Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
HPLC Ov PDF
HPLC Ov PDF
n Biochimie
Teorie i Practica
2011
OSTAFE, Vasile
Aplicaii ale Cromatografiei de Lichide de nalt Performan n Biochimie.
Teorie i Practic: Curs / Vasile Ostafe
Timioara, Editia a doua (revizuta , 2011
Biochimie Analitic Modern
300 p: il., fig., tab.
22 cm
n amintirea D-lui Dr. Horst D. Schell,
Cel ce mi-a ndrumat primii pai n arta cromatografiei de lichide
PARTEA I
NOTIUNI TEORETICE
Prefaa ................................................................................................................. 7
Noiuni Introductive ......................................................................................... 9
Teoria HPLC ........................................................................................................ 15
Mecanismele Separrii...................................................................................... 25
Pregtirea Probelor ........................................................................................... 27
Tehnici de Injectare a Probelor n Sistemul HPLC .................................... 35
Pompele de Faze Mobile i Degazoarele ....................................................... 38
Detectoarele HPLC ............................................................................................ 47
Derivatizarea ...................................................................................................... 74
Colectarea Datelor i Evaluarea Metodelor................................................. 77
. . . . . . . . CUPRINS
PARTEA A II-A
EXEMPLE PRACTICE DE SEPARARE HPLC
Proteine, Peptide i Aminoacizi .................................................................... 81
Proteine............................................................................................................................................. 82
Peptide .............................................................................................................................................. 90
Aminoacizi ........................................................................................................................................ 94
Glucide ................................................................................................................ 102
Separarea zaharidelor simple ..................................................................................................... 109
Separarea oligozaharidelor ......................................................................................................... 116
Analiza prii glucidice.................................................................................................................. 117
Nucleotide ......................................................................................................... 119
Baze azotate .................................................................................................................................... 123
Nucleozide........................................................................................................................................ 125
Nucleotide ........................................................................................................................................ 130
Lipide .................................................................................................................. 139
Acizi grai ........................................................................................................................................ 140
Acilgliceroli ...................................................................................................................................... 144
Fosfolipide........................................................................................................................................ 148
Sfingolipide ...................................................................................................................................... 153
Steroizi .............................................................................................................. 157
Steroli ............................................................................................................................................... 158
Hormoni steroidici ......................................................................................................................... 161
Vitamine ............................................................................................................. 171
Vitamine hidrosolubile ................................................................................................................... 173
Vitamine liposolubile ...................................................................................................................... 186
6
P r e f a
Va s i l e O s t a f e
8
N
NOO UN
IIU NII IIN
NT RO
TR DU
OD CT
UC VEE
TIIV
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
. . . . . . . . INTRODUCERE
1
Martin, A.J.P., Synge, R.L.M., Biochem. J., 35 (1941) 1358
2
Martin, A.J.P. in: Nobel Lectures: Chemistry 1942-1962, Amsterdam, Elsevier, 1964, p. 359-371
3
James, A.T., Martin, A.J.P., Biochem.J., 48(1) (1951) 7
4
James, A.T., Martin, A.J.P., Analyst (London) 77 (1952) 915
5
Porath, J., Flodin, P. A., Nature 183 (1959) 1657
10
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier
Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1990
11
. . . . . . . . INTRODUCERE
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, Wiley-
Interscience, 1979
2
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1988, p.260
3
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, Wiley-
Interscience, 1979
12
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
3
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
13
. . . . . . . . INTRODUCERE
HPLC
Paraquat Ioni
Diquat Fenoxiacizi Glucide
Acizi carboxilici Aminoacizi anorganici
volatili
Glifosat
Alcooli
Aldehide Colorani Surfactani
Cetone alimentari Enzime
Sulfoamide sintetici
Glicoli
Hidrazine nitrai i
clorurai BHT, BHA, THBQ Ierbicide
Pesticide Antioxidani fenil-ureice
organo- Flavonoide
DDT
fosforice Triazine Colorani
Nitrozamine
Ftalai alimentari
Alcooli
naturali
Vitamine
PCB PAH-uri
Halogenuri liposolubile
alifataice
Epoxizi Dioxine Monomeri Fosfolipide
Trigliceride
Uleiuri Benzeni pentru
eseniale mase plastice
GC
GC HPLC
Substane Substane
volatile Volatilitate nevolatile
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1988. p. 260
14
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
15
. . . . . . . . INTRODUCERE
16
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
17
T
TEEO
OR A H
RIIA HPPLLC
C
FORE IMPLICATE Retenia unui amestec de solui pe o faz staionar are loc
N RETENIA ca urmare a conlucrrii mai multor fore, printre care
SOLUILOR amintim1:
Fore Van der Waals ;
Interacii dipol-dipol;
Legturi de hidrogen;
Interacii ionice.
PARAMETRI Principalii parametri cromatografici rezultai n urma
CROMATOGRAFICI analizei cromatografice sunt prezentai n Figura 3a1,2:
to timpul scurs de la injectarea probei n sistem pn ce
frontul de solvent sau orice solut total nereinut de
coloan a ajuns n celula de detecie;
V0 volumul mort (void volume)(Fig. 3a) reprezint su-
ma volumelor interstiiale dintre particulele fazei sta-
ionare i a volumelor accesibile fazei mobile din
porii particulelor fazei staionare (n cromatografia de
cernere molecular3 V0 reprezint doar volumul de
solvent din afara perlelor de gel - Fig. 3b);
tR timpul de retenie al solutului de interes;
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Fischer, L.,"Gel Filtration Ghromatography", Amsterdam, Elsevier, 1980
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
VR = tRF,
VR = V0 +KVS
Fig. 3b. Variabile folosite (unde VS este volumul fazei staionare. n cromatografia de
pentru a caracteriza patul
cromatografic: Vo - volu- cernere molecular, sau gel-cromatografie, se folosesc
mul de solvent din afara adesea 2 coeficieni de partiie, diferena provenind din
perlelor de gel; Vx - volu-
mul fazei staionare (atunci modul de definiie a fazei staionare: daca ntreg gelul este
se mai noteaz cu Vs) sau considerat faz staionar atunci Kaw = (VR-V0)/VX; dac
volumul la care are acces
analitul; Vt - volumul total faza staionar este doar poriunea de faz mobil din
al coloanei.
interiorul perlelor de gel, dar fr volumul ocupat de pereii
perlelor de gel, atunci Kd = (VR - V0)/VS, dei n al doilea
caz msurarea lui VS este dificil)
19
. . . . . . . TEORIA H P L
C
20
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
2
t Wb = 2Wh = 4
N R Ec. 5.
Eficiena coloanei cromatografice depinde de N.
2
4tR
N
Ec. 6.
Wb S considerm coloana mprit n multe talere teoretice
n fiecare taler teoretic moleculele de solut vor atinge un
2
t echilibru de distribuie ntre faza mobil i cea staionar.
N 5,54 R Ec. 7.
Wh N este att o msur a eficienei coloanei ct i a lrgimii
(dispersiei) benzilor cromatografice1, conform cu ecuaiile
t h
2
N 2 R Ec. 8. 5, 6 i 7.
A Determinarea valorilor dispersiei la baza sau la jumtatea
nlimii piscurilor cromatografice poate fi o sarcin destul
Noiunile de talere teore-
tice i teoria talerelor au de dificil. Majoritatea integratoarelor sau a softurilor
fost introduse de Martin dedicate nu calculeaz automat aceste valori. n schimb
i Synge [2]. Teoria lor
vedea coloana cromato- integratoarele i softurile cromatografice calculeaz aria i
grafic ca fiind divizat nlimea piscurilor cromatografice, motiv pentru care
ntr-un numr mare de
segmente, numite talere numrul de talere teoretice poate fi calculat cu mai mare
teoretice similare cu uurin cu ecuaia 8, n care h este nlimea piscului
treptele individuale dintr-
o separarea n contracu- cromatografic iar A este aria sa (ambele exprimate n
rent. n fiecare din aceste unitile integratorului sau softului respectiv).
1
Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991,p. 123-166
21
. . . . . . . TEORIA H P L
C
talere ipotetice se presu- Cu ct valoarea lui N este mai mare cu att separarea va fi
punea a avea loc o echili-
brare complet a partiiei mai bun. N crete:
solutului ntre faza staio- cu ct particulele cromatografice ale fazei staionare
nar i cea mobil. Aceste
echilibrri se presupu- sunt mai mici
neau a avea loc secvenial cu ct viteza fazei mobile prin coloan este mai mic;
de la primul la ultimul ta-
ler teoretic al coloanei. cu ct temperatura fazei mobile este mai ridicat:
Cu ct numrul de talere cu ct viscozitatea fazei mobile este mai sczut;
teoretice este mai mare
cu att separarea este mai cu ct mpachetarea fazei mobile este mai bun;
eficient. Din acest motiv cu ct moleculele de solut au mase moleculare mai mici.
N este o abreviere pentru
eficiena separrii.
22
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
23
. . . . . . . TEORIA H P L
C
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
24
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
2(t RA t RB )
Rs
WbA WbB Rezoluia poate fi exprimat i n termenii cromatografici
fundamentali: selectivitatea ( =kA/kB) , numrul de
Ec. 11. talere teoretice N i factorul de capacitate k, conform
1 k' ecuaiei 11. Pentru a obine cea mai bun rezoluie, aceti
Rs N
4 1 k' trei factori pot fi optimizai separat. Factorul de
selectivitate pare a fi cel mai important factor al rezoluiei
i el poate fi modificat prin schimbarea1:
temperaturii,
a compoziiei fazei mobile,
a fazei staionare.
1
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
25
M
MEEC
CA SM
NIIS
AN MEELLEE S
SEEPPA
AR R
R RIIII
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier
Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1990
. . . . MECANISMELE SEPARARII
1
Smith, F.C.J. Chang, R.C., The Practice of Ion Chromatography, New York:Wiley, 1984
2
Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New
York:Wiley-Interscience, 1979
3
Steiner, F., Applications of Narrow-bore Columns in HPLC, Waldbronn Analytical Devision, HP,
Germany:Hewlett Packard (12-5091-2736E), 1991
26
P
PR G
REEG T AP
REEA
TIIR PR
RO OR
BEELLO
OB R
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
. . . . PREGTIREA PROBELOR
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
28
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
29
. . . . PREGTIREA PROBELOR
extracii selective
compuilor volatili din matrice solide. De exemplu,
EXTRACIA Extracia lichid lichid (ELL) este cea mai comun metod
LICHID LICHID
de extracie folosit pentru probele lichide. Cuprinde
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
30
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
EXTRACIA N FAZ Extracia n faz solid (Solid Phase Extraction - SPE) este
SOLID foarte potrivit pentru analiza probelor de ap sau a
Avantaje SPE vs ELL diferitelor tipuri de buturi1. Proba este sucionat peste un
extracia analitului mai cartu pre-condiionat sau un disc umplut cu adsorbani
complet
consum redus de
corespunztori. Materialul adsorbant reine analiii ce pot fi
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
31
. . . . PREGTIREA PROBELOR
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1988
32
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York:John
Wiley and Sons, 1988
2
Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New
York:Wiley-Interscience, 1979
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
33
. . . . PREGTIREA PROBELOR
PROBE GAZOASE Compuii organici din aer pot fi mprii n trei grupe2:
Gazele (n stare natural), sunt, de obicei, analizate
prin GC.
Substanele organice ce au o presiune de vapori
suficient pentru a sublima sau a se volatiliza, sunt
colectate prin sucionarea unui volum bine determinat
de aer ntr-un tub umplut cu un material adsorbant
potrivit. Compuii adsorbii pot fi eluai cu solveni
organici, concentrai i injectai n sistemul HPLC.
Substanele organice ce sunt ataate la particule din
aer, cum ar fi praful, sunt colectate prin filtrare,
precipitare electrostatic sau alte procedee, dup care
sunt izolate (extrase n solveni potrivii) i
concentrate.
