II.

CROMATOGRAFIA

Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodata de

analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula într-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumită și eluent , se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece în coloana
cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila,– se scurge continuu, cu
viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea,
cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la
gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si
se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Spalati de eluent, o parte
din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se
datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în
grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea pe rând a componentilor, la parasirea coloanei cromatografice de catre un
detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod ideal la oricare)
dintre speciile moleculare ce traversează coloana ceomatografică. Detectorul dă un
semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza mobila.
Intr-o exprimare plastică se poate spune că detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia
din substantele ce compun initial amestecul analizat în mod similar cu un sistem
Video care înregistreaza trecerea liniei de sosire de către concurenti în atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme

Dacă se inregistrează semnalele date de detector in funcție de timp se obține o

cromatogramă. Pe cromatograma se disting o serie de maxime, numite peak-uri (peak
engl. = vârf), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei,
paralela cu axa timpului. In cazul ideal, oricare peak are forma distributiei normale
Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obține cea

1
mai simplă cromatogramă posibilă de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind
reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea
(injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului – exprimat în unitati
arbitrare.
In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de bază:

1. Peak- urile cromatografice. În cazul prezentat în fig. 1, cele doua semnale

sau vârfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate în toate metodele
cromatografice în scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in
amestecul analizat. In acest sens inălțimea peak-ului sau suprafața lui reprezintă o
măsură a concentrației speciei chimice și timpul de sosire la detector ( denumit timp de
retenție) reprezintă o caracteristică a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogramă
este asemănătoare cu o spectrogramă. Diferențele intervin la faptul că la o
spectrogramă identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de undă
care este o constantă fizică, iar la o cromatogramă identificarea speciilor se face prin
timpul de retenție care este o mărime caracteristică numai in conditii date de
temperatură, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe
cromatografia este superioară spectrometriei. La analiza spectrometrică a unor
amestecuri complexe, cu lungimi de undă specifice apropiate pentru unele specii
chimice, se poate ajunge la identificări greșite. Asemenea erori sînt excluse la
cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferiți prin
dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclusă atît confuzia acestora cît și
posibilitatea ca acestia să părăsească coloana neidentificați .
Primul peak din cromatogramă, de înălțime mai redusă, corespunde unui
component inert ( gazul purtător în cromatografia de gaze sau diluantul lichid in
cromatografia de lichide ) - care este retinut în foarte mică măsură de coloana
cromatografică. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice în cazul
de fata) analizate. Sosirea intirziată a grupului de molecule a acestei specii față de
eluent se datorează staționarii mai îndelungate în coloana cromatografică ca urmare
afinității mai mari a acestei specii față de materialul coloanei. Gradul de afinitate este
exprimat prin numărul absorbțiilor și desorbțiilor repetate de pe umplutura sau pereții
coloanei și este o caracteritrică a naturii speciilor analizate. Cu cît numărul absorbțiilor
și desorbțiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de către o specie chimică
cu atît mai tîrziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe
timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval
Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet neretinut de catre
faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pâna la detector. Acesta nu
poate fi zero. În cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu
timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul
scurs de la injectarea (introducerea) probei în coloana si aparitia maximului de
concentratie în detector, pentru componentul neretinut.
Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al
amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pâna la
verticala prin vârful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau în amestec.
Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie
(legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe):

2
 VR = tR·Qe

Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea

compara timpii masurati pe coloane diferite, în cazul aceluiași component - este dat de
diferenta:
tR' = tR - tM

Volum de retentie ajustat are expresia :

VR' = VR - VM

unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tM·Fe
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.

II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE

S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de
altele în primul rând prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge:
a. cromatografia de gaze (GC) când faza mobila este un gaz;
b. cromatografia de lichide (LC) când faza mobila este un lichid
c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat
peste temperatura critica.

In cadrul cromatografiei de gaze (GC) se disting urmatoarele tehnici:

1. Cromatografia gaz-lichid (cromatografie de repartiţie), faza stationara este un lichid

nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, de
tip silicagelul sau alumina, situat într-o coloană, la asa-numita cromatografie
conventională sau suportul poate fi chiar peretele coloanei, confectionată la
dimensiuni capilare, la așa numita cromatografie pe coloana capilara.
2. Cromatografia gaz-solid (cromatografie de absorbţie), faza stationara o constituie tot
silicagelul sau alumina, respectiv “sitele moleculare” (niste silicati naturali sau
sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta
pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE

Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze

sau solide care pot fi trecute sau există în stare gazoasă şi care nu se descompun la
încălzire în alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiză este acela în care

3
amestecurile supuse analizei sînt în stare lichidă din care sînt aduse în stare gazoasă
prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este
la substanţele la care temperatura de vaporizare este mai mare decît temperatura de
descompunere a substantelor de analizat rezultind alţi compuşi decît cei supuşi
analizei. In aceste cazuri Înainte de introducerea probei în cromatograf se pot realiza
niste derivati (compusi noi), volatili, utilizând anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uşurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode.
Printre domeniile în care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia,
industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica.
La cromatografia cu gaze proba este evaporată la intrarea în coloana
cromatografică fie direct la capătul acestei fie într-un dispozitiv special plasat tot la
intrarea în coloană. Separarea de-a lungul coloanei (eluţia) are loc cu ajutorul unui gaz
purtător care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacţionează cu faza
mobilă , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din
amestec prin coloană. Începuturile Cromatografiei de gaze sînt legate de coloane cu
umplutură în care se transfera amestecul de substanţe gazoase după ce în prealabil
erau evaporate spontan într-un injector încălzit. La ora actuală este folosită în
exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fără umplutură cu cele
dou[ tipuri :
- cromatografia de gaze pe faze staţionare solide (cromatografie de absorbţie)
- cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide (cromatografie de repartiţie)
La cromatografia de gaze pe faze staţionare solide retenţia speciilor de
analizat din amestec este realizată pe bază de absorbţie fizică pe peretele interior al
coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii şi lungimi
apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbţii ireversibile, care duc
la rîndul lor reproductibilităţi slabe, această tehnică este folosită rar şi numai la
substanţe cu puţine molecule în structură.
Cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide se bazează pe repartiţia
substanţei de analizat între faza mobilă gazoasă şi o faza lichidă imobilizată pe
peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este
folosită la ora actuală la scara cea mai larga. Relaţiile matematice care o descriu sînt
valabile cu mici modificări şi la cromatografia de lichide, aceste modificări sînt dictate
de faptul că gazele sînt compresibile şi ca atare proprietăţile şi comportarea reologică
sînt influenţate de presiune şi de temperatură. Din acest motiv la cromatografia de
gaze este folosit în locul timpului de retenţie tr volumul de retenţie Vr care ţine cont de
debitul mediu Q al fazei mobile exprimată în ml/min, debit ce depinde de presiune şi
de temperatură :

Vr= tr . Q

Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influenţă mare
asupra lăţirii de bandă ( vezi şi cap. – Cromatografia de lichide) influenţa difuziei
longitudinale fiind importantă dtorită coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine
de mărime la gaze faţă de cel al lichidelor.

II.2.1. Aparate folosite în gazcromatografia de gaze

4
Un gazcromatograf respectă schema bloc din figura avînd particularităţi specifice
pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arată ca în figura II.2.

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purtător, 2-reductor de

presiune, 3 - manometru de înaltă presiune, 3- manometru de joasă presiune, 5- regulator
de presiune şi debit, 6- seringă de injecţie pentru substanţe de analizat în stare iniţială
lichidă, 7-dispozitiv de evaporare rapidă , 8-cuptor termostatat de încălzire, 9- coloană
cromatografică tubulară, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de
achiziţie prelucrare şi afişare date, 13 – calculator, 14- imprimantă

II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purtător

Gazul purtător trebuie să fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de
vedere intră în discuţie gazele inerte, hidrogenul, azotul şi bioxidul de carbon. Natura
gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rîndul lui de
mai mulţi factori dar în principal de clasa de substanţe analizate. Gazele purtătoare de
înaltă puritate sînt preluate de regulă din butelii speciale de înaltă presiune prevăzute cu
reductoare de presiune ce asigură presiuni de intrare cuprinse între 1,5 şi 3 ata, dar pot
fi produse şi pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purtător
se găseşte un debitmetru electronic precum şi o sită moleculară pentru reţinerea
vaporilor de apă şi a eventualelor impurităţi solide de dimensiuni mici.

