VALIDAREA

METODELOR DE
ANALIZ
1

Validarea unei metode analitice, conform

Farmacopeei Statelor Unite ale Americii 28, este procesul
prin care se stabilete prin studii de laborator, dac acea
metod ndeplinete condiiile pentru aplicaiile
analitice pentru care a fost pus la punct.
Validarea este aadar, o etap important n
determinarea reproductibilitii i siguranei metodei,
deoarece poate confirma dac metoda este potrivit
pentru a fi utilizat pentru un anumit sistem.

n laboratoarele de analiz, validarea are la baz

standarde, cum ar fi:
Bunele practici de producie (Good Manufacturing Practices GMP)
Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP)
Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc.
Alte reguli pentru validare sunt stabilite de:
Organizaia Internaional a Standardelor (ISO) n seriile 9000
i 17025
Normele Europene (EN 45001)
Farmacopeea Statelor Unite ale Americii (United States
Pharmacopoeia - USP)
Agenia Alimentelor i Medicamentului (Food and Drug
Administration - FDA)
Agenia pentru Protecia Mediului (Environmental Protection
Agency - EPA).
3

Este important de precizat c la ora actual nu exist un

consens n ceea ce privete diferitele documente de
reglementare internaional (ISO, ICH, Afnor, Sanco, FDA, ANM,
Conferina de la Washington) pentru definirea criteriilor care
trebuie testate n faza de validare.
De exemplu criteriul de liniaritate este prezentat diferit
de la un document la altul, n cazul n care acesta apare printre
criterii.
Acelai lucru se ntmpl pentru exactitatea mediei care
poate fi confundat cu exactitatea n unele documente.
Ca o parantez, n limba romn confuzia este foarte
uoar, datorit faptului c pentru termenii din limba englez i
francez (trueness/justesse i accuracy/exactitude) exist un
singur cuvnt romnesc - exactitate.
De aceea s-a propus pentru trueness echivalentul
exactitatea mediei pentru c se refer la exactitatea dintre
media mai multor msurtori i o valoare convenional
adevrat.
4

Criterii de validare dup Farmacopeea European

Criterii
Fidelitatea
(precizia)
Exactitatea
(acurateea)
Limita de
detecie
Limita de
cuantificare
Specificitatea
Intervalul de
validitate
Liniaritatea
Robusteea

Determinarea
Determinarea
principiului activ impuritilor sau
sau a produilor
produilor de
finii
degradare
Da

Da

Nu

Nu

Nu

Nu

Nu

Da

Teste pentru
limitele de
impuriti
Nu

Teste farmacotehnice
Da

Da

Da

Da

Da

Nu

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Nu
Da

Da
Da
5

Criterii de validare dup Comunitatea Economic

European (CEE)
METODA

CRITERII DE VALIDARE

Identificarea/ detecia

specificitatea

Determinarea coninutului de
impuriti

specificitatea
limita de detecie
limita de cuantificare

Determinarea coninutului
(concentraiei) sau a activitii
substanei active

specificitatea
fidelitatea
repetabilitatea
reproductibilitatea
exactitatea
liniaritatea
intervalul de liniaritate
sensibilitatea
6

Normele IUPAC menioneaz c validarea poate fi:

Validare

ntr-un singur laborator atunci cnd se

verific viabilitatea metodei naintea unui studiu n
colaborare (ntre mai multe laboratoare) i asigur faptul
c metoda pus la punct este utilizat corect.

Validare complet caracteristicile metodei au fost

verificate de multiple laboratoare, n colaborare.