1
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
2
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
34
T
TEEH
HNNIIC DEE IIN
CII D CT
NJJEEC AR
TA A P
REE A PR OB
RO OR
BEELLO R N
N
SSIIS
STTEEMMUULL H
HPPLLC
C
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
. . . . INJECTAREA PROBELOR
1
Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo, Oxford
University Press, 1991,p. 123-166.
36
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991, p. 123-166
4
Kraak, J.C. Sample Introduction Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam,
1978.
5
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
37
P
PO MP
OM DEE F
PEELLEE D FAA ZZEE M
MO OB II
BIILLEE
D
DEEG AZZO
GA OA ARREELLEE
1
Huber, J.F.K., The Chromatographic Apparatus from the Viewpoint of System Theory. In:
Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier
Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1978, p. 1-9
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
creeaz gradieni
sistemul HPLC trebuie s conin cel puin 2 pompe,
fiecare funcionnd izocratic, cu unul din cei 2 solveni.
cu pant mare
Sistemul are avantajul c poate forma gradieni foarte
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
2
Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier, Amsterdam, 1978, p. 10-40
39
. . . . . . . POMPE H P L C
ieftin, poate
redus. Pompa va trage un timp definit de microprocesor
din diferitele lichide n funcie de valva care este deschis.
amesteca mai mult de
2 solveni Prin urmare acest sistem, dei mai ieftin, creeaz un
necesit degazare
gradient n trepte, acurateea lui depinznd n mare msur
de programul de control al valvelor i de design-ul
sistemului de amestecare a solvenilor. n plus, degazarea
solvenilor este absolut necesar. Marele avantaj al acestui
sistem este faptul c, n funcie de numrul de valve, poate
amesteca mai mult de 2 solveni2.
1
Huber, J.F.K., ed. Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Elsevier
Amsterdam, 1978.
2
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
3
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
40
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
41
. . . . . . . POMPE H P L C
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
2
Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier
Scientific Publishing Company, 1978, p. 1-9
42
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
43
. . . . . . . POMPE H P L C
Fig. 7.
Pompa cu dispozitive volu-
metrice de formare a gra-
dienilor la presiune redus.
Pompa se compune din (a)
dispozitive volumetrice de
msurare a solvenilor, (b)
dispozitiv de pompare la
presiune redus, (c) pomp
de mare presiune, (d)
atenuator de pulsuri de
presiune cu dispozitiv de
msurare a presiunii.
Figura 8.
Schema unei pompe ce
formeaz gradieni la
mare presiune.
PERFORMANE
Precizie realizare vitez vo-
lumetric: <0,3%
Domeniu 0,055,0 Lmin-1
Volum ntrziere n forma- Acest sistem asigur realizarea de conexiuni capilare
re gradient: 0,2-0,5 mL
Puls de presiune <2%
interne i externe foarte mici, reducnd astfel volumul mort
Precizie n realizarea com- extracoloan la mai puin de L i volumul de ntrziere a
poziiei gradientului 0,2% formrii gradientului la mai puin de 500 L. Ambele
44
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
2
Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier
Scientific Publishing Company, 1978, p. 1-9
45
. . . . . . . POMPE H P L C
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
2
Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier
Scientific Publishing Company, 1978, p. 10-40
46
D
DEETTEEC
CT OA
TO REELLEE H
AR HPP LL C
C
1
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
2
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc. 1993
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc. 1993
2
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
48
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc. 1993
49
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Scrott, R.P.W., Techniques of Liquid Chromatography (Simpson, C.F., ed.) Wiley-Heden,
Chichester, 1982
2
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
50
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Fig. 9.
Detector UV cu
lungime de und
variabil
1
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
51
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Wickam, D., in "A Practical Guide to HPLC Detection", Parriott, D., ed., Academic Press, San
Diego, CA, 1933
2
Pole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam,
1984
3
Huber, L., Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn
Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, 1994
4
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc. 1993
52
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Fig. 10.
Schema drumului optic
i a principalele
componente ale DAD,
model HP
53
. . . . . DETECTOARELE H P L C
Rezoluia digital = do- Una din facilitile oferite de acest tip de detectoare este
meniul lungimilor de un-
d acoperit de reeaua de posibilitatea de a face instantaneu msurtori la mai multe
difracie (lrgimea maxi- lungimi de und. Msurarea variaiei intensitii de lumin
m a spectrului) supra
numrul de diode din i- pe ntreg domeniul de lungimi de und duce la obinerea
rul de diode al cipului. unui spectru de absorpie. Pentru analize de rutin, DAD
1
Huber, J.F.K., Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Amsterdam - Oxford
- New York, Elsevier Scientific Publishing Company, 1978
54
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Parriott, D. (ed.), "A Practical Guide to HPLC Detection", San Diego, Academic Press, Inc. 1993
2
Poole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam,
1984
55
. . . . . DETECTOARELE H P L C
Fig. 13.
Adaptarea lrgimii benzii
rezoluiei optice duce la
modificarea sensibilitii
semnalului detectorului. Da-
tele de finee pot fi n-
registrate cnd rezoluia op-
tic este maxim, dei n
acest caz i raportul semnal /
zgomot este mare.
56
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
2
Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J., Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991, p. 123-166
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
57
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
2
Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
58
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
59
. . . . . DETECTOARELE H P L C
(2) Normaliznd i
comparnd 2 sau mai
multe cromatograme
extrase la lungimi de
und diferite. Pentru a-
nalii impuri piscurile
au timpi de retenie di-
ferii. Totui, dac tim-
pii de retenie ai piscu-
rilor sunt aceeai,
aceasta nu este un
indiciu sigur c
analitul este pur (figura
21) Fig. 21. Cromatograme normalizate pentru testarea puritii pis-
curilor cromatografice.
(3) Normaliznd i
comparnd spectrele la
2 sau mai multe poriu-
ni ale piscului croma-
tografic respectiv. De
obicei se compar
spectrul din vrful pis-
cului (apex) cu cele din
punctele de inflexiune
(fig. 22). Exist diferi-
te algoritme de compa-
raie. De exemplu, HP
compar punctele din
spectrele normalizate
genernd o dreapt de
regresie. Coeficientul
de regresie este multi- Fig. 22. Cromatogramele extrase i spectrele normalizate. La
plicat cu 1000 i denu- analiza dup algoritmul HP cu ct factorul de potrivire este mai
mit factorul de potrivi- apropiat de 1000 cu att probabilitatea ca piscul cromatografic
re. respectiv s fie mai pur este mai mare, deoarece spectrele din
apexul piscului i cele din punctele de inflexiune sunt mai
similare, indicnd lipsa contaminanilor.
60
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
61
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
2
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc. 1993
62
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
63
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Lavrich, C., Kissinger, P.T., in "Therapeutic Drug Monitoring and Toxicology by Liquid
Chromatography", Wong, S.H.Y., ed., Marcel Dekker, New York, 1985
64
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic
Science Series, Marcel Dekker, New York, 1997
2
Kissinger, P.T., Heineman, W.R., eds., Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry,
Marcel Dekker, New York, 1984
65
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic
Science Series, Marcel Dekker, New York, 1997
2
Krull, I.S., Selavka, C.M., Lookabaugh, M., Childress, W.R., LC/GC, 7(9) (1989) 758
66
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc. 1993
2
Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic
Science Series 58, Marcel Dekker, New York, 1992
67
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York, 1990
68
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
INTERFAA FASCICUL DE
PARTICULE
Interfaa fascicul de
particule se bazeaz
Fig. 28. (dreapta) pe principiul separ-
Pompe pentru interfaa
fascicul de particule. rii momentane a sol-
ventului, ilustrat n
fig. 28. Eluentul
Fig. 29. (jos) Spectru HPLC trece prin mai
fascicul de particule al multe camere sub
prometrynului presiune.
Pe msur ce eluentul trece prin doze fine,
solventul de evapor i este eliminat prin nite
supape sub presiune.
Particulele mai grele continu pe traiectoria lor
original i intr n sursa de ioni. Instrumentele
cu fascicul de particule folosesc o surs standard
(GC-MS) fie modelul impact cu electroni (EI) fie
modelul ionizare-chimic (CI).
Impactul cu electroni fragmenteaz proba mai mult dect
ionizarea chimic sau termospray-ul, dup cum se poate
vedea comparnd spectrul termospray (fig. 27) cu cel al
impactului de electroni din interfaa cu fascicul de particule
(fig. 29) al aceleai substane.
69
. . . . . DETECTOARELE H P L C
1
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc. 1993
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
3
Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York, 1990
70
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic
Science Series 58, Marcel Dekker, New York, 1992
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
3
Technical literature on LCQ, Analytical Newsletter, Finnigan / MAT Instruments, San Jose, CA,
1995
71
. . . . . DETECTOARELE H P L C
INTERFAA DE IONIZARE
CHIMIC LA PRESIUNE
ATMOSFERIC (APCI)
1
Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic
Science Series 58, Marcel Dekker, New York, 1992
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
72
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Tabelul 3.
Comparaii ntre
Tip detector
Sensibilitate
Selectivitate
caracteristicile
Avantaje
Aplicaii
detectoarelor HPLC
73
D
DEER VA
RIIV AR
TIIZZA
AT REEA
A
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, John Wiley and
Sons, New York, 1997
2
Techniques in Protein Chemistry, Vols. I VIII, Academic Press, San Diego, CA, 1989 1985
3
Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York, 1989
4
Gy, P.M., Sampling of Heterogeneous and Dynamic Material Systems, Elsevier, Amsterdam, 1992
5
Harris, D.C., Quantitative Chemical Analysis, 4th ed., W.H. Freeman, New York, 1994
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing,
Springfield, OR, 1985
2
King, B., Graham, G.S., Handbook of Derivatives for Chromatography, Heyden, Philadelphia, 1979
3
Poole, C.F., Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier, Amsterdam, 1993
4
Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York, 1989
75
. . . . . . . DERIVATIZAREA
1
Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing,
Springfield, OR, 1985
2
Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York, 1989
76
C
CO CT
OLLEEC AR
TA A D
REEA DAAT OR
TEELLO R II
E
EVVA UA
ALLU AR AM
REEA MEETTOOD OR
DEELLO R
1
Huber, L. Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn
Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, 1994
2
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
. . . . COLECTAREA DATELOR
78
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Berridge, J.C., Techniques for the Automated Optimization of HPLC Separation, Wiley, New York,
1985
79
. . . . COLECTAREA DATELOR
1
Schoenmakers, P.J., Optimization of Chromatographic Selectivity, Elsevier, Amsterdam, 1986
2
Glajch, J.L., Snyder, L.R. (eds.), Computer-Assisted Development for High - Performance Liquid
Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 1989
80
P
PR OT
RO NEE,, P
TEEIIN PEEPPTTIID II A
DEE AM NO
MIIN AC
OA CIIZZII
1
Regnier, F.E., Gooding, K.M:, Anal. Biochem., 103 (1980) 1-25
2
Ghosh, R., Cui, Z.F., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) 1619-1626.
3
Zeng, X.F., Ruckenstein, E., Biotechnol. Prog., 15(1999) 1003-1019.
4
Horvath, C.(ed.) "High Performance Liquid Chromatography: Advances and Perspectives",
Academic Press, New York, vol. 3, 1983
5
Henschen, A., Hupe, K.P., Lottspeich, F., Voelter, W. (eds.) "HPLC in Biochemistry", WCH,
Weinheim, Germany, 1985
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
82
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
83
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
1
Shine, J., Fettes, I., Lan, N.C.Y., Roberts, J.L., Baxter, J.D., Nature, 285 (1980) 456-461
2
Sassenfeld, H.M., Brewer, S.J., Biotechnology, 2 (1984) 76-81
3
Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887(2000) 137-163.
84
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Kamberi, M., Kamberi, P., Nakano, S., J. Chromatogr. B., 741 (2000) 295-300.
2
Ren, Q., de Roo, G., Kessler, B., Witholt, B., Biochem. J. 349 (2000) 599-604
3
Engel, S., Barak, Z., Chipman, D.M., Merchuk, J.C., J. Chromatogr. B., 743 (2000) 281-286.
