UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE PROTECIE A MEDIULUI

DOMENIUL : INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE
SPECIALIZAREA : SIGURAN I SECURITATE
AGROALIMENTAR
FORMA DE NVMNT : CU FRECVEN

DETERMINAREA VITAMINEI E DIN

FURAJE
PRIN METODA
CROMATOGRAFICA

PROF. COORDONATOR :
ef lucr. dr. ing. CHI ADRIANA
STUDENT :
BODEA ALEXANDRA

ORADEA
~ 2013 ~

CUPRINS
CUPRINS..2
CAPITOLUL I.........4
NOIUNI GENERALE PRIVIND FURAJELE ( NUTREURILE )....................4
I.1. Generaliti...................................................................................................................................4
I.2. Clasificarea nutreurilor.............................................................................................................4
I.2.1. Suculente..............................................................................................................................5
I.2.1.1. Nutreuri verzi............................................................................................................5
I.2.1.2. Nutreuri nsilozate.....................................................................................................5
I.2.1.3. Semisiloz......................................................................................................................5
I.2.1.4. Rdcinoase.................................................................................................................5
I.2.1.5. Tuberculi.....................................................................................................................6
I.2.2. Fibroase................................................................................................................................6
I.2.2.1. Fnuri..........................................................................................................................6
I.2.2.2. Fin i granule din plante verzi deshidratate.........................................................6
I.2.3. Grosiere................................................................................................................................6
I.2.3.1. Paie de cereale............................................................................................................6
I.2.3.2. Cocenii de porumb......................................................................................................7
I.2.3.3. Ciucalii de porumb....................................................................................................7
I.2.3.4. Vrejurile leguminoase.................................................................................................7
I.2.3.5. Pleava cerealelor.........................................................................................................7
I.2.4. Concentrate.........................................................................................................................7
I.2.4.1. Concentrate cultivate.................................................................................................7
I.2.4.2. Concentrate industriale.............................................................................................7
I.2.4.3. Finuri proteice de origine vegetal.........................................................................8
I.2.4.4. Finuri proteice de origine animal..........................................................................8
I.2.5. Energetice...........................................................................................................................8
I.2.5.1. Grsimi vegetale de uz furajer....................................................................................8
I.2.5.2. Grsimi animale de uz furajer...................................................................................8
I.2.5.3. Zahr furajer...............................................................................................................9
I.2.6. Substane minerale..............................................................................................................9
I.2.6.1. Macroelemente furajere..............................................................................................9
I.2.6.2. Microelemente furajere...............................................................................................9
I.2.7. Aditivi furajeri.....................................................................................................................9
I.2.7.1. Vitaminele....................................................................................................................9
I.2.7.2. Aminoacizii.................................................................................................................9
I.2.7.3. Coloranii.................................................................................................................10
I.2.8. Preparate furajere............................................................................................................10
I.2.8.1. Nutreuri combinate................................................................................................10
I.2.8.2. Premixuri.................................................................................................................11
2

CAPITOLUL II...............................................................................................................11
VITAMINA E.................................................................................................................11
II.1. Distribuie...................................................................................................................................11
II.2. Structur.....................................................................................................................................11
II.3. Rol biochimic..............................................................................................................................11
II.4. Proprieti...................................................................................................................................11
II.5. Carena de vitamina E...............................................................................................................12

CAPITOLUL III..............................................................................................................13
CROMATOGRAFIE LICHID DE NALT PERFORMAN CU FAZ
INVERS (HPLC)...........................................................................................................13
III.1. Factorii care influeneaz separarea n cromatografia de lichide........................................13

CAPITOLUL IV..............................................................................................................15
DETERMINAREA VITAMINEI E ( TOCOFEROLUL ) DIN FURAJE
PRIN
METODA CROMATOGRAFIC.................................................................................15
IV.1. Scop i domeniu.........................................................................................................................15
IV.2. Principiu.....................................................................................................................................15
IV.3. Reactivi.......................................................................................................................................15
IV.4. Aparatur...................................................................................................................................15
IV.5. Modul de lucru...........................................................................................................................16
IV.5.1. Pregtirea probei..............................................................................................................16
IV.5.2. Saponificare......................................................................................................................16
IV.5.3. Extracie............................................................................................................................16
IV.5.3.1. Extracie folosind un tub de separare.....................................................................17
IV.5.3.2. Extracie folosind un aparat de extracie...............................................................17
IV.5.4. Prepararea soluiei prob pentru HPLC.......................................................................17
IV.5.5. Determinare prin HPLC..................................................................................................17
IV.5.6. Calibrare...........................................................................................................................17
IV.5.6.1. DL acetata de tocoferol standard............................................................................17
IV. 5.6.2. DL-alfa-tocoferol standard.....................................................................................18
IV.6. Calcularea rezultatelor.............................................................................................................18

CAPITOLUL V................................................................................................................19
CONCLUZII....................................................................................................................19
BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................20

CAPITOLUL I
NOIUNI GENERALE PRIVIND FURAJELE ( NUTREURILE )
I.1. Generaliti
Sunt considerate nutreuri produsele i subprodusele organice i anorganice care prin procesul de
ingestie sunt folosite ca surse de hran de ctre organismul animal , fr s dauneze asupra snt ii i
produciei acestuia .
Nutreurile utilizate n alimentaia animalelor alctuiesc baza furajer i sunt clasificate dup
origine sau principalele lor nsuiri :
I.2. Clasificarea nutreurilor
Nr.crt.