SPECIFICITATEA / SELECTIVITATEA
n limbajul comun, termenii de specificitate i
selectivitate sunt deseori interschimbabili.
O metod este specific dac este adecvat pentru un
singur analit, n timp ce o metod este selectiv dac poate fi
utilizat pentru mai muli analii care pot fi ns difereniai
sau, cu alte cuvinte, reprezint capacitatea unei metode de a
cuantifica cu acuratee i specific analitul sau analiii n
prezena altor compui.
Selectivitatea implic capacitatea de a separa analitul de
produii de degradare, metabolii (n cazul medicamentelor)
i ali compui prezeni n prob.
n
cazul
medicamentelor,
USP
28,
definete
specificitatea ca fiind capacitatea de a analiza analitul n
prezena altor componeni cum ar fi impuriti, produi de
8
degradare i matricea.

IUPAC i AOAC (Asociaia Stiinific Dedicat

Excelenei n Metode Analitice) utilizeaz termenul de
selectivitate mai mult dect cel de specificitate pentru
metodele care sunt complet selective, pe cnd USP, ICH
(Conferina Internaional De Armonizare A Cerinelor
Tehnice Pentru nregistrarea Produselor Farmaceutice
de Uz Uman) i FDA folosesc termenul specificitate.

n tehnicile cromatografice, selectivitatea metodei

poate fi dovedit printr-o bun separare ntre analit i
alte componente (cum ar fi excipieni, impuriti,
produi de degradare i metaboliii).
Rezoluia de separare a analitului trebuie s fie de
1,5-2 ori mai mare dect a celorlalte componente.
Pentru a mpiedica coeluia altor substane,
trebuie s fie cercetat puritatea peak-ului analitului.
De exemplu, pentru a determina puritatea peakului se apeleaz la spectrul UV-VIS .

10

Spectrul UV-VIS al analitului poate fi nregistrat la

mijlocul peak-ului sau pe pantele peak-ului.

11

Pentru punerea la punct a unei metode de analiz

ntr-un laborator de analiz al medicamentului,
selectivitatea poate fi cercetat foarte simplu prin
injectarea sau spotarea de etaloane sau martori
(blank).
Sistemul cromatografic studiat va trebui s
realizeze separarea analitului, iar puritatea i
identificarea peak-ului analitului se va realiza prin
comparare cu peak-ul etalonului.

12

Peak-ul cromatografic poate fi considerat pur dac

factorul de separare calculat la lungimi de und diferite este
constant.
Compararea semnalelor la diferite lungimi de und
poate fi utilizat pentru demonstrarea puritii peak-urilor.
S-a propus utilizarea limii peak-ului msurat la mijlocul
nlimii, precum i simetria peak-ului.
Chiar dac peak-urile analitului i a etalonului sunt
identice, proba poate conine o impuritate cu spectru
similar analitului.
Cele mai selective metode de analiz aplicate la probe
biologice sunt cele combinate:

LCUV;

LCMS;

GCMS;
13

GCFTIR.

LINIARITATEA
Liniaritatea reprezint capacitatea metodei de a
produce rezultate direct sau indirect proporionale cu
concentraia analitului din prob pe un anumit interval
de concentraii.
De obicei, liniaritatea este reprezentat printr-o
curb de regresie liniar a valorii msurate ca o funcie a
creterii concentraiei analitului
Pe de alt parte, liniaritatea rezultatelor unei
proceduri de analiz reprezint capacitatea acesteia de a
obine rezultate direct proporionale cu concentraia
analitului din prob.
Criteriul de liniaritate se aplic pentru rezultatele
obinute, adic pentru relaia dintre concentraia
calculat experimental pe baza funciei de rspuns i cea
introdus (calculat teoretic).
14

Liniaritatea funciei de rspuns poate fi evaluat

vizual de pe diagrama ce reprezint modificarea
semnalului funcie de coninutul sau concentraia
analitului.
Dac exist o relaie liniar, testul trebuie s fie
evaluat prin metode statistice, de exemplu prin calculul
dreptei de regresie folosind metoda celor mai mici
ptrate.
n anumite cazuri, pentru a obine liniaritatea
ntre
rspuns
i
concentraia
probei,
datele
experimentale trebuie supuse unei transformri
matematice nainte de analiza lor prin regresie.
15

n urma analizei de regresie se vor calcula

parametri cum sunt: coeficientul de corelaie (r),
coeficientul de regresie (r2), interceptul cu ordonata,
panta i deviaia standard a dreptei de regresie,
suma rezidual a ptratelor etc.
De asemenea, se va reprezenta grafic
dependena semnalului de concentraia analitului
din prob.
Intervalul de linearitate ce trebuie cercetat
depinde de scopul metodei analitice i se consider
n general 20% fa de concentraia int, dar poate
ajunge pn la 150% din concentraia int.