II.2.1.2. Sistemul de injecţie

Caracteristicile sistemului de injecţie asigură în mare parte calitatea analizelor

cromatografice, fiind responsabile de lăţirea de bandă a peak-urilor. Un sistem

5
 Fig.II.3. Fazele de injecţie ale amestecului lichid de analizat

performant de injecţie trebuie să asigure injecţia în timp scurt a unor cantităţi extrem de
mici de subsatanţă de analizat numai aşa sînt asigurate peak-uri înguste la bază.
Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticlă aşezat pe suportul
mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale acţionată automat.
Acul seringii perforează un dop de cauciuc siliconic sau şi absoarbe o cantitate bine
definită de probă, figura II.3. , după care se ridică automat , se deplasează şi injectează
proba printr-un “semptum” prevăzut cu un dop de cauciuc siliconic într-un dispozitiv de
evaporare rapidă situat la intrarea în coloană. Este foarte important ca evaporarea să
se producă practic instantaneu astfel încît amestecul fazei purtătoare cu substanţa de
analizat să se producă chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe
analizate pentru coloane analitice normale variază de la cîţiva μl la cca 30 μl, la
coloane capilare volumul probei este mult mai mic de cîtiva nl fiind necesară folosirea
unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigură
preluarea pentru analiză numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat în mediu.
Aceste sisteme de splitare sînt în principiu divizări de debit cu tuburi de tip “T”,
existente atît pe traseul gazului purtător cît şi pe cel al amestecului gazos, pe ale cărori
ramuri se crează rezistenţe hidraulice bine controlate astfel încît să poată fi purjată cea
mai mare parte din substanţa de analizat, pe coloană ajungînd numai o parte infimă de
amestec şi gaz purtător aşa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantităţi

6
 Fig. II.4. Două procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze
a. tub de evaporare cu dop de vata de sticlă sau de cuarţ , 4 corpul
dispozitivului de injecţie , 5- ventil cu 3 căi, 6- ventil cu ace cu debit
reglabil

mici de probă, aşa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manuală duce la erori
importante motiv pentru care pentru dozare şi injecţie sînt recomandate dispozitive de tip
autosampler.

II.2.1.3. Coloane cromatografice

Termenul de coloană cromatografică este oarecum impropriu pentru
cromatografia de gaze, el provine incă din timpul în care se foloseau coloane cu
umplutură de lungimi rezonabile care încăpeau în gazcromatograf sau care erau
montate în poziţie verticală lîngă aparat avînd o termostatare concentrică. Diametrul
interior al coloanelor cu umplutură pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm
sau la aşa numitele coloane “micro” <1mm. Acest tip de coloane este astăzi extrem de
rar folosit din cauza faptului că au o capacitate de separare redusă şi o rezoluţie slabă.
Astăzi sînt folosite cu precădere coloane capilare care se prezintă sub forma unor
tuburi metalice de cupru , oţel inoxidabil sau din sticlă cele din urmă fiind trase într-un
film de poliamidă sau de aluminiu pentru a le mări rezistenţa mecanică la incovoiere.
“Coloanele capilare ” sînt goale, au diametre interioare submilimetrice şi lungimi de zeci
de metrii putînd depăşi şi o sută de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare
şi rezoluţie mare în schimb din cauza cantităţilor extrem de mici de substanţă analizată
au au o limită de detecţie scăzută şi un timp de analiză mai ridicat. Din cauza
volumului extrem de mic necesar într-o coloană capilară , de ordinul μl, ale amestecului
gazos de analizat înainte de intrarea în coloana cromatografică se foloseşte “splitarea”

7
(divizarea) probei ,prin această operaţie numai o mică parte a acesteia, la limita dozării
volumice, este admisă în colană cealaltă parte fiind purjată în atmosferă. Această
cantitate emică de substanţă analizată este motivul limitei de detecţie mai scăzute. Atît
coloanele cu umplutură cît şi cele capilare pot funcţiona în regim de cromatografie de
absorbţie (gaz- solid) sau în regim de cromatografie de repartiţie (gaz - lichid).
La folosirea coloanelor cu umplutură pentru cromatografia de absorbţie umplutura
este formată dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiţie
umplutura este formată dintr-un material poros figura II.5, a cărui suprafaţă este
impregnată cu o fază lichidă staţionară.

Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate în gazcromatografie. a- coloane cu umplutură pentru

cromatografia de absorbţie, 1-perete coloană, 2-umplutură poroasă . b-coloane cu
umplutură pentru cromatografia de repartiţie, 1-perete coloană, 2- umplutura, 3-fază
staţionară lichidă depusă pe umplutură, 3-umplutură. c-coloană capilară cu film lichid
subţire, 1-perete coloană, 2-film lichid , d-coloană capilară cu strat subţire impregnat
cu lichid, 1-perete coloană, 2- film lichid, 3-strat granular subţire.

La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film şi capilare cu strat.

La coloanele capilare cu film, figura, faza staţionară aderă sub forma unui film subţire
de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura,
faza stationară este aplicată sub forma unui strat subţire de diatomee impregnat cu faza
lichidă staţionară. În cadrul cromatografiei de gaze sînt valabile tot relaţiile stabilite la
ceromatografia de lichide cu condiţia ca influenţa temperaturii şi a presiunii să fie
redusă la maxim. În acest scop procesul de sparare în coloană trebuie să fie izoterm
iar trecerea amestecului în fază gazoasă cît mai rapid posibil.
Pentru alegerea corectă a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie să se
ţină cont de următoarele:
- proprietăţile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiză, absorbţie
reziduală) sînt proporţionale cu lungimea crescînd deci cu creşterea acesteia
- singura proprietate pozitivă a coloanei şi anume capacitatea ei de separare
creşte abia cu pătratul lungimii coloanei, acesta fiind şi motivul folosirii unor
coloane de lungime medie de 20 -30 m în locul unor lungimi ce pot depăşi 100
m. Afară de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiză şi absorbţia
reziduală deoarece ea este proporţională cu lungimea drumului parcurs de faza
mobilă în mediul absorbant

8
 - Atunci cînd se solicită o separare avansată se vor folosi coloane de lungime
mare cu recomandarea ca drept gaz purtător să se folosească hidrogenul
deoarece se reduc sensibil timpii de analiză. Trebuie avut în vedere că aici creşte
timpul de analiză
- Reducerea timpului analiză prin mărirea presiunii iniţiale a gazului purtător
duce la reducerea capacităţii de separare a coloanei capilare

II.2.1.4. Cuptoare de termostatare

Temperatura coloanei este un parametru esenţial pentru gazcromatografie deoarece
ea provoacă practic gradientul de presiune ce transportă gazul prin coloană. Creşterea
Temperaturii duce la creşterea exponenţială a presiunii amestecului gazos care la
rîndul ei duce la creşterea vitezei de migrare reducînd sensibil timpul de retenţie. În
general se consideră că o creştere atemperaturii cu cca 300C duce la reducerea la
jumătate a timpului de retenţie. În realitate nu interesează viteza absolută de migrare ci
viteza relativă de migrare vr ca fiind raportul dintre viteza medie vma liniară a substanţei
analizate raportată la viteza medie vmp a gazului purtător:

v ma
vr 
v mp
valoarea vitezei relative de migrare se situează între 0 şi 1, ceea ce înseamnă că la
valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mică, iar la valoarea 1
nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traversează coloana cu
aceeşi viteză cu gazul purtător nefiind reţinuţi diferenţiat în timp diferiţii componenţi.
Care valoare intermediară între zero şi 1 este optimă depinde în mare parte de
dificultatea separării. Temperatura optimă a coloanei depinde de temperatura de
fierbere şi de gradul de separare. Pentru amestecuri a căror temperatură de evaporare
se situează într-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ
bună că o temperatură egală sau ceva mai mare decît temperatura medie de
evaporare a probei duce la un timp de eluţie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce
reprezintă valori acceptabile. Dacă se foloseşte acest raţionament se apelează la
regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constantă). In cadrul lucrului în regim
izoterm valoarea temperaturii trebuie menţinută constant în limitele ±0,1 0C motiv pentru
care coloana se găseşte într-un cuptor termostatat . În cazul unor probe cu un interval
mare de fierbere este de dorit să fie folosit un program de temperatură în cadrul
căruia temperatura este crescută fie în mod continuu fie în trepte . La injecţie proba se
găseşte la temperatura cea mai scăzută optimă pentru componentele volatile dar
necorespunzătoare pentru componentele cu temperatură de vaporizare mare. În timpul
analizei temperatura este crescută progresiv pînă cînd se obţine în final temperatura
corespunzătoare componentelor volatile. În cadrul programelor de temperatură nu
trebuie depăşită însă temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative
de migrare vr