4
Kit, YY., Kuligina, E.V., Onishchenko, A.M., Yurchenko, L.V., Romannikova, I.V., Richter, V.A.,
Vlassov, V.V., Biochem.-Moscow., 64 (1999) 896-900.
5
Brewer, S.J., Dickerson, C:D., Ewbank, J.J., Fallon, A., J. Chromatogr., 362 (1985) 443-449
85
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
1
Yu, X., Zhao, R., Liu, G.Q., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) 1821-1830.
2
Szpunar, J., Analyst., 125 (2000) 963-988.
86
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Rubinstein, M., Levy, W.P., Moschera, J.a., Lay, C.Y., Hershberg, R., Barlett, R., Pestka, S., Arch.
Biochem. Biopys., 210 (1980) 307-318
2
Mahoney, W.C., Hermodson, M.A., J. Biol. Chem., 255 (1980) 11199-11203
3
Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep., 3 (1983) 93-100
4
Kato, Y., Komiya, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 246 (1982) 13-18
5
Ui, N., J. Chromatogr., 215 (1981) 289-292
6
Voelter, W., in "HPLC in Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp 217-317.
7
Nice, E.C:, O'Hare, M.J., Anal. Biochem., 129 (1979)22-30
87
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
CROMATOGRAFIA DE AFINITATE
Dei cromatografia de afinitate are o foarte mare eficien ea este folosit
destul de rar6. Cele mai cunoscute faze staionare utilizate pentru acest tip de
cromatografie sunt fazele staionare de la Beckman ("Fast Affinity"), Pharmacia,
LKB, BioRad i Pierce.
Sunt date exemple de parteneri afini n care ligandul i solutul i-au schimbat
rolurile. De exemplu, lactat dehidrogenaza a fost purificat n prezena piruvatului
(0,1 M) pe o coloan avnd AMP imobilizat. Eluarea enzimei s-a realizat folosind
1
Luiken, J., Van der Zee, R., Welling, G.W., J. Chromatogr., 284 (1984) 482-486
2
Fullmer, C.S., Anal. Biochem., 142 (1984) 336-339
3
Ekstrom, B., Jackobson, G., Anal. Biochem., 142 (1981) 134-139
4
O'Hare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 16 (1982) 277-322
5
Froescheis, O., Moalli, S., Liechti, H., Bausch, J., J. Chromatogr. B., 739 (2000) 291-299.
6
Garcia ,M.C., Marina, M.L., Torre, M., J. Chromatogr. A., 880 (2000) 169-187.
88
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Lowe, C.R., Glad, M., Larsson, P.-O., Ohlson, S., Small, D.A.P., atkinson, A., Mossbach, K., J.
Chromatogr., 215 (1981) 303-316
2
Nilsson, K., Larsson, P.O., Anal. Biochem., 134 (1983) 60-72
3
Oliva, M.L.V., Souza-Pinto, J.C., Batista, I.F.C., Araujo, M.S., Silveira, V.F., Auerswald, E.A.,
Mentele, R., Eckerskorn, C., Sampaio, M.U., Sampaio,,C.A.M., Biochim. Biophys. Acta-
Protein Struct. Molec. Enzym., 1477 (2000) 64-74.
4
Wenk, S.O., Kruip, J., J. Chromatogr. B. 737(2000) 131-142.
89
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
INTRODUCERE
HPLC a fost folosit pentru analiza i purificarea peptidelor att pentru
producerea de peptide sintetice ct i pentru izolarea peptidelor naturale. n
domeniul cromatografierii peptidelor exist o bogat literatur tiinific, exemplele
din prezentul capitol avnd rolul doar de a ilustra anumite aplicaii specifice.
90
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Voelter, W., n "Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp. 217-317
2
Meek, J.C., Rosetti, Z.L., J. Chromatogr., 211 (1985) 15-28
91
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
1
Tempst, P., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E., Anal. Biochem., 137 (1984) 188-195
92
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Sullivan, R.C., Shing, V.W., D'Amore, P.A., Klagsbrun, M., J. Chromatogr., 266 (1983) 301-311
93
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
INTRODUCERE
Dezvoltarea fazelor staionare de mare performan pentru analiza
aminoacizilor a fost un proces continuu de la prima apariie a analizorului automat
de aminoacizi2. Valoarea mic a coeficienilor de extincie a majoritii
aminoacizilor a dus la dezvoltarea unor metode de detecie prin derivatizarea3
gruprilor amino cu un derivat colorat4 sau fluorescent. Cei mai des utilizai reactivi
de derivatizare a aminoacizilor sunt prezentai n tabelul alturat.
1
Naider, F., Huchital, M., Becker, J.M., Biopolymers, 22 (1983) 1401-1407
2
Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S., Anal. Chem., 30 (1950) 1190-1205
3
Fernandes, J.O., Ferreira, M.A., J. Chromatogr. A., 886 (2000) 183-195.
4
Strong, R.A., Liu, H.J., Krull, I.S., Cho, B.Y., Cohen, S.A., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23
(2000) 1775-1807.
94
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Kubec, R., Svobodova, M., Velisek, J., J. Chromatogr. A., 862 (1999) 85-94.
2
Zdebska, E., Koscielak, J., Anal. Biochem., 275 (1999) 171-179.
3
Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000) 167-179
4
Albin, D.M,. Wubben, J.E., Gabert, V.M., J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 1684-1691.
5
Kelly, MT., Fabre, H., Perrett, D., Electrophoresis., 21 (2000) 699-705.
6
Wang, F., Chen, X., Chen, Q., Qin, X.C., Li, Z.X., J. Chromatogr. A., 883(2000) 113-118.
95
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
Derivatizarea pre-coloan
Orto-ftalaldehida (OPA). Simplitatea acestei metode de derivatizare a fcut
ca metoda s devin foarte popular2. Timpul de separare a OPA-aminoacizilor a
fost mult redus prin scderea lungimi coloanei i creterea vitezei volumetrice a
1
Vacchina, V., Chassaigne, H., Oven, M., Zenk, M.H., Lobinski, R., Analyst., 124 (1999) 1425-1430.
2
Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000) 167-179
96
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
fazei mobile. Principalele dezavantaje ale metodei sunt timpul de via relativ scurt
al derivailor OPA n comparaie cu derivaii de dansil sau furam i slaba
reactivitate fa de aminele secundare (dei adugarea de hipoclorit poate s
nlture aceast din ultim problem).
97
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
Derivatizarea post-coloan
Orto-ftalaldehida (OPA). Pentru a realiza o derivatizare post-coloan cu
OPA se folosete o spir de reacie (4 x 0,3 mm) inserat ntre punctul de
amestecare cu agentul fluorescent i detector1. Deoarece volumul spirei de reacie
influeneaz dispersia peak-urilor, derivatizarea post-coloan nu este la fel de bun
ca cea pre-coloan. n plus se impune folosirea unei viteze volumetrice mici, ceea
ce duce la creterea timpului total de analiz. Totui, principalul avantaj al
derivatizrii post-coloan este reproductibilitatea. Fa de metoda cu ninhidrin,
derivatizarea cu OPA nu necesit un dispozitiv de nclzire.
1
Vasanits, A., Kutlan, D., Sass, P., Molnar-Perl, I., J. Chromatogr. A., 870 (2000) 271-287.
98
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Udenfriend, S., Stein, S., Bohlen, P., Dairman, W., Leimgruber, W., Weigle, W., Science, 178 (1972)
871-873
2
Stein, S. Brink, L., Methods Enzymol., 29 (1981) 120-121
3
Miller, M.L., Johnson, G.V.W., J. Chromatogr. B., 732 (1999) 65-72.
99
. . PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
1
Zahou, E., Jornvall, H., Bergman, T., Anal. Biochem., 281 (2000) 115-122.
2
Heinrikson, R.I., Meredith, S.C., Anal. Biochem., 136 (1984) 35-74
3
Abe, Y., Fukui, S., Koshiji, Y., Kobayashi, M., Shoji, T., Sugata, S., Nishizawa,H., Suzuki, H., Iwata,
I., Biochim. Biophys. Acta-Protein Struct. Molec. Enzym., 1433 (1999) 188-197.
4
Gray, W.R., Hartley, B.S., Biochem. J., 89 (1963) 379-380
5
Schauer-Vukasinovic, V., Bur, D., Kitas, E., Schlatter, D., Rosse, G., Lahm, H.W., Giller, T., Eur. J.
Biochem., 267 (2000) 2573-2580.
6
Lin, CRC Handbook for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 1, 1984, pp.
359-366
100
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Chang, J.Y., Brauer, D., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 93 (1980) 205-214
2
Lehmann, A., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 176 (1984) 360-364
3
Charlwood, J., Birrell, H., Camilleri, P., J. Chromatogr., B., 734 (1999) 169-174.
4
Yoshida, T., J. Chromatogr. A., 852 (1999) 607
5
Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep. J., 3 (1983) 93-100
101
G
GLLU
UC DEE
CIID
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
formule de proiecie Haworth (care sunt cele mai folosite), dei cele mai corecte
reprezentri sunt conformaiile tip baie sau scaun.
Diferite moduri de scriere O OH HO H HOH2C OH
monozaharidelor: HC C C
H2C O HO C H
H C OH C H C OH O
H C OH
Formule lineare,
HO C H HO C H HO C H O H C
Proiecii Haworth
CH2OH
Conformaii tip baie sau H C OH H C OH H C OH
scaun H C OH H C OH H2C OH
H C
C C
H2C C O
H2C CH2OH
OH OH C C
H2C OH
C O HO CH2 H C OH
OH O 2 C C
C C C OH C C C
OH C O
HO HO C C OH
C C H2C OH
OH HO
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
103
. . . . . . . . GLUCIDE
1
Wood, P.J., Sidiqui, I.R., Carbohydr. Res., 19 (1971) 283-286
2
Eisenberg, F., Jr., Carbohydr., Res., 19 (1971) 135-138
3
Crowell, E:P., Burnett, B.B., Anal. Chem., 39 (1967) 121-124
4
Thiem, J., Schwenter, J., Karl, H., Sievers, A., Reimer, J., J. Chromatogr., 155 (1978) 107-118
5
Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000) 137-163.
104
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
din anii '70 s-au comercializat detectoare indice de refracie1, detecia glucidelor nu
mai constituie o "problem" pentru analizele HPLC.
1
Palmer, J.K., Anal. Lett., 8 (1975) 215-224
2
Wannet, W.J.B., Hermans, J.H.M., van der Drift, C., den Camp, H.J.M.O., J. Agric. Food Chem., 48
(2000) 287-291.
3
D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) 1-10
4
Aitzetmuller, K., J. Chromatogr., 156 (1978) 354-358
5
Verhaar, L.A.Th., Kuster, B.F.M., J. Chromatogr., 220 (1981) 313-322
6
Wilson, C.W., Shaw, P.E., Campbell, C.W., J. Sci. Food Agric., 33 (1982) 777-780
105
. . . . . . . . GLUCIDE
plumb dup care sunt filtrate (i deionizate). Diluarea cu acetonitril i filtrarea sau
centrifugarea probei sunt, de obicei ultimile etape naintea analizei HPLC. Se
recomand utilizarea unei coloane de protecie (guard) pentru a se proteja coloana
analitic de potenialii contaminani, cum ar fi proteinele.
Solubilitatea oligozaharidelor n acetonitril scade odat cu creterea masei
moleculare. Monozaharidele suport pn la 75% acetonitril, dar n cazul
oligozaharidelor cu pn la 15 uniti glucidice concentraia acetonitrilului nu
trebuie s depeasc 55%.
n general, buturile nealcoolice, vinurile i sucurile de fructe pot fi injectate
direct, dup etapa de filtrare. Polizaharidele necelulozice din pereii celulari pot fi
eliberate din celule prin hidroliza acid (acid trifluoracetic 2M, timp de 1 or, la
120C) urmat de deionizare (pe un schimbtor de ioni sau pe un cartu de extracie
n faz solid - SPE)1.