Grupa nutreurilor

1.

Suculente

2.

Fibroase

3.

Grosiere

4.

Concentrate

5.

Energetice

6.

Substane minerale

7.

Aditivi furajeri

Denumirea nutreurilor din grup

a. nutreuri verzi
b. nutreuri nsilozate
c. semisiloz
d. rdcinoase
e. tuberculi
a. fnuri
b. fin i granule din plante verzi deshidratate
c. fin din nutreuri fibroase
a. paie de cereale
b. coceni de porumb
c. ciucali
d. vrejuri
e. plevuri
a. concentrate cultivate
b. concentrate industriale
c. finuri proteice de origine vegetal
d. finuri proteice de origine animal
a. grsimi vegetale de uz furajer
b. grsimi animale de uz furajer
c. zahr furajer
d. glucoz
e. amidon
a. macroelemente
b. microelemente
a. vitamine
b. aminoacizi
c. colorani

8.

Preparate furajere

a. nutreuri combinate
b. premixuri

I.2.1. Suculente

I.2.1.1. Nutreuri verzi

http://www.all.biz/ro/furaje-verzi

Nutreul verde provine din pajitile naturale sau cultivate destinate consumului directe de ctre
animale sau plante furajere destinate consumului proaspt din recoltatre mecanic . Nutreul verde
reprezint hrana de baz a animalelor n timpul verii , conine substane nutritive cu valoare biologic
ridicat i este uor digestibil .

I.2.1.2. Nutreuri nsilozate

http://www.graiulsalajului.ro

nsilozarea este un procedeu de conservare a plantelor verzi , n scopul asigurrii unei hrane
bogate n substane nutritive i vitamine , suculent i dietetic , la un cost redus .
I.2.1.3. Semisiloz
Sub denumirea de semisiloz se nelege murarea plantelor furajere cnd umiditatea lor este
cuprins ntre 40-50 % . Metoda are avantajul obinerii unui nutre mai bogat n substane nutritive , care
se poate utiliza i n perioada avansat de gestaie la rumegtoare .

I.2.1.4. Rdcinoase
www.seminteplante.ro

Sfecla furajer este apreciat datorit digestibilit ii ridicate 85 % la rumegtoare , 92% la

cabaline , 87 % la suine i 89 % la psri .
Gulia furajer se folosete n hrana vacilor de lapte i n hrana bovinelor de ngrat.
Morcovul furajer este consumat cu plcere de animalele tinere i este uor digestibil.

I.2.1.5. Tuberculi
www.agropataki.ro

Se folosesc n hran dup fierbere i amestecat cu nutre concentrat la porci , vaci cu lapte , g te
i rae .

I.2.2. Fibroase

I.2.2.1. Fnuri
www.amfostacolo.ro

Fnul se obine prin uscarea natural sau artificial a plantelor verzi , nainte de a ajunge la
maturitate fiziologic , prin reducerea umiditii de la 80 % la 13-14 % . Se folose te n hrana ovinelor ,
bovinelor , cabalinelor .
I.2.2.2. Fin i granule din plante verzi deshidratate
Deshidratarea se face la circa 800 C , pentru nlturarea rapid a apei din plante , folosind
instalaii cu mare capacitate de nclzire . Pentru a produce finuri de fn se folosete lucerna sau trifoiul
verde , plante bogate n proteine , provitamine i sruri minerale .
I.2.3. Grosiere

I.2.3.1. Paie de cereale

www.agricultureguide.org

Paiele sunt produse secundare ale cerealelor de toamn sau primvar ( gru , orz , secar , orez ) .
Ele au un coninut ridicat de celuloz , deaceea sunt valorificate mai bine de rumegtoare , care diger
50 % din substana uscat , iar cabalinele numai 30 % .

I.2.3.2. Cocenii de porumb

www.ziarulfaclia.ro

Sunt utilizai n hrana vacilor cu lapte i bovinelor la ngrre cu rol de balast intestinal , fr a fi
un aliment de baz n hrana animalelor .
I.2.3.3. Ciucalii de porumb
Se utilizeaz sub form mcinat i n amestec cu melasa , borhot umed , nutre combinat i nutre
murat .

I.2.3.4. Vrejurile leguminoase

www.revis
taplafar.ro

Provin din recoltarea boabelor de fasole , mazre , lucern sau trifoi , fiind reprezentate de
tulpinile , frunzele i pstile uscate ale plantelor . Se utilizeaz n hrana bovinelor adulte , iar la ovine
sub form de amestec cu nutre .
I.2.3.5. Pleava cerealelor
Este nutritiv superioar paielor , mai digestibil . Plevurile se consum ca atare , dar este mai
indicat n amestec cu sfecla . Se recomand n hrana bovinelor adulte .
I.2.4. Concentrate

I.2.4.1. Concentrate cultivate

www.frumusetea-naturii.blogspot.ro

Din aceast grup fac parte boabele de graminee , seminele de la leguminoase , oleaginoase ,
caracterizate prin digestibilitate ridicat i un coninut ridicat de substane nutritive . Boabele de
graminee cele mai des utilizate sunt boabele de porumb , orz , ovz , secar , gru , care nu se
administreaz n hrana animalelor imediat dup recoltare ci numai dup o perioad de maturare de circa
6-8 sptmni .

