a modificrilor esuturilor renale, s-a evideniat c cele provenite de la lotul DZ T nu au
suferit modificri n aceeai masur ca i cele provenite de la lotul DZ, aadar, extractul
liofilizat administrat a prezentat efecte protectoare asupra aparatului renal, fapt observat
anterior i la analiza parametriilor biochimici. esutul splenic a prezentat un aspect histologic
normal la toate loturile aflate n studiu, neobservndu-se modificri produse de diabet.

27

CAPITOLUL VI. CONCLUZII GENERALE

Studiile originale efectuate i raportate n cea de-a doua parte a tezei de doctorat au
condus la formularea urmtoarelor concluzii generale:
A fost optimizat metoda de extracie i hidroliz a principalilor compui bioactivi din
materialul vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor de in din soiul autohton
Cosmin.
Compuii bioactivi obinui n urma extraciei au fost identificai i dozai cantitativ
prin metode moderne de analiz incluznd cromatografia lichid de nalt performan
(HPLC) cuplat cu spectrometria de mas (MS), spectrofotometria UV-Vis i cromatografia
n faz gazoas (GC).
n urma caracterizrii i determinrii proprietilor antioxidante s-a constatat c soiul
romnesc Cosmin, care este un soi hibrid destinat preponderent obinerii de fibre de calitate
superioar, reprezint totodat i o bun surs de lignani i compui fenolici, fapt care
conduce la utilizarea eficient i n totalitate a plantei de Linum ussitatissimum.
Substanele biologic active obinute prin extracie din material vegetal au fost utilizate
n domeniu farmaceutic prin nglobare n suportul polimeric Xa CS. Studiile cinetice
efectuate n medii similare de pH cu cele ntlnite n tractul gastrointestinal au confirmat c
eliberarea lignanilor i a polifenolilor urmeaz o cinetic de ordin zero. Aceast comportare
ncadreaz sistemele obinute n categoria celor cu eliberare controlat.
S-a formulat un produs de tip coldcrem care a fost caracterizat din punct de vederea
a coninutului n compui bioactivi, a activitii antioxidante i a proprietilor reologice.
Preparatul a fost testat in vitro, studiindu-se difuzia transdermal i in vivo privind
biocompatibilitatea i capacitatea de vindecare a rnilor. Rezultatele evideniaz c preparatul
ar putea fi utilizat pentru repararea i regenerarea n condiii de siguran a esuturilor dermice
afectate.
Extractul liofilizat a fost testat in vivo n vederea evalurii aciunii sale asupra
diabetului zaharat indus prin streptozotocin la obolani. Parametrii biochimici i analizele
morfopatologice confirm faptul c extractul obinut are efect protector asupra esuturilor
afectate i efect benefic asupra parametriilor clinici i biochimici evaluai.
Coninutul ridicat n lignani i compui fenolici, activitatea antioxidant precum i
efectele benefice asupra sntii recomand utilizarea extractului provenit din materialul
vegetal rezultat n urma presrii la rece a seminelor de in din soiul Cosmin att ca aditiv n
industria alimentar i cosmetic ct i n cea farmaceutic.
28

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1

Sainvitu, P., Nott, K., Richard, G., Blecker, C., Jrme, C., Wathelet, J. P., Paquot, M.,

Deleu, M. (2012). Structure, properties and obtention routes of flaxseed lignan

secoisolariciresinol: a review. Biotechnologie, Agronomie, Societe et Environnement, 16(1),
115-124;
2

Popova, I. E., Hall, C., Kubtov, A. (2009). Determination of lignans in flaxseed using

liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry.Journal of Chromatography

A, 1216(2), 217-229;
3

Ibnescu, C., Danu, M., Nanu, A., Lungu, M., Simionescu, B. C. (2010). Stability of

disperse systems estimated using rheological oscillatory shear tests. Academia Romana.
Revue Roumaine de Chimie, 55(11-12), 933-940;
4

Ibnescu, C., Danu, M., Nanu, A., Lungu, M., Simionescu, B. C. (2010). Stability of

disperse systems estimated using rheological oscillatory shear tests. Academia Romana.
Revue Roumaine de Chimie, 55(11-12), 933-940;
5

Singh, B., Sharma, S., Dhiman, A. (2013). Design of antibiotic containing hydrogel wound

dressings: Biomedical properties and histological study of wound healing. International

journal of pharmaceutics, 457(1), 82-91;
6

Heberl, G., Dos Santos, M. A., Magri, S. (2012). Cosmetic formulations containing

blueberry extract (Vaccinium Myrtillus L.). The Online Journal of Science and
Technology, 2(1), 1-6;
7

Hao, H. H., Shao, Z. M., Tang, D. Q., Lu, Q., Chen, X., Yin, X. X., Wu, J., Chen, H. (2012).