II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie

9
II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor

La ieşirea din coloana gascromatografice există condiţii optime de măsurare pentru

multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rînd substanţe gazoase pure cu o diluţie
ideală realizată cu un gaz inert. Pentru identificări calitative este indicată folosirea de
spectrometre la ieşirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combinaţii sînt:
gazcromatograf- spectrometru de masă ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru în
infraroşu cu transformată Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativă a probelor
( probe a căror compoziţie calitativă este deja cunoscută) s-au impus cîteva detectoare
utilizate la ora actuală la scară mare acestea se clasifică după principiul lor fizic în:

- Detectoare sensibile la variaţie de concentraţie

- Detectoare sensibile la variaţie de debit masic

La detectoarele sensibile la variaţie de concentraţie semnalul electric al

detectorului este proporţional cu concentraţia momentană a substanţei (i) din volumul
din imediata vecinătate a detectorului. La un detector sensibil la variaţie de debit masic
semnalul electric al detectorului este proporţional cu debitul masic (Mi), adică cu masa
de substanţă ce trece în unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile
la variaţia de concentraţie sînt influenţate de debitul de gaz purtător motiv pentru care
debitul de gaz purtător trebuie reglat automat în vederea menţinerii constante a valorii
lui. Influenţa debitului de gaz purtător nu se manifestă la detectoarele sensibile la
variaţie de debit masic.

Sensibilitatea S a detectorului reprezintă nivelul de conversie a mărimii

fizice neelectrice într-o mărime electrică proporţională. La detectoarele sensibile la

Fig.II.6. Componente dăunătoare ale semnalului electric al detectoarelor

variaţie de concentraţie sensibilitatea detectorului este dată de raportul dintre

semnalul electric Ei şi concentraţia substanţei i din gazul purtător, iar la detectoare
sensibile la variaţie de debit masic sensibilitatea este dată de raportul dintre
semnalul electric Ei şi debitul masic Mi - masă în unitate de timp). Prin înregistrarea
semnalului electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric I-
mA) în funcţie de timp se obţine cromatograma. Semnalul electric al unui detector
conține pe lîngă semnal electric util şi componente dăunătoare sau parazite
precum: abateri, zgomot de fond , drift (plajă de variaţie) , figura II.6., care pot

10
 duce la erori importante de măsurare. Abaterile periodice îşi au originea în reglările
periodice automate ale temperaturii şi debitului gazului pe cînd oscilaţii neperiodice
trebuie puse mai ales pe seama coloanelor de separare incălzite incomplet sau
murdare. Zgomotul de fond are frecvenţă ridicată este specific fiecărui detector şi
electronicii sale aferente şi se manifestă mai ales atunci cînd amplificarea
electronică a semnalului este mare. Componentele parazite din semnalul electric se
determină în felul următor: din semnalul înregistrat al detectorului în funcţie de timp
se alege întimplîtor un interval de 15 minute si se trasează pe ambele părţi ale
liniei de bază a semnalului două linii paralele în aşa fel încît aceste linii să atingă
tangenţial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari.
Drift-ul , figura , este definit ca fiind înclinaţia celor două linii paralele faţă de
abscisă. Abaterile sînt definite ca distanţa între cele două linii. Pentru stabilirea
mărimii zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezină cel mai
mare zgomot. Nivelul zgomotului de fond se determină prin mărimea distanţei între
cele două linii paralele ce unesc vîrfurile semnalului de zgomot.

Limita de detectare Ld reprezintă concentraţia [mg/l] sau debitul masic [g/s] a

substanţelor analizate de valoarea cea mai mică care sînt detectabile cu un senzor
cromatografic adecvat: Pentru descrierea capacităţii unui senzor folosit în
cromatografie se foloseşte exclusiv limita de detectabilitate şi nu sensibilitatea lui. Limita
de detectabilitate se determină din raportul dintre nivelul p a tuturor semnalelor
parazite praportat la sensibilitate S:

Ld =p/S

Numai atunci cînd diferenţa E între valoarea mărimii măsurate şi valoarea medie a
unei analize oarbe este de trei ori mai mare decît abaterea standard (s) a tuturor
semnalelor parazite p se poate susţine cu o siguranţă de 99% că că un punct de
măsurare oarecare P de pe cromatogramă reprezintă un punct a semnalului util şi
nu a componentelor parazite ale semnalului. La acest raţionament se iau în calcul
numai abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumătatea
semnalului de eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este
modificat în practica cromatografică în sensul că se iau în considerare atît
abaterile pozitive cît şi cele negative , măsurătorea făcîndu-se ” vîrf – vîrf”. Din
aceste măsurători ar rezulta prin împărţire un factor f , (f = 1,5 (în loc de 3) pentru
distanţa punctului de măsurare P de la valoarea mediană a semnalului de
abatere . de regulă pentru calculul limitei de detectabilitate Ld se fololoseşte un
factor f =1,2 – 2:

Ld = (1,5...2) semnal de abatere /Si

Ld = (5...10) semnal de abatere /Si

În conformitate cu alte standarde sînt folosite şi alte valori pentru factorul f, de ex

IUPAC recomandă f = 3.
Limita de determinare reală Ldet reclamă valori mai mari pentru (f) decît în
cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie să fie cuprinsă între 5-10
corespunzător cu siguranţa statistică cerută pentru rezultatul măsurătorilor.

11
 Constanta de timp (τ) , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a
electronicii aferente, reprezintă timpul care trece din momentul iniţierii măsurătorii
pînă în momentul în care este indicat 63,2% a întregului semnal. După (5τ) se obţin
99,3 % a întregului semnal

Fig.II.7. Influenţa consatantei de timp  asupra timpul de răspuns t

Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilităţile diferite pentru două

materiale diferite i şi j. Selectivitatea Si,j este indicată ca fiind raportul sensibilităţii
detectorului pentru cele două substanţe:

Sij= Si/Sj

Dacă sensibilitatea pentru substanţa j se apropie de valoarea unu detectorul este

specific pentru substanţa i, (Si = ∞)
Domeniul liniar al unui detector, figuraII.8, reprezintă domeniul unde
sensibilitatea Si este constantă . În partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita

Fig.II.8. Domeniul liniar (a) şi domeniul dinamic (b) al unui detector folosit în cromatografie

de detectabilitate Ld. În partea de sus prin o abatere tolerată de 5% de la dreapta ideală

de liniaritate. Pentru exemplificare grafică a domeniului liniar se reprezintă în
coordonate dublu logaritmice suprafaţa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului

12
 Ei în funcţie de cantitatea m i a probei, concentraţia Ci , respectiv faţă de debitul
masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosită se reprezintă
sensibilitatea Si în funcţie de cantitatea de probă folosită mi, în funcţie de
concentraţia Ci sau în funcţie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul
liniar se exprimă prin raportul dintre limita superioară a domeniului liniar şi limita de
detectabilitate, este obligatorie şi indicarea naturii substanţei analizate i. Domeniul
dinamic al detectorului este plasat în continuarea domeniului liniar şi reprezintă
domeniul în care o modificare a concentraţiei sau a debitului masic mai provoacă
o modificare sensibilă şi posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.