I.2.4.2. Concentrate industriale

www. farmaciadomnului.blogspot.ro

Trele rezultate n urma mcinrii cerealelor sunt valoroase pentru consumul furajer datorit
coninutului ridicat de protein , vitamine din complxul B . Trele de gru i secar sunt recomandate
7

pentru vacile cu lapte , iar cele de orz , ovz i porumb , mai bogate n celuloz , se recomand bovinelor
la ngrat .

I.2.4.3. Finuri proteice de origine vegetal

www. havanacafe.ro

Fina furajer se obine prin mcinarea grului i orzului i se folosete n hrana porcilor de
ngrat .

I.2.4.4. Finuri proteice de origine animal

www.recolta.eu

Acestea reprezint o surs important de proteine , grsimi i vitamina B , rezultate din

prelucrarea produselor animaliere n fabricile de lapte , de conserve de pete sau abatoare . Laptele
smntnit deshidratat se folosete n hrana purceilor i vieilor . Fina de carne este utilizat n cre terea
psrilor , a tineretului .
I.2.5. Energetice

I.2.5.1. Grsimi vegetale de uz furajer

www.sanatate.bzi.ro

Sunt utilizate numai sub form de ulei de porumb sau soia n roturi i nutre uri combinate
aducnd un important aport de grsimi . Au o digestibilitate ridicat i un con inut ridicat n acizi gra i
nesaturai .

I.2.5.2. Grsimi animale de uz furajer

www.e-retete.ro

Din aceast grup fac parte untura de porc , seul i jumrile de abator rezultate din prelucrarea
produselor de abator . Untura de porc se folosete n prelucrarea nutreurilor combinate . Jumrile de

abator dau rezultate bune n n hrana tineretului porcin i a psrilor datorit coninutului relativ bun de
proteine .

I.2.5.3. Zahr furajer

www.descopera.ro

Este utilizat ca stimator energetic pentru animalele care depun eforturi fizice caii de galop , trap
, obstacole , cinii de curse care au nevoie de resurse furajere energetice concentrate .
I.2.6. Substane minerale
I.2.6.1. Macroelemente furajere
Din categoria de macroelemnte fac parte : Ca, P, K, Na, Mg, Cl, S . Acestea fac parte din hrana
porcilor , psrilor , taurinelor i n special a animalelor tinere .
I.2.6.2. Microelemente furajere
Din aceast categorie fac parte : Fe, Cu , Co , Mn , Zn , I . Aceste microelemente fac parte din
grana porcior , ovinelor , puilor de gin i de curc .
I.2.7. Aditivi furajeri
I.2.7.1. Vitaminele
Vitamina A poate fi sintetizat pe cale industrial prin suplimentarea nutre urilor combinate cu
aceasta .
Vitamina D3 sintetic este utilizat n amestecurile combinate pentru a suplini lipsa lor din
nutreurile de origine vegetal .
Vitamina E este necesar a se suplimenta mai ales la animalele crescute n sistem intensiv , care nu
pot sintetiza vitamina E .
Vitamina C se produce i pe cale sintetic , acidul ascorbic fiind necesar mai ales la animalele
crescute n condiii intensive de cretere .
n hrana animalelor se mai gasesc vitaminele din complexul B i vitamina K.
I.2.7.2. Aminoacizii
Cele mai utilizate preparate de aminoacizi sunt :
L lizina furajer folosit n nutre combinat pe baz de porumb ( porci i viei 0 6 luni ) ;
DL metionina folosit n nutreuri combinate ( purcei , pui de carne ) .

I.2.7.3. Coloranii
www.ripostafacile.it

Pigmenii vegetali se realizeaz prin extract de lucern sau fin de ardei n nutreurile combinate
, cu scopul realizrii pigmentrii pielii puilor broiler sau a glbenuului de ou .
I.2.8. Preparate furajere
I.2.8.1. Nutreuri combinate
Nutreul combinat este un amestec omogen format din mai multe macro i micro componente ,
care satisface cerinele nutritive pentru specia i categoria la care este destinat .
I.2.8.2. Premixuri
Premixurile sunt amestecuri de vitamine , antibiotice , aminoacizi , minerale i furaje proteice ,
care sunt utilizate pentru combaterea stresului , a unor afeciuni nutriionale sau simularea produciei .

CAPITOLUL II
VITAMINA E

10

www.getfit.ro

II.1. Distribuie
Tocoferolii sunt de origine exclusiv vegetal , fiind rspndii n majoritatea plantelor , n frunze
verzi , n uleiuri vegetale ca cel din germenii de gru i porumb.
II.2. Structur
Se cunosc mai multe tipuri de tocoferoli , ns cel mai important ca activitate biologic este tocoferolul.