16

Pentru teste de puritate, intervalul n care

metoda trebuie s fie liniar cuprinde limita de
cuantificare i 30% peste concentraia int.
Testele de stabilitate au un interval de 02% fa
de concentraia int, iar cele de dizolvare 20% fa
de concentraia int
Pentru evaluarea liniaritii sunt necesar minim
5 valori ale concentraiei pentru cel puin trei serii
de soluii de substane standard de diferite
concentraii (de regul concentraia de interes 20
pn la 50% pentru valorile extreme de
concentraie).
Pentru metodele TLC, curba de calibrare trebuie
obinut pentru fiecare plac ce va conine
etaloanele i probele necunoscute.
17

Metoda statistic cea mai utilizat pentru a gsi cea

mai bun corelare ntre curba de calibrare i date
precum i tipul de curb de calibrare care ofer cea mai
bun corelare, este regresia liniar sau metoda celor mai
mici ptrate.
Pentru a compara dou curbe de calibrare este
necesar msurarea celei mai bune corelri a etalonului
la linie, n care scop se utilizeaz parametrii coeficientul
de corelaie i eroarea standard a regresiei.
Coeficientul de corelaie, este o msur a asocierii
liniare dintre dou variabile, cu alte cuvinte a gradului n
care reprezentarea bivariat sub forma unei diagrame de
mprtiere se apropie de o dreapt.

18

Coeficientul de corelaie ia valori intre -1 i +1

inclusiv, cu semnificaia de asociere pozitiv /
negativ dup semnul coeficientului i de lipsa de
asociere pentru rxy = 0.
O valoare de +1 indic o relaie liniar perfect
ntre semnalul analitic i concentraie cu semnalul
n cretere, iar o valoare -1 indic o relaie liniar
perfect cu semnalul analitic n scdere.
Coeficientul de corelaie nu indic liniaritatea
dac nu are o valoare ce depete r = 0,999.
Pentru valori mai mici trebuie calculai i ali
parametri, ca de exemplu testul ANOVA pentru
regresie.
Cea mai comun metod de calibrare const n
prepararea unor soluii standard de concentraie
cunoscut, ce acoper domeniul de concentraie n
care se afl proba de analizat.
19

EXACTITATEA MEDIEI
(BIAS = EROARE SISTEMATIC)
Exactitatea mediei unei proceduri analitice
exprim ngustimea acordului ntre valoarea medie
obinut dintr-o serie de msurtori i o valoare care
este acceptat fie ca valoare convenional adevrat,
fie ca valoarea acceptat (de exemplu, standard
internaional, standard al farmacopeei).

20

PRECIZIA
Precizia exprim ngustimea acordului (gradul
de dispersie, coeficientul de variaie) dintre o serie de
msurtori care provine din mai multe serii ale
aceleiai probe omogene (rezultate independente) n
condiii identice de lucru.
Precizia
ofer
date
asupra
erorilor
ntmpltoare i nu are nici o legtur cu valoarea
adevrat. Deoarece toate msurtorile conin erori
ntmpltoare, rezultatul unei singure msurtori nu
poate fi acceptat ca valoare adevrat.
Pentru a prezice domeniul n care se gsete
valoarea adevrat este necesar o estimare a acestei
erori, acest lucru fcndu-se prin repetarea
msurtorii de mai multe ori.
Din acest proces se obin doi parametri
importani i anume valoarea medie i variabilitatea
msurtorilor.
21