Oligozaharidele complexe din urin pot fi separate de sruri i metabolii prin
adsorpie pe crbune activ2 i eluarea ulterioar cu o soluie apoas de etanol.
Glicoproteinele conin oligozaharide complexe legate covalent de partea
proteic. Analiza HPLC a acestor oligozaharide poate fi realizat dup eliberarea
oligozaharidelor prin hidrazinoliz controlat.
Procedeele moderne de pregtire a probelor de glucide recomand utilizarea
cartuelor de extracie n faz solid (SPE), cum ar fi Sep-Pak C18 sau Oasis
(Waters). Prin aceast operaie se ndeprteaz contaminanii, cum ar fi lipidele i
se mrete timpul de via (folosire) al coloanei analitice. n cazul folosirii
cromatografiei de schimb ionic pentru analiza glucidelor, probele trebuie deionizate
pentru a se evita interaciile i elurile aleatorii. Dificultile legate de deionizare
pot fi rezolvate uor dac se folosete ionul format care poate fi ndeprtat prin
liofilizare3.
1
Barton, F.E., Windham, W.R., Himmelsbach, D.S., J. Agric. Food Chem., 30 (1982) 1119-1123
2
Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983) 171-182
3
Baust, J.G., Lee, R.E., James, H., J. Liq. Chromatogr., 5 (1982) 767-779
106
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Una dintre principalele probleme ale analizei zaharidelor este lipsa de grupri
cromofore care s absoarb la lungimi de und mai mari de 200 nm. Cel mai uor
glucidele sunt monitorizate cu detectorul indice de refracie. Totui, n unele situaii
sensibilitatea limitat a acestui tip de detector face ca analiza s nu fie practic i
pentru a se evita operaiile de concentrare a probei, operaii consumatoare de timp
i bogate n surse de erori se recomand derivatizarea pre-coloan1.
Derivatizarea pre-coloan a glucidelor are ca scop obinerea unui derivat care
Se obine uor, reproductibil i cu randament mare;
Are un coeficient de absorbie ridicat la o lungime de und convenabil;
Este compatibil cu sistemul de solveni ales pentru cromatografiere;
Permite recuperarea uoar a precursorului;
Este potrivit pentru eventualele analize ulterioare, cum ar fi RMN sau MS2.
Literatura de specialitate menioneaz mai multe tipuri de derivai ai
zaharidelor, printre care amintim acetaii3, benzoaii, 4-nitrobenzoaii4, benziloxim
perbenzoaii5, derivaii de fenildimetilsilan6 i derivaii alchilai7
Pentru analiza oligozaharidelor complexe care, cel mai adesea, sunt prezente
n probe n concentraii mici, marcarea radioactiv cu borohidrura de sodiu tritiat
este o metod ce trebuie luat n considerare datorit sensibilitii i preciziei n
cuantificare8.
1
Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999)
596-600.
2
White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) 99-109
3
Wells, G.B., Lester, R.L., Anal Biochem., 97 (1979) 184-190
4
Nachtmann, F., Budna, K.W., J. Chromatogr., 136 (1978) 279-287
5
Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) 201-212
6
White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) 99-109
7
McGinnis, G.D., Fang, P., J. Chromatogr., 153 (1978) 107-114
8
Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 313-326
107
. . . . . . . . GLUCIDE
1
White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) 99-109
2
Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) 201-212
3
Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999)
596-600
4
D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) 1-10
5
Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983) 211-224
6
Grimble, G.K., Barker, H.M., Taylor, R.H., Anal. Biochem., 128 (1983) 422-428
7
Nordin, P., Anal. Biochem., 131 (1983) 492-498
8
Gandelman, M.S., Birks, J.W., Anal. Chim. Acta, 155 (1983) 159-171
108
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Mrochek, J.E., Dinsmore, S.R., Waalkes, T.P., Clin. Chem., 21 (1975)1314-1322
2
Rabel, F.M., Caputo, A.G., Butts, E.T., J. Chromatogr., 126 (1976) 731-740
3
Binder, H., J. Chromatogr. 189 (1980) 414-420
109
. . . . . . . . GLUCIDE
Coloanele tip amino pot fi folosite att ca schimbtori slabi de anioni, fie ca
faze staionare pentru cromatografia n faz inversat sau n faz normal. n
ultimile dou cazuri este greu de apreciat dac separarea se ncadreaz n faz
normal sau inversat. Totui, pentru c retenia glucidelor scade, de obicei, odat
cu creterea coninutului de ap al fazei mobile, putem considera c este vorba de
cromatografie n faz normal.
1
White, C.A., Corran, P.H., Kennedy, J.F., Carbohydr. Res., 87 (1981) 165-173
2
Aitzetmuller, K. Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) 195-202
3
Wheals, B.B., White, P.C., J. Chromatogr., 176 (1979) 421-426
110
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
toate c pre-echilibrarea se poate realiza la 0,1%1. Deoarece pH-ul rezultat este 9,2
pentru a se evita dizolvarea silicagelului se recomand folosirea unei coloane de
protecie sau saturarea fazei mobile cu silicagel.
Optimizarea unor astfel de sisteme implic studiul compoziiei fazei mobile2,
influenei pH-ului3, a concentraiei modificatorului aminic, a viteze volumetrice,
etc.4
Figura alturat prezint un exemplu de separare a oligozaharidelor dintr-un
extract de plante. n condiiile experimentale reaciile chimice nedorite dintre
modificatorul aminic i componentele probei au fost neglijabile5.
1
Aitzetmuller, K., Chromatografia., 13 (1980) 432-436
2
Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000) 137-163.
3
Vendrell-Pascuas, S., Castellote-Bargallo, A.I., Lopez-Sabater, M.C., J. Chromatogr. A., 881 (2000)
591-597.
4
Hendrix, D.L., Lee, R.E., Baust, J.G., James, H., J. Chromatogr., 210 (1981) 45-53
5
Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983) 211-224
111
. . . . . . . . GLUCIDE
1
Kawamoto, T., Okata, E., J. Chromatogr., 258 (1983) 284-288
112
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
113
. . . . . . . . GLUCIDE
114
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Tian, Q.G., Ding, X.L., J. Chromatogr. A., 874 (2000) 13-19.
2
Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999)
596-600.
3
Cheethan, N.W.H., Sirimanne, P., Day, W.R., J. Chromatogr., 207 (1981) 739-444
4
Lochmuller, C.H., Hill, W.B.Jr., J. Chromatogr., 264 (1983) 215-222
115
. . . . . . . . GLUCIDE
Analizele HPLC ale oligozaharidelor din esuturile animale sau din fluidele
biologice au fost folosite pentru determinarea distribuiei masei lor moleculare1.
Majoritatea separrilor oligozaharidelor complexe au fost realizate folosind att
coloane amino care separ moleculele pe baza lungimii lanului (ca cele menionate
mai sus sau Aminex 87C, 7 m, 200 x 7,8 mm, forma calciu) ct i coloane n faz
inversat. Sistemele n faz inversat sunt n special utile deoarece sunt sensibile la
diferenele stereochimice ale moleculelor2. Multe oligozaharide care sunt prezente
ca pri ale glicoproteinelor sunt ncrcate negativ datorit prezenei resturilor de
acid sialic, fosfat sau sulfat. n acest caz se poate utiliza cu succes HPLC de schimb
anionic.
n cazul coloanelor amino, eluarea se face cu amestec ap - acetonitril ce
conine 3% acetat de trietilamoniu (pH 5,5). n acest caz glicoproteinele sunt
separate n funcie de coninutul net de carbohidrai. Adugarea de sare duce la
supresia ionic3.
Printre aplicaiile care au beneficiat de analize HPLC ale glucidelor se
numr separarea oligozaharidelor izomerice din glicoproteine4, cuantificarea
acidului hialuronic5, diagnosticul unor boli ereditare lizozomale prin evidenierea n
urin a unor cantiti mari de manoz6, sau de galactozil oligozaharide1, etc.
1
Urashima, T., Kawai, Y., Nakamura, T., Arai, I., Saito, T., Namiki, M., Yamaoka, K., Kawahawa, K.,
Messer, M., Comp. Biochem. Physiol. C-Pharmacol. Toxicol. Endocrinol., 124 (1999) 295-
300.
2
Arbatsky, N.P., Likhosherstov, L.M., Serebryakova, M.V., Brusov, O.S., Shibaev, V.N.,
Derevitskaya, V.A., Kochetkov, N.K., Bioorg. Khim., 26 (2000) 51-60.
3
Mellis, S.J., Baenziger, J.U:, Anal., Biochem., 114 (1983) 276-280
4
Bergh, M.L.E., Koppen, P.L., Van den Eijnden, J., Anarp, J., Lonngren, J., Carbohydr. Res., 117
(1983) 275-278
5
Nebinger, P., Koel, M., Franz, A., Werries, E., J. Chromatogr., 265 (1983) 19-25
6
Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983) 171-182
116
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 313-326
117
. . . . . . . . GLUCIDE
a) Separarea HPLC a
-1,4-poliglucozei
derivatizat cu fenil-
metil pirazolon.
b) Separarea HPLC a
oligozaharidelor
marcate cu fenil-metil-
pirazolon din
ribonucleaza B.
118
N
NU OT
CLLEEO
UC DEE
TIID
1
Cohn, W.E., Science, 109 (1949) 377-378
2
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
fosfodiesterice 5' - 3'. Timina, sau 5-metiluracilul, se gsete n ADN, dar de obicei
nu i n ARN, n timp ce uracilul este prezent n ARN, dar foarte rar n ADN.
Celelalte baze azotate se gsesc n ambele tipuri de acizi nucleici.
O alt diferen ntre ADN i ARN este dat de pentoza din structura
nucleotidelor: 2-dezoxi-D-riboza i respectiv D-riboza.
Exist un numr destul de mare de derivai modificai chimic ai
nucleotidelor. Ei au importante funcii biologice, iar unii dintre aceti compui sunt
folosii n tratamentul infeciilor virale i al cancerului.
Pentru separarea bazelor azotate, nucleozidelor, nucleotidelor (i chiar a
acizilor nucleici) s-au folosit n special trei dintre cele mai comune tehnici HPLC:
cromatografia de schimb ionic, cromatografia n faz inversat i cea perechi-
ionice.
Valorile pK' ale bazelor nucleozidelor Valorile pK' pentru baze azotate i
joac un rol important n alegerea nucleotide
tipului de cromatografie i a pKa pKb
condiiilor de lucru. Baze
Adenina NH O Guanina
Adenina 4,15 9,8
2
Dezoxiriboza C C
Guanina 3,20 9,6
N N
O HC
C N
HC
C NH Hipoxantina 2,00 8,9
HO P O 2 CH N
C
N
CH
NH
C
2N
C
NH
Xantina 0,80 7,5
O
OH HC CH Citozina 4,45 12,2
O
CH2 CH
HC C
Timina Uracil 3,40 9,5
3
OH C NH Timina - 9,9
Acid dezoxidenozin monofosforic
NH
HC
NH
C
O
Nucleozide
2
Citozina
C
Adenozina 3,50 12,5
O
O
HC N
Guanozina 1,60 9,2
C
HO P O CH
HC
N
C
O HC NH Inozina 1,20 8,8
2
OH HC
O
CH
HC
NH
C
O
Xantozina <2,50 5,7
CH CH Uracil Citidina 4,15 12,5
Riboza
OH OH Uridina - 9,2
Acid citozin monofosforic Timidina - 9,8
120
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Maybaum, J., Klein. F.K., Sadee, W., J. Chromatogr., 188 (1980) 149-158
2
Garrett, C., Santi, D.V., Anal. Biochem., 99 (1979) 153-177
3
Colonna, A., Russo, T., Esposito, F., Salvator, F., Cimino, F., Anal. Biochem., 130 (1983) 19-26
4
Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979) 659-676
121
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Zakaria, M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 226 (1981) 167-290
122
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Bazele azotate din structura acizilor nucleici sunt adesea analizate n prezena
nucleozidelor corespunztoare, deoarece metodele cromatografice pot discrimina
ntre cele dou categorii de substane. Dei iniial separarea acestor substane se
fcea prin cromatografie de schimb ionic datorit gruprilor ionizabile1 actualmente
cromatografia n faz inversat este tot mai des folosit2.