Sunt substane uleioase de culoare galben , instabile n prezena agenilor oxidani , solubile n
lipide i solveni ai acestora . Absoria lor se realizeaz la nivelul intestinului subire i este facilitat de
prezena acizilor biliari .Manifest activitate optic datorit atomului de carbon asimetric izomerul
natural fiind cel dextrogir .
II.3. Rol biochimic
Manifest activitate antioxidant , protejnd antioxidrii acizii grai nesaturai , retinolii i
carotinele ; protejeaz sistemele mitocondriale de inhibiia ireversibil a peroxizilor lipidici ; proprietate
antioxidant i de participare ca transportatori de hidrogen n procesele de oxido-reducere .
De asemenea , tocoferolii protejeaz anumite enzime care particip n procesul de respira ie
celular , intervin n controlul asupra vitezei de biosintez a ADN , favorizeaz sinteza cromatinei ,
particip n reglarea consumul de oxigen n esutul muscular , cresc rezistena oragnismului fa de
infecii .
II.4. Proprieti
Tocoferolul are urmtoarele proprieti :
intervine in metabolismul grsimilor, al calciului i al fosforului, ca i n sinte za
proteinelor;
limiteaz producerea de colesterol;
controleaz eliminarea apei din organism;
previne mbtrnirea celulelor;
ntrete i protejeaz inima i arterele mpotriva instalrii aterosclerozei;

11

fortific musculatura si esutul conjunctiv, ca i funcia sexual i capacitaile mintale;

acioneaz pozitiv asupra circulaiei sanguine periferice i a regenerrii pielii;
are efect diuretic i hipotensiv;
ajut la prentmpinarea producerii avorturilor;
scade riscul instalrii ischemiilor cardiace;
atenueaz ritmul procesului de mbtrnire;
este eficient in diabetul zaharat, arsuri i rni greu vindecabile, atrofie testicular ,
ovarian i uterin , impotena, sterilitate feminin i masculin;
amelioreaz ritmul de dezvoltare a organelor genitale la pubertate;
intervine in caz de menstruaii dureroase, tulburri de menopauz , tulburri de cretere la
copii, in miocardite, angina pectorala si insuficien cardiac , ateroscleroz (cu exceptia
hipotensivilor), putnd atenua chiar si simptomele afeciunilor deja instalate ;
are rol benefic in tratarea eczemelor, acneei, psoriazisului, miopiei evolutive, a opacifierii
cristalinului i cataractei, ca i in boala Parkinson etc.

II.5. Carena de vitamina E

Carena de vitamina E duce la distrofii musculare i la apariia unor leziuni nervoase,
precum i la instalarea atero-sclerozei. La femei, hipovitaminoza E poate produce avort spontan.
Trebuie amintit i faptul c insuficiena vitaminic respectiv provoac boli ale muchilor i ale
nervilor, iar cantitatea de colesterol crete n snge i n muchi. Tulburrile produse n organism
de carena de vitamina E sunt reversibile la femei si ireversibile la brbai. La aduli, aceast
carena vitaminic produce i o uoar scdere a duratei de via a globulelor rosii. Eficacitatea
tocoferolului sporete prin asocierea acestuia cu vitaminele A, B, si C, cu inozitolul, precum i
prin aportul de mangan si seleniu. Tocoferolul intensific activitatea vitaminei A.

CAPITOLUL III

12

CROMATOGRAFIE LICHID DE NALT PERFORMAN

CU FAZ INVERS (HPLC)
Cromatografia este o metod fizico-chimic modern, considerat nu doar o metod de separare;
n majoritatea variantelor ea prezint o metod analitic hibrid,care mbin separarea cu identificarea
ulterioar i dozarea componenilor depistai n amestecurile complexe. Termenul de cromatografie de
lichide este utilizat pentru a denumi o gama extinsa de sisteme cromatografice care au n comun faptul
ca utilizeaz o faza mobila lichid . Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul c
permite i analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul c i faza mobil particip la
separare ofer posibiliti suplimentare pentru realizarea unor separri eficiente.
Cromatografia de lichide clasic a fost caracterizat de utilizarea unor coloane cu diametre mari,
umplute cu particule de faza staionar de o granulaie fin i prin care faza mobil trecea sub influen a
forei gravitaionale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi n separrile cromatografice lichid-solid, au
permis realizarea separrii unor amestecuri complexe de substane n condiii foarte bune, ns viteza de
separare este mic iar analiza suplimentar a compuilor separai prin metode spectroscopice este mai
dificil. Apariia cromatografiei de lichide de nalt performan (HPLC) a permis eliminarea acestor
deficiene si chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metod mai performant de analiz dect
cromatografia de gaze.
Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de nalt performan sunt:
-

Capacitate de separare ridicat

Viteza ridicat a separrii

Posibilitatea monitorizrii continue a efluentului coloanei

Realizarea unor analize repetate si reproductibile utiliznd aceeai coloana

Automatizarea procedurii analitice si a prelucrrii datelor.