Preventive effects of rutin on the development of experimental diabetic nephropathy in

rats. Life sciences, 91(19), 959-967;

29

ACTIVITATEA TIINIFIC N DECURSUL DESFURRII STUDIILOR

DE DOCTORAT
Articole publicate sau n curs de publicare n reviste cotate ISI
1. Draganescu, D., Silion, M., Ignat, I., Srghie, C., Popa, M.I. (2013). Entrapment of
flaxseed extract into xanthan-chitosan complex. Cellulose Chemistry and Technology,
47, 231238;
2. Pag, I. A., Radu, G. D., Draganescu, D., Popa, M.I., Srghie, C. (2014). Flaxseed Cake
A sustainable source of antioxidant and antibacterial extracts. Cellulose Chemistry
and Technology, 48 (3-4), 265-273;
3. Draganescu, D., Ibanescu, C., Tamba, B.I., Andritoiu, C.V., Dodi, G., Popa, M.I.
(2015). Flaxseed lignan wound healing formulation: Characterization and in vivo
therapeutic evaluation, International Journal of Biological Macromolecules, 72, 614623;
4. Dodi, G., Hritcu, D., Draganescu, D., Popa, M.I. Iron oxide nanoparticles for
magnetically assisted patterned coatings, Journal of Magnetism and Magnetic
Materials n curs de evaluare;
5. Draganescu, D., Andritoiu, C.V., Hritcu, D., Dodi, G., Popa, M.I. Antidiabetic effect
of lyophilised flaxseed extract in streptozotocin induced diabetic rats n curs de
finalizare.
Comunicri la manifestri tiinifice naionale i internaionale
1. Pag, A., Radu, D., Draganescu, D., Popa, M.I., Srghie, C. (2012). Obtaining and
Characterisation of flaxseed lignans, International Symposium Research and
Education in Innovation Era (ISREIE), 4th Edition, November 8th 9th, Arad,
Romania;
2. Ignat, I., Radu, D., Pag, A., Draganescu, D. (2012). Extraction and characterisation of
flax seed lignans, International Symposium Research and Education in Innovation Era
(ISREIE), 4th Edition, November 8th 9th, Arad, Romania;
3. Popa, M.I., Ignat, I., Draganescu, D., Pag, A., Srghie, C. (2012). Embedding active
principles from flax seeds extract in xantan-chitosan matrix, International Symposium
Research and Education in Innovation Era (ISREIE), 4th Edition, November 8th 9th,
Arad, Romania;
30

4. Draganescu, D., Srghie, C., Hricu, D., Popa, M.I. (2013). Separation and analysis of
main lignans and phenolic compounds from flaxseed, International Conference of
Applied Sciences, Chemistry and Chemical Engineering, 7th Edition, May 15th 18th,
Bacau, Romania;
5. Draganescu, D., Srghie, C., Silion, M., Popa, N., Popa, M.I. (2013). Nutraceutical and
cosmetic uses of phenolic compounds from flaxseed, International Conference of
Applied Sciences, Chemistry and Chemical Engineering, 7th Edition, May 15th 18th,
Bacau, Romania;
6. Draganescu, D., Srghie, C., Ibanescu, C., Popa, N., Popa, M.I. (2013). Cosmetic use
of lignans from flaxseed, 11th Romanian International Symposium on Cosmetic and
Flavor Products (RISCFP) Knowledge and Creativity in Cosmetology, June 4th 7th,
Iasi, Romania;
7. Draganescu, D., Tamba, B. I., Andritoiu, C. V., Dodi, G., Popa, M.I. (2014). In vivo
wound healing effects of flaxseed extract, International Conference of Applied
Sciences, Chemistry and Chemical Engineering, 8th Edition, May 8th 9th, Bacau,
Romania;
8. Hritcu, D., Dodi, G., Draganescu, D., Popa, M.I. (2014). Magnetic iron oxide particles
for composite coatings, International Conference of Applied Sciences, Chemistry and
Chemical Engineering, 8th Edition, May 8th 9th, Bacau, Romania;
9. Hritcu, D., Dodi, G., Draganescu, D., Popa, M.I. (2014). Magnetite nanoparticles for
composite coatings with patterned roughness, Proceedings of the 5th International
Conference on Nanotechnology: Fundamentals and Applications, August 11th-13th,
Prague, Czech Republic;
10. Dodi, G., Hritcu, D., Draganescu, D., Popa, M.I. (2014). Magnetic nanoparticles for
composite materials with various applications, Summer School Magnetism on a
Molecular Scale: Experiment and Theory, September 17th -19th, Hamburg, Germany.
Training-uri
1. Seminar Aplicaii ale spectrometriei de mas n cercetare, organizat n data de 27
noiembrie 2013, la Institutul de Chimie Macromolecular Petru Poni Iai, de ctre
SC Cromatec Plus n colaborare cu AB Sciex i Institutul de Chimie Macromolecular
Petru Poni;

31

2. Summer School Magnetism on a Molecular Scale: Experiment and Theory,

September 17th -19th 2014, Hamburg, Germany.
Proiecte de cercetare
1. Programul Operaional Sectorial Creterea Competitivitii Economice, Axa prioritar
2 - Competitivitate prin CDI, Operaiunea 2.1.2: "Proiecte CD de nalt nivel tiinific
la care vor participa specialiti din strintate": Plantele liberiene-resurse regenerabile
strategice pentru economia European BASTEURES membru echip;
2. Noi materiale compozite pentru acoperiri superhidrofobe cu proprieti de neaderare a
gheii, Ministerul Educaiei Naionale, CNCS UEFISCDI, numr proiect PN-II-IDPCE-2012-4-0433 membru echip.

32