II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flacără ( FID)

Detectorul de ionizare cu flacără, figura II.9, este un detector folosit pentru

substanţe organice ( hidraţi de carbon) ce are aplicaţia de bază la cromatografele
de gaze deoarece îmbină o sensibilitate ridicată cu robusteţea. Un detector de
ionizare cu flacără este de cca 1000 ori mai sensibil decît un detector de
conductivitate termică. Alte domenii de aplicare ale acestui detector sînt la
supravegherea apelor privind prezenţa de hidrocarburi volatile precum şi la
supravegherea poluării atmosferei şi a aerului din spaţii interioare cu hidrocarburi
gazoase. Principiul detectorului se bazează pe măsurarea conductivităţii electrice
unei flăcări de hidrogen plasată între doi electrozi. Substanţele de analizat sînt
transportate în flacără cu un gaz purtător unde sînt ionizate termic datorită
aportului de căldură din flacără. În felul acesta în cîmpul electric dintre cei doi
electrozi apare un curent ionic măsurabil care este înregistrat în funcţie de timp
de către înregistrator sub formă unor vîrfuri (Peak-uri) cu aplicaţii în analiza chimică
calitativă. Intensitatea semnalului electric al detectorului (înălţimea maximă al Peak-
ului) este liniară şi proporţională cu conţinutul de hidrocarbură într-un domeniu
foarte larg de concentraţie , cu aplicaţii în analiză cantitativă. Din acest motiv
concentraţia unei hidrocarburi poate fi determinată direct din semnal fără a se folosi
curbe de etalonare. Unele substanţe organice ( de ex. acidul formic,
acetaldehida) au detectabilitate slabă . Alte substanţe precum: gazele nobile, H 2 ,
N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legături de halogen ,
halogenuri de siliciu

Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-arezător, 2-flacără de

hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 – amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare şi afişare

13
 Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea
concomitentă a compoziţiei calitative şi cantitative moleculare precum şi a celei
calitative şi cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. În acest scop este
folosit un gazcromatograf echipat cu detector FID dispozitivat cu o structură
spectrometrică modulară formată dintr-o sondă, compusă la rîndul ei dintr-o lentilă
colimatoare, o fibră optică, un spectrometru miniatural compact echipat cu reţea de
difracţie fixă , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informaţii spectrale de emisie
atomică precum şi un sistem de procesare, afişare şi tipărire spectre. Sonda se
montează perpendicular pe direcţia de ardere a flăcării de hidrogen şi valorifică emisia
spectrală a atomilor elementelor chimice excitate în flacăra de hidrogen la cca 3.000
0
C. Informaţia spectrală ajunge prin lentila colimatoare şi fibra optică pe reţeaua de
difracţie a unui spectrometru miniatural, iar după difracţie, pe un detector Diode-Array
care împreună cu microprocesorul spectrometrului furnizează spectrograma de
emisie atomică a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in
amestecul de gaze analizat.

Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3-

sistem de adaptare pentru sonda optică, 4-flacără de hidrogen, 5-lentilă colimatoare din
sticlă de cuarţ, 6- fibră optică de transmisie, 7-spectrometru cu reţea de difracţie şi
detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afişare şi tipărire spectre

II.2.1.5.3. Detectorul pentru compuşi de azot şi fosfor (NPD)

Detectorul pentru azot şi fosfor este un detector modificat de tip FID care conţine o
sursă alcalină de silicat sub forma unei perle din sticlă sau ceramică dopată cu
elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce eliberează uşor electroni. Perla alcalină este
fixată pe o sîrmă de platină între flacăra de hidrogen şi electrozii colectori de electroni
ai detectorului, figura fiind încălzită atît pe cale electrică prin sîrma de platină pusă sub
tensiune cît şi prin flacăra de hidrogen, în jurul ei formîndu-se un nor termic plasmatic
care prin norul de electroni emişi are totdeauna sarcina negativă faţă de sarcina
pozitivă a electrozilor colectori .

14
Detectorul NPD poate fi folosit în două moduri:
- ca detector de fosfor (P)
- ca detector de azot (NP)
în cazul utilizării lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacăra de hidrogen arde ca la
detectorul FID deasupra arzătorului cu deosebirea că arzătorul este legat la pămînt,
figura, deoarece electronii rezultaţi din arderea unor componente ce conţin atomi de
carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , sînt respinşi în
acest caz de potenţialul negativ al perlei scurgîndu-se la masă, în schimb electronii
ce iau naştere pe suprafaţa perlei alcaline , al căror număr este proporţional cu
concentraţia de fosfor, ajung nestingheriţi la electrozii colectori formînd semnalul
electric al detectorului. În ce priveşte mecanismul propriuzis de reacţie trebuie arătat că
la început se formează în flacără oxizi de fosfor cu un număr impar de electroni , prin
fixarea a electronului impar se formează în prima fază anionii diferiţilor acizi fosforici
care în flacără sînt oxidaţi în flacără cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,

a) b)

Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot şi fosfor (N-P). 1-
arzător, 2- flacără de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perlă alcalină, 6-
plasmă, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare şi afişare

ocazie cu care electronul fixat este eliberat şi se constituie în semnalul electric al

detectorului. La folosirea detectorului pentru compuşi de azot mecanismul este
asemănător ca la fosfor deoarece şi şi azotul are un număr impar de electroni care
duce la formarea de oxizi numai că aceştia se descompun prea repede şi nu
reacţionează cu perla alcalină . Dacă în schimb se scade regimul termic de încălzire al
perlei se formează radicali cian care dau reacţie alcalină specifică . Pentru a reduce
regimul termic se micşorează debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 μl/min şi cel de
aer la cca 100 μl/min, condiţii în care flacăra de hidrogen se stinge iar aportul slab de
hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui în
jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian formaţi prin piroliză
termică fixează un electron iar anionii CN - formaţi reacţionează cu hidrogenul
o
respectiv cu radicali OH cu formare de compuşi neutrii de tip CO2, H2O, N2 cu
eliberarea unui electron ce se constituie , aşa cum s-a mai arătat, în semnalul
detectorului .
Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putînd fi folosit în principiu
pentru toate elementele care au un număr impar de electroni , inclusiv pentru compuşi
volatili de bor şi arsen , utilizarea lui de bază este totuşi cea pentru compuşi fosfor şi
azot în regimul de lucru N-P, figura II.11 b. În regimul de lucru numai pentru fosfor

15
(regimul P) detectorul este selectiv pentru compuşi de fosfor dar are sensibilitatea mai
redusă ca în regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru
de tip N) nu este posibil fiind indicate alături de compuşi de azot totdeauna şi compuşi
de fosfor , bineînţeles dacă aceştia sînt prezenţi în amestecul de subsatanţe analizate

II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termică

Detectorul de conductivitate termică este unul din cele mai vechi detectoare
folosite în cromatografie. El se bazează pe măsurarea continuă a conductivităţii termice
a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purtător şi amestecul gazos de analizat,
figura. Conductivitatea termică este o mărime fizică specifică naturii şi concentraţiei
substanţelor. Amestecuri de gaze de compoziţii şi concentraţii diferite ce scaldă cei patru
rezistori încălziţi ai punţii Wheatstone modifică proporţional cu natura şi cu
concentraţiilor substanţelor rezistenţa acestor rezistori ducînd la apariţia unei tensiuni
de dezechilibru a punţii.