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horvth la Universitatea din Yale n
1964 i tehnica a fost denumit cromatografie de lichide de nalta performan (HPLC). n continuare,
termenul care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de nalt performan . Prima separare
realizat de grupul lui Horvth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea
extraordinar a acestei tehnici n ultimii zeci de ani se datorete n mare msur faptului c a permis
analiza unor compui care puteau fi separai foarte greu pe alte ci, de exemplu a biomoleculelor.
Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:
-

cromatografia de adsorbie lichid-solid (LSC)

cromatografia de repartiie lichid-lichid (LLC)

cromatografia ionica (IC)

cromatografia prin excluziune (SEC)

III.1. Factorii care influeneaz separarea n cromatografia de lichide

Pentru a putea utiliza cromatografia de lichide ca metod de analiz n condiii satisfctoare, nu
este necesar cunoaterea n amnunt a teoriei cromatografiei de lichide, dar este indispensabil
stpnirea noiunilor de baz, mai ales pentru a se putea face selecia fazelor cromatografice ntr-o
manier corect.

13

n ciuda complexitii aparente a instrumentului, parte a analizei cromatografice este procesul de

separare care are loc n coloan, restul aparaturii avnd doar rolul auxiliar de a asigura depozitarea fazei
mobile, asigurarea compoziiei sale stabilite i a presiunii de intrare n coloan, introducerea probei,
detectarea componentelor separate i procesarea datelor. Ca urmare a modului n care este conceput
designul aparatelor moderne, aceast esen se pierde ns de multe ori n spatele complexit ii
electronice sau inginereti a ntregului sistem. Rezultatul este ca rolul important al funciunii coloanei
este neles doar superficial i tehnica cromatografic nu este utilizat ntr-o manier adecvat.
n timpul separrii cromatografice n coloana au loc doua procese care se produc simultan,
continuu si aparent independent una de alta. Prima este deplasarea fiecrei soluie printr-o succesiune de
echilibre de distribuie ntre faza mobil si cea staionar, n conformitate cu coeficientul su de
distribuie . Al doilea proces este specific coloanei, care trebuie s limiteze dispersia natural a solu iilor
astfel nct la ieirea din coloan fiecare soluie s se regseasc sub forma unei benzi de elu ie ct mai
nguste si distincte de celelalte. Primul proces, cel al reteniei componentelor, este de natur
termodinamic i poate fi controlat prin alegerea corespunztoare a naturii fazelor cromatografice. Cel
de-al doilea proces este, n esen, de natura cinetic i depinde de proprietile fizice ale componentelor
sistemului de separare cromatografic: faza staionar i faza mobil. Pentru a putea realiza o separare
optim, pentru fiecare prob va trebui gsit perechea de faze cea mai potrivit i selectat coloana
corespunztoare.
n cromatografia de lichide, ecuaia esenial care permite nelegerea procesului de retenie si
identificarea parametrilor cu ajutorul crora va fi posibil optimizarea analizei este ecuaia volumului de
retenie.

unde VM este volumul mort al coloanei, K este coeficientul de distribuie al solutului, iar VS este volumul
fazei staionare. Aceast relaie este dedus pe baza teoriei talerelor a lui Martin i Synge, perfecionat
apoi de ali autori. n cromatografia de lichide, spre deosebire de cromatografia de gaze, volumul fazei
staionare din coloan nu mai poate fi definit aa de net. n majoritatea cazurilor, n separare nu intervine
ntregul acest volum ci numai volumul fazei staionare disponibil solutului.
Separarea a doi compui va fi posibil dac volumele lor de reten ie vor fi diferite, adic n cazul
n care fie coeficienii de distribuie ai celor doi solui vor fi diferii, fie volumul de faz sta ionar
disponibil fiecrui component al amestecului analizat va fi diferit. Aadar pentru a realiza separarea
dorit trebuie studiai factorii care influeneaz aceti doi parametri, coeficientul de distribuie si
volumul fazei staionare disponibile.

