Terapia genica de augmentare

(Studiu de caz - Gene Augmentation Therapy for a Missense Substitution in the

cGMP-Binding Domain of Ovine CNGA3 Gene Restores Vision in Day-Blind
Sheep)

Student: Popovici Vlad Prof: Dr. Toma Sebastian

Medicina Anul 2
Tratamentul tulburarilor genetice prin introducerea unor gene
corespunzatoare in celulele organului tinta, se numeste terapie
genetica.
Terapia de augmentare a genei pentru o substituție de tip Missense în
domeniul de (legare a genei cGMP a ovulelor Gene CNGA3
restaurează viziunea la ovinele de zi.

Aromatopsia congenitală (ACHM) este o tulburare ereditară a vederii

cauzată de disfuncția fotoreceptorului conului. 1 In cele mai multe
cazuri umane, AMCM rezultă din mutații în CNGA3 și CNGB3 gene care
codifică subunități a și p ale gated nucleotide ciclic (GNC) canalul ionic
al fotoreceptori con, respectiv. 2 , 3 mutații în patru gene suplimentare
- PDE6C , PDE6H , GNAT2 și ATF6 - de asemenea provoacă boala.

Scop
Aplicarea terapiei de augmentare a genei CNGA3 pentru a vindeca o
mutație nouă cauzală din cauza achromatopsiei (ACHM) la oi.

Metode
Viziunea defectuoasă care a apărut spontan la miei nou-născuți a fost
caracterizată prin tehnici comportamentale, electroretinografice (ERG)
și histologice. Secvențarea profundă a unui miel afectat și a mielului
neafectat au fost comparate în cadrul regiunilor conservate genomice
ortologice pentru genele umane implicate în tulburări vizuale similare.
Substituțiile nesemnificative de aminoacizi observate au fost clasificate
după scorul lor de dăunătorie. Mutația cauzală cauzală a fost evaluată
prin producerea de heterozygote de compus CNGA3 și prin aplicarea
terapiei de augmentare a genei utilizând cADN uman ortologic.

Rezultate
Analiza comportamentală a evidențiat orbirea pe zi, iar examinarea ERG
ulterioară a arătat răspunsuri fotopice atenuate. Examinarea histologică
și imunohistochimică a ochilor afectați de ovine nu a evidențiat
degenerare și au fost prezenți fotoreceptori de conuri care exprimă
CNGA3. Analizele bioinformatice și secvențiere au sugerat o substituție
c.1618G> A, p.Gly540Ser în domeniul de legare GMP al CNGA3 ca
mutație cauzală. Acest lucru a fost confirmat de testul de concordanță
genetică și de experimentul de complementare genetică: Toți cei cinci
heterozygote CNGA3 , purtând atât mutații p.Arg236 * și p.Gly540Ser în
CNGA3 , au fost orbi zi. Mai mult, administrarea subretinală a CNGA3
uman intact folosind o viziune fotopică restabilită a vectorului viral
adeno-asociat (AAV), în doi pași homozigotari afectați de p.Gly540Ser.

Concluzii
Substituția c.1618G> A, p.Gly540Ser în CNGA3 a fost identificată drept
mutația cauzală pentru o nouă formă de ACHM în oile Awassi. Terapia
cu augmentare genetică a restabilit viziunea la ovinele afectate.
Această mutație nouă oferă un model de animal de mare amploare,
care este valabil pentru majoritatea pacienților cu ACHM CNGA3 uman ;
majoritatea dintre aceștia poartă o greșeală mai degrabă decât mutații
premature de terminare.

Evaluare comportamentală
Testul de navigare pe labirint de ovine neafectate afectate și de control
a fost efectuat așa cum s-a descris mai înainte. 11 Pe scurt, animalele
au fost îndreptate să treacă printr-un labirint lung de 9 m cu două
obstacole de barieră. Un grup de oi poziționate la capătul labirintului a
atras animalul testat să treacă prin labirint cât mai repede posibil.
Timpul de trecere și numărul de coliziuni cu obstacole sau pereți de
labirint au fost înregistrate pentru fiecare încercare. Un proces a durat
până la 30 de secunde, iar un timp de trecere de 30 de secunde a fost
atribuit animalelor care nu au reușit să navigheze cu succes în labirint.
Pentru fiecare oaie, un test a constat din două încercări succesive, cu
barierele rearanjate aleatoriu în orientarea lor dreaptă sau stângă între
încercări pentru a evita un efect de învățare.

Două dintre animalele afectate au suferit o terapie de augmentare a

genei în ochiul lor drept. Sesiunile postoperatorii de testare a
labirintului pentru acele animale au fost efectuate cu patch-uri
alternative ale ochilor tratați și netratați.

Histologie și IHC ale retinelor de control și oilor afectate

Nu s-au observat diferențe între ovinele locale Awassi afectate și cele
neafectate în examinarea histopatologică a secțiunilor retinale pătate
cu hematoxilină și eozină (H & E) ( figura suplimentară S3 A). Evaluarea
imunohistochimică a retinelor afectate a evidențiat o structură
retiniană în general conservată, cu un număr mare de fotoreceptori
conici ( Fig. Complementar S3 B) care exprimă atât opsine roșu / verde,
cât și conuri albastre ( figura complementară S3C ).

Colorarea retinei ovine afectate cu anticorp anti-CNGA3 a demonstrat

expresia proteinei CNGA3 în segmentele interioare și exterioare ale
fotoreceptorilor ( Figura 1 ).
Bibliografie:
https://www.majordifferences.com/2013/10/gene-augmentation-vs-
corrective-gene.html
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5361581/