Cea mai utilizat modalitate de msur a valorii

medii este media aritmetic, calculat utiliznd formula:
n

x=

x
i =1

(suma valorilor msurtorilor raportat la numrul

total de msurtori).
Deoarece erorile ntmpltoare sunt distribuite
normal, modul comun de msur a variabilitii
(preciziei) este deviaia (abaterea) standard ().
Valoarea deviaiei (abaterii) standard se calculeaz
utiliznd relaia:
n

x
i =1

n
_

22

Dac setul de date este limitat, valoarea medie

este adesea aproximat ca valoare adevrat, fiind
necesar estimarea abaterii standard. n acest caz,
valoarea abaterii standard, notat cu SD, se calculeaz
cu formula:
n

SD =

n 1

x
i =1

Odat ce numrul de valori din setul de date

crete, valoarea SD se va apropia de valoarea .
23

Un alt termen comun utilizat pentru a msura

variabilitatea este coeficientul de variaie (CV) sau
deviaia standard relativ (RSD), care se exprim ca
procent, conform formulei de mai jos:
RSD =

SD
_

sau

% RSD =

SD
_

100

Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii

standard relative (RSD) n studiul preciziei metodei
este RSD 2% (n 6).
Precizia este important n mod particular atunci
cnd n analiz este implicat i o etap de pregtire a
probei.
24

Variabilitatea poate afecta exactitatea.

Se cunoate faptul c reproductibilitatea unei
analize descrete disproporional cu scderea
concentraiei.
Incertitudinea n analiza urmelor crete
exponenial comparativ cu componenii majori i
minori.
De la acest fapt pot aprea abateri n situaiile n
care exist etape de pregtire a probei.
Pe de alt parte, modul de pregtire a probei
rmne un proces riguros care influeneaz
majoritatea variabilitilor.

25

Precizia caracterizeaz gradul de concordan a

rezultatelor analitice ntre ele, la aplicarea repetat a
metodei de analiz pe aceeai prob omogen sau
eantion pregtit pentru analiz n condiii identice.
Precizia arat ct de aproape se afl valorile
msurate una fa de alta pentru un numr de
msurtori n aceleai condiii.
Normele elaborate de ICH (International
Conference of Harmonization) definesc precizia ca
fiind format din 3 componente: repetabilitatea,
precizia intermediar i reproductibilitatea.
26

Repetabilitatea: rezultatele independente sunt

obinute folosind aceeai procedur, pe probe
identice, n acelai laborator, de ctre acelai
operator, utiliznd acelai echipament i ntr-un
interval scurt de timp.
Repetabilitatea analizei (precizia intra prob)
se studiaz utiliznd un minim de 9 determinri
acoperind domeniul specific de concentraie (de
exemplu 3 determinri la 3 valori ale concentraiei),
sau un minim de 6 determinri la o valoare de 100%
din concentraia soluiei ce urmeaz a fi testate.
27

Precizia intermediar: rezultatele independente

sunt obinute folosind aceeai procedur, pe probe
identice, n acelai laborator, de ctre diveri
operatori, folosind echipamente diferite i ntr-un
interval de timp dat.
Reproductibilitatea: rezultatele independente
sunt obinute folosind aceeai procedur, pe probe
identice, n laboratoare diferite, de ctre diveri
operatori i folosind echipamente diferite.