CAPITOLUL IV

14

DETERMINAREA VITAMINEI E ( TOCOFEROLUL ) DIN FURAJE

PRIN METODA CROMATOGRAFIC

IV.1. Scop i domeniu

Aceast metod se folosete pentru determinarea vitaminei E din furaje i premixuri . Con inutul
de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol / kg . Astfel , 1 mg DL acetat de tocoferol
corespunde la 0,91 mg DL tocoferol ( vitamina E ) . Limita de determinare este de 2 mg vitamina E / kg.
IV.2. Principiu
Proba este hidrolizat cu soluie de hidroxid de potasiu etanolic , iar vitamina E este extras n eter
de petrol . Solventul este nlturat prin evaporare , iar reziduul este dizolvat n metanol i , dac este
necesar , diluat pn la concentraia necesar . Coninutul de vitamina E este determinat prin lichid
cromatografie de nalt performan cu faz inversat ( RP-HPLC ) , folosindu-se un detector cu
fluorescen sau UV .
IV.3. Reactivi
3.1. Etanol
3.2. Eter de petrol , fracia 40C - 60C
3.3. Metanol
3.4. Soluie de hidroxid de potasiu , beta = 50 g/100 ml
3.5. Soluie de ascorbat de sodiu , beta = 10 g / 100 ml
3.6. Sulfit de sodiu , Na2S x H2O ( x = 7-9 )
3.6.1. Soluie de sulfit de sodiu , c = 0,5 mol/l n glicerol , beta = 120 g/l ( pentru x=9 )
3.7. Soluie de fenolftalein , beta = 2g/100 ml n etanol
3.8. Faza mobil pentru HPLC : amestec de metanol i ap , de exemplu : 980+20 (v+v ) . Raportul
exact trebuie s fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite .
3.9. Azot , liber de oxigen
3.10. DL-alfa-tocoferol acetat , extrapur , cu activitate certificat
3.10.1. Soluie stoc din DL-a-acetat de tocoferol: se cntresc , cu aproximaie de 0,1 mg , 100 mg
DL-a-acetat de tocoferol ntr-un balon gradat de 100 ml . Se dizolv n etanol i se completeaz pn la
semn cu acelai solvent . Astfel , 1 ml din aceast soluie conine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol
3.11. DL-alfa-tocoferol , extrapur , cu activitate certificat
3.11.1. Se cntresc , cu aproximaie de 0,1 mg , 100 mg de DL-alfa-tocoferol , ntr-un balon
gradat de 100 ml . Se dizolv n etanol i se completeaz pn la semn cu acela i solvent . Astfel , 1 ml
din aceast soluie conine 1 mg DL-alfa-tocoferol
3.12. 2,6 di-ter-butil-metifenol ( BHT ).
IV.4. Aparatur
4.1. Evaportaor rotativ cu vacuum
4.2. Sticlrie brun
4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml , cu slif
4.2.2. Baloane cotate , cu dopuri rodate , cu gt strmt , cu capacitate de 10 , 25 , 100 i 500 ml

15

4.2.3. Plnii de separare conice , de 1000 ml , cu dopuri de sticl

4.2.4. Baloane de 250 ml
4.3. Condensator Allihn , de 300 mm , cu legtur din sticl , cu adaptor pentru o pip de
aprovizionare cu gaz
4.4. Hrtie de filtru pentru separare fazic , cu diametrul de 185 mm ( de exemplu Schleicher &
Schuell 597 HY1/2 sau similar )
4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecie
4.5.1. Coloan de lichid cromatografie , 250 mm x 4 mm , C18 , de 5 ori 10 m sau ecchivalent
4.5.2. Detector UV sau de fluorescen , cu ajustare variabil a lungimii de und
4.6. Spectofotometru cu cuve de cuar de 10 mm
4.7. Baie de ap cu agitator magnetic
4.8. Aparat de extracie constnd din :
4.8.1. Cilindru de sticl cu capacitate de 1 l , cruia i se pun un gt i un dop de sticl
4.8.2. Muf din sticl mat , echipat cu un bra exterior i cu un tub ajustabil ce trece prin centru .
Tubul ajustabil trebuie s aib un capt n form de U situat n partea de jos i un capt efilat la partea
opus , astfel nct stratul superior de lichid din cilindru s poat fi transferat ntr-o plnie de separare .
IV.5. Modul de lucru
NOT : Vitamina E este sensibil la lumina ( UV ) i oxidare . Toate operaiunile trebuie
efectuat n absena luminii ( folosindu-se sticlrie brun sau sticlrie protejat cu folie de aluminiu ) i a
oxigenului ( a se spla cu azot ) . n timpul extraciei , aerul de deasupra lichidului trebuie nlocuit de
azot ( a se evita presiunea , prin lrgirea dopului din cnd n cnd ).
IV.5.1. Pregtirea probei
Se mrunete proba astfel nct s treac printr-o sit cu ochiuri de 1 mm , avndu-se grij s se
evite generarea de cldur . Mrunirea trebuie efectuat imediat nainte dce cntrire i saponificare ,
astfel pot avea loc pierderi de vitamina E .
IV.5.2. Saponificare
n funcie de coninutul de vitamina E , se cntresc cu aproxima ie de 0,01 g , 2 pn la 25 g din
prob , ntr-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic . Se adaug n continuare , prin amestecare , 130
ml etanol , aproximativ 100 mg BHT , 2 ml soluie de ascorbat de sodiu i 2 ml solu ie de sulfit de
sodiu . Se potrivete un condensator la balon i se scufund balonul ntr-o baie de ap cu agitator
mecanic . Se nclzesc pn la fierbere i se las la reflux timp de 5 minute . Se adaug apoi 25 ml de
soluie de hidroxid de potasiu prin condensator i se las la reflux timp de 25 de minute , agitndu-se sub
un flux de azot apoi se cltete condensatorul cu aproximativ 20 ml ap i se rcete coninutul balonului
la temperatura camerei .
IV.5.3. Extracie
Se transfer , prin decantare , ntreaga soluie de saponificare , prin cltire cu un volum total de
250 ml ap pn la 1000 ml , a plniei de separare sau a aparatului de extracie . Se clte te balonul de
saponificare , n continuare , cu 25 ml etanol i 100 ml eter de petrol i se transfer solu iile de cltire n
tubul de separare sau n aparatul de extracie . Proporia de ap i etanol n solu iile combinate trebuie s
fie de 2:1 . Se scutur viguros timp de dou minute i se las s se sedimenteze timp de dou minute .
IV.5.3.1. Extracie folosind un tub de separare . Cnd straturile de lichid s-au separat , se transfer
stratul de eter de petrol ntr-un alt tub separator . Se repet aceast extracie de dou ori cu 100 ml eter