Fig.II.12. Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punţii

Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achiziţie , prelucrare şi
afişare, R1,R2, R3, R4 - rezistori din platină încălziţi electric

Detectorul de conductivitate termică , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat în care se găsesc patru celule de gaz identice prevăzute
cu filamente de platină sau de wolfram , sub formă de sîrmă, legate electric într-o
punte de tip Wheatstone. În detector se realizează o măsurare comparativă de
compensaţie. În acest scop prin două celule, situate pe două laturi opuse ale
braţelor punţii, trece gazul purtător pur, iar prin celelalte două braţe ale punţii trece
gazul purtător în amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele sînt
parcurse de un curent electric care provoacă încălzirea acestora prin efect Joule-
Lenz. Temperatura sîrmelor şi prin aceasta şi rezistenţa lor electrică depinde de
conductivitatea termică a gazelor ce trec prin celule. Modificări ale compoziţiei
gazelor provoacă prin conductivităţile lor termice specifice modificări
corespunzătoare de temperatură şi prin această modificări ale rezistenţei electrice
a filamentelor de sîrmă. Diferenţele de temperatură a filamentelor în celulele de
măsurare şi în celulele de referinţă duc la un dezechilibru electric măsurabil al punţii
Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporţional cu

16
 natura substanţei care traversează la acel moment două braţe opuse ale punţii , iar
valoarea dezechilibrului este proporţională cu concentraţia acelei substanţe din
amestecul de gaze. Detectorul de conductivitate termică este un detector universal,
utilizabil la aproape toate substanţele, singurele îngrădiri sînt la substanţe puternic
corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de scăzută.

II.2.1.5.5. Detectorul cu capcană de electroni (ECD)

Detectorul cu capcană de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este

un detector specific pentru gazcromatografie folosit în analiza substanţelor sulfuroase,
substanţelor cu azot şi a substanţelor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplicaţiile de
bază sînt în analiza urmelor şi în chimia mediului. Detectorul este format dintr-o cameră
de ionizare ce conţine un catod şi un anod şi un flux continuu de gaz. Pentru ionizare
sînt folosite radiaţii (ß) emise de o sursă radioactivă sub forma unei folii foarte subţiri al
izotopului Ni63, sursa de radiaţii constituie totodată şi catodul, figura II.13.
Descompunerea radiaţiei (ß) duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu
moleculele (N2) ale gazului purtător şi ca urmare iau naştere ioni N2 încărcaţi pozitiv şi
electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni între cei doi electrozi apare un
cîmp electric prin care electronii secundari liberi se deplasează spre anod unde produc
un curent electric de cîţiva nanoamperi numit curent de ionizare de bază. Dacă în
amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare faţă de electroni atunci această
substanţă colectează o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micşorarea
curentului de ionizare de bază. Această micşorare afectează proporţional curentul de
bază şi reprezintă semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcană de electroni
reacţionează la substanţe cu afinitate de electroni cum sînt de exemplu substanţe
halogenate precum şi anumite pesticide. Sistemul clasic cu măsurarea curentului de
ionizare de bază, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv
pentru care în aparate moderne se foloseşte alt sistem de lucru. Astfel se aplică un
impuls de tensiune cu frecvenţă variabilă . În momentul în care există semnalul de
tensiune (0,5 pînă la 1μs), electronii care nu au reacţionat cu substanţele amestecului
de gaze din gazul purtător sînt colectaţi de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric
se aleg aşa de scurţi pentru ca ionii grei, rezultaţi ca urmare a absorbţiei de electroni,
să nu poată ajunge la anod. Frecvenţa semnalelor electrice aplicate nu este constantă ci
modificată continuu în sensul asigurării unei intensităţi de curent constante. Dacă în
detector intră prin amestecul de gaze un număr mare de molecule electrofile pentru
compensarea scăderii sub limită a curentului (ca urmare a scăderii numărului de
electroni) se măreşte frecvenţa curentului. La acest mod de lucru semnalul util al
detectorului nu-l mai reprezintă micşorarea curentului de ionizare de bază ci modificarea
frecvenţei tensiunii aplicate în scopul menţinerii constante a intensităţii curentului ,
frecvenţa semnalului fiind proporţională cu concentraţia moleculelor captoare de
electroni. Prin timpul de pauză între semnale se asigură în limite largi un număr de
electroni liberi constant , ceea ce însemnă că şi la concentraţii mari ale substanţei de
analizat sînt suficienţi electroni la dispoziţie pentru ionizare. Numărul de electoni se
adaptează concentraţiei substanţei de analizat prin acesta extinzîndu-se sensibil şi
domeniul liniar.

17
 Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1
Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni 63, 3- amplificator electronic, 4-
sistem electronic de prelucrare şi afişare

Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativă pentru diferite clase de compuşi organici

Gruparea chimică Sensibilitatea relativă

Hidrocarburi 1
eteri, esteri 10
Alcoli alifatici, cetone, amine 100
Legături mono-Cl- şi mono-F-, mono-Br-, legături di-Cl şi di-F 1000
Aldehide şi legături tri-Cl 104
Legături mono-J-, di-Br- şi legături nitro 105
Legături di-J-, tri-Br-, legături poly-Cl şi poly-F 106

Valorile din tabel 1 sînt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizării.
Sensibilitatea variază destul de mult chiar în cadrul aceleiaşi grupări chimice deoarece
ea depinde de structura legăturilor .

II.2.1.5.6. Detectorul de emisie atomica

Detectorul de emisie atomică (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14,

reprezintă o realizare relativ recentă fiind legat în principal de evoluţia detectorului de
tip Diode- Array. Eluatul ce părăseşte colana cromatografică este introdus într-o
plasmă termică de heliu generată într-un cuptor cu microunde . Energia înaltă a
plasmei atomizează toate elementele din probă provocînd emisie atomică specifică a
acestora . Prin decompunerea radiaţiei rezultate cu o reţea de difracţie rezultă
spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode – Array. Marele avantaj
al acestui tip de detector este analiza multiplă fiind posibilă detectarea mai multor
elemente în acelaşi timp. Profitînd de prezenţa unei plasme de înaltă energie deja

18
existentă la spectrometrele clasice cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS), la ora actuală
se realizează combinaţii deosebit de performante între cromatografe HPLC şi
spectrometrele cu plasmă cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) şi gazcromatografe şi
spectrometre cu plasmă cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combinaţii sînt
avantajoase ca preţ de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiază de o plasmă
termică deosebit de performantă generată de un alt aparat , respectic un spectroscop
cu plasmă cuplată inductiv (ICP) prezent poate chiar în acelaşi laborator.

Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomică. 1-cameră cu plasmă

termică dată de microunde, 2- plasmă termică, 3-oglindă plană de reflexie, 4-
retea de difracţie, 5-detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem
electronic de achiziţie , prelucrare şi afişare

II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare

Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, în cromatografia de gaze se

datorează atît selectivităţii cît şi sensibilităţii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor

Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-cameră de ionizare cu radiaţii

ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lampă de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare şi afişare

19
aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizeză
ionizarea cu radiaţii ultraviolete a compuşilor ce părăsesc coloana cromatografică
după următorul model:

R  hν  R   e 

Doi electrozi colectează electronii rezultaţi ca urmare a ionizării, electroni ce formează

de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este proporţional cu
gradul de ionizare , iar acesta la rîndul lui este proporţional cu concentraţia specieiei
anlizate ce se găseşte în acel moment în camera de ionizare.

II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA

(HPLC)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

În cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, în functie de

mecanismele de separare, astfel există :

- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;

- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;

In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchisă sînt cunoscute metodele:

1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu
molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina,
folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara
solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni -
substante cu o retea solida afânata, de natura organica sau anorganica. Cele
mai raspândite sunt rasinile schimbatoare de ioni.
3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare
poroase dar cu porozitatea selectionata astfel încât sa corespunda
dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin
pori, iar altele sunt excluse deplasându-se practic neretinute odata cu faza
mobila. Tehnica se mai întâlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau
permeatie prin geluri în functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile.
4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), în care faza stationara este o faza lichida,
nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, într-o coloana. Aici
suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este
cea mai raspândita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide.
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula
printr-un material poros dispus într-un plan si formând un strat relativ subtire, dar

20
de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana
închisă. Se disting metodele :
1. Cromatogafia pe hârtie, tehnica în care faza stationara este o hârtie poroasa
din celuloza (initial o hârtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte
capilare.
2. Cromatografia pe strat subtire (TLC), în care faza stationara pulverulenta
este fixată de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant,
formând un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate.
3. Cromatografia pe strat subtire de înalta performanta (HPTLC), în care faza
stationara are granulatie extrem de fina ridicându-se astfel eficienta
separarilor dar si viteza acestora.