Analiza unor baze azotate purinice i pirimidinice
prin cromatografie n faz inversat
Coloana Inertsil 5 ODS-2, 150 x 4.6mm
Faza 0,1 M H3PO4 + 0,2 M NaClO4, pH
2.0
mobil
Gradient Nu
Viteza 1 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie UV@260 nm
Proba 1. citozin 2. uracil 3. Guanin 4.
adenin 5. citidin 6. Uridin 7.
timin 8. Adenozin 9. Guanozin
10. Timidin
1
Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C., J. Chromatogr., 138 (1977) 203-212
2
Ichishima, E., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000) 675-688.
3
Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979) 659-676
123
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
fosfat - metanol s-au separat 28 de compui i s-au stabilit relaii ntre structurile
chimice i timpii de retenie ai derivailor din seriile purinic i pirimidinic ceea ce
a permis prezicerea timpilor de retenie din structura chimic.
Determinarea exact a concentraiilor metaboliilor purinici i pirimidinici
ntr-o mare varietate de lichide biologice a permis studierea unui mare numr de
boli i sugerarea unor abordri terapeutice. Probele de urin a fost filtrate i
analizate direct. Serul i plasma au fost deproteinizate prin precipitare cu acid
percloric i neutralizate nainte de injectare. S-au folosit diferite tipuri de coloane
ODS-2 i eluii cu tampoane fosfat (0,05M, pH 5,6) n amestec cu metanol, sau
sulfat de amoniu (pH 3,5) cu metanol sau acetonitril. n separarea bazelor azotate
tampoanele acetat dau eficiene mai sczute dect cele fosfat.
Analiza unor baze azotate purinice i pirimidinice
prin cromatografie n faz inversat perechi ionice
Coloana Bondapak C18, 300 x 4mm
Faza 0,1N Formiat de amoniu: acetonitril
mobil 100:1
Gradient Tampon A: 0,1 mM tetrabutilamonium
0-30 min hidrogen sulfat (C16), 2,5 mM
tetraetilamoniu bromur (C8) i 2%
metanol n 2 mM acetat de sodiu, 1,5
30-50 min mM tampon fosfat, pH 6,0.
Tampon A + 30 mM fosfat
Viteza 1 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie UV@254 nm
FU - fluorouracil, FUR - fluorouracil ribozid,
FUdR - Fluorouracil dezoxiribozid, FUMP -
fluorouridin 5'-monofosfat, 5'dFUR - 5'-dezo-
xifluorouracil ribozid, FdUMP - dezoxifluo-
rouridin monofosfat, UDPG - uridin
difosfoglucoz, UDP - uridin difosfat, dUDP -
dezoxiuridin monofosfat , UTP - uridin
trifosfat.
124
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
125
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Davis, G.E., Gehrike, C.W., Kuo, K.C., Agris, P.F., J. Chromatogr., 173 (1979) 281-298
2
Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C., . J. Chromatogr., 138 (1977) 203-212
126
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Efectul pH-ului
Variaia pH-ului ntre 4 i 8 nu influeneaz major timpii de retenie ai
nucleotidelor. Exist o uoar tendin de mrire a timpilor de retenie pe msur ce
pH-ul crete, dar efectele sunt mai vizibile la nucleozidele al cror pK' se afl n
acest domeniu de pH2. De exemplu, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, 1-
metiladenozina, adenozina i 7-metilguanozina au urmtoarele valori de pK'a 8,7;
4,3; 7,6; 3,5 i respectiv 7,1 i prin urmare timpii lor de retenie se vor schimba
disproporional, pe msur ce ctig sau pierd sarcina lor. Deci, pH-ul poate fi
folosit pentru a se modifica selectivitatea sistemului cromatografic.
Efectul Temperaturii
Timpii de retenie ai nucleozidelor scad ca o funcie liniar odat cu creterea
temperaturii pe domeniul 25 - 55C. Eficiena coloanei crete odat cu creterea
temperaturii.
Folosirea cromatografiei de afinitate cu acid boronic s-a dovedit a fi util
pentru separarea ribonucleozidelor i ribonucleotidelor, care conin grupri 2',3'-cis-
diol de moleculele ce nu conin hidroxili vicinali cum sunt dezoxiribonucleozide i
nucleozidele 2',3'-ciclic-fosfai. La pH alcalin moleculele ce conin grupri hidroxil
1
Breter, H.J., Seibert, G., Zahn, R.K., J. Chromatogr., 140 (1977) 251-256
2
Ostafe, V., Chiriac., A., Jastorff, B., Annals of Western University of Timisoara, ser.chim. 4 (1995) 1-
16.
3
Gehrke, C.W., Kuo, K.C., Zumwalt, R.W., J. Chromatogr., 188 (1980) 129-147
127
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Hageman, J.H., Kuehn, G.D., Anal. Biochem., 80 (1977) 547-554
2
Buck, M., Connick, M., Ames, B.N., Anal. Biochem., 129 (1983) 1-13
3
Glad, M., Ohlsen, S., Hansson, L., Mansson, M.-O, Mosbach, K., J. Chromatogr., 200 (1980) 254-
260
4
Hall, R.H., in "The Modified Nucleosides in Nucleic Acids", Columbia University Press, New York,
NY, 1971, p. 281-294
128
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
129
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999) 547-552.
130
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Hartwick, R.A., Brown, P.R., J. Chromatogr., 112 (1975) 695-657
2
Kmiec, Z., Smolenski, R.T., Zych, M., Mysliwski, A., Acta Biochim. Pol., 47 (2000) 349-353.
3
Ericson, A., Niklasson, F., De Verdier, C.-H., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 47-59
4
Linz, U, J. Chromatogr., 260 (1983) 161-163
131
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999) 547-552.
2
Debetto P., Bianchi, V., J. High Res. Chromatogr. Commun., 6 (1983) 117-122
132
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Su, Y., Hen, Y.Y., Chu, Y.Q., Van de Poll, M.E.C., Relling, M.V., J. Chromatogr. B., 732 (1999) 459-
468.
2
Monkkonen, H., Moilanen, P., Monkkonen, J., Frith, J.C., Rogers, M.J., Auriola, S., J. Chromatogr.
B. 738 (2000) 395-403.
3
Hoffman, N.E., Liao, J.C., Anal. Chem., 49 (1977) 2231-2235
4
Payne, S.M., Ames, B.N., anal Biochem., 123 (1982) 151-161
133
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
Seliger, H., Bach, T.C., Gortz, H.H., Harpp, E., Holluirek, M., Seemann-Preising, B., Schiebel,
H.M., Schulten, H.R., J. Chromatogr., 253 (1982) 65-79
2
Wei, Y.N., Marino, M., Thompson, B., Girard, J.E., J. Chromatogr. A., 864 (1999) 49-57.
134
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Shaw-Bruha, C.M., Lamb, K.A., Biotechniques., 28 (2000) 794-797.
2
Jiang, P.H., Chany-Fournier, F., Chany, C., Biochimie., 81 (1999) 701-707.
3
Topp, H., Schoch, G., Pediatr. Res., 47 (2000) 163-168.
135
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
1
McLaughlin, V.L:, Romanuik, E., Anal. Biochem., 124 (1982) 37-44
2
Sato, H., Akama, K., Kojima, S., Miura, K., Sekine, A., Nakano, M., Protein Expr. Purif., 16 (1999)
454-462.
3
Newton, C.R., Greene, A.R., Heathcliffe, G.R., Atkinson, T.C., Holland, D., Markham, A.F., Edge,
M.D., Anal. Biochem., 129 (1983) 22-30
4
Pearson, J.D., Regnier, F.E., J. Chromatogr., 255 (1983) 137-149
5
Kato, Z., Nakamura, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 266 (1983) 385-390
6
Haupt, W., Pingoud, A., J. Chromatogr., 260 (1983) 419-427
136
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) 3730-3739.
2
Schott, H., Mezer, H.D., Bazer, E., J. Chromatogr. , 280 (1983) 297-311
137
. . . . . . . . NUCLEOTIDE
putea fi separat de ceilali produi de reacie, mult mai polari. Ulterior, structura
naturalpoate fi regenerat prin ndeprtarea chimic a gruprii hidrofobe
protectoare1.
HPLC N FAZ INVERSAT PERECHI-IONICE
n cromatografia n faz inversat perechi-ionice sarcinile negative ale
gruprilor fosfat ale oligonucleotidelor sunt neutralizate prin adugarea ionilor
ncrcai pozitiv de alchilamoniu2. Cromatografierea se realizeaz pe o faz
staionar tip ODS. Metoda a fost aplicat i pentru determinarea lungimii
oligonucleotidelor dup digestia enzimatic iniial cu o fosfodiesteraz3.
HPLC DE EXCLUDERE MOLECULAR
n general, HPLC de excludere molecular nu este folosit pentru separarea
oligonucleotidelor ce conin mai puin de 100 de baze datorit rezoluiei sczute n
comparaie cu cromatografia de schimb ionic sau cea n faz inversat4. Totui,
cromatografia de excludere molecular a fost utilizat pentru separarea moleculelor
mari5, cum ar fi ARNt, ARNr i fragmente de ADN, cu toate c electroforeza n gel
de poliacriamid este preferat pentru astfel de separri.
1
Ike, Z., Ikuta, S., Sato, M., Huang, T., Itakura, K., Nucleic Acids Res., 11 (1983) 477-488
2
Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) 3730-3739.
3
Crwother, J.B., Caronia, J.P., Hartwick, R.A., Anal.Biochem., 124 (1982) 65-73
4
Bijsterbosch, M.K., Rump, E.T., De Vrueh, R.L.A., Dorland, R., van Veghel, R., Tivel, K.L.,
Biessen, E.A.L., van Berkel, T.J.C., Manoharan, M., Nucleic Acids Res., 28 (2000) 2717-
2725.
5
Graeve, L, Goemann, W., Foldi, P., Kruppa, J., Biochem. Biophys., Res. Commun., 107 (1982) 1559
138
LLIIPPIID
DEE
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
. . . . . . . . LIPIDE
Dei exist i ca molecule libere, lipidele pot fi combinate, fie covalent, fie
prin legturi slabe, cu compui din alte clase de biomolecule, formnd molecule
hibride, cum ar fi glicolipidele i lipoproteinele.
Fiind o clas foarte eterogen, nici un tip de clasificare nu este perfect.
Simplist, putem clasifica lipidele n lipide complexe (care n urma hidrolizei
alcaline elibereaz sruri ale acizilor grai, operaie numit i saponificare) i lipide
simple care nu conin acizi grai (i deci nu sunt saponificabile).
1
Giuffrida, A., de Fonseca, F.R., Piomelli, D., Anal. Biochem., 280 (2000) 87-93.
2
Browne, R.W., Armstrong, D., Clin. Chem., 46(2000) 829-836.
140
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
configuraie a catenei, cu ct nesaturarea este mai mare cu att eluarea se face mai
repede.
141
. . . . . . . . LIPIDE
1
Batta, A.K., Dayal, V., Colman, R.W., Sinha, A.K., Shefa, S., Salen, G., J. Chromatogr., 284 (1984)
257-260
2
Bailie, A.G., Wilson, T.D., O'Brien, R.K., Beebe, J.M., McCosh-Lilie, E.J., Hill, D.W., J.