16

de petrol i de dou ori cu 50 ml eter de petrol . Se spal extractele combinate n tubul de separare , de
dou ori , prin amestecare uoar ( pentru a se evita formarea emulsiilor ) , cu cantit i de 100 ml ap i
apoi cu cantiti de 100 ml ap , cu agitare repetat , pn cnd apa rmne incolor la adugarea soluiei
de fenolftalein ( splarea de patru ori este de obicei suficient ) . Se filtreaz extractul splat printr-un
filtru mpturit , pentru separare fazic , pentru a se nltura orice cantitate de ap n suspensie , ntr-un
balon gradat de 500 ml . Se spal tubul de separare i filtrul cu 50 ml eter de petrol , se umple pn la
semn cu eter de petrol i se amestec bine .
IV.5.3.2. Extracie folosind un aparat de extracie . Cnd straturile s-au separat se nlocuiete
dopul cilindrului de sticl printr-o inserie din sticl i se aranjeaz captul de jos n form de U al
tubului ajustabil , astfel nct s se afle deasupra nivelului interfeei . Prin aplicarea unei presiuni de la
generatorul nitrogenului , prin braul exterior , se transfer stratul superior de eter de petrol ntr-un tub de
separare de 1000 ml . Se adaug 100 ml eter de petrol n cilindrul de sticl , se ata eaz dopul i se agit
bine . Se las straturile s se separe i se transfer stratul de deasupra n tubul de separare , ca i
mainainte . Se repet procedura extraciei cu nc 100 ml eter de petrol , apoi de dou ori cu cantit i de
50 ml de eter de petrol i se adaug straturi de eter de petrol tubului de separare . Se spal extractele
combinate din eter de petrol , dup cum este descris 5.3.1. , i se procedeaz dup cum este descris acolo
.
IV.5.4. Prepararea soluiei prob pentru HPLC . Se pipeteaz o cantitate din soluia de eter de petrol
ntr-un balon n form de par , de 250 ml . Se evapor solventul aproape de uscare pe evaporatorul
rotativ cu presiune redus , la o temperatur a bii ce nu depete 40C . Se readuce la presiunea
atmosferic prin admisie de azot i se ndeprteaz balonul de pe evaporatorul rotativ . Se nltur
solventul rmas printr-un curent de azot i se dizolv imediat reziduul cu un volum cunoscut ( 10 100
ml ) de metanol ( concentraia de DL alfa- tocoferol trebuie s fie ntre 5 g/ml i 30 g/ ml ) .
IV.5.5. Determinare prin HPLC . VITAMINA E este separat pe o coloan cu faz inversat de C18 ,
iar concentraia este msurat printr-un detector de fluorescen ( excitaie : 295 nm , emisie : 330 nm )
sau un detector de UV ( 292 nm ) . Se injecteaz o fracie alicot ( de exemplu : 20 l ) de solu ie
metanolic obinut conform pct. 5.4. i se realizeaz o eluie cu faza mobil . Se calculeaz media
nlimii peak ului mai multor injecii din aceiai soluie de prob i mediile nl imii peak ului ale
mai multor injecii ale soluiilor de calibrare .
Condiii HPLC : - coloan de lichid cromatografie : 250 mm x 4 mm , C18 , ambalaje de cinci ori
zece m sau echivalent ;
- faza mobil : amestec de metanol i ap , de exemplu : 980+20 (v+v) ;
- rata de curgere : 1-2 ml /min ;
- detector : detector cu fluorescen .
IV.5.6. Calibrare ( DL acetat de tocoferol sau DL-alfa-tocoferol )
IV.5.6.1. DL acetata de tocoferol standard
IV.5.6.1.1. Prepararea soluiei standard de lucru : se transfer cu o pipet 25 ml soluie de DL
acetat de tocoferol , ntr-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic i se hidrolizeaz dup cum este
descris la pct . 5.2. , dar fr a se aduga BHT . Apoi se extrage cu eter de petrol , n concordan cu pct .
5.3. , i se completeaz pn la 500 ml cu eter de petrol . Se evapor 25 ml din acest extract , pe
evaporatorul rotativ pn aproape de uscare , se nltur solventul rmas cu un curent de nitrogen i se
redizolv reziduurile n 25,0 ml metanol . Concentraia nominal a acestei soluii este 45,5 g DL-alfa-

17

tocoferol / ml , echivalent cu 50 g DL-alfa-tocoferol acetat / ml . Soluia standard de lucru trebuie