Cromatografia HPLC

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă ( engl. HPLC - High

Performance Liquid Chromatography ) cunoscută în literatură şi sub denumirea
de cromatografie de înaltă presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografică cea performantă şi este folosită în separarea şi
identificarea calitativă şi cantitativă a substanţelor din amestecuri lichide.
Separări şi analize de substanţe imposibul de realizat prin alte metode pot fi
realizate uşor prin HPLC. Pe de altă parte la această tehnică pot fi făcute şi
multe greşeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experienţă
practică bogată dar şi de cunostiinţe stiinţifice fundamentale. Avînd în vedere că
atît în cromatografia de gaze (GC) cît şi in cromatografia de lichide HPLC starea
de agregare iniţială a probelor este cea lichidă trebuie luată decizia asupra
metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute
în vedere următoarele:
- la cromatografia de gaze proba trebuie adusă în stare gazoasă prin
încălzire fără ca această operaţie să ducă la distrugere integrităţii
moleculare a speciei anlizate , in practică numai cca 20 % din speciile
moleculare îndeplinesc această condiţie [LINDSAY
- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare şi au limite
de detecţie mai bune decît la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografică necorespunzătoare în gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie făcută in cromatografie lichidă
- în cromatografia de gaze există numai o singură fază staţionară care
poate interacţiona cu moleculele probei , faza solidă sau faza lichidă, cu
aceasta fază poate absorbi proba gazoasă în orice raport
- în HPLC atît faza staţionară cît şi cea mobilă pot interacţiona mai selectiv cu
proba . Multitudinea acestor interacţiuni selective face cromatografia HPLC
multilaterală faţă de cromatografia de gaze cu ea putînt fi rezolvate
probleme de separare avansată deosebit de complexe.
- În situaţiile în care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru
gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare şi sînt mai
rapide, iar dacă este vorba de determinări curente la anumite clase de

21
 compuşi trebuie avut in vdere că un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
decît un cromatograf pentru HPLC.
La cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare denumită "Eluent"
împreună cu substanţele lichide de analizat este pompată cu ajutorul unei
pompe printr-o coloană cromatografică de separare ce conţine faza staţionară.
În mod obişnuit înaintea coloanei de separare propriu zise se cuplează o pre -
coloană de separare pentru reţinerea impurităţilor, coloană care este sensibil
mai ieftină decît coloana de bază. O coloană de separare într-un cromatograf
HPLC are lungimea cuprinsă între 5 şi 30 cm iar debitul de fază mobilă este
cuprins între 1-5 ml/min.

La ora actuală există următoarele metode de cromatografie de lichide :

- cromatografie prin absorbţie
- cromatografie prin repartiţie
- cromatografie prin schimb ionic
- cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbătoare de ioni faza stationară este este o răşină

schimbătoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea
interacţiunilor intre ionii probei şi grupele schimbătoare de ioni din răşină . In
cromatografia de excludere ca fază staţionară este folosit un gel cu pori mari
care poate separa moleculele după mărime şi formă , la acest tip de
cromatografie moleculele mari traversează cel mai rapid sistemul cromatografic.
Cromatografia cu lichide supracritice

Dacă în timpul separarii cromatografice compoziţia substanţei de analizat

rămîne constantă tehnica de cromatografică este denumită eluţie izocratică.
Dacă compoziţia fazei analizate este schimbată în timpul procesului de
separare după o modalitate prestabilită, tehnica poartă denumirea de eluţie de
gradient .Cea din urmă tehnică este folosită atunci cînd domeniul timpilor de
retenţie a moleculelor din probă este atît de mare încît acetes nu pot fi eluate
într-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solvenţi.
Detectorii folosiţi în HPLC lînt detectori selectivi, ceea ce înseamnă că ei
nu răspund la toate moleculele existente înt-un amestec ci numai la anumite
molecule sau clase de compuşi. In cromatografia de lichide încă nu există un
detector universal şi de inaltă sensibilitate aşa cum este de exemplu detectorul
de ionizare cu flacără FID din cadrul cromatografiei de lichide, în schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoperă un număr mult mai mare de
substanţe decît cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe sînt
greu de detectat în HPLC şi trebuiesc aduse după părăsirea coloanei
cromatografice într-o formă detectabilă tehnică denumită derivatizare după
coloană. Ca şi la alte cromatografii în condiţii tehnice date pentru analiza
calitativă este definitoriu timpul necesar unei molecule din probă pentru a
traversa sistemul cromatografic şi a ajunge la detector, timp denumit timp de

22
retenţie. Dat fiind numărul extrem de mare de substanţe organice unele
substanţe au timpi de retenţie identici situaţie în care peak-urile se suprapun
putînd da naştere la erori importante de interpretare. Pentru înlăturarea acestui
neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC sînt spectrometrele. Tot
mai des ieşirile din coloanele cromatografice se cuplează la spectrometre
clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de masă (MS) situaţia clasică fiind
cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaţii de aparate au sisteme de
performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automată prin
compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare, în momentul
sosirii ei din coloana cromatografică la spectrometru, cu spectrele etalon din
bibliotecă electronică de spectre.

Aparatura folosită în cromatografia HPLC

Cromatografele de lichide de înaltă performanţă sînt formate dint-un sistem de

vase cu solvenţi (1) , o pompă de înaltă presiune (3), o coloană cromatografică
(6), unul sau mai mulţi detectori (8), şi un sistem de prelucrare a datelor (9), ele
mai sînt completate cu elemente de reglare automată a debitului , a presiunii şi a
temperaturii. In figura 1 este reprezentată schema de principiu a unui
cromatograf de lichide.

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil înaltă presiune, 3-
manometru înaltă presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joasă presiune, 6- sistem
distribuitor şi dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pompă cu sistem de gradient,
11-sistem de măsurare a presiunii şi a debitului, 12-sistem de introducere probă, 13- xxxx, 14-
coloană cromatografică,
7- incintă de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziţie şi prelucrare
date, 10-cromatogramă.

Trebuie avut în vedere că în HPLC se folosesc solvenţi organici puternici sau

soluâii tampon care pot ataca chimic orice componentă ce se găseşte în traseul
lor de la recipientele de stocare pină la detector , ca atare toate materialele
folosite pe acest traseu trebuie să prezinte o rezistenţă chimică corespunzătoare.
O altă recomandare este aceea ca volumul mort , denumit şi volum

23
extracolumnar, între introducerea probei şi traversarea detectorului să fie
menţinut cît mai mic posibil prin aceasta evitîndu-se o lăţire de bandă (vezi şi
cap). Reducerea volumului mort se realizează în primul rînd prin măsuri
constructive ale furnizorului de cromatograf şi prin de alegerea corespunzătoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rînd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC

Cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC) acopera azi, în proportie

aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si
anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa
moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, împreuna cu cromatografia de

Fig. II.16. Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern

gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Desi
eficacitatea coloanelor nu o egaleaza înca pe cea din GC, prin faptul ca se poate
modifica, pe lânga faza stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face
posibile separari si analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu
spectrometria de masa a transformat, în ultimul timp, aceasta metoda în principalul
mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii
pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si
biotehnologia moderna.
Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana
clasica, care servea în primul rând la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin

24
introducerea pompelor si în consecinta, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm),
dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent
constituite din granule de faze stationare sferice, cu diametre 2-5µm), în coloane tot mai
scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se
poate observa ca din recipientele continând unul sau mai multi solventi pompa (sau
pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un amestec de doi sau mai multi
solventi). În imediata vecinatate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul
unui ventil cu by pass. În coloana aflata într-o etuva termostat, are loc separarea
propriu-zisa. Efluentul coloanei intra într-un detector de unde componentul, daca este
separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni.
Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În
esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai
prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se
poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de
eluent – pompa.