Chromatogr. Sci., 20 (1982) 466-470
3
Van Rollins, M., Aveldano, M.I., Sprecher, H.W., Horrocks, L.A., Methods, Enzymol., 86 (1982)
518-530
142
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Printre reactivii cel mai des folosii pentru derivatizare pre-coloan a acizilor
grai menionm: derivaii benzil2, de 2-naftacil3, de o- i p-nitrobenzil4, de fenacil5,
de p-bromofenacil6, de metoxifenacil7, de 1-naftilamid8, etc. Derivaii de
nitrobenzil, fenacil, p-bromofenacil, metoxifenacil, 1-naftilamida pot fi monitorizai
cu detectoarele UV la 254 nm, cu sensibiliti pn la 4 ng acid gras. Derivaii de 2-
naftacil pot fi detectai prin fluorescen, cu lungimea de und de excitare la 290
nm i emisie la 450 nm9.
Cromatografierea derivailor acizilor grai se realizeaz, de obicei, tot pe
coloane ODS cu faza mobil metanol - ap sau acetonitril - ap. n acest caz
concentraia modificatorului organic este mai mare dect n cazul cromatografiei
acizilor grai nederivatizai. Ordinea de eluarea a acizilor grai derivatizai este
aceeai cu cea observat la speciile nederivatizate, adic timpul de retenie crete
odat cu lungimea lanului atomilor de carbon i descrete odat cu creterea
gradului de nesaturare.
Dei mult mai puin folosite i alte tehnici HPLC sunt uneori utilizate. De
exemplu, pentru separarea p-bromofenacil esterilor acizilor grai cu caten scurt
din artropode s-a folosit cromatografia n faz normal, cu silicagel ca faz
staionar i eluare cu un gradient de amestec de cloroform - hexan10.
Cromatografia de argintare a fost utilizat pentru separarea izomerilor geometrici ai
1
Akasaka, K., Ohrui, H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (1999) 1209-1215.
2
Polizer, I.R., Griffin, G.W., Dowty, B.J., Laseter, L., Anal. Lett., 6 (1983) 539-540
3
Cooper, M.J., Anders, M.W., Anal. Chem., 46 (1974) 1849-1852
4
Knapp, D.R., Krueger, S., Anal. Lett., 8 (1985) 603-606
5
Borch, R.F., Anal. Chem., 47 (1975) 2437-3439
6
Durst, H.D., Milano,H., Kikta, E.J., Connelllz, S.A., Grushka, E., Anal. Chem., 47 (1975) 1797-
1799
7
Miller, R.A., Bussell, N.E., Riketts, C., J. Liq. Chromatogr., 1 (1978) 291-304
8
Ikeda, M., Shimada, K., Sakaguchi, T., J. Chromatogr., 272 (1983) 251-259
9
Distler, W., J. Chromatogr., 192 (1980) 240-246
10
Weatherston, J., MacDonald, L.M., Blake, T., Benn, M.H., Yuang, Y.Y., J. Chromatogr., 161 (1978)
347-351
143
. . . . . . . . LIPIDE
esterilor metil ai acizilor grai1. n acest caz faza staionar a fost o coloan de
silicagel echilibrat cu soluie diluat de azotat de argint. Faza mobil a fost
haxanul, la care s-a adugat o mic cantitate dintr-un modificator organic mai polar
i anume acetonitrilul.
1
Scholfield, C.R., J. Am. Oil Chem. Soc., 56 (1979) 510-516
2
Blaha, V., Solichova, D., Cernohorsky, D., Bratova, M., Vyroubal, P., Zadak, Z., J. Pharm. Biomed.
Anal., 22 (2000) 563-572.
3
Hammond, E.W.,J. Chromatogr., 203 (1981) 397-403
144
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1,0 g per peak. S-au raportat separri prin faza normal a lipidelor serice1, din
uleiul de soia sau linte2 sau a unor amestecuri complexe de acilgliceroli3 i acizi
grai4. n ultimul caz faza mobil a fost 2,2,4-trimetilpentan - tetrahidrofuran - acid
formic (90:10:0,5).
1
Aitzetmuller, K., Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) 195-202
2
Plattner, R.D., Payne-Wahl, K., Lipids, 14 (1979) 152-153
3
Retterstol, K., Haugen, T.B., Christophersen, B.O., BBA-Mol. Cell. Biol. Lipids., 1483 (2000) 119-
131.
4
Greenspan, M.D., Schroeder, E.A., Anal. Biochem, 127 (1982) 441-448
145
. . . . . . . . LIPIDE
1
Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984)178-181
2
Jensen, P., J. Chromatogr., 204 (1981) 407-411
3
Parris, N.A., J. Chromatogr., 157 (1978) 161-170
4
Marai, L., Myher, J.J., Kuksis, A., Can. J. Biochem. Cell Biol., 61 (1983) 840-849
5
Vonach, B., Schomburg, G., J. Chromatogr., 149 (1978) 417-430
146
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Plattner, R.D., Spencer, G.E., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 54 (1977) 511-515
2
Plattner, R.D., Wade, K., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 55 (1978) 381-383
3
Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984)178-181
147
. . . . . . . . LIPIDE
1
Ramstedt, B., Slotte, J.P., Anal. Biochem., 282 (2000) 245-249.
2
Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.F., McCluer, R.H., Biochem. J., 145 (1975) 517-526
3
Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976) 55-60
148
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., J. Chromatogr., 227 (1982) 25-31
149
. . . . . . . . LIPIDE
mobil: acetonitril - metanol - acid sulfuric (100: 3: 0,05). n acest fel s-a reuit
separarea fosfatidilinozitolului, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilserinei, fosfatidil-
etanolaminei, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilcolinei i sfingomielinei1. Reducerea
coninutului de acid fosforic duce la creterea reteniei fosfatidilserinei,
fosfatidiletanolaminei i fosfatidilcolinei, iar omiterea acidului sulfuric face ca
aceste componente s nu mai elueze deloc. Creterea coninutul de metanol a dus la
scderea reteniei fosfolipidelor, motiv pentru care probele au fost pregtite n
cloroform - dietileter (1:1) pentru a se evita modificarea concentraiei metanolului
n faza mobil.
Alte combinaii de soluii folosite pentru faza mobil sunt: hexan - propanol -
ap , cloroform - propanol - acid acetic - ap (50:55:2,5 - 5: 5 - 10)3, cloroform -
2
metanol (95:5)4.
Folosind eluarea n gradient, pornind de la 96% 2-propanol - hexan (1:1) -
4% ap i ajungnd n 15 minute la 8% ap s-au separat fosfatidilglicerolul,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitolul, acidul fosfatidic, fosfatidilserina,
lizofosfatidilcolina.
Folosirea pentru perioade lungi de timp a unor faze mobile ce conin cantiti
mari de ap sau de metanol poate duce la instabilitatea fazei staionare de silicagel.
Aceasta poate fi evitat prin folosirea unor faze staionare schimbtoare de ioni.
Cum ar fi Bodnapak-NH2 ca faz normal i eluare cu gradient pornind de la
cloroform pn la metanol - ap (25:1 sau 25:4)5. n acest caz ordinea de eluare a
fost acid fosfatidic, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilcolina. Pe o coloan
Ultrasil-NH2 cu eluare n gradient de hexan - 2-propanol (11:16) i hexan - 2-
1
Kaduce, T.L., Norton, K.C., Spector, A.A., J. Lipid Res., 24 (1983) 1398-1403
2
Geurts van Kessel, W.S.M., Hax, W.M.A:, Bemel, R.A., de Gier, J., Biochim. Biophys. Acta, 486
(1977) 524-529
3
Blom, C.P., Deierkauf, F.A., Riemersma, J.C., J. Chromatogr., 171 (1979) 331-338
4
Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim.
Acta, 113 (1983) 97-110
5
Kiuchi, K., Ohata, T., Ebine, H., J. Chromatogr., 133 (1977) 226-230
150
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Hanson, V.L., Park, J.Y., Osborn, T.W., Kiral, R.M., J. Chromatogr., 205 (1981) 393-400
2
Gross, R.W., Sobel, B.E., J. Chromatogr., 197 (1980) 79-85
3
Smith, M., Jungalwala, F.B., J. Lipid Res., 22 (1981) 697-704
4
Porter, N.A., Wolf, R.A., Nixon, J.R., Lipids, 14 (1979) 20-24
5
Patton, G.M., Fasulo, J.M., Robins, S.J., J. Lipid Res., 23 (1982) 190-195
6
Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976) 55-60
151
. . . . . . . . LIPIDE
1
Hansen, H.H., Hansen, S.H., Schousboe, A., Hansen, H.S., J. Neurochem., 75 (2000) 861-871.
2
Kinoshita, M., Oikawa, S., Ayasaka, K., Sekikawa, A., Nagashima, T., Toyota, T., Miyazawa, T.,
Clin. Chem., 46 (2000) 822-828.
3
Pfefferle, C.M., Breinholt, J., Olsen, C.E., Kroppenstedt, R.M., Wellington, E.M.H., Gurtler, H.,
Fiedler, H.P., J. Nat. Prod., 63 (2000) 295-298.
4
Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 145 (1975) 517-526
5
Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., Chen, H.-H.Y., J. Chromatogr., 208 (1981) 339-346
6
Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim.
Acta, 133 (1983) 97-110
152
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
2
Sugawara, T., Miyazawa, T., Lipids., 34 (1999) 1231-1237.
3
Gerdt, S., Dennis, R.D., Borgonie, G., Schnabel, R., Geyer, R., Eur. J. Biochem., 266 (1999) 952-
963.
4
Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859
(1999) 99-105.
5
Kalhorn, T., Zager, R.A., Am. J. Physiol.-Renal Fluid Electrolyte Physiol., 277 (1999) F723-F733.
6
Rosenfelder, G., Chang, J.-N, Braun, D.G., J. Chromatogr., 272 (1983) 21-27
153
. . . . . . . . LIPIDE
1
Kadowaki, H., Bremer, E.G., Evans, J.E., Jungalwala, F.B., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 24 (1983)
1389-1397
2
Do, U.H., Per, P.T., Miinard, R.D., Lipids, 16 (1983)855-862
154
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859
(1999) 99-105.
2
Evans, J.E., McCluer R.H., Biochim. Biophys. Acta, 270 (1972) 565-569
3
Lee, D.P., J. Chromatogr., 20 (1982) 203-208
4
Ullman, M.D., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 18 (1977) 371-378
5
McCluer, R.H., Evans, J.E., J. Lipid Res., 17 (1976) 412-418
6
Kniep, B., Hunig, T.G., Fitch, F.W., Heurer, J., Kolsch, E., Muhlradt, P.F., Biochemistry, 22 (1983)
251-255
7
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
8
Bremer, E.G., Gross, S.K., McLuer, R.H., J. Lipid Res., 20 (1979) 1028-1035
155
. . . . . . . . LIPIDE
1
Traylor, T.D., Koontz, D.A., Hogan, E.L., J. Chromatogr., 272 (1983) 9-20
2
Hikita, T., Tadano-Aritomi, K., Iida-Tanaka, N., Toyoda, H., Suzuki, A., Toida, T., Imanari, T., Abe,
T., Yanagawa, Y., Ishizuka, I., Anal. Biochem., 281 (2000) 193-201.
156
S
STTEER
ROOIIZZII
1
Heftman, E., Lin, J.-T., J. Liq., Chromatogr., 5 (Suppl. I) (1982) 121-173
. . . . . . . . STEROIZI
Sterolii sunt alcooli steroidici care conin o grupare hidroxil la carbonul 3 din
ciclul A i un bra alifatic ramificat de cel puin 8 atomi de carbon la C17 din ciclul
D. Ei se gsesc fie ca alcooli liberi, fie sub form de esteri ai gruprii hidroxil de la
carbonul 3 cu acizi grai cu caten lung.
Pentru analiza sterolilor s-au folosit tehnicile HPLC n faz inversat3, n
faz normal4, argintarea5 i combinaii ale acestora. Majoritatea separrilor n faz
inversat au fost realizate cu faze staionare de tip ODS iar ca faz mobil s-au
folosit amestecuri apoase de diferii solveni organici. Avantajul major al folosirii
tehnicilor n faz inversat const n faptul c separarea depinde de numrului
atomilor de carbon ct i de numrul legturilor duble carbon-carbon ale sterolilor
supui separrii.