preparat proaspt nainte de folosire .
IV.5.6.1.2. Prepararea soluiilor de calibrare sau a graficului de calibrare : se transfer 1,0 ;
2,0 ; 4,0 i 10,0 ml din soluia standard de lucru ntr-o serie de baloane gradate de 20 ml , se completeaz
pn la semn cu metanol i se amestec . Concentraiile nominale ale acestor soluii sunt : 2,5 ; 5,0 ; 10,0
i 25,0 g / ml DL-alfa-tocoferol acetat , de exemplu : 2,28 ; 4,55 ; 9,10 g / ml DL-alfa-tocoferol . Se
injecteaz 20 l din fiecare soluie de calibrare de mai multe ori , i se determin media nl imii peakului . Folosindu se mediile nlimii peak-ului , se ntocmete un grafic de calibrare .
IV.5.6.1.3. Standardizarea UV a soluiei de tocoferol acetat : se dizolv 5,0 ml soluie de
tocoferol acetat pn la 25,0 ml cu etanol i se msoar spectrul UV al soluiei fa de etanol , cu un
spectofotometru la o lungime de und ntre 250 nm i 320 nm . Absoria maxim trebuie s fie la 284 nm
: E (1 cm) % = 43,6 la 284 nm n etanol . La aceast diluie trebuie obinut o valoare de extinc ie de
aproximativ 0,84 0,88 .
IV. 5.6.2. DL-alfa-tocoferol standard
IV.5.6.2.1. Prepararea soluiei standard de lucru : se transfer , cu pipeta , 2,0 ml solu ie de
tocoferol acetat ntr-un balon cotat de 50 ml , se dizolv n metanol i se completeaz pn la semn cu
metanol . Concentraia nominal a acestei soluii este de 40 g DL tocoferol acetat / ml , echivalent cu
44,0 g de tocoferol acetat / ml . Soluia standard de lucru trebuie preparat proaspt nainte de folosire
.
IV.5.6.2.2. Preparaea soluiilor de calibrare i a graficului de calibrare : se transfer 1,0 ; 2,0 ;
4,0 i 10,0 ml din soluia standard de lucru diluat , ntr-o serie de baloane gradate de 20 ml , se
completeaz pn la semn cu metanol i se amestec . Concentraiile nominale ale acestor solu ii sunt :
2,0 ; 4,0 ; 8,0 i 20,0 g / ml i 22,0 g / ml tocoferol acetat . Se injecteaz 20 l din fiecare solu ie de
calibrare de mai multe ori i se determin mediile nlimii peak ului . Folosindu se mediile nl imii
peak ului , se ntocmete un grafic de calibrare .
IV.5.6.2.3. Standardizarea UV a soluiei DL-alfa-tocoferol : se dizolv 2,0 ml pn la 25,0 ml
din soluia stoc de tocoferol cu etanol i se msoar spectrul UV al acestei soluii fa de etanol , cu
spectofotometru la lungime de und ntre 250 nm i 320 nm . Absoria maxim trebuie s fie la 292 nm :
E (1cm) % = 75,8 la 292 nm n etanol . La aceast diluie trebuie obinut o valoare de extincie de 0,6 .
IV.6. Calcularea rezultatelor
Pornindu se de la media nlimii peak ului pentru vitamina E a solu iei de prob , se
determin concentraia soluiei de prob n g / ml prin referire la graficul de calibrare ( pct. 5.6.1.2. sau
5.6.2.2. ) .
Coninutul w de vitamina E n mg/kg de prob este dat de urmtoarea formul :
W = 500 x beta x V2 ( mg / kg ) / V1 x m1 ,
n care :
beta = concentraia de vitamina E din soluia de prob n Ul / ml ;
V1 = volumul soluiei de prob folosit la pct . 5.4. n g / ml ;
V2 = volumul cantitii alicote folosite la pct . 5.4 n ml ;
m = masa poriunii de testat , n g .

18

CAPITOLUL V
CONCLUZII

V.1. Pentru probe cu concentraie redus de vitamina E poate fi util s se combine extractele de eter
de petrol din dou ncrcturi de saponificare (cantitate cntrit : 25 g)
ntr-o soluie de prob , pentru determinare HPLC .
V.2. Greutatea probei utilizate pentru analiz nu ar trebui s conin mai mult de 2 g de grsime .
V.3. Dac separarea fazic nu are loc , se adaug aproximativ 10 ml etanol , pentru a ntrerupe
emulsia .
V.4. Dup msurarea cu spectofotometrul a soluiei de tocoferol acetat sau DL-alfa-tocoferol , se
adaug aproximativ 10 mg BHT la soluie i se pstreaz soluia la frigider ( perioad de pstrare de
maximum 4 sptmni ) .
V.5. Poate fi folosit hidrochinona n loc de BHT .
V.6. Folosindu se o coloan fazic normal , este posibil separarea unui a- , beta- , Y i d- tocoferol
.
V.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic n loc de soluie de ascorbat de sodiu .
V.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA n loc de soluie de sulfit de sodiu .

19

BIBLIOGRAFIE

1. Carmen Hura " Ghid de laborator . metode de analiza pentru produse alimentare " ,
Editura Cermi , Iasi , 2006 .
2. Marcu N. , Mierlu D. , - "Zootehie general i alimenta ie " , Editura Digital Data ,
Cluj Napoca , 2006 .
3. Tma V. , erban M. , Cotru Maria " Biochimie medical veterinar " , Editura
Didactic i Pedagogic , Bucureti , 1981 .
4. Popescu N., Popa G., Stnescu V., - " Determinri fizico chimice de laborator pentru
produsele alimentare de origine animal ", Editura Ceres , Bucureti , 1986 .
5. Rotaru O. i M. Mihaiu - " Igiena veterinar a produselor alimentare Patologie prin
alimente ", Editura Todesco, Cluj Napoca , 2002 .
6. http://www.scribd.com/doc/48633070/cunoasterea-nutreturilor

20