Solvent → Pompa → Injector → Coloana → Detector → Înregistrator

Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 2.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de înalta performanta

(HPLC)

Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii în

cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o
coloana si care pot înregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum
decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar
semnalul lor.
Întrucât coloanele de separare performante au capacitati de încarcare mici,
sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca în LC volumul
de proba este de ordinul microlitrilor (8-10µl), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum
apropiat pentru a se putea sesiza în mod continuu picul cromatografic.
În calitate de instrumente se poate utiliza, în principiu, oricare dispozitiv de
analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de
instrumente fizice. De exemplu, în ultimul timp, combinatia dintre un detector
refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace în analiza
polimerilor în amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar
posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica în urma adaugarii, cu
un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate
practica chiar înainte de introducerea probei în coloana, dar si dupa iesirea din coloana
a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pâna în prezent în special legata de
metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza
unor amestecuri de compusi numerosi având aceleasi functiuni reactive (de exemplu
aminoacizi).
Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente
analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

25
II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici în UV-VIS

Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pâna în prezent, atât în LC,
cât si în HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie
colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe
de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-
Beer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita
de detectie sau zgomotul de fond se prezinta în cazul acestor detectori în AUFS
(prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la
întreaga scala, l. engl.). Astfel în cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de
0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele
substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au
grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina în UV-VIS. Este
vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor
hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH 2). Între
acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici
etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de
debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct proporţionala cu coeficientul
de extincţie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui
mărita lungimea celulei dar aceasta este restricţionata. Sensibilitatea este de ordinul
5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
Se pot distinge si în cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza
doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspândit se compune dintr-o sursa
luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un
domeniu îngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui
astfel de detector este prezentata în figura II.18.

Sursa → Monocromator → Celula → Înregistrator

Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric

2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizaţi în cromatografele HPLC moderne permit

si selectarea lungimii de unda la care se lucrează, dar chiar pot înregistra electronic
absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai
mare siguranţa analizei, în sensul ca permite stabilirea purităţii, adică daca picul
constituie un semnal dat de o singura substanţa sau de un amestec (ceea ce se
cunoaşte sub numele de stabilirea purităţii picului).
Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentată în figura II.19.
Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1µl-10µl care este
intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treacă prin
celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la
fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta măreşte intensitatea semnalului) si apoi la
sistemul de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor obţinute (8); rezultatul este o
cromatograma (9) ale cărui picuri va oferi informaţii calitativa si cantitative despre
substanţele din soluţia analizata.

26
 10
2 3
6

7
1

4
I
5
8

9 t

Fig. II.19. Principiul de funcţionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substanţa ce vine de la
coloana cromatografica,3- substanţa ce pleacă, 4- geam de cuarţ, 5- tub capilar prin
care circula substanţa de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8-
sistem de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva
detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici

Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.

Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de
transmitere a luminii prin medii transparente având un indicele de refractie dat. Astfel, un
fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente
unul continând doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura
II.20

3 8

1 M
5 6

9 7
6’
C
I

2 10
t

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2-

amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6 *-
fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem înregistrator, 10-

27
 cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcţie de
unghiul sub care cad razele

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6’ iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul primeşte un semnal de corecţie, in scopul egalizării tensiunilor, astfel are
loc compensarea modificării indicilor de refracţie. In urma deplasarii şurubului 8 ,
sistemul înregistrator 9 va înregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate în cele doua compartimente vor fi practic
nule, atâta timp cât din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita în momentul în care în
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. În
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
În cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lânga sensibilitatea
relativ coborâta (10-5mol·L-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat în cromatografia cu gradienti deoarece, în acest caz, compozitia
eluentului la intrarea în coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistând o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(±0.0001°C) fiind necesara termostatarea, atât a detectorului cât si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici

Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si

cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv
reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat
detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante
momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda
analiza si identificare a substantelor.
Exista doua tipuri de detectori electrochimici:
- Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti
- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la
substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici

Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde

substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere în
cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici
inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-
1ng). Detectorii conductometrici măsoară conductivitatea fazei mobile. Este constituit din
doi electrozi situaţi in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta
este măsurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata.
Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat în figura
II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati
din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula
conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica

28
conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub
forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A
doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce
la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in
cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de
ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu
5kH.

6
7
1 2

4
5 H 8
3

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta

frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat
ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica,
6- amplificator, 7- sistem de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor, 8- cromatograma
in coordonate conductivitate si timp

II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici

Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din

trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar
alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de
referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba
cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt
negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa.
Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul.
Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta
inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.

29
 i 10

3 4
7

1 t
6

2 5

Fig.II.22. Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele

ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4-
celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat, 6-
electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem
de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor,10- cromatograma in coordonate
intensitatea cinetica si timp

t
+i

E6 E5 E4 E3
0
E0 E1 E2 E(mv)

-i

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta

Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama
potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se
duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se
duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta

Detectorii de fluorescenta se bazează pe măsurarea intensităţii fluorescentei

pentru substanţele ce prezintă acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care
apare la unele substanţe când sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substanţe emit radiaţii
pe o lungime de unda mai mare decât a radiatei incidente. Daca emisia de radiaţii are

30
loc in acelaşi timp cu emisia de radiaţie ultravioleta incidenta fenomenul se numeşte
fluorescenta. Putini compuşi prezintă fluorescenta iar cei ce nu prezintă pot fi
transformaţi in derivaţi ai lor ce au aceasta proprietate.
Fluorescenta s-a arătat a fi foarte folositoare ca proces de detecţie iar cu detectorii
bazaţi pe fluorescenta s-au obţinut unele dintre cele mai înalte sensibilitati din
cromatografie de lichide. Tehnicile de detecţie bazate pe fluorescenta conferă o buna
sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci când se folosesc
instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina
de fluorescenta este măsurata pe un fundal întunecat( sau la zgomot de fond redus).
Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poată fi măsurata instrumental, raportul
dintre cantitatea de radiaţie remisa si cantitatea de radiaţie UV incidenta trebuie sa aibă
valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este
aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90º), figura
II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar
interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal
aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru).
Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce
monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi
foarte sensibil si relativ ieftin).

1
2 I 16
15
3

t
13
8
5

14
6
7 9 10 11 12

Fig.II.24. Principiul de funcţionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaţie, 2- fanta,

3- filtru, 4- lentila, 5- substanţa ce vine de la coloana. 6- substanţa de analizat, 7-
cuva cu pereţi de cuarţ, 8- unghi de 90 grade,9- substanţa ce iese din cuva, 10-
lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem
de preluare, prelucrare si afişare a datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcţionare: Radiaţia emisa de sursa (1) după trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90º pe radiaţia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii măsoară intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afişare a datelor(15). Datele obţinute sunt afişate
sub forma unei cromatograme (16).

II. 2.1.5.Detectoare Diode Array

31
 Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu
determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.
Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care
emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar
lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7).
Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda
acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este
preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare,
prelucrare si afişare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele
pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o
cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si
timpii lor de retentie (analiza calitativa).
Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10 -7 g/ml iar domeniu dinamic
liniar de 5x103.
Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25

2 3

1 6

4 5 I

10

7
t

8
9

Fig.II.25. Principiul de funcţionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaţii ultraviolete, 2-

substanţa ce vine de la coloana cromatografica,3- substanţa ce pleacă la tratament
chimic, 4- fereastră cuart, 5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat, 6-
reţea de difracţie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziţie si
afişare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de
unda)

II. 2.1.6. Alti detectori

In practica analitica se mai întâlnesc si alti detectori prezentati schematic în tabelul

2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria
de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin
alte variante de detectie în lipsa etaloanelor cunoscute.
Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre
cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate
substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti în proba.

Tab. II.2. Alti detectori utilizati în LC

32
Detectori LC Limita de Caracteristici Disponibilitateco
detectie merciala
Fluorimetrici 1-10pg Este necesara uneori derivatizarea Da
Sensibilitate 10-10M

Electrochimici 10pg = 1ng Sensibilitate 10-10M Da

(Amperometrici) Compusi oxidabili sau reductibili

Bazati pe 100pg - Necesare coloane capilare Da

Spectrometria 1ng Necesara pulverizarea
de Masa (MS) Pret de cost ridicat

FT-IR 1µg Pret de cost ridicat Da

Difuzia luminii 10µg Adecvati pentru macromolecule Da

Activitate optica 1ng Pentru substante optic active Nu
Electrozi ion 10ng Doar pentru ioni sau compusi Nu
selectivi ionizabili

Fotoionizare 1pg- 1ng - Nu

II. 2.2. Electroforeza capilara

Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea

componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu.
Electroforeza poate fi:
 fara medii stabilizante;
 cu medii stabilizante.
Mediile stabilizante pot fi:
 hartia electroforetica;
 geluri speciale pe placi de sticla;
 structuri de pulberi depuse in tuburi.
Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza
fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a
montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand
sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de
gradientul lor de potential, fig. II.26.b.