28

ACURATEEA (EXACTITATEA)
Normele
elaborate
definesc
acurateea
(exactitatea) ca o caracteristic a apropierii
rezultatelor analitice de valoarea adevrat.
Exactitatea este o msur a deviaiei valorii
medii gsit prin analiz, fa de valoarea adevrat.
Acurateea se evalueaz prin aplicarea metodei
de analiz studiat, la probe cu concentraii
cunoscute.
La efectuarea acestor analize probele se
analizeaz fa de soluii etalon corespunztoare sau
fa de martori, pentru a se nltura astfel efectul
interferenelor.
29

O alt variant este constituit de compararea

rezultatelor obinute prin metoda nou cu cele
obinute printr-o metod deja cunoscut, despre care
se tie c prezint acuratee.
Pentru substane medicamentoase, testul de
acuratee se efectueaz frecvent prin adugarea unei
cantiti cunoscute din analit, prin cntrire sau prin
msurarea unui volum de soluie (analit dizolvat n
solvent), la soluia placebo, astfel nct s se obin
concentraii cu valori n domeniul de detecie al
analitului.
Pentru
forme
farmaceutice
cum
sunt
comprimatele, supozitoarele, cremele etc., acest fapt
poate nsemna evaluarea potenialelor interaciuni
ale substanei active cu excipienii n soluie.
30

Acest test evalueaz specificitatea metodei n

prezena excipienilor n condiiile utilizate pentru
analiza acelui compus activ.
Se recomand ca studiile de exactitate pentru
substane active sau diverse produse s se
efectueze la nivele de 80%, 100% i 120% (un
interval de 80 120% sau chiar 75 125% din
concentraia real).
Aceste soluii se utilizeaz pentru studiile de
acuratee numite amestecuri sintetice sau
preparate realizate n laborator.
n cazul metodei de analiz prin adaos de
standard, concentraia dispersat este n intervalul
50 150% din valoarea de interes i se realizeaz
prin dispersarea concentraiilor cunoscute de
analit n probe biologice (ser, plasm etc.).
31

La fiecare nivel de concentraie studiat se

evalueaz probe replicate.
Valoarea deviaiei standard relative (RSD) a
rezultatelor obinute n urma calculului pe aceste
probe replicate vor furniza variaia analizei sau
precizia metodei.
Valoarea medie reprezentat ca procent indic
exactitatea metodei.
Pentru evaluarea acurateii se calculeaz
regsirea n procente, calcule ce se fac pe baza
rezultatelor experimentale obinute.
Intervalul n care se accept rezultatele testului
de regsire este cuprins ntre 98 i 102% sau 95 i
32
105%.

Pentru probele biologice, regsirea poate fi 20%

din concentraia real.
n cazul determinrii unui analit aflat n urme,
criteriile de acceptare sunt cuprinse ntre 80 120%,
pentru mai mult de 100 ppb i 60 100%, sub 100 ppb
146.
Pentru impuriti, criteriile acceptate sunt 20%,
pentru o concentraie a impuritilor 0,5% i de
10% pentru o concentraie de impuriti 0,5% 146.
Pentru a elimina posibilele erori ce pot apare pe
parcursul determinrilor, se va calcula media
valorilor obinute.
33

Valorile acceptate n studiul acurateii i preciziei pentru

diferite concentraii de analit

Concentraia
analitului(%)

uniti

regsirea
medie

precizia
(RSD %)

34

LIMITA DE DETECIE
Limita de detecie (LD) reprezint cantitatea
minim dintr-un anumit component ce se poate pune
n eviden, fa de o prob martor, cu o anumit
limit de ncredere (n general 1%).
n metodele cromatografice estimarea LD se
efectueaz pe baza evalurii raportului semnal/
zgomot de fond (linie de baz).
Pentru estimarea limitei de detecie, n
general se consider acceptabil un raport semnal /
zgomot de 3/1 sau 2/1.

35

Estimarea LD se mai poate face i pe baza deviaiei

standard i a pantei dreptei de regresie i se realizeaz utiliznd
formula:
3
LD =

P
unde reprezint deviaia standard a dreptei de regresie, iar P
reprezint panta dreptei de regresie.
Pentru estimarea deviaiei standard a dreptei de regresie se pot
utiliza mai multe metode:

pe baza deviaiei standard a probelor martor se msoar

magnitudinea semnalului de fond pentru un numr mare de probe
martor i se calculeaz deviaia standard a valorilor obinute;

pe baza curbei de calibrare trebuie s se construiasc i s se

studieze o curb de calibrare specific folosind probe ce conin
analitul ntr-un domeniu de concentraie apropiat de limita de
detecie.
36

LIMITA DE CUANTIFICARE (LQ)

Limita de cuantificare (LQ) reprezint cantitatea
minim dintr-un anumit component identificat ce se poate
cuantifica cu certitudine.