Majoritatea separrilor n faz inversat au fost realizate pe faze staionare
ODS, eluarea realizndu-se cu faze mobile apoase ce conineau un modificator
organic. Avantajul major al tehnicii n faz inversat este c rezoluia sterolilor
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
2
Evrard D.A., Harrison B.L., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 34. (1999) 1-10.
3
Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C.,
Endocrinology., 141 (2000) 2450-2457.
4
Grizard, G., Sion, B., Bauchart, D., Boucher, D., J. Chromatogr. B., 740 (2000) 101-107.
5
Ruan, B.F., Wilson, W.K., Pang, J.H., Schroepfer, G.J., Steroids., 65 (2000) 29-39.
158
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Hansbury, E., Scallen, T.J., Chromatogr. Sci., 16 (1982) 253-276
2
Ansari, G.A.S., Smith, L.L., J. Chromatogr., 175 (1979) 307-315
3
Perkins, E.G:, Hendren, D.J., Bauer, J.E., El-Hamdy, A.H., Lipids, 16 (1981) 609-613
4
Duncan, I.W., Culbreth, P.H., Burtis, C.A., J. Chromatogr., 162 (1979) 281-292
159
. . . . . . . . STEROIZI
1
Pascal, R.A., Faris, C.L., Schroepfer, G.J., Anal. Biochem., 101 (1980) 15-22
2
Colin, H., Guichon, G., Siouffi, A. Anal. Chem., 51 (1979) 1661-1666
160
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
n aceast clas sunt incluse mai multe grupe de substane printre care
cortocosteroizii, hormonii gestrogeni, androgeni i estrogeni. nc de timpuriu au
fost publicate ample articole consacrate acestui subiect2,3.
1
Yaku, K., Morishita, F., J. Biochem. Biophys. Methods., 43(1-3), (2000) 59-76
2
Nice, E.C., OHare, M.J., J. Chromatogr., 162 (1982) 401-407
3
Alvarez-Coque, M.C.G., Broch, S.C., J. Chromatogr. B. 736(1-2) (1999) 1-18
4
Bodor, N., Drustrup, J., Wu, W., Pharmazie., 55 (2000) 206-209.
5
Marquet, P., Lachatre, G., J. Chromatogr. B. 733(1-2) (1999) 93-118
6
Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C.,
Endocrinology., 141 (2000) 2450-2457.
161
. . . . . . . . STEROIZI
1
Touchstone, J.C., Wortmann, W., J. Chromatogr., 76 (1973) 244-247
2
Trefz, F.K., Byrd, D.J., Kochen, W., J. Chromatogr., 272 (1975) 9-20
3
Loo, J.C.K., Butterfield, A.G., Moffatt, J., Jordan, N., J. Chromatogr., 143 (1977) 275-280
4
Schwedt, G., Bussemas, H., J. Chromatogr., 285 (1977) 381-385
5
Ebling, W.F., Szefler, S.J., Jusko, W.J., J. Chromatogr., 305 (1984) 271-280
6
Van den Berg, J.H.M., Mol, C.R., Deeldr, R.S., Thijssen, J.H., Clin. Chim. Acta, 78 (1977) 165-172
7
Nilsson, B., J. Chromatogr., 276 (1983) 413-417
162
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Reardon, G.E., Caldarella, A.M., Canalis, E., Clin. Chem., 25 (1979) 122-126
2
Ulrick, S., Ramirez, L.C., New, M.I., J. Clin. Endocrinol., 44 (1977) 799-802
3
Bevalot, F., Gaillard, Y., Lhermitte, M.A., Pepin, G., J. Chromatogr. B., 740 (2000) 227-236
4
Engel, L.L. (ed.) The Physical Properties of Steroid Hormones, Pergamon Press, Oxford, 1963
5
Gotelli, G.R., Wall, J.H., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 27 (1981) 441-443
6
Kawasaki, T., Maeda, M., Tsuji, A., J. Chromatogr., 163 (1979) 143-150
7
Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Liq. Chromatogr., 6 (1983) 1131-1138
8
Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Chromatogr., 305 (1983) 188-193
163
. . . . . . . . STEROIZI
1
Lin, J.-T., Heftmann, E., Hunter, I.R., J. Chromatogr., 190 (1980) 169-174
164
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Purdy, R.H., Durocher, C.K., Moore, P.H., Rao, P.N., Chromatogr. Sci., 234 (1982) 513-516
2
Liere, P., Akwa, Y., Weill-Engerer, S., Eychenne, B., Pianos, A., Robel, P., Sjovall, J., Schumacher,
M., Baulieu, E.E., J. Chromatogr. B., 739 (2000) 301-312.
3
Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) 485-487
4
Kawalek, J.C., Hawang, K.K., Kelsey, M.I., Chromatographia, 14 (1981) 633-637
5
Van der Hoeven, J., J. Chromatogr., 196 (1980) 494-497
165
. . . . . . . . STEROIZI
1
Darney, K.J., Wing, T.-Y, Ewing, L.I., J. Chromatogr., 257 (1983) 81-90
2
Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) 485-487
3
Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Dingman, J., Anal. Chem., 44 (1972) 2211-2216
4
Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Anal. Chem., 45 (1973) 2310-2314
5
OHare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 14 (1982) 277-322
6
Gotelli, G.R., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 23 (1977) 165-168
166
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Cele mai populare tehnici HPLC folosite pentru separarea estrogenilor sunt
cromatografia n faz inversat1,2 i cea n faz inversat perechi ionice3. Mult mai
puin folosite sunt cromatografia n faz normal i cea de schimb ionic.
n cazul cromatografiei n faz inversat, faza staionar cea mai folosit a
fost ODS, iar faza mobil amestecuri apoase de metanol i acetonitril. De exemplu,
cnd faza mobil a fost metanol 0,1% carbonat de amoniu (n ap) estriolul i
estradiolul au fost eluai succesiv. Cnd faza staionar a fost silicagelul i eluia s-a
fcut cu etanol n-heptan (5:95), ordinea de eluie a fost estrona, estradiolul i
estriolul.
Importana modificatorului organic n determinarea ordini de eluie n cazul
cromatografiei n faz inversat a fost demonstrat folosind o faz staionar ODS
i o faz mobil format din acetonitril - 0,5% fosfat monoacid de amoniu, pH 3,0
(1:2) pentru separarea 17-ceto i 17-hidroxi estrogenilor. Cnd metanolul a fost
substituit cu acetonitril s-a schimbat ordinea de eluare4.
n cromatografia n faz normal s-au folosit att faze staionare cu silicagel
ct i diol. Faza mobil a fost hexan etanol (9:1) pentru separarea estrogenilor
polari (estradiol, 6-cetoestradiol, 16-epiestriol, estriol, 16,17-estirol, 2-hidroxiestri-
ol), iar pentru estrogenii mai puin polari s-a folosit hexan etanol (97:3)5.
Separarea epimerilor se realizeaz mai bine prin cromatografie n faz
normal, dar cnd compuii ce urmeaz a fi separai difer prin prezena unei
grupri ceto, hidroxi sau a unei duble legturi, se recomand cromatografia n faz
inversat.
Dei mult mai puin folosit, cromatografia de schimb ionic poate da
rezultate bune. S-au folosit schimbtori de anioni i faze mobile formate din 0,01 M
1
Hauptmann, H., Paulus, B., Kaiser, T., Luppa, P.B., Bioconjugate Chem., 11 (2000) 537-548.
2
Wolfling, J., Schneider, G., Peter, A., J. Chromatogr. A., 852 (1999) 433-440.
3
Johnsen, H.K., Tveiten, H., Willassen, N.P., Arnesen, A.M., Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem.
Mol. Biol., 124 (1999) 355-362.
4
Shimada, K., Tanaka, M., Nambara, T., J. Chromatogr., 178 (1979) 350-354
5
Lin, J.-T, Heftmann, E., J. Chromatogr., 312 (1981) 239-244
167
. . . . . . . . STEROIZI
fosfat monopotasic, pH 4,2, sau 0,1 M clorur de sodiu, pH 5,0, sau 0,01 M tampon
fosfat pH 6,8 cu diferite concentraii de perclorat. Ordinea de eluie este estrioli,
estrani, estradiol, 17-hidroechilina, echilenina i dihidroechilenina. Conjugaii
inelului A sunt eluai naintea conjugailor inelului D. Conjugaii glucuronici sunt
eluai naintea fosfailor i sulfailor1.
n cromatografia n faz inversat perechi ionice s-au folosit coloane C2 i
C8, echilibrate cu 1-pentanol i folosind ca agent pentru formarea perechilor ionice
hidroxidul de tetrapropilamoniu2.
1
Van der Wal, Sj., Huber, J.F.K., J. Chromatogr., 135 (1977) 305-321
2
Hermansson, J., J. Chromatogr., 152 (1978) 437-442
168
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) 505-512
2
Taylor, J.T:, Knotts, J.G., Schmidt, G.J., Clin. Chem., 26 (1980) 130-132
3
Fishman, S., J. Pharm. Sci., 64 (1975) 674-680
4
Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) 505-512
5
Prescott, W.R., Boyd, B.K., Seaton, J.F., J. Chromatogr., 234 (1982) 513-516
169
. . . . . . . . STEROIZI
170
V
VIITTA
AM NEE
MIIN
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
. . . . . . . . VITAMINE
172
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
cantiti mici de material biologic. Ele mai trebuie s ndeplineasc i alte condiii,
cum ar fi:
Rapiditate;
Capacitatea de a evita expunerea vitaminelor la cantiti mari de cldur,
lumin UV sau surse de oxidare;
Utilizarea de sisteme sensibile de detecie, deoarece multe vitamine nu conin
grupri cromofore puternice.
HPLC ndeplinete toate aceste condiii i este folosit pentru analiza
vitaminelor din cele mai diverse tipuri de probe inclusiv esuturi animale, vegetale
sau produse alimentare1. Cele mai comune metode de separare a vitaminelor includ
cromatografia n faz inversat2, n faz inversat perechi ionice3, n faz normal4
i de schimb ionic5. Cromatografia de afinitate i gel-filtrare6 au o aplicabilitate
redus n cazul vitaminelor.
Multe vitamine sunt extrem de labile motiv pentru care trebuie luate msuri
speciale pentru a se mbunti stabilitatea lor n timpul extraciei i analizei HPLC.
1
Parrish, D.B., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 13 (1980) 161-170
2
Gatti, R., Gioia, M.G., Cavrini, V., J. Pharm. Biomed. Anal., 23 (2000) 147-159.
3
Fraser, A.G., Woollard, G.A., J. Gastroenterol. Hepatol., 14 (1999) 1070-1073
4
Abidi, S.L., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 197-216.
5
Sharpless, K.E., Margolis, S., Thomas, J.B., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 171-181.
6
Juntunen, K., Rochel, N., Moras, D., Vihko, P., Biochem. J., 344 (1999) 297-303.
173
. . . . . . . . VITAMINE
1
Wittina, D.P., Hanley, W.G., n GLC and HPLC Analysis of Therapeutic Agents (Tsuji, M.,
Monowitch, W., eds.), Dekker, New York, NY, 1976
174
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Wielder, Mink, (1983)
175
. . . . . . . . VITAMINE
Cele mai comune forme ale vitaminei B2 sunt riboflavin 5-fosfatul (FMN) i
flavin adenin dinucleotidul (FAD), care sunt cunoscute datorit participrii lor ca n
calitate de cofactori enzimatici la lanul transportor de electroni. Aceti cofactorii
sunt de obicei legai de apoenzime prin gruprile fosfat i izolarea lor din esuturi
poate fi realizat prin hidroliz acid blnd sau hidroliz enzimatic cu fosfataze
acide. Exist i cazuri n care flavin nucleotidul este legat covalent de un rest
histidinic din lanul polipeptidic al enzimei (succinat dehidrogenaza) cnd este
necesar o hidroliz n condiii mai drastice.