33
 _
-

+ +
electrozi

Solutie
tampon
A C
C A
A+B B+C
B B+C

A+B+C

b
a
Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante

Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita
incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC
doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe
cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre
electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de
detectare al eletroforezei capilare).

8
9
10

5
_ +

2 1
4 3
11 t

Fig.II.27. Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica,

4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie,
8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achiziţie si afişare a datelor, 11-
cromatograma electoforetica

Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice
U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de
potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de
analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la
stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi

34
detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un amplificator.
Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achiziţie si afişare a datelor
care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din amestecul analizat sub
forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este caracterizata de timpul
propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii
despre cantitatea de substanta existenta.
Avantaje ale electroforezei capilare sint:
- separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC şi creste cu
cit tensiune electrica aplicata este mai mare
- pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC;
- fiabilitate mai buna decit la HPLC

35
Electroforeza cu gel- Separare fragmente DNA . 1- tata , 2-fiu, 3- mama

36
 II. CROMATOGRAFIA

Analiza chimica cromatografica include mai multe metode de separare si totodata

de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula într-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumită și eluent , se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece în coloana
cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila,– se scurge continuu, cu
viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea,
cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la
gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si
se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Spalati de eluent, o parte
din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se
datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în
grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea componentilor, pe rând, la parasirea coloanei, de catre un instrument, în
grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod
ideal la oricare) dintre componenti ce ies din coloana si care este plasat în eluent,
imediat dupa iesirea din coloana. Acest analizor, denumit detector este capabil sa dea
un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza
mobila. În consecinta, dispozitivul, "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce
formeaza initial proba, similar cu o fotocelula care înregistreaza trecerea concurentilor la
sosire în atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme

În orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu

concentratia, alteori cu masa componentului aflat în celula de masura, semnal ce poate
fi înregistrat în functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de
eluent se numeste cromatograma. Pe cromatograma distingem o serie de maxime,
numite picuri (peak = vârf în l. engleza), care se produc deasupra liniei de baza sau a
portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. Aceasta apare ori de câte ori în
detector nu apare nici un component, în afara eluentului evident. Oricare pic are, în

37
cazul ideal, forma distributiei normale Gauss. Sa consideram cea mai simpla
cromatograma posibila: cazul introducerii unui singur component, într-un gaz, C, care
contine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme
este cel prezentat în figura II.1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de
eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a
ordonatelor, semnalul detectorului - în unitati arbitrare.
Distingem urmatoarele elemente de baza ale unei cromatograme:
3. Picurile cromatografice. În cazul prezentat în fig. 1, cele doua semnale
sau vârfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile în analiza
calitativa si cantitativa în toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde
unui component inert (aerul de exemplu în CG) - care nu este retinut de loc - iar cel de-al
doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic în cazul de fata) al probei
considerate si este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul migrarii prin
coloana între faza mobila si cea stationara si care, în consecinta, ies mai târziu din
coloana.
4. Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet neretinut de
catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pâna la detector. Acesta
nu poate fi zero. În cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al
aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la
injectarea (introducerea) probei în coloana si aparitia maximului de concentratie în
detector, pentru componentul neretinut.
5. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component
al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pâna la
verticala prin vârful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau în amestec.
6. Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de
retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe):

VR = tR·Fe

7. Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea

compara timpii masurati pe coloane diferite, în cazul aceluia si component - este dat de
diferenta:
tR' = tR - tM

8. Corespunzator exista si un volum de retentie ajustat,

VR' = VR – VM

unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tM·Fe
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.

38
 ANALIZA CROMATOGRAFICA

Cromatografia reprezintă un un şir de procedeu prin care un

amestec de substanţe complexe în fază gazoasă sau lichidă , cu
compoziţii asemănătoare, este separat pe componente. La folosirea
cromatografiei în scop analitic imediat după separarea
componentelor amestecului acestea sînt analizate cu aparatură
spectrometrică, termoc-onductometrică, ion - conductometrică,
polarimetrică sau refractometrică în scopul determinării compoziţieie
chimice şi/sau a concentraţiei. La toate separările cromatografice
proba de analizat se solvă într-o fază mobilă care este fie un gaz fie
un lichid fie un fluid supracritic. Fenomenul separării componentelor
amestecului fazei mobile într-un cromatograf se datorează frînării
diferenţiate a deplasării acestora de către o fază staţionară ce se
găseşte fixată pe o coloană sau pe o suprafaţă plană. La
cromatografie toate componentele amestecului de substanţe
analizate pleacă concomitent şi ajung la detector pe rînd. Natura
fazei mobilă şi a fazei staţionară se alege în aşa fel încît separarea
componentelor în timp să fie cît mai avansată. Componentele frînate
mai puternic de faza staţionară se deplasează cu viteză mai mică iar
cele frînate mai puţin se deplasează cu viteză mai mare şi
corespunzător ultimele sosec primele la capătul sistemului
cromatografic de separare unde se găseşte şi detectorul. Pe baza
acestor mobilităţi diferite componentele amestecului lichid sau gazos
se separă în eşantioane de substanţe pure ce ocupă fiecare un
interval bine definit de timp de ieşire din coloană. Sistemul de
detecţie cromatografică plasat la ieşirea coloanei cromatografice
trebuie să prezinte o viteză de răspuns suficient de mare pentru a nu
exista pericolul ca anumite fracţiuni de concentraţie mică (interval
scurt de sosire la capătul coloanei) să rămînă nedectate. La ora
actuală cromatografia ocupă un loc important în chimia organică,
chimia anorganică, în biochimie, în chimia alimentară, în chimia
mediului, în expertiza criminalogică ş.a. În figura de mai jos este
redată schema de principiu a cromatografiei.

39
 Rezultatul cromatografiei unui amestec de substanţe este o
cromatogramă, ca cea din figura de mai jos, ce este compusă dintr-
o succesiune de peak-uri in timp

Elementele unei cromatograme

La orice tip de cromatografie inălţimea peak-ului este

proportională fie cu concentratia fie cu masa componentului
analizat şi constituie baza analizei cantitative, iar timpul de
sosire este o măsură a naturii specieiei respective şi constituie
baza analizei calitative

CROMATOGRAFIA DE GAZE

Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate

amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau
există în stare gazoasă şi care nu se descompun la încălzire în
alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiză este acela în
care amestecurile supuse analizei sînt în stare lichidă din care

40
sînt aduse în stare gazoasă prin evaporare. Singura restrictie
pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la
substanţele la care temperatura de vaporizare este mai mare
decît temperatura de descompunere a substantelor de analizat.
In urma încălzirii acestor substanțe rezultă alţi compuşi decît
cei supuşi analizei. In aceste cazuri Înainte de introducerea
probei în cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi),
volatili, utilizând anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uşurinta cu care se pune la punct o analiza
noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si
largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale
acestei metode. Printre domeniile în care GC si-a cucerit un loc
de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia
mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica. Un
gazcromatograf respectă schema bloc din figura de mai jos
avînd particularităţi specifice pentru analiza unei faze gazoase
schema lui de principiu arată ca în figura

Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purtător, 2-

reductor de presiune, 3 - manometru de înaltă presiune, 3- manometru
de joasă presiune, 5- regulator de presiune şi debit, 6- seringă de
injecţie pentru substanţe de analizat în stare iniţială lichidă, 7-dispozitiv
de evaporare rapidă , 8-cuptor termostatat de încălzire, 9- coloană
cromatografică tubulară, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12-
sistem electronic de achiziţie prelucrare şi afişare date, 13 – calculator,
14- imprimantă

41