Estimarea LQ pe baza evalurii raportului

semnal /zgomot se realizeaz prin compararea
semnalelor msurate pentru probe cu o concentraie
sczut i cunoscut a analitului i probe martor
urmat de stabilirea concentraiei minime la care
analitul poate fi cuantificat cu fidelitate.
Pentru estimarea limitei de cuantificare, n
general se consider acceptabil un raport semnal /
zgomot de 10/1.
37

Valoarea estimat trebuie s fie validat prin analize

independente a unui numr adecvat de probe la care se
cunoate faptul c sunt preparate astfel nct sa conin
concentraii aproape de limita de cuantificare.
n general, limita de cuantificare (LQ) se calculeaz
prin multiplicarea cu 3 a limitei de detecie (LD):
LQ = 3 x LD

38

ROBUSTEEA I STABILITATEA METODEI

Robusteea unei metode analitice se definete prin
msurarea capacitii metodei de a rmne neafectat de variaii
mici, deliberate, ale unor parametri. De aceea, parametrul ofer o
indicaie a reabilitrii metodei pe parcursul utilizrii.
Dac msurtorile sunt susceptibile de variaii n ceea ce
privete condiiile analitice, aceste condiii trebuie s fie controlate
sau trebuie luate anumite msuri de precauie.
O consecin a robusteei este aceea c se stabilesc o serie de
parametri de sistem pentru a ne asigura c validitatea procedeului
analitic se menine ori de cte ori se utilizeaz.
Stabilitatea unei metode analitice reprezint gradul de
reproductibilitate a rezultatelor obinute pe aceeai prob, n
condiii diferite, cum sunt: laboratoare diferite, analiti diferii,
aparatur diferit, diferite loturi de reactivi, zile diferite de lucru
etc.
39

n studiul robusteii metodelor cromatografice pe

strat subire trebuie studiat influena pe care o
manifest urmtorii factori:
temperatura;
umiditatea;
metoda de aplicare a spoturilor;
forma i mrimea spoturilor;
compoziia fazei mobile;
pH-ul;
tipul de strat subire utilizat;
volumul de prob aplicat;
forma bacului;
condiiile de uscare a placilor.
40

Pentru metodele HPLC trebuie studiat influena

urmtorilor factori asupra robusteii metodei:
viteza de curgere a fazei mobile;
temperatura n coloan;
tipul de coloan cromatografic;
volumul injectat;
compoziia faze mobile;
pH;
lungimea de und de detecie.

41

Pentru studii pe lichide biologice, trebuie cercetat

stabilitatea analitului n mediul biologic.
Trebuie cercetat o eventual degradare n perioada
dintre recoltarea probei i analiz.
Instabilitatea analitului poate fi provocat de diveri
factori, precum: interaciuni cu recipientul, aerul,
descompunerea termic, evaporarea componenilor volatili sau
fotoliz.
Pentru a limita degradarea pot fi efectuate unele
prelucrri ale probei precum rcirea sau chiar congelarea
probei, pstrarea n loc ferit de lumin, adugarea unor ageni
stabilizani, ajustarea pH-ului, derivatizarea, utilizarea
inhibitorilor enzimatici.
42

Validarea metodelor analitice trebuie efectuat de

ctre toate laboratoarele de analiz i urmrete testarea
parametrilor principali ai validrii pentru a asigura
acurateea, precizia, specificitatea, reproductibilitatea i
robusteea metodei pentru intervalul de concentraie n
care poate fi studiat analitul.

43