Absorbia intrinsec a diferitelor forme ale vitaminelor B2 faciliteaz detecia
lor prin monitorizarea absorbanelor UV la 280 nm. Detecia prin fluorescen2
(excitaie la 450 nm, emisie la 520 nm) este mult mai sensibil i selectiv.
Separrile vitaminelor B2 se realizeaz de obicei prin cromatografie n faz
inversat3, n faz inversat perechi ionice i n faz normal.
Flavin nucleotidele din extractele de carne au fost determinate prin folosirea
ca faz staionar a silicagelului cu o faz mobil format din cloroform - metanol
(90:10)4
Pentru separarea vitaminelor B2 prin cromatografie n faz inversat perechi
1
Ishii, K., Sarai, K., Sanemori, H., Kawasaki, T., Anal. Biochem., 97 (1979) 191-195
2
Craig, I.D., Ashby, C.W., Brown, I., Crosby, N.T., Guffogg, S., et all., Analyst., 125 (2000) 353-360.
3
Gliszczynska-Swiglo, A., Koziolowa, A., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 285-297
4
Ang, C.Y.W., Moseley, J., J. Agric. Food Chem., 28 (1980) 483-486
176
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
ionice (a se vedea i exemplele de la vitamina B1) s-au propus diferite tipuri de faze
mobile:
metanol 0,1 M foarmat de amoniu, pH 3,7 (17:83);
metanol 5 mM format de tetrabutilamoniu, pH 3.5 (27:73);
metanol 0,1 % acid fosforic, 5 mM pentan sulfonat de sodiu (15:85)
A: 5mM pentan sulfonat de sodiu + 0.1% H3PO4; B: Eluent "A" in 80% MeCN,
eluare n gradient: 2.5%B pn la 80%B n 20 minute
177
. . . . . . . . VITAMINE
1
Fu, M.M., Silverman, R.B., Bioorg. Med. Chem., 7 (1999) 1581-1590
2
Vanderslice, J., Maire, C.E., J. Chromatogr., 196 (1980) 176-179
178
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Acidul nicotinic are mai multe forme active, pornind de la acidul nicotinic
liber i derivaii amidei sale, ct mai ales derivaii nucleotidici - nicotinamid-
adenin-dinucleotidul (NAD) i nicotinamid-adenin-dinucleotid fosfatul (NADP).
Acidul nicotinic i derivaii si sunt stabili la oxidare prin cldur, lumin,
acizi sau baze, ceea ce nseamn c extracia lor cu un sistem compatibil cu HPLC
este o sarcin uoar n comparaie cu alte vitamine. Extractele biologice sunt
obinute prin deproteinizare cu aceton, urmat de extracia cu acid clorhidric
diluat. Alternativ, se poate folosi acetatul de etil n combinaie cu acidul clorhidric.
Cea mai popular metod HPLC de separare a piridin nucleotidelor este
cromatografia n faz inversat1 perechi ionice (a se vedea i vitaminele B1, B2). De
exemplu, folosind o coloan ODS cu o faz mobil ap metanol (9:1) plus 0,05 M
tetrabutilamoniu fosfat ca agent de pereche ionic, s-a reuit eluarea consecutiv a
nicotinamid-N-oxidului, acidului 2-hidroxipiridin-5-carboxilic, nicotinamidei,
acidului nicotinic i acidului nicotinuric2.
1
Albrecht, W., Storck, M., Pfetsch, E., Martin, W., Abendroth, D., Ther. Drug Monit., 22 (3) 283-294.
2
Hengen, N., Seiberth, V., Hengen, M., Clin. Chem., 24 (1978) 1740-1743
179
. . . . . . . . VITAMINE
1
Tsuruta, Y., Kohashi, K., Ishida, S., Ohkura, Y., J. Chromatogr., 309 (1984) 309-315
2
Okada, M., Kyoguchi, M., Nakayama, T., Hirota, R., Amachi, T., Ueda, T., J. Nutr. Sci. Vitaminol.,
46 (2000) 101-104.
3
Jonvel, P., Andermann, G., Bartholemy, J.F., J. Chromatogr., 281 (1985) 371-376
180
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Halvorsen, O, Skrede, S., Anal. Biochem., 107 (1980) 103-108
2
Ingerbretsen, O.C., Normann, D.T., flatmark, T., Anal. Biochem., 96 (1979) 181-188
3
Wilbur, D.S., Pathare, P.M., Hamlin, D.K., Frownfelter, M.B., Kegley, B.B., Leung, W.Y., Gee,
K.R., Bioconjugate Chem., 11 (2000) 584-598
4
Shahdeo, K., Karnes, H.T., J. Pharm. Biomed. Anal., 21 (1999) 361-370.
5
Desbene, P.L., Coustal, S., Frappier, F., Anal. Bochem., 128 (1983) 359-362
181
. . . . . . . . VITAMINE
Acidul folic este compusul cel mai rspndit din grupul complex al
conjugailor pterinelor, avnd funcia de transfer a unor grupri cu un atom de
carbon. Tetrahidrofolatul (FH4) este un transportor intermediar al gruprilor
hidroximetil (CH2OH), formil (CHO) sau metil (CH3).
Folaii sunt foarte sensibili la oxidare prin cldur, lumin UV sau expunere
n mediu acid1, motiv pentru care trebuie luate precauiuni speciale n toate etapele
de separare i analiz.
Dintre metodele cromatografice cele mai folosite sunt cromatografia n faz
inversat2,3, cromatografia n faz inversat perechi ionice (a se vedea exemplele de
la vitaminele B1, B2 i piridin nucleotide) i cromatografia de schimb ionic.
Detecia se face de obicei prin monitorizarea UV ntre 285 - 305 nm, dar s-ar
raportat i detecia amperometric4.
1
Baugh, C.M., Krundieck, C.I., Ann. N.Y. Acad. Sci., 186 (1971) 28-40
2
Stokes, P., Webb, K., J. Chromatogr. A., 864 (1999) 59-67.
3
Forssen, K.M., Jagerstad, M.I., Wigertz, K, Witthoft, C.M., J. Am. Coll. Nutr., 19 (2000) 100S-110S.
4
Birmingham, B.K., Green, D.S., J. Pharm. Sci., 72 (1983) 1306-1309
182
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
Acidul lipoic poate exist liber dar i legat de partea proteic a enzimelor
prin intermediul gruprii epsilon amino a unui rest de lizin. Mai mult de 90% din
cofactorul legat poate fi regsit prin tratare cu 6 M HCl la 110C pentru 24 ore1.
Iniial, acidul lipoic se separa prin cromatografie n strat subire, dar astzi se
folosesc aproape exclusiv variantele HPLC2 - n faz inversat, faz inversat
perechi ionice i schimb ionic.
Folosind o coloan C18 i eluare n gradient de la 25% la 75% metanol n
acid acetic s-au separat 11 derivai ai acidului lipoic: acidul lipoic, acidul
dihidrolipoic lipoil glicinamida, 8-metil-lioatul, acidul 6,9-ditiononanoic, S-oxidul
metil tetranorlipoatului, acidul tetranorlipoic, acidul -hidroxi bis-norlipoic, acidul
bis-norlipoic i metil lipoatul3.
1
Bayer, E., Skutclsky, E., Wilchek, M., Methods Enzymol., 62D (1979) 308-338
2
Haj-Yehia, A.I., Assaf, P., Nassar, T., Katzhendler, J., J. Chromatogr. A., 870 (2000) 381-388.
3
Howard, S., McCormick, D.B., J. Chromatogr., 208 (1981) 129-134
4
Tsao, C.S., Salin, S.L., J. Chromatogr., 224 (1981) 477-486
5
Lieber, L-F-. Kuo, J., Krigel, R., Pille, E., Silber, R., Anal. Biochem. 118 (1981) 53-60
6
Bui-Nguyen, M.H., J. Chromatogr., 196 (1980) 163-165
183
. . . . . . . . VITAMINE
1
Ostafe, V., Brumaru, C., Papoe, G., Lupa, I., Annals West Univ. Timioara, Series of Biology, 2
(1999) 95-104
2
Fraser, A.G., Woollard, G.A., J. Gastroenterol. Hepatol., 14 (1999) 1070-1073
3
Speek, A.J., Schriver, J., Schreurs, W.H.P., Anal. Chem., 30 (1984) 1190-1205
4
Freukel, E., Prough, R., Kitchens, R.C., Methods Enzymol., 67 (1980) 31-40
184
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, Wiley-Interscience,
New York, NY, 1979
2
Jacobsen, D.W:, Green, R., Quadros, E.V., Montejano, Y.D., Anal. Biochem., 120 (1982) 394-403
3
Mizoguchi, K., Kagawa, M., Nakamura, M., Sato, K., J. Nutr. Sci. Vitaminol., 46 (2000) 97-100
4
Maggio-Hall, L.A., Escalante-Semerena, J.C.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96 (1999) 11798-11803
5
Jacobsen, D.W:, Green, R., Quadros, E.V., Montejano, Y.D., Anal. Biochem., 120 (1982) 394-403
6
Whitman, W.B., Wolfe, R.S., Anal. Biochem., 137 (1984) 261-265
185
. . . . . . . . VITAMINE
1
Schweigert, F.J., Hurtienne, A., Bathe, K., Int. J. Vitam. Nutr. Res., 70 (2000) 79-83.
186
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
1
Annesley, T., Grachero, D., Wilherson, K., Grekin, J., Ellis, C., J. Chromatogr., 305 (1984) 199-203
2
Noll, G.N., Becker, C., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 183-188.
187
. . . . . . . . VITAMINE
metode de extracie, dar cea mai comun este saponificarea probei i extracia cu un
solvent organic (uzual hexan sau dimetilsulfoxid). Folosirea ca faz mobil a
eterului etilic n locul hexanului a fost recomandat deoarece acest solvent a permis
separarea vitaminelor D2, D3 i E din ficatul de pete1.
Principalii contaminani n analiza vitaminelor D2 i D3 sunt precursorii lor
metabolici, 7-dehidrocolesterolul i ergosterolul. Totui, att HPLC2 n faz
normal3 ct i n faz inversat4 pot duce la separri satisfctoare.
Detecia vitaminelor D se realizeaz, de obicei, la 254 nm.
1
Stancher, B., Zonta, F., J. Chromatogr., 286 (1983) 93-98
2
Higashi, A., Shimada, K., Yakugaku Zasshi-J. Pharm. Soc. Jpn., 119 (1999) 898-920
3
Kissmeyer, A.M., Sonne, K., Binderup, E., J. Chromatogr. B. 740 (2000) 117-128.
4
Gamiz-Gracia, L., Jimenez-Carmona, M.M., de Castro, M.D.L., Chromatographia., 51 (2000) 428-
432.
5
Abidi, S.L., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 197-216.
6
Zaspel, B.J., Saari-Csallany, A., Anal. Biochem., 130 (1983) 146-150
188
. . . VASILE OSTAFE . . . . .
la 295 nm, emisie la 340 nm). Detecia UV la 294 nm este, de asemenea posibil,
dar mult mai puin sensibil.
1
Lefebre, M.D:, Leenheer, A.P., Claeys, A.E., J. Chromatogr., 186 (1979) 749-762
2
Iwase, H., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 261-266.
189
. . . . . . . . VITAMINE
1
Bolton-Smith, C., Price, R.J.G., Fenton, S.T., Harrington, D.J., Shearer, M.J., Br. J. Nutr., 83 (2000)
389-399.
2
Miyakawa, T., Kajiwara, Y., Shirahata, A., Okamoto, K., Itoh, H., Ohsato, K., Jpn. J. Cancer Res.,
91 (2000) 68-74.
3
Iwase, H., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 261-266.
4
Langenberg, J.P., Tjaden, U.R., J. Chromatogr., 305 (1984) 